procedimiento de cribage que utiliza el pez · pdf file5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65...
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19© OFICINA ESPAÑOLA DEPATENTES Y MARCAS
ESPAÑA
11© Número de publicación: 2 286 79451© Int. Cl.:
G01N 33/50 (2006.01)
A01K 67/027 (2006.01)
12© TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3
86© Número de solicitud europea: 05708384 .286© Fecha de presentación : 17.02.200587© Número de publicación de la solicitud: 164473387© Fecha de publicación de la solicitud: 12.04.2006
54© Título: Procedimiento de cribado que utiliza el pez cebra y la barrera hemato-encefálica.
30© Prioridad: 17.02.2004 GB 0403490
45© Fecha de publicación de la mención BOPI:01.12.2007
45© Fecha de la publicación del folleto de la patente:01.12.2007
73© Titular/es: Daniolabs Limited7330 Cambridge Research Park, LandbeachCambridge, Cambridgeshire CB5 9TN, GB
72© Inventor/es: Goldsmith, Paul yFleming, Angeleen, Louise
74© Agente: Zea Checa, Bernabé
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, dela mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europeade Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo seconsiderará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 delConvenio sobre concesión de Patentes Europeas).E
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Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid
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DESCRIPCIÓN
Procedimiento de cribado que utiliza el pez cebra y la barrera hemato-encefálica.
La presente invención se refiere al uso de un pez, en particular el pez cebra, en el cribado (“screening”) de sus-tancias con un efecto oftalmológico o un efecto biológico sobre el cerebro o el sistema nervioso central y/o un efectosobre una enfermedad o trastorno del cerebro o el sistema nervioso central. Además se refiere al uso del pez cebra enel cribado de sustancias que tienen una actividad biológica deseada y que no cruzan la barrera hematoencefálica.
La invención se basa en parte en el descubrimiento de que los inventores de que los peces cebra tiene una barrerahematoencefálica (BBB) y que esta barrera hematoencefálica se establece en momentos definidos. Aunque todos losvertebrados tienen alguna forma de BBB, esta barrera está poco caracterizada en los vertebrados inferiores. Aunquese han identificado algunas diferencias claras en las propiedades de la BBB en teleósteos y mamíferos, por ejemplo,las monoaminas pueden atravesar la BBB de teleósteos pero no la de roedores (Khan y Deschaux, 1997), se sabe pocosobre cómo difiere la BBB en términos de estructura o función entre especies de vertebrados. Además, se sabe que, enlos mamíferos, la BBB “se hace más hermética” a lo largo del desarrollo y sólo es madura en los animales después denacer (Ibiwoye et al., 1994; Wolburg y Lippoldt, 2002; Nag., 2003). Uno de los efectos beneficiosos principales delpez cebra como organismo modelo es la capacidad de realizar los cribados en fases juveniles, pero en la técnica no sedispone del conocimiento sobre la presencia de una barrera hematoencefálica en estos organismos y del momento deformación de esta barrera durante el desarrollo. El conocimiento proporcionado ahora por primera vez en este docu-mento tiene una aplicación técnica importante en el diseño y ejecución de cribados de sustancias que tienen efectosbiológicos deseados en el cerebro o el sistema nervioso central, desde el punto de vista oftalmológico y similares.
En mamíferos, la BBB proporciona una barrera compleja a la penetración de fármacos en el SNC. La red capilar delcerebro es tan densa que cada neurona y célula de la glia está a una distancia no mayor de 20 micrómetros de un capilarvecino. Hasta ahora, la presencia de la barrera hematoencefálica ha sido uno de los mayores obstáculos en el desarrollode fármacos para tratar afecciones neurológicas, atravesando esta barrera menos de un 1% de las moléculas pequeñas.Además, existen las barreras de membrana epitelial aracnoideas y las barreras epiteliales del plexo coroideo, aunquela barrera hematoencefálica tiene un área de superficie 1000 veces mayor que las barreras sangre-CSF y las barrerasde membrana aracnoidea y, por lo tanto, es cuantitativamente el sistema de barrera más importante (Dohrmann, 1970).
El primer nivel de barrera se presenta por las uniones endoteliales estrechas, que poseen las uniones estrechasde alta resistencia observadas en las células epiteliales, haciendo que el endotelio capilar del cerebro esté sellado,a diferencia de sus parientes endoteliales periféricos permeables. De esta manera, no existe movimiento paracelularde fluidos y sólo se produce una pinocitosis mínima (Brightman, 1977). Las tres células componentes de la barrerahematoencefálica son las propias células endoteliales, los pericitos capilares y los procesos pediculares de astrocitosperivasculares (Pardridge, 2003), expresando todos ellos una diversidad de enzimas tales como aminopeptidasas, car-boxipeptidasas, endopeptidasas y colinesterasas que inactivan muchos fármacos (Pardridge, 2002), aunque las enzimastambién pueden activar profármacos. Los sistemas transportadores permiten la entrada de una diversidad de moléculasque de otra manera no entrarían en el cerebro (Pardridge, 2002). Además, ciertas moléculas se difunden libremente através de la barrera hematoencefálica, pero son expulsadas de forma activa por transportadores de salida activos, delos que el más importante es la glicoproteína p (pgp) (Tsuji y Tamai, 1999).
Previamente no se ha establecido si los peces cebra tienen una barrera hematoencefálica. Existen pruebas de algúntipo de BBB en varias especies de peces, pero no ha habido ningún informe previo de una BBB en el pez cebra. Borg-Neczak y Tjalve, 1996, examinaron el lucio y demostraron la captación selectiva de mercurio inyectado periféricamen-te en la trucha adulta, que sugería la exclusión a través de la mayor parte del cerebro, lo cual implicaba una barrerahematoencefálica. Otro estudio sobre la trucha arco iris (de 42 días de edad) usando 3-OMG, un análogo de glucosano metabolizable que usa el mismo vehículo de transporte que la glucosa, presentó resultados indicativos de que se fa-cilitaba la captación en el cerebro, de forma similar a lo notificado también para el triptófano en el cerebro de la truchaarco iris (Aldegunde et al., 2000), aunque la evolución de los niveles de radiactividad a lo largo del tiempo en el ce-rebro y el plasma se pudieron explicar por una barrera hematoencefálica incompleta. Se presentó un resultado similaren la trucha arco iris que mostraba un transporte axonal que evitaba la barrera hematoencefálica para el tributilestaño,un organometal presente en el agua (Rouleau, Xiong, Pace Pavicius 2003). Sin embargo, hasta la fecha no ha habidoningún informe sobre si el pez cebra posee una BBB y, de hecho, también hay indicios contradictorios que sugierenque ciertas especies de peces no tienen una barrera hematoencefálica. Bachaur (Bachaur, Failing, Georgii) examinólas concentraciones de bifenilos policlorados (PCB) en diversos tejidos de trucha arco iris (de edades no indicadas),zorros, corzos y seres humanos e indicaron la exclusión de los PCB del cerebro de mamíferos en comparación con lospeces, concluyendo que la barrera hematoencefálica de los peces debe ser menos eficaz que la de los mamíferos. Khany Deschaux (Journal of Experimental Biology, Volume 200, 1997) indicaron que las aminas biogénicas podían pasara través de la barrera hematoencefálica de peces teleósteos, remitiéndose a las pruebas de Fritsche (Fritsche, Reid,Thomas y Perry, 1993), aunque el documento mencionado no parece proporcionar ninguna prueba de esto.
Otro hecho que se desconoce en la técnica aparte de si el pez cebra tiene una barrera hematoencefálica, es lomadura que es esta barrera hematoencefálica en relación con un organismo más avanzado. En los mamíferos, laconcentración eficaz en el cerebro de un compuesto es profundamente dependiente de las bombas de entrada y salidaactivas, principalmente de pgp (Schumacher y Mollgard, 1997). El tamaño de los poros también está bajo un estrechocontrol regulador que implica moléculas tales como claudin-5 (Nitta et al., 2003).
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Además, se reconoce que la barrera hematoencefálica madura gradualmente durante el desarrollo en los mamíferos,reduciéndose la permeabilidad a las pequeñas moléculas con la edad. Se sabe que las sustancias excluidas del cerebrode rata adulta atraviesan los capilares cerebrales del embrión (Wolburg y Lippoldt, 2002). De forma similar, la BBBdel ratón en desarrollo muestra una menor permeabilidad a los compuestos según madura (Stewart y Hayakawa, 1987).
