MESSA A PUNTO DELL’APPARATO OTTICO DI UN SISTEMA COMPATTO PER

MICROSCOPIA OTTICA A DUE FOTONI

Elaborato di Laurea di ELENA UGOLOTTI

Relatore: Prof. A. TomaselliCorrelatore: Prof C. Vacchi

Università degli studi di Pavia

Scopo del progetto

Sviluppare un sistema:

• Che sfrutti la

microscopia a due fotoni

• Possibilità di osservare

campioni biologici in vivo

• Risoluzioni

submicrometriche

• Economico

• Compatto

Microscopia a due fotoni

Due fotoni simultanei nell’IR stimolano lo stesso salto energetico di un singolo fotone nell’UV-VIS

Vantaggi:• Processo non lineare:

L’intensità è concentrata solo nel punto da osservare

• Non si generano radicali liberi• Maggior penetrazione nel

campione

222

)(

1)()(

zwzwzIfltot

Schema del microscopio presente in laboratorio:

Laser

Specchi dideflessione

Divisore di fascio

Obiettivo

Campione

Fototubo

f=30mm

f=85mm

f=35mm

Microscopio presente in laboratorio

Scopo del mio lavoro:

Quando ho iniziato il lavoro, lo schema del microscopio era provvisorio in quanto non era mai stato fatto uno studio accurato e delle simulazioni del sistema ottico.

Scopo del mio lavoro: studiare la configurazione ottica ottimale per il sistema, che sia un buon compromesso tra compattezza del dispositivo e risoluzione ottenibile.

Fasci gaussiani

Parametri importanti:

2

0wzr

z

zzzR r

2

)(

2

0 1)(

rz

zwzw

2)(

2

)(

1

)(

1

zkwi

zRzq

Raggio di curvatura complesso q(z):

Distanza di Rayleigh:

Raggio di curvatura:

Raggio del fascio:

Metodo matriciale “ABCD”

La propagazione dei fasci Gaussiani attraverso ottiche anche complesse può essere studiata tramite le matrici ABCD:

Se ci sono più elementi ottici incascata la matrice totale del sistemaè il prodotto delle matrici dei singolielementi.

Con le matrici ABCD si ricava direttamente:

Analisi del sistema:

Con il laser He-Ne si ha:• λ = 632 nm• w0 = 0,4 mm

f1 = 35 mm, f2 = 85 mm

θg = 0,08 rad

zr = 79 cm

wc = 1 μm

La risoluzione che si ottiene non è sufficiente. Bisogna modificare le distanze tra le ottiche o le focali delle lenti per migliorarla senza diminuire l’area investigata.

La zona di campione investigata è un quadrato di lato 340 μm

Miglioramento della risoluzione

La risoluzione migliora quanto più le dimensioni del fascio sul campione sono piccole

Il fascio deve incidere più ampio possibile sull’obiettivo

Variabili che ho provato a modificare nel sistema:

dS-L1

dL1-L2

dL2-O f1

f2

Distanza specchi-prima lente:

Influisce sull’allontanamento del fascio dal centro

Bisogna assicurare l’ingresso di tutto il fascio nell’obiettivo e

l’ingresso sulle lenti in zone centrali non soggette a non idealità

Soluzione migliore:

Distanza pari alla focale della prima lente

Determina le dimensioni di campione esplorato durante

la scansione

Focale della prima e della seconda lente del telescopio:

• Entrambe le lenti del telescopio devono essere convergenti

• Ingrandimento M=f2/f1 f1 piccola, f2 grande

• Per le considerazioni fatte prima sulla distanza specchi-prima lente e sugli ingombri, f1 non può essere troppo piccola

f1 = 35 mm ; f2 = 85 mm

Distanza tra le lenti:

• Telescopio con lenti convergenti d = f1 + f2

• Se d < f1 + f2 fascio uscente divergente

• Se d > f1 + f2 fascio uscente convergente

La convergenza non conviene: - si perde ingrandimento- si peggiora compattezza microscopio

La divergenza può essere vantaggiosa: - a pari compattezza aumenta l’ingrandimento- peggiorano le

dimensioni totali investigate

Per operare in divergenza: f2 = 150 mm

Distanza telescopio - obiettivo:

• Indifferente se si opera in collimazione

Più piccola possibile per ridurre ingombro totale del microscopio

• Se si opera in divergenza:

distanza grande migliore risoluzione, ingrandimento maggiore, zona esplorata più piccola

IDEA: Doppio telescopio

Ho pensato di aggiungere un secondo telescopio prima degli specchi di deflessione per ingrandire

ulteriormente il fascio

Significativo miglioramento della risoluzione

Aumento delle dimensioni del microscopio

Perdita di potenza sulle lenti

Schema finale del microscopio:

Campione

Obiettivo 40x

Fototubo

Beam-splitter

Lente,f=30mm

Lentef=85-150mm

Lentef=35mm

Galvospecchi

specchio

Lentef=75mm

Lentef=40mm

Immagini di un campione graduato prima delle modifiche

Ingrandimento 1x Ingrandimento 4x

50 μm

Immagini del campione graduato ottenute con il doppio telescopio e in collimazione

(f2=85mm):

Ingrandimento 1x Ingrandimento 4x

50 μm

Immagini del campione graduato ottenute con il doppio telescopio e in divergenza

(f2=150mm):

Ingrandimento 1x Ingrandimento 4x

Immagini di circuiti microelettronici (1):

Immagini di circuiti microelettronici (2):

2 μm

Immagini dei globuli rossi:

Ingrandimenti 1x e 4x; diametro globuli di circa 7 μm

7 μm

Immagini sferette di diametro 2,5 μm :

In collimazione (f2=85mm) In divergenza (f2=150mm)

Caratterizzazione della profondità di fori su silicio per BrightSolutions:

8 campioni di silicio con fori per aumentare la superficie illuminata di celle solari

Campioni diversi hanno fori di profondità diversa perché eseguiti con laser a potenza diversa

Misurare la profondità dei fori contando quanti passi intercorrono tra il punto in cui è a fuoco la superficie o il fondo del foro

Futuri miglioramenti previsti (1):

Meccanica:

• Visualizzare un campione posto in orizzontale

• Creare un supporto fisso definitivo

Software:

• Sviluppare un software per poter ricostruire immagini in 3D

Futuri miglioramenti previsti (2):

• Replicare una sorgente impulsata per il microscopio

Possibili sorgenti:

• Cr: Forsterite λe=1240; λp=1064; Δimp=20-100fsfrip=60-150MHz

• Cr: LISAF λe=860; λp=670; Δimp=20-100fsfrip=80-150MHz

• Nd: Glass λe=1054; λp=804; Δimp=300fsfrip=140MHz

• Sostituire il Beam-Splitter con un Cold Mirror