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Uso del pez cebra como animal modelopara estudios de nanotoxicidad

Sandra Rainierisrainieri@azti.es

JORNADA “NANOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN”1 Junio 2015

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In vitroEstrés oxidativo

InflamaciónApoptosis

…

Toxicidad NP metálicas

Mecanismo de acción no siempre claro

Faltan protocolos estandarizados y resultados uniformes

Pocos estudios in vivo y a largo plazo

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Modelos animales para estudios de toxicidad

• Los ensayos de toxicidad son obligatorios para cada aditivo / nuevo ingrediente

• Los procedimiento estándar incluyen ensayo in vitro e in vivo

• Los estudios con animales son caro, complicados, low-throughput y éticamenteproblemáticos

Invertebrados Embriones

Solución: utilizar sistemas alternativos para llevar a cabo ensayosiniciales.

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Pez cebra (Danio rerio)

Zebrafish

© AZTI-Tecnalia. Todos los derechos reservados.

• Fácil y económico de mantener• Reproducción externa• Embriones transparente• Herramientas genética• Test alternativos

48 hpf5 hpf

120 hpf5 hpf

MODELO RECONOCIDO

• Biología del desarrollo• Enfermedades humanas• Desarrollo de medicamentos• Eco-toxicología• Investigación alimentaria• Acuicultura

Alimentación espontanea(ANIMAL)

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Estudios in vivo alternativos al uso de animales

Inflamación- cepa transgénica queexpresa mieloperoxidasa (mpx).

Estrés oxidativo – tinción con fluoróforoque detecta producción de ROS.Además, estimación daño oxidativo(peroxidación lipidica, daño proteinas,ADN….).

Apoptosis – tinción con fluoróforo quedetecta muerte celular programada.

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Estudios in vivo alternativos al uso de animales

Absorción / Bioacumulación

Espresión genica – genes individuales omediante array.

Olasagasti et al., J. Appl. Toxicol., 2014 López-Serrano et al., Nanotoxicology., 2014

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Fases de un estudio de nanotoxicidad

• Caracterización físico – química de las NPs con diferentestécnicas (a T0 y durante el experimento).

• Definición de un protocolo de exposición adecuado.

• Evaluación del absorción y distribución en el sistema biológicoutilizado (durante el experimento).

• Evaluación de end-points de toxicidad específicos.

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Estudio sobre la toxicidad de AgNPscomerciales

Objetivos del trabajo:

1) Definir un protocolo adecuado para la evaluación de latoxicidad de NPs metálicas con embriones de pez cebra.

2) Clarificar si la toxicidad se debe a NPs o a liberación de Ag+.

3) Verificar si existen biomarcadores de toxicidad comunesentre diferentes tipos de AgNPs.

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Fase 1: definición protocolo exposición

nAg coloidal

Absorción y distribución

Protocolo 14hpf-48hpf

Protocolo 272hpf-120hpf

Protocolo 396hpf-120hpf

48h 48h 24h

OECD 236 (FET test)96h

Olasagasti et al., J. Appl. Toxicol., 2014

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0

20

40

60

80

100

0.01 ppm 1 ppm 5 ppm

% M

orta

lity

nAg concentration

nAg deionized water

nAg embryo water

Embryo water Agua desionizadanAg coloidal Polytech & Nety AgNO3

• Toxicidad aguda• Expresión génica

Ag+ (complejos con aniones) = NO efectoAg+ (NO complejos) = efecto

Fase 2: NPs vs Ag+

Olasagasti et al., J. Appl. Toxicol., 2014

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NP vs Ag+

Genesinducidos/reprimidos

Procesosbiológicos

Rutasmetabólicas

1 proceso común:“cellular macromolecule

metabolic process”

!! NO genescomunes!!

Mecanismodiferente

Mecanismodiferente

AgNPs vs AgNO3 (agua desionizada)

Análisistranscriptómico

1 en comúnMetabolismo

lipídico

Mecanismodiferente

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NP vs Ag+

• Toxicidad de las AgNPs debida al tamaño nano y a laliberación de iones.

• El mecanismo de acción de las AgNPs depende delmedio y de la concentración.

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Nanoplata coloidal Polytech & Net

AgNPs SIGMA + citrato

Suplemento alimentario

10.82 nm

5.9 nm

19.05nm

0

20

40

60

80

100

0.01 ppm 1 ppm 5 ppm 7 ppm 11 ppm 15 ppm

% M

orta

lity

LC506.24 ppm

0

20

40

60

80

100

120

0,093 ppm 0,1875 ppm 0,375 ppm 0,75 ppm 1,5 ppm 3 ppm

% M

orta

lity

LC501.07 ppm

0

20

40

60

80

100

0,05625 ppm 0,1125 ppm 0,225 ppm 0,45 ppm 0,9 ppm

Mor

talit

y %

LC500.076 ppm

Más toxico!

Fase 3: Comparación efectos diferentes AgNPs

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Products NPs Ag mt il1β slc16a9a opn1mw2 ucp3

nAg colloidal Polytech & Net

NPs Ag Sigma

Supplement nAg

up-regulated down-regulated(p<0.01)

Comparación efectos diferentes AgNPs

Expresión diferencial de genes seleccionados

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• El nivel de toxicidad y las rutas metabólicas afectadasdependen del tipo de AgNPs

Comparación efectos diferentes AgNPs

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• En estudios de nanotoxicidad es fundamental definir unprotocolo de exposición adecuado.

• El medio de disolución influye en la toxicidad de las AgNPs.

• La toxicidad de las AgNPs es debida en parte al tamaño nano yen parte a la liberación de Ag+.

• No se han detectado biomarcadores específicos para ladetección de toxicidad de los tres tipos de las AgNPs estudiadas.

Conclusiones

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Equipo toxicidad y pez cebra AZTI

Alex Barranco Nadia Conlledo Monica Martinez Santos Sandra RainieriMaider Olasagasti

Nagore Egurrola M. Jose Sierra Amaia Mendizabal Miguel Ángel Pardo

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ColaboradoresDepartamento de química analíticaUniversidad Complutense de Madrid

2011-2014Analítica, transcriptómica y proteómica para laevaluación de la toxicidad mecanismos ybioacumilacion de contaminantes alimentarios yambientales (ATP-ToxBio). CTQ2011-28328-C02-022015-2017Evaluación de los efectos tóxicos de la presencia denanopartículas, medicamentos y compuestosorgánicos persistentes en alimentos (SAFEFOOD)

Financiación

Gracias!!

2009-2011- DaReTest-El pez cebra como modelo animal en investigación alimentaria:evaluación de la seguridad y de la efectividad de ingredientes y modelo de acuicultura.2012-2015- SEGURFISH: Nuevas metodologías para garantizar la seguridad alimentariade productos pesqueros

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