La contribución hecha mediante el trabajo descrito en este documento es crítica en la interpretación de la pene-tración potencial de la barrera hematoencefálica en el pez cebra, dado que la estrategia evolutiva del pez cebra esdesarrollarse de una forma extremadamente rápida para alcanzar un estado parecido al del adulto en 72 horas parapoder escapar de los depredadores. De esta manera, en el día cuatro ya pueden ver, escapar de los depredadores yalimentarse, aunque no alcanzan la madurez sexual hasta los tres meses. Este rápido desarrollo ha permitido estudiar ymodelar muchos procesos en esta fase larvaria en la que su pequeño tamaño y su fácil cría hace que sean los más ade-cuados para el cribado de compuestos. Sin embargo, previamente se desconocía la sofisticación de cualquier desarrollode la barrera hematoencefálica en el pez cebra y lo madura que es esta barrera en las fases larvarias.
En este documento se demuestra que el pez cebra efectivamente desarrolla una barrera hematoencefálica sofisticadacon sistemas de transporte activos y que la desarrolla de una manera dependiente del tiempo. Por lo tanto, la presenteinvención puede proporcionar por primera vez estrategias racionales para investigar compuestos con indicacionesneurológicas, así como para generar un sistema in vivo para determinar la penetración en el cerebro de un compuestoin vivo.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 es un organigrama esquemático que presenta el cribado de acuerdo con una realización de la presenteinvención. Aquí, como en otras partes de este documento, la referencia a “después del día 5” es 5 días después dela fertilización o posteriormente, es decir, después del establecimiento de la barrera hematoencefálica tal y como sedetermina en este documento.
La figura 2 es un histograma que muestra la intensidad media de fluorescencia en el cerebro de peces a los quese les ha inyectado azul de Evans y controles con solución salina. El eje X representa los días transcurridos despuésde la fertilización y el eje Y representa la intensidad de fluorescencia en el cerebro. Cada serie de barras representaun solo punto de tiempo, representando las barras oscuras los controles a los que se les ha inyectado solución salinay representando las barras sombreadas muestras a las que se les ha inyectado azul de Evans. Existe un descensodependiente de la edad de la intensidad de fluorescencia en el cerebro, que indica la exclusión del azul de Evans segúnmadura la BBB.
La figura 3 es un organigrama esquemático que incorpora las características de la reivindicación 1 e ilustra ademásel uso de los resultados obtenidos en los cribados de acuerdo con la presente invención para evaluar actividadesbiológicas de sustancias de ensayo.
La figura 4 muestra la exclusión del colorante fluoresceína sódica, un colorante de bajo peso molecular, del cerebro10 días después de la fertilización (d.p.f.). El eje X representa los días transcurridos posteriores a la fertilización y eleje Y representa la intensidad de fluorescencia en el cerebro. Cada serie de barras representa un solo punto de tiemporepresentando las barras oscuras los controles a los que se les ha inyectado solución salina y representando las barrassombreadas las muestras a las que se les ha inyectado fluoresceína sódica. Existe un rápido descenso dependiente dela edad en la intensidad de fluorescencia en el cerebro a 10 d.p.f., que indica la exclusión de pequeñas moléculas delcerebro en ese momento.
La figura 5 muestra la exclusión de colorante rodamina 123 (R123), un colorante de bajo peso molecular, delcerebro 10 días después de la fertilización (d.p.f.). Aunque es similar en peso molecular a la fluoresceína sódica,R123 es un sustrato para Pgp y, por lo tanto, se transporta activamente hacia el exterior del SNC. El eje X representalos días transcurridos posteriores a la fertilización y el eje Y representa la intensidad de fluorescencia en el cerebro.Cada serie de barras representa un solo punto de tiempo representando las barras oscuras los controles a los que seles ha inyectado solución salina y representando las barras sombreadas las muestras a las que se les ha inyectadoR123. Hay un rápido descenso dependiente de la edad en la intensidad de fluorescencia en el cerebro a 8 d.p.f., queindica la exclusión de R123 del cerebro en ese momento. Este punto de tiempo coincide con el inicio de la expresiónde Pgp en el endotelio vascular del SNC. Por lo tanto, aunque la fluoresceína sódica y el R123 tienen un tamañosimilar, R123 es excluido del cerebro a edades más jóvenes que la fluoresceína sódica ya que se retira activamentepor Pgp.
La figura 6 demuestra que la exclusión del colorante rodamina 123 (R123) del cerebro se realiza a través de un me-canismo dependiente de Pgp. El eje X representa los días transcurridos después de la fertilización y el eje Y representala intensidad de fluorescencia en el cerebro. Cada serie de barras representa un solo punto de tiempo, representandolas barras oscuras las larvas en las que se ha inyectado R123 criadas en medio de embrión y representando las barrassombreadas muestras a las que se les ha inyectado R123 desarrolladas en presencia de un inhibidor de Pgp, verapamil(V). Cuando se crían en condiciones normales (medio de embrión), existe un rápido descenso dependiente de la edaden la intensidad de fluorescencia en el cerebro a 8 d.p.f., que indica la exclusión de R123 del cerebro en este momentoy coincide con la expresión de Pgp cuando se detecta por inmunohistoquímica. Esta exclusión dependiente de la edadse invierte incubando larvas en medio de embrión que contiene el inhibidor de Pgp verapamil, de tal forma que la
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fluorescencia en los cerebros de estas muestras a 8 d.p.f. y 10 d.p.f. es equivalente a la observada a edades más jóvenes(3 y 5 d.p.f.).
Es bien conocido que la investigación farmacéutica que lleva a la identificación de un nuevo fármaco puede implicarel cribado de cantidades muy grandes de sustancias candidatas, tanto antes como después de haber encontrado uncompuesto candidato. Éste es un factor que hace que la investigación farmacéutica sea muy cara y requiera muchotiempo. Los medios para ayudar a los procesos de cribado tienen una utilidad e importancia comercial considerables.
El pez cebra se está haciendo cada vez más popular como una herramienta sofisticada de investigación del efectode pequeñas moléculas sobre procesos fisiológicos y patológicos complejos (Goldsmith, 2004). Esto se debe a que sonvertebrados con un tamaño y complejidad de genoma similares a los de los seres humanos, pero es posible generarcientos de miles de descendientes en un tamaño moderado de acuario cada año. Cuando los descendientes no tienenmás que unos pocos milímetros de longitud, viviendo las larvas en volúmenes tan pequeños como de 50 microlitros,son particularmente adecuadas para la investigación de compuestos de alto rendimiento. En la bibliografía se estánpresentando cada vez más modelos de enfermedades humanas, tales como la enfermedad de Parkinson (Anichtchik etal., 2004), degeneraciones de la retina (Goldsmith et al., 2003), y sordera sensorineural (Whitfield, 2002).
Aunque se ha demostrado que en el pez cebra los efectos de varios compuestos farmacéuticos son similares a los delos mamíferos (Langheinrich, 2003), una cuestión principal con respecto a la utilidad de la investigación de moléculaspequeñas para una afección neurológica u oftalmológica es si una molécula pequeña alcanzará su sitio diana. Como seha indicado, la presente invención proporciona una contribución importante al diseño y uso de nuevos procedimientosde cribado y ensayo, permitiendo la identificación y uso de nuevos fármacos.
En diversos aspectos adicionales, la presente invención se refiere a procedimientos y medios de cribado y ensayo,y a las sustancias identificadas por estos métodos y medios.
Más específicamente, la presente invención emplea el pez cebra en procedimientos de cribado y ensayo de sustan-cias que son biológicamente activas en el cerebro o el sistema nervioso central (SNC) y/o ejercen un efecto biológicooftalmológico, por ejemplo, mejorando uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno del cerebro o el sistemanervioso central, donde la metodología de cribado o ensayo tiene en cuenta el conocimiento (1) de que el pez cebratiene una barrera hematoencefálica y (2) que la barrera hematoencefálica se forma en los embriones del pez cebra alos cinco días.
Debe indicarse que la referencia en este documento al establecimiento de una barrera hematoencefálica cincodías después de la fertilización es una referencia al establecimiento de una barrera hematoencefálica suficiente paraexcluir moléculas de Mr comparable al azul de Evans. En el caso de moléculas más pequeñas, pueden excluirseposteriormente cuando se haya desarrollado una barrera hematoencefálica eficaz. De esta manera, en todos los aspectosy realizaciones de la presente invención, debe determinarse si las moléculas más pequeñas pueden atravesar la barrerahematoencefálica a los 5 días después de la fertilización, pero se excluyen en un punto posterior en el tiempo, entoncesese punto en el tiempo (por ejemplo, 6 días o 7 días después de la fertilización) ha de ser sustituido por la referenciade los 5 días después de la fertilización, cuando la sustancia de ensayo tiene ese tamaño más pequeño.
Más específicamente, en este documento se establece que moléculas de 960 daltons o mayores se excluyen a loscinco días y moléculas menores de 960 daltons se excluyen a los diez días, excepto cuando hay una salida activa de lasmoléculas por pgp a los 8 días, refiriéndose las edades indicadas al pez cebra criado en condiciones convencionales,y son ajustadas si el pez cebra crece en condiciones que aceleran o retrasan la consecución de la fase de desarrolloequivalente.
