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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

LABSINFA – LABORATÓRIO DE PLANEJAMENTO, SÍNTESE AVALIAÇÃO DE

FÁRMACOS

SÍNTESE E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIINFLAMATÓRIA,

CITOTÓXICA E IMUNOMODULATÓRIA DE DERIVADOS DA

FTALIMIDA

Orientadora: Dra. Ana Cristina Lima Leite

Co-Orientador: Dr. Dalci José Brondani

Fábio Fernandes Barbosa

Recife, PE

2007

Síntese e Avaliação das Atividades Antiinflamatória, Citotóxica e Imunomodulatória de Derivados da Ftalimida





LABSINFA – LABORATÓRIO DE PLANEJAMENTO, SÍNTESE E AVALIAÇÃO DE

FÁRMACOS



FTALIMIDA

Orientadora: Dra. Ana Cristina Lima Leite

Co-Orientador: Dr. Dalci José Brondani

Fábio Fernandes Barbosa+

+Bolsista do CNPq

Recife

2007

Dissertação submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas do

Centro de Ciências da Saúde da UFPE, como

requisito parcial para obtenção do grau de

Mestre em Ciências Farmacêuticas na Área

de Concentração: Síntese de Fármacos.


Barbosa, Fábio Fernandes

Síntese e avaliação das atividades antiinflamatória, citotóxica e imunomodulatória de derivados da Ftalimida / Fábio Fernandes Barbosa. - Recife: O Autor, 2007.

82 folhas : il., fig., tab., quadros, esquemas.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2007.

Inclui bibliografia e anexos.

1. FTALIMIDAS 2.

ANTIINFLAMATÓRIOS. I. TÍTULO.

615.15 CDU (2.ed.) UFPE 615.19 CDD (20.ed.) CCS2007-111






LABSINFA – LABORATÓRIO DE PLANEJAMENTO, SÍNTESE E AVALIAÇÃO DE

FÁRMACOS



FTALIMIDA

BANCA EXAMINADORA:

Presidente:

Profa. Dr

a. Ana Cristina Lima leite - UFPE

Membro Interno Titular:

Profa. Dr

a. Maria do Carmo Alves de Lima - UFPE

Membro Externo Titular:

Profa. Dr

a. Valéria Rêgo Alves Pereira – CPqAM / FIOCRUZ

Prof. Drª. Teresinha Gonçalves da Silva - UFPE

Membros Suplentes:

Prof. Dr. Dalci José Brondani - UFPE

Profa. Dr

a. Valdênia Maria Oliveira de Souza - UFPE



REITOR

Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins

VICE-REITOR

Prof. Dr. Gilson Gonçalves e Silva

PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E POS-GRADUAÇAO

Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAUDE

Prof. Dr. José Tadeu Pinheiro

CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Profa. Dr

a. Jane Sheila Higino

COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto

VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

Profa. Dr

a. Beate Saegesser Santos


DEDICATÓRIA

Aos meus amados pais Severino e Zélia pelo

enorme sacrifício empregado para minha

formação, pelo exemplo de caráter, pelo

carinho constante, e pelo amor incondicional.

A minha querida esposa Joelma por seu

sereno e forte apoio a todo instante e pelo

amor, fidelidade e paciência sempre

disponíveis.

Ao meu irmão e grande amigo João Paulo.

Ao meu avô Antônio Barbosa, pelo exemplo de

coragem e fé que, com muito amor, soube

transmitir durante sua jornada.


Agregar valor é a verdadeira essência

da capacitação das pessoas.

John C. Maxwell


AGRADECIMENTOS

A Deus que faz da vida uma conspiração para sucessivas vitórias.

A Prof.ª Dra. Ana Cristina que não só me orientou, como também me

compreendeu, incentivou, acreditou em mim e me deu o prazer de fazer parte de

sua vida profissional, sempre pensando positivamente e elevando o moral de

toda equipe do Labsinfa.

Ao Prof. Dr. Dalci Brondani pela co-orientação, pelas broncas construtivas e por

momentos de descontração que proporcionou com suas piadas nas horas certas.

A Prof.ª Dra. Teresinha Gonçalves, do Laboratório de Farmacologia

Experimental do Departamento de Antibióticos da UFPE, pela realização dos

ensaios antiinflamatórios, pela valiosa ajuda e constantes incentivos.

A Prof.ª Valdênia Sousa pela realização dos testes de imunologia.

A Dra. Valéria Pereira, do Laboratório de Imunoparasitologia do CPqAM, pela

realização dos ensaios de citotoxicidade.

Ao Prof. Dr. Rajendra Mohan Srivastava, do Laboratório de Química Orgânica –

DQF, UFPE, pela ajuda e incentivos na síntese.

A Prof.ª Cláudia do O Pessoa e o doutorando Paulo Michel, do Laboratório de

Oncologia Experimental da UFC, pela realização dos ensaios de atividade

antitumoral.

Aos técnicos da Central Analítica do DQF, em especial a Ricardo e Eliete.

Ao médico Agenor Barros, por ter cedido a Talidomida, para os testes

biológicos.

A Joelma, minha esposa, pelo incentivo aos meus estudos e pela cobrança dos

resultados.

Aos meus familiares mais próximos, principalmente minha cunhada Josivilma,

por toda amizade.

Ao meu irmão João Paulo pelo apoio técnico na parte de informática.

Aos meus amigos Diogo e Marcos que tanto contribuíram para a realização

deste trabalho, participando efetivamente e acreditando em meu sucesso. Valeu.

As alunas de IC Ana Célia e Cristiane pela ajuda e envolvimento nesse trabalho.

Aos demais colegas do laboratório: Lucas, Marcos Moraes e Victor Hugo.

A meu amigo Flávio Ricardo, presente desde os tempos de monitoria.

A aluna de doutorado Laudelina Rodrigues de Magalhães, pela ajuda nos

ensaios biológicos.


A todos os professores que compõem o quadro de funcionários da Faculdade de

Farmácia da UFPE.

Aos alunos de Química Orgânica 07A, pela oportunidade e ocasião na qual

aprendemos juntos.

Ao CNPq, pela concessão da bolsa de Mestrado, como também pelo importante

suporte financeiro concedido ao nosso grupo de pesquisa (Edital Universal

#471834/2006-8 e #475355/2007-8.)

A UFPE, pela reforma do nosso laboratório.


SUMÁRIO

Pag.

INTRODUÇÃO 17

CAPÍTULO I

1. REVISÃO DA LITERATURA

1.1. Ftalimidas: classificação química e usos terapêuticos 20

1.2. Síntese formal da talidomida e derivados da ftalimida 21

1.3. Derivados da ftalimida como potentes agentes antiinflamatórios 25

1.4. Ensaio antiinflamatório ‗in vivo‘ do ―bolsão de ar‖ 28

1.5. Derivados da talidomida como potentes agentes antitumorais 29

1.6. Atuação do NO como mediador de processos inflamatórios e

imunológicos 31

1.7. Utilização dos aminoácidos como grupos transportadores de fármacos

32

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivos Gerais 34

2.2 Objetivos Específicos 34

CAPÍTULO II

3. ARTIGO

Synthesis, Cytotoxic and Anti-Inflammatory Activities of N-Phthaloyl Amino Acid

Derivatives 35

4. REFERÊNCIAS 45

CAPÍTULO III

5. CONCLUSÕES 53

6.PERSPECTIVAS 54


ANEXOS

GENERALIDADES

Obtenção dos derivados N-ftalil-aminoacil-tiazolinonas 55

Obtenção dos derivados N-ftalil-hidrazidas 56

METODOLOGIAS: REACIONAL E DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS

Parte Experimental 59

Procedimentos Experimentais 59

Ensaios Biológicos 61

Atividade antiinflamatória 61

Atividade citotóxica frente às células de mamíferos 61

Atividades citotóxicas frente às células tumorais 62

DADOS DE ESPECTROSCOPIA

N-(ácido etanóico)-1,3- isoindolinadiona (1) 63

N-(i-ácido propiônico)-1,3- isoindolinadiona (2) 63

N-(n-ácido propiônico)-1,3- isoindolinadiona (3) 63

N-(3-metil-ácido butanóico)-1,3- isoindolinadiona (4) 63

N-(3-metil-ácido pentanóico)-1,3- isoindolinadiona (5) 64

N-(3-acido-ácido butanóico)-1,3- isoindolinadiona (6) 64

N-(3-fenil-ácido propiônico)-1,3- isoindolinadiona (7) 64

N-(3-indolil-ácido propiônico)-1,3- isoindolinadiona (8) 65

ESPECTROS SELECIONADOS 66

ARTIGO E TRABALHOS PUBLICADOS DURANTE O MESTRADO


LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

bFGF Fator de crescimento de fibroblasto

CDCl3 – Clorofórmio deuterado

DMF N,N-dimetilformamida

DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado

D2O Água deuterada

ELISA Enzime – Linked Immusorbent Assay

HOBt N-Hidroxibenzotriazol

IV Espectroscopia no Infra-Vermelho

NF-B Fator nuclear kappa-B

NO Óxido Nítrico

PBS Solução de tampão fosfato

PDE Fosfodiesterase

REA Relação estrutura – Atividade

RMN – 13

C Ressonância magnética nuclear de carbono 13

RMN – 1H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio

TEA Trietilamina

THF Tetrahidrofurano

TNF- Fator de necrose tumoral

J – Constate de Acoplamento

Deslocamento químico


LISTA DE ESQUEMAS

Pág.

