uniwersytet w arszawski ci - biol.uw.edu.pl · regulamin pracowni 1. w pracowni nale $y zachowa...

Zak!ad Biologii Molekularnej

BIA&KA i KWASY NUKLEINOWE

Materia!y do zaj"# dla studentów

w roku akademickim 2008

Uniwersytet Warszawski

wersja 1.5

wersja elektroniczna dost"pna @ www.biol.uw.edu.pl/zbm/

Wpisz w ramk" poni$ej swoje imi" i nazwisko

Spis tre!ci

Regulamin pracowni....................................................... 3Wst"p................................................................................ 4Literatura ogólna............................................................ 6Zespó# prowadz$cy zaj"cia............................................ 6

%wiczenia

1. Oczyszczanie bia!ek HMG z grasicy ciel"cej........................... 7

2. Oczyszczanie rekombinowanego ludzkiego bia!ka SF2/ASF

z komórek bakterii Escherichia coli ........................................ 13

3. Badanie oddzia!ywa# bia!ek Fos2 i ERH w dro$d$owym

systemie dwuhybrydowym........................................................

23

4. Identyfikacja transformantów dro$d$owych metod% PCR.........

29

Appendix

1. Elektroforeza bia!ek w $elu poliakryloamidowym

zawieraj%cym SDS (SDS-PAGE).............................................. 33

2. Elektroforeza DNA w $elu agarozowym.................................... 36

3. Po co s% te substancje w roztworach stosowanych podczas

&wicze#?................................................................................... 38

Uwaga !!! W skrypcie zastosowano nast"puj%ce oznaczenia:

1. Znakiem ! oznaczono uwagi dotycz%ce czynno'ci niebezpiecznych dla

zdrowia.

2. Podane w cz"'ci opisuj%cej wykonanie &wiczenia numery odczynników (w

kwadratowych [ ] nawiasach) odpowiadaj% numerom stosowanym w spisie

odczynników.

! Zak!ad Biologii Molekularnej UW, kwiecie# 2008 r

2/39

Regulamin pracowni

1. W pracowni nale$y zachowa& ostro$no'&, porz%dek i czysto'&.2. W pracowni nale$y nosi& bezpieczne obuwie i fartuch laboratoryjny, a przy

pracy z substancjami szkodliwymi r"kawiczki gumowe. Okrycia wierzchnie

nale$y pozostawi& w szatni wydzia!owej.

3. Opuszczaj%c stanowisko pracy nale$y sprawdzi& czy wszystkie niepotrzebne

urz%dzenia elektryczne, gaz i woda zosta!y wy!%czone, drobny sprz"t od!o$ony

na miejsce, a u$yte naczynia laboratoryjne umyte i od!o$one do suszenia.

4. Studenci nie mog% pracowa& w pracowni bez opieki pracownika

dydaktycznego.

5. W pracowni nie wolno pali& tytoniu, spo$ywa& posi!ków i napojów, aplikowa& kosmetyków. Nie u$ywa& do celów spo$ywczych naczy# laboratoryjnych.

6. Odczynniki nale$y przechowywa& w odpowiednim porz%dku. Nie wolno

trzyma& $adnych substancji w niepodpisanych opakowaniach. )atwopalne

rozpuszczalniki, a tak$e st"$one kwasy i zasady mo$na przechowywa& w

pracowniach pod wyci%giem tylko w ilo'ciach zaspokajaj%cych bie$%ce

potrzeby.

7. Prace z rozpuszczalnikami organicznymi nale$y prowadzi& przy sprawnie

dzia!aj%cej wentylacji. Podczas pracy nie wolno u$ywa& otwartego ognia.

Etanol u$ywany w pracowni jest ska$ony.

8. Prace z kwasami i zasadami nale$y prowadzi& pod sprawnie dzia!aj%cym

wyci%giem chemicznym.

9. Nigdy nie nale$y pipetowa& ustami substancji truj%cych, $r%cych lub innych

szkodliwych dla zdrowia.

10. Odpadów substancji, które mog% stanowi& zagro$enie dla 'rodowiska

naturalnego nie wolno wylewa& do zlewów. Nale$y je zlewa& do szczelnych

podpisanych butelek i przechowywa& pod wyci%giem. B"d% okresowo zbierane

do zniszczenia.

11. Odpady innych st"$onych substancji mo$na wylewa& do zlewu po ich

znacznym rozcie#czeniu, obficie sp!ukuj%c wod% z kranu.

12. Okna w pracowni mo$na tylko uchyla& w pozycji pionowej. Nie otwiera& ich

na o'cie$.13. W razie zaistnienia nawet najmniejszego wypadku nale$y niezw!ocznie

powiadomi& opiekuj%cego si" pracowni% pracownika dydaktycznego.


3/39

Wst"p

Szanowni Pa#stwo,

Witamy na pracowni "Bia!ka i kwasy nukleinowe". Cieszymy si" bardzo, $e

wybrali Pa#stwo nasze zaj"cia z bogatej oferty Wydzia!u Biologii.

W tym roku akademickim przygotowali'my dla Pa#stwa now%, poszerzon% wersj" skryptu do &wicze#. Mamy nadziej", $e znajd% w nim Pa#stwo wszystkie

niezb"dne wskazówki potrzebne do wykonania &wicze# oraz wiele dodatkowych

informacji.

G!ównym celem naszych zaj"& jest zapoznanie Pa#stwa z metodami oczyszczania

bia!ek, z uwzgl"dnieniem pracy z chromatyn%, b"d%c% kompleksem

nukleoproteinowym oraz zaprezentowanie jednej z metod analizy oddzia!ywa# mi"dzybia!kowych, systemu dwuhybrydowego.

Wszystkie &wiczenia wykonuj% Pa#stwo w parach. Ka$dy wykona zestaw czterech

&wicze#. %wiczenie pierwsze (Bia!ka HMG) zawiera elementy klasycznej i

$mudnej procedury oczyszczania bia!ek (homogenizacja materia!u biologicznego i

wyodr"bnianie frakcji bogatej w oczyszczane bia!ko, ekstrakcja, ró$nicowe

wytr%canie, dializa, chromatografia jonowymienna, przygotowanie próbek do

elektroforezy, elektroforeza bia!ek i wizualizacja bia!ek w $elu). %wiczenie drugie

wykorzystuje natomiast nowoczesne z!o$a stosowane w chromatografii

powinowactwa, umo$liwiaj%ce oczyszczenie bia!ka w krótkiej, jednoetapowej

procedurze. Oczyszczenie ludzkiego SF2/ASF z komórek E. coli opiera si" na

oddzia!ywaniu z kompatybilnym z!o$em dodanego do SF2/ASF metodami

in$ynierii genetycznej znacznika, który stanowi w jednym przypadku krótka

sekwencja aminokwasowa a w drugim okre'lone bia!ko. W przeciwie#stwie do

pierwszego &wiczenia, w którym z!o$e do oczyszczania bia!ek u!o$one jest w

kolumnie chromatograficznej, &wiczenie drugie jest przyk!adem zastosowania

z!o$a bez potrzeby u$ycia kolumny. (wiczenie to jest tak$e przyk!adem tzw.

mikropreparatyki. W 'wiczeniu trzecim (system dwuhybrydowy) pokazana jest

wygodna metoda badania interakcji mi"dzy bia!kami bez potrzeby ich

oczyszczania. %wiczenie czwarte (identyfikacja transformantów dro$d$owych),

które jest uzupe!nieniem &wiczenia trzeciego, prezentuje u$ycie metody PCR do

szybkiej analizy dro$d$y po transformacji DNA. W sk!ad &wiczenia czwartego

wchodzi tak$e elektroforeza DNA i wizualizacja DNA w $elu.

Podstaw% zaliczenia fakultetu jest wykonanie wszystkich przewidzianych &wicze# i uzyskanie oceny pozytywnej ze sprwdzianu. Oceniaj%c Pa#stwa b"dziemy bra& pod

uwag" znajomo'& procedur, organizacj" pracy, jako'& otrzymanych preparatów

oraz wynik sprawdzianu ko#cz%cego &wiczenia. Nie mo(na poprawia'


4/39

poszczególnych 'wicze). W uzasadnionych przypadkach dopuszczalne jest powtórzenie analizy elektroforetycznej uzyskanych preparatów.

Sprawdzian b"dzie sk!ada! si" z kilku pyta# opisowych. Pytania mog% dotyczy& rozwi%zywania problemów laboratoryjnych lub odnosi& si" do podstaw

teoretycznych metod pracy z bia!kami i DNA.

Zakres tematyki obowi$zujacy do kolokwium zaliczeniowego:1. Izolacja bia#ek ze *róde# „naturalnych” (np. grasicy ciel"cej) i bia#ek

rekombinowanych z systemów heterologicznych.2. Metody oczyszczania bia#ek ze szczególnym uwzglednieniem RÓ+NYCH

metod chromatograficznych.3. Elektroforeza bia#ek jako narz"dzie analizy preparatów bia#kowych.4. System dwuhybrydowy – podstawy teoretyczne i zastosowanie.5. PCR – podstwy teoretyczne i zastosowanie

W trakcie ca#ych zaj"' prosimy o:1. Bezwzgl"dne przestrzeganie regulaminu pracowni.2. Prowadzenie dziennika laboratoryjnego zawieraj$cego obliczenia i

notatki zwi$zane z wykonywanymi 'wiczeniami.3. Wybieranie na ka(dych 'wiczeniach osoby odpowiedzialnej za

pozostawienie porz$dku w pracowni.4. Ogóln$ dba#o!' o sal".

*yczymy Pa#stwu przyjemnych &wicze#,

Zespó! prowadz%cy


5/39

Literatura ogólna

1. Hames, B.D., Hooper, N.M. i Houghton, J.D. (1999) Krótkie wyk!ady:

biochemia. PWN, Warszawa.