Como sabrá cualquier biólogo especializado en el pez cebra, la velocidad de desarrollo puede ser más lenta o másrápida si se altera, en particular, la temperatura del acuario o si se usa una cepa diferente. Se sabe que un aumentode la temperatura acelera el desarrollo mientras que un descenso de la temperatura retrasa el desarrollo. Las condi-ciones convencionales implican el crecimiento del pez cebra a una temperatura de 28,5ºC. Más específicamente, lascondiciones pueden ser las definidas por Westerfield (1995) y definidas adicionalmente por Kimmel et al., (1995),específicamente una temperatura de 28,5ºC a baja densidad (no más de 5 larvas por ml) en medio de embrión (NaCl 5mM, KCl 0,17 mM, CaCl2 0,33 mM, Mg2SO4 0,33 mM, azul de metileno al 10−5%) en un ciclo de 14 horas de luz y10 horas de oscuridad.
En estas condiciones, se alcanzan las siguientes fases del desarrollo a los 5, 8 y 10 días, respectivamente:
(i) 5 días - el momento en el que aparecen por primera vez las células caliciformes en la parte posterior del tubodigestivo, está presente osificación en el opérculo y la vaina de la punta anterior de la notocorda;
(ii) 8 días - el momento en el que es evidente la osificación del centro en la columna vertebral, se expresa pgp enel endotelio vascular que rodea al SNC y se observa mielina compactada madura en el rombencéfalo;
(iii) 10 días - el momento en el que son evidentes centros de osificación en el cartílago de Meckel y el palatocuadra-do, están presentes arcos neurales en las vértebras cervicales, y es evidente osificación en todos los centros cervicalesy torácicos.
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Por consiguiente, cuando se dice que se realiza un procedimiento a los 5, 8 ó 10 días, una definición alternativa deltiempo requerido es por referencia a la fase del desarrollo equivalente, es decir, 5 días para el pez cebra en condicionesconvencionales equivale a la aparición de las características indicadas en el punto (i) anterior sean cuales sean lascondiciones en las que está creciendo el pez cebra, que puede tener lugar, por ejemplo, antes de cinco días para el pezcebra criado a una temperatura mayor de 28,5ºC o después de cinco días para el pez cebra criado a una temperaturamenor de 28,5ºC. De forma similar, 8 días equivale a la aparición de las características indicadas en el punto (ii)anterior y 10 días equivale a la aparición de las características indicadas en el punto (iii) anterior.
Teniendo en cuenta la variación que se produce por la alteración de las condiciones, las moléculas menores de 960daltons pueden excluirse entre el día 7 y 13, y especialmente entre el día 9 y 11, y en particular en el día 10, con unasalida activa cuando sea aplicable entre el día 6 y 12 y especialmente entre el día 7 y 10, y en particular en el día 8.
La presente invención, por ejemplo, proporciona un procedimiento de cribado de una sustancia con el efectodeseado, donde el procedimiento es sustancialmente como se indica en la figura 1. “Compuesto x” se refiere a unasustancia de ensayo.
La presente invención proporciona una solución para los problemas técnicos asociados con la falta de conocimientoen relación con la barrera hematoencefálica.
Si no se tienen conocimientos sobre la formación de la barrera hematoencefálica en el pez cebra, pueden obtenerseresultados falsos negativos o falsos positivos cuando se buscan sustancias con un efecto sobre el cerebro o el sistemanervioso central.
Por ejemplo, si el cribado se realiza después de haberse formado la barrera hematoencefálica (como ha sido deter-minado por los presentes inventores), una sustancia que pueda ejercer el efecto biológico deseado si se administra alcerebro pero no pueda ejercer el efecto biológico deseado cuando no se administra específicamente al cerebro porqueno atraviesa la barrera hematoencefálica producirá un resultado falso negativo. Una persona que ensaya esa sustanciasin saber que existe una barrera hematoencefálica a través de la cual no puede pasar la sustancia descartará la sustanciaconsiderándola no útil para conseguir el efecto biológico deseado, aunque si se usara la administración correcta (porejemplo, directamente en el cerebro o el ojo) la sustancia efectivamente sería útil para conseguir ese efecto biológico.
Por otra parte, si se realiza esta búsqueda usando el pez cebra antes de la formación de la barrera hematoencefálica(como ha sido determinado por los presentes inventores), puede obtenerse un resultado equivalente a un resultadofalso positivo. Por ejemplo, una sustancia puede ejercer el efecto biológico deseado en el cribado, pero posteriormentepuede fallar en adultos porque no puede atravesar la barrera hematoencefálica. La sustancia entonces puede descartarseconsiderándose no útil, después de realizar algún aporte de esfuerzos significativo a la luz del resultado inicialmentepositivo en el cribado. La evaluación de la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica y, además, de emplear unpez de ensayo en una fase apropiada del desarrollo, teniendo en cuenta el conocimiento proporcionado por la presenteinvención, evita estos problemas y es muy beneficioso en la técnica.
De acuerdo con aspectos y realizaciones de la presente invención, aplicando el conocimiento de la existencia ymomento de formación de la barrera hematoencefálica del pez cebra, el experto en la materia obtendrá resultadosmejores y más útiles con las sustancias de ensayo. Por ejemplo, puede ensayarse una actividad biológica deseada enuna sustancia que se sabe que no puede atravesar la barrera hematoencefálica, en un cribado que se diseña teniendoen cuenta la presencia o ausencia de una barrera hematoencefálica en el pez empleado en la investigación. Puedenusarse embriones de peces antes de la formación de una barrera hematoencefálica y pueden encontrarse sustancias quetengan el efecto biológico deseado. Adicional o alternativamente, pueden ensayarse sustancias en peces en los que seha formado una barrera hematoencefálica, estableciendo de esta manera no sólo la capacidad de ejercer la actividadbiológica deseada, sino también la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica. Una opción es administrarla sustancia directamente en el cerebro en un pez en el que se sabe que se ha formado la barrera hematoencefálica,ensayando de esta manera su capacidad de ejercer el efecto biológico deseado sin limitación en cuanto a su capacidadde atravesar la barrera hematoencefálica.
En otras realizaciones, la invención proporciona procedimientos de cribado de sustancias que ejercen una actividadbiológica deseada en el cuerpo pero también una actividad biológica indeseada en una diana que existe en el cerebro,sistema nervioso central y/u ojo. De esta manera, puede emplearse un procedimiento de cribado para determinar laactividad biológica de una sustancia de ensayo y determinar la capacidad o incapacidad de la sustancia de ensayode atravesar la barrera hematoencefálica, por ejemplo, determinando si la sustancia aparece o no aparece en algunamedida significativa dentro del cerebro, el sistema nervioso central o el ojo cuando no se administra directamente aestos tejidos. El conocimiento sobre la existencia de la barrera hematoencefálica en el pez cebra y el momento de suestablecimiento permite diseñar procedimientos de cribado en los que puede determinarse la exclusión de sustanciasdel cerebro, sistema nervioso central y/o el ojo en virtud de su incapacidad de atravesar la barrera hematoencefálica yemplearse, por ejemplo, en la selección de compuestos candidatos para el desarrollo adicional como fármacos.
La persona experta está bien documentada en el diseño y realización de investigaciones biológicas y la aplicaciónde experimentos de control apropiados. La presente invención incluye cribados en el pez cebra que tienen en cuenta laexistencia de la barrera hematoencefálica en el pez cebra y el momento de su formación.
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En diversos aspectos y realizaciones, la presente invención proporciona la materia objeto indicada en las reivindi-caciones presentadas más adelante.
Además, puede determinarse si una molécula es metabolizada por la barrera hematoencefálica evaluando el perfilde metabolitos por HPLC de una sustancia de ensayo administrada tanto antes como después de la formación de laBBB.
La invención generalmente es aplicable a cualquiera de una diversidad de enfermedades y trastornos, y a conti-nuación se indican específicamente una serie de ejemplos: Las siguientes enfermedades son trastornos comunes delsistema nervioso central. Una característica común de todos estos trastornos es que la célula a la que se dirige el agenteterapéutico está detrás de una barrera celular - la barrera hematoencefálica o la barrera sangre-retina.
Degeneraciones de la retina, incluyendo:
Degeneración macular
Retinitis pigmentosa
Degeneración de células ganglionares (glaucoma)
Trastornos desmielinizantes, incluyendo:
Esclerosis múltiple
ADEM
Trastornos degenerativos, incluyendo:
Enfermedad de Parkinson
Enfermedad de Alzheimer
Enfermedad de Huntington
Enfermedades con inclusiones de neuronas motoras
Tauopatías
Degeneración corticobasal
Trastornos neuropsiquiátricos, incluyendo:
Depresión
Enfermedad bipolar
Esquizofrenia
Ansiedad
Agresión
Disfunción sexual
Trastornos diversos, incluyendo:
Epilepsia
Dolor de cabeza
Dolor
Trastornos del sueño
Saciedad
Malignidades del SNC/retina
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Pueden encontrarse afecciones menos frecuentes del SNC y la retina en cualquier libro de texto médico conven-cional.
