us6858742 ftalimida
TRANSCRIPT
-
8/9/2019 US6858742 Ftalimida
1/9
US006858742B2
1 2 ) United
States
Patent 1 0 ) P a t e n t N 0 . 2 US
6 , 8 5 8 , 7 4 2 B2
Chou e t a l . 4 5 )
Date
o f P a t e n t : F e b . 2 2 , 2 0 0 5
( 5 4 )
DNA
LABELING REAGENTS, ( 5 1 )
I n t . Cl?
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C07D
93/04
ACRIDINIUM-9-CARBOXAMIDE
( 5 2 )
US. l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 549/282; 546/104; 546/105;
DERIVATIVES
AND
PROCESS OF 5 4 6 / 3 0 3 ;
4 3 6 / 6
PREPARING DNA LABELING OMPOUNDS ( 5 8 ) F i e l d Of Search . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 549/282; 546/104
( 7 5 ) I n v e n t o r s : Georg e Chin-Sheng Chou, H s i n - S h i
( T W ) ;
Y u - C h e n g Wu, H s i n - S h i
( T W ) ; 5 6 ) R e f e r e n c e s C lt e d
PO'Ya H s u ’ H s i n ' s h i (TW) U . S . PATENT DOCUMENTS
( 7 3 ) Assignee:
ASiaGEN Corporatiom Tainan Hsien 4 , 3 1 2 , 8 8 3 A * 1 / 1 9 8 2 B a c c i c h e t t i e t a l . . . . . . .
5 1 4 / 4 5 5
( 1 “ )
. . . . _ * Cited by examiner
* ) N o t i c e :
S u b J e c t
t o a n y d i s c l a i m e r ,
t h e
t e r m
o f
t h i s
p a t e n t
i s
e x t e n d e d o r a d j u s t e d u n d e r 3 5
P r i m a r y
Examiner_Evelyn Mei
Huang
U ' S ' C ' 1 5 4 k ) )
b y 0 d a y s ‘ 7 4 )
A t t o r n e y , A g e n t ,
o r
F i r m — T r o X e l l LaW O f ? c e , PLLC
2 1 )
A p p l . N o . : 1 0 / 6 8 9 , 5 8 6
5 7 ) ABSTRACT
( 2 2 ) F i l e d ?
O c t - 2 2
2 0 0 3
T h e p r e s e n t i n v e n t i on
r e l a t e s t o DNA
a b e l i n g r e a g e n t s
( 6 5 )
P r i o r
P u b l i c a t i o n
Data
c o m p r i s i n g
a
f u r o c o u m a r i n
d e r i v a t i v e
a n d
a
d e t e c t a b l e
group W i t h
o r
W i t h o u t bound
v i a
a
b i n d i n g e n h a n c e r ,
and
s 2004/0219564
A1 N O V - 4 , 2004 acridinium-9-carboXamide d e r i v a t i v e s
f o r use a s chemilu
minescent l a b e l s . The
p r e s e n t i n v e n t i o n
a l s o r e l a t e s t o a
R e l a t e d US‘ A p p l i c a t i o n D a t a
p r o c e s s
o f
p r e p a r i n g
DNA a b e l i n g c o m p o u n d .
( 6 2 ) D i v i s i o n o f a p p l i c a t i o n N o . 1 0 / 4 2 8 , 1 3 7 ,
? l e d
o n
May 2 ,
2 0 0 3 . 6
C l a i m s , 3
Drawing S h e e t s
-
8/9/2019 US6858742 Ftalimida
2/9
-
8/9/2019 US6858742 Ftalimida
3/9
-
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4/9
-
8/9/2019 US6858742 Ftalimida
5/9
US 6 , 8 5 8 , 7 4 2 B2
1
DNA
ABELING REAGENTS,
ACRIDINIUM-9-CARBOXAMIDE
DERIVATIVES
AND PROCESS
OF
PREPARING
DNA
LABELING
COMPOUNDS
T h i s
a p p l i c a t i o n
i s
a
D i v i s i o n a l
a p p l i c a t i o n
o f
US.
n o n p r o v i s i o n a l
a p p l i c a t i o n
S e r .
N o .
1 0 / 4 2 8 , 1 3 7 ,
? l e d
May ,
2 0 0 3 .
FIELD OF THE INVENTION
The p r e s e n t i n v e n t i on r e l a t e s
t o
DNA a b e l in g r e a g e n t s
and acridinium-9-carboXamide
d e r i v a t i v e s
f o r use a s chemi
l u m i n e s c e n t
l a b e l s .
The p r e s e n t i n v e n t i on
a l s o
r e l a t e s
t o a
p r o c e s s
o f
p r e p a r i n g DNA
a b e l i n g
c o m p o u n d .
BACKGROUND OF THE INVENTION
I t ’ s W e l l knoWn h a t , a n g e l i c i n ,
a n a n g u l a r
f u r o c o u m a r i n ,
c o u l d b i n d
t o
d o u b l e s t r a n d DNA h r o u g h
t h e
UV a d i a t e d
a t 365 nm. The mecha nism
i n v o l v e d
t h e
[ 2 + 2 ]
c y c l o a d d i t i o n
b e t W e e n
3 , 4 )
o r
( 4 , 5 ) - d o u b l e b o n d s o f
t h e
f u r o c o u m a r i n a n d
t h e
5 , 6 d o u b l e bond o f p y r i m i d in e b a s e o n
t h e
d o u b l e
s t r a n d
DNA. T h i s p h o t o r e a c t i o n i s d i r e c t e d t o tWo s t e p s r e a c t i o n .
The
? r s t
s t e p i s f u r o c o u m a r i n
and DNA
o r m a t i o n o f
a
m o l e c u l a r
c o m p l e x .
The s u b s e q u e n t i r r a d i a t i o n o f t h e
com
p l e X m o l e c u l e s a t UV 65 nm e a d s
t o c o v a l e n t
b i n d i n g o f
f u r o c o u m a r i n s t o
DNAs.
L . M u s a j o e t
a l . ,
“ P h o t o r e a c t i o n s
a t
3655A
betWeen
pyrimidine bases and skin
p h o t o s e n s i t i Z i n g f u r o c o u m a r i n s ,
P h o t o c h e m i s t r y a n d
P h o t o b i o l o g y ” ,
V o l . 6 , p p 7 1 1 — 7 1 9 , 6 ( 1 9 6 7 )
a n d G .
R o d i g h i e r o , e t a l , “ M e c h a n i s m o f s k i n - p h o t o s e n s i t i Z a t i o n b y
f u r o c o u m a r i n s : p h o t o r e a c t i v i t y o f v a r i o u s f u r o c o u m a r i n s
W i t h n a t i v e
DNA
n d
W i t h
r i b o s o m a l RNA”,
B i o c h i m .
B i o p h y s .
A c t a , 2 1 7 ,
4 0
1 9 7 0 ) .
S e v e r a l d e r i v a t i v e s
o f
t h e a n g e l i c i n
h a v e
b e e n s y n t h e s i Z e d
a n d c o m p a r e d t h e i r b i n d i n g
a b i l i t y t o DNA, i n c l u d i n g
4 ‘
(hydroXymethyl)-4, 5‘-dimethylangelicin, 4 ‘
( m e t h o X y m e t h y l ) - 4 , 5 ‘ - d i m e t h y l a n g e l i c i n ,
a n d t h e h y d r o
c h l o r i d e o f 4 ‘ - ( a m i n o m e t h y l ) - 4 , 5 ‘ - d i e m t h y l a n g e l i c i n .
T h e
more W a t e r
s o l u b i l i t y
o f furocoumarin shoW ed more b i n d i n g
a b i l i t y
t o t h e DNA. D a l l ’ A c q u a ,
e t . a l . ,
“NeW
monofunc
t i o n a l
r e a g e n t s
f o r DNA s p o s s i b l e
a g e n t s
f o r t h e p h o t o
chemotoerapy o f p s o r i a s i s : D e r i v a t i v e s o f 4 , 5 ‘
d i m e t h y l a n g e l c i n ” ,
J .