Esquema 1: Estrutura química da (±)Talidomida. 17

Esquema 2: Alguns exemplares de importantes imidas cíclicas. 20

Esquema 3: Síntese formal da (±) Talidomida. 21

Esquema 4: Síntese de N-(alquil)- 1,8-naftalimidas. 22

Esquema 5: Síntese de Gabriel aplicada a resolução quiral e, portanto, é um

excelente reagente para a síntese de L-α aminoácidos não naturais. 22

Esquema 6. Síntese de aminas quirais, descritos por Goldberg e colaboradores. 23

Esquema 7: Síntese de ftalimidas e sacarinas, mediados pelo rearranjo de

Gabriel-Colman. 24

Esquema 8: Síntese de derivados mono- e di-tiocarbonilados das ftalimidas. 24

Esquema 9: Planejamento de novos análogos da Talidomida, proposto por

Barreiro e colaboradores. 25

Esquema 10: Síntese do composto (±)-N-(2-metil-o-fénoxido)-1,3-

isoindolinadiona, descrito como mais potente que a Talidomida e protótipo

LASSBio-468. 26

Esquema 11: Síntese de derivados das f talimidas acoplados ao núcleo 1,2,4-

oxadiazol,com propriedades analgésicas e antiinflamatórias. 27

Esquema 12: Estrutura dos compostos ácido-N-(4-fluorfenil)ftalâmico (1) e

ácido-N-(1,2,4-triazol-3-il)ftalâmico (2), relatados como agentes antiinflamatórios. 28

Esquema 13: Tentativas sintéticas para obterem os derivados N- (aminoacil)-

ftalimida-4-tiazolinona. [a: DCC e HOBt, TEA, DCM (1ª tentativa),DIC, TEA,

DCM / DMF (2ª tentativa)]. 55

Esquema 14: Síntese de N-acilhidrazidas-piridinas. 56

Esquema 15: Síntese `de inéditas N-(hidrazidas)-1,3-isoindolinaionas. 57

Esquema 16: Síntese do derivado N-(4‘-tiazolinona)-1,3-isoindolinadiona. 57


LISTA DE QUADROS E TABELAS

Pág.

Quadro 1: Estrutura química, dados das atividades antitumorais e referências de

promissores análogos da Talidomida. 30

Quadro 2: Esquema simplificado da biosíntese do NO. 31

Quadro 3: Estruturas de agentes bioativos, contendo resíduos de L--aminoácidos 33

Tabela 1. Antiinflammatory activity of compounds 1-8 and thalidomide (Thl). 39

Tabela 2: Antiproliferative activity evaluation of compounds 1-8 on MDA-MB435,

HCT-8 and SF-295 cells lines at 25 g/mL. 40

Tabela 3: Inhibitory effects on NO-induced productiona in murine spleen cells and

cytotoxic effect on spleen cell BALB/c mice in vitro. 41


LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. RMN – 1H em CDCl3 a 300 MHz para o composto N-(ácido etanóico)-1,3-

isoindolinadiona (1). 66

Figura 2. Espectro no Infravermelho em KBr (pastilhas) para o composto N-(ácido etanóico)-

1,3- isoindolinadiona (1). 67

Figura 3. RMN – 1H em DMSO-d6 a 300 MHz para o composto N-(3-ácido- i-ácido

butanóico)-1,3- isoindolinadiona (6). 68

Figura 4. RMN – 1H em DMSO-d6 a 300 MHz para o N-(3-ácido- i-ácido butanóico)-1,3-

isoindolinadiona (6), após adição de D2O. 69

Figura 5. Espectro no Infravermelho em KBr (pastilhas) para o composto N-(3-ácido- i-ácido


Figura 6. RMN - 13

C em DMSO-d6 a 75.5 MHz para o composto N-(3-ácido- i-ácido


Figura 7. RMN – 1H em DMSO-d6 a 300 MHz para o composto N-(3-fenil-ácido

propiônico)-1,3- isoindolinadiona (7). 72

Figura 8. RMN – 13

C em DMSO-d6 a 75.5 MHz para o composto N-(3-fenil-ácido


Figura 9. Espectro no Infravermelho em KBr (pastilhas) para o composto N-(3-fenil-ácido


Figura 10. RMN – 1H em DMSO-d6 a 300 MHz para o composto N-(3-indolil-ácido


Figura 11. RMN – 1H em DMSO-d6 a 300 MHz para o composto N-(3-indolil-ácido

propiônico)-1,3- isoindolinadiona (8), após a adição de D2O. 76


C em DMSO-d6 a 75.5 MHz para o composto N-(3-indolil-ácido


Figura 13. Espectro no Infravermelho em KBr (pastilhas) para o composto N-(3-indolil-ácido


Figura 14. RMN – 1H em CDCl3 a 300 MHz para o composto N-(metil-ácido pentanóico)-



C em CDCl3 a 75.5 MHz para o composto N-(3-metil-ácido pentanóico)-


Figura 16. RMN – 1H em CDCl3 a 300 MHz para o composto N-(3-metil-ácido pentanóico)-

1,3- isoindolinadiona (5), após a adição do reagente de deslocamento químico tri-[3-

(heptafluorpropilhidroxidometileno)-(+)-canforato] de európio III [Eu(hfc)3]. 81

Figura 17. Espectro no Infravermelho em KBr (pastilhas) para o composto N-(3-metil-ácido

pentanóico)-1,3- isoindolinadiona (5). 82


RESUMO

Os relatos de Relação Estrutura Atividade (REA) da Talidomida e análogos revelam o

potencial farmacofórico do anel ftalimídico e, ao mesmo tempo, denotam o perfil toxicofórico

do grupamento glutarimida. Em conseqüência, o núcleo ftalimida vem sendo explorado

visando-se agentes antiinflamatórios e antitumorais mais potentes e menos tóxicos. Merece

destaque ainda o conhecimento de que pequenos resíduos de L-α-aminoácidos são utilizados

como grupos transportadores na latenciação de agentes farmacológicos menos tóxicos. Em

um estudo de REA preliminar, são descritos neste trabalho, a síntese e a avaliação das

atividades antiinflamatória, citotóxica e imunomodulatória de derivados do tipo N-

aminoacídicos-1,3-isoindolinadionas. Através da condensação entre o anidrido ftálico e os

respectivos L-α-aminoácidos os produtos foram obtidos e, posteriormente, submetidos aos

testes biológicos. Para avaliação da atividade antiinflamatória ‗in vivo‘ empregou-se o ensaio

do bolsão de ar em camundongos. As substâncias foram administradas por via oral, na dose de

100 mg.kg-1

, tomou-se a Talidomida como droga padrão. Foram realizados ainda, ensaios ‗in

vitro‘ frente às células tumorais MDA-MB 435, HCT-8 e SF-295, assim como para a

linhagem de células de mamíferos BALB/c. Os resultados apontaram o derivado N-(3-metil-

ácido pentanóico)-1,3- isoindolinadiona (5) como o mais potente antiinflamatório desta série,

com percentual de inibição comparável com a Talidomida. A avaliação do derivado 5 na dose

de 10 mg.Kg-1

no ensaio antiinflamatório demonstrou potência semelhante ao padrão. Todos

os compostos apresentaram baixo nível de citotoxicidade em esplenócitos de mamíferos e não

inibiram o crescimento das linhagens testadas na concentração de 25 g.mL-1

. No intuito de

elucidar um possível mecanismo de atividade antiinflamatória por via imunomodulatória, as

moléculas também foram testadas como possíveis inibidores da produção de óxido nítrico

(NO). Todos os produtos foram capazes de inibir a produção de NO, no ensaio de ELISA, nas

concentrações de 25 e 50 g.mL-1

, e com níveis bem próximos da droga padrão. Portanto,

além de sintetizar derivados do tipo N-aminoacídicos-1,3-isoindolinadionas, esses produtos

foram testados em ensaios preliminares para determinação de suas potenciais atividades

biológicas.

Palavras-chaves: Ftalimidas, aminoácidos, agentes antiinflamatórios, citotoxicidade,

imunomodulatórios.


ABSTRACT

The findings of the Structural Activity Relationship (SAR) on Thalidomide and its analogues

reveal the pharmacophoric potential of the phthalidic ring, and, at the same time, indicate the

toxicophoric profile of the glutarimide group. As a result, the phthalimide nucleus has been

investigated in search of anti-inflammatory and anti-tumor agents that are more potent and

less toxic. It should also be pointed out that small residues of L-α-aminoacids are used as

transporter groups in the latentiation of less toxic pharmacological agents. As part of a

preliminary SAR study, this work describes the synthesis and evaluation of the anti-

inflammatory, cytotoxic and immunomodulatory properties of derivatives of the N-

aminoacid-1,3-isoidolinadione type. The products were obtained by way of condensation of

phthalic anhydride and the respective L-α-aminoacids and subsequently subjected to

biological tests. For the ‗in vivo‘ evaluation of anti-inflammatory properties the air-pouch

assay method was used on mice, with a dose of 100 mg.kg1 administered orally, and taking

Thalidomide as the standard drug. ‗In vitro‘ assays were also carried out to test the action of

the products on cell tumors MDA-MB 435, HCT-8 and SF-295, and also for BALB/c

mammalian cells. The results point to the derivative N-(3-methyl-pentanoic acid)-1,3-

isoindolinadione (5) as being the most potent anti-inflammatory of this series, with a

percentage of inhibition comparable to that of Thalidomide. The evaluation of derivative 5 at

a dose of 10 mg.Kg-1

in the anti-inflammatory assay showed potency similar to that of the

standard drug. All the compounds showed a low level of cytotoxicity in mammalian spleen

cells and did not inhibit growth of the cell tumors tested at a concentration of 25 g.mL-1

. In

order to shed light on a possible mechanism for anti-inflammatory activity by way of

immunomodulation, the molecules were also tested as possible inhibitors of the production of

nitric oxide (NO). All the products were capable of inhibiting the production of NO, in the

ELISA assay, at concentrations of 25 and 50 g.mL-1

, and with levels near those of the

standard drug. Therefore, besides synthesizing derivatives of the N-aminoacid-1,3-

isoidolinadione type, those products were tested in preliminary rehearsals for determination of

their biological potentials.

Keywords: Phthalimides, amino acids, anti-inflammatory agents, cytotoxicity,

immunomodulators.


RESUMO GRÁFICO

N

O

O

C

CH3

H

CO2H

N

O

O

CH2 CH2 CO2H

N

O

O

CH2 CO2H

N

O

O

C

CH2

H

CO2H

CH2 CO2H

N

O

O

C

CH2

H

CO2H N

O

O

C

CH2

H

CO2H

N

H

N

O

O

C

C

H

CO2H

CH2 CH3

CH3

H

N

O

O

C

CH

H

CO2H

CH3

CH3

3 4

5 6

7 8

1 2


INTRODUÇAO

O primeiro relato da atividade antitumoral da Talidomida [(±)-N-(1H-glutarimida)-1,3-

isoindolinadiona, Esquema 1)], e estudos de elucidação de ação de sua estrutura foi descrito

por D‘AMATO, LOUGHNAN, FOLKMAN, (1994) estes associaram que o conhecido efeito

teratogênico desta droga estava relacionada com a inibição no desenvolvimento de artérias e

veias fetais e que a Talidomida inibia, com elevada potencia, o fator de crescimento de

fibroblasto (bFGF) induzidos pelo processo da angiogênese. Diante destes relatos, diversos

autores exploraram os efeitos da inibição da angiogênese para esta droga e análogos, como

ferramenta para a busca de novos agentes antineoplásicos frente a tumores sólidos (TABIN,

1994; MARRIOTT et al., 2001). Entretanto, no caso da eficácia da Talidomida frente ao

sarcoma de Kaposi associado à AIDS, sua ação biológica é relatada não por suas propriedades

angiogênicas, mas por meio da inibição dos níveis elevados de TNF-α presentes neste tumor

(MARRIOTT et al, 1999).