La presente invención proporciona la formulación de un algoritmo para aplicar en el diseño de ensayos de cribado,teniendo en cuenta la existencia de la barrera hematoencefálica en el pez cebra (como ha sido determinado por lospresentes inventores) y el momento de formación de la barrera hematoencefálica, opcionalmente también si se sabeo no que una sustancia de ensayo puede o no atravesar la barrera hematoencefálica. Por medio de una estrategiaalgorítmica, la persona experta determina la combinación o combinaciones de experimentos que emplean pez cebrade una edad particular, el modo y sitio de administración de la sustancia de ensayo, la naturaleza de la sustancia deensayo, el procedimiento para determinar el efecto, etc., que se emplean en el procedimiento de cribado. Además, estaestrategia permite interpretar los resultados obtenidos en diferentes experimentos, tal y como se ilustra, por ejemplo,en la figura 3.
El pez cebra de ensayo puede tener uno o más síntomas o signos de una enfermedad o trastorno antes del uso en elcribado de una sustancia con la actividad deseada.
La sustancia de ensayo puede administrarse con o antes de la administración de una sustancia que también induceuno o más síntomas o signos de la enfermedad o trastorno de interés.
De esta manera, la invención es igualmente aplicable a la investigación de sustancias que ejercen un efecto bio-lógico que altera una actividad o función en el sistema nervioso central, cerebro u ojo, ya sea normal o esté sujeta auna enfermedad o trastorno, para investigar si las sustancias que ejercen un efecto biológico que mejora un signo osíntoma de una enfermedad o trastorno, son terapéuticas o son profilácticas.
El organismo de ensayo es un pez cebra.
El pez cebra es un organismo que combina muchas de las ventajas de los sistemas modelo de mamíferos e inver-tebrados. Es un vertebrado y, por lo tanto, más relevante en modelos de enfermedad humana que Drosophila u otrosinvertebrados, pero a diferencia de otros modelos de vertebrados puede usarse para realizar cribados genéticos.
Varios documentos revisados por iguales destacan y validan el uso del pez cebra como especie en la que crearmodelos de trastornos humanos. [Dooley K y Zon LI (2000) Zebrafish: a model system for the study of human di-sease. Current Opinion in Genetics and Development 10: 252-6-Barut BA y Zon LI (2000) Realising the potentialof Zebrafish as a model for human disease Physiological Genomics 13: 49-51 - Fishman MC (2001) Zebrafish: TheCanonical Vertebrate. Science 294: 1290-1].
Los inventores han apreciado que el pez cebra ofrece la combinación única de las capacidades de reproducciónde los invertebrados y de modelado de los vertebrados. Se desarrollan rápidamente, habiéndose establecido ya elplan básico del cuerpo a las 24 horas de la fertilización. Además, su desarrollo extrauterino dentro de una cápsulatransparente facilita la visualización in vivo de órganos internos por medio de un microscopio de disección. Muchaspatologías pueden modelarse dentro de la primera semana de vida, momento en el que los embriones sólo tienen unospocos milímetros de longitud y pueden vivir en 100 µl de fluido. Esto permite el análisis de embriones individuales enformato multicanal, tal como un formato de placa de 96 pocillos. Esto es particularmente útil para la investigación defármacos, disponiendo de muchos agentes químicos en un formato de placa de 96 pocillos.
Puede emplearse una población de pez cebra en una placa Petri o un depósito. Una población del pez puedetratarse conjuntamente y puede ensayarse conjuntamente, por ejemplo, por medio de la adición de una o más o unacombinación de sustancias de ensayo al agua.
El pez cebra tiene un corto periodo de maduración de dos a tres meses y es muy fecundo, pudiendo producir unasola pareja de adultos de 100 a 200 descendientes por semana. Tanto los embriones como los adultos son pequeños,siendo los embriones de unos pocos mm y los adultos de 2-3 cm de longitud. Son baratos y fáciles de mantener. Lacapacidad de generar grandes números de descendientes en un pequeño sitio ofrece la posibilidad de producción agran escala.
El pez cebra, por lo tanto, es un organismo válido para la investigación de sustancias con actividad biológica envertebrados, incluyendo mamíferos, incluyendo seres humanos, siendo estas sustancias útiles in vivo, por ejemplo,como agentes terapéuticos. La presente invención amplía el valor de los cribados en el pez cebra mejorando el diseñode las investigaciones y mejorando la utilidad de los resultados obtenidos.
Una ventaja adicional del pez cebra es el hecho de que vive en agua. Esto facilita la administración de las sustanciasde ensayo ya que pueden añadirse al agua en la que están los peces. El pez cebra absorbe fácilmente agentes químicos.La concentración eficaz de agentes químicos en el agua a menudo equivale a la concentración plasmática eficaz enmamíferos.
A cada pocillo de una placa multipocillo, tal como una placa de 96 pocillos, se le pueden añadir diferentes sustan-cias de ensayo para identificar la sustancia de ensayo que presenta un efecto beneficioso o perjudicial. En cada pocillopuede haber uno o múltiples peces expuestos a la sustancia de ensayo.
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El pez cebra también es tolerante al DMSO (dimetilsulfóxido). Esto es importante, ya que el DMSO se usa comodisolvente para disolver muchos fármacos. Los inventores han establecido que el pez cebra puede tolerar el DMSO al1%. De esta manera, un fármaco candidato u otra sustancia de ensayo puede disolverse en DMSO y administrarse alpez cebra añadiéndose al agua del pez para dar una concentración final de DMSO de al menos hasta un 1%. Esto seemplea en diversos aspectos preferidos y realizaciones de la presente invención.
La misma sustancia de ensayo puede añadirse a diferentes pocillos a una concentración diferente. Por ejemplo, lasustancia de ensayo 1 puede añadirse al pocillo A1 a una concentración de 1 mM, al pocillo A2 a una concentraciónde 100 µM, al pocillo A3 a una concentración de 10 µM, al pocillo A4 a una concentración de 1 µM y al pocillo A5 auna concentración de 0,1 µM. Entonces la sustancia de ensayo 2 se puede añadir al pocillo B1, etc. Las sustancias deensayo pueden ser fármacos conocidos o nuevas entidades químicas.
Además, las sustancias de ensayo pueden añadirse en combinación. Por ejemplo, el pocillo A2 puede contenersustancias de ensayo 1 y 2, el pocillo A3 sustancia de ensayo 1 y 3, y el pocillo B2 sustancia de ensayo 2 y 3. Comoalternativa, cada pocillo puede contener la sustancia de ensayo x, conteniendo los pocillos individuales una serie desustancias de ensayo adicionales.
En otras opciones, puede emplearse una población de pez cebra en una placa Petri o un depósito y tratarse conjun-tamente, por ejemplo, mediante la adición de una o más o una combinación de sustancias de ensayo en el agua.
Para la administración en el cerebro, puede emplearse un sistema de administración, por ejemplo, que usa unamolécula de liberación lipófila, administrándose el “caballo de Troya” entero al agua del pez. Como alternativa, lasustancia de ensayo puede inyectarse directamente con la ayuda de un micromanipulador, en el SNC, por ejemplo enun ventrículo, evitando de esta manera la BBB.
De esta manera, el pez cebra permite investigar la ruta biológica entera de un vertebrado de una forma de altorendimiento.
La presente invención, en ciertos aspectos y realizaciones, proporciona el cribado y preferiblemente la identifi-cación u obtención de una sustancia que proporciona una combinación sinérgica con otra sustancia, o el cribado ypreferiblemente la identificación u obtención de dos o más sustancias que conjuntamente proporcionan una combi-nación aditiva o sinérgica. Las combinaciones sinérgicas de fármacos a menudo proporcionan ventajas clínicas. Eluso de un sistema de cribado de acuerdo con la presente invención permite la identificación de estas combinacionessinérgicas.
De esta manera, en ciertas realizaciones, la invención comprende tratar el pez cebra, como se ha descrito, con doso más sustancias, de las que al menos una es una sustancia de ensayo, y comparar el efecto de las dos o más sustanciasen combinación para determinar el efecto óptimo (tanto si se aplican simultáneamente como si se aplican secuencial-mente) sobre un aspecto del comportamiento o fisiología con el efecto de cualquiera o las dos o más sustancias cuandose aplican individualmente o solas. Todas (o las dos) sustancias aplicadas pueden ser una sustancia de ensayo, o unade las sustancias puede ser un fármaco que se sabe que tiene un efecto beneficioso en la enfermedad que es objeto delcribado, o al menos un efecto en el pez de ensayo.