M e d . C h e m . 1 9 8 1 ,
2 4 , 1 7 8 — 1 8 4 ) .
F u r o c o u m a r i n s ,
Which a r e
l i n k e d
t o
b i o t i n W i t h t h e
s u i t
a b l e s p a c e r m o l e c u l e s , h a v e
been
shoWn o b e
v e r y s u i t a b l e
f o r
t h e
p h o t o b i o t i n y l a t i o n o f
n u c l e i c a c i d s .
A f t e r h y b r id iZ a
t i o n t o
a
gene p r o b e W i t h
a
complementary n u c l e i c
a c i d
s e q u e n c e , a n d a
s e p a r a t i o n s t e p , d e t e c t i o n
t a k e s p l a c e , f o r
e X a m p l e
b y a d d i t i o n o f a c o m p l e x o f
a n t i b i o t i n
a n t i b o d y o r
a v i d i n o r s t r e p t a v i d i n W i t h a l k a l i n e
p h o s p h a t a s e .
F o r t h e
d e t e c t i o n , a c o l o r r e a c t i o n , Which i s
e l i c i t e d by
a l k a l i n e
p h o s p h a t a s e , i s c a r r i e d o u t
i n
a n a d d i t io n a l s t e p
J . J . L e a r y ,
D .
J .
B r i g a t i ,
D .
C .
W a r d ,
P r o c .
N a t l .
A c a d .
S c i .
USA
0 ,
4 0 4 5 — 4 0 4 9 1 9 8 3 ) ) .
I n t h e
d e s c r i p t i o n
o f US.
P a t . N o .
5 , 6 1 6 , 7 3 1 ,
o n e
d i s a d
v a n t a g e o f t h e d e t e c t i o n s y s t e m u s i n g b i o t i n i s t h e W i d e
d i s t r i b u t i o n o f b i o t i n
i n
b i o l o g i c a l
s y s t e m s . T h i s
d i s a d v a n
t a g e i s a v o i d e d
b y u s i n g ,
f o r e X a m p l e , d i g o X i g e n i n i n s t e a d o f
b i o t i n .
S u r p r i s i n g l y ,
no
d e n a t u r a t i o n o f
t h e n u c l e i c
a c i d s
h a s
b e e n
o b s e r v e d
i n
p h o t o r e a c t i o n s W i t h d i g o X i g e n i n
r e a g e n t s ,
Which a r e l i n k e d t o
furocoumarins
b y
means
o f a s u i t a b l e
s p a c e r .
N i c o l a u s B a h r e t
a l . ,
“A n i t r o X y l
s y n t h a s e
c a t a l y t i c
a n t i b o d y , ” J .
Am.
Chem. S o c . 1 9 9 6 , 1 1 8 , 3550—3555
d e s c r i b e d
t h e u s e
o f
a n
a n t i b o d y
r a i s e d
a g a i n s t a c r i d i n i u m
h a p t e n t o a n a l y Z e t h e r e t r o D i e l s - A l d e r
r e a c t i o n
o f t h e
10
1 5
20
25
30
35
40
45
50
55
60
6 5
2
anthracene-HNO
c y c l o a d d u c t t o r e l e a s e a n t h r a c e n e a n d
n i t r o X y l ( H N O ) .
Maciej AdamcZyk
e t
a l . ,
“Neopentyl
3 - T r i ? y l o X y p r o p a n e s u l f o n a t e ” J . Am.
Chem. S o c .
1 9 9 8 ,
6 3 ,
5 636—5
639 d e s c r i b e d
a
r e a c t i v e s u l f o p r o p y l a t i o n r e a g e n t
f o r
t h e p r e p a r a t i o n o f c h e m i l u m i n e s c e n t l a b e l s .
SUMMARY OF THE INVENTION
The p r e s e n t i n v e n t i o n r e l a t e s t o r e l a t e t o DNA a b e l i n g
r e a g e n t s
and
a c r i d i n i u m
9-carboXamide
d e r i v a t i v e s
f o r
u s e
a s
chemiluminescent
l a b e l s .
The
p r e s e n t
i n v e n t i o n
a l s o r e l a t e s t o a
p r o c e s s o f p r e p a r
i n g DNA
a b e l i n g c o m p o u n d .
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
F I G . 1
i l l u s t r a t e s s y n t h e s i s
o f
a n g e l i c i n - b i n d i n g
e n h a n c e r
b i o t i n .
F I G .
2
i l l u s t r a t e s
s y n t h e s i s
o f 4 ‘ - ( a m i n o m e t h y l ) - 4 ‘ , 5 “
d i m e t h y l a n g e l i c i n .
F I G . 3 i l l u s t r a t e s s y n t h e s i s
o f
9 - ( 4 “ - ( a m i n o m e t h y l ) - 4 ‘ , 5 “
d i m e t h y l a n g e l i c i n ) a c r i d i n i u m
c a r b o X a m i d e .
DETAILED DESCRIPTION OF THE
INVENTION
The
r e s e n t
i n v e n t i o n r e l a t e s t o a DNA a b e l i n g r e a g e n t o f
t h e f o r m u l a :
Wherein Fu r e p r e s e n t s a furocoumarin d e r i v a t i v e s e l e c t e d
f r o m t h e g r o u p c o n s i s t i n g
o f
a n g e l i c i n
d e r i v a t i v e s
a n d
p s o r a l e n
d e r i v a t i v e s ; Wherein BE r e p r e s e n t s none o r a
b i n d i n g e n h a n c e r s e l e c t e d f r o m t h e g r o u p c o n s i s t i n g o f C 4 _ 1 2
a l k y l ,
a l k y e n y l ,
p o l y a l k y l a m i n e a n d
p o l y e t h y l e n e g l y c o l ;
and Wherein D e p r e s e n t s a d e t e c t a b l e g r o u p s e l e c t e d from
t h e g r o u p c o n s i s t i n g
o f :
b i o t i n , ? u o r e s c e n c e , a c r i d i n i u m
e s t e r
and
a c r i d i n i u m - 9 - c a r b o X a m i d e .
F u r o c o u m a r i n s
EP 187 3 3 2
mentions
a number o f l i t e r a t u r e r e f e r e n c e s
t h a t
d e s c r i b e
t h e
s y n t h e s i s o f
f u r o c o u m a r i n s
a n d
t e a c h e s
e l s e W h e r e t h a t o t h e r
f u r o c o u m a r i n s
c a n b e s y n t h e s i Z e d f o l
l o W i n g p u b l i s h e d
p r o c e d u r e s . T h e r e f o r e ,
t h e f o r e g o i n g f u r o
c o u m a r i n s a r e e i t h e r a l r e a d y
knoWn
o r
t h e y
c a n b e p r e p a r e d
i n manner a n a l o g o u s t o t h e knoWn
f u r o c o u m a r i n s .
For
e X a m p l e , a c c o r d i n g t o EP 1 8 7 3 3 2 , Venema t
a l ,
M o l . G e n .
G e n e t , d e s c r i b e a n g e l i c i n . 1 7 9 : 1 ( 1 9 8 0 ) ; 4 , 5 ‘
d i m e t h y l a n g e l i c i n b y V e d a l d i
e t
a l , Chem. i o l . I n t e r a c t . ,
3 6 :
2 7 5
( 1 9 8 1 ) ; p s o r a l e n b y
M a r c i a n i e t
a l , N a t u r f o r s c h B , 2 7 :
1 9 6
1 9 7 2 ) ;
8 - m e t h o X y p s o r a l e n
b y B e l o g n Z o v e t
a l , M u t a t .
R e s . ,
8 4 :
1 1 ( 1 9 8 1 ) ,
a n d
b y S c o t t
e t a l ,
P h o t o c h e m .