N

O

O

N

O

O

H

Esquema 1: Estrutura química da (±)Talidomida.

Resumidamente, SINGHAL (1999) tem destacado o valor da Talidomida como

antitumoral nos seguintes casos:

Em casos de reincidência de tumores sólidos;


Nas terapias combinadas para o combate de Mieloma Múltiplo (neoplasia de origem

óssea);

Em terapias combinadas, frente aos tumores sólidos refratários aos agentes

alquilantes e antimetabólitos.

Segundo SANO et al. (2005) a Talidomida é uma das mais conhecidas drogas multi-

alvos, sendo sua ação bem relatada para os seguintes alvos: modulador do TNF-α, fator NF-

кB, antagonista de receptores androgênicos, inibidor de peptidases, glicosidases e

ciclooxigenase isoforma 2 (COX-2).

Os relatos de Relação Estrutura Atividade (REA), da Talidomida e análogos denotam

o potencial farmacofórico do anel ftalimídico. Ao mesmo tempo, relatam o perfil toxicofórico

do grupamento glutarimida (LIMA, FRAGA & BARREIRO, 2001).

O núcleo ftalimida tem sido muito utilizado como grupo protetor de aminas primárias,

fato bem documentado para os aminoácidos (GREENE & WUTS, 1991; TODA et al, 1993).

Contudo, nos últimos anos, especial interesse se tem revelado na obtenção de derivados da

ftalimida visando à obtenção de atividades analgésica e antiinflamatória. O perfil de atividade

imunomoduladora foi verificado para os derivados da ftalimida desenhados como análogos

híbridos da Talidomida (CLOUGH et al., 2003).

Por outro lado, os aminoácidos vêm sendo muito utilizados na Química medicinal,

como estratégia de obtenção de agentes terapeuticamente ativos, mais seletivos e menos

tóxicos (DENNY, 2001).

Vários N-ftaloil aminoácidos já foram sintetizados, entretanto, estes não foram

explorados como compostos bioativos (SENA, 2001). Levando-se em conta o interesse do

grupo ftalimida com conhecidas ações antiinflamatórias, antitumorais e imunomodulatórias,

um estudo de REA foi desenvolvido utilizando-se a ftalimida acoplada a aminoácidos.


Neste trabalho foi realizada uma primeira abordagem com relação à síntese e o perfil

de atividade biológica de derivados N-ftalil-aminoácidos. É relatada a síntese de oito N-

ftaloil-aminoácidos, alguns dos quais são inéditos e foram ensaiados no que se refere à

atividade antiinflamatória utilizando o modelo do bolsão inflamatório, atividade citotóxica

frente a linhagens de células MDA-MB-435, HCT-8 e SF-295, assim como cultura de células

BALB/C. Um estudo preliminar da atividade imunomodulatória foi verificado através da

capacidade de inibir a produção de óxido nítrico (NO).


1. REVISÃO DA LITERATURA

1.1. FTALIMIDAS: CLASSIFICAÇÃO QUÍMICA E USOS TERAPÊUTICOS

As imidas cíclicas são compostos que contêm o grupo –CO-N(R)-CO-, sendo R um

átomo de hidrogênio, grupos alquila ou arila (Esquema 2). Tais compostos podem ser

divididos em subclasses, incluindo as maleimidas, succinimidas, glutarimidas, ftalimidas,

naftalimidas, etc., e seus respectivos derivados (CECHINEL, 2003).

N-naftalimidasN-ftalimidas

N-glutarimidasN-succinimidas N-maleimidas

N R1

O

O

R`

N

O

O

R1

R`

N

O

O

R1N

O

O

R1

N R1

O

O

Esquema 2: Alguns exemplares de importantes imidas cíclicas.

Por vários anos, as ftalimidas, têm ressurgido e atraído a atenção da comunidade

científica, devido, principalmente, às suas potencialidades terapêuticas tais como:

hipolipidêmica (CHAPMAN et al., 1985), hipotensiva (PRESS et al., 1986), antiviral

(HOLFFMAN et al., 1992), antimicrobiana

(ORZESKO et al., 2000), anticonvulsiva

(VAMECQ et al., 1998) e analgésica (ANTUNES et al., 1998).


1.2. SÍNTESE FORMAL DA TALIDOMIDA E DERIVADOS DA FTALIMIDA

A síntese formal da (±) Talidomida é classicamente realizada pela condensação (sob

fusão) do anidrido ftálico com o (±) ácido glutâmico, seguida do borbulhamento de amônia

gasosa em tolueno ou com hidróxido de amônio em refluxo (Esquema 3), fornecendo um

rendimento total de 93 % , sem a necessidade purificação por cromatografia.

N

O

O

N

O

O

H

NH3 (g)

N

O

O

CO2H

CO2H

HO2CCH(NH2)CH2CH2CO2H

O

O

O

180 0C

Esquema 3: Síntese formal da (±) Talidomida.

A adição de um único anel aromático conjugado, como nos casos dos derivados 1,8-

naftalimidas, propicia para estes compostos importantes propriedades fluorescentes, com

excelentes foto estabilidades e resistência térmica, quando os compostos análogos do tipo

ftálicos não possuem estas características. (GRABTECHEV et al., 1996). Entretanto, as 1,8-

naftalimidas são dotadas de semelhantes reatividades químicas (CHANG, UTECHT &

LEWIS, 1999), sendo passíveis de sofrerem as clássicas reações de Gabriel, Colman e de

tiocarbonilações (Esquema 4).


N

O

O

RN

O

O

RBr

DMF,

53-58%

Esquema 4: Síntese de N-(alquil)- 1,8-naftalimidas.

Outra aplicação das ftalimidas e de seus derivados tem sido explorada por KUBO et

al. (1996), utilizando a ftalimida de potássio como um reagente de auxílio para a resolução de

misturas de aminoácidos (Esquema 5). Empregando-se ftalimida de potássio como uma base

nucleofílica e volumosa, este derivado favorece à conversão de apenas um único

diastereoisômero e permitindo a resolução quiral através de uma reação ácido-base livre de

catalisador e com excelente estereoseletividade e rendimento.

95 % 3%

90 % rend.

+

(S)

(S)

N

N

Me

OtBuO2C

N

R1 O

O

(R)

(S)

N

N

Me

OtBuO2C

N

R1 O

O

NMP, t.a.

N-K+

O

O(S)

N

N

Me

OtBuO2C

Br

R1

Esquema 5: Síntese de Gabriel aplicada à resolução quiral e, portanto, é um excelente

reagente para a síntese de L-α aminoácidos não naturais (NMP é N-metil-2-pirrolidona,

solvente utilizado).

As reações de Gabriel também são empregadas na síntese total de aminas primárias

assimétricas, como relatado por Goldberg e colaboradores (TODA, SODA & GOLBERG,

1993) e mostrado no Esquema 6. Estes autores relataram que as aminas quirais foram obtidas

com a prevalência de um dos diastereoisômeros (com valores de excesso enantiomérico entre


50-90%) ou como produto puro, de acordo com as análises do RMN 1H após a adição das

bases de Schift quirais tri-[3-(heptafluorpropilhidroxidometileno)-(+)-canforato] de Európio

III [Eu (hfc)3] ou o reagente de Oshima [(-)-1,6-bis-difenil-2,4-hexadieno-1,6-diol)] (TODA

& TANAKA, 1988). Estes mesmos autores postularam que provavelmente o uso de reações

convencionais de SN2 levariam à obtenção de apenas compostos racêmicos, sem excesso

enantiomérico.

N-K+

O

O

RBr, DMF

refluxo, 2 hs N

O

O

RNH

N

O

NHR

NH2NH2, EtOH

refluxo, 2 hs

KOH, DMFrefluxo, 3 hs

R-NH2

R = PhMeCH, Me2CHCH2MeCH,

EtMeCH, EtMeCHCH2.

Esquema 6. Síntese de aminas quirais, descritos por Goldberg e colaboradores.

GROUTAS et al. (1994) descreveram a síntese de derivados das ftalimidas e

sacarinas, planejados como possíveis inibidores das enzimas Catepisina G, proteinase tipo 3 e

elastases de leucócitos (HLE), envolvidos em diversos processos inflamatórios tais como no

enfisema pulmonar, fibrose cística e psoríase (GROUTAS et al., 1992). Os compostos foram

obtidos através do rearranjo de Gabriel-Colman (que consiste na reação envolvendo a abertura

do anel induzida por alcóxidos seguida de ciclização) obtendo-se os derivados

funcionalizados com ésteres, sulfonas e tio-eteres (Esquema 7). Os resultados das atividades

biológicas mostraram que os compostos do tipo sacarinas são ativos enquanto que as

ftalimidas não são, frente aos ensaios de ‗binding‘ nestas enzimas.


X: C=O, SO2 R1 = OH, SCH2Ph, SO2CH2Ph,

F, H, Imidazol

X

N

O

CO2Me

R1

TEA / AminoacidosTHF / refluxo50-80 %

C

O

N N

NN

X

O

O

Esquema 7: Síntese de ftalimidas e sacarinas, mediados pelo rearranjo de Gabriel-Colman.

Mais recentemente, SENA (2003) tem descrito que as reações de tiocarboxilaçoes em

N-aril-ftalimidas podem ser realizadas, com regioseletividade, utilizando o reagente de

Lawesson [2,4-bis-(4-metoxifenil)-1,2,3,4—ditiofosfoetano-2,4-dissulfito] em tolueno sob

refluxo por 2.5 hs, obtendo-se uma proporção de 3:1 dos respectivos N-aril-monotioftalimidas

e N-aril-ditioftalimidas (Esquema 8), sendo esta estratégia, uma inédita e importante

ferramenta para a obtenção de bioisósteros das ftalimidas .

Onde R = p-metoxifenil

N

O

O

R1 PS

SP

S

S

R

R+ Tolueno, N2

Refluxo, 2.5 hs

N

S

O

R1

N

S

S

R1

50 %

15 %

Esquema 8: Síntese de derivados mono- e di-tiocarbonilados das ftalimidas.