2. K!yszejko-Stefanowicz, L., red. (1999) (wiczenia z biochemii. PWN,

Warszawa.

3. Witwicki, J. i Ardelt, W., red. (1984) Elementy enzymologii. PWN, Warszawa.

4. autor anonimowy (1998) Protein purification. handbook. Amersham Pharmacia

Biotech, Uppsala. (http://www4.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/

Content/862381B4A8A84D5DC125726C0002CD93/$file/18114275AC.pdf)

Osobom, które nie uczestniczy#y w zaj"ciach „Biologia molekularna”, zalecamy zapoznanie si" z komentarzem do tych 'wicze) zamieszczonym na stronie: www.biol.uw.edu.pl/zbm/

Zespó# prowadz$cy zaj"cia

1. Jan Fronk, pok. 104/D, tel: (+22) 55-43-104

2. Agnieszka Girstun, pok. 115/D, tel: (+22) 55-43-115

3. Takao Ishikawa, pok. 105/D, tel: (+22) 55-43-105

4. Barbara Kowalska-Loth, pok. 115/D, tel: (+22) 55-43-115

5. Piotr Koz!owski, pok. 108/D, tel: (+22) 55-43-108

6. Joanna Trzci#ska-Danielewicz, pok. 108/D, tel: (+22) 55-43-108


6/39

%wiczenie 1Oczyszczanie bia#ek HMG z grasicy ciel"cej

WST,P

Bia!ka HMG (High Mobility Group od ich ruchliwo'ci na $elu podczas

elektroforezy) nale$% do grupy bia!ek strukturalnych chromatyny. Bia!ka HMG s% zwi%zane z chromatyn% s!abiej ni$ histony i daj% si" ekstrahowa& z chromatyny ju$ 0.35 M chlorkiem sodowym. Wszystkie bia!ka HMG s% rozpuszczalne w

2% kwasie trójchlorooctowym (TCA) i dzieli si" je na dwie grupy:

• rozpuszczalne w 10% TCA, ma!ocz%steczkowe (m.cz. ok. 10-12 kDa):

HMG 14 i HMG 17,

• nierozpuszczalne w 10% TCA, wielkocz%steczkowe (m.cz. ok. 26 kDa):

HMG 1 i HMG 2 (stanowi%ce dominuj%c% ilo'ciowo grup" w'ród bia!ek

HMG).

(wiczenie polega na wyizolowaniu chromatyny z grasicy ciel"cej, ekstrakcji bia!ek

HMG 0.35 M chlorkiem sodowym i oczyszczeniu bia!ek HMG 1 i HMG 2 przy

u$yciu chromatografii jonowymiennej na kolumnie z CM-Sephadex C25 (kationit z

grup% karboksymetylow%).

Frakcje uzyskane w trakcie ca!ej preparatyki zostan% poddane analizie na $elu

poliakryloamidowym zawieraj%cym SDS (ryc. 1).

Ryc. 1. Obraz elektroforetyczny preparatów bia!ek HMG 1 i HMG 2 na

poszczególnych etapach oczyszczania. Z lewej strony wzorce masy cz"steczkowej.

W czwartej studzience oczyszczone bia!ka HMG 1 i HMG 2.


7/39

PROCEDURA

Uwagi ogólne:

1. W tym 'wiczeniu wszystkie bufory potrzebne do izolacji nale(y przygotowa' samodzielnie w oparciu o st"(one roztwory przygotowane przez prowadz$cych (oznaczone " ).

2. Bia#ka HMG bardzo #atwo ulegaj$ degradacji przez obecne w grasicy peptydazy. Dlatego te(, izolacj" bia#ek HMG nale(y wykonywa' zawsze w obecno!ci !wie(o dodanego (niestabilny w roztworze wodnym) inhibitora peptydaz fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) oraz w temperaturze poni(ej 4oC. %wiczenie nale(y wykona' w pracowni, trzymaj$c próbki w lodzie i uzywaj$c sch#odzonych buforów, z wyj$tkiem dializy i kolumny, które nale(y wykona' w ch#odni. Na zaj"ciach poprzedzaj$cych 'wiczenia wymagaj$ce u(ycia wirówki K-23 przygotowa' probówki szklane wraz z gilzami, wst"pnie zrównowa(y' i pozostawi' w lodówce do nastepnych zaj"' do sch#odzenia.

3. ! PMSF jest gro*ny dla b#on !luzowych, oczu i skóry. Nigdy nie pipetowa' ustami. W przypadku kontaktu z PMSF nale(y natychmiast przemy' skór" (oczy) du($ ilo!ci$ wody.

4. ! "-merkaptoetanol jest trucizn$. Nigdy nie pipetowa' ustami. St"(onych roztworów u(ywa' tylko pod w#$czonym wyci$giem chemicznym. W przypadku kontaktu z "-merkaptoetanolem nale(y natychmiast przemy' skór" du($ ilo!ci$ wody.

Materia# biologiczny:

zamro$ona grasica ciel"ca.

Odczynniki:

1. " 1 M Tris-HCl, pH 7.5

2. " 1 M Tris-HCl, pH 8.0

3. " 0,5 M EDTA, pH 8.0

4. " 5 M NaCl

5. " 100 mM PMSF w 96 % etanolu

6. " 14,3 M "-merkaptoetanol


8/39

7. Bufor do homogenizacji:

75 mM NaCl

25 mM EDTA, pH 8.0

10 mM Tris-HCl, pH 7.5

0.1 mM PMSF (Doda' bezpo!rednio przed u(yciem odpowiedni$ ilo!' roztworu [5])

8. Bufor do ekstrakcji:

0.35 M NaCl



9. " 100 % (w/v) kwas trójchlorooctowy (TCA)

10." 70 % etanol

11. Bufor do dializy:

50 mM NaCl

10 mM "-merkaptoetanol



12. Zawiesina CM-Sephadex C25 (doda& 0.5 g CM-Sephadex C25 do 200 ml

buforu do dializy [11])

Uwaga !!! Przygotowa& na &wiczeniach poprzedzaj%cych chromatografi" i

pozostawi& w lodówce do sp"cznienia.

13. Bufor do elucji "niska sól":

0.3 M NaCl



.1mM PMSF (Doda' bezpo!rednio przed u(yciem odpowiedni$ ilo!' roztworu [5])

14. Bufor do elucji "wysoka sól":

0.5 M NaCl




15. " 100 mM Tris-HCl, pH 8.0

16. " Bufor Laemmli'ego 5x (zob. Appendix pkt 1)


9/39

Wykonanie:

1. 2 g drobno pokrojonej grasicy homogenizowa& w 150 ml buforu

homogenizacyjnego [7] (w sch!odzonym mikserze 2 razy po 1 minucie przy

maksymalnych obrotach).

2. Homogenat rozla& do sch!odzonych szklanych probówek wirówkowych na 100

ml i zrównowa$y& probówki wraz z zimnymi gilzami.

3. Homogenat wirowa& przy 3000 rpm przez 10 min w 4oC w uprzednio

sch!odzonej wirówce K23

4. Delikatnie zla& supernatant. Do osadu doda& oko!o 70 - 100 ml buforu

homogenizacyjnego [7], osad zawiesi& bagietk% i wirowa& jak wy$ej.

5. Powtórzy& przemycie opisane w pkt. 4. Otrzymany osad chromatyny

niezw!ocznie u$y& do izolacji HMG.

6. Do osadu chromatyny doda& 3 ml buforu ekstrakcyjnego [8], zawiesi& osad

bagietk% i odwirowa& w wirówce K23 przy 3000 rpm przez 10 minut.

7. Supernatant przenie'& do nowej szklanej probówki wirówkowej na 100 ml, za' do osadu doda& kolejne 3 ml buforu ekstrakcyjnego [8], zawiesi& osad bagietk% i odwirowa& w wirówce K23 przy 3000 rpm przez 10 minut.

8. Supernatant po!%czy& z poprzednim supernatantem i wymiesza&. Do probówki

typu Eppendorf (oznaczonej nr 1) pobra& 200 µl po!%czonego supernatantu,

doda& 50 µl 100% TCA [9], wymiesza& i pozostawi& w lodówce (nie

zamra$a&!) jako próbk" do elektroforezy.

9. Zmierzy& obj"to'& pozosta!ego supernatantu i doda& do niego 100% TCA [9]

do ko#cowego st"$enia 2 %.

10. Odwirowa& w wirówce K23 przy 3000 rpm przez 10 minut.

11. Otrzymany supernatant przenie'& do nowej szklanej probówki wirówkowej na

100 ml, doda& 100% TCA [9] do ko#cowego st"$enia 12 % i pozostawi& do

nast"pnych &wicze# w lodówce (nie zamra$a&!).12. Odwirowa& w wirówce K23 przy 3000 rpm przez 15 minut. Supernatant

odrzuci&.Uwaga !!! Przy zlewaniu supernatantu bardzo !atwo zgubi& drobny osad!

13. Osad przemy& 5 ml 70 % etanolu [10] i odwirowa& w wirówce K23 przy 3000

rpm przez 15 minut.

14. Osad podsuszy& w strumieniu zimnego powietrza z suszarki. W czasie

suszenia nie trzyma& probówek w lodzie.

15. W trakcie suszenia osadu namoczy& otrzymany od prowadz%cych woreczek

dializacyjny w buforze do dializy [11].

16. Podsuszony osad rozpu'ci& w 1 - 2 ml buforu do dializy [11] i przenie'& do

woreczka dializacyjnego. Probówk" przep!uka& 0.5 ml buforu do dializy [11] i

nast"pnie doda& go do woreczka dializacyjnego.

17. Preparat dializowa& w ch!odni przez 30 minut wobec 250 ml buforu do dializy


10/39

[11], wymieni& bufor do dializy na 'wie$y i prowadzi& dializ" kolejne 30

minut.