P h o t o b i o l . , 3 4 : 6 3 ( 1 9 8 1 ) ; 5-aminomethyl-8
m e t h o X y p s o r a l e n by Hansen
e t
a l , T e t . L e t t . 2 2 :
1847
1 9 8 1 ) ;
4 , 5 , 8 - t r i m e t h y l p s o r a l e n
b y B e n - H u r e t a l , B i o c h e m .
B i o p h y s .
A c t a , 3 3 1 : 1 8 1 1 9 7 3 ) ; a n d
4 ‘ - a m i n o m e t h y l - 4 , 5 , 8
t r i m e t h y l p s o r a l e n b y
I s s a c s e t a l , B i o c h e m . ,
1 6 :
1 0 5 8
1 9 7 7 ) .
O t h e r r e f e r e n c e s d i s c l o s e s y n t h e s i s s c h e m e s
s u i t a b l e
f o r
p r e p a r i n g
f u r o c o u m a r i n s i n c l u d i n g Kaufman
e t a l ,
J . O r g .
C h e m . , 4 5 : 7 3 8 ( 1 9 8 0 ) ;
W u l f f
e t a l , J . Am. Chem. S o c . , 1 1 0 :
7 4 1 9 ( 1 9 8 8 ) ; US. a t . N o .
4 , 9 5 0 , 7 4 4 ,
W h i c h i s s u e d A u g . 2 1 ,
1 9 9 0 ,
t o
D a t t a g u p t a e t a l ; a n d
US.
P a t .
N o . 5 , 0 9 9 , 0 3 1 ,
i s s u e d
M a r .
2 4 ,
1 9 9 2 , t o M i k h a i l e t a l .
I n t h e DNA a b e l i n g
r e a g e n t ,
t h e p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s
o f
f u r o c o u m a r i n s
d e r i v a t i v e s a r e a n g e l i c i n d e r i v a t i v e s . The
f u r t h e r
p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s o f f u r o c o u m a r i n s d e r i v a t i v e s
a r e a c i d s a l t s o f 4 ‘ - ( A m i n o m e t h y l ) - 4 , 5 ‘ - d i m e t h y l a n g e l i c i n .
-
8/9/2019 US6858742 Ftalimida
6/9
US 6 , 8 5 8 , 7 4 2 B2
3
E s p e c i a l l y , t h e h y d r o c h l o r i d e o f 4 ‘ - ( A m i n o m e t h y l ) - 4 , 5 ‘
d i m e t h y l a n g e l i c i n
i s e x c e l l e n t
r e a g e n t
t o b i n d t h e DNA
t h r o u g h t h e
i r r a d i a t i o n
b y UV 6 5 nm a n d showed
good
r e s u l t i n a q u e o u s
c o n d i t i o n .
B i n d in g E n h a n c e r s
The b i n d i n g e n h a n c e r c a n
a v o i d
t h e s t e r e o
h i n d r a n c e
betWeen
b i n d i n g g r o u p a n d
DNAs
nd
c a n
i n c r e a s e
t h e
d a r k
r e a c t i o n d u r i n g t h e ? r s t s t e p t o f o r m t h e
c o m p l e x
m o l e c u l e
b e t W e e n t h e f u r o c o u r m a r i n s a n d DNA. S u i t a b l e b i n d i n g
e n h a n c e r s a r e d e s c r i b e d i n EP 187 3 3 2 . For i n s t a n c e ,
t h e
b i n di n g e n h a n c e r c o u l d b e C 4 — C 1 2 a l k y l ,
a l k y e n y l ,
p o l y a l k y l a m i n e ,
p o l y e t h y l e n e
g l y c o l
o r a c o m b i n a t i o n
t h e r e o f . H o W e v e r ,
W i t h o u t b i n d i n g e n h a n c e r ,
t h e
r e a g e n t s
c o m p r i s i n g t h e f u r o c o u m a r i n d e r i v a t i v e s a n d d e t e c t a b l e
g r o u p s t i l l c o u l d b e u s e d a s DNA a b e l i n g r e a g e n t . I n t h e
DNA a b e l i n g
r e a g e n t ,
t h e
p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s
o f b i n d
i n g
e n h a n c e r s a r e
C 4 — C 1 2 a l k y l o r p o l y e t h y l e n e g l y c o l .
C 4 — C 1 2 a l k y l i s t h e
m o s t
p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s .
D e t e c t a b l e G r o u p s
The d e t e c t a b l e
g r o u p s
c o u l d b e
b i o t i n ,
? u o r e s c e n c e ,
A c r i
dinium e s t e r o r
acridinium-9-carboxamide.
I n
t h e DNA
a b e l i n g r e a g e n t ,
t h e
p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s
of
d e t e c t a b l e
groups a r e
b i o t i n ,
acridinium
e s t e r o r
a c r i d i n i u m - 9 - c a r b o x a m i d e .
A c r i d i n i u m - 9 - c a r b o x a m i d e
i s t h e most r e f e r r e d embodi
ments.
A
process
o f
preparing hydrochloride
o f
4 ‘
A m i n o m e t h y l ) - 4 , 5 ‘ - d i m e t h y l a n g e l i c i n c o m p r i s i n g t h e
s t e p s
o f
a ) r e a c t i n g 4 ‘ - ( N - p h t h a l i m i d e m e t h y l ) - 4 , 5 ‘
d i m e t h y l a n g e l i c i n W i t h
h y d r a Z i n e
h y d r a t e t o p r o d u c e a
m i x t u r e ;
b ) d i s s o l v i n g t h e
m i x t u r e i n o r g a n i c e x t r a c t i n g
s o l v e n t ;
c ) i n t r o d u c i n g a c i d
g a s
i n t o
t h e
o r g a n i c
l a y e r
o f
t h e
m i x t u r e
t o
form
a
p r e c i p i t a t e ;
and
d ) W a s h i n g t h e p r e c i p i t a t e W i t h o r g a n i c s o l v e n t .
I n t h e s t e p
a ) o f
t h e
p r o c e s s ,
t h e m i x t u r e i s
p r e f e r r e d
u n d e r
t h e c o n d i t i o n
o f
h e a t i n g t h e
m i x t u r e t o
s o l v e n t r e ? u x .
The
s o l v e n t c o u l d b e C 1 _ 6 a l k y l
a l c o h o l
i n W h i c h e t h a n o l i s
t h e
p r e f e r r e d
e m b o d i m e n t . I n t h e s t e p
b ) o f
t h e
p r o c e s s ,
t h e
o r g a n i c e x t r a c t i n g
s o l v e n t
i n s t e p
b )
i s h a l o g e n a t e d
a l k a n e t
i n
Which
c h l o r o f o r m i s t h e
p r e f e r r e d
embodiment.
t
ma y s e
W a t e r
t o
Wash
r e s i d u e s
b e t W e e n s t e p
b )
a n d s t e p I n s t e p
c )
o f t h e
p r o c e s s , a c i d
g a s Was i n t r o d u c e d
i n t o
t h e o r g a n i c
l a y e r o f t h e
m i x t u r e
t o form a p r e c i p i t a t e . The a c i d g a s
c o u l d
b e
any a c i d g a s W i t h o u t a f f e c t i n g t h e f o r m a t i o n o f a p r e
c i p i t a t e .
The
m o s t
p r e f e r r e d embodiment i s HCl g a s . I n t h e
s t e p
b ) o f
t h e p r o c e s s , t h e
o r g a n i c s o l v e n t i n
s t e p
d )
i s
h a l o g e n a t e d a l k a n e t i n Which c h l o r o f o r m i s
t h e
p r e f e r r e d
embodiment.
I t i s d i f f i c u l t t o
p u r i f y t h e h y d r o c h l o r i d e o f
4 ‘
( a m i n o m e t h y l ) - 4 ,5 ‘ - d ie m t h y l a n g e l i c in a f t e r s y n t h e s i s .