1.3. DERIVADOS DA FTALIMIDA COMO POTENTES AGENTES

ANTIINFLAMATÓRIOS

No contexto biológico, LIMA et al. (2002) descreveram a síntese de duas séries de

derivados da ftalimida, planejados como novos análogos aquirais da Talidomida,

funcionalizados com as sulfonamidas e amidas (Esquema 9). A atividade antiinflamatória in

vivo na dose de 10 mg.kg-1

mostrou que os derivados do tipo sulfonamidas são mais potentes

do que seus bioisósteros, as amidas, e a abertura do anel isoindólico leva à inatividade frente

a este ensaio biológico. Para esta série, o derivado LASSBio 468 revelou excelente atividade

antiinflamatória, com o mecanismo de ação mediado pela modulação dos níveis de TNF-α,

sendo este derivado 50% mais potente que a Talidomida. Entretanto, nenhum destes

compostos demonstrou atividade frente à enzima fosfodiesterase, isoforma 4 (PDE-4), pois o

grupamento sulfonamida é bem relatado como importante grupo farmacofórico de inibidores

da PDE-4, demonstrando que a inserção desta função não é suficiente para induzir ação

mediada por esta cascata de enzima.

HibridaçãoMolecular

inibidor da PDE-4

N

O

N

HO

O

O

inibidor do TNF-

S

CH3O

CH3O

O O

N

O

S

N

O

O

X

O

N

O

C

N

O

X

O

X = S, LASSBio-468

Bioisósteros

Esquema 9: Planejamento de novos análogos da Talidomida, proposto por LIMA et al


Diante de resultados satisfatórios, MACHADO et al. (2005) decidiram investigar as

possíveis modificações moleculares no composto LASSBio 468, através da obtenção de

regioisômeros desse composto, bem como na funcionalização do anel N-fenil deste protótipo,

e portanto, estabelecer novas REA para uma possível otimização deste protótipo (Esquema

10). Os resultados mostraram que os regioisômeros orto e para substituídos para a função

sulfonamida não incrementam a atividade biológica. Em adicional, a orto-hidroxilação do

LASSBio 468 mostrou-se deletéria para atividade biológica. Por outro lado, quando estes

pesquisadores decidiram investigar a orto-fenoxidação do anel aromático, os derivados

contendo esta funcionalização mostram excelentes atividades, sendo o composto (+) N-[(2-

metil)-2-fenoxifenil]-1,3-isoindolinadiona (4h) o mais potente da série, com percentual de

inibição frente ao TNF-α superior a Talidomida e ao protótipo-líder, o LASSBio 468. Por

último, a modificação deste novo protótipo (4h) com o grupo sulfonamida substituído, não

levou a uma potencialização da atividade biológica.

2-NH2PhOH

AcOH, refluxo1 h, 91 %,

O

O

O

MeO2CH(CH3)Br

K2CO3, DMF,

t.a., 72 hs, 83%

N

O

O

O

H

N

O

O

O

O

O

CH3

4h

Esquema 10: Síntese do composto (±)-N-(2-metil-o-fénoxido)-1,3-isoindolinadiona, descrito

como mais potente que a Talidomida e protótipo LASSBio-468.

Os efeitos analgésicos, anti-hiperlipidêmicos e antiinflamatórios de derivados das

ftalimidas também têm sido explorados por ANTUNES et al. (1998), quando sintetizaram

uma serie de ftalimidas acopladas ao anel 1,2,4-Oxadiazol, previamente relatado como um

importante heterocíclico dotado de ação antiinflamatória (AFIATPOUR, 1994). Como

mostrado no Esquema 11, os produtos foram obtidos a partir da reação de condensação entre


o anidrido ftálico e a glicina, catalisado por Microondas, com posterior reação com

amidoximas na presença de DCC, no qual em aquecimento, leva a formação dos respectivos

derivados do tipo 1,2,4-Oxadiazóis. Os resultados das atividades antiinflamatória e analgésica

revelaram o derivado N’-[3-(fenil)-l,2,4-oxadiazol-5-il alquil]ftalimida (não substituído) como

o mais ativo da série quando comparado com a Aspirina como padrão. Os valores de ID50 =

22 mg.kg-1

frente ao ensaio de analgesia induzido por ácido acético em camundongos e com

atividade no teste de hiperanalgesia induzido por formalina, na dose de 10 mg.kg-1

, indicaram

que este composto é dotado de atividade biológica na fase terminal da dor e nos processos

inflamatório e analgésico.

+

Onde Ar substituído por: H, CH3, NO2 ou Cl.

N

O

O

CH2

O

N

N

Ar

140o

C

C

NH

OH

Ar NH2

DCC,

DMF, t.a.

N

O

O

CH2 C

O

O

N

C

ArNH2

N

O

O

CH2 CO2H

H2NCH2CO2H

MO (sem solvente)

O

O

O

Esquema 11: Síntese de derivados da ftalimida acoplados ao núcleo 1,2,4-oxadiazol, com

propriedades analgésica e antiinflamatória.

Sena (2001) propôs a síntese e avaliação antiinflamatória crônica e aguda ‗in vivo‘

frente ao edema de pata (na dose de 20 mg.kg-1

), de derivados N-arilftalâmicos e N-(1,2,4-

triazol)-4-il-ftalâmicos, planejados por modificação estrutural no anel glutarimida da

Talidomida (Esquema 12). Sendo os compostos ácido-N-(4-fluorfenil)ftalâmico I e ácido-N-


(1,2,4-triazol-3-il)ftalâmico II, os mais potentes da série estudada, com percentuais inibição

de 33.1 e 34.4 %, respectivamente.

I II

CO2H

NH

O

N N

N

H

H

CO2H

NH

O

F

Esquema 12: Estrutura dos compostos ácido-N-(4-fluorfenil)ftalâmico (I) e ácido-N-(1,2,4-

triazol-3-il)ftalâmico (II), relatados como agentes antiinflamatórios.

1.4. ENSAIO ANTIINFLAMATÓRIO ‗IN VIVO‘ DO ―BOLSÃO DE AR‖

O modelo do bolsão de ar - ―Air Pouch Model‖ foi primeiramente descrito por

EDWARDS, SEDWICK & WILLOUGHBY (1981). Consiste em uma câmara ―in vivo‖ no

qual é formado no dorso do rato pela injeção subcutânea de ar. Após um período de 5 a 7 dias,

o bolsão é espontaneamente desenvolvido e vascularizado, composto primeiramente por

células do tipo macrófagos, fibroblastos e leucócitos (SDEWICK, SIN & EDWARDS, 1983).

A injeção de estimulantes inflamatórios tais como Lipopolissacarídeo (LPS), Concanavalina

A (ConA), 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) e Carragenina induzem as formações

de uma variedade de mediadores imunomodulatórios (HARMSEN & HAVELL, 1990),

incluindo PGE2, COX-2, TNF-α e outros mediadores (ESSER et al., 2005). Portanto, o

método do Bolsão de ar é um rápido, atrativo e eficiente ensaio para os estudos de drogas

antiinflamatórias, com as seguintes vantagens:

Possibilidade de realizar um ensaio da medição quantitativa do percentual da

inibição da inflamação, por via oral ou Intraperitoneal;


Permitir a avaliação bioquímica do exudato coletado, e conseqüentemente, a

elucidação da via de ação das drogas;

Também permite a medição da concentração da droga e a análise indireta da

metabolização das drogas.

1.5. DERIVADOS DA TALIDOMIDA COMO POTENTES AGENTES

ANTITUMORAIS

No Quadro 1, são mostrados resumidamente as estruturas e alguns dados de

atividades biológicas dos mais representativos agentes antitumorais, relatados como análogos

da Talidomida.

Quadro 1: Estrutura química, dados das atividades antitumorais e referencias de promissores

análogos da Talidomida. Composto Estrutura Atividade Biológica Ref.

Actimid (CC-4047)

N

O

O

N

HO

O

NH2

Potente agente antimieloma, na

dose oral de 1 mg.-dia, com

inibição de 25 % em pacientes

com mieloma múltiplo avançado

(n = 18), e 50 % de inibição em

pacientes com estágio inicial da

doença (n = 20).

A, B

Revlimid (CC-5013)

N

O

N

HO

O

NH2

Ativo contra mieloma múltiplo,

melanoma e outros tumores

sólidos, com diminuição dos

níveis de TNF-α e IL-12, sem

apresentar efeitos adversos.

C


5HPP-33

N

OH

O

O

Ativo frente a diversos tumores

sólidos, atuando na inibição do

TNF-α, do fator NF-кB, e como

inibidor da polimerização de

microtúbulos semelhante ao

paclitaxel. Este composto foi

eficaz em inibir a proliferação de

células tumorais ‗in vitro‘,

quando a talidomida é inativa.

D, E

CC-3032

N

O

O

O

O

O

O

Planejado como um novo

derivado solúvel em água é

dotado de potente atividade anti

TNF-α, com baixa toxicidade e

mutagênicidade e não é

neurotóxico. Apresenta excelente

atividade frente à enzima PDE-4.

F

Análogo 5HPP-33

N

O

O

OH

Relatado com um potente

inibidor do fator NF-кB, e

dotado de excelente atividade

angiogênica.

G

A = LENTZSCH et al.; 2002. B = SCHEY et al., 2002. C = BANTLETT et al. 2004. D= LI et al., 2006. E =

INATSUKI et al.; 2005. F = MARRIOTT et al., 1998. G = CARCACHE-DE-BLANCO et al., 2007.


1.6. ATUAÇÃO DO NO COMO MEDIADOR DE PROCESSOS INFLAMATÓRIOS E

IMUNOLÓGICOS

O radical NO é um metabólito simples, gasoso e permeável em membranas biológicas,

no qual sua síntese é gerada pela oxidação do aminoácido L-Arginina através da ação da

enzima Óxido Nítrico Sintetase (NOS) (Quadro 2), encontrada em diversos animais e plantas

(MONCADA & HIGGS, 1993). O NO é bem conhecido como um fator relaxante derivado do

endotélio, e também como um importante mediador fisiológico nos sistemas cardiovascular,

imunológico e nervoso (FURCHGOTT & ZAWADZKI). Três principais isoformas da NOS

têm sido identificadas: endotelial (eNOS), indutiva (iNOS) e a neuronal (nNOS) (CASAS et

al., 2006). Em alguns processos patológicos (imunológicos e inflamatórios), ocorre a

superprodução de NO pela iNOS, agravando e / ou resultando em varias doenças, tais como:

Alzheimer (CHOI & ROTHMAN, 1990), Parkinson (GOOD et al., 1998) e arteriosclerose

(ZIMMET & HARE, 2006).

