Université Paris XIFACULTE DE PHARMACIE DE CHÂTENAY-MALABRY

ECOLE DOCTORALE :INNOVATION THERAPEUTIQUE : DU FONDAMENTAL A L’APPLIQUE

PÔLE : PHARMACOTECHNIE ET PHYSICO-CHIMIE

ANNEE 2001-2002 SERIE DOCTORAT N° 741

THESE

PrésentéeA L’UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE

FACULTE DE PHARMACIE DE CHÂTENAY-MALABRY UNIVERSITE PARIS XI

pour l’obtention du grade deDOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS XI

par Melle Sandrine WEISSE

Titre : Complexes cyclodextrines / ester de vitamine A :

stabilisation, solubilisation et promotion de l’absorption cutanée.

Soutenance le 14 octobre 2002 devant la commission d’examen composé de :

J-C. DEBOUZY ………..Rapporteur E. FATTAL

D. WOUESSIDJEWE …..Rapporteur F. DJEDAÏNI-PILARD

D. DUCHÊNE ………….Président du jury P. ANDRE

B. PERLY

A mon père, à ma mèreprésents dans les bons comme dans les pires moments.

« Le poison est dans chaque substance et rien n’est exempt de poison.Ce n’est que le dosage qui en fait soit un poison, soit un remède »

Paracelse (1493-1541)

2

1 H-RMN : résonance magnétique nucléaire du protonAc : anticorpsAchE : acétylcholinestéraseAg : antigèneBSA : bovine serum albumineCCM : chromatographie couche minceCD : cyclodextrine(s)CMC : concentration micellaire critiqueChol-βCD-Ac : cholestéryl béta-cyclodextrine acyléeCOSY : correlation spectroscopyDIMEB : heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose ou diméthyl béta-cyclodextrineD2O : eau deutéréeDMPC : dimyristoylphosphatidylcholine DMSO :diméthyle sulphoxyded6-DMSO : diméthyle sulphoxyde hexadeutéréDSC : differential scanning calorimetryDTNB : 5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoique acide)E : épidermeEDTA : acide éthylène diamine tétra acétique EIA : enzyme immuno-assayHCl : acide chlorydriqueHPLC : high performance liquide chromatographyIgG : immonoglobuline GLR : liquide récepteurNa2CO3 : carbonate disodiqueNOESY : nuclear Overhauser effectPVA : propionate de vitamine ASC : stratum cornéum ou couche cornéeRAMEB : randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaoseROESY : rotating frame Overhauser effect spectroscopyT : températureT-ROESY : transverse rotating frame Overhauser effect spectroscopyUV : ultra-violet

3

TABLE DES MATIERES

4

TABLE DES MATIERES

6INTRODUCTION GENERALE 8PRESENTATION DES ACTEURS ET DU SUJET 13

1.2 LE RETINOL 131.2.1Historique 131.2.2Structure et origine 131.2.3Devenir dans l’organisme 151.2.4Rôles physiologiques 171.2.5Pénétration et absorption percutanée 221.2.6Inconvénients liés à ses propriétés physico-chimiques 23

1.3LES CYCLODEXTRINES 241.3.1Historique des cyclodextrines 241.3.2Structure et propriétés des cyclodextrines 261.3.3Inclusion – Complexation 291.3.4Applications des cyclodextrines. 331.3.5Toxicité des cyclodextrines 341.3.6Interaction avec les membranes biologiques 36

2. TRAVAUX ANTERIEURS 422.1MOYENS UTILISES POUR AMELIORER LA STABILITE ET LA

SOLUBILITE DE LA VITAMINE A DANS LES FORMES PHARMACEUTIQUES 422.1.1Emulsions et antioxydants 422.1.2Microparticules 442.1.3Divers 46

2.2INCLUSION DU RETINOL DANS LES CYCLODEXTRINES 472.2.1Méthodes de caractérisation des complexes d'inclusion 472.2.2Essais d'inclusion du rétinol et/ou de ses esters dans les cyclodextrines

naturelles ou modifiées 523.TRAVAUX PERSONNELS 60

3.2Chapitre 1 633.2.2Article n°1 633.2.3Brevet FR0201241 823.2.4Article n° 2 953.2.5Article n° 3 1083.2.6DISCUSSION 126

3.3 CHAPITRE 2 1323.3.1Article n°4 1383.3.2Article n° 5 1643.3.3DISCUSSION 179

CONCLUSION GENERALE 183ANNEXES 186

5

ANNEXE 1 : LA PEAU 187ANNEXE 2 : DOSAGES IMMUNOENZYMATIQUES 201

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 214

6

INTRODUCTION GENERALE

7

INTRODUCTION GENERALE

L'organisme vivant, en particulier humain est constitué d'un ensemble d'organes

interconnectés qui communiquent entre eux par la voie de messagers, de connections directes

et en particulier de la vascularisation. Ce système complexe est fragile. Il est donc important

d'établir une barrière entre ce fragile assemblage de fonctions vitales et le milieu extérieur,

source d'agressions multiples telles que les irradiations diverses, l'oxydation et les toxiques

présents dans l'environnement. Ce rôle, dans le cas des mammifères est dévolu à la peau.

Toutefois, il ne faut pas se limiter à penser que cette dernière n'est qu'une cuirasse inactive.

Elle est en elle-même un élément très actif pour isoler les compartiments et limiter les

agressions extérieures. Parmi ces dernières, les processus d'oxydation par l'oxygène, l'ozone et

les irradiations sont des éléments majeurs car ils contribuent de façon active à la formation de

radicaux libres pouvant conduire à des réactions non réversibles entraînant des affections

multiples. Dans ce rôle d'interface, la peau elle-même est la première soumise à toutes ces

agressions, entraînant des modifications de l'élasticité, les rides, les affections cutanées

directes et pouvant aller jusqu'à la cancérisation.

Ces processus sont modulés et atténués par de nombreux composants présents dans les

diverses couches de la peau. Une structure détaillée de ces différentes strates sera présentée

dans la suite de ce mémoire. Parmi ces composés, la vitamine A et ses dérivés jouent un rôle

essentiel en particulier dans la destruction des radicaux libres. Ces composés sont présents

naturellement dans la peau mais il paraît utile d'en augmenter la teneur pour retarder les effets

délétères des agressions extérieures. Cette amélioration de la teneur intrinsèque en vitamine A

pose toutefois de nombreux problèmes :

- La vitamine A et ses dérivés sont strictement insolubles dans l'eau

- Ces composés sont très facilement oxydables et cette oxydation peut conduire à la

formation d'acides rétinoïques très toxiques s'ils passent dans la circulation. La localisation de

ces composés actifs dans les différentes strates de la peau n'est pas indifférente.

Afin d'améliorer les performances des dérivés de vitamine A trois objectifs sont

essentiels sans pour autant rêver à un "élixir de jouvence". Les compagnies pharmaceutiques,

para-pharmaceutiques et cosmétiques développent sans cesse de nouveaux produits mais qui

8

ne sont parfois que des composés destinés à formuler la vitamine A sous forme acceptable

pour la peau. Nos objectifs sont différents :

- Il faut que la vitamine A soit stabilisée vis à vis de la dégradation par l'oxygène, la

température et surtout la lumière.

- La formation d'un composé hydrosoluble permettrait de disposer de nouvelles

formulations.

- Il est essentiel que le principe actif soit dirigé et reste dans les strates de la peau où

son action sera optimale.

Certes, de nombreuses méthodes ont déjà été utilisées pour atteindre ces objectifs,

comme nous le verrons plus loin dans ce mémoire, qu’elles soient mécaniques, chimiques ou

galéniques. Mais les résultats en terme de stabilité et surtout de solubilité restent insuffisants.

Dans le but de remplir les objectifs précédemment cités, plusieurs solutions seront

envisagées et testées ici. Ces études feront appel à de très nombreuses et diverses approches

scientifiques allant de la physico-chimie aux études sur peau humaine en passant par

l’immunologie, pour assurer le suivi des espèces impliquées, et la galénique. Ne désespérons

donc pas de voir un jour une nouvelle classe de dérivés destinés à nous protéger d'une partie

des agressions qui ne feront sans doute que croître. La nature nous a fourni des pistes, à nous

de les optimiser.

Notre choix concernant l’outil à utiliser c’est porté sur les cyclodextrines (CD). Celles-ci

sont déjà largement utilisées dans le milieu pharmaceutique, principalement comme adjuvant

de solubilisation pour améliorer la biodisponibilité de la molécule active et elles sont

considérées en cosmétologie comme des promoteurs d’absorption. Notre approche consiste à

utiliser les propriétés des cyclodextrines afin d’obtenir une solution aqueuse contenant une

forme chimiquement stable de vitamine A et permettant une évaluation biologique de la

vectorisation de la vitamine A dans la peau. Il faut entendre propriétés au sens large, que ce

soit leurs propriétés d’inclusions ou de formation de systèmes organisés.

Nous avions aussi le choix quant au dérivé de vitamine A à choisir. En effet la vitamine

A pure, qui correspond au rétinol est trop instable pour permettre une utilisation courante à

l’échelle du laboratoire. Ainsi, il est bien plus courant d’utiliser un des esters de la vitamine

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A, dont l’activité est proche. Le propionate de vitamine A (PVA) fut choisit parmi plusieurs

esters de la vitamine A sur la base d’une étude préalable destinée à évaluer leur efficacité en

terme de croissance sur des cultures de fibroblastes (cellules dermiques) humains. Cette étude

a été effectuée il y a plusieurs années par l’équipe du département de recherche et

développement de LVMH Branche Parfums et Cosmétiques à Orléans.

Ce travail de thèse débute par la présentation des acteurs - à savoir la vitamine A et les

cyclodextrines – et par une étude bibliographique des moyens utilisés par le passé pour

améliorer les propriétés physico-chimiques de la vitamine A, y compris les cyclodextrines.

La suite est consacrée aux travaux personnels et se divise en deux chapitres décrivant

chacun une approche différente et donc l’utilisation d’une cyclodextrine différente.

Dans le premier chapitre sont décrits les résultats obtenus avec des cyclodextrines

commerciales. Les premiers essais ont été faits au cours du stage de recherche de DEA qui a

précédé cette thèse, avec les cyclodextrines naturelles αCD, βCD et γCD et l’étude des

composés d’inclusion obtenus est présentée dans un premier article.

