untersuchungen zur funktion des p38ip-gens bei prostatazelllinien doreen kunze 21.07.05 institut...
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Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatazelllinien
Doreen Kunze
21.07.05
Institut für Biochemie
Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften
Technische Universität Dresden
Klinik und Poliklinik für Urologie
Universitätsklinikum Carl Gustav Carus
Technische Universität Dresden
Einleitung
• häufigste Krebserkrankung bei Männern
• zweithäufigste Krebs-Todesursache
• Lebenszeitrisiko:– zu erkranken: 9,6 %– zu sterben: 3,2 %
• Häufigkeitsgipfel zwischen 70. – 75. Lebensjahr
• genetisch und tumorbiologisch sehr heterogen
2
Prostatakarzinom (PCa)
Einleitung 3
Tumorentwicklung
• Überexpression von Onkogenen und/oder funktionelle Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen (TSG)
• PCa:– Onkogene: Progression– TSG: Entstehung
→ häufig Allelverluste (LOH – loss of heterozygosity) auf den
Chromosomen- abschnitten 8p und 13q
Einleitung
P38IP (C13orf19, FAM48A)
• lokalisiert auf 13q13 zwischen zwei TSG
• LOH-Ereignisse
• mRNA-Expression in primären PCa reduziert
Chromosom 13
13RB1
C 13BRCA2
• Hypothese: Tumorsuppressorfunktion in Prostatagewebe
→ verbesserte Proliferation der PCa-Zellen nach Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression ?
4
Einleitung
siRNA (small interfering RNA)
5
Zellkern
Target-mRNA
Target-Gen
polyA
polyA
polyA
Sequenzspezifisches Gensilencing
Target-mRNA- Spaltung
Aktivierter RISC
ATP
ADP + Pi
zelluläre Kinase
RISC
Bildung von RISC
siRNA-Entwindung
Anlagerung von RISCan Target-mRNA
siRNA
modifiziert nach D. Bauer
• Bestandteil der RNA-
Interferenz
• posttranskriptionelle
Geninhibierung
• 2 nt-3`-Überhänge
• antisense-Strang aktiviert
RISC (RNA induced
silencing complex)
• Hydrolyse
komplementärer mRNA
1. Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene ?
2. Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK ?
3. Androgenabhängigkeit der P38IP-mRNA-Expression ?
6Ziele
1.1 P38IP-mRNA-Inhibition
h nach TF-Start
siRNA-D1 (2245-2265 nt)
siRNA-D2 (2215-2235 nt)
siRNA-D3 (1024-1044 nt)
siRNA-D4 (440-460 nt)
siRNA-D5 (1288-1308 nt)
12 42 % 49 % 22 % 55 % 12 %
24 50 % 58 % 40 % 56 % 16 %
48 45 % 45 % 32 % 67 % 23 %
72 56 % 50 % 36 % 93 % 31 %
Aussaat(PC-3, BPH-1)
siRNA-Transfektion(125 + 250 nM, 4 h)
24 – 72 h WST-1-Test
ZellzählungRNA-Isolierung + qPCR
ApoptosemessungZellzyklustest
Zellkoloniebildungstest
20 – 68 h
Zeitabhängige Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression in PC-3-Zellen:
effektive, langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression
P38IP-mRNA-Expression/PBGD, normiert auf ns-siRNA; Klammerausdruck: Position des sense-Stranges der siRNA auf der P38IP-mRNA (3077 nt)
7
1.1 P38IP-mRNA-Inhibition
Zellkoloniebildungstest
WST-1-Test
→ keine Kurzzeit-
proliferations-
veränderungen
0
20
40
60
ns-s
iRN
A
siR
NA-D
5
unbe
hand
elt
Kolo
niez
ahl
100 Zellen/w ell
150 Zellen/w ell
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6ns
-siR
NA
siR
NA
-D5
ns-s
iRN
A
siR
NA
-D5
unbe
hand
elt
OD
450
nm
125 nM 250 nM
8
→ keine Langzeit-
proliferations-
effekte
1.1 P38IP-mRNA-Inhibition
0%
20%
40%
60%
80%
100%
ns-s
iRN
A
siR
NA-
D5
unbe
hand
elt
ns-s
iRN
A
siR
NA-
D5
unbe
hand
elt
ns-s
iRN
A
siR
NA-
D5
unbe
hand
elt
G2-M
S-Phase
G0-G1
24 h 48 h 72 h
Zellzyklusverteilung
→ keine
Zellzyklus-
veränderungen
9
unbehandeltsiRNA-D5
5,5 %
ns-siRNA
4,9 % 4,3 %
Apoptosemessung (FACS) - 48 h
→ keine
Veränderung
der Apoptoserate
1.2 Kombinationsbehandlung mit siRNA und CT
CT (Etoposid, Docetaxel; 24 h)
Aussaat(PC-3)
siRNA-Transfektion(250 nM, 4 h)
24 – 72 h 20 h WST-1-Test
ZellzählungApoptosemessung
Zellzyklustest
24 – 72 h
0%
4%
8%
12%
16%
20%
ns-s
iRN
A
siR
NA-
D5
Eto
posi
d
ns-s
iRN
A +
Eto
posi
d
siR
NA-
D5
+E
topo
sid
unbe
hand
elt
Apop
tose
rate