18. W trakcie dializy uformowa& w ch!odni 1 ml kolumn" z przygotowanej

wcze'niej zawiesiny CM-Sephadex C25 [12], kolumn" wyrównowa$y& poprzez jej przemycie 10 ml buforu do dializy [11].

19. Po zako#czeniu dializy przenie'& preparat z woreczka do 15 ml probówki typu

Falcon. Do probówki typu Eppendorf (oznaczonej nr 2) pobra& 200 µl

preparatu po dializie, doda& 50 µl 100% TCA [9], wymiesza& i pozostawi& w

lodówce (nie zamra$a&!) jako kolejn% próbk" do elektroforezy.

20. Nanie'& na kolumn" reszt" preparatu po dializie i zacz%& zbiera& wyciek do

15 ml probówki typu Falcon (oznaczonej nr 3). Kiedy poziom roztworu

zrówna si" z górn% powierzchni% z!o$a, na z!o$e delikatnie nawarstwi& 10 ml

buforu do dializy [11]. Dalej zbiera& wyciek do tej samej probówki (nr 3).

21. Przeprowadzi& elucj" 5 ml buforu do elucji "niska sól" [13]. Zebra& ca!o'& wycieku do 15 ml probówki typu Falcon (oznaczonej nr 4).

22. Przeprowadzi& elucj" 5 ml buforu elucji "wysoka sól" [14]. Zebra& ca!o'& wycieku do 15 ml probówki typu Falcon (oznaczonej nr 5).

23. Zawarto'& probówek nr 3, 4 i 5 wymiesza&, do ka$dej doda& 100% TCA [9] do

ko#cowego st"$enia 20% (po 0.2 ml TCA na ka$de 0.8 ml wycieku),

wymiesza& i pozostawi& do nast"pnych &wicze# w lodówce (nie zamra$a&!).24. Probówki oznaczone nr 1 i 2 odwirowa& w mikrowirówce przez 10 minut,

probówki oznaczone nr 3, 4 i 5 odwirowa& w wirówce Haereus przy 3000 rpm

przez 15 minut. Supernatanty zla&, za' otrzymane osady (mog% by& s!abo

widoczne) przemy& 70 % etanolem [10] (osady z probówek nr 1 i 2 - 1 ml , a

osady z probówek 3, 4 i 5 - 5 ml), odwirowa& jak wy$ej i starannie usun%& supernatanty znad osadów.

25. Osady wysuszy& strumieniem zimnego powietrza z suszarki.

26. Przygotowa& próbki do elektroforezy: wysuszone osady zawiesi& w 30 µl

100 mM Tris-HCl [15], nast"pnie do ka$dej z próbek doda& 7.5 µl buforu

Laemmli'ego 5x [16].

Uwaga !!! Je'li po dodaniu buforu Laemmli'ego kolor roztworu zmieni si" z

fioletowego na pomara#czowy, nale$y skonsultowa& si" z prowadz%cymi.

Tak przygotowane próbki nale$y przechowywa& w temperaturze –20°C.

27. Przeprowadzi& rozdzia! elektroforetyczny przygotowanych próbek w 15% $elu

poliakryloamidowym zawieraj%cym SDS (zob. Appendix pkt 1), nak!adaj%c po

25 µl ka$dej próbki i zachowuj%c reszt" w zamra$alniku na wypadek

konieczno'ci powtórzenia elektroforez.

Literatura do 'wiczenia:


11/39

1. Goodwin, G.H., Nicolas, R.H. i Johns, E.W. (1975) Biochim. Biophys. Acta

405, 280291.

2. Johns, E.W. (1982) The chromosomal proteins. Academic Press, London.

3. K!yszejko-Stefanowicz, L. (1995) Cytobiochemia. PWN, Warszawa.


12/39

%wiczenie 2 Oczyszczanie rekombinowanego ludzkiego

bia#ka SF2/ASF z komórek bakterii Escherichia coli

WST,P

Biolog molekularny chc%c uzyska& interesuj%ce go bia!ko w du$ych ilo'ciach si"ga

cz"sto po techniki izolacji rekombinowanych bia!ek w uk!adzie heterologicznym.

W tym celu konstruuje wektor ekspresyjny nios%cy cDNA interesuj%cego bia!ka z

do!%czonym znacznikiem pozwalaj%cym na wydajn% izolacj" rekombinowanego

bia!ka metod% chromatografii powinowactwa. Jednak to, czy rekombinowane

bia!ko b"dzie dogodnym modelem do bada#, zale$y w znacznej mierze od jego

naturalnych w!a'ciwo'ci. Trudno'ci z izolacj% danego bia!ka mo$na omin%& stosuj%c ró$ne warunki hodowli i izolacji, zmieniaj%c docelowe komórki do

produkcji a tak$e do!%czaj%c ró$ne rodzaje znaczników. W niektórych wypadkach

pomocne mo$e by& wyra$anie w systemie heterologicznym skróconego bia!ka, np.

pozbawionego problematycznych domen. Niniejsze &wiczenie ma na celu zbadanie

wp!ywu przy!aczonego znacznika i d!ugo'ci wyra$anego polipeptydu na sposób i

wydajno'& izolacji bia!ka. Badanymi znacznikami s%: sekwencja sze'ciu histydyn

(6xHIS) oraz bia!ko transferazy glutationowej ze Schistosoma japonicum (GST).

(wiczenie polega na oczyszczeniu z bakterii E.coli bia!ka ludzkiego czynnika

splicingowego 2 (SF2/ASF). W cz%steczce bia!ka SF2/ASF mo$na wyrózni& dwie

domeny RRM (RNA Recognition Motif), które obejmuj% aminokwasy [1 – 194] i

domen" SR bogat% w powtórzenia seryna/ arginina (pozosta!a cz"'& bia!ka).

Domena SR zmniejsza rozpuszczalno'& bia!ka SF2/ASF i jej obecno'& powoduje,

$e w komórkach ssaczych SF2/ASF jest gromadzony w postaci tzw. spekli (z ang.

speckles) a w komórkach bakteryjnych jest s!abo rozpuszczalny. Dopiero

fosforylacja reszt serynowych w powtórzeniach SR zwi"ksza rozpuszczalno'& SF2/

ASF.

W &wiczeniu wykorzystane zostan% trzy konstrukty nios%ce cDNA bia!ka SF2/ASF

– jeden z przy!%czonym znacznikiem 6xHis, dwa w fuzji z GST, z których jeden

niesie sekwencj" koduj%ca pe!ne bia!ko SF2/ASF, a drugi tylko jego domeny RRM

(SF2/ASF[1-194]).

Sporz%dzenie pierwszego konstruktu zak!ada oczyszczanie SF2/ASF z do#$czonym znacznikiem 6xHis przy pomocy chromatografii powinowactwa na

unieruchomionych jonach metali. W przypadku tego &wiczenia izolacja zostanie


13/39

przeprowadzona w warunkach denaturuj$cych. W oczyszczaniu w warunkach

denturuj%cych zawarto'& komórek rozpuszcza si" w silnych i st"$onych

detergentach- 6 M chlorowodorku guanidyny lub 8 M moczniku. Silne detergenty

mog% up!ynnia& tak$e nierozpuszczalne agregaty bia!ek powstaj%ce cz"sto przy

wysokim poziomie ekspresji rekombinowanego bia!ka (np. cia!a inkluzyjne w

E.coli). Jako z!o$e u$yta b"dzie agaroza zawieraj%ca jony Ni2+ chelatowane

kwasem nitrylotrójoctowym (Ni-NTA agaroza). Bia!ka posiadaj%ce rejon bogaty w

reszty histydynowe !%cz% si" z Ni-NTA agaroz% w neutralnym pH z du$ym

powinowactwem (Kd = 10-13). Zwi%zane ze z!o$em bia!ka wymywa si" albo

buforem o ni$szym pH (obni$enie pH powoduje uprotonowanie grup

histydynowych, a w konsekwencji ich oddysocjowanie od kompleksu Ni-NTA).

Na oczyszczanie bia!ka SF2/ASF i SF2[1-194] w fuzji z GST pozwala

zastosowanie z#o(a agarozowego z do#$czonym kowalencyjnie zredukowanym glutationem. Zredukowany glutation jest naturalnym substratem dla glutationo-

transferazy i wi%$e si" z du$ym powinowactwem w zakresie pH od 6,5 do 9,5.

Zwi%zane ze z!o$em bia!ka wymywa si" nadmiarem glutationu.

HIS-SF2/ASF b"dzie oczyszczany z bakterii E. coli TG1 zawieraj%cych wektor

ekspresyjny pTRCHis (ryc. 2), koduj%cy SF2/ASF z do!%czon% na jego N-ko#cu

sekwencj% sze'ciu reszt histydynowych (HIS-SF2/ASF) pod kontrol% promotora

indukowalnego przez izopropylo-b-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG).

GST-SF2/ASF i GST-SF2/ASF[1-194]b"d% oczyszczany z bakterii E. coli BL21-

DE3 zawieraj%cych wektor ekspresyjny pGEX- 4T (ryc. 3) koduj%cy GST w który

wklonowano SF2/ASF lub SF2/ASF[1-194] tak, aby powstaj%ce bia!ko fuzyjne

posiada!o GST na N ko#cu. Gen bia!ka fuzyjnego znajduje si" pod kontrol% indukowalnego promotora przez izopropylo-"-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG).

Frakcje uzyskane podczas oczyszczania zostan% poddane analizie na $elu

poliakryloamidowym zawieraj%cym SDS. HIS-SF2/ASF migruje w $elu

poliakryloamidowym z SDS jako bia!ko o masie cz%steczkowej oko!o 35 kDa.