Les trois autres publications de ce premier chapitre sont consacrées aux résultats obtenus

avec la per(2,6-O-diméthyle)βCD commerciale (Rameb). Les caractéristiques de solubilité et

stabilité du complexe d’inclusion Rameb/PVA ont permis la formation d’un gel aqueux à base

de Rameb/PVA et l’étude de la pénétration de l’hôte et de son invité dans des échantillons de

peau. Le PVA est facilement dosé par HPLC et pour la Rameb nous nous sommes tourné vers

les dosages immunoenzymatiques.

Le second chapitre est consacré à des dérivés de cyclodextrines synthétisés au

Laboratoire sur le modèle des cholestéryl-cyclodextrines [Auzély-Velty, 1999, 2000], c’est à

dire des dérivés obtenus en greffant un cholestérol sur une cyclodextrine monofonctionnalisée.

Dans un premier article, nous regarderons les remarquables propriétés d’insertion dans les

membranes du dérivé Cholestéryl-per(2,6-O-diméthyle)βCD ou Chol-Dimeb, grâce à des

films modèles de phospholipides : les films noirs.

Nous avons ensuite choisi un dérivé insoluble dans l’eau et capable d’interactions avec

les bicouches lipidiques et l’avons rendu encore plus hydrophobe en acétylant la partie

cyclodextrine. Le but est d’obtenir un composé capable de former des nanoparticules afin

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d’obtenir un nouveau type de vecteur pour le PVA et d’étudier la pénétration cutanée du PVA

à partir de ce vecteur.

Finalement, une comparaison pourra être faite entre les résultats de pénétration sur peau

obtenus avec le PVA sous forme moléculaire dans le complexe Rameb/PVA et les résultats

obtenus avec le PVA sous forme particulaire.

Toutes les études de pénétration sur peau ont été effectuées dans le laboratoire de

toxicologie de LVMH – R&D – Branche Parfums et Cosmétique, à Orléans.

L’étude des films noirs par réflectivité des rayons X a été effectuée sous la direction de

J.J Benattar au Service de Physique de l’Etat condensé du CEA Saclay.

Les dosages immunoenzymatiques par compétition de la Rameb ont été effectués sous la

direction de C. Créminon au Service de Pharmacologie et d’Immunologie du CEA Saclay.

11

1. PRESENTATION DES ACTEURSET DU SUJET

12

PRESENTATION DES ACTEURS ET DU SUJET

1.2 LE RETINOL

1.2.1 Historique

Dès l'antiquité, on a traité avec succès des malades atteints d'héméralopie (diminution

importante de la vision crépusculaire) en leur faisant absorber du foie, sans avoir la moindre

idée de l'existence de substances vitaminiques. Dans la seconde moitié du XIX ième siècle,

apparaît la notion que certaines affections ophtalmologiques surviennent essentiellement chez

des populations ou des individus malnutris, et peuvent donc être en rapport avec une

insuffisance quantitative ou qualitative de la ration alimentaire. C'est en 1909 que F.G.

Hopkins et W. Stepp s'aperçoivent que certaines substances liposolubles, présentes dans

l'alimentation, sont indispensables à la croissance des rats et des souris. Ce facteur de

croissance liposoluble, auquel on donne le nom de vitamine A, en reprenant le terme proposé

par C. Funk à propos de la thiamine, est ensuite extrait du beurre et du jaune d'œuf par E.V.

McCollum et M. Davis (1913). La structure chimique est définie par P. Karrer en 1931 et la

synthèse réalisée en 1947 par O. Isler dans les laboratoires F. Hoffman-La Roche [LeGrusse,

1993].

1.2.2 Structure et origine

La vitamine A (rétinol) est présente dans les produits d'origine animale. Elle se trouve

dans la fraction lipidique, matière grasse du lait et des fromages, et dans le foie des animaux

qui est l'organe de stockage. On peut donc l'extraire de ces produits naturels (huile de foie de

poisson par exemple), mais ceux ci contiennent plusieurs isomères [Lehninger, 1994] et donc

on n'utilise pratiquement plus actuellement en thérapeutique que la vitamine A synthétique. La

vitamine A peut aussi être synthétisée par le corps humain à partie de pro-vitamine A tels les

caroténoïdes (ex : béta-carotène, lycopène) que l'on trouve surtout dans les végétaux : carottes,

melons, abricots, mangues, épinards, tomates.. .

13

Figure 1. Structure de la béta-carotène

Les rétinoïdes, quant à eux, ne sont pas des vitamines mais des substances naturelles ou

synthétiques qui sont dérivées de la vitamine A ou qui lui sont apparentées structurellement.

Ils ne doivent pas être confondus avec elle. Ils sont pharmacologiquement plus actifs mais

tératogènes. De nombreux produits ont été synthétisés dans le but de développer certaines

propriétés de la vitamine A tout en diminuant les signes d'hypervitaminose. Cette dissociation

des propriétés de la vitamine A est mesurée par un index thérapeutique. Trois générations de

rétinoïdes ont vu le jour avec un index thérapeutique toujours plus élevé :

- Première génération : dérivés naturels de la vitamine A : trétinoïne (acide trans-

rétinoïque), isotrétinoïne (acide 13-cis-rétinoïque), rétinol…

- Deuxième génération : rétinoïdes monoaromatiques (étrétinate, acitrétine)

- Troisième génération : rétinoïdes polyaromatiques (arotinoïdes)

Ci-dessous quelques exemples de structures chimiques de rétinoïdes

Figure 2 . Rétinol R= CH2OH Rétinal R= CHO

Trétinoïne ou ac. rétinoïque R=COOH

Figure 3. Acide13-cis-rétinoïque ou isotrétinoïne R = COOH

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Figure 4. Un arotinoïde

Figure 5. Etrétinate R=OC2H5

Le rétinol est un alcool primaire C20H30O composé d’un noyau à six atomes de carbone et

d’une chaîne latérale possédant 5 doubles liaisons conjuguées [diméthyl-3,7 (triméthyl-2,6,6

cyclohexène-1 yl)-9 nonatétraène-2,4,6,8ol-1]. La forme biologique la plus active est le rétinol

tout-trans ou trans-rétinol (les 5 doubles liaisons de forme trans).

1.2.3 Devenir dans l’organisme

L'alimentation nous apporte de la vitamine A sous différentes formes. Les produits

d'origine animale contiennent des esters du rétinol, principalement du palmitate. Les végétaux

contiennent des caroténoïdes. Dans l'estomac, tous sont libérés des protéines alimentaires pour

être hydrolysés dans l'intestin grêle sous l'action conjuguée de la bile et des enzymes

pancréatiques. Le rétinol et les caroténoïdes sont alors incorporés aux micelles présents et

absorbés par un mécanisme de transport actif. Le rétinol et les caroténoïdes sont absorbés et

métabolisés à l'intérieur de la cellule intestinale. La majorité du rétinol est réestérifiée en

palmitate et incorporé aux chylomicrons (lipoprotéine plasmatique constituée d’un cœur de

triacylglycérols stabilisé par une enveloppe protéique et phospholipidique et qui transporte les

lipides de l’intestin vers les tissus). Les caroténoïdes sont partiellement hydrolysés en rétinal

par une dioxygénase puis réduits en rétinol et également incorporés aux chylomicrons. Ceux

ci sont excrétés dans la lymphe qui rejoint la circulation générale par le canal thoracique. Une

petite partie de rétinol et de béta-catotène passe dans la circulation sans subir de

modifications. Les esters du rétinol plasmatiques sont captés par les cellules hépatiques et le

rétinol est libéré par une hydrolase. Il se lie alors à un transporteur spécifique cytoplasmique,

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la Retinol Binding Protéine cytoplasmique (RBPc), qui le transporte vers le site de stockage :

les globules lipidiques des hépatocytes et des lipocytes. A partir du foie, le rétinol peut être

libéré dans le sang où il est transporté par la Retinol Binding Protéine plasmatique (RBPp). Le

rétinol lié à la RBPp se fixe sur l"albumine et le complexe ainsi formé constitue la principale

forme circulante de vitamine A. Au niveau des cellules, le rétinol est reconnu par un récepteur

membranaire spécifique, capté par la cellule et repris en charge par la RBPc. Il est transformé

dans la cellule cible car pour être actif le rétinol doit être oxydé. Il se forme alors du rétinal

qui peut se transformer par une nouvelle oxydation en acide rétinoïque tout-trans. La première

réaction est réversible, la seconde ne l'est pas. L'acide rétinoïque est transporté par la RABPc

dans le noyau où il exerce son action.

Figure 6 . Shéma de l’absorption et distribution de la vitamine A

ALIMENTATION

ESTOMAC

INTESTIN

CELLULEINTESTINALE

LYMPHE

SANG

CELLULEHEPATIQUE

protéines animalesrétinyl esters

rétinyl esters

rétinol

protéines végétalescaroténoïdes

caroténoïdes

caroténoïdesmicelles

rétinol caroténoïdes

rétinyl esters rétinal

chylomicrons rétinol

chylomicrons

rétinyl esters rétinol - RBPp-préalbumine

rétinyl esters

rétinol-RBPc

rétinol

rétinyl palmitate

globule lipidique

RBPc-rétinol

RALBPc-rétinal

RABPc-aciderétinoïque

estersphosphateglucuronide

base de Schiff

glucuronide

AUTRECELLULE

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1.2.4 Rôles physiologiques

Lors de la découverte de la vitamine A au début du siècle, deux équipes (MacCollum et

Davis, Osborne et Mendel) tentèrent chacun la même expérience : une hypovitaminose induite

chez le rat jeune. Celle-ci entraîne une perturbation de la croissance, les os et le système

nerveux ne peuvent se développer normalement. La peau devient sèche et épaisse. La vision

est fortement altérée (surtout la vision nocturne). Enfin les sujets adultes deviennent stériles.

Ces molécules possèdent aussi un fort pouvoir tératogène, des malformations importantes sont

observables après administration de rétinoïdes à des animaux gravides. Au fil des études il est

apparu que la vitamine A était impliquée dans plusieurs fonctions majeures de l’organisme

[Sporn 1986].

a ) Vision (Fig.7)

La vision de nuit, ou l’adaptation à l'obscurité, est un phénomène physico-chimique lié à

la présence, dans les cellules en bâtonnets de la rétine, d'un pigment photosensible : la

rhodopsine dont la synthèse s'effectue à partir d'un dérivé de vitamine A, le 11-cis-rétinal, et

d'une protéine, l'opsine. Lorsque la rhodopsine est exposée à une lumière de faible intensité, le

11-cis-rétinal est isomérisé en trans-rétinal, ce qui entraîne une cascade de réactions dont la

conséquence finale est la décomposition de la rhodopsine et la production d'un influx nerveux.

La vision des formes et des couleurs fait appel au même mécanisme grâce à la présence dans

les cellules en cônes de la rétine de trois pigments photosensibles également synthétisés à

partir du 11-cis-rétinal. Il est important de savoir que la carence en vitamine A, qui est la

première cause de mortalité infantile dans de nombreux pays en voie de développement, est

aussi la première cause de cécité dans le monde [Head, 1999].

rétinol plasmatique

cis-rétinal+

opsine

trans-rétinal+

opsine

lumière de faible intensité

RHODOPSINEobscurité

influx nerveux

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Figure 7. Rôle du rétinol dans le processus de vision

b) Différentiation cellulaire

Si le rétinal est la molécule impliquée dans la vision, c'est par contre l'acide rétinoïque

qui agit dans le noyau au niveau de la différentiation cellulaire. L’acide rétinoïque et ses

isomères agissent comme des hormones pour réguler l’expression des gênes et ainsi influencer

de nombreux processus physiologiques. L’acide rétinoïque tout-trans est transporté par une

protéine (Cytoplasmic Retinoic Acid Binding Protein) vers le noyau de la cellule où il se lie a

son récepteur, le Retinoic Acid Nuclear Receptor. Ce récepteur RAR appartient à la super

famille des récepteurs nucléaires recevant les stéroïdes, les prostaglandines, les hormones

thyroïdiennes, la vitamine D et certaines molécules intervenant dans la prolifération de

cellules spécifiques. Les isomères de l’acide rétinoïque tout-trans se lient à un récepteur

légèrement différent : le RXR. Une fois liés à un acide rétinoïque, RAR et RXR forment

ensemble un hétérodimère RAR/RXR qui va se lier à une région spécifique d’un chromosome

appelée RARE (retinoic acid response elements), stimulant ou inhibant la transcription de

certains gênes. Ainsi, en jouant le rôle de facteur de transcription de gênes spécifiques,

l ‘acide rétinoïque joue un rôle majeur dans la croissance, la différentiation et la mort des

cellules [Lampen, 2000 ; Lotan, 1980 ; Hoffman, 1994]. La plupart des effets physiologiques

attribués à la vitamine A résultent de ce rôle dans la différentiation cellulaire.

c) Reproduction

La vitamine A intervient dans le développement des spermatozoïdes, des ovaires et du

placenta, la croissance de l’embryon, ainsi que dans la prolifération et la différentiation de

l’épithélium. Un taux sérique faible en vitamine A chez la mère est associé à une mortalité et

une morbidité infantile accentuée. Une déficience en vitamine A peut donner différentes

malformations embryonnaires notamment au niveau des reins, de l’œil et des oreilles [Raz,

1999]. De même, les enfants de faibles poids à la naissance, les retards de croissance et les

infections respiratoires résultant d’immuno-déficience sont plus communs chez les enfants nés

de mère déficiente en vitamine A.

d) Système immunitaire

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A ses débuts, la vitamine A était connue comme «la vitamine anti-infection » car elle est

essentielle au bon fonctionnement du système immunitaire. Elle joue un rôle important dans le

développement et la différentiation des cellules sanguines blanches, l’activation des

lymphocytes T passant par la liaison de l’acide rétinoïque tout-trans à son récepteur RAR.

e) Oncologie

Le rôle déterminant de la vitamine A (par l'intermédiaire de l'acide rétinoïque) dans le

contrôle de la croissance et de la différentiation cellulaire lui confère un intérêt particulier en

oncologie. La vitamine A et ses esters sont capables d’inhiber la carcinogénèse. En effet, ils

se sont montrés efficaces dans un certain nombre d’expériences in vivo sur des cancers du

poumon, du sein, du colon, de la prostate et de la peau [Niles, 2000 ; Lippman, 1994]. De

nombreux rétinoïdes on été utilisés seuls ou en association pour le traitement de plusieurs

cancers, tel le carcinome des cellules basales, le carcinome des cellules squameuses de la

peau, les mélanomes, le lymphome des cellules T cutanées, la leucémie aigüe à

promyélocytes, les carcinomes ovariens, les carcinomes du poumon, du sein, de la prostate, de

la bouche, des cellules rénales et des cellules squameuses de la tête et du cou et le syndrôme

nevus displasique [Hunter, 1994].

Les récepteurs RAR et RXR (qui se divisent chacun en plusieurs sous classes) semblent

être exprimés différemment en fonction du tissu et de son action biologique. La relation entre

les variations observées dans l’expression des récepteurs par l’organe cible et la réponse aux

agents anticancéreux est actuellement le sujet de nombreuses études. Les mécanismes par

lesquels les rétinoïdes exercent leur action anticancéreuse pourraient comprendre un large

éventail de voies. Par exemple, une étude in vitro a montré une activité limitée des dérivés de

l’acide rétinoïque sur des lignées cellulaires issues de cancer ovarien. Toutefois, une

inhibition significative de la prolifération a été obtenue en associant l’acide rétinoïque tout-

trans avec le TGF-bêta (transforming growth factor-beta). Ce dernier étant produit par la

surface épithéliale des ovaires sains, les dérivés de l’acide rétinoïque et les inducteur du TGF-

bêta pourraient avoir une activité in vivo chimio-préventive [Dabal, 1995].

Le béta-carotène, en dehors de son rôle de provitamine A, possède des propriétés propres

d'agent anti-oxydant. Il possède la faculté de piéger les radicaux libres et de désactiver les

molécules d'oxygène hautement réactives (oxygène singulet). Un grand nombre d'études

épidémiologique a démontré que de faibles apports en béta-carotène sont associés à une

augmentation du risque de développer certains cancers (poumon, col utérin, œsophage, sein,

vessie…..) [Le Grusse, 1994].

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Le rétinol, ses esters et les isomères de l’acide rétinoïque (tout-trans, 9cis et 13cis) sont

les rétinoïdes les plus utilisés dans les essais cliniques actuellement. Mais les traitements par

voie systémique sont limités par la forte toxicité de ses produits qui résulte de l’activation de

nombreuses voies. Cette toxicité concerne la peau et les muqueuses (sécheresse,

desquamation, prurit, dermatoses, photosensibilité), le foie (élévation réversible des enzymes

hépatiques), le squelette (calcification des ligaments), le système nerveux central (migraines)

et le taux sérique des lipides [Smith, 1992 ].

f) Dermatologie

L’action de la vitamine A sur la prolifération et la différenciation des épithéliums en fait

une molécule de grand intérêt en dermatologie. La première utilisation des rétinoïdes en

dermatologie remonte à 1959 avec les travaux de Stüttgen [Stüttgen, 1959] qui compris que

puisque le rétinol et ses esters étaient efficaces dans le traitement de plusieurs pathologies,

lorsque donnés par voie cutanée mais pas par voie orale, la molécule efficace devait être un

métabolite, par exemple la forme acide. Plus tard, il rapporta des résultats probants dans le

traitement de kératoses actiniques et séborrhéiques, sur les verrues de type viral et le

carcinome des cellules basales. Quelques années plus tard, Kligman et coll. [Kligman, 1969]

rapportèrent des effets bénéfiques sur l’acné vulgaris, les ichtyoses, le psoriasis, le lichen et

les lésions précancéreuses, ainsi que les mélanomes de la peau. Plus tard, ces effets sur le

traitement du vieillissement de la peau induit par les rayons lumineux furent reportés.

Les mécanismes d’action des rétinoïdes sur la peau sont encore le sujet de nombreuses

recherches, mais certains faits ont déjà été clairement établis.

En ce qui concerne l’épiderme, ils jouent un rôle important dans la prolifération des

cellules épidermiques, la kératinisation et les phénomènes de desquamation [Torras, 1996 ;

Fisher, 1996]. Ils perturbent aussi la synthèse kératinique. Des études sur des kératinocytes en

culture ont montré la formation d’une kératine spécifique d’épithélium non différentié après

traitement des cellules avec de l’acide rétinoïque tout-trans. D’autres études in vitro ont

montré que les rétinoïdes sont capables d’inhiber la prolifération des sébocytes et de modifier

leur différentiation ainsi que la composition de la matrice extracellulaire. L‘effet des

rétinoïdes sur ces cellules semble être dose-dépendant [Gendimenico, 1993], en effet une

étude portant sur la morphogénèse d’épithélium reconstruit a montré qu’une faible dose

d’acide rétinoïque tout-trans permet une formation optimale de l’épiderme, une dose plus

importante produisant un effet inverse. Au niveau dermique, ils influencent la prolifération

des fibroblastes et le métabolisme du collagène. Lors de la réaction inflammatoire, ils

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montrent une activité immunomodulatrice et préviennent la croissance tumorale. La forme

active dans la peau est l’acide retinoïque. Par voie topique, l’acide rétinoique tout-trans est

converti dans l’épiderme (et probablement dans le derme) en acide 13-cis, 9-cis, et 4-

hydroxyrétinoïque. Seule la moitié approximativement reste sous forme tout-trans.

Paradoxalement, in vivo, les rétinoïdes donnent des effets inverses de ce que l’on peut

observer sur cultures cellulaires : les rétinoïdes induisent une hyperprolifération des

kératinocytes se traduisant par une hyperplasie de l’épiderme avec accumulation de matière

intercellulaire, le stratum cornéum ainsi que l’épiderme apparaissent désorganisés. Cette

différence semble être due au fait que la réponse des cellules aux rétinoïdes diffère en fonction

du contexte des autres signaux. De plus les cellules en cultures expriment beaucoup moins de

récepteurs aux rétinoïdes que des cellules in vivo. Malgré ces observations tendant à montrer

un effet négatif des rétinoïdes in vivo, ils sont très efficaces dans de nombreuses indications

cliniques : acide rétinoïque tout-trans et 13-cis (Roaccutane), adapalène (Differine) pour

l’acné, l’étrétinate (Tigason) pour le psoriasis…….

g) Cosmétologie

Dans le domaine de la cosmétologie, les rétinoïdes sont utilisés depuis une vingtaine

d’années. Le premier article sur l’utilisation topique d’acide rétinoïque pour le traitement du

vieillissement cutané induit par la lumière date de 1983. Cordero et coll. [Cordero, 1983]

observèrent une amélioration des rides faciales et un adoucissement de la peau après

traitement par 0.001 à 0.05% d’acide rétinoïque pendant 6 mois.

L’acide rétinoïque agit sur le vieillissement photo-induit en modulant le programme de

différentiation cellulaire impliqué dans la pathologie concernée [Torras, 1996]. Le

vieillissement photo-induit de la peau se traduit au niveau épidermique par d’importants

dommages, à savoir une grande atypie cellulaire, la mort prématurée de certaines cellules avec

contraction du cytoplasme et perte de la membrane cellulaire, enfin la perte de la polarité et

l’apparition de modèles désorganisés (dysplasie). Ces changements se traduisent rapidement

cliniquement par une atrophie avec diminution du nombre de couches cellulaires, par des

cellules plus petites, rétractées, par l’aplatissement de la jonction dermo-épidermique et par

l’apparition de gros granules de mélanines près du noyau des kératinocytes. Il est observé un

épaississement irrégulier avec des infiltrats inflammatoires et une dégénérescence massive

élastosique. Après traitement par l’acide rétinoïque on observe au microscope une disparition

quasi-totale de la dysplasie et de l’atypie, il y a restauration de la polarité, élimination des

21

kératoses actiniques, l’épiderme rosit et la couche cornée devient plus fine. Les mélanocytes

qui avaient tendance à emmagasiner des amas de grains de mélanine, donnant une apparence

tachetée à la peau, reprennent leur aspect normal et leur contenu en mélanine devient plus

uniforme. Les cellules de Langerhans sont plus actives, ce qui implique une plus grande

immunocompétence. Macrocospiquement, les rides profondes et l’aspect râpeux au toucher

sont significativement améliorés mais moins que les rides superficielles [Montassier, 1996].

Au niveau du derme, la peau présentant un vieillissement photo-induit contient peu de

fibrocytes, ceux ci sont déformés, peu actifs et dans certains cas la membrane est rompue. Le

collagène présent sous la lame basale est tacheté, éparpillé, rompu et distribué au hasard.

Après traitement par l'acide rétinoïque les fibroblastes deviennent hyperactifs, la lame basale

est réparée et du collagène nouvellement formé et d'apparence normale est retrouvé sous

forme de faisceaux orientés parallèlement à la basale, repoussant vers le derme plus profond le

vieux matériel élastosique. Tout ceci explique l'amélioration des fines ridules et tendrait à

prouver qu'un traitement prolongé pourrait améliorer les rides plus profondes.

1.2.5 Pénétration et absorption percutanée

Les rétinoïdes appliqués par voie cutanée sont thérapeutiquement actifs à faible

concentration. Les études de pharmacocinétique cutanée se concentrent sur le shéma de

distribution dans la peau, l’atteinte de la circulation sanguine et le mode d’excrétion. Deux

voies de pénétration doivent être prises en compte (cf. Annexe 1 – La peau) : la voie

transépidermale, qui donne lieu à une augmentation typique du gradient de concentration

épiderme/derme et qui fait très certainement partie du mode d’action impliqué dans les

désordres de la kératinisation ; et la voie transfolliculaire qui intervient dans les désordres

folliculaires tels que l’acné. La partie cutanée de la pharmacocinétique des rétinoïdes dépend

largemant de leur structure chimique et donc varie. Toutefois, on trouve des aspects communs

comme de hautes concentrations cutanées, alors que le passage dans la circulation générale

parait faible, donnant lieu à des concentrations difficilement mesurables. Pour la

pharmacocinétique, l’application topique présente des intérêts majeurs par rapport à la voie

systémique. Les rétinoïdes peuvent être ciblés vers le site voulu, avec une toxicité systémique

supprimée.

22

1.2.6 Inconvénients liés à ses propriétés physico-chimiques

Outre la toxicité, la vitamine A pose d’autres problèmes : insolubilité totale dans l’eau

et instabilité chimique. Le rétinol et ses esters se présente sous forme de cristaux ou de

solutions huileuses insolubles dans l’eau, solubles dans les solvants organiques (alcool,

acétone, éther, chloroforme..)

⇒ Solubilité : le rétinol tout-trans est un composé hydrophobe et liposoluble : il est

pratiquement insoluble dans l'eau mais facilement soluble dans les solvants organiques

(éthanol, chloroforme, éther, éther de pétrole,.......).

⇒ Stabilité : il est hautement instable en présence d'oxygène (ou d'oxydants) et se

décompose en quelques jours à l'air libre. Il est aussi très sensible à la lumière et à la chaleur :

la lumière catalyse l'isomérisation des doubles liaisons et lorqu'elle est très intense d'autres

réactions photochimiques plus drastiques ont lieu, provoquant une dimérisation et amenant à

la formation de kitol et autres dimères. En absence d'oxygène, la formation de kitol ou la

dégradation de la vitamine A sera beaucoup plus rapide si les échantillons sont éclairés. Et

même dans des conditions parfaitement inertes, la stabilité dans le noir de la vitamine A n'est

pas infinie Ceci est du à la formation de kitol induite par la chaleur [Runge, 2000].

La vitamine A est stable en milieu basique mais très sensible aux acides qui provoquent

des réarrangements des doubles liaisons de la chaîne aliphatique. On obtient alors un mélange

de produits déshydratés et réarrangés sous l'effet de l'oxydation [Blomhoff, 1994].

Les esters du rétinol sont un peu plus stables à l'air mais en fait l'isomérisation n'est que

ralentie. En effet, en solution en milieu acide, on aura toujours une évolution lente de la forme

native tout-trans vers la forme cis (i.e., 13-cis rétinol, 9-cis rétinol et 9, 13-di-cis rétinol) pour

aboutir à un mélange d'environ 66% de tout-trans et 33% de forme cis, qui est moins active

[Sarama , 1995].

Les chercheurs ont donc du faire preuve d’ingéniosité pour trouver des formulations

permettant d’améliorer la stabilité et la solubilité de la vitamine A afin de favoriser son

incorporation dans les différentes formes galéniques actuellement utilisées, comme nous le

verrons dans la section 2.1 (section Travaux antérieurs).

23

1.3 LES CYCLODEXTRINES

1.3.1 Historique des cyclodextrines

En 1891, Villiers [Villiers, 1891] isolait pour la première fois un groupe

d’oligosaccharides non réducteurs provenant de la dégradation enzymatique de l’amidon par

une amylase (cyclodextrine glucosyl transférase) produite par différents bacilles dont Bacillus

macerans. Villiers a isolé 3 g d’une substance cristalline ((C6H10O5)2 3H2O) à partir de la

digestion de 1 kg d’amidon par une souche de micro-organismes. Ces produits (Villiers met

en évidence la présence de deux produits, probablement l’α- et la β-cyclodextrine) possèdent

des particularités physico-chimiques proches de celles de la cellulose, il les baptise donc

« cellulosines ».

Schardinger [Schardinger, 1904 et 1905], 20 ans plus tard, isole la souche microbienne

responsable de la formation de ces « cellulosines », qu’il dénomme Bacillus Macerans et,

décrit le mode de purification et de préparation de ces oligosaccharides. Il met aussi en

lumière la capacité de ces dextrines (appellation générale des produits de dégradation de

l’amidon) à former des adduits particuliers avec les molécules de diiode. La distinction entre

l’α-dextrine et la β-dextrine est due à leur différence quant aux complexes cristallins formés

avec l’iode. Le complexe de l’α-dextrine est gris-vert alors que celui formé par la β-dextrine

est rouge-brun.

C’est en 1932 que Prigsheim [Prigsheim, 1932] et son équipe démontrent que ces

produits ont la propriété de former des complexes avec des molécules organiques. D. French,

F. Cramer et K. Freudenberg contribuèrent également grandement à la connaissance des

cyclodextrines et à l’élucidation de leur structure durant les années 30-40. Freudenberg et son

équipe démontrent alors que ces oligosaccharides sont constitués d’un enchaînement de n

unités α-D-glucopyranosidiques, la fraction principale contenant

l’alpha et la bêta-cyclodextrine (possédant respectivement 6 et 7 unités). De même le postulat

en la capacité des cyclodextrines à former des composés d’inclusion [Freudenberg, 1938] est

posé. C’est cette même équipe qui, en 1948, découvre la γ-cyclodextrine (constituée de 8

unités glucose) et qui détermine entièrement sa structure [Freudenberg,1953].

Au début des années 1950, les équipes de French et de Cramer étudièrent de façon

intensive les productions enzymatiques de cyclodextrines, leurs purifications, et leurs

caractérisations physico-chimiques.

24

O

HO

OH

HO

OHHO

OH

OH

OH

HOHO

OH

OH

HO

OH

HO

HO

HOOH

OH

HO

OH

O

OO

O

O

O

O

O

O

O

OO

OO

O

OH

HO

OH

γ cyclodextrine

Forme spatiale

Forme spatiale

O

O

OH

HO

OH1

2

3

5

6 6 '4

Unité glucose en C41

Figure 8. Formule générale des CDs et représentation schématique de leur structure

tridimensionnelle.

Cette propriété des cyclodextrines à former des complexes d’inclusion devient alors le

sujet d’études intensives, notamment par l’équipe de Cramer [Cramer, 1954]. C’est ainsi que

le tout premier brevet concernant l’application des cyclodextrines pour la mise en forme d’un

composé à activité biologique est déposé en 1953 [Freudenberg, 1953]. A partir de ce

moment, on observe une recrudescence de l’étude des cyclodextrines, tant du point de vue de

leur fabrication industrielle, que de l’exploitation de leurs propriétés, de leurs modifications

chimiques ou bien encore, de leurs domaines d’applications [Duchêne, 1991 ; Atwood, 1996 ;

Wenz ,1994 ; Chem. review, 1998].

1.3.2 Structure et propriétés des cyclodextrines

Les cyclodextrines (CD) sont donc des oligosaccharides cycliques non-réducteurs

obtenus industriellement par dégradation enzymatique de l’amylose (forme linéaire de

l’amidon) à l’aide d’une enzyme, la cyclodextrine glucosyltranférase (CGTase). Les trois

types de CD les plus couramment rencontrés sont l’α, la β et la γCD, qui sont constitués

respectivement de 6, 7 et 8 unités D-glucopyranosiques, liées en α-1,4.

Nomenclature.

L’appellation IUPAC de la β-cyclodextrine, est : 5,10,15,20,25,30,35 -heptakis

(hydroxymethyl)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29,32,34-tétradécaoxaoctacyclo

[31.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.223,26.228,31] nonatétracontane-36,37,38,39, 40,41,42,43,44,45,46,

25

47,48,49-tétradécole. Dans un souci de clarté, on retrouve diverses appellations dans la

littérature : β-dextrine de Schardinger, cyclomaltoheptaose, cycloheptaglucane,

cycloheptaamylose, β-CD, ou bien encore C7A pour la β-cyclodextrine. Dans cette étude

le terme βCD ou βcyclodextrine sera utilisé.

Les structures tridimensionnelles des CD ont pu être obtenues à partir de l’étude de leurs

monocristaux par diffraction des rayons X (et même, de quelques monocristaux de complexes

CD-invitée) ce qui a permis de mettre en évidence la structure tronconique des CD ainsi que

de déterminer les dimensions des cavités de chacune d’elles [Saenger, 1984].

Figure 9. Structures tridimensionnelles des cyclodextrines naturelles (α, β, et γCD de gauche à droite),

avec de haut en bas: une vue de la face des hydroxyles secondaires (« grand côté »), une vue latérale et, une

vue de la face des hydroxyles primaires (« petit côté »). En bas, les dimensions respectives des CD obtenues

d’après les données cristallographiques.

26

Ces études ont permis de montrer que l’extérieur des CD est tapissé par les fonctions

hydroxyles des unités glucose, tandis que les atomes de carbone et d’hydrogène tapissent

l’intérieur de la cavité. La structure des cyclodextrines, alliée à l’orientation particulière

adoptée par les diverses fonctions hydroxyles des unités glucopyrannose, donnent aux CD leur

caractère amphiphile caractéristique, du à un extérieur relativement hydrophile (surface de

contact avec le solvant) et à un cœur relativement hydrophobe (surface de contact avec la

molécule invitée).

Figure 10. Représentation d’un cycle α-D-glucose en conformation chaise 4C1 et représentation

schématique de la coupe transversale d’une cyclodextrine avec numérotation des atomes de carbones.

Les cyclodextrines présentent donc une forme torique, le côté le plus étroit étant appelé

face primaire (les hydroxyles primaires y étant situés) et le côté le plus large, face secondaire

(les deux groupes hydroxyles secondaires de chaque unité y étant localisés).

De plus, on entrevoit sur la figure, que les hydroxyles primaires et secondaires forment un

réseau dense de liaisons hydrogène, contribuant ainsi à la rigidité du macrocycle, et stabilisant

la forme tronc-conique des molécules. Cette structure spatiale des CD est aussi responsable de

certaines de leurs caractéristiques physico-chimiques.

La cavité interne du tore est relativement apolaire car tapissée de deux couronnes de

groupes CH (protons H3 près de la face secondaire et protons H5 près de la face primaire),

séparées par les oxygènes glucosidiques. On peut distinguer sur la figure ci-dessus que tous

les protons H3 et H5 des différentes unités glucose pointent vers l’intérieur de la cavité des

CD, particularité importante pour l’étude par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) des

propriétés d’inclusion de ces molécules, comme cela sera explicité par la suite.

27

Tableau 1. Caractéristiques physico-chimiques des principales cyclodextrines [Szjetli1988]

αCD βCD γCD

Nombre d’unités glucose 6 7 8

M (g/mol) 972 1135 1297

Formule brute C36H60O30 C42H70O35 C48H80O40

Solubilité dans l’eau à 298K (g/L) 145 18,5 232

[α]D 25°C 150 ±0,5 162,5 ± 0,5 177,4 ± 0,5

Volume approximatif de la cavité (106 pm3) 174 262 427

Diamètre de la cavité (grand côté-petit côté)

( )4,7-5,3 6,0-6,5 7,5-8,3

Il est à remarquer la faible solubilité de la βCD en comparaison de celles de l’α et de la

γCD. Cette perte de solubilité, dont les causes n’ont pas été totalement éclaircies, semble due

au réseau de liaisons hydrogène particulièrement fort dans le cas de CD à 7 unités. Lors de

synthèses de βCD modifiées, mono- ou poly-modifications, les solubilités obtenues sont alors

très largement augmentées par rapport à la CD naturelle, y compris après greffage de

groupements relativement hydrophobes, renforçant l’hypothèse du réseau stabilisant. Dans le

cas de l’αCD cette ceinture de liaisons H est incomplète, l’une des unités étant dans une

position distordue, il n’y a donc que 4 liaisons formées (au lieu des 6 prévues). Pour ce qui est

des CD de taille supérieure δ-, ε-… celles-ci se présentent sous forme de cylindre non

28

régulier, effondré en leur centre, de ce fait, leur cavité se trouve être plus petite que celle de la

γCD.

C’est le caractère amphiphile lié à leur structure tridimensionnelle qui donne aux

cyclodextrines leur propriété la plus intéressante, celle de former des complexes

supramoléculaires en solution aqueuse avec une (des) molécule(s) invitée(s).

1.3.3 Inclusion – Complexation

1.3.3.1 Inclusion

Les CD sont, de ce fait, des composés de choix pour l’inclusion de molécules

hydrophobes à la condition que la taille de ces invités s’accorde aux dimensions internes de la

cavité. Les CD peuvent ainsi inclure partiellement ou en totalité un composé invité, ce qui

donne alors lieu à la formation de complexes comportant éventuellement plusieurs molécules

(1 ou 2) de CD ou de molécules invitées. De nombreux exemples de complexes CD-invité,

avec divers arrangements structuraux, se trouvent ainsi décrits dans la littérature. Les

structures des principaux complexes ayant fait l’objet de publications sont représentées sur la

figure suivante.

Figure 11. Diverses structures de complexes cyclodextrines-invités, en solution aqueuse, décrites dans la

littérature a) inclusion complète ; b) inclusion « axiale » ; c) inclusion partielle ; d) complexe 2:1 ; e) complexe

1:2 ; f) complexe 2:2 ; g) complexe « non-spécifique ».

Ces structures peuvent être mises en évidence et caractérisées en employant diverses

techniques d’analyses physico-chimiques, comme la spectroscopie UV-visible,

la spectroscopie de fluorescence, l’analyse cristallographique, la spectroscopie RMN ou bien

encore, à l’aide des méthodes d’analyses électrochimiques [Szente, 1996].

29

La taille des CD peut être un facteur limitatif important quant à leur capacité à former des

complexes d’inclusion et à leurs stabilités relatives. Ainsi, en relevant diverses valeurs de

constantes de complexation (K de l’équilibre hôte-invité, dans des cas de complexes 1:1)

parues dans la littérature, Connors a tracé la fréquence de distribution des constantes de

complexation pour les complexes formés par l’α, la β et la γCD [Connors, 1997].

Figure 12. Distribution des constantes de complexation des complexes 1:1 formés par les différentes

cyclodextrines naturelles.

Une distribution quasi-gaussienne de ces constantes de complexation est observée, quelle

que soit la CD naturelle considérée. Une valeur moyenne de K a pu alors être extraite pour

chacune de ces CD, dans le cas de complexes 1:1 (avec σ l’ecart type observé).

Tableau II: Paramètres utilisés pour établir les courbes de distributions des constantes de complexation

des différentes CDs dans le cas de complexes 1:1.

Molécule

hôte

Nombre de constantes de

complexation prises en

compte

Nombre de systèmes

hôte-invité 1:1 différents

log (K)moy.

(M-1)

σ

(M-1)

αCD 960 663 2,11 0,90βCD 1142 721 2,69 0,89γCD 188 166 2,55 0,93

Il apparaît alors que toutes les cyclodextrines naturelles présentent une valeur moyenne

de constante de complexation relativement faible (Ka~103 M-1). Il est à noter que c’est grâce à

la faible sélectivité du processus de complexation par les CD qu’il a été possible de multiplier

le nombre et la diversité des molécules invitées.

30

Des modifications chimiques du macrocycle ont été envisagées de façon à permettre

l’accroissement des constantes de complexation des complexes supramoléculaires formés par

les CD. Il est même possible de synthétiser des CD “sur mesure”, c’est à dire modifiées de

façon à accroître leur affinité pour une molécule précise [Djedaïni-Pilard, 1993]

1.3.3.2 Energies mises en cause.

En solution aqueuse la cavité des CD est occupée par des molécules d’eau énergiquement

non-favorables (interaction polaire-apolaire), ce qui permet une substitution aisée par des

molécules invitées de moindre polarité que l’eau.

Plusieurs contributions énergétiques ont été mises en évidence pour expliquer les

interactions en jeu lors de la formation de complexes par des cyclodextrines.

- Adaptation stérique : par des changements conformationnels de la molécule invitée

et/ou de la cyclodextrine (conformation induite) lors du processus d’inclusion.

- Formation de liaisons hydrogène.

- Interactions de Van der Waals : forces de dispersion de London et interactions dipôle-

dipôle induit.

- Interactions hydrophobes, dipôle-dipôle, de transfert de charges et électrostatiques.

- Relargage de molécules d’eau à «haute-enthalpie» de la cavité de la cyclodextrine.

- Relargage de molécules de solvant de la cavité de la cyclodextrine avec un gain

d’entropie.

- Relâchement des tensions du macrocyle.

C’est l’action simultanée de plusieurs de ces interactions qui rend effective l’inclusion

spécifique, les phénomènes de reconnaissances moléculaires étant dus à la coopération de

multiples interactions faibles. Ce phénomène d’inclusion-complexation ne fait intervenir

aucune liaison covalente mais uniquement des forces telles que les liaisons hydrogène ou des

interactions de Van der Waals, ce qui permet ainsi le relargage de la molécule invitée, ouvrant

la voie à de multiples applications.

1.3.3.3 Conséquences.

31

L’inclusion d’invités dans la cavité des CD, influence nombres de propriétés de

ceux-ci, ouvrant la voie à de nombreuses études tant théoriques qu’industrielles. Les

propriétés physico-chimiques des invités se trouvent modifiées du fait de la formation de

complexe d’inclusion :

- Le déplacement chimique en RMN est modifié du fait de ce changement

d’environnement anisotropique.

- Lorsque des composés achiraux sont inclus dans une CD, le complexe formé est

optiquement actif et montre un important effet de Cotton induit en dichroïsme circulaire.

- Parfois le maximum en UV est déplacé de plusieurs nm.

- La fluorescence est aussi très influencée car la molécule fluorescente passe d’un milieu

aqueux à un milieu apolaire.

La réactivité chimique des molécules incluses est aussi modifiée lors de l’inclusion. Le

plus souvent elle est diminuée car l’invité se trouve stabilisé, mais la cyclodextrine peut aussi

agir comme catalyseur. La diffusion et la volatilité sont modifiées, ainsi que les propriétés

chromatographiques des molécules incluses, en particulier en chromatographie chirale.

1.3.4 Applications des cyclodextrines.

Le phénomène d’inclusion dans les molécules cages hydrophiles que sont les CD, fournit

à la recherche fondamentale un modèle d’étude des réactions enzymatiques, catalytiques, ou

de complexations. De nombreuses et diverses applications des CD sont décrites dans la

littérature, ainsi que dans les registres de brevets. Toutes ces applications tirent parti des

propriétés complexantes en milieu aqueux des CD avec un panel impressionnant de molécules

invitées. De nombreuses applications technologiques découlent de l’observation faite que, par

la formation du complexe d’inclusion, la stabilité, la solubilité, la bio-disponibilité, la durée

de vie, la toxicité et l’odeur de la molécule invitée se trouvent favorablement modifiées.

[ Loftsson, 1998b ; Duchêne, 1987 ; Chem. review, 1998]

- Complexant

La formation de ces complexes d’inclusion est mise à profit, non seulement dans le

domaine pharmaceutique (solubilisation, stabilisation, masquage d’effets secondaires)

[Duchêne, 1987 ; Duchêne 1991], mais aussi dans les industries chimiques et agro-

alimentaires [Hedges, 1998] (stabilisant d’arômes, protection des vitamines, extraction du

32

cholestérol). Citons aussi l’utilisation toute récente, dans des produits vaporisés sur tissus, de

la CD pour masquer les odeurs désagréables [Noh, 1998].

- Vectorisation

Les cyclodextrines sont aussi employées comme vecteur [Uekama, 1998], pour le ciblage

de médicaments. Quelques tentatives d’emploi des cyclodextrines dans un but de vectorisation

de principes actifs ont été réalisées. Le schéma employé est identique dans toutes les

approches relevées : on part de la structure de base des CD sur laquelle on greffe

chimiquement une «antenne » destinée à assurer la fonction de ciblage. L’originalité des

différentes approches réside essentiellement dans la pertinence du choix de cette antenne,

ainsi que dans l’approche synthétique employée lors de la réalisation de ces conjugués [Péan,

1998].

- Catalyseurs - Modèles d’enzymes artificielles

En plus de la sélectivité des complexes hôte-invité, les cyclodextrines possèdent des

propriétés catalytiques à rapprocher de celles des enzymes (inhibitions compétitives, cinétique

de Michaelis-Menten). Les CD ont été largement étudiées en tant que modèle enzymatique de

l’α-chymotrypsine, de l’anhydrase carbonique et, des ribonucléases ainsi que comme

inducteur de chiralité dans des réactions aussi diverses que la réduction de céto-acides,

l’halogénation, l’oxydation de sulfures, l’époxidation, certains réarrangements

sigmatropiques, l’addition de Michaël, les réactions de Diels-Alder et de Wittig, en utilisant

un réactif achiral et un substrat prochiral [Takahashi, 1994 ; Breslow, 1992 ; Breslow, 1998].

- Complexant chiral

Les CD sont aussi utilisées en séparation énantiomérique par électrophorèse capillaire,

chromatographie en phase gazeuse ou chromatographie liquide haute performance. Ce sont,

cependant, les applications en séparation chirale (colonnes CLHP, CPG), dans le domaine de

la formulation de médicaments (galénique) et de l’industrie

agro-alimentaire qui ont donné lieu aux plus nombreuses applications des CD. Celles-ci ont

eu pour conséquences les dépôts de nombreux brevets nationaux et internationaux couvrant

l’exploitation de ces applications. Les cyclodextrines ont aussi été utilisées en RMN comme

auxiliaires chiraux pour la détermination d’excès énantiomériques [Gosnat, 2000].

33

1.3.5 Toxicité des cyclodextrines

Le profil toxicologique des 3 cylodextrines naturelles les plus communes et de certains

dérivés chimiquement modifiés a récemment été passé en revue [Loftsonn, 1998b ;

Frömming, 1994]. En général, les cyclodextrines naturelles et leurs dérivés plus hydrophiles

sont seulement capables de passer à travers les membranes biologiques lipophiles, telles la

cornée, les muqueuses ou la peau, avec de grandes difficultés. Même la βCD méthylée qui est

plus ou moins lipophile ne passe pas facilement les membranes biologiques lipophiles, bien

qu’elle interagisse de manière plus efficace avec les membranes que les dérivés hydrophiles.

Gerloczy et coll. [Gerloczy, 1988] ont ainsi montré que seule une très faible quantité de

diméthyl-βcyclodextrine radiomarquée est absorbée transdermiquement. On peut supposer

que le haut poids moléculaire des CD est une des causes limitant ce passage.

Toutes les études de toxicité ont démontré que l’administration orale de cyclodextrines

est non-toxique, ceci étant du à leur très faible absorption gastro-intestinale (0.1 à 3%). Le

caractère hémolytique des cyclodextrines est bien connu mais n’apparaît en fait qu’à forte

concentration : en effet à faible concentration (5mmol pour l’αCD et 10mmol pour la βCD)

les cyclodextrines protègent les globules rouges contre l’hémolyse osmotique et l’hémolyse

induite par la chaleur alors qu’à forte concentration elles provoquent l’hémolyse en

complexant et relarguant le cholestérol des membranes cellulaires. Cette action hémolytique

est faible avec la γCD mais plus forte avec l’αCD et la βCD et cette propriété conditionne les

effets des CD par voie intraveineuse ou intramusculaire. Un certain nombre d’études

toxicologiques ont montré que la γCD, la 2-hydroxypropyl-βCD, la sulfobutyléther-βCD et

la maltosyl-βCD sont sans danger même pour l’administration parentérale. Par contre, l’αCD,

la βCD et les βCD méthylées ne sont pas acceptables pour l’administration parentérale

(irritation à l’injection pour les trois et très forte néphrotoxicité pour α et β).

Les cylodextrines ont longtemps été accusées de provoquer des irritations lors de leur

application cutanée [Uekama, 1982], ceci étant lié directement à leur pouvoir hémolytique et

donc à leur capacité à inclure les différents constituants des membranes biologiques. Mais une

étude, consistant en l’application de quantités équivalentes à 2mg de CD sur 1 cm2 de peau

(volontaires sains avertis) et utilisant un vélocimètre laser Doppler afin de mesurer la

34

vasodilatation éventuelle de la peau, a démontré clairement l’absence d’effet irritant (après

24h d’occlusion) des cyclodextrines naturelles, de la diméthyl-βcyclodextrine et des dérivés

hydroxypropyl de la βCD et la γCD [Montassier, 1996]. Il a aussi été montré par cette même

technique que l’utilisation du complexe d’inclusion βCD/acide rétinoïque permettait de

réduire significativement l’irritation cutanée produite par le principe actif seul [Amdidouche,

1994]. De plus il faut souligner le fait que cet effet irritant “supposé” est lié aux

cyclodextrines vides et que dans leur utilisation habituelle celles-ci sont, pour un temps donné

sous forme compléxée.

Ainsi la per(2,6-O-diméthyle) βCD randomisée ou Rameb, qui sera largement utilisée

dans notre étude semble ne présenter ancune irritation lorsqu’elle est administrée par voie

nasale, cutanée ou oculaire [Loftsonn, 1998b]. Aucun effet tératogène ou embryotoxique n’a

été relevé au cours des différentes études effectuées dans ce but chez le rat.

1.3.6 Interaction avec les membranes biologiques

Figure 13. Représentation shématique d’une bicouche membranaire

Les membranes biologiques telles la peau, la cornée ou les muqueuses forment une

barrière lipophile vis à vis de la pénétration de principes actifs. Les principes actifs

relativement lipophiles sont capables de passer à travers ces membranes par diffusion passive.

La possibilité de passage des CD à travers les membranes biologiques a longtemps été

considérée comme très improbable du fait de leur hydrophilie et de leur haut poids

35

moléculaire. Mais, comme nous l’avons brièvement mentionné dans le chapitre précédent,

cette supposition a ensuite été démentie preuves à l’appui. Arima et coll. [Arima, 1990] ont

mis en évidence la pénétration importante des cyclodextrines au travers de la peau dans les

heures qui suivent leur application et dans l’ordre croissant suivant : βCD < diméthyl-βCD <

hydroxypropyl-βCD. Plus tard, Vollmer et coll. [Vollmer, 1992] ont montré, en travaillant sur

l’hydroxypropyl-βCD radio-marquée qu’elle pénétrait, en forte quantité dans le stratum

cornéum, couche superficielle compacte et hydrophile, ainsi que dans les couches profondes

hydrophiles tels le derme et l’épiderme.

La diffusion passive des molécules lipophiles à travers les membranes biologiques est

régie par la concentration en principe actif dans le milieu aqueux extérieur de la membrane

(larmes, salives) ou dans le vecteur aqueux qui contient le principe actif (hydrogels, crèmes

hydrophiles). Ainsi une plus grande perméabilité pourrait être obtenue avec des principes

actifs qui soient à la fois lipophiles et très solubles dans le milieu aqueux extérieur. Cette

réflexion a amené les chercheurs à utiliser les cyclodextrines comme un moyen d’améliorer la

pénétration de certains principes actifs et donc de conférer aux cyclodextrines le rôle de

promoteur d’absorption. Par exemple la solubilisation de la testostérone par la formation d’un

complexe avec l’hydroxypropyl-βCD provoque une augmentation significative de son

passage au travers de la peau de souris nue. Cette même expérience a montré qu’un excès d’

hydroxypropyl-βCD provoquait à l’opposé une réduction de la distribution dermique et

transdermique [Loftsson, 1998a]. Des résultats intéressants ont été obtenus avec les anti-

inflammatoires. Des travaux réalisés chez le rat ont montré que le pouvoir anti-inflammatoire

de ce produit était augmenté par inclusion dans une cyclodextrine dans l’ordre croissant

suivant : βCD < diméthyl-βCD < hydroxypropyl-βCD. Bien que ces cyclodextrines soient

capables de pénétrer dans la peau, la plus grande activité des produits n’est pas due à une

altération de celle-ci car un simple prétraitement local par une solution de cyclodextrine n’a

aucun effet sur l’absorption du principe actif. De plus les auteurs ont noté que la pénétration

de la CD dans la peau augmente la résistance de celle-ci au principe actif. Cet effet négatif est

donc plus que compensé par l’inclusion dans la CD qui augmente la quantité de principe actif

soluble disponible en surface. D’autres auteurs ont mis en évidence l’augmentation du

pouvoir anti-inflammatoire de l’indométacine lorsqu’elle est présente dans le gel aqueux sous

forme de complexe avec la βCD ou l’hydroxypropyl-βCD [Duchêne, 1996].

36

Mais comment les CD augmentent-elles la perméabilité d’un principe actif à travers les

membranes biologiques ?

Il est généralement reconnu que les CD se comportent comme de véritables vecteurs en

gardant le principe actif en solution et en le distribuant dans les membranes biologiques. Les

membranes lipophiles ayant peu d’affinité pour les cyclodextrines, la majeure partie de celles-

ci reste dans le milieu aqueux extérieur. Les promoteurs d’absorption classiques, comme les

alcools ou les acides gras, agissent en bouleversant les couches lipidiques de la membrane.

Mais ce n’est pas le cas pour les cyclodextrines, malgré leur faculté à inclure dans leur cavité

le cholestérol et les lipides, car on sait que le prétraitement de la peau par une solution de

cylodextrines n’améliore pas le passage cutané d’un principe actif, de plus les cylodextrines

présentes à la surface le sont sous forme déjà complexée et leur aptitude à capter les

constituants membranaires dépend alors, en solution, des différentes constantes d’affinité

mises en causes.

Les cyclodextrines exercent leur rôle de promoteur d’absorption en augmentant la

solubilité du principe actif et donc la quantité disponible à la surface de la barrière biologique.

En effet, la dissolution du principe actif est indispensable pour son absorption. Pourtant il a

été rapporté qu’un excès de cyclodextrines provoquait une moindre absorption au travers de la

peau ou de la cornée. Le mécanisme d’action des CD semble donc complexe.

Loftsson et coll. [Loftsson, 1999] ont étudié ce mécanisme en utilisant une membrane

de cellophane semi-perméable ou de la peau de souris comme membrane modèle dans des

cellules de Franz. Le flux de principes actifs est déterminé par dosages (HPLC) répétés du

liquide récepteur. La théorie veut que lorqu’un principe actif diffuse d’une phase aqueuse

donneuse (ici gel ou solution) à travers une membrane lipophile vers une phase réceptrice, il

rencontre 2 types de résistance. D’abord une résistance à sa diffusion dans la phase aqueuse

donneuse (Raq) puis une résistance à sa diffusion à travers la membrane elle-même (Rm). Le

premier terme dépend du coefficient de diffusion aqueux de la molécule en question et de

l’épaisseur de la couche de diffusion aqueuse, et le second terme dépend du coefficient de

partition de la molécule entre la phase aqueuse et la membrane, du coefficient de diffusion

membranaire et de l’épaisseur de la membrane.

En général, la diffusion à travers la peau est lente et requiert plusieurs heures avant que le

principe actif ne puisse être détecté dans la phase réceptrice. On estime donc que la

contribution de la résistance de la phase aqueuse donneuse est très faible. Ainsi, avec ce

modèle, le flux de principe actif (R-1 × [p.a]) de la solution saturée n’est pas affecté par la

concentration en CD dans la phase aqueuse donneuse. Mais les études citées précédemment

37

ont montré que le flux de principe actif à travers la peau augmente presque

proportionnellement avec la concentration en CD, et des observations comparables ont été

faites quand les effets des CD sur la perméabilité de principes actifs à travers la cornée ou les

muqueuses nasales ont été étudiés. Considérant cela, les auteurs ont établi qu’il devait exister

une couche de diffusion aqueuse en surface de la peau où le coefficient de diffusion et/ou la

constante de complexation sont différents de ceux de la phase aqueuse donneuse. De

nouvelles équations régissant le flux de passage du principe actif à travers les différentes

phases ont donc été décrites et comparées aux résultats obtenus dans les expériences sur

cellules de Franz.

Il en découle que l’amélioration du transport percutané d’un principe actif par des CD

peut s’expliquer par le modèle classique de double diffusion membranaire, aqueuse puis

lipophile, et que les données expérimentales peuvent être ajustées pour obtenir les constantes

qui décrivent ce système. La vitesse de diffusion dans la couche aqueuse doit être

considérablement plus faible que dans la phase aqueuse donneuse. La cyclodextrine

fonctionne donc comme un vecteur, amenant le principe actif de la phase aqueuse donneuse

vers la barrière aqueuse à partir de laquelle il passe dans la couche lipophile de la peau en

fonction de son coefficient de partition.

La participation des follicules pileux et des glandes sébacées n’est pas oubliée mais ceux-

ci ne couvrant que 0.1% de la surface de la peau, il est probable qu’ils ne jouent pas un rôle

significatif dans la diffusion trandermique. Notons tout de même que certaines études ont mis

en évidence que cette voie était la principale pour des molécules comme l’hydrocortisone

[Masson, 1999].

Les CD modifient le transport de principe actif au travers de la cornée et des muqueuses

de la même façon que dans les expériences au travers de la peau. Par contre la participation

annexe des follicules pileux et glandes sébacées n’existe pas. Ces membranes sont recouvertes

par un mucus relativement visqueux et qui représente une barrière potentielle pour la diffusion

de principe actif et peut donc être aussi une barrière aqueuse à la diffusion de principes actifs

à partir de solutions de CD.

Une autre approche, beaucoup plus mécanistique a été développée par certaines équipes,

en particulier Debouzy et coll. [Fauvelle, 1997]. Ils étudient essentiellement par 31P RMN les

interactions entre cyclodextrines naturelle et parfois modifiées et des bicouches obtenues à

38

partir de phospholipides modèles. Les résultats semblent démontrer une grande complexité

dans les mécanismes.

Toutefois, de nombreuses zones d’ombres existent dans la compréhension du mécanisme

de pénétration membranaire des cyclodextrines, en particulier en l’absence de méthodes de

dosages très fines. Dans la suite de ce travail, nous expliquerons comment les dosages

immunologiques nous ont permis de doser, avec une haute sensibilité, des cyclodextrines dans

la peau.

39

2. TRAVAUX ANTERIEURS

40

2. TRAVAUX ANTERIEURS

2.1 MOYENS UTILISES POUR AMELIORER LA STABILITE ET LA SOLUBILITE

DE LA VITAMINE A DANS LES FORMES PHARMACEUTIQUES

Outre l'utilisation d'emballages protégeant les préparations de la lumière [Tagliaferri,

1989] la première et la plus évidente des solutions proposées pour améliorer la stabilité du

rétinol fut d'incorporer des antioxydants. On sait par exemple que l'ajout d'α-tocophérol,

d'acide ascorbique, de butyl-hydroxyanisole (BHA) ou de butyl-hydroxytoluène (BHT) permet

d'améliorer la stabilité d'une solution de rétinol ou d'esters de rétinol [Froix, 1996 ;

Shkunkova, 1973].Toutefois l'ajout d'antioxydants seul n'est d'aucune utilité pour améliorer la

solubilité du rétinol et la stabilité obtenue est très relative.

2.1.1 Emulsions et antioxydants

2.1.1.1 Emulsions eau-dans-huile (E/H)

Plusieurs préparations cosmétologiques comprenant une émulsion E/H à base de rétinol

ont été décrites et même commercialisées. Dans ce cas le but n'est pas d'incorporer le rétinol

en phase aqueuse mais d'obtenir une crème applicable sur la peau et pour laquelle le rétinol

conserve son activité au fil des mois.

Ainsi le brevet US 4826828 [Wilmott, 1989] décrit une émulsion E/H contenant le

rétinol, une huile siliconée (la cyclométhicone), ainsi qu'un solvant du rétinol et de la

silicone : l'éthanol. Or le rétinol se dégrade rapidement lorsqu'il est introduit dans l'émulsion.

Celle-ci devra donc se faire extemporanément : il faut préparer une solution contenant le

rétinol (mélange cyclométhicone, éthanol dénaturé, BHT, BHA, émulsifiant) et la mélanger au

moment de l'emploi à une émulsion E/H contenant aussi, dans sa phase aqueuse, des

antioxydants et des agents chélateurs des métaux lourds. La stabilité d'une telle composition,

comme l'indique Avon, le détenteur du brevet, sur ses produits Bioadvance et Bioadvance

2000, n'excède pas un mois, ce qui est très insuffisant au regard d'une utilisation prolongée et

nécessite un réapprovisionnement rapide, donc couteux.

41

Clum et coll [Clum, 1991] proposent une stabilisation du rétinol dans une émulsion E/H

(rétinol en phase huileuse) par adjonction d'un complexe stabilisant, comprenant associés, un

antioxydant liposoluble et un agent chélatant d'ions métalliques.

Si, toutefois, la stabilité du rétinol semble améliorée dans de telles compositions (60% du

rétinol étant encore présent après trois mois de conservation à 40°C), il n'en demeure pas

moins que cette stabilité relative n'est due qu'à la présence dans la composition, d'une quantité

importante d'antioxydants et d'agents chélatants stabilisants. En effet, il apparait évident que le

rétinol se trouvant obligatoirement dans la phase externe de l'émulsion E/H il n'est en aucun

cas protégé de la dégradation par l'air ambiant.

2.1.1.2 Emulsions huile-dans-eau (H/E)

Par contre la formulation d'émulsions type huile-dans-eau (H/E), contenant le rétinol en

phase huileuse interne additioné d'antioxydants semble une solution plus efficace pour lutter

contre la dégradation et surtout incorporer le rétinol en phase aqueuse.

Cette solution s'est d'ailleurs montrée très efficace pour l'acide rétinoïque pour lequel de

nombreux produits commercialisés (crème Retin A , Roc S.A) sont constitués d'émulsion

H/E contenant l'acide rétinoïque et un antioxydant liposoluble dans la phase huileuse, voir

même parfois avec un chélatant type EDTA [Clum, 1991 ; Felty Lanny, 1975]. Cependant les

premiers essais de stabilité menés sur de telles émulsions H/E additionées d'antioxydants

liposolubles se sont montrés décevant pour le rétinol et certains de ses esters (acétate et

palmitate). On observe en effet que ces émulsions perdent rapidement leur activité en

s'oxydant ou s'isomérisant pour donner des formes chimiques inactives [Clum, 1991].

Il semblerait que les émulsions H/E facilitent la diffusion de l'oxygène vers le rétinol,

contrebalançant ainsi l'action des antioxydants [Froix, 1996].

Plus tard des émulsions H/E un peu plus stables ont pu être préparées obtenant des

stabilités supérieures à 90% sur plusieurs mois (2 mois à 50°C et 6 mois à température

ambiante) [Liu, 1996 ; Couval, 1994]. Mais ces résultats sont obtenus au prix de l'utilisation

de quantités importantes de produits stabilisateurs (plusieurs antioxydants et/ou plusieurs

chélatants dans chaque phase). Nous verrons dans les paragraphes suivants que de nombreuses

recherches ont été menées afin de diminuer au maximum, voire d'éliminer, la présence de tels

stabilisants dans les compositions cosmétiques et pharmaceutiques contenant du rétinol, tout

en conservant à celui-ci une bonne stabilité dans la composition , acceptable au regard de ses

effets et en relation avec une utilisation prolongée de la composition.

42

2.1.2 Microparticules

Les microparticules sont des structures supramoléculaires solides ultradispersées

généralement à base de polymères et ayant une taille supérieure à un micron. Elles existent

sous deux formes (Fig 14 et 15 ) :

• Microsphères : systèmes pleins constitués par une trame polymère.

• Microcapsules : systèmes dotés d'une cavité centrale huileuse, entourée d'une couche

polymérique.

Figure 14. Microsphère Figure 15. Microcapsule

2.1.2.1 Microsphères

Des microsphères de collagène ont été utilisées, à la surface desquelles était adsorbé du

rétinol. La stabilité du rétinol à long terme a été étudiée sur deux hydrogels à base

d'hydroxyéthylcellulose (témoin contre microsphères) qui ont montré que l'adsorption du

rétinol en surface réduit les phénomènes de cristallisation mais n'empêche pas l'oxydation de

la molécule [Roessler, 1994].

L'adsorption simple en surface n'apporte donc qu'une faible amélioration mais d'autres

techniques ont été étudiées.

Froix et coll. [Froix, 1996] ont utilisé des particules (ou suspensions de particules)

constituées d'une matrice polymère poreuse, le rétinol étant situé à l'intérieur de ce réseau

continu de pores. Ces particules microscopiques sont solides, insolubles dans l'eau et inertes

par rapport au rétinol, aux antioxydants, aux chélatants, tensioactifs et autres ingrédients

classiquement utilisés en galénique. Le rétinol y est déposé par contact physique

43

conventionnel après formation des particules et, de ce fait, il réside seulement dans les pores

et non dans la matrice elle-même. Ces particules sont dispersées dans la phase aqueuse d'une

émulsion qui contient aussi des antioxydants lipophiles et hydrophiles.

Bigger et coll. [Bigger, 1996] ont utilisé un système similaire pour mettre des esters

d'alpha-hydroxy-acides du rétinol en suspension dans des crèmes, lotions et autres milieux

aqueux.

On peut ainsi mettre en suspension le rétinol en milieu aqueux, propriété que la

cosmétique a su exploiter puisque l'on trouve actuellement dans le commerce ce type de

préparations à base de microsphères de rétinol ( gamme Retinol Actif Pur ROC ).

2.1.2.2 Microcapsules

C'est encore la cosmétique qui s'est intéressée au développement de microcapsules de

rétinol [Noda, 1992]. Celles-ci, constituées d'un fin film polymérique qui casse facilement lors

de l'étalement, sont idéales pour une application cutanée. Les microcapsules sont préparées

par une méthode complexe de coacervation impliquant une séparation de phase dans un

mélange gélatine-acacia, en phase aqueuse. Le glutaraldéhyde est utilisé comme agent de

réticulation pour rendre le polymère de gélatine insoluble en milieu aqueux. La stabilité du

rétinol ainsi préparé s'est révélée supérieure à celle du rétinol émulsifié. De plus les auteurs

ont constaté que la stabilité augmentait avec l'épaisseur du film polymérique et avec l'ajout de

polylysine. Ces deux constatations ont permis de montrer, grâce à des mesures de coefficient

de perméabilité à l'oxygène, que la matrice gélatine / polylysine diminue la perméabilité à

l'oxygène, améliorant ainsi la stabilité.

D'autres travaux ont montré que l'encapsulation par une enveloppe de nature variée

(gélatine, pectine, éthyl-cellulose, gommes ou amidon) aide à protéger le rétinol de l'action

des rayons ultra-violet, et de ce fait permet de diminuer la quantité d'antioxydants (tocophérol)

utilisée. Toutefois, même si cette forme de vitamine A est plus stable (3 mois), il a été montré

que l'oxydation au cours du temps a toujours lieu [Sarama, 1995].

Dans un tout autre domaine, l'encapsulation de la vitamine A a été réalisée dans le but de

diminuer sa dégradation au niveau de l'estomac, lors de l'administration par voie orale

(nourriture pour ruminants supplémentée en vitamine A). Les essais in vitro ont montré que la

meilleure protection contre la dégradation microbienne, enzymatique et hydrolytique est

obtenue avec une double enveloppe de gélatine et d'acide palmitique. Il faut noter que

44

l'addition d'antioxydants s'est révélée nécessaire et que les études de stabilité menées ne

concernaient que le passage du premier estomac des ruminants [Markus, 1989].

⇒ Ces essais montrent que les microsphères et les microcapsules amènent dans certains

cas une stabilité relative par un effet de protection physique et permettent surtout de suspendre

le rétinol en milieu aqueux. Toutefois les méthodes de préparation sont complexes et passent

par des phases critiques.

2.1.3 Divers

Certaines équipes ont réalisé l'association du rétinol avec des peptides amphiphiles

naturels d'origine végétale ou animale tels les oléosines ou les β-lactoglobulines. Le but

premier était de favoriser la vectorisation du rétinol à travers les couches de l'épiderme mais il

a été montré que cela permettait aussi d'incorporer le rétinol dans un support non dissociant

(non huileux et non tensio actif) c'est à dire un milieu aqueux. L'addition d'antioxydants n'a

pas été évitée [Redziniak, 1996].

D'autres travaux ont montré que par la sélection bien déterminée de certains solvants,

comme véhicule du rétinol, on pouvait obtenir des compositions anhydres destinées à une

application topique présentant une certaine stabilité dans le temps, et ceci, sans avoir recours à

des antioxydants. Ces solvants organiques, liquides à température ambiante, sont choisis

parmi plusieurs groupes parfaitement définis d'alcool gras, de diesters d'alcool isopropylique

et d'acides dicarboxyliques, et de triglycérides d'acides gras [Segot, 1995]. Les essais de

conservation réalisés ont permis de montrer, par une méthode HPLC, que par rapport à

d'autres solvants couramment utilisés comme véhicule de substance active, ceux sélectionnés

conduisaient à une amélioration de la stabilité. On retrouve ainsi, lors du dosage, 100% du

produit de départ mais seulement sur une période limitée à 2 mois.

Le détenteur du brevet, la firme L'Oréal, a ensuite cherché à améliorer son procédé par

l'addition, à ce type de solvant, d'un gélifiant particulier (comprenant au moins un alkyléther

de polysaccharide formé de motifs comportant au moins 2 cycles osidiques différents). Il s'agit

d'une gomme non-ionique, par exemple la guar éthylée. Cette composition est dite stable pour

le rétinol, l'acétate et le palmitate de rétinol mais aucun chiffre n'est avancé [Gagnebien,

1997].

45

2.2 INCLUSION DU RETINOL DANS LES CYCLODEXTRINES

2.2.1 Méthodes de caractérisation des complexes d'inclusion

Il est important de souligner qu'une analyse complète et efficace d'un complexe

d'inclusion potentiel doit fournir des réponses concernant la réalité de l'inclusion, sa

stoechiométrie, sa constante d'association et devrait aussi proposer une structure

tridimensionelle de la supramolécule. Or, parmi les techniques d'analyse couramment

utilisées, peu peuvent répondre à ces questions. Ceci est dû le plus souvent à des limitations

techniques ou théoriques mais dans un certain nombre de situations les incohérences relevées

dans la littérature peuvent venir d'une mauvaise interprétation des données expérimentales

[Perly, 1991].

2.2.1.1 Diffractions des rayons X

Parmi les nombreuses techniques utilisées pour mettre en évidence les complexes

d'inclusion, la cristallographie est clairement la plus puissante [Perly, 1991]. Cependant, elle

est rarement utilisée car elle nécessite d'avoir des monocristaux du complexe moléculaire en

question ce qui n'est pas toujours le cas. De plus la géométrie des complexes d'inclusion et les

interactions mises en jeu peuvent être différentes à l'état solide et en solution. On peut noter

aussi que la cristallographie fait souvent appel à l'utilisation de cosolvants qui peuvent

modifier la nature du complexe. Or de nombreuses applications des cyclodextrines suppose la

mise en solution des complexes. Il est donc préférable d'avoir des techniques pouvant fournir

des informations valables en solution.

⇒ Nous avons décrit plusieurs solutions, plus ou moins efficaces, proposées pour

améliorer les propriétés physico-chimiques du rétinol et de ses esters. Dans le même ordre

d'idée, les cyclodextrines ont été aussi beaucoup utilisées et le chapitre suivant leur sera

entièrement consacré. Après avoir décrit les différentes méthodes utilisées dans la

caractérisation physico-chimique des complexes d'inclusion cyclodextrines / molécule invitