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Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei
Prostatakarzinomzelllinien
Doreen Kunze
20.05.05
Institut für Biochemie
Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften
Technische Universität Dresden
Klinik und Poliklinik für Urologie
Universitätsklinikum Carl Gustav Carus
Technische Universität Dresden
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Ziele
1. Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene
2. Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK
3. Hormonabhängigkeit der P38IP-mRNA-Expression
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1. P38IP-mRNA-Inhibition (Einleitung)
Prostatakarzinom (PCa)
• häufigste Krebserkrankung bei Männern
• zweithäufigste Krebs-Todesursache
• Lebenszeitrisiko:– Zu erkranken: 9,6 %– Zu sterben: 3,2 %
• Häufigkeitsgipfel zw. 70 – 75 Lebensjahr
• genetisch sehr heterogen
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1. P38IP-mRNA-Inhibition (Einleitung)
P38IP• C13ORF19, Fam48A
• lokalisiert auf 13q13 zwischen zwei Tumorsuppressorgenen
• mRNA-Expression im PCa reduziert
• Hypothese: Tumorsuppressorfunktion in Prostatagewebe: verbesserte Proliferation der PCa-Zellen nach Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression
Chromosom 13
13RB1
C 13BRCA2
In situ Hybridisierung von Prostatagewebe mit P38IP
Schematische Darstellung des längsten offenen Leserahmens im P38IP-Gen und das abgeleitete Proteinmuster.
PEST-RegionKernlokalisierungssignal
Glutamin-Cluster-Helix-Region
733 AA
CN
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1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (M & M, Ergebnisse)
• M & M:
• Ergebnisse:
h nach TF-Start
siRNA-D1
siRNA-D2
siRNA-D3
siRNA-D4
siRNA-D5
12 42 % 49 % 22 % 55 % 12 %
24 50 % 58 % 40 % 56 % 16 %
48 45 % 45 % 32 % 67 % 23 %
72 56 % 50 % 36 % 93 % 31 %
020406080
100
0 100 200 300 400 500 600
Konzentration der siRNA in nM
P38I
P-m
RNA
-Ex
pres
sion
/PBG
D no
rmie
rt
auf n
s-si
RNA
siRNA-D3 siRNA-D5
Aussaat(PC-3, BPH-1)
Transfektion(4 h)
24 – 72 h WST-1-Test
ZellzählungRNA-Isolierung + qPCR
ApoptosemessungZellzyklustest
ZellkoloniebildungstestWestern Blot
20 – 68 h
Tf mit 250 nM siRNA:
24 h nach Tf:
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1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (Ergebnisse)
unbehandelt 48 h
siRNA-D5 48 h
5,5 %
ns-siRNA 48 h
4,9 % 4,3 %
Apoptosemessung (FACS) - Tf mit 125 nM siRNA
ZellkoloniebildungstestWST-Test 48 h nach Tf
0
40
80
120
160
200
ns-s
iRNA
siRN
A-D
5
unbe
hand
elt
Kolo
niez
ahl
100 Zellen/w ell 125 nM
150 Zellen/w ell 125 nM
300 Zellen/w ell 250 nM
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
ns-s
iRN
A
siR
NA-
D3
siR
NA-
D5
ns-s
iRN
A
siR
NA-
D3
siR
NA-
D5
unbe
hand
elt
OD
450
125 nM 250 nM
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1.1 P38IP-mRNA-Inhibition (Ergebnisse)
0%
20%
40%
60%
80%
100%ns
-siR
NA
siR
NA
-D5
unbe
hand
elt
ns-s
iRN
A
siR
NA
-D5
unbe
hand
elt
ns-s
iRN
A
siR
NA
-D5
unbe
hand
elt
G0-G1 S-Phase G2-M
24 h 48 h 72 h
langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression
keine Kurz- und Langzeit- Proliferationseffekte