De esta manera, la invención proporciona el cribado, y preferiblemente la identificación u obtención de una sustan-cia que proporciona un efecto aditivo a un fármaco conocido o un efecto sinérgico con el fármaco conocido. Tambiénpermite el cribado y preferiblemente la identificación u obtención de una combinación de dos o más sustancias queproporcionan un efecto sinérgico, en comparación con el efecto de las dos sustancias cuando se emplean individual-mente o solas.
Las terapias de adición son útiles porque es difícil realizar ensayos clínicos en los que un fármaco existente se retirade un paciente y se reemplaza con un fármaco nuevo. El paciente se ve privado de un fármaco que ha conseguido almenos alguna eficacia demostrada y alguna confianza en su perfil de efectos secundarios. Además, el paciente serávulnerable a su enfermedad durante las fases de retirada del fármaco existente y acumulación del fármaco de ensayo.
El pez cebra de ensayo puede estar mutado en lugar de ser de tipo salvaje. Entonces, es posible ensayar efectosde interacción, efectos sinérgicos beneficiosos o efectos perjudiciales de la mutación más las sustancias de ensayo.Como alternativa, el análisis puede ser del agente terapéutico conocido y la mutación genética para descubrir un nuevofármaco diana beneficioso en combinación con el fármaco conocido, o un marcador genético para uso en la predicciónde los pacientes con más probabilidad de beneficiarse (o no beneficiarse) de la prescripción del fármaco conocido.
En otra realización, se administra una combinación de agentes potencialmente útiles a un pez cebra de ensayo quetiene uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno, que puede generarse por medio de la adición de un agenteal pez de ensayo, por ejemplo, por adición al agua donde vive el pez o a través de la expresión o desactivación de ungen, para evaluar si la combinación es más eficaz que cualquiera de los agentes individuales.
La presente invención también proporciona el cribado y preferiblemente la identificación u obtención de una sus-tancia que mejora uno o más efectos secundarios de una sustancia activa, por ejemplo, una sustancia terapéuticamenteactiva. Hay muchos fármacos que se han abandonado en ensayos clínicos, o se comercializan pero se recetan con
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poca frecuencia, no porque no sean terapéuticamente eficaces, sino porque su perfil de efectos secundarios es limi-tante. Los efectos secundarios pueden ser relativamente benignos pero significativos para el paciente, tal como lesiónrenal (por ejemplo, ciclosporina). Es deseable permitir la administración de estos fármacos, con efectos beneficiososdemostrados, por medio de la co-administración de un agente adicional para mejorar el perfil de efectos secundarios.
De acuerdo con la presente invención, estos agentes se investigan en el pez cebra en el que la administración de lasustancia activa induce un efecto secundario u otro fenotipo que refleja o indica un efecto secundario. De esta manera,en realizaciones de la invención, se administra un agente activo a un pez cebra de ensayo que tiene uno o más síntomasde una enfermedad autoinmune y se evalúa el efecto secundario de otro fenotipo para dicho pez cuando se somete auna o más sustancias de ensayo. Esto no requiere un conocimiento previo de la acción del agente coadministrado. Enotras realizaciones, pueden cribarse agentes que consiguen el efecto terapéutico deseado con una reducción de efectossecundarios, y preferiblemente identificarse u obtenerse, por medio de la evaluación de un fenotipo de enfermedady un fenotipo de efectos secundarios. Como ocurre con otros aspectos y realizaciones de la presente invención, estopuede implicar la coadministración de un compuesto primario junto con una serie de sustancias candidatas, o juntocon una mutación genética inducida aleatoriamente. Con esta última estrategia, es decir, mutación, se necesitan etapasposteriores para identificar el agente co-terapéutico apropiado después de la identificación del pez con una mutaciónque proporciona un efecto de mejora.
Puede usarse una biblioteca diversa de compuestos de tipo fármaco, tales como la biblioteca LOPAC (Sigma) ola biblioteca combinatoria diversa Chembridge PHARMACOphore. Pueden usarse otras bibliotecas dirigidas contraclases de dianas particulares, tales como bibliotecas de canales iónicos y bibliotecas de proteína G.
Después de la identificación de una sustancia activa usando un cribado de acuerdo con la presente invención, lasustancia puede usarse en un método de tratamiento médico de la presente invención, realizándose la administraciónpreferiblemente en una “cantidad profilácticamente eficaz” o una “cantidad terapéuticamente eficaz” (según sea elcaso, aunque la profilaxis puede considerarse una terapia), siendo esta cantidad suficiente para mostrar un efectobeneficioso para el individuo. La cantidad real administrada, y el ritmo y el curso de administración a lo largo deltiempo, dependerán de la naturaleza y gravedad del trastorno que se está tratando. La prescripción del tratamiento, porejemplo, las decisiones sobre la dosificación, etc., está dentro de la responsabilidad de los especialistas generales yotros médicos.
1. Una sustancia de ensayo se añade al pez de ensayo antes de la aparición de la patología, en el momento dela inducción de la patología o después de la inducción de la patología. Las dos primeras situaciones tienen másprobabilidad de identificar un agente químico profiláctico, y la última un fármaco que invierte la patología de nuevoa un estado normal. La sustancia de ensayo puede ser un agente químico y puede ser un agente químico aleatorioadministrado de una forma de alto rendimiento a peces en un formato de placa de 96 pocillos, o un agente químicoseleccionado administrado a un grupo de peces en una placa Petri.
2. Después se investiga en el pez la desviación de la patología inicial.
En el cribado son muy deseables las siguientes etapas adicionales y su uso se proporciona por la presente invenciónen realizaciones preferidas:
En lugar de añadir un solo agente químico, se añade una combinación de agentes químicos. Por ejemplo, puedeadministrarse a todos los peces un agente terapéutico conocido a una dosis a la que aún pueda detectarse un efectobeneficioso adicional. Después se añade una biblioteca química aleatoria al pez y se investiga un efecto en aumento.
1. Inducir una patología autoinmune por medio de la administración de anticuerpos a un pez.
2. Administrar fármaco 1 a la fila 1, fármaco 2 a la fila 2, etc.
3. Administrar fármaco 1 a la columna 1, fármaco 2 a la columna 2, etc.
4. Comparar el efecto inmunosupresor de todos los pocillos con el de los fármacos cuando se administran solos.
Otra realización de lo anterior permite la detección del aumento de un fármaco particular por medio de una muta-ción particular, como se indica a continuación:
1. Inducir una mutación genética por medio de cualquiera de los puntos anteriores.
2. Inducir una patología por medio de cualquiera de los puntos anteriores.
3. Administrar el compuesto químico de ensayo.
4. Evaluar si la combinación de la mutación más el agente químico tiene un efecto mayor que cuando se administransolos.
5. El gen mutado después se usa a continuación como diana beneficiosa, como se ha descrito anteriormente.
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Otra realización de la invención permite la identificación de factores genéticos que ayudan a determinar la ido-neidad de un agente terapéutico particular para un paciente dado. Si la mutación aumenta el efecto del fármaco, sebusca esa mutación en homólogos humanos. A los pacientes con esta mutación se les debe recetar preferentemente elfármaco. Si la mutación produce un efecto perjudicial o ausencia de efecto, entonces los pacientes deben evitar estefármaco.
Parte experimental
Se usó colorante azul de Evans (961 Da) para investigar la presencia de BBB en larvas de pez cebra. El azul deEvans se usa en estudios de BBB en roedores y se excluye del cerebro si la BBB está intacta. En roedores, se observauna fuga de azul de Evans después de un traumatismo cerebral.
1) Se inyectó azul de Evans al 2% en solución salina al 0,9% en el saco pericárdico de larvas con edades compren-didas entre dos días después de la fertilización (d.p.f.) y un mes. Como control se inyectó solución salina al 0,9%.
2) Las larvas se dejaron desarrollar durante 6 horas para dejar que el colorante penetrara desde el torrente sanguíneoa los tejidos.
3) Las larvas se visualizaron con un microscopio de disección fluorescente (filtro TRITC) para asegurar que elcolorante estaba presente en los vasos sanguíneos.
4) Las larvas se anestesiaron y se fijaron en PFA al 4% a 4ºC durante una noche.
5) Se incluyeron en O.C.T. (compuesto de temperatura óptima de corte) y se tomaron secciones congeladas de 10µm en el plano parasagital.
6) Las secciones centrales se visualizaron en un microscopio fluorescente (filtro TRITC) a 40x. Se tomaron imá-genes de muestras a las que se les había inyectado azul de Evans y solución salina.
7) La intensidad de fluorescencia se midió en 3 regiones de control y muestras en las que se había inyectado azulde Evans usando el software Analysis. Se calculó la intensidad media de fluorescencia para cada grupo de edad.
8) Se comparó la intensidad media de fluorescencia en los que se había inyectado azul de Evans frente a loscontroles con solución salina por medio de un histograma (figura 2).