GST-SF2/ASF migruje w $elu poliakryloamidowym z SDS jako bia!ko o masie

cz%steczkowej oko!o 50 kDa. GST-SF2/ASF[1-194] migruje w $elu

poliakryloamidowym z SDS jako bia!ko o masie cz%steczkowej oko!o 45 kDa.


14/39

Ryc. 2. Wektor bakteryjny pTrcHis z kaset" ekspresyjn" zawieraj"c":

(i) Regulowany, silny promotor trc z sekwencj" operatorow" operonu

laktozowego, pozwalaj"cy na indukcj# ekspresji przez dodanie do hodowli

IPTG,

(ii) Antyterminator,

(iii) Syntetyczne miejsce wi"zania rybosomu,

(iv) Kodon "start",

(v) Sekwencj# koduj"c" sze%& reszt histydynowych,

(vi) Miejsce wklonowania po$"danego cDNA,

(vii) Terminator transkrypcji.


15/39

Ryc. 3. Wektor bakteryjny pGEX 4T z kaset" ekspresyjn" zawieraj"c":

(i) Regulowany, silny promotor tac z sekwencj" operatorow" operonu

laktozowego, pozwalaj"cy na indukcj# ekspresji przez dodanie do hodowli

IPTG,

(ii) Syntetyczne miejsce wi"zania rybosomu,

(iii) Kodon "start",

(iv) Sekwencj# koduj"c" transferaz# glutationow",

(v) miejsce wklonowania po$"danego cDNA,

(vi) 2 kodony "stop",

(vii) Terminator transkrypcji

(viii)

Podsumowuj%c, &wiczenie sk!ada si" z trzech cz"'ci:

(a) oczyszczanie rekombinowanego bia!ka HIS-SF2/ASF (warunki

denaturuj%ce)

(b) oczyszcznie rekombinowanego bia!ka GST-SF2/ASF (warunki natywne)

(c) oczyszczanie rekombinowanego polipeptydu obejmuj%cego domeny RRM

bia!ka SF2/ASF – GST-SF2/ASF[1-194] (warunki natywne)


16/39

PROCEDURA

Uwagi ogólne:

1. Wykonanie 'wiczenia nale(y podzieli' na dwa dni zaj"' – jednego dnia wykona' oczyszcznie bia#ka HIS-SF2/ASF, drugiego oczyszczanie bia#ek w fuzji z GST. GST-SF2/ASF i GST-SF2/ASF[1-194] nale(y oczyszcza' równolegle, w ten sposób, (e ka(da osoba z pary zajmuje si" jednym z bia#ek.

2. Próby ze wszystkich trzech cz"!ci b"d$ analizowane na jednym (elu elektroforetycznym.

3. Je!li nie zosta#o podane inaczej, po pobraniu prób do analizy elektroforetycznej wszystkie frakcje chromatograficzne nale(y zamrozi' i zachowa' do momentu obejrzenia wyników, na wypadek konieczno!ci wykonania dodatkowej elektroforezy.

5. Wszystkie wirowania nale(y wykona' w mikrowirówce przy maksymalnych obrotach.

6. W 'wiczeniu u(ywa si" ma#ych ilo!ci zló( chromatograficznych, które #atwo zgubi' na poszczególnych etapach. Nale(y post"powa' z nim ostro(nie, szczególnie uwa(aj$c, aby po wirowaniu nie wci$gn$' pipet$ z#o(a razem z supernatantem.

1. Oczyszczanie rekombinowanego bia!ka HIS-SF2/ASF (warunki

denaturuj$ce)

Uwagi ogólne:

Wszystkie czynno!ci nale(y wykonywa' w temperaturze pokojowej.

Procedura wykonana przed 'wiczeniami:

Do komórek bakterii E. coli, szczep TG1 wprowadzono plazmid pTrcHis nios%cy

sekwencj" koduj%c% bia!ko SF2/ASF. Takie bakterie hodowano w pod!o$u

p!ynnym w temp. 37°C z wytrz%saniem. Gdy hodowla osi%gn"!a OD600=0.9

(g"sto'& optyczna mierzona spektrofotometrycznie przy d!ugo'ci fali 600 nm),

pobrano cz"'& bakterii jako prób" nieindukowan% a w pozosta!ej hodowli

indukowano ekspresj" HIS-SF2/ASF (0.25 mM IPTG, przez 4 godz.). Po

zako#czeniu ekspresji bakterie odwirowano, zawieszono w buforze PBS (sk!ad

zob. cz"'& (b)) i sonikowano. Tak samo post%piono z bakteriami nieindukowanymi

IPTG.


17/39


zamro$ona po sonikacji zawiesina bakterii E. coli wyra$aj%cych

rekombinowane ludzkie bia!ko HIS-SF2/ASF

Odczynniki:

1. Bufor B:

100 mM NaH2PO4

10 mM Tris-HCl pH 8.0

8 M mocznik

2. 50% zawiesina Ni-NTA agarozy w buforze B (100 µl)

3. Bufor do p!ukania:

bufor B pH 6.4

4. Bufor do elucji:

bufor B pH 4.0

5. Bufor Laemmli'ego 5x (zob. Appendix pkt 1)

Wykonanie:

1. Otrzyman% zawiesin" bakterii odwirowa& przez 10 min.

2. Supernatant zebra& do nowej probówki (wykorzysta& probówki 2 ml

otrzymane od prowadz%cych). Z supernatantu pobra& 20 µl i przenie'& do

probówki podpisanej A1, zachowa& do elektroforezy. Supernatant odrzuci& a

osad zawiesi& w 2 ml buforu B [1] i inkubowa& z mieszaniem przez 40 min.

3. Odwirowa& przez 10 min. Supernatant zebra& do nowej 2 ml probówki. Z

supernatantu pobra& 20 µl i przenie'& do probówki podpisanej A2, zachowa& do elektroforezy.

4. Supernatant przenie'& do probówki z zawiesin% Ni-NTA agarozy [2].

5. Inkubowa& ze z!o$em przez 1 godz. z mieszaniem, nast"pnie odwirowa& przez

1 min.

6. Pipet% zebra& supernatant (bia!ka niewi%$%ce si" do z!o$a) do nowej

probówki.

7. Z!o$e przep!uka& 3#1 ml buforu B [1]. Za ka$dym razem kilkakrotnie

wstrz%sn%& probówk% i wirowa& przez 1 min., nast"pnie zebra& supernatant

znad z!o$a, pierwsz% porcj" przenie'& do nowej probówki, pozosta!e mo$na

wyla&.8. Z!o$e przep!uka& 1 ml buforu do p!ukania [3]. Wirowa& jw., zebra&

supernatant i przenie'& do nowej probówki.

9. Bia!ko eluowa& 4 porcjami po 100 µl buforu elucyjnego [4]. Wirowa& jw. i

zebra& wyeluowane frakcje do nowych probówek. Z ka$dej frakcji elucyjnej

pobra& po 5 µl i przenie'& do JEDNEJ wspólnej probówki podpisanej A3,

zachowa& do elektroforezy.

10. Nast"pnie do probówek A1, A2 i A3 doda& po 5 µl buforu Laemmli'ego 5#


18/39

[5]. Dodatkowo do elektroforezy przygotowa& próbk" kontroln% A0,

otrzyman% od prowadz%cych. Próbka zawiera 20 µl odwirowanej po sonikacji

zawiesiny bakterii nieindukowanych IPTG i 5µl buforu Laemmli'ego 5x [5]).

Próbki do elektroforezy nale$y przechowywa& w temperaturze –20°C.

Uwaga !!! Je'li po dodaniu buforu Laemmli'ego kolor roztworu zmieni si" z

fioletowego na pomara#czowy, nale$y doda& kropl" NaOH.

2. Oczyszczanie rekombinowanego bia!ka GST-SF2/ASF (warunki

natywne)

Uwagi ogólne:

1. Wszystkie czynno!ci nale(y wykonywa' w temperaturze pokojowej, trzymaj$c próby w lodzie i u(ywaj$c sch#odzonych buforów.

2. Zwró' uwag", (e w tej cz"!ci 'wiczenia stosuje si" bufor PBS o dwóch ró(nych st"(eniach: 10# i 1#


Do komórek bakterii E. coli, szczep BL21 wprowadzono plazmid pGEX-4T

nios%cy sekwencj" koduj%c% bia!ko SF2/ASF. Takie bakterie hodowano w pod!o$u

p!ynnym w temp. 37°C z wytrz%saniem. Gdy hodowla osi%gn"!a OD600=0.8

(g"sto'& optyczna mierzona spektrofotometrycznie przy d!ugo'ci fali 600 nm),

pobrano cz"'& bakterii jako prób" nieindukowan% a w pozosta!ej hodowli

indukowano ekspresj" GST-SF2/ASF (0.5 mM IPTG, przez 3 godz.). Po

zako#czeniu ekspresji bakterie odwirowano, zawieszono w 10 mM +-

merkaptoetanolu w H2O i sonikowano. Tak samo postapiono z bakteriami

nieindukowanymi IPTG.



rekombinowane ludzkie bia!ko GST-SF2/ASF

Odczynniki:

1. PBS 10#

1.4 M NaCl

27 mM KCl

100 mM Na2HPO4

18 mM KH2PO4, pH 7.3


19/39

2. PBS 1#

0.14 M NaCl

2.7 mM KCl

10 mM Na2HPO4

1.8 mM KH2PO4, pH 7.3

3. 50% zawiesina glutationo-agarozy w PBS 1# (100 µl)

4. Bufor do elucji:


20 mM glutation


Wykonanie:




probówki podpisanej B1, zachowa& do elektroforezy. Do pozosta!ego

supernatnatu (ok. 2 ml) doda& 1/10 obj"to'ci PBS 10# [1], wymiesza&.3. Przenie'& supernatant do probówki z zawiesin% glutationo-agarozy [3].