I n
c o n v e n t i o n a l m e t h o d s , a f t e r e v a p o r a t e d a l l t h e
s o l v e n t ,
p e o p l e e x t r a c t e d
f r o m c h l o r o f o r m
a n d a q u e o u s a c i d W a t e r ,
a n d t h i s s t e p l o s t a
l o t
o f
t h e d e s i r e d compound i n
W a t e r . I f
t h e
s o l u t i o n e x t r a c t e d
i n b a s e a q u e o u s t h e d e s i r e d compound
h a r d l y s u r v i v e d i n t h a t c o n d i t i o n . A f t e r
Washed
W i t h W a t e r
t W i c e ,
t h e a c i d
g a s Was p u r g e d i n t o
t h e
c h l o r o f o r m
a n d
c o l l e c t e d t h e p r e c i p it a t i o n , Washed W i t h
c h l o r o f o r m
t o g e t
t h e
p u r e d e s i r e d compound i n
h i g h
y i e l d . T h i s method
c a n
a v o i d t h e t e d i o u s p r o c e d u r e p e o p l e u s e d
t o
o p e r a t e a n d
m a n u f a c t u r e
t h i s
compound
i n
l a r g e
s c a l e .
T h e
f o l l o W i n g
d a t a
p r o v e
t h e
a d v a n t a g e o f
t h e p r e s e n t method
o v e r
t h e
e x t r a c t e d m e t h o d .
5
10
1 5
20
25
30
35
40
45
50
55
60
6 5
2 0 g
c r u d e p r o d u c t R e c o v e r y y i e l d S o l v e n t consumed Worked t i m e
180 mins
30 mins
E x t r a c t e d method
HCl g a s
method
3 0%
90%
A
ompound
o f t h e
f o r m u l a :
CH3
N+
\
R
o N
R2
W h e r e i n
R1 i s H
r C 1 _ 6 a l k y l o r C 2 _ 6
a l k e n y l ;
a n d
R2 s H
o r C 1 _ 6
a l k y l
o r C 2 _ 6
a l k e n y l .
The
above compounds can be used a s chemiluminescent
l a b e l s . 9 - ( 4 “ - ( A m i n o m e t h y l ) - 4 ‘ , 5 “ - D i m e t h y l - a n g e l i c i n )
a c r i d i n i u m
c a r b o x a m i d e
i s
t h e
p r e f e r r e d c h e m i l u m i n e s c e n t
l a b e l .
To p r e p a r e t h e a c r i d i n i u m - 9 - c a r b o x a m i d e from a c r i d i n e
9 - c a r b o x y l i c
a c i d ,
t h e
m i x t u r e
o f
a c r i d i n e - 9 - c a r b o x y l i c
a c i d
a n d
t h i o n y l c h l o r i d e
Was h e a t e d t o
8 0 °
C .
f o r
o v e r n i g h t .
Removed a l l t h e t h i o n y l c h l o r i d e
by
r e d u c e d p r e s s u r e
a n d
Washed t h e y e l l o W r e s i d u e
W i t h
h e x a n e t o
a f f o r d t h e
y e l l o W
c r y s t a l , a c r i d i n e - 9 - c h l o r i d e . A c r i d i n e - 9 - c h l or i d e c o u l d f o r m
a c r i d i n e - 9 - c a r b o x a m i d e
W i t h a n y p r i m a r y a m i n e a n d s e c
o n d a r y
a m i n e ,
a n d
a f t e r
m e t h y l a t i o n o r
e t h y l a t i o n t o g e t t h e
d e s i r e d c o m p o u n d , a c r i d i n i u m - 9 - c a r b o x a m i d e d e r i v a t i v e s .
Acridinium e s t e r and a c r i d i n i u m - 9 - c a r b o x a m i d e Would
b e h y d r o l y s i s i n b a s i c
b u f f e r
a n d l o s t t h e c h e m i l u m i n s e n c e .
As
shoWn
i n
T a b l e 1 ,
t h e c h e m i l u m i n s c e n e
o f a c r i d in i u m
e s t e r
i s s t r o n g e r
t h a n
t h e a c r i d i n i u m - 9 - c a r b o x a m i d e . I f t h e s e
compounds Were
i n
b a s i c b u f f e r , t h e a c r i d i n i u m e s t e r Would
b e h y d r o l y s i s
more
t h a n
t h e
a c r i d i n i u m - 9 - c a r b o x a m i d e .
TABLE
Acridinium
e s t e r
D e r i v a t i v e s
A c r i d i n i u m - 9 - c a r b o
xamide
D e r i v a t i v e s
Chemiluminescence in Water 1-3 x 107
0 . 5 - 1
x 10°
R L U / p m o l )
C h e m i l u m i n e s c e n c e i n
pH 8
B u f f e r
a t
RT 0 min
(RLU/
p m o l )
C h e m i l u m i n e s c e n c e i n pH
8
B u f f e r
a t
RT 5 m i n s (RLU/
p m o l )
C h e m i l u m i n e s c e n c e i n pH 8
B u f f e r a t
RT 1 0 m i n s
(RLU/
p m o l )
C h e m i l u m i n e s c e n c e i n pH 8
B u f f e r
a t 6 0 ° C .
0
min
R L U / p m o l )
C h e m i l u m i n e s c e n c e
i n
pH 8
B u f f e r a t 6 0 ° C . 5 mins
R L U / p m o l )
C h e m i l u m i n s c e n c e i n
pH 8
B u f f e r
a t 6 0 °
C .
10
mins
R L U / p m o l )
2x107 5x107
1 . 8 X 107 s X 106
1 . 6 X
107
5 X 1 0 5
2 X 107
s
X 106
s
X 106
3
X 105
4x106 8x104
*RT s
2 5 °
C .
RLU
s r e l a t i v e
luminescence
u n i t
t o
measure t h e e f f i
c i e n c y o f
chemiluminscene e m i t t e d .
The
machine W e used
o
measure
chemiluminsence i s luminometer
from
B e r t h o l d .
The b u f f e r
i s 0.2M
sodium t e t r a b o r a t e
b u f f e r .
-
8/9/2019 US6858742 Ftalimida
7/9
US 6 , 8 5 8 , 7 4 2 B2
5
EXAMPLES
The e x a m p l e s below a r e n o n - l i m i t i n g a n d a r e m e r e l y
r e p r e s e n t a t i v e o f v a r i o u s
a s p e c t s
a n d
f e a t u r e s o f t h e p r e s e n t
i n v e n t i o n .
S y n t h e s i s
o f
H y d r o c h l o r i d e
o f
4 ‘ - ( A m i n o m e t h y l ) - 4 , 5 ‘
d i m e t h y l a n g e l i c i n
E x a m p l e
1
T h e P r e p a r a t i o n o f
7 - h y d r o x y - 4 - m e t h y l c o u m a r i n
R e s o r c i n o l ( 1 1 0
g ,
1
m o l ) i s
m i x e d
W i t h e t h y l a c e t o a c e t a t e
( 1 3 0 g , 1 m o l ) a n d p l a c e d
i n a
d r o p p i n g
f u n n e l .
T h i s
m i x t u r e
i s
a d d e d
d r o p W i s e
t o
a
c h i l l e d
o f s u l f u r i c a c i d ( 1 5 0 mL)
contained i n t h e r e a c t o r With a mechanical
s t i r r e r
and a
t h e r m o m e t e r . The r a t e
o f a d d i t i o n
i s s u c h t h a t t h e i n t e r n a l
t e m p e r a t u r e d id n o t
e x c e e d
2 0 °
C .
A f t e r ? n i s h e d t h e d r o p
W i s e , s t i r r e d 1 0 h o u r s a t
room t e m p e r a t u r e .
Poured
t h i s
s o l u t i o n
s l o W l y i n t o
i c e
W a t e r W i t h v i g o r ou s
s t i r r i n g .