Resultados
Un alto nivel de fluorescencia en el cerebro en 3 d.p.f. indicó que el azul de Evans entraba en el cerebro y queno se había establecido la BBB. A la edad de 5 d.p.f., la fluorescencia del cerebro en las muestras a las que se leshabía inyectado azul de Evans no fue diferente de las muestras que habían recibido inyecciones de solución salina,demostrando que el azul de Evans se excluía e indicando que la BBB se había desarrollado a la edad de 5 d.p.f.
Métodos
Cría
Se recogieron embriones procedentes del emparejamiento de adultos (cepas TL, AB y WIK), criados en condicio-nes convencionales (Westerfield, 1995). Los embriones se criaron en un medio de embrión (NaCl 5 mM, KCl 0,17mM, CaCl2 0,33 mM, Mg2SO4 0,33 mM, azul de Metileno al 10−5%) y se clasificaron usando un criterio convencional(Kimmel et al., 1995).
Experimentos de exclusión de colorante
Se prepararon soluciones madre para inyección de azul de Evans al 2% en solución salina al 0,9% y fluoresceínasódica al 10% en solución salina al 0,9% y se almacenaron a 4ºC. Las larvas se anestesiaron por inmersión en 0,2mg/ml de ácido 3-aminobenzoico (MS222) antes de inmovilizarse y orientarse en metilcelulosa al 3% en medio deembrión en una posición lateral de manera que el corazón fuera accesible. En larvas y juveniles de 2 días despuésde la fertilización (d.p.f.) a 30 d.p.f. se inyectaron en la región pericárdica de 0,5 a 2 nl de colorante o control desolución salina, dependiendo de la edad, usando un aparato de microinyección de huevos de pez cebra convencional(Westerfield, 1995). Los peces se transfirieron a medio de embrión nuevo para que se recuperaran de la anestesia ydespués se visualizaron usando un microscopio de disección de fluorescencia a intervalos de 1 hora para determinar elmomento de captación del colorante en la circulación y el momento en el que el colorante se había infiltrado desde lacirculación al tejido corporal no vascular. Se anestesiaron las larvas en las que se había inyectado colorante y soluciónsalina a las 4 horas y 6 horas después de la inyección y se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS. Se incluyeron 10larvas por grupo de edad y tratamiento con inyección en Compuesto OCT Sakura Tissue-Tek (Bayer, Newbury, UK)y se cortaron secciones parasagitales congeladas con un espesor de 10 µm.
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Cuantificación de fluorescencia del colorante
Las secciones se visualizaron sin medio de montaje por microscopía de fluorescencia en un microscopio OlympusBX51. Se identificaron tres secciones sagitales centrales de cada larva y se capturaron imágenes usando una cámaraColorView (Olympus) y el software AnalySis (Soft Imaging System). Se cuantificó la intensidad de fluorescenciadentro del cerebro para cada sección central de cada larva en cada grupo de tratamiento usando mediciones del umbralde color y de área en AnalySis. Los valores medios, las desviaciones estándar y los ensayos T se calcularon usando elsoftware Excel (Microsoft Office).
Microscopía Electrónica de Transmisión
Se fijaron larvas a 3, 5, 8 y 10 d.p.f. en glutaraldehído al 4% en tampón cacodilato que contenía peróxido dehidrógeno al 0,006% durante 3 horas, y posteriormente se lavaron en tampón cacodilato antes de la fijación posterioren tetróxido de osmio. Las muestras se tiñeron de forma generalizada con acetato de uranilo, se deshidrataron en etanoly se incluyeron en resina de Spurr. Se prepararon secciones finas (5 nm) con un Leica Ultracut UCT, se tiñeron conacetato de uranilo y citrato de plomo y se visualizaron en un microscopio electrónico Philips CM100 a 80 KV.
Expresión de pgp
Se fijaron las larvas a 3, 5, 8 y 10 d.p.f. en PFA al 4% y se procesaron para el crioseccionamiento como se hadescrito anteriormente. Después se lavaron secciones de 10 µm en PBS y se realizó tinción con anticuerpo contra pgp(Abcam) a una dilución 1:100 y la tinción se detectó usando un anticuerpo secundario fluorescente Alexa 568 (Mole-cular Probes). Las secciones se tiñeron con un colorante de contraste y se montaron usando Vectamount que conteníaDAPI (Vector Laboratories, Peterborough, UK) y después se visualizaron usando un microscopio Olympus BX51 coniluminación fluorescente. Las imágenes representativas se capturaron usando una cámara ColorView (Olympus) y unsoftware AnalySis (Soft Imaging System).
Experimentos de exposición de fármacos y distribución
Se transfirieron aproximadamente 100 larvas a un solo pocillo de una placa de 12 pocillos (Corning) que conteníanmedio de embrión. El volumen final del medio de embrión por pocillo se ajustó a 1,5 ml. Los compuestos de interésse prepararon como soluciones madre congeladas a 2 mg/ml en DMSO. Se añadieron 11,25 µl de solución madre acada pocillo para dar una concentración final de 15 µg/ml. Las larvas se incubaron con el fármaco durante 1 hora atemperatura ambiente y después se anestesiaron en hielo. Para el análisis de captación completo, las larvas anestesiadasse transfirieron a pequeños tubos de microcentrífuga y se retiró todo el exceso de líquido. Para el análisis de captaciónen el cerebro frente al cuerpo, las larvas se anestesiaron por enfriamiento y después se decapitaron usando tijeras finaspara iridectomía. Se recogieron muestras de tejido cefálico y corporal en tubos de microcentrífuga separados en hieloy se retiró todo el exceso de líquido. Se midió el peso total de la muestra de tejido. Las muestras después se congelarona -20ºC antes de la extracción para HPLC. Para el análisis de HPLC posterior, se descongelaron muestras de tejido yse realizó una extracción inicial usando terc-butilmetiléter (t-bme). Después se evaporó el extracto de disolvente y sereconstituyó en tampón acetato 1 M, pH 4,7. Se obtuvo una limpieza adicional usando un procedimiento de extracciónen fase sólida de modo mixto (intercambio catiónico). El eluato se evaporó y se reconstituyó en metanol/ácido acético.Se realizaron inyecciones de 10 ml de muestras extraídas en un sistema LCMS usando una columna analítica WatersSymmetryShield (150 x 3,9) RP8. Las muestras se analizaron por LCMS/MS de exploración completa en condicionesde APCI en modo de ion positivo. Las condiciones de LC se proporcionan en la Tabla 1. Los parámetros de exploraciónde MS/MS se proporcionan en la Tabla 2.
Fueron necesarias modificaciones adicionales para la extracción de simvastatina y pravastatina, ya que se realizaroninyecciones de 10 µl en el sistema de LCMS usando una columna analítica Luna C18 (5 x 4,6). Las muestras seanalizaron por LCMS/MS de exploración completa en condiciones de ESI en modo de ion positivo para simvastatinay en modo de ion negativo para pravastatina. Las condiciones de LC se proporcionan en la Tabla 3. Los parámetros deexploración de MC se proporcionan en la Tabla 4.
El efecto de inhibición de pgp sobre la distribución de rodamina 123
Se disolvió rodamina 123 en EtOH al 10% en solución salina al 0,9% para obtener una solución madre de 0,5mg/ml. Se realizaron experimentos de exclusión de colorante en larvas a 3, 5, 8 y 10 d.p.f. como se ha descritoanteriormente usando 0,5 mg/ml de rodamina 123 en presencia o ausencia de verapamil. Las larvas se expusieron averapamil a 50 µg/ml durante 2 horas antes y durante la inyección intrapericárdica del colorante y durante 3 horasdespués de la inyección. Tres horas después de la inyección, las larvas se anestesiaron y se fijaron en PFA al 4% antesdel procesamiento para obtener las secciones congeladas. La cuantificación de fluorescencia en el cerebro se realizócomo se ha descrito anteriormente.
Análisis del comportamiento después de la exposición al fármaco
Se transfirieron larvas a 3, 5 y 10 d.p.f. a placas de 96 pocillos (Millipore) que contenían medio de embrión. Elanálisis del comportamiento se realizó en placas de 96 pocillos con un pez por pocillo. El volumen final de medio deembrión por pocillo se ajustó a 200 µl. Se obtuvieron soluciones madre de compuestos de ensayo a una concentración
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de ensayo 100x. Los compuestos de ensayo eran fármacos antihistamínicos seleccionados basándose en su capacidadde atravesar la BBB en mamíferos; difenhidramina, un fármaco sedante que atraviesa la BBB; y desloratidina, unfármaco no sedante que no atraviesa la BBB. En cada pocillo de la placa de cribado se añadieron 2 µl de soluciónmadre de compuesto de ensayo. Se prepararon 12 pocillos para cada compuesto en cada edad larvaria. La actividad seregistró con pocillos individuales de la placa de 96 pocillos durante un periodo de 2 horas usando un equipo y softwareEthovision TrackSys. Se calculó la actividad total media para cada grupo de tratamiento en cada edad larvaria usandoun software Excel.