4. Inkubowa& ze z!o$em przez 1 godzin" z mieszaniem w temperaturze

pokojowej, nast"pnie odwirowa& przez 1 min.


probówki.

6. Z!o$e przep!uka& 3#1 ml PBS 1# [2]. Za ka$dym razem kilkakrotnie



wyla&.7. Bia!ko eluowa& 2#100 µl buforu elucyjnego [4], Wirowa& jw. i zebra&

wyeluowane frakcje do nowych probówek. Z ka$dej frakcji elucyjnej pobra& po 10 µl i przenie'& do JEDNEJ wspólnej probówki podpisanej B2, zachowa& do elektroforezy.

8. Nast"pnie do probówek B1 i B2 doda& po 5 µl buforu Laemmli'ego 5# [5].

Dodatkowo do elektroforezy przygotowa& próbk" kontroln% B0, otrzyman% od

prowadz%cych. Próbka zawiera 20 µl odwirowanej po sonikacji zawiesiny

bakterii nieindukowanych IPTG i 5µl buforu Laemmli'ego 5x [5]). Próbki do

elektroforezy nale$y przechowywa& w temperaturze –20°C.


20/39

3. Oczyszczanie rekombinowanego bia!ka GST-SF2/ASF[1-194]

(warunki natywne)

Uwagi ogólne:

Wszystkie czynno!ci nale(y wykonywa' w temperaturze pokojowej, trzymaj$c próby w lodzie i u(ywaj$c sch#odzonych buforów.


Do komórek bakterii E. coli, szczep BL21 wprowadzono plazmid pGEX-4T

nios%cy sekwencj" koduj%c% fragment bia!ka SF2/ASF odpowiadaj%cy domenom

RRM (SF2/ASF[1-194]). Ekspresj" prowadzono tak, jak w przypadku pe!nego

bialka SF2/ASF (zob. cz"'& (a)) Po zako#czeniu ekspresji bakterie odwirowano,

zawieszono w buforze PBS 1# (zob. ni$ej) i sonikowano.



rekombinowane ludzkie bia!ko GST-SF2/ASF[1-194]

Odczynniki:1. PBS 1#

2. 50% zawiesina glutationo-agarozy w PBS 1# (100 µl)

3. Bufor do elucji:


20 mM glutation


Wykonanie:




probówki podpisanej C1, zachowa& do elektroforezy.

3. Przenie'& supernatant do probówki z zawiesin% glutationo-agarozy [2].

4. Inkubowa& ze z!o$em przez 1 godzin" z mieszaniem w temperaturze

pokojowej, nast"pnie odwirowa& przez 1 min.


probówki.

5. Z!o$e przep!uka& 3#1 ml PBS 1# [1]. Za ka$dym razem kilkakrotnie



wyla&.


21/39

6. Bia!ko eluowa& 2#100 µl buforu elucyjnego [3], Wirowa& jw. i zebra& wyeluowane frakcje do nowych probówek. Z ka$dej frakcji elucyjnej pobra& po 10 µl i przenie'& do JEDNEJ wspólnej probówki podpisanej C2, zachowa& do elektroforezy.

7. Nast"pnie do probówek C1 i C2 doda& po 5 µl buforu Laemmli'ego 5# [4].

Próbki do elektroforezy nale$y przechowywa& w temperaturze –20µC.

4. Analiza elektroforetyczna

Po wykonaniu wszystkich cz"'ci &wiczenia 2 przeprowadzi& rozdzia! elektroforetyczny przygotowanych prób w 12% $elu poliakryloamidowym

zawieraj%cym SDS, nak!adaj%c po 20 µl prób A0 – A3, B0 – B2, C1, C2 oraz

ca!o'& mieszaniny bia!ek wzorcowych otrzymanej od prowadz%cych (zob.

Appendix pkt 1).


1. Hoffman, A. i Roeder, R.G. (1991) Nucl. Acids Res. 19, 6337-6338.

2. autor anonimowy (2003) The QIAexpressionist: a handbook for high-level

expression and purification of 6xHis-tagged proteins. QIAGEN, Hilden.

(http://www1.qiagen.com/HB/QIAexpressionist_EN)

3. http://www.sigmaaldrich.com (szukaj opisu dla "N 3158")

4. autor anonimowy (2002) GST Gene Fusion Systems – Handbook, Amersham

Biosciences. (http://www4.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/

87478CFA7E09E0C7C1256EB400417E59/$file/18115758.pdf)

5. autor anonimowy (2007) Affinity chromatography. Principles and methods, GE

Healthcare (http://www4.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/

91D3DF5DE303E8B6C1256EB400417F34/$file/18102229AE.pdf)


22/39

%wiczenie 3Badanie oddzia#ywa) bia#ek Fos2 i ERH w

dro(d(owym systemie dwuhybrydowym

WST,P

System dwuhybrydowy jest metod% badania oddzia!ywa# bia!kowych

wykorzystuj%c% aktywno'& transkrypcyjn% jako miar" interakcji bia!ko-bia!ko.

Zastosowanie tego systemu umo$liwi!a modu!owa natura wielu aktywatorów

transkrypcji, które sk!adaj% si" z domeny wi%$%cej DNA oraz domeny aktywuj%cej

transkrypcj". Domena wi%$%ca si" z DNA rozpoznaje specyficzne sekwencje

poprzedzaj%ce okre'lone geny, które s% regulowane, za' domena aktywuj%ca

kontaktuje pozosta!e bia!ka transkrypcyjnej maszynerii. System dwuhybrydowy

opiera si" na obserwacji $e dwie domeny aktywatora nie musz% by& kowalencyjnie

zwi%zane, lecz mog% pozostawa& w po'rednim kontakcie poprzez dwa inne bia!ka.

Skonstruowanie dwuhybrydowego systemu do analizy oddzia!ywa# miedzybia!kowych polega na stworzeniu dwóch fuzji: i) domeny wi%$%cej DNA z

bia!kiem przyn"t% oraz ii) domeny aktywuj%cej z bia!kiem zdobycz%. Hybrydy

zawieraj%ce cDNA bia!ek przyn"ty i ofiary musz% by& wyra$ane w komórkach

dro$d$y zawieraj%cych przynajmniej jeden gen reporterowy. Je'li bia!ka przyn"ty i

zdobyczy oddzia!uj% ze sob%, s% w stanie stworzy& funkcjonalny aktywator, co

objawia si" ekspresj% genów reporterowych (np. lacZ, HIS3, ADE2).

Wiele systemów dwuhybrydowych opiera si" na naturalnie wyst"puj%cym w

dro$d$ach czynniku transkrypcyjnym GAL4 odpowiadaj%cym za pobudzenie

ekspresji genów metabolizmu galaktozy. W &wiczeniu zostanie u$yty system

opieraj%cy si" na bakteryjnym bia!ku LexA wi%$%cym swoiste sekwencje

wprowadzone przed sekwencj% TATA (pe!ni%ce rol" UAS) reporterowych genów

dro$d$owych. Bia!ko LexA wspó!pracuje z domen% aktywuj%c% wirusowego bia!ka

B42. Plazmid nios%cy bia!ko przyn"ty w fuzji z LexA to pHybLex/Zeo (ryc. 4).

Niesie on gen oporno'ci na antybiotyk Zeocyn" jako marker selekcyjny. Plazmid

nios%cy bia!ko zdobycz w fuzji z B42 to pYESTrp (ryc. 5) nios%cy gen pozwalaj%cy

na wzrost na pod!o$u bez tryptofanu. Interakcja b"dzie badana w szczepie dro$d$y

Saccharomyces cerevisiae L40 przy u$yciu dwóch genów reporterowych: HIS3 i

lacZ.

(wiczenie polega na przeprowadzeniu testu dwuhybrydowego dla dwóch przyn"t: bia!ka Fos2 i ERH. Bia!ko Fos2 tworzy wraz z bia!kiem Jun czynnik

transkrypcyjny AP1. Bia!ko ERH (enhancer of rudimentary homolog) jest bardzo

malo poznanym bia!kiem badanym przez jeden z zespo!ów pracuj%cych w


23/39

Zak!adzie Biologii Molekularnej UW.(wi"cej informacji na stronie

www.biol.uw.edu.pl/zbm/). Dro$d$e wyrazaj%ce przyn"ty b"d% transformowane

„mini-bibliotek%” powsta!% na bazie plazmidu pYESTrp przez zmieszanie

plazmidów koduj%cych trzy rodzaje zdobyczy: bia!ko Jun, bia!ko ZNF356 lub

bia!ko JAI3 (dwa ostatnie bia!ka to potencjalni partnerzy ERH). Transformanty

b"d% selekcjonowane na po$ywce bez tryptofanu i z dodan% zeocyn%. Wybrane 10

transformantów b"dzie analizowane pod k%tem zdolno'ci do wzrostu bez histydyny

i aktywno'ci "-galaktozydazy. W &wiczeniu 4 wykonana zostanie analiza PCR

pozwalaj%ca na identyfikacj" wstawek niesionych przez plazmid pYESTrp w

wybranych klonach dro$d$owych.