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1.2 Chemoprotektion (M & M, Ergebnisse)
• M & M:
• Ergebnisse:
CT (Etoposid, Docetaxel; 24 h)
Aussaat(PC-3)
Transfektion(4 h)
24 – 72 h 20 h WST-1-Test
ZellzählungApoptosemessung
Zellzyklustest
24 – 72 h
WST-1-Test: 96 h nach Tf
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
ns-s
iRN
A
siR
NA
-D5
Eto
posi
d
ns-s
iRN
A +
Eto
posi
d
siR
NA
-D5
+E
topo
sid
Eto
posi
d
ns-s
iRN
A +
Eto
posi
d
siR
NA
-D5
+E
topo
sid
unbe
hand
elt
OD
450
5 µM 20 µM
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1.2 Chemoprotektion (Ergebnisse)
0
4
8
12
16
20
ns-siRNA siRNA-D5 Etoposid ns-siRNA +Etoposid
siRNA-D5 +Etoposid
unbehandelt
Apo
ptos
erat
e in
%
0
0,5
1
1,5
2
2,5
ns-siRNA siRNA-D5 Etoposid ns-siRNA +Etoposid
siRNA-D5 +Etoposid
unbehandelt
Zellz
ahl (
x 10
6 )
0%
20%
40%
60%
80%
100%
ns-s
iRN
A
siR
NA
-D5
Eto
posi
d
ns-s
iRN
A +
Eto
posi
d
siR
NA
-D5
+E
topo
sid
unbe
hand
elt
G0-G1 S-Phase G2-M
A
B125fache VergrößerungA: PC-3 siRNA-D5B: PC-3 siRNA-D5 + Etoposid
Zellzyklusarrest, keine Apoptoseinduktion
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2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Einleitung)
• P38IP = p38MAPK interacting protein
• MAPK = mitogen-aktivierte Proteinkinase• intrazelluläre Signalübertragung
(Proteinkinasen-Kaskaden)• streßaktiviert• 4 Isoformen (α, β, γ, δ)
• SB203580 inhibiert p38α und p38β durch Bindung an ATP-Bindestelle
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2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (M & M, Ergebnisse)
• M & M:
• Ergebnisse:
Aussaat (PC-3, BPH-1)
DMEM ohne FKS
24 – 72 h 24 – 72 h ZellzählungRNA-Isolierung + qPCRWestern Blot (HSP27)
10 – 60 minSB203580(0,5 – 8 µM)
020406080
100120140160
DM
SO
0,5
µM
2 µM
8 µM
unbe
hand
elt
DM
SO
0,5
µM
2 µM
8 µM
unbe
hand
elt
P38I
P-m
RNA-
Expr
essi
on re
lativ
zu
TBP
norm
iert
auf D
MSO
BPH-1 PC-3
kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK erkennbar
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2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Ergebnisse, Ausblick)
• Ergebnisse:
HSP 27ß-Actin
HSP27 ist kein geeigneter Nachweis für p38MAPK-Inhibition
• Ausblick:Einfluss von siRNA-D5-Behandlung auf p38MAPK ?
(Western Blot mit AK gegen p38MAPK)
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3. Hormonabhängigkeit (M & M, Ergebnisse)
• M & M:
• Ergebnisse:
P38IP-mRNA-Expression ist nicht hormonabhängig
Aussaat Hormonfreies Medium
24 h 3 – 48 hAndrogen R1881(+ Casodex)
24 h RNA-Isolierung + qPRC
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
0 10 20 30 40 50
Zeit (in h)
P38I
P-m
RNA
-Ex
pres
sion
/TBP
1 nM R1881 1 nM R1881 + Casodex10 nM R1881 10 nM R1881 + Casodex
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40 50
Zeit (in h)
PSA
-mRN
A-Ex
pres
sion
/TBP
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Zusammenfassung
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !
langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression
keine Kurz- und Langzeit- Proliferationseffekte
kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK
P38IP-mRNA-Expression ist nicht hormonabhängig