Resultados
El pez cebra muestra indicios anatómicos de una barrera hematoencefálica
TEM a 3 d.p.f. no muestra ningún indicio de uniones estrechas. Por el contrario, TEM a 5 d.p.f. muestra queestán presentes uniones estrechas en parte pero no en todo el endotelio vascular, produciéndose posteriormente unamaduración gradual.
El pez cebra posee un ortólogo de pgp
La clonación in silico identificó un ortólogo de pez cebra potencial de pgp humana.
El pez cebra expresa PGP de una forma regulada en el desarrollo
Pgp se expresa en el endotelio vascular del SNC a 8 d.p.f. y fases posteriores.
La formación de una barrera hematoencefálica se correlaciona con cambios en el desarrollo de la distribución defármacos
Los fármacos que no atraviesan la BBB están presentes en todo el cuerpo de muestras a 3 d.p.f., pero se excluyende la cabeza a 10 d.p.f. Los fármacos que atraviesan la BBB se distribuyen igualmente en muestras a 3 d.p.f. y a 10d.p.f.
La intensidad de fluorescencia del compuesto de ensayo y el agente de control se midió en el cerebro del pez cebradespués de una inyección periférica en diversos puntos de tiempo. La fluoresceína sódica, al igual que otras moléculaspequeñas ensayadas, se infiltra en el cerebro hasta el día 8, pero se excluye desde el día 10.
Por el contrario, el Azul de Evans, una molécula mucho mayor que se sabe que forma multímeros, se excluye delcerebro desde el día 5.
La presencia de una barrera hematoencefálica se correlaciona con los efectos funcionales de los fármacos
Se observó que ciertos antihistamínicos que se sabía que no eran sedantes en seres humanos debido a su exclusióndel cerebro no tenían un efecto sedante en el pez cebra d10, a diferencia de los antihistamínicos conocidos por tenerun efecto sedante en seres humanos basándose en su penetración en el cerebro, que también tenían un efecto sedanteen el pez cebra d10.
El pez cebra muestra el transporte activo de compuestos a través de la barrera hematoencefálica
R123 es rodamina 123, un sustrato fluorescente para pgp. La coadministración de verapamil, un inhibidor de pgp,conduce a la penetración de rodamina 123 en el cerebro en puntos de tiempo cuando de otra manera se excluiría,demostrando una salida activa de rodamina 123.
Discusión
El pez cebra tiene una barrera hematoencefálica (BBB) regulada durante el desarrollo
La creación de un compartimento selectivo por medio de la formación de una barrera epitelial utiliza dos tipos deuniones: uniones herméticas y uniones tabicadas. Las dos uniones son selectivas y dinámicas y pueden asociarse aseñales y rutas intracelulares a través de proteínas asociadas a la membrana.
Las barreras epiteliales de cerebro de los peces se han estudiado anatómicamente en varias especies por micros-copía electrónica (Nakao, 1979). Con microscopía electrónica de secciones ultrafinas, aparecen uniones estrechas enla zona de contacto completo entre las membranas plasmáticas de células adyacentes (Farquhar y Palade, 1965). Trasuna electromicroscopía de fractura por congelación, aparecen como una red anastomótica continua de cadenas deuniones estrechas de salientes y ranuras complementarias (Staehelin, 1974). Rascher y Wolburg (Rascher y Wolburg,1997) examinaron secciones ultrafinas de carpa adulta y mostraron uniones estrechas y huecos y desmosomas en lamembrana aracnoidea. El mismo documento demostró una maduración gradual de las uniones estrechas en el polluelo.Concluyen su discusión con la siguiente afirmación (última frase, última página): la gran variabilidad de la anatomíade las capas meníngeas en vertebrados y - como hemos demostrado aquí - de la estructura de unión estrecha dificulta
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el esclarecimiento del mecanismo de la inducción de la barrera aracnoidea y la transferencia de un resultado de unaespecie a otra.
A través de la administración periférica de fluoresceína sódica, de peso molecular 376 Da, se ha podido demostrarque el pez cebra efectivamente tiene una barrera hematoencefálica. Ésta empieza a formarse el día 5, con el resultado deque a partir de este momento se excluyen moléculas de mayor tamaño tales como el azul de Evans (que algunas vecespuede formar multímeros). La BBB permanece permeable, sin embargo, a pequeñas moléculas tales como moléculaspequeñas de tipo fármaco hasta que la BBB ha madurado adicionalmente en el día 10, a menos que haya una salidaactiva por pgp, en cuyo caso la exclusión eficaz se produce a partir del día 8.
La BBB del pez cebra posee sistemas de transporte activo funcionales
Un buen ejemplo clínico del papel de expulsión de la glicoproteína p es la explicación de los efectos no sedantesde antihistamínicos de segunda generación, saliendo éstos activamente desde el cerebro a diferencia de sus homólogosde primera generación (Chen et al., 2003). Por ejemplo, la hidroxizina, la difenhidramina y la triprolidina son antihis-tamínicos sedantes, mientras que la loratadina, la desloratadina (el metabolito activo de la loratadina) y la cetirizina(el metabolito activo de la hidroxizina) son no sedantes.
La pgp está presente en células epiteliales especializadas en la secreción y excreción de moléculas indeseadas,particularmente en el intestino, hígado, riñón y BBB. Las glicoproteínas p experimentan modificaciones postraduccio-nales extensas, incluyendo la fosforilación y la glicosilación. Hay al menos 3 tipos de glicoproteína p en mamíferos.Bard (aquatic toxicology, 2000) resume la expresión de proteínas de tipo pgp en peces en la figura 2, aunque no indicala expresión de BBB.
En el presente documento se han proporcionado pruebas tanto anatómicas como funcionales del transporte activode moléculas a través de la barrera hematoencefálica en el pez cebra. De esta manera, aunque moléculas pequeñasque no son sustratos de la pgp pueden atravesar la BBB hasta el día 10, las que son sustratos de pgp se expulsanactivamente a partir del día 8.
Un modelo de pez cebra para la penetración de compuesto a través de la BBB
Los intentos de predecir la penetración de fármacos a través de las membranas incluyen la medición del repartode fármacos en disolventes; aunque la perfusión a través de disolventes no es idéntica a la difusión a través de lasmembranas biológicas, no olvidemos la falta de información sobre los sistemas de transporte activos (Lieb y Stein,1976). De hecho, como resultado de proteínas de transporte tales como las glicoproteínas p, los efectos netos de unadiversidad de fármacos hidrófobos, tales como digoxina, ciclosporina y loperamida, es relativamente baja (Schinkel etal., 1996).
Los modelos de barrera hematoencefálica que implican sistemas de cultivo de células juegan algún papel en laevaluación de si los fármacos pueden atravesar la barrera hematoencefálica, pero son limitados, ya que los sistemasde transporte y las enzimas de la barrera hematoencefálica pueden regularse negativamente de forma severa o no estarpresentes en absoluto (Terasaki et al., 2003). Además, no forman uniones herméticas rígidas.
El pez cebra, por lo tanto, puede emplearse de manera muy útil para determinar si un compuesto atraviesa la BBBen una situación in vivo. Además, estos resultados permiten la investigación racional de pequeñas moléculas paracriterios de valoración del SNC y oftalmológicos en el pez cebra.
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REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de cribado para obtener una sustancia con actividad biológica en el sistema nervioso central(SNC), cerebro u ojo, comprendiendo el procedimiento:
administrar una sustancia de ensayo a un pez cebra de ensayo
determinar el efecto de la sustancia de ensayo sobre la actividad o función del sistema nervioso central, cerebro uojo, o el efecto de la sustancia de ensayo sobre un síntoma o una enfermedad o trastorno del sistema nervioso central,cerebro u ojo del pez de ensayo,
identificando de esta manera una sustancia con dicha actividad biológica;
donde
se sabe que la sustancia de ensayo atraviesa la barrera hematoencefálica y el procedimiento se realiza en pez cebrade cualquier edad;
o se sabe que la sustancia de ensayo no atraviesa la barrera hematoencefálica y el procedimiento se realiza en pezcebra con una edad menor de cinco días desde la fertilización para moléculas de 960 daltons o más, menor de diez díasdesde la fertilización para moléculas de menos de 960 daltons no expulsadas por la glicoproteína p (pgp), o menorde 8 días desde la fertilización para moléculas expulsadas de forma activa por pgp, y/o se realiza en pez cebra conuna edad de al menos cinco días desde la fertilización para moléculas de 960 daltons o más, o al menos diez díasdesde la fertilización para moléculas de menos de 960 daltons no expulsadas por la pgp y al menos ocho días desdela fertilización para moléculas expulsadas activamente por la pgp, y comprende la liberación directa de la sustancia deensayo para evitar la barrera hematoencefálica;
o, sin saber si la sustancia de ensayo puede o no atravesar la barrera hematoencefálica, el procedimiento se realizaen un pez cebra con una edad de al menos cinco días desde la fertilización para moléculas de 960 daltons o más, y almenos diez días desde la fertilización para moléculas de menos de 960 daltons, con la liberación directa de la sustanciade ensayo para evitar la barrera hematoencefálica;
donde las edades indicadas se refieren al pez cebra criado en condiciones convencionales y se ajustan si el pezcebra se cría en condiciones que aceleran o retrasan la consecución de una fase de desarrollo equivalente.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha liberación directa comprende la inyección en elcerebro o el ojo.