Ryc. 4. Wektor bakteryjno- dro$d$owy

pHybLex/Zeo zawieraj"cy:

(i) Konstytutywny, silny promotor

ADH1 do wyra$ania fuzji z bia!kiem

LexA,

(ii) kompletne cDNA genu lexA,

(iii) Terminator transkrypcji ADH1,

(iv) ori bakteryjne ColE1 i dro$d$owe

2µ,

(v) dro$d$owy promotor TEF1 i

bakteryjny promotor EM-7 do

wyra$ania genu oporno%ci na zeocyn#,

(vi) cDNA genu oporno%ci na zeocyn#

(vii) terminator transkrypcji CYC1

Ryc. 5. Wektor bakteryjno-

dro$d$owy pYESTrp zawieraj"cy:

(i) Promotor GAL1 do

wyra$ania bia!ka przyn#ty w fuzji z

B42 (konstytutywny w L40),

(ii) epitop V5 umo$liwiaj"cy

identyfikacj# immunologiczn"

bia!ka fuzyjnego,

(iii) sekwencj# NLS kieruj"c"

bia!ko fuzyjne do j"dra,

(iv) Sekwencj# koduj"c" domen#

aktywuj"c" bia!ka B42

(v) m i e j s c e w k l o n o w a n i a


24/39

po$"danego cDNA,

(vi) sygna! terminacji transkrypcji CYC1, a ponadto:

(vii) ori bakteryjne ColE1 i dro$d$owe 2µ

(viii) gen oporno%ci na ampicylin#

(ix) gen TRP1 gwarantuj"cy komplementacj# auksotrofii tryptofanu

Podsumowuj%c, &wiczenie sk!ada si" z nast"puj%cych etapów:

(a) transformacja „mini-bibliotek%” dwóch szczepów dro$d$owych

wyra$aj%cych przyn"ty: bia!ka Fos 2 i ERH i wykonanie replik klonów

dro$d$owych wyselekcjonowanych po transformacji

(b) test wzrostu na pod!o$u bez histydyny klonów dro$d$owych

wyselekcjonowanych po transformacji

(c) test aktywno'ci +-galaktozydazy w klonach dro$d$owych

wyselekcjonowanych po transformacji

PROCEDURA

Uwagi ogólne:

1. Wszystkie czynno!ci nale(y wykonywa' sterylnie u(ywaj$c sterylnych ko)cówek i probówek typu Eppendorf i Falcon.

2. Przed rozpocz"ciem kolejnej cz"!ci 'wiczenia przygotowa' odpowiedni$ liczb" potrzebnych szalek z pod#o(em hodowlanym

(a) Transformacja dro%d%y metod$ jednoetapow$


1. szczep dro$d$owy L40 nios%cy plazmid pHybLex/Zeo_Fos2 (YOS)

2. szczep dro$d$owy L40 nios%cy plazmid pHybLex/Zeo_ERH (YER)

3. “mini-biblioteka” – mieszanina plazmidów:, pYESTrp_Jun,

pYESTrp_ZNF356, pYESTrp_JAI3

(genotyp szczepu dro$d$owego Saccharomyces cerevisiae L 40:

MATa his3 $200 trp1-901 leu2-3112 ade2 LYS2::(4lexAop-HIS3)URA3::(8lexAop-

lacZ) GAL4)


25/39

Odczynniki:

1. Jednoniciowy no'nikowy DNA, 2mg/ml

2. Bufor do transformacji

1.7 % DTT

1% octan litu

40% PEG 3350

3. Pod!o$e pe!ne – YPAD (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium + Adenine)

1 % yeast extract

2 % pepton

2% D-glukoza

0.01 % adenina

4. Pod!o$e minimalne zdefiniowane – YC

0.12 % yeast nitrogen base

0.5 % siarczan amonu

1 % kwas bursztynowy

2 % D-glukoza

uzupe!nienia aminokwasowe:

0.01 % Ade, Arg, Cys, Leu, Lys, Tre, Trp, Ura,

0.005 % Asp, His, Ile, Met, Phe, Pro, Ser, Tyr, Val

(+ 2% agar w pod!o$u sta!ym)

Uwaga !!! W zale$no'ci od wymaga# wzrostowych u$ywanego szczepu

dro$d$y w pod!o$u YC mo$na eliminowa& poszczególne aminokwasy. W

&wiczeniu u$ywa si" pod!o$a YC-W (nie zawiera Trp) i YC-HW (nie

zawiera His i Trp)

5. Zeocyna, 100 mg/ml

6. Szalki YC-W+ZEO – przygotowac przez dodanie do pod!o$a YC-W zeocyny

do st"$enia 300 µg/ml (3 µl roztworu [5] na 1 ml pod!o$a)

7. Szalki YC-W-H+ZEO – przygotowac przez dodanie do pod!o$a YC-W-H

zeocyny do st"$enia 300 µg/ml (3 µl roztworu [5] na 1 ml pod!o$a)

8. 3-aminotriazol (3AT)

9. nitroceluloza

10. bufor Z

60 mM Na2HPO4

40 mM NaH2PO4,

10mM KCl

1mM MgSO4, pH 7.0

11. X-gal, 1mg/ml w buforze Z

Wykonanie:

1. Przed przyst%pieniem do wykonania transformacji przygotowa& !a,ni" wodn%


26/39

o temp. 45oC blok grzejny o temp. 100oC.

2. Nosnikowy DNA [1] zgrza& przez 5 min. w temp. 100oC.

3. Przygotowa& dwie probówki zawieraj%ce po 100 µl buforu do transformacji

[2]. Jedn% podpisa& YOS, drug% YER. Do ka$dej z probówek wprowadzi& zgodnie z podpisem odpowiednie 'wie$e dro$d$e z szalki, u$ywaj%c do tego

celu jednorazowej ko#cówki do pipety lub wyka!aczki. Ilo'& dro$d$y powinna

odpowiada& mniej wi"cej wielko'ci g!ówki od szpilki. Bardzo dok!adnie

wymiesza&, mo$na u$y& wytrz%sarki typu vortex.

4. Doda& po 5 µl DNA no'nikowego, dokadnie wymiesza& ko#cówka pipety

5. Doda& 5 µl „mini-biblioteki”, dok!adnie wymieszac ko#cówk% pipety.

6. Wstawi& do!a,ni o temp. 45oC na 30 min.

7. Po zako#czeniu inkubacji ca!% mieszanin" przenie'& do probówki typu Falcon,

podpisanej odpowiednio YOS lub YER i dodac 4 ml pod!o$a YPAD [3].

Hodowa& w temp. 30 oC z wytrz%saniem przez 1 godz.

8. Dro$d$e zwirowa& w wirówce Haereus, przy 3000 rpm, 3 min., zla& supernatant. Osad dro$d$y zawiesic w resztce supernatantu pozosta!ej po

zlaniu i wysia& na szalki YC-W+ZEO [6] wykonuj%c 2-3 ruchy g!aszczk%. Hodowa& w 30°C przez 2-4 dni.

9. 10 kolonii transformantów dro$d$owych (otrzymanych po transformacji) o

'rednicy ok 2mm przesia& na pod!o$e selekcyjne YC-W+ZEO formuj%c kreski

o d!ugo'ci ok 1 cm. Szalki inkubowa& w 30°C przez 2 – 3 dni

(b) Test wzrostu na pod!o%u bez histydyny

10 kolonii transformantów dro$d$owych z szalki z replikami przesia& na pod!o$e

selekcyjne YC-W-H+ZEO [7] formuj%c kreski o d!ugo'ci ok 1 cm. Szalki

inkubowa& w 30°C przez 2 – 3 dni.

(c) Test aktywno&ci "- galaktozydazy

1. Na szalkach z replikami klonów otrzymanych po transformacji umie'ci& na

chwil" odpowiednio przyci"t% b!on" nitrocelulozow%. 2. B!on" zdj%&, umie'ci& na pustej szalce (dro$d$ami do góry) i inkubowa& 5

min w temp. –800C.

3. Z bibu!y Whatmann 3mm wyci%& kr%$ek rozmiaru szalki, umie'ci& w pustej

szalce i nas%czy& roztworem X-gal w buforze Z (1,5 ml).

4. Na bibule po!o$y& b!on" dro$d$ami do góry i inkubowa& w 300C do

uzyskania zabarwienia.

Porówna& wyniki otrzymane w obu testach.



27/39

1. autor anonimowy (2008) Yeast Protocol Handbook, Clontech (http://

www.clontech.com/images/pt/PT3024-1.pdf)

2. Criekinge W.V. and Beyaert R. (1999) Yeast Two-Hybrid: State of the Art, Biological Procedures Online, Vol. 2 No. 1, (http://

ww.biologicalprocedures.com/bpo/arts/1/16/m16.htm)

3. autor anonimowy (2003) Hybrid Hunter, Invitrogen (http://

tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/hybrid_man.pdf)


28/39

%wiczenie 4Identyfikacja transformantów

dro(d(owych metod$ PCR

WST,P

)a#cuchowa reakcja polimerazy (PCR) jest metod% pozwalaj%c% na namno$enie

(amplifikacj") okre'lonego odcinka DNA w jednej, powtarzanej cyklicznie reakcji

enzymatycznej. Warunkiem, który musi by& spe!niony, jest znajomo'& sekwencji

nukleotydowej na obu ko#cach odcinka, który ma by& namna$any.

Do przeprowadzenia reakcji PCR potrzebne s%: - DNA, który b"dzie powielany (matryca),

- startery o sekwencji komplementarnej do ko#cowych rejonów matrycy,

- substraty do syntezy DNA (dATP, dGTP, dTTP, dCTP),

- termostabilna polimeraza DNA

- odpowiedni dla polimerazy bufor, zapewniaj%cy optymalne warunki dla dzia!ania

enzymu.

Namna$anie okre'lonego odcinka DNA nast"puje podczas powtarzaj%cych si" cykli

syntezy DNA, z których ka$dy sk!ada si" z trzech etapów: denaturacji matrycy,

przy!%czenia starterów i wyd!u$ania starterów.

Metoda PCR znajduje liczne zastosowania w biologii molekularnej np. przy przy

klonowaniu DNA czy sekwencjonowaniu, a tak$e w diagnostyce medycznej,

medycynie s%dowej, czy biotechnologii.