Quadro 2. Esquema simplificado da biosíntese do NO.


Considerando este aspecto, diversos inibidores da superprodução de NO têm sido

descritos nos últimos anos, tais como: N-acetil-3-O-metildopamina (SEO et al., 2005),

análogos da L-Arginina (IJUIN et al. 2006), ácidos acético-4-xantenonas e ácidos acético-5,6-

dimetil-xantenonas (GOBBI et al., 2006) entre outros (HAGMANN et al., 2000).

A literatura não cita trabalhos descrevendo derivados da Ftalimida como inibidores da

superprodução de NO, entretanto, devido aos inúmeros relatos de propriedades

imunomodulatórias das imidas cíclicas, com destaque para a Talidomida, tornou-se viável

investigar a atividade inibitória do NO para os derivados das Ftalimidas condensados aos L-α-

aminoácidos.

1.7. UTILIZAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS COMO GRUPOS TRANSPORTADORES

DE FÁRMACOS

São vários os relatos da literatura, enumerando as vantagens na utilização dos

aminoácidos como grupos transportadores de fármacos, como mostrados brevemente no

Quadro 3.

Quadro 3: Estruturas de agentes bioativos, contendo resíduos de L-α-aminoácidos.

Composto Atividades Relatadas Referência*

N

NH

R1

H3CO

C2H5

NNH2

O

R2H

Onde R1 = OC6H13

Relatados como derivados peptididomiméticos

da Primaquina, alguns destes demonstraram

excelente atividade antimalárica, nas

concentrações de 50 mg/kg via oral, e ativos

frente a cepas multi - resistentes.

A


O

O NO2

N

O C4H8

NH2

O

NH Boc

H

Descritos como derivados peptídicos do núcleo

Safrol (1,3-benzodioxolo) e dotados de

atividade citotóxica ‗in vitro‘, e seletivos para

a fase de divisão celular.

B

OH

NaO2C

N N

ONaO

Planejado como uma pró-droga do AAS,

acoplado com resíduo de D - fenilalanina

demonstrou potente ação antiinflamatória e

antitumoral em baixas doses.

C

MeO

O N

O

R1

O

NH2

R2

Planejados como pró-drogas de

antiinflamatórios não esteroidais (AINS),

demonstraram pobre hidrosolubilidade e

estabilidade química, porém possui atividade

biológica semelhante ao protótipo.

D

N

NO

NH2

OP

O

O

O

O

NH2

R1

Desenhados como análogos do Cidofovir

(potente agente antiviral), contendo uma

função aminoácidica, e dotados com atividade

4x superior ao ganciclovir, porém com pobre

biodisponibilidade oral.

E

*A = VANGAPANDU et al.2004. B = MOREIRA, et al. 2007. C = DHANESHWARA et al, 2007. D =

MAJUMDARA & KENNETH, 2007. E = ERIKSSONA et al, 2007.


2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL:

Planejar, sintetizar e avaliar as atividades antiinflamatória, imunomodulatória e

citótoxica de derivados da ftalimidas condensados a diversos aminoácidos.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Sintetizar e elucidar estruturalmente novos derivados N-(aminoácidicos)-1,3-

isoindolinadionas;

Avaliar a atividade antiinflamatória ‗in vivo‘ pelo ensaio do bolsão de ar em

camundongos por via oral e intraperitoneal;

Estudar in vitro as ações imunomodulátoria e citotóxica frente às células tumorais, de

mamíferos e frente ao NO.


33.. AARRTTIIGGOO

Synthesis, cytotoxic and anti-inflammatory activities of N-phthaloyl amino

acid derivatives

Ana Cristina L. Leite1*, Fábio Fernandes Barbosa

1, Dalci J. Brondani

1, Marcos V. Oliveira

Cardoso1, Diogo R. M. Moreira

1, Laudelina R. de Magalhães

2, Valdênia Maria O. Souza

3,

Vláudia Maria A. Costa3, Rajendra M. Srivastava

4, Valéria Rego A. Pereira

5, Luiza de C.

Reis5, Marina de A. Souza

5, Paulo Michel P. Ferreira

6, Letícia V. Costa Lotufo

6, Manoel O.

de Moraes 6, Claudia Pessoa

6 and Terezinha G. da Silva

2

1 LabSINFA - CCS,

2 Department of Antibiotics and

3 LIKA – CCB,

4 Department of

Fundamental Chemistry - CCEN, Federal University of Pernambuco, 50740-520, Recife, PE,

Brazil.

5 Department of Immunology, CPqAM / FIOCRUZ, Recife, PE, Brazil

6 LOE, Federal University of Ceará, 60430-270, Fortaleza - CE, Brazil.

*Corresponding author: Dra. Ana Cristina L. Leite Phone/Fax: (+55) 81 2126 8511,

e-mail: [email protected]

mailto:[email protected]


Abstract — New N-phthaloyl amino acids were synthesized and tested for anti-inflammatory

activity using air pouch model. The N-phthaloyl-L-isoleucine compound possessed strong

anti-inflammatory activity when it was administered orally. Many of these compounds

effectively suppress nitric oxide (NO) production in RAW cells stimulated with LPS. None of

the -phthaloyl amino acid exhibited any significant cytotoxicity against tumor cells neither

in vitro nor in spleen cell culture of the BALB/c mice. These results suggest that the

compounds could be considered as potential immunomodulatory agents.

Key-words: Phthalimides, amino acids, cytotoxicity, anti-inflammatory, nitric oxide.


The use of the phthalimides as primary amine protecting groups, especially for -

amino acids 1 are extensively documented in the chemical literature.

2 Many phthalimide

derivatives have been explored for biological activities. For examples, some phthalimides

have antihyperlipidemic activities (due to their ability to inhibit acetyl-CoA carboxylase

action) and effective in reducing serum cholesterol levels. 3 This class of compounds has been

found to possess mainly anticonvulsant potency 4

and analgesic activity against inflammatory

pain in mice. 5 A series of immunomodulatory drugs, designed by chemical modification of

thalidomide, have been developed to overcome the congenital birth side effects 6

and also

planned as hybrid and functionalized analogues of thalidomide endowed with

immunomodulatory properties. 5

Indeed, new thalidomide analogues have been planned as

more potent than one at inhibiting TNF- overproduction and potent inducers of T - cell

proliferation with IFN- and IL-2 secretion from peripheral blood mononuclear cells. 7

Although many N-phthaloyl amino acids have previously been synthesized, but no

biological activity tests have been performed, therefore it appeared interesting to carry out

thorough pharmacological evaluations of these acids. 8 In this report, we describe the

synthesis of eight protected amino acids using the microwave irradiation which caused the

drastic reduction of the reaction time and simplified the work-up procedure. This

communication also describes the preliminary results of their in vivo anti-inflammatory

property evaluations. The compounds were tested in an interactive approach in order to

provide the antiinflammatory activity and as potential immunomodulatory agents. Modulation

of NO synthesis and action represents a new way to the treatment of inflammatory and

autoimmune diseases.9

In addition, the compounds were also evaluated for their cytotoxicity

behavior against the representatives cell lines (MDA/MB-435, HCT-8 and SF-295) and spleen

cell culture of the BALB/c mice, taking into account that highly cytotoxic agents will hardly

be developed as antiinflammatory drug candidates.


Comp. Entry R Comp. Entry R

1 Gly -H 5 Ile -CH(CH3)CH2CH3

2 Ala -CH3 6 Glu -CH2CH2CO2H

3 -Ala -CH2CH2- 7 Phe -CH2C6H5

4 Val -CH(CH3)2 8 Trp -CH2(3-indolyl)

N-CH-CO2H

O

O

R

Figure 1. Structural feature of compounds 1-8.

The above-mentioned compounds (1-8, Fig. 1) were prepared by a convenient one-pot

synthesis, by condensing L--aminoacids and phthalic anhydride as previously described. 8

Following this procedure, it was possible to obtain eight compounds in good yields. 10

It is

worthy to mention that only the desired S-enantiomers were obtained in all cases as verified

by the chiral shift reagent Eu(hfc)3 1H-NMR spectra.

The compounds were screened for anti-inflammatory activity in a ‗air-pouches‘ model

assay, with at a single dose of 100 mg/kg orally administered to mice and evaluated for its

ability to inhibit the leucocytes migration from blood circulation into air-pouches. 11

For the

purpose of determining selectivity, the derivatives were also tested against on proliferation of

mouse splenocytes BALB/c, a fine method which is effective for evaluation of specific T

lymphocyte cytotoxicity. 12

To further understand the immunomodulatory properties of

phthalimides derivatives, a NO-induced production inhibitory assay in murine spleen cells

was performed. Thalidomide was used as standard drug.


Table 1. Antiinflammatory activity of compounds 1-8 and thalidomide (Thl). .

Compounds (100mg/Kg) % Inhibition PMNLa (10

5/cm

3) (n=6; after 6h)

b

Vehicle - 53.89 ± 1.4

1 45.50 28.18 ± 2.4

2 38.43 33.18 ± 2.3

3 54.19 24.69 ± 1.3

4 57.80 22.72 ± 3.7

5 67.50 17.94 ± 2.0

6 61.70 20.64 ± 1.4

7 64.22 19.28 ± 1.4

8 43.85 30.26 ± 1.8

Thl 72.13 15.02 ± 2.2

Thl(10mg/Kg) 76.30 12.75 ± 2.2

5 (10mg/Kg) 64.70 19.03 ± 2.5

8 (i.p.) 76.00 13.34 ± 2.2c

a PMNL is cell infiltration by polymorphonuclear leucocytes.

b Data points represents the mean PMNL counts

number/ group ± standard error. C after 24 h of assay.

In the series of phthalimides derivatives (1-8), the most active compound containing a

isoleucine moiety (5) as depicted in Table 1, and was selected for the preliminary short study

of the dose – dependent response for anti-inflammatory assay. This compound inhibited the

inflammation induced at low dose of 10 mg/kg, with potency comparable with structurally

related - drug, thalidomide. Since compound 8 (an indolyl derivative) presented low

antiinflammatory activity orally, we decided to investigate its biological profile by

administering intraperitoneally. This compound had its anti-inflammatory action improved

when administered in intraperitoneal way. Therefore, we suggest that this compound is

suffering a pharmacokinetic effect, which may contribute to reduce their bioavailability when

assayed orally. Besides, the others compounds tested resulted in moderate to low inhibition of

inflammation.


Table 2: Antiproliferative activity evaluation of compounds 1-8 on MDA-MB435, HCT-8

and SF-295 cells lines at 25 g/mL.

Compounds % Inhibition SEMa

MDA/MB-435 HCT-8 SF-295

1 -4.72 (0.25) -0.61 (2.30) 3.98 (15.39)

2 5.01 (22.38) 6.11 (2.88) 12.21 (4.26)

3 -3.71 (0.29) 18.94 (12.53) 12.57 (7.01)

4 7.82 (2.87) 4.28 (1.87) 2.74 (5.88)

5 14.95 (1.32) 15.02 (3.67) 20.00 (6.01)

6 12.92 (5.96) 6.52 (2.88) 14.42 (7.63)

7 11.72 (1.03) -7.23 (2.30) 13.54 (5.38)

8 13.75 (2.43) 10.44 (3.67) 24.51 (8.39) a Standard deviation is given in parentheses.

Furthermore, the compounds were evaluated in vitro against a 4-cell line panel

consisting of MDA/MB-435, HCT-8 and SF-295, using a previously well - described MTT

assay. 13

In this protocol, each cell lines inoculated and preincubated on a microtiter plate.

Test agents were then added at a single concentration (25 g/mL) and the culture incubated

for 48 h. End-point determinations are made with MTT. The results for each test agent were

reported as the percent of growth of the treated cells when compared to the untreated control

cells. Compounds which reduced the growth of any one of the cell lines to 32% or less are

considered to be cytotoxic. 12

According to these criteria, the derivatives are considered as

non - cytotoxic (Table 2).

In recent years, nitric oxide (NO) has been identified as one of the important and

unique mediators of diverse physiological processe.9 Besides its function as endothelium-

derived relaxing factor, as a neurotransmitter and also as an immune defense molecule,

evidence is accumulating that NO participates in inflammatory- and autoimmune-mediated

tissue destruction. The overproduction of NO can destroy functional normal tissue during

acute and chronic inflammation 14

As shown in Table 3, some tested compounds showed

potent inhibitory effects on NO production upon stimulation LPS, and comparable to

thalidomide. Only compound 4 showed its inability to inhibit the NO production when used in


low doses. It was also found that this analogous stimulated the proliferation of splenocytes

without affecting cell viability. Therefore, we conclude that these results are interesting

because none of the synthesized derivatives exhibited significant cytotoxicity (Table 3).

Table 3. Inhibitory effects on NO-induced productiona in murine spleen cells and cytotoxic

effect on spleen cell BALB/c mice in vitro. Comp. Plus LPS

b NO-levels (g/mL) ± the s.d.

+ Cytotoxic effects

at 25 g/mL at 50 g/mL Conc. (g/mL)c % Inhibition

d

Thl 3.6 ± 0.0 3.6 ± 0.0 >100 none

1 4.2 ± 0.9 3.6 ± 2.3 50 25.60

2 2.1 ± 0.3* 1.5 ± 0.6* > 100 none

3 3.6 ± 0.0 4.4 ± 1.2 50 22.20

4 6.4 ± 0.0* 2.7 ± 0.6* 25 24.69

5 3.1 ± 0.0* 2.3 ± 0.0* 12,5 26.06

6 2.9 ± 0.9* 3.4 ± 0.3* 50 8.750

7 2.3 ± 0.0* 0.7 ± 0.0* 25 21.52

8 1.3 ± 0.9 2.1 ± 1.4 50 27.62 a NO-induced production in macrophages, by stimulating with lipopolysaccharide (LPS) and measured by

Griess´s method 15

. bLPS was dosed as a solution at 1.0 g/mL, with mean equal to 7.5 ± 1.2 g/mL. * P < 0.05

compared with control (LPS). c the highest non-toxic concentration on spleen cell of BALB/c mice;

d percentage

of growth inhibition as described in note 13.

Our data show, for the compounds tested in different models, that the amino acyl

moiety plays an important role only in anti-inflammatory assay and any specificity about the

amino acyl moiety can be seen in the imunommodulatory and citotocixity models. In

summary, N-phtaloyl amino acids were readily synthesized and evaluated for their anti-

inflammatory activity, cytotoxicity and NO production inhibition. The N-phtaloyl amino acid

possesses simple structure and can be easily improved structurally. Any important

cytotoxicity was showed. Moreover, stimulation of lymphocyte proliferation and inhibition of

NO production suggest that the compounds could be considered as potential

immunomodulatory agent. The principle of immunomodulation and their mechanisms are

subjects for further studies.


Acknowledgements

We would like to thank the Brazilian National Research Council (CNPq # 471834/2006-8),

the Research Foundation of Pernambuco State (FACEPE) and FIOCRUZ for financial

support. F.F.B. and M.V.O.C. are recipients of CNPq M.S. fellowships and D.R.M.M. of a

fellowship from CAPES. Our thanks are also due to the Department of Fundamental

Chemistry UFPE, for recording the 1H-NMR and IR spectra of all compounds.

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10. Spectroscopic data: N-(3-acid-i-butanoic acid)-1,3-isoindolinedione (6): NMR – 1H (300

MHz, ppm): δ 2.48 – 2.63 (m, 1H, CH2); 2.11 – 2.05 (m, 1H, CH2); 2.96 – 2.84 (m, 2H, CH2);

5.13 – 5.19 (m, 1H, CH); 7.87 – 7.90 (m, 4H, Ar); 7.80 (m, 4H, Ar); 11.15 (s, 1H, CO2H);

11.33 (s, 1H, CO2H); The 11.15 and 11.33 signals dissapear after adding D2O. NMR – 13

C

(75.5 MHz, ppm): 22.044 (CH2); 30.995 (CH2);49.025 (CH); 122.967 (C2 and C5);

131.261 (C1 and C6); 134.927 (C3 and C4); 167.217 (C=O); 169.960 (CO2H); 172.873

(CO2H). IR (KBr, cm-1

): 3201 (OH); 1775 (C=O); 1740 (C=O); 1465 (C-N-C). N-(3-

indolyl propionic acid)-1,3-isoindolinedione (8): NMR – 1H (300 MHz, ppm): δ 3.58 (d, J =

7.00 Hz, 2H, CH2); 5.15 (t, J = 7.00 Hz, 1H, CH); 6.89 (t, J = 8.00 Hz, 4H, Ar); 7.03 (m,

4H, Ar); 7.27 (d, J = 9.00 Hz, 4H, Ar); 7.49 (d, J = 9.00 Hz, 4H, Ar); 7.79 (sl, 4H, Ar);

10.762 (s, 1H, NH); The 10.762 signal dissapear after adding D2O. NMR – 13

C (75.5 MHz,

ppm): δ 24.140 (CH2); 52.680 (CH); 109.758 (C7); 111.517 (C4); 117.960 (C10); 118.475

(C9); 121.049 (C8); 123.399 (C2' and C5‘); 126.964 (C11); 130.920 (C1‘ and C6‘); 134.923

(C3‘ and C4‘); 168.545 (C=O); 170.461 (CO2H). IR (KBr, cm-1

): 3406 (NH); 3258 (OH);

1771 (C=O); 1715 (C=O); 1464 (C-N-C).

11. Air - pouches were produced on the dorsal cervical region of mice by subcutaneous

injection of 2.5 mL of air for 3 days. Only 6th

day, a suspension of carrageenan (1 mL) was


immediately injected into the air pouch on this third day to induce inflammation and after 1h,

the compounds test were administered orally or i.p. way. After 6h, the mice were killed and

the lumem of the air pouch was lavaged by intrapouch injection of 3 mL of PBS containing

50ng/mL heparin and subsequent aspiration of the fluid. Total numbers of PMNL cells

infiltration were determined with a Newbauer hemacytometer.

12. Jacobs, R. S.; White, S.; Wilson, L. Fed. Proc. 1981, 40, 26-29.

13. The compounds were dissolved in DMSO and in vitro evaluated for their ability to inhibit

splenocytes proliferation at concentration between 1 and 100 g/mL. Cell proliferation was

determined by adding 1 Ci of [3H] – thymidine per well for 24 h at 37C and 5 % CO2. The

cultures were harvested with an automatic cell harvester (Scatron) and [3H] – thymidine was

estimated by liquid scintillation counter. The toxicity of the compounds was determined

comparing the percentage of [3H] – thymidine incorporation of drug-treated wells in relation

to untreated wells. Non-toxic concentrations were defined as those causing a reduction of [3H]

– thymidine incorporation below 30% in relation to untreated controls.

14. (a) Moormann, A. E.; Metz, S.; Toth, M. V.; Moore, W. M.; Jerome, G.; Kornmeier, C.;

Manning, P.; Hansen, D. W.; Pitzele B. S.; Webber, R. W. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001,

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5. CONCLUSÕES

Uma série de oito N-ftaloil-aminoácidos foi sintetizada empregando uma metodologia

simples e economicamente viável.

Dos produtos testados, os compostos N-(3-metil-ácido pentanóico)-1,3-

isoindolinadiona (5) e N-(3-fenil-ácido propiônico)-1,3- isoindolinadiona (7) foram os

mais ativos no teste do bolsão de ar utilizando a dose de 100 mg/Kg por via oral. A

utilização da dose de 10 mg/Kg para o composto 5 revelou que o mesmo apresenta

atividade comparável à talidomida, o que desperta interesse para novos estudos e

síntese de derivados desse composto .

A administração por via oral do composto N-(3-indol-ácido propiônico)-1,3-

isoindolinadiona (8) na dose de 100 mg/Kg revelou interferência da farmacocinética

na redução da atividade biológica.

Nenhum dos compostos apresentou atividade citotóxica frente às linhagens tumorais,

também não foi citotóxica para linhagens de células de mamíferos no ensaio ‗in vitro‘.

O que sugere que os produtos obtidos podem revelar baixos índices de toxicidade.

Com exceção do composto 4, todos os derivados sintetizados foram hábeis em inibir a

produção de NO, com valores de inibição bem próximo do padrão, esse resultado nos

anima submeter as substâncias a ensaios de atividades imunomodulatórias frente a

outros mediadores da inflamação, como TNF-


6. PERSPECTIVAS

Avaliar a toxicidade aguda ‗in vivo‘ para o derivado N-(3-metil-ácido pentanóico)-1,3-

isoindolinadiona (5) e comparar o perfil de toxicidade para a droga padrão, a

Talidomida;

Realizar os ensaios de atividade imunomodulatória frente ao TNF-α, e outras

citocinas, para elucidação dos mecanismos de ações para estes compostos;

N

O

O

CH C

R

O

NH2

NH4OH - t.aN

O

O

CH CO2H

R

IBCF - TEA

Obter os derivados do tipo amida (que são considerados bioisósteros clássicos dos

ácidos carboxílicos) para estes derivados, utilizando as clássicas reações de aminólise

com cloroformiato de i-butila (IBCF) em meio básico, na presença de amônia gasosa

(fornecida pelo refluxo de NH4OH), como ilustrado no esquema acima;

Obtenção dos produtos híbridos, do tipo: N -(aminoacil)-ftalimida-4-tiazolinona, como

mostrado na figura abaixo.

N

O

O

CH C

O

NH NH

N

S

O

R

Aminoácido R Aminoácido R Gly -H Ile -CH(CH3)CH2CH3

Ala -CH3 Glu -CH2CH2CO2H

-Ala -CH2CH2- Phe -CH2C6H5

Val -CH(CH3)2 Trp -CH2(3-indolyl)


GENERALIDADES

OBTENÇÃO DOS DERIVADOS N-FTALIL-AMINOACIL-TIAZOLINONAS

O nosso grupo de pesquisa tem explorado, nos últimos anos, a síntese e atividades

biológicas das 4-tiazolinonas e seus derivados, com destaque para as propriedades

antitumorais (LEITE, 2006) e anti- Tripanossoma cruzi (LEITE, 2006).

Neste contexto, os nossos objetivos iniciais estavam focados na obtenção de derivados

N-(aminoacil)-ftalimida, condensados com o anel 4 - tiazolinona, entretanto, várias tentativas

reacionais (empregando os métodos clássicos de síntese peptídica) sem sucesso nos levaram a

modificar a nossa estratégia sintética (Esquema 15).

R1= Cadeia lateral dos

aminoácidos

ftalil-aminoacil-tiazolinona

ftalil-aminoácido

N

O

O

CH C

O

NH NH

N

S

O

R

N

O

O

CH C

OH

O

R1

+H3N N

HN

S

O

CF3COO-

+

Condensação do ftalil-aminoácido com

TFA-tiazolinona utilizando a ou b como

ativador da carbonila.

a ou b

Esquema 13: Tentativa para obtenção dos derivados N-(aminoacil)-ftalimida-4-tiazolinona.

a) DCC e HOBt, TEA, DCM. b) DIC, TEA, DCM / DMF.

Provavelmente, a função hidrazina do produto 4-tiazolinona não é suficientemente

básica para atacar o ácido carboxílico do N-(aminoacil)-ftalimida, mesmo na presença de

supernucleófilos como DCC (N,N-diclicohexilcarbodiimida) e DIC (N,N-


diisopropilcarbodiimida) em meio básico. Diante desta metodologia sem êxito, novas

estratégias foram vislumbradas.

Consultando a literatura, apenas uma metodologia descreve a reação de condensação

entre L--aminoácidos e derivados da hidrazina (MOULIN, MARTINEZ & FEHRENTZ,

2006), utilizando-se como agente super-nucleofílico o Reagente BOP de Castro ou apenas

BOP [Benzotriazol)1-iloxitris-(dimetilamino)-fosfonio-hexafluorofosfato] em meio básico

com DIEA (Diisopropil-etilamino) em DCM (diclorometano), fornecendo excelentes

rendimentos dos produtos condensados (Esquema 14). Contudo, o reagente de BOP de

Castro é caro e tóxico, isso nos levou a considerar outras estratégias sintéticas, as quais

poderão ser empregadas na continuidade deste trabalho.

60-83% rend

BOC NH

OH

O

NH2 N

H N

+

BOP

DIEA

DCM

BOC NH

N

O

H

N

H N

Esquema 14: Síntese de N-acilhidrazidas-piridinas.

OBTENÇÃO DOS DERIVADOS N-FTALIL-HIDRAZIDAS

Devido ao sucesso e facilidades reacionais em obter as séries de derivados do

tipo N-(aminoácidicos)-1,3-isoindolinadionas (1-8), decidimos sintetizar derivados das

ftalimidas contendo um grupamento hidrazida, empregando esta mesma metodologia.

Inicialmente, tentamos obter os compostos do tipo N-(hidrazida)-1,3-isoindolinadionas


através da condensação (por fusão ou utilizando Microondas) entre quantidades equimolares

do anidrido ftálico e as respectivas hidrazidas, porém os rendimentos foram baixos, e uma

grande quantidade dos produtos de partida foi recuperada. Estas reações foram desenvolvidas

sob refluxo, utilizando ácido acético como solvente, os produtos foram obtidos com

excelentes rendimentos e facilmente purificados com clorofórmio a quente. (Esquema 17).

70-93%

Onde X : O, S

R1: H, CH3, C6H5 (X: S)

N

O

O

N

NH

X

HR1

O

O

O

NH2NHC(X)NH2

AcOH, refluxo

3-5 hs

Esquema 15: Síntese de inéditas N-(hidrazidas)-1,3-isoindolinadionas.

Com o êxito nesta etapa, decidimos realizar a reação de ciclização do derivado N-

(tiosemicarbazida)-1,3-isoindolinadiona, para obter o composto N-(4‘-tiazolinona)-1,3-

isoindolinadiona, um importante composto intermediário para os novos objetivos iniciais de

preparação dos produtos híbridos, do tipo N-(aminoacil)-1,3-isoindolinadionas-4‘-tiazolinona.

Na reação com a tiosemicarbazida foi realizada, obteve-se o produto esperado, com bom grau

de pureza e rendimento, utilizando-se o clássico método de ciclização em meio básico

(acetato de sódio anidro) na presença de ácido –α-cloroacético em etanol seco sob refluxo

forte (Esquema 18), fornecendo 75 % de rendimento de um pó branco amorfo.

N

O

O

N

H N

S

O

ClCH2CO2H

AcONa, EtOH

refluxo, 5h

N

O

O

N

NH2

S

H

Esquema 16: Síntese do derivado N-(4‘-tiazolinona)-1,3-isoindolinadiona


Todos estes produtos foram caracterizados por espectroscopia de IV e RMN-1H (dados

não mostrados). Estes derivados das hidrazidas e 4-tiazolinona são inéditos e representam

estratégicos compostos para comparar as atividades biológicas com os produtos do tipo

híbridos, além deles próprios serem dotados de interessantes funcionalidades químicas, que

denotam potenciais ações bioativas.


METODOLOGIAS: REACIONAL E DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS

PARTE EXPERIMENTAL

Os solventes utilizados foram de grau analítico e usados sem prévia purificação. Para

todas as reações de condensação, o anidrido ftálico (Fluka, USA), foi rapidamente macerado

até se obter um pó finamente cristalino (devido a sua propriedade higroscópica). Todos os

produtos da série foram obtidos como pós amorfos ou cristalinos, sem a necessidade de

purificação por coluna cromatográfica. Os aminoácidos (enantiômero S) utilizados foram

adquiridos da Sigma-Aldrish (USA) ou Acros (USA) e são de grau analítico.

Os pontos de fusão (em °C) foram determinados em um aparelho Quimis (modelo

340) e não foram corrigidos. As Cromatografias em Camada Delgada foram efetuadas em

placa Merck Kieselgel 60 F254 de 0,25mm de espessura e revelado por luz ULTRAVIOLETA

(254 ou 320 mm). Os valores de Rf, determinaram-se utilizando o sistema eluente 8:2 –

clorofórmio: metanol. Os espectros de RMN, registraram-se em um aparelho Varian

UnityPlus (300 MHz para hidrogênio e 75.5 MHz para carbono 13), e estão expressos em

ppm em relação ao TMS. Obteve-se os espectros de IV em um espectrofotômetro Bruker,

modelo IF 566, usando pastilhas de KBr.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Preparou-se um banho de óleo e este foi aquecido até atingir a temperatura de 180

graus, após estabilização desta temperatura por 15 minutos, um tubo de vidro foi colocado no

banho de óleo contendo os reagentes, anidrido ftálico e o respectivo aminoácido (em

proporções equimolares): A reação foi mantida sob aquecimento por 15 minutos e com o


auxílio de uma espátula o anidrido ftálico foi recolocado na mistura reacional à medida que o

mesmo sublimava. Após fusão da mistura reacional o tubo foi retirado do aquecimento e

imediatamente formou-se um precipitado. Dos oito produtos sintetizados apenas dois não

formaram precipitados: N-(3-metil-ácido pentanóico)-1,3-isoindolinadiona (5) e o N-(3-metil-

ácido butanóico)-1,3- isoindolinadiona (4), no qual ao término da reação formou-se um

produto com alta viscosidade e adesividade que foi lavado com n-hexano (50 mL) para

facilitar a cristalização. Formou-se, então, um pó branco amorfo que foi filtrado em funil

sinterisado com rendimentos de 74% e 50%, respectivamente.


ENSAIOS BIOLÓGICOS

Atividade antiinflamatória: Foram usados camundongos albinos suíços, machos, pesando

30-35 g, e com idades entre 2-3 meses, provenientes do Biotério do Departamento de

Antibióticos da UFPE. Os bolsões de ar foram induzidos pela injeção no dorso (por três dias

consecutivos), de 2,5 mL de ar através de seringas estéreis. Após seis dias, uma solução de

Carragenina (1 mL) foi injetada no bolsão formado, e então, após uma hora os compostos

foram administrados (como soluções salinas, suspensos em DMSO ou Tween 80) por via oral.

Logo após seis horas da administração dos compostos testados (exceto no composto 8, que

também foi testado por via intraperitoneal, no qual exudato foi coletado após 24 hs),

sacrificaram-se os animais e os bolsões de ar foram cuidadosamente lavados com solução de

PBS (3 mL), contendo heparina à 50 µg.mL-1

, e os exudatos foram coletados. O número total

de infiltrações de leucócitos polimorfonucleares (PMNL) foi mensurado em uma câmara de

Neubauer. O controle negativo utilizado foi a solução de PBS, e a droga padrão foi a

Talidomida (Origem: CIMED - Brasil, 100 mg, sem excipientes). Os resultados foram

expressos como o percentual de inibição dos níveis de PMNL para os compostos, em

comparação ao controle negativo (veículo).

Atividade citotóxica frente às células de mamíferos:. Os testes foram conduzidos tendo como

controle th (0,05%) (droga com atividade citotóxica conhecida) e cultura de esplenócitos sem

tratamento. A percentagem de atividade nos esplenócitos foi determinada comparando-se os

valores das absorbâncias dos poços incubados com os compostos e os valores do controle sem

tratamento. As concentrações atóxicas foram definidas como aquelas que causaram uma

redução na incorporação com timidina tritiada abaixo de 30% em relação ao controle sem

tratamento (células esplênicas sem as substâncias testadas).


Atividades citotóxicas frente às células tumorais: As linhagens utilizadas, MDA-MB435

(mama - humano), HCT-8 (cólon - humano) e SF-295(glioblastoma - humano), foram cedidas

pelo Instituto Nacional do Câncer (EUA), tendo sido cultivadas em meio RPMI 1640,

suplementados com 10 % de soro fetal bovino e 1 % de antibióticos, mantidas em estufa a 37

C e atmosfera contendo 5% de CO2. As células foram plaqueadas na concentração de 0,1 x

106 cel./mL para as linhagens MDA/MB-435 e SF-295 e 0,7 x 10

5 seu/mL para a linhagem

HCT-8. Os diversos compostos foram acrescidos em concentração única de 25 g/mL As

placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5% de CO2 a 37C. Ao término deste, as

mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante, removido. Em seguida, adicionou-se 150 L

da solução de MTT (sal de tetrazolium), e as placas incubadas por 3h. A absorbância foi lida

após dissolução do precipitado com 150 L de DMSO puro em espectrofotômetro de placa a

590 nm.


DADOS DE ESPECTROSCOPIA

N-(ácido etanóico)-1,3- isoindolinadiona (1)

Rend. 96 %, Rf: 0.5; pf: 187-191. RMN – 1H (300 MHz, ppm): δ 4.15 (s, 2H, CH2); 7.50-7.70

(m, 4H, Ar); 10.58 (s, 1H, CO2H). RMN – 13

C (75.5 MHz, ppm): δ 39.1 (CH2); 122.4 (C2 e

C5); 132.6 (C1 e C6); 135.8 (C3 e C4); 165.9 (C=O); 174.9 (CO2H). IR (KBr, cm-1

): 3212

(νOH); 1775 (νC=O); 1715 (νC=O); 1401 (νC-N-C); 1374 (νC-N-C).

N-(i-ácido propiônico)-1,3- isoindolinadiona (2)

Rend. 70 %, Rf: 0.46; pf: 135. RMN – 1H (300 MHz, ppm): δ 1.70 (d, J= 7.5 Hz, 3H, CH3);

5.02 (q, J= 7.5 Hz, 1H, CH); 7.70-7.85 (m, 4H, Ar); 10.02 (s, 1H, CO2H). RMN – 13

C (75.5

MHz, ppm): δ 16.9 (CH3); 51.7 (CHα); 122.4 (C2 e C5); 132.7 (C1 e C6); 135.8 (C3 e C4);

165.6 (C=O); 171.9 (CO2H). IR (KBr, cm-1

): 3205 (νOH); 1752 (νC=O); 1740 (νC=O); 1469

(νC-N-C); 1397 (νC-N-C).

N-(n-ácido propiônico)-1,3- isoindolinadiona (3)

Rend. 90%, Rf: 0.5; pf: 133-135. RMN – 1H (300 MHz, ppm): δ 2.50 (t, J= 15.0 Hz, 2H,

CH2); 3.77 (t, J= 15.0 Hz, 2H, CH2), 7.67-7.51 (m, 4H, Ar), 8.07 (s, 1H, CO2H). RMN – 13

C

(75.5 MHz, ppm): δ 29.5 (CH2); 33.1 (CHα); 122.4 (C2 e C5); 132.6 (C1 e C6); 135.8 (C3 e

C4); 165.9 (C=O); 175.9 (CO2H). IR (KBr, cm-1

): 3170 (νOH); 1771 (νC=O); 1727 (νC=O);

1466 (νC-N-C); 1411 (νC-N-C).

N-(3-metil-ácido butanóico)-1,3- isoindolinadiona (4)

Rend. 50 %, Rf: 0.60; pf: 79-81. RMN – 1H (300 MHz, ppm): δ 1.9 (d, J = 4.0 Hz, 6H, CH3);

2.70-2.79 (m, 1H, CH); 4.98 (d, J = 5.0 Hz, 1H, CH); 8.11 (d, J = 7 Hz, Ar); 8.16 (d, J = 7.0


Hz, Ar); 9.14 (s, 1H, OH). RMN – 13

C (75.5 MHz, ppm): δ 18.9 (CH3); 29.5 (CH); 56.5

(CHα); 122.4 (C2 e C5); 130.7 (C1 e C6); 135.9 (C3 e C4); 165.5 (C=O); 172.9 (CO2H). IR

(KBr, cm-1

): 3234 (νCO2H); 1763 (νC=O); 1691 (νC=O); 1469 (νC-N-C); 1401 (νC-N-C).

N-(3-metil-ácido pentanóico)-1,3- isoindolinadiona (5)

Rend. 74 %, Rf: 0.5; pf 110-112. RMN – 1H (300 MHz, ppm): δ 0.87 (d, J= 7.2 Hz, 3H); 1.22

(t, J = 6.3 Hz, 3H); 1.50-1.49 (m, 2H); 2.54-2.52 (m, 1H); 4.70 (d, J= 8.4 Hz, 1H); 7.87-7.72

(m, 4H); 9.45 (s, 1H, OH). RMN – 13

C (75.5 MHz, ppm): δ 10.6 (CH3); 16.6 (CH3); 25.4

(CH2); 33.9 (CH); 56.5 (CHα); 122.9 (C4 e C9); 131.3 (C5 e C8); 133.8 (C6 e C7); 167.5

(C=O); 170.3 (CO2H). IR (KBr, cm-1

): 3250 (νOH); 1763 (νC=O); 1703 (νC=O); 1460 (νC-

N-C); 1394 (νC-N-C).

N-(3-acido-ácido butanóico)-1,3- isoindolinadiona (6)

Rend. 31,9 %, Rf: 0.58; pf: 204-207. RMN – 1H (300 MHz, ppm): δ 2.48 – 2.63 (m, 2H,

CH2); 2.11 – 2.05 (m, 1H, CH2); 2.96 – 2.84 (m, 1H, CH2); 5.13 – 5.19 (m, 1H, CH); 7.87 –

7.90 (m, 2H, Ar); 7.80 (m, 2H, Ar); 11.15 (s, 1H, OH); 11.33 (s, 1H, OH); Os sinais em 11.15

e 11.33 desaparecem após adição de D2O. RMN – 13

C (75.5 MHz, ppm): δ22.0 (CH2); 30.9

(CH2);49.0 (CHα); 122.9 (C2 e C5); 131.2 (C1 e C6); 134.9 (C3 e C4); 167.2 (C=O); 169.9

(CO2H); 172.8 (CO2H). IR (KBr, cm-1

): 3201 (νOH); 3095 (νNH2); 1775 (νC=O); 1740

(νC=O); 1465 (νC-N-C); 1385 (νC-N-C).

N-(3-fenil-ácido propiônico)-1,3- isoindolinadiona (7)

Rend. 87,4 %, Rf: 0.54; pf: 167-170. RMN – 1H (300 MHz, ppm): δ 3.60 (d, J = 9.0 Hz, 2H,

CH2); 5.258 (t, J = 7.0 Hz, 1H, CH); 7.15 – 7.196 (m, 5H, Ar); 7.65 – 7.68 (m, 2H, Ar); 7.76

– 7.790 (m, 2H, Ar); 9.01 (s, 1H, OH). RMN – 13

C (75.5 MHz, ppm): δ 34.0 (CH2); 52.9


(CHα); 123.4 (C2‘ e C5‘); 126.6 (C5 e C9); 128.3 (C6); 128.7 (C8); 130.7 (C7‘); 135.0 (C3‘ e

C4‘); 137.3 (C4); 167.2 (C=O); 170.2 (CO2H). IR (KBr, cm-1

): 3274 (νCO2H); 1752 (νC=O);

1704 (νC=O); 1450 (νC-N-C); 1398 (νC-N-C).

N-(3-indolil-ácido propiônico)-1,3- isoindolinadiona (8)

Rend. 96 %, Rf: 0.48; pf: 94-96. RMN – 1H (300 MHz, ppm): δ 3.58 (d, J = 7.00 Hz, 2H,

CH2); 5.15 (t, J = 7.00 Hz, 1H, CH); 6.89 (t, J = 8.00 Hz, 1H, Ar); 7.03 (m, 2H, Ar); 7.27 (d,

J = 9.00 Hz, 1H, Ar); 7.49 (d, J = 9.00 Hz, 1H, Ar); 7.79 (sl, 4H, Ar); 10.76 (s, 1H, NH); O

sinal em 10.76 desaparece após adição de D2O. RMN – 13

C (75.5 MHz, ppm): δ 24.1 (CH2);

52.6 (CHα); 109.7 (C7); 111.5 (C4); 117.9 (C10); 118.4 (C9); 121.0 (C8); 123.3 (C2' e C5‘);

126.9 (C11); 130.9 (C1‘ e C6‘); 134.9 (C3‘ e C4‘); 168.5 (C=O); 170.4 (CO2H). IR (KBr, cm-

1): 3406 (νNH); 3058 (νOH); 1771 (νC=O); 1715 (νC=O); 1464 (νC-N-C); 1393 (νC-N-C).


ESPECTROS SELECIONADOS

Fig

ura

1.

RM

N –

1H

em

CD

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00 M

Hz

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(1).


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2.

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cido e

tanóic

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1,3

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(1).


Fig

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3.

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1H

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Hz

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(6).


Fig

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4.

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1H

em

DM

SO

-d6 a

300 M

Hz

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a o N

-(3

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(6),

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(6).


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7.

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(7).


Fig

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8.

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(7).


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(7).


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10.

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11.

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DM

SO

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300 M

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.


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14.

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13.

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(8).


Fig

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14.

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1H

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15.

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(5).


Fig

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16.

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(5),

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ARTIGO E TRABALHOS PUBLICADOS DURANTE O MESTRADO

sÍntese e avaliaÇÃo das atividades antiinflamatÓria ... · síntese e avaliação das...

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