3. Procedimiento de cribado para obtener una sustancia con actividad biológica en el sistema nervioso central(SNC), cerebro u ojo, comprendiendo el procedimiento:
administrar una sustancia de ensayo a un pez cebra de ensayo,
determinar el efecto de la sustancia de ensayo sobre una actividad o función del sistema nervioso central, cerebro uojo, o el efecto de la sustancia de ensayo sobre un síntoma o una enfermedad o trastorno del sistema nervioso central,cerebro u ojo del pez de ensayo,
identificando de esta manera una sustancia con dicha actividad biológica;
donde el procedimiento se realiza para moléculas de 960 daltons o más en pez cebra con una edad menor de cincodías desde la fertilización y en pez cebra con una edad de al menos cinco días desde la fertilización, o se realiza paramolécula de menos de 960 daltons en pez cebra con una edad menor de diez días desde la fertilización y en pez cebracon una edad de al menos diez días desde la fertilización, sin la liberación directa de la sustancia de ensayo paraevitar la barrera hematoencefálica, con lo que se obtiene una sustancia que tiene dicha actividad biológica y tiene lacapacidad de atravesar la barrera hematoencefálica;
donde las edades indicadas se refieren al pez cebra que se ha criado en condiciones convencionales y se ajustan siel pez cebra se cría en condiciones que aceleran o retrasan la consecución de la fase de desarrollo equivalente.
4. Procedimiento para obtener una sustancia con actividad biológica en el sistema nervioso central (SNC), cerebrou ojo, comprendiendo el procedimiento un ensayo de cribado llevado a cabo administrando una sustancia de ensayo aun pez cebra de ensayo, con lo que se obtiene una sustancia con dicha actividad biológica, donde el diseño del ensayode cribado emplea un algoritmo formulado para tener en cuenta la presencia y el momento de la formación de unabarrera hematoencefálica en el pez cebra.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, donde el algoritmo se formula adicionalmente para tener encuenta si la sustancia de ensayo atraviesa o no la barrera hematoencefálica.
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6. Procedimiento de cribado para una sustancia con actividad biológica en el sistema nervioso central (SNC),cerebro u ojo sustancialmente como se presenta en la figura 1.
7. Uso de la existencia y el momento de formación de una barrera hematoencefálica en un pez cebra en el diseñode un ensayo para cribado de una sustancia con actividad biológica en el sistema nervioso central (SNC), cerebro uojo.
8. Procedimiento de cribado para obtener una sustancia con actividad biológica, sustancia que no atraviesa labarrera hematoencefálica, comprendiendo el procedimiento:
administrar una sustancia de ensayo al pez cebra de ensayo y
determinar el efecto de la sustancia de ensayo sobre la actividad o función en el pez cebra o el efecto de la sustanciade ensayo sobre un síntoma o una enfermedad o un trastorno en el pez cebra,
identificando de esta manera una sustancia con dicha actividad biológica,
donde el procedimiento comprende además determinar la capacidad o incapacidad de la sustancia con dicha activi-dad biológica de atravesar la barrera hematoencefálica en el pez cebra de ensayo con una edad de al menos cinco díasdesde la fertilización para moléculas de 960 daltons o más, o al menos diez días desde la fertilización para moléculasde menos de 960 daltons, identificando de esta manera una sustancia con dicha actividad biológica y que no atraviesala barrera hematoencefálica;
donde las edades indicadas se refieren al pez cebra que se ha criado en condiciones convencionales y se ajustan siel pez cebra se cría en condiciones que aceleran o retardan la consecución de la fase de desarrollo equivalente.
9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende identificar la sustancia con dicha actividadbiológica en un pez cebra de ensayo con una edad menor de cinco días desde la fertilización para una molécula de 960daltons o más, menor de diez días desde la fertilización para una molécula de menos de 960 daltons que no se expulsapor pgp o menor de ocho días desde la fertilización para una molécula que se expulsa de forma activa por pgp; dondelas edades indicadas se refieren al pez cebra criado en condiciones convencionales y se ajustan si el pez cebra se críaen condiciones que aceleran o retrasan la consecución de la fase de desarrollo equivalente.
10. Uso de la existencia y el momento de formación de una barrera hematoencefálica en un pez cebra en el diseñode un ensayo para el cribado de una sustancia con actividad biológica y que no atraviesa la barrera hematoencefálica.
11. Procedimiento o uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende deter-minar si una sustancia de ensayo se transporta activamente a través de la barrera hematoencefálica.
12. Procedimiento o uso de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende determinar si una sustancia de ensayose transporta activamente al interior del cerebro.
13. Procedimiento o uso de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende determinar si una sustancia de ensayose transporta activamente al exterior del cerebro.
14. Procedimiento o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende determinarsi una sustancia de ensayo es transportada por la glicoproteína p.
15. Procedimiento o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende determinarsi una sustancia de ensayo interfiere en la función de la glicoproteína p.
16. Procedimiento o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende determinarsi una sustancia de ensayo altera la expresión de la glicoproteína p.
17. Procedimiento o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde la sustancia de ensayose evalúa tanto antes como después del desarrollo de glicoproteínas p funcionales.
18. Procedimiento o uso de acuerdo con la reivindicación 17, donde la sustancia de ensayo se evalúa el día 8 ó 9después de la fertilización, así como el día 10 o posterior, donde las edades indicadas se refieren al pez cebra que seha criado en condiciones convencionales y se ajustan si el pez cebra se cría en condiciones que aceleran o retrasan laconsecución de la fase de desarrollo equivalente.
19. Procedimiento o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende determinarsi una combinación de sustancias de ensayo ha alterado la penetración a través de la BBB en comparación con unasustancia de ensayo administrada sola.
20. Procedimiento o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende determinarlos gradientes de concentración de fármaco cuerpo:cerebro.
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21. Procedimiento o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende comparareficacias relativas de sustancias de ensayo con la actividad deseada en el sistema nervioso central en presencia de unabarrera hematoencefálica.
22. Procedimiento o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende determinarla penetración de una sustancia de ensayo a través de la barrera sangre-retina.
23. Procedimiento o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende determinarsi una sustancia de ensayo es metabolizada por la barrera hematoencefálica.
24. Uso del pez cebra para determinar si una sustancia de ensayo se transporta activamente a través de la barrerahematoencefálica.
25. Uso del pez cebra para determinar si una sustancia de ensayo se transporta activamente al interior del cerebro.
26. Uso del pez cebra para determinar si una sustancia de ensayo es transportada activamente al exterior del cerebro.
27. Uso del pez cebra para determinar si una sustancia de ensayo se transporta a través de la barrera hematoence-fálica por la glicoproteína p.
28. Uso del pez cebra para determinar si una sustancia de ensayo interfiere con la función de la glicoproteína p.
29. Uso del pez cebra para determinar si una sustancia de ensayo altera la expresión de la glicoproteína p.
30. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, donde la sustancia de ensayo se evalúa tantoantes como después del desarrollo de glicoproteínas p funcionales.
31. Uso de acuerdo con la reivindicación 30, donde la sustancia de ensayo se evalúa el día 8 ó 9 después de lafertilización, así como el día 10 o posterior, donde las edades indicadas se refieren al pez cebra que se ha criado encondiciones convencionales y se ajustan si el pez cebra se cría en condiciones que aceleran o retrasan la consecuciónde una fase de desarrollo equivalente.
32. Uso del pez cebra para determinar si una combinación de sustancias de ensayo ha alterado la penetración através de la BBB en comparación con una sustancia de ensayo administrada sola.
33. Uso del pez cebra para determinar gradientes de concentración de fármaco cuerpo:cerebro.
34. Uso del pez cebra para comparar eficacias relativas de sustancias de ensayo con actividad deseada en el SNCen presencia de una barrera hematoencefálica.
35. Uso del pez cebra para determinar la penetración de una sustancia de ensayo a través de la barrera sangre-retina.
36. Uso del pez cebra para determinar si una sustancia de ensayo es metabolizada por la barrera hematoencefálica.
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