Zellzahlreduktion
infolge CT-Behandlung
keine Kombinations-
effekte
keine Apoptoseinduktion
10
0
3
6
9
12
15
1 2 3 4 5 6
Zellz
ahl (
x10
5 )
1.2 Kombinationsbehandlung mit siRNA und CT
0%
20%
40%
60%
80%
100%
ns-s
iRN
A
siR
NA
-D5
Eto
posi
d
ns-s
iRN
A +
Eto
posi
d
siR
NA
-D5
+E
topo
sid
unbe
hand
elt
G0-G1 S-Phase G2-M
125fache VergrößerungA: PC-3 siRNA-D5B: PC-3 siRNA-D5 + Etoposid
Vergrößerung der
Zellen infolge des
G2/M-Arrestes
Zellzyklusverteilung
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CT-vermittelter
Zellzyklusarrest
effektive und langanhaltende Geninhibition durch siRNA
P38IP hat keinen Einfluss auf das Wachstum der untersuchten Prostatazelllinien
verminderte Expression nicht ursächlich mit PCa-Entstehung verbunden
möglicherweise mit Progression der Karzinome assoziiert oder Begleiterscheinung der zunehmenden genetischen Instabilität auf dem Chromosom 13q
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Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene
Zusammenfassung 1.Teil
2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK
P38IP = p38MAPK interacting protein
• MAPK = mitogenaktivierte Proteinkinase• intrazelluläre Signalübertragung
(Proteinkinasen-Kaskaden)• stressaktiviert• 4 Isoformen (α, β, γ, δ)
• SB203580 inhibiert p38α und p38β durch Bindung an ATP-Bindestelle
Quelle: www.cellsignalingtechnology.com
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2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK
Inhibition der p38MAPK durch SB203580
P38IP-mRNA-Expression
Inhibition der P38IP- mRNA-Expression mit siRNA-D5
Expression und Phosphorylierungsstatus der p38MAPK
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2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK
Expression & Phosphorylierungsstatus der p38MAPK unverändert
1. Inhibition von P38IP mit siRNA-D5
15
phospho-p38MAPK
β-Actin
β-Actin
p38MAPK (gesamt)
siRNA-D
5
unbe
hand
elt
unbe
hand
elt
unbe
hand
elt
ns-si
RNA
siRNA-D
5
ns-si
RNA
siRNA-D
5
Mark
er
PC-3
Erntezeitpunkt nach Transfektion: 72 h 96 h 72 h
2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Ergebnisse)
kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK
2. Inhibition der p38MAPK mit SB203580
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
DMSO
0,5
µM S
B203
580
2 µM
SB2
0358
0
8 µM
SB2
0358
0
unbe
hand
elt
DMSO
0,5
µM S
B203
580
2 µM
SB2
0358
0
8 µM
SB2
0358
0
unbe
hand
elt
P38I
P-m
RNA-
Expr
essi
on/T
BP n
orm
iert
auf
DM
SO-
beha
ndel
te Z
elle
nBPH-1 PC-3
16
3. Androgenabhängigkeit
P38IP-mRNA-Expression ist nicht androgenabhängig
Aussaat (LNCaP)
Hormonfreies Medium
24 h 3 – 48 hAndrogen R1881(+ Bicalutamid)
24 h RNA-Isolierung + qPCR
17
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
0 10 20 30 40 50Zeit (in h)
P38I
P-m
RNA-
Expr
essi
on re
lativ
zu
TBP
1 nM R1881 1 nM R1881 + 10 µM Bicalutamid10 nM R1881 10 nM R1881 + 10 µM Bicalutamid
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40 50Zeit (in h)
PSA
-mR
NA-
Expr
essi
onre
lativ
zu
TBP
Zusammenfassung 18
1. P38IP besitzt keine Tumorsuppressor-funktion in den untersuchten Zelllinien
2. Kein Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK → Genbezeichnung: C13orf19 oder FAM48A
3. P38IP-mRNA-Expression ist androgen-unabhängig
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !
Etoposid:
Glykosidderivat des Podophyllotoxins(amerikan. Maiapfel)
Docetaxel:
Taxoid
(europ. Eibe – Taxus baccata)
Chemotherapeutika
O
OH
R1881 (Methyltrienolon) BicalutamidCN
CF3
HN C
O
C
CH3
OH
CH2
SO2
F
O
OH
Dihydrotestosteron
Androgenabhängigkeit
LOH-PCR
Epitheliale Expression
In situ Hybridisierung von Prostatagewebe mit P38IP-mRNA(Schmidt et al. 2001)
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 100 200 300 400 500 600
Konzentration der siRNA (nM)
P38I
P-m
RNA-
Expr
essi
on/P
BGD
norm
iert
auf n
s-si
RNA
siRNA-D3 siRNA-D5
Konzentrationsabhängigkeit