Jednym z przyk!adów zastosowania PCR jest szybka analiza kolonii bakterii lub

dro$d$y po transformacji DNA. Pozwala ona na identyfikacj" transformantów bez

konieczno'ci czasoch!onnego izolowania DNA i trawienia go enzymami

restrykcyjnymi. W porównaniu z bakteriami, z dro$d$y trudniej jest uwolni& plazmidowe DNA poprzez zgrzewanie, z uwagi na obecno'& 'ciany komórkowej,

co w konsekwencji powoduje, $e nie jest to metoda niezawodna. Tym niemniej jest

to nadal najszybsza metoda przekonania si" o obecno'ci DNA plazmidowego i

niesionych przez nie sekwencji.

(wiczenie polega na przygotowaniu matrycy, przeprowadzeniu reakcji PCR i

analizie elektroforetycznej otrzymanych produktów. Jego celem jest identyfikacja

wstawek niesionych w wektorze pYESTrp w klonach dro$d$owych wybranych

spo'ród tych, które wykazywa!y aktywno'ci reportera histydynowego i +-


29/39

galaktozydazy i klonach, które nie wykazywa!y takiej aktywno'ci. Na podstawie

wielko'ci fragmentów powsta!ych w czasie PCR nale$y zidentyfikowa& oddzia!uj%ce bia!ko. Po namno$eniu ze starterów YESTfor i YESTrev

komplementarnych do sekwencji plazmidu pYESTrp powstaj% produkty:

dla cDNA bia!ka Jun: 247 bp

dla cDNA bia!ka ZNF356 1548 bpdla cDNA bia!ka JAI3 732 bp

PROCEDURA

Uwagi ogólne:

1. Wszystkie czynno!ci mo(na wykona' w temperaturze pokojowej.2. Przed rozpocz"ciem wykonywania 'wiczenia nale(y przygotowa' blok

grzejny o temp. 100oC


Klony dro$d$y otrzymane w &wiczeniu nr 3

(do analizy nale$y wybra& po jednym klonie dro$d$owym otrzymanym w

wyniku transformacji szczepów YOS i YER i wykazuj%cym aktywno'& genów

reporterowych oraz po jednym klonie nie wykazuj%cym tej aktywno'ci – w

sumie cztery klony)

Odczynniki:

1. woda dejonizowana (sterylna)

2. bufor dla polimerazy 10x:


200 mM (NH4)2SO4

0.1% Tween 20

3. dNTP mix: 10 mM dla ka$dego dNTP

4. 25 mM MgCl2

5. startery YESTfor i YESTrev (20 pmol/µl)

6. polimeraza Taq, 1U/µl (Fermentas)

7. olej mineralny

8. barwnik do elektroforezy oran$ G 10x (zob. Appendix pkt 2)


30/39

Wykonanie:

1. Do czterech 1,5 ml probówek typu Eppendorf odpipetowa& po 50 µl wody [1] .

2. Z szalek replikowych pobra& troch" materia!u z wybranych klonów

dro$d$owych przy pomocy jednorazowych ko#cówek i przy u$yciu pipety

dok!adnie zawiesi& dro$d$e w wodzie. Nale$y pobra& BARDZO MA)O

materia!u, gdy$ zbyt du$a ilo'& mo$e powodowa& hamowanie reakcji

3. Zawieszone dro$d$e inkubowa& przez 5 minut w rozgrzanym do temperatury

100°C bloku grzejnym, a nast"pnie zwirowa& w mikrowirówce przez 2

minuty w temperaturze pokojowej. Odwirowane probówki trzyma& w lodzie.

4. Przygotowa& mieszanin" reakcyjn% do reakcji PCR zgodnie z poni$sz% tabel%:

Uwaga !!! Polimeraz" Taq do mieszaniny reakcyjnej dodaj% prowadz%cy

&wiczenia.

5. Przygotowan% mieszanin" reakcyjn% rozpipetowa& po 40 µl do czterech 0,5

ml probówek do PCR. Oznaczy& probówki.

6. Do mieszaniny nale$y doda& matryc" – po 10 µl supernatantu ze zgrzanych

probówek.

7. Zawarto'& wszystkich probówek dok!adnie wymiesza&.8. Aby zapobiec parowaniu roztworu podczas reakcji PCR na powierzchni"

próbek przy u$yciu pipety na!o$y& 40 µl oleju mineralnego [7].

10. Tak przygotowane próbki wstawi& do termocyklera i prowadzi& reakcj" amplifikacji wed!ug profilu termicznego;

cykl dodatkowy – 940C 1 min

30 cykli wg profilu: 940C 30s

500C 30s

720C 2min

cykl dodatkowy 720C 7 minut

11. Po zako#czeniu reakcji PCR do próbek doda& po 5 µl barwnika do


31/39

sk!ad mieszaniny reakcyjnej

dla 1 reakcji x 4,5

bufor 10x [2] 5 µl 22,5 µl

dNTP mix [3] 1 µl 4,5 µl

25 mM MgCl2 [4] 3 µl 13,5 µl

woda [1] 28 µl 126 µl

elektroforezy oran$ G 10x [8].

12. Przeprowadzi& rozdzia! elektroforetyczny 20 µl otrzymanej próbki w 1% $elu

agarozowym (zob. Appendix pkt 2).


1. McPherson, M. J., Quirke, P., Taylor, G. R. (red.) (1992) PCR. A practical

approach. Oxford University Press, Oxford.

2. Turner, P.C., McLennan, A. G., Bates, A.D., White, M. R. H. (2002) Krótkie

wyk!ady: biologia molekularna. PWN, Warszawa.


32/39

Appendix

1. Elektroforeza bia#ek w (elu poliakryloamidowym zawieraj$cym SDS (SDS-PAGE)

Uwagi ogólne:

1. ! Akryloamid przed polimeryzacj$ jest silnie truj$cy. Nigdy nie pipetowa' ustami. Wszystkie czynno!ci z akryloamidem wykonywa' tylko w r"kawiczkach.

2. Opary kwasu octowego s$ truj$ce. Nigdy nie pipetowa' ustami st"(onego kwasu. Odbarwianie (elu przeprowadza' pod w#$czonym wyci$giem chemicznym.

Odczynniki:

1. Mieszanina monomerów:

30 % (w/v) akryloamid

0.8 % (w/v) N,N'-metylenobisakryloamid

2. 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8

3. 0.625 M Tris-HCl, pH 6.8

4. 1 % (w/v) SDS

5. 10 % (w/v) nadsiarczan amonowy (APS)

6. N,N,N',N'-tetrametylenodiamina (TEMED)

7. Bufor do elektoforezy (pH 8.3):

0.025 M Tris

0.192 M glicyna

0.1 % (w/v) SDS

8. Mieszanina bia!ek wzorcowych w buforze Laemmli'ego 1x:

albumina, z krowiej krwi m.cz. 66 kDa

owoalbumina, kurza m.cz. 45 kDa

pepsyna, 'wi#ska m.cz. 34,7 kDa*

trypsynogen (traktowany PMSF), z krowiej trzustki m.cz. 24 kDa

"-laktoglobulina, z krowiego mleka m.cz. 18,4 kDa

lizozym, z bialka jaja kurzego m.cz. 14,3 kDa

* przy elektroforezach wykonywanych podczas tych &wicze# bia!ko to

nie migruje liniowo.

9. " Bufor Laemmli'ego 5x:

0.325 M Tris-HCl, pH 6.8

10 % (w/v) SDS

50 % (w/v) glicerol


33/39

5 % (v/v) "-merkaptoetanol

0.05 % (w/v) b!"kit bromofenolowy

10. " Roztwór do barwienia $elu (do wielokrotnego u$ycia):

0.2 % (w/v) b!"kit Coomassie'go R-250 w roztworze woda:metanol:st. kwas

octowy 5:5:1

11. 7 % (v/v) kwas octowy

Wykonanie:

1. Z!o$y& ze sob% dwie bardzo czyste (przetarte dodatkowo etanolem) i suche

p!ytki szklane przedzielone szarymi przek!adkami. Jedna z p!ytek powinna by& ustawiona wci"ciem ku górze, za' druga z p!ytek, dwoma zaokr%glonymi

rogami na dó!. Wokó! tej drugiej powinna by& owini"ta pomara#czowa

uszczelka zgrubieniem do 'rodka (mi"dzy p!ytki). Kraw"dzie górne p!ytek

powinny by& na tej samej wysoko'ci, ale przek!adki i uszczelka mog% wystawa& powy$ej górnych kraw"dzi p!ytek. Tak przygotowany komplet

szybek ustabilizowa& czterema du$ymi bia!ymi klamrami (dwie na dole i po

jednej na ka$dym boku). Mi"dzy szybki w!o$y& bia!y grzebyk z 10 z%bkami.

Zaznaczy& markerem na szybce punkt ok. 3 mm poni$ej dolnej kraw"dzi

z%bków grzebyka. Delikatnie wyci%gn%& grzebyk.

2. Przygotowa& odpowiedni $el (10% -12 %) mieszaj%c ze sob% roztwory wg

kolejno'ci w tabeli poni$ej. Uwaga !!! TEMED zawsze dodawa& na chwil" przed wylaniem $elu.

Roztwór 10 %

1 $el

10 %

2 $ele

12 %

1 $el

12 %

2 $ele

4 %

1 $el

4 %

2 $eleMieszanina monomerów [1] 2.00 ml 4.00 ml 2.40 ml 4.80 ml 0.20 ml 0.40 ml

Woda dejonizowana 1.90 ml 3.80 ml 1.50 ml 3.00 ml 0.90 ml 1.80 ml

1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 [2] 1.50 ml 3.00 ml 1.50 ml 3.00 ml - -

0.625 M Tris-HCl, pH 6.8

[3]

- - - - 0.30 ml 0.60 ml

1 % SDS [4] 0.60 ml 1.20 ml 0.60 ml 1.20 ml 0.15 ml 0.30 ml

10 % APS [5] 40 µl 80 µl 40 µl 80 µl 20 µl 40 µl

TEMED [6] 5 µl 10 µl 5 µl 10 µl 5 µl 10 µl

3. Mieszanin" wla& mi"dzy p!ytki szklane ustawione na plastikowej tacy a$ do

poziomu zaznaczonego uprzednio na szybce. Na powierzchni" roztworu

ostro$nie nawarstwi& wod" na wysoko'& ok.1 cm. Tak przygotowany 10 lub 15


34/39

% $el rozdzielaj%cy pozostawi& do spolimeryzowania (oko!o 30 minut w

temperaturze pokojowej, powinna pojawi& si" wyra$na granica mi"dzy

spolimeryzowanym $elem a warstw% wody). Nast"pnie zla& wod" znad $elu.

4. Pod koniec polimeryzacji $elu rozdzielaj%cego przygotowa& 4 % $el

zag"szczaj%cy mieszaj%c ze sob% roztwory wg kolejno'ci w tabeli powy$ej.

Uwaga !!! TEMED zawsze dodawa& na chwil" przed wylaniem $elu.

5. Mieszanin" nawarstwi& na $el rozdzielaj%cy do kraw"dzi szybki z wci"ciem.

Wsun%& grzebie# i tak przygotowany $el zat"$aj%cy pozostawi& do

spolimeryzowania (oko!o 30 minut w temperaturze pokojowej).

6. Ostro$nie wyci%gn%& grzebyk, a nast"pnie trzymaj%c szybki zdj%& klamry i

gumow% uszczelk".7. Umie'ci& $el w aparacie (szybk% z wci"ciem do 'rodka aparatu), szybki

umocowa& w aparacie ma!ymi bia!ymi klamrami. Wla& bufor do elektroforezy

[7] do dolnego i górnego zbiornika.

8. Kieszonki w $elu przep!uka& buforem do elektroforezy [7].

9. Próbki do elektroforezy (tak$e mieszanin" bia!ek wzorcowych [8] otrzyman% od prowadz%cych) zawieraj%ce bufor Laemmli'ego [9] ogrzewa& przez 3

minuty w 100oC.

10. Po zwirowaniu i sch!odzeniu do temperatury pokojowej próbki nanie'& na $el.

11. W!%czy& ch!odzenie aparatu do elektroforezy (lekko odkr"ci& kran) i pod!%czy& aparat do zasilacza (elektroda ujemna od strony kieszonek, elektroda dodatnia

od dolnej kraw"dzi $elu).

12. Elektroforez" prowadzi& przy napi"ciu oko!o 100 V do czasu przesuni"cia si" barwnika do dolnej kraw"dzi $elu (oko!o 1.5 godz.).

13. Wyj%& szybki z $elem z aparatu, wyci%gn%& przek!adki i roz!o$y& szybki

(delikatnie podwa$aj%c jedn% z nich). Obci%& warstw" $elu zag"szczaj%cego (z

kieszonkami).

14. *el umie'ci& w naczyniu z roztworem do barwienia $eli [10].

15. *el barwi& przez 20 minut (lub d!u$ej) w pude!ku na plastikowej tacy.

16. Wyj%& $el z roztworu do barwienia [10] i odbarwia& go poprzez kilkukrotne

p!ukanie w 7% kwasie octowym [11] na gor%co (oko!o 60 - 80oC) pod

wyci%giem chemicznym.

Literatura:

Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680685.


35/39

2. Elektroforeza DNA w (elu agarozowym

Uwagi ogólne:

1. ! Bromek etydyny jest silnym mutagenem i umiarkowanie siln$ trucizn$. Nale(y za#o(y' r"kawiczki przed ka(d$ prac$ z roztworami zawieraj$cymi bromek etydyny.

2. ! Promieniowanie ultrafioletowe (UV) jest niebezpieczne i nale(y go unika'. +ele nale(y ogl$da' w UV po przykryciu ich p#ytk$ szklan$ i po za#o(eniu okularów.

Odczynniki:

1. Agaroza (w proszku)

2. Bufor do elektroforezy TAE 1x:

40 mM Tris-octan, pH 7.6

1 mM EDTA,

3. Barwnik do elektroforezy oran$ G 10x

0.4% (w/v) oran$ G 50% (w/v) glicerol

4. wzorzec wielko'ci: DNA, GeneRuler100 bp Plus (14 fragmentów DNA,

wielko'& w bp: 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400,

300, 200, 100)

5. bromek etydyny (1µg/ml)

Wykonanie:

1. Odwa$y& 0.5 g agarozy [1] potrzebne do przygotowania 50 ml 1 % $elu.

2. Do odwa$onej agarozy [1] doda& bufor do elektroforezy TAE 1x [2] i ogrza& w kuchence mikrofalowej do rozpuszczenia si" agarozy.

3. Z!o$y& aparacik do elektroforezy (w!o$y& przek!adki i grzebie#).4. Po lekkim sch!odzeniu agarozy, wyla& $el o grubo'ci oko!o 0.5 cm (oko!o

40 ml agarozy) i pozostawi& go do zastygni"cia.

5. Usun%& przek!adki i grzebie#, zala& $el buforem. Pod!%czy& aparat do

zasilacza (elektroda ujemna od strony kieszonek, elektroda dodatnia od dolnej

kraw"dzi $elu) i sprawdzi&, czy p!ynie pr%d.

6. Od!%czy& aparat od zasilacza. Próbki zawieraj%ce barwnik do elektroforezy

oran$ G [3] oraz wzorce wielko'ci DNA [4] nanie'& na $el i ponownie

pod!%czy& aparat.

7. Prowadzi& elektroforez" przy napi"ciu 100 V do momentu przesuni"cia si" pomara#czowego barwnika do dolnej kraw"dzi $elu.

8. Wyj%& $el z aparatu i w!o$y& do naczynia z roztworem bromku etydyny [5].

*el barwi& przez oko!o 15 minut.


36/39

9. *el obejrze& w 'wietle UV, korzystaj%c z transiluminatora. Je'li potrzeba (gdy

$el mocno 'wieci) odbarwi& go p!ucz%c w wodzie destylowanej.

Literatura:

Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory

manual, 2. wyd. CSHLP, Cold Spring Harbor.


37/39

3. Po co s$ te substancje w roztworach stosowanych podczas 'wicze)?

woda – podstawowy rozpuszczalnik stosowany w biologii molekularnej

Tris (w formie Tris-HCl, Tris-octan, Tris-glicyna) – substancja buforuj%ca,

utrzymuje pH roztworu (7-8)

glicyna (w formie glicyna-HCl) – substancja buforuj%ca, utrzymuje pH roztworu

(2-3)

NaH2PO4 – substancja buforuj%ca, utrzymuje pH roztworu (7-8)

NaCl – substancja zapewniaj%ca si!" jonow% roztworu (tak$e ci'nienie osmotyczne)

SDS – mocny anionowy detergent, up!ynniaj%cy wszystkie b!ony komórkowe i

denaturuj%cy bia!ka, nadaj%cy im ujemny !adunek wypadkowy

"-merkaptoetanol ("-ME) – substancja redukuj%ca, m. in. mostki dwusiarczkowe

w bia!kach

ditiotreitol (DTT)- substancja redukuj%ca, m. in. mostki dwusiarczkowe w

bia!kach

fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) – nieodwracalny inhibitor peptydaz

serynowych

EDTA – substancja hamuj%ca nukleazy poprzez wymiareczkowanie z roztworu ich

kofaktorów – kationów dwuwarto'ciowych, np. Mg2+

imidazol – substancja wspó!zawodnicz%ca z resztami histydyn o miejsca wi%$%ce

na Ni-NTA agarozie

mocznik – substancja lizuj%ca komórki i denaturuj%ca bia!ka

akryloamid (i N,N'-metylenobisakryloamid) – substancje wytwarzaj%ce w

wyniku polimeryzacji ze sob% usieciowany poliakryloamid

nadsiarczan amonowy (APS) – przeciwutleniacz u$ywany przy polimeryzacji

akryloamidu

N,N,N',N'-tetrametylenodiamina (TEMED) – katalizator polimeryzacji

akryloamidu i N,N'-metylenobisakryloamidu

kwas trójchlorooctowy (TCA) – substancja wytr%caj%ca bia!ka z roztworu, mo$e

przy okazji niestety nieodwracalnie zniszczy& ich aktywno'& biologiczn%NaOH – substancja do zoboj"tnienia mocno zakwaszonych próbek przed

elektroforez%glicerol – substancja obci%$aj%ca próbk" do elektroforezy

b#"kit bromofenolowy – ciemnofioletowy barwnik migruj%cy do anody w trakcie

SDS PAGE

b#"kit Coomassie'go R-250 – barwnik tworz%cy niebieskie kompleksy z bia!kami

kwas octowy – substancja do usuwania nadmiaru barwnika po barwieniu bia!ka w

$elu akryloamidowym

etanol – substancja do odp!ukiwania TCA z osadu bia!ek

agaroza – substancja wytwarzaj%ca, po utworzeniu na gor%co roztworu i

ostudzeniu, usieciowany $el.


38/39

oran( G – pomara#czowy barwnik migruj%cy do anody w trakcie elektoforezy w

$elu agarozowym

bromek etydyny – barwnik tworz%cy z DNA kompleksy 'wiec%ce w UV na

pomara#czowo

3- aminotriazol (3AT) – inhibitor enzymu umo$liwiaj%cego syntez" histydyny

IPTG – izopropylo-"-D-1-tiogalaktopiranozyd, analog laktozy, induktor ekspresji

genów b"d%cych pod kontrol% promotora laktozowego

X-gal – 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-"-D-galaktopiranozyd, substrat

"-galaktozydazy, po hydrolizie daj%cy niebiesk% pochodn% indygo

KONIEC SKRYPTU


39/39

uniwersytet w arszawski ci - biol.uw.edu.pl · regulamin pracowni 1. w pracowni nale $y zachowa...

Documents