A d j u s t e d t h e pH o 6 . 5 W i t h t h e
a q u e o u s
s o d i u m h y d r o x
i d e . T h e
p r o d u c t i s c o l l e c t e d b y ? l t r a t i o n , Washed i t h W a t e r
a n d
a i r d r y t o a f f o r d
1 7 8 g
( 9 0 % ) . m p . 1 6 5 ° C . , Hl-NMR
( 3 0 0 H Z ,
C D 3 O D ) :
d e l t a 7 . 5 8 d ,
1 H ,
J = 8 . 8 H Z ) ,
6 . 8 2 d d ,
1 H ,
J = 8 . 8 & 2 . 4
H Z ) , 6 . 6 9 1 H , d , J = 2 . 4 H Z ) ,
6 . 0 8 s ,
1 H ) ,
2 . 4 9 s ,
3 H ) .
E x a m p l e
2
T h e
P r e p a r a t i o n
o f
7 - O - ( 2 - c h l o r o p r o p e n y l ) - 4
m e t h y l c o u m a r i n
7 - h y d r o x y - 4 - m e t h y l
c o u m a r i n
( 1 4 5
g ,
0 . 8 2 m o l )
Was
m i x e d W i t h 2 , 3 - d i c h l o r o - 1 - p r o p e n e ( 1 0 7
g ,
0 . 9 5 m o l )
i n
1
L
d i m e t h y l f o r a m i d e
a n d 1 L t o l u e n e
i n t h e
p r e s e n c e
o f p o t a s
sium
c a r b o n a t e .
The
m i x t u r e
i s
h e a t e d
t o
t o l u e n e
r e ? u x
f o r
1 8
h o u r s . F i l t r a t e d
t h e p r e c i p i t a t i on
a n d
t h e s o l v e n t W a s
removed
u n d e r
r e d u c e d
p r e s s u r e a n d
t h e
r e s i d ua l e x t r a c t e d
W i t h
c h l o r o f o r m
1 L ) t W i c e . T h e
d r y c h l o r o f o r m
Was
? l t e r e d
a n d
t h e
s o l v e n t
removed
u n d e r r e d u c e d
p r e s s u r e .
R e c r y s t a l l i z a t i o n
f r o m
e t h a n o l
t h e n c o l l e c t e d t h e c r y s t a l s
a n d d r i e d t o
a f f o r d 1 5 6
g
( 8 0 % ) .
mp.
1 0 6 0
C .
H1-NMR(300
HZ
C D 3 O D ) :
d e l t a 7 . 5 7 d ,
1 H ,
J = 9 . 0 H Z ) , 6 . 8 8 d ,
1 H ,
J = 9 . 0
H Z ) , 6 . 1 1 s , 1 H ) ,
5 . 1 3 s ,
1 H ) ,
4 . 9 5 s ,
1 H ) ,
4 . 6 0 s ,
1 H ) ,
3 . 8 3 s ,
2 H ) ,
2 . 4 4 s ,
3 H ) .
E x a m p l e
3
T h e P r e p a r a t i o n
o f 8 - c h l o r o p r o p e n y l - 7 - h y d r o x y- 4
m e t h y l c o u m a r i n
A o l u t i o n
o f
7 - ( 2 - c h l o r o p r o p e n y l ) - 4 - m e t h y l c o u m a r i n
( 1 2 0
g , 0 . 4 8
m o l )
i n a m i x t u r e o f p - d i s o p r o p y l - b e n Z e n e 1 L )
a n d n - b u t y r i c a n h y d r i d e 1 6 0
mL
as h e a t e d t o
1 8 0 °
C . f o r
2 4 h o u r s . The o r g a n i c l a y e r Was e v a p o r a t e d u n d e r r e d u c e d
p r e s s u r e a n d r e s i d u e r e c r y s t a l l i Z a t e d from e t h a n o l t o a f f o r d
7 5 g o f t h e d e s i r e d compound.
E x a m p l e
4
T h e P r e p a r a t i o n
o f
4 , 5 ‘ - d i m e t h y l i s o p s o r a l e n
A i x t u r e
o f
8 - c h l o r o p r o p e n y l - 7 - h y d r o x y - 4 - m e t h y l cou
m a r i n
( 4 8
g ) a n d
s u l f u r i c a c i d ( 5 0 mL)Was
s t i r r e d
a t
0 °
C .
o v e r n i g h t .
T h e
p r o d u c t
W a s p r e c i p i t a t e d b y m e t h a n o l ( 3 0 0
mL)
a n d c o l d W a t e r ( 2 0 0 0 m L ) .
T h e
p r o d u c t i s c o l l e c t e d b y
? l t r a t i o n , Washed
W i t h W a t e r
t i l l Washing a r e n e u t r a l . The
r e s i d u e
Was r e c r y s t a l i Z e d from m e t h a n o l t o
a f f o r d t h e
p r o d
u c t
4 1 g ( 9 2 % ) . Hl-NMR ( 3 0 0 H Z , C D C l 3 ) :
d e l t a 7 . 4 2 d ,
1 H , J = 8 . 8
H Z ) , 7 . 3 2 d ,
1 H , J = 8 . 8
H Z ) , 6 . 7 2 s , 1 H ) , 6 . 2 4 s ,
1 H ) ,
2 . 5 0 s ,
3 H ) ,
2 . 4 8 s ,
3 H ) .
10
1 5
20
25
30
35
40
45
50
55
60
6 5
6
E x a m p l e
5
T h e P r e p a r a t i o n o f
4 ‘ - c h l o r o m e t h y l ) - 4 . 5 ‘
d i m e t h y l a n g e l i c i n
A o l u t i o n o f
4 , 5 ‘ - d i m e t h y l i s o p s o r a d e n
( 1 2 g ) i n a c e t i c
a c i d
( 1 0 0 mL) W a s a d d e d c h l o r o m e t h y l
m e t h y l
e t h e r
( 6 0
mL).
The
s o l u t i o n
W a s
s t i r r e d
a t
room
t e m p e r a t u r e
f o r
56
h o u r s . The s o l u t i o n Was p l a c e d i n t o t h e
i c e
b a t h and t h e
W h i t e p r e c i p i t a t e c o l l e c t e d by ? l t r a t i o n t o g a v e 1 1 g
o f
t h e
d e s i r e d c o m p o u n d .
Hl-NMR ( 3 0 0 H Z ,
C D C l 3 ) :
d e l t a
7 . 4 2 d ,
1 H , J = 8 . 8
H Z ) ,
7 . 3 2 d , 1 H , J = 8 . 8
H Z ) , 6 . 2 4 s , 1 H ) , 5 . 3 3 s ,
2 H ) , 2 . 5 0 s , 3 H ) , 2 . 4 8 s , 3 H ) .
E x a m p l e 6
T h e
P r e p a r a t i o n
o f
4 ‘ - N - p h t h a l i m i d e m e t h y l ) - 4 , 5 ‘
d i m e t h y l a n g e l i c i n
T h e m i x t u r e o f
4 ‘ - ( c h l o r o m e t h y l ) - 4 , 5 ‘ - d i m e t h y l
a n g e l i c i n
6 . 5
g )
a n d p o t a s s i um p h t h a l i m i d e 7 . 0
g )
W e r e d i s s o l v e d i n
d i m e t h y l f o r a m i d e ( 1 0 0 mL)
a n d h e a t e d t o 9 0 ° C . f o r
1 2
h o u r s .
F i l t r a t i o n
o u t
t h e
s o l i d ,
t h e
s o l v e n t removed b y
r e d u c e d
p r e s s u r e .
T h e
d e s i r e d
compound
8 . 5 g )
Was
c o l
l e c t e d
f r o m r e c r y s t a l l i Z a t i o n . Hl-NMR ( 3 0 0 H Z ,
C D C l 3 ) :
d e l t a 7 . 8 3 m , 2 H ) , 7 . 6 8 m , 2 H ) , 7 . 4 2 d , 1 H , J = 8 . 8
H Z ) ,
7 . 3 0 d , 1 H , J = 8 . 8
H Z ) ,
6 . 2 2 s , 1 H ) , 5 . 1 9 s , 2 H ) , 2 . 5 0 s , 3 H ) ,
2 . 4 8 s , 3 H ) .
E x a m p l e 7
T h e P r e p a r a t i o n o f H y d r o c h l o r i d e o f 4 ‘
A m i n o m e t h y l ) - 4 . 5 ‘ - d i m e t h y l a n g e l i c i n
The
s o l u t i o n o f 4 ‘ - ( N - p h t h a l i m i d e m e t h y l ) - 4 , 5 ‘
d i m e t h y l a n g e l i c i n ( 2 0 g ) i n
a b s o l u t e e t h a n o l
( 5 0 0 mL)
W a s
p l a c e d i n t h e r e a c t o r , f o l l o W e d
b y
a d d i t i o n h y d r a Z i n e
h y d r a t e
7 . 5 mL) t h e n h e a t e d t h e s o l u t i o n
t o e t h a n o l
r e ? u x f o r 1 8
h o u r s . The s o l v e n t W a s
e v a p o r a t e d
and t h e r e s i d u e s Were
d i s s o l v e d
i n
c h l o r o f o r m
( 3 0 0
mL)
a n d
W a s h e d W a t e r ( 3 0 0
mL) t W i c e . W h i l e
t h e
volume o f o r g a n i c l a y e r
Was
r e d u c e d
t o h a l f , t h e
HCl
g a s Was
p u r g e d i n t o
t h e o r g a n i c l a y e r u n t i l
t h e p r e c i p i t a t i o n Was e m e r g e d . The p r e c i p i t a t i o n
Was
c o l
l e c t e d a n d Washed
W i t h
c h l o r o f o r m
( 5 0
mL) t o
a f f o r d
t h e
d e s i r e d c o m p o u n d 1 2 g ) . Hl-NMR 3 0 0 H Z , C D 3 O D ) : d e l t a
8 . 3 4 b r , 2 H ) , 7 . 6 7 d , 1 H ,
J = 8 . 8
H Z ) , 7 . 5 7 d , 1 H ,
J = 8 . 8
H Z ) ,
6 . 3 9 s , 1 H ) , 4 . 2 2 m , 2 H ) ,
2 . 5 0 s ,
3 H ) ,
2 . 4 7 s ,
3 H ) .
S y n t h e s i s o f B i o t i n - h e x a n o i c
S p a c e r - a n g e l i c i n
E x a m p l e 8
T h e
P r e p a r a t i o n
o f 6 - ( b io t i n y l ) a m i n o ) h e x a n o i c
a c i d
T h e
m i x t u r e
o f
b i o t i n
( 3 0 0
m g ) a n d N - h y d r o x y s u c c i m i d e
( 1 4 5
mg)
Were
t a k e n
i n t o r e a c t o r .
A f t e r
a l l t h e s o l i d
Were
d i s s o l v e d
i n d i m e t h y l f o r a m i d e
1 5 m L ) ,
a d d e d t h e d i c y c l o
h e x a n y l c a r b o d i i m i d e
0 . 2
mL)
b y
s y r i n g e
a t
0 °
C .
S t i r r e d
a t
room t e m p e r a t u r e f o r
36
h o u r s .
F i l t e r e d t h e p r e c i p i t a t i o n
a n d
e v a p o r a t e d
a l l t h e
d i m e t h y l f o r a m i d e ,
t h e
r e s i d u e W a s h e d
W i t h
a c e t o n e t o
a f f o r d t h e
d e s i r e d
compound, b i o t i n - N H S .
Hl-NMR 3 0 0
H Z ,
D M S O - d 6 ) : d e l t a .
6 . 4 0 s ,
1 H ) ,
6 . 3 5 s ,
1 H ) ,
4 . 3 0 m ,
1 H ) ,
4 . 1 4 m ,
1 H ) ,
3 . 1 2 m ,
1 H ) ,
2 . 8 0 m ,
1 H ) ,
2 . 7 1 s , 4 H ) , 2 . 6 5 m , 2 H ) , 2 . 5 8 m , 2 H ) , 1 . 7 2 — 1 . 4 3 m ,
6 H ) .
B i o t i n - N H S
1 . 4
g ) a n d
6 - a m i n o
c u p r o i c
a c i d ( 5 4 5
m g )
Were t a k e n i n t o t h e
r e a c t o r ,
a f t e r
d i s s o l v e d
in d i m e t h y l f o r a
m i d e
( 2 5
m l ) c o m p l e t e l y ,
k e p t t h e
r e a c t o r a t
room t e m p e r a
t u r e f o r
24
h o u r s .
F i l t e r e d t h e
s o l i d and
Washed W i t h
a c e t o n e
1 5
m l ) t o a f f o r d t h e
d e s i r e d
c o m p o u n d
( 9 5 0
m g ) .
T h e y i e l d
i s
7 5 % , m . p . 2 1 0 ° C . , Hl-NMR ( 3 0 0 H Z , D M S O - d 6 ) : d e l t a .
1 2 . 0 0 b ,
1 H ) , 7 . 7 2 t , 1 H , J = 5 . 4 H Z ) ,
6 . 4 0 s ,
1 H ) ,
6 . 3 4 s ,
-
8/9/2019 US6858742 Ftalimida
8/9
US 6 , 8 5 8 , 7 4 2 B2
7
1 H ) ,
4 . 2 8 m ,
1 H ) , 4 . 1 1 m , 1 H ) ,
3 . 0 1 m ,
1 H ) ,
2 . 9 8 m ,
1 H ) ,
2 . 8 0 m ,
1 H ) ,
2 . 5 4 m ,
1 H ) ,
2 . 1 m ,
2 H , J = 7 . 2 H Z ) , 2 . 0 2 0 , 2 H ,
J = 7 . 2 H Z ) ,
1 . 4 9 — 1 . 2 0 m ,
1 2 H ) .
E x a m p l e
9
T h e P r e p a r a t i o n o f
B i o t i n - h e x a n o i c
S p a c e r
a n g e l i c i n
6 - ( b i o t i n y l ) a m i n o ) h e x a n o i c
a c i d
( 5 0 0
m g ) a n d
N - h y d r o x y s u c c i m i d e ( 1 7 5 m g ) W e r e t a k e n i n t o
t h e
s i n g l e
neck
r e a c t o r
A f t e r a l l t h e s o l i d
Were
d i s s o l v e d i n 25 mL
d i m e t h y l s u l ? d e , a d d e d
t h e
d i c y c l o h e x a n y l c a r b o d i i m i d e
( 0 . 4 7 mL)
b y
s y r i n g e a t 0 °
C .
S t i r r e d a t room e m p e r a t u r e f o r
3 6
h o u r s . F i l t e r e d t h e s o l i d a n d e v a p o r a t e d a l l t h e d i m e t h
y l s u l ? d e
a n d W a s h e d t h e W h i t e s o l i d W i t h
a c t o n e ( 1 0
mL)
o
a f f o r d t h e
d e s i r e d compound ( 1 8 0 m g ) . mp. 1 8 2 °
C .
Hl-NMR
3 0 0 H Z ,
D M S O - d 6 ) : d e l t a .
1 2 . 0 0 b r ,
1 H ) ,
7 . 7 2 t ,
1 H , J = 5 . 4
H Z ) ,
6 . 4 0 s ,
1 H ) ,
6 . 3 4 s ,
1 H ) , 4 . 2 8 m ,
1 H ) ,
4 . 1 1 m ,
1 H ) ,
3 . 0 1 m , 1 H ) , 2 . 9 8 m ,
1 H ) ,
2 . 8 0 m , 1 H ) ,
2 . 5 4
m , 1 H ) , 2 . 1 7 t , 2 H , J = 7 . 2 H Z ) , 2 . 0 2 t , 2 H , J = 7 . 2 H Z ) ,
1 . 4 9 — 1 . 2 0 m ,
1 2 H ) .
BC-NHS ( 6 3 5 m g )
a n d
a n g e l i c i n ( 2 9 0 m g ) W e r e
t a k e n
i n t o t h e s i n g l e
neck
r e a c t o r .
A f t e r
a l l
s o l i d
Were
d i s s o l v e d
i n
25
mL
i m e t h y l s u l ? d e , S t i r r e d a t room t e m p e r a t u r e f o r 36
h o u r s .
F i l t e r e d t h e
p r e c i p i t a t i o n a n d e v a p o r a t e d a l l
t h e
d i m e t h y l s u l ? d e a n d W a s h e d t h e c r y s t a l W i t h c h l o r o f o r m ( 1 0
m L ) . T h e
d e s i r e d p r o d u c t
( 4 0 0
mg) Was
o b t a i n e d . m . p . 2 4 8 °
C . Hl-NMR ( 3 0 0 H Z , D M S O - d 6 ) : d e l t a . 8 . 9 7 b r , 1 H ) ,
7 . 6 7 b r , 1 H , ) ,
7 . 6 1 d , 1 H , J = 8 . 8 H Z ) , 7 . 5 2 d , 1 H , J = 8 . 8 H Z ) ,
6 . 3 9 s ,
1 H ) ,
6 . 3 5 s ,
1 H ) ,
6 . 3 3 s ,
1 H ) ,
4 . 4 6 d , 2 H , J = 4 . 8
H Z ) ,
4 . 2 8 m , 1 H ) ,
4 . 1 1 m ,
1 H ) , 3 . 0 1 m ,
1 H ) ,
2 . 9 8 m , 2 H ) ,
2 . 8 0
m , 1 H ) , 2 . 5 4 m , 1 H ) , 2 . 4 8 s , 3 H ) , 2 . 4 5 s , 3 H ) , 2 . 0 5 m , 4 H ) ,
1 . 4 9 — 1 . 1 7 m , 1 2 H ) .
S y n t h e s i s
o f A c r i d i n i u m D e r i v a t i v e s
E x a m p l e
1 0
T h e P r e p a r a t i o n o f A c r i d i n i u m - 9 - c a r b o x a m i d e
D e r i v a t i v e s
A i x t u r e o f a c r i d i n e - 9 - c a r b o x y l i c a c i d
3
g ) a n d t h i o n y l
c h l o r i d e ( 2 0
mL)
Was h e a t e d t o
8 0 °
C .
f o r
o v e r n i g h t .
Removed a l l t h e
t h i o n y l c h l o r i d e by
r e d u c e d p r e s s u r e a n d
W a s h e d t h e y e l l o W r e s i d u e W i t h h e x a n e
( 1 5
mL)
o a f f o r d t h e
y e l l o W c r y s t a l , a c r i d i n e - 9 - c h l o r i d e . T h e s o l u t i o n o f a c r i d i n e
9 - c h l o r i d e ( 0 . 3 7
m g )
a n d 4 ‘ - ( A m i n o m e t h y l ) - 4, 5 ‘
d i m e t h y l a n g e l i c i n ( 0 . 3 7
m g )
i n
c h l o r o f o r m
( 2 0
mL) W a s
s t i r r e d a t
room t e m p e r a t u r e
u n d e r a r g o n
f o r
30
m i n s .
Evapo
r a t e d a l l t h e s o l v e n t , t h e
r e s i d u e Washed
W i t h m e t h a n o l ( 1 0
mL) t o a f f o r d t h e d e s i r e d
c o m p o u n d
9 - ( 4 “ - ( A m i n o m e t h y l )
4 ‘ , 5 “ - d i m e t h y l a n g e l i c i n ) a c r i d i n e c a r b o x a m i d e . Hl-NMR
( 3 0 0 H Z ,
C D C l 3 ) :
d e l t a
8 . 1 7 d ,
2 H , J = 8 . 7 H Z ) ,
7 . 8 4 d ,
2 H ,
J = 8 . 7
H Z ) , 7 . 7 0 d d , 2 H , J = 8 . 7 & 7 . 2 H Z ) ,
7 . 4 6 d ,
1 H , J = 8 . 8
H Z ) ,
7 . 4 0 d ,
1 H ,
J = 8 . 8
H Z ) ,
7 . 3 2 d d ,
2 H , J = 8 . 7 & 7 . 2 H Z ) ,
6 . 1 1 s ,
1 H ) ,
5 . 0 2 d ,
2 H ,
J = 7 . 5 H Z ) ,
2 . 8 0 s ,
3 H ) ,
2 . 4 7 s ,
3 H ) ,
1 . 4 1 b r , 1 H ) .
The solution 9 - ( 4 “
- Aminomethyl)-4‘,5 -
d i m e t h y l a n g e l i c i n ) a c r i d i n e
c a r b o x a m i d e
( 1 0 0 m g ) a n d
? u o
r o s u l f o n i c a c i d
m e t h y l e s t e r
0 . 2
mL) n c h l o r o f o r m ( 1 5 mL)
W a s s t i r r e d a t room t e m p e r a t u r e f o r 3 0 h o u r s . F i l t r a t i o n
t h e
p r e c i p i t a t i o n a n d
W a s h e d
W i t h e t h e r ( 1 5 mL) t o a f f o r d t h e
d e s i r e d c o m p o u n d ,
9 - ( 4 “ - ( A m i n o m e t h y l ) - 4 ‘ , 5 “ - D i m e t h y l
a n g e l i c i n ) a c r i d i n i u m c a r b o x a m 5 4 m g ) . Hl-NMR
3 0 0
H Z ,
D M S O - d 6 ) : d e l t a 9 . 7 0 b r ,
1 H ) , 8 . 7 9 d ,
2 H ,
J = 9 . 0 H Z ) ,
8 . 5 2 d , 2 H ,
J = 8 . 4
H Z ) , 8 . 4 4 d d , 2 H , J = 8 . 4 & 7 . 5 H Z ) , 8 . 0 8 d d ,
2 H , J = 9 . 0 & 7 . 5 H Z ) ,
7 . 6 0 d ,
1 H , J = 8 . 8 H Z ) ,
7 . 5 6 d ,
1 H , J = 8 . 8
H Z ) ,
6 . 4 3 s ,
1 H ) ,
5 . 0 2 d ,
2 H , J = 7 . 2 H Z ) ,
4 . 8 1 s ,
3 H ) ,
2 . 6 5 s ,
3 H ) , 2 . 6 3 s , 3 H ) .
10
1 5
20
25
30
35
40
45
55
60
6 5
8
While t h e i n v e n t i o n h a s b e e n d e s c r i b e d a n d e x e m p l i ? e d
i n
s u f ? c i e n t
d e t a i l f o r t h o s e
s k i l l e d i n t h i s
a r t
t o make and u s e
i t , v a r i o u s a l t e r n a t i v e s ,
m o d i ? c a t i o n s , a n d
i m p r o v e m e n t s
s h o u l d b e a p p a r e n t W i t h o ut d e p a r t i n g
f r o m
t h e
s p i r i t
a n d
s c o p e
o f t h e i n v e n t i o n .
One s k i l l e d i n
t h e a r t
r e a d i l y a p p r e c i a t e s t h a t
t h e
p r e s e n t
i n v e n t i o n i s W e l l
a d a p t e d
t o
c a r r y o u t t h e o b j e c t s
a n d
o b t a i n
t h e
e n d s
and
a d v a n t a g e s m e n t i o n e d ,
a s
W e l l
a s
t h o s e i n h e r e n t
t h e r e i n .
T h e c e l l
l i n e s , e m b r y o s ,
a n i m a l s , a n d
p r o c e s s e s a n d
m e t h o d s
f o r
p r o d u c i n g t h e m
a r e
r e p r e s e n t a t i v e
o f p r e f e r r e d
embodiments, a r e exemplary,
and
a r e n o t i n t e n d e d a s l i m i
t a t i o n s on t h e
s c o p e
o f t h e i n v e n t i o n . Modi?cations t h e r e i n
and o t h e r u s e s
W i l l
occur t o t h o s e s k i l l e d i n
t h e
a r t .
These
m o d i ? c a t i o n s
a r e encompassed
W i t h i n t h e s p i r i t o f
t h e
i n v e n t i o n
a n d a r e de?ned by t h e
s c o p e
o f
t h e c l a i m s .
I t
W i l l be r e a d i l y
a p p a r e n t
t o a p e r s o n s k i l l e d i n t h e a r t t h a t
v a r y i n g
s u b s t i t u t i o n s a n d m o d i ? c a t i o n s may b e
made
t o t h e
i n v e n t i o n
d i s c l o s e d h e r e i n W i t h o u t
d e p a r t i n g
f r o m t h e
s c o p e
a n d s p i r i t o f t h e i n v e n t i o n .
A l l p a t e n t s a n d p u b l i c a t i o n s m e n t i o n e d
i n
t h e s p e c i ? c a
t i o n a r e
i n d i c a t i v e
o f t h e l e v e l s
o f
t h o s e
o f o r d i n a r y
s k i l l i n
t h e a r t t o Which t h e i n v e n t i o n p e r t a i n s . A l l
p a t e n t s
a n d
p u b l i c a t i o n s a r e
h e r e i n
i n c o r p o r a t e d b y r e f e r e n c e t o t h e
same
e x t e n t
a s
i f
each
i n d i v i d u a l p u b l ic a t i o n
W a s
s p e c i ?
c a l l y a n d i n d i v i d u a l l y i n d i c a t e d t o b e i n c o r p o r a t e d b y r e f
erence.
T h e i n v e n t i o n i l l u s t r a t i v e l y
d e s c r i b e d
h e r e i n s u i t a b l y
may
b e
p r a c t i c e d i n t h e
a b s e n c e o f
a n y e l e m e n t o r e l e m e n t s ,
l i m i t a t i o n
o r l i m i t a t i o n s , Which a r e n o t s p e c i ? c a l l y
d i s c l o s e d
h e r e i n .
T h u s ,
f o r e x a m p l e ,
i n
e a c h i n s t a n c e h e r e i n a n y
o f
t h e
t e r m s “ c o m p r i s i n g ” ,
“ c o n s i s t i n g
e s s e n t i a l l y o f ” a n d
“ c o n
s i s t i n g
o f
” ma y
b e
r e p l a c e d
W i t h
e i t h e r
o f t h e o t h e r
tWo
t e r m s . The t e r m s
a n d
e x p r e s s i o n s
Which
h a v e
been
employed a r e used a s t e r m s o f d e s c r i p t i o n and n o t o f
l i m i t a t i o n , and
t h e r e
i s
no
i n t e n t i o n
t h a t
i n
t h e
u s e
o f s u c h
t e r m s a n d
e x p r e s s i o n s o f
e x c l u d i n g a n y e q u i v a l e n t s o f t h e
f e a t u r e s
shoWn a n d
d e s c r i b e d o r p o r t i o n s t h e r e o f ,
b u t
i t i s
r e c o g n i Z e d t h a t v a r i o u s m o d i ? c a t i o n s a r e p o s s i b l e
W i t h i n
t h e
s c o p e o f t h e i n v e n t i o n c l a i m e d . T h u s , i t
s h o u l d
b e u n d e r
s t o o d
t h a t
a l t h o u g h
t h e
p r e s e n t i n v e n t i on
h a s
b e e n
s p e c i ?
c a l l y d i s c l o s e d
b y
p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s a n d o p t i o n a l
f e a t u r e s ,
m o d i ? c a t i o n a n d v a r i a t i o n o f t h e
c o n c e p t s h e r e i n
d i s c l o s e d may b e r e s o r t e d t o by t h o s e
s k i l l e d
i n t h e a r t ,
a n d
t h a t
such modi?cations
and v a r i a t i o n s a r e
c o n s i d e r e d t o be
W i t h i n
t h e s c o p e o f t h i s
i n v e n t i o n a s
de?ned by h e a p p e n d e d
c l a i m s .
I n a d d i t i o n , Where f e a t u r e s o r a s p e c t s
o f
t h e i n v e n t i o n a r e
d e s c r i b e d i n t e r m s o f Markush g r o u p s , t h o s e
s k i l l e d
i n t h e
a r t W i l l r e c o g n i Z e
t h a t
t h e
i n v e n t i o n i s
a l s o
t h e r e b y de s c r i b e d
i n t e r m s o f
any
i n d i v i d u a l
member
o r
subgroup
o f members
o f
t h e
Markush
g r o u p . F o r e x a m p l e , i f
X
s
d e s c r i b e d
a s
s e l e c t e d f r o m t h e
g r o u p c o n s i s t i n g o f b r o m i n e , c h l o r i n e , a n d
i o d i n e , c l a i m s f o r X e i n g b r o m i n e a n d c l a i m s f o r X e i n g
bromine
a n d c h l o r i n e a r e f u l l y d e s c r i b e d .
O t h e r
embodiments
a r e s e t
f o r t h
W i t h i n
t h e
f o l l o W i n g
c l a i m s .
What
i s c l a i m e d
i s :
1 . A r o c e s s
o f
p r e p a r i n g h y d r o c h l o r i d e
o f
4 ‘
A m i n o m e t h y l ) - 4 , 5 ‘ - d i m e t h y l a n g e l i c i n
c o m p r i s i n g t h e s t e p s
o f
a )
r e a c t i n g 4 ‘ - ( N - p h t h a l i m i d e m e t h y l ) - 4 , 5 ‘
d i m e t h y l a n g e l i c i n W i t h h y d r a Z i n e h y d r a t e
t o p r o d u c e
a
p r o d u c t c o m p o u n d ;
b ) d i s s o l v i n g t h e
p r o d u c t
c o m p o u n d
i n
a n o r g a n i c
e x t r a c t i n g
s o l v e n t
t o p r o d u c e
a m i x t u r e ;
c )
i n t r o d u c i n g HCL
a s i n t o a n o r g a n i c
l a y e r
o f t h e
m i x t u r e
t o form a p r e c i p i t a t e ; and
d ) W a s h i n g
t h e
p r e c i p i t a t e
W i t h
o r g a n i c s o l v e n t .
-
8/9/2019 US6858742 Ftalimida
9/9
US 6 , 8 5 8 , 7 4 2 B2
9 1 0
2 . The
p r o c e s s a c c o r d i n g
t o c l a i m 1 w h e r e i n s t e p a ) i s 5 . The
p r o c e s s a c c o r d i n g
t o c l a i m 1 , Which f u r t h e r com
u n d e r t h e c o n d i t i o n o f h e a t i n g t h e m i x t u r e
t o a
s o l v e n t p r i s e s
a
W a s h i n g s t e p by t h e u s e o f W a t e r b e t W e e n s t e p b )
r e ? u x .
a n d
s t e p. The p r o c e s s a c c o r d i n g
t o c l a i m 2 W h e r e i n
t h e s o l v e n t 6 . The p r o c e s s a c c o r d i n g t o
c l a i m 1 W h e r e i n
t h e o r g a n i c
i s
e t h a n o l .
5
s o l v e n t in
s t e p
d )
i s
c h l o r o f o r m .
4 . The p r o c e s s a c c o r d i n g
t o
c l a i m 1 W h e r e i n t h e
o r g a n i c
e x t r a c t i n g
s o l v e n t
i n s t e p
( b ) i s
chloroform.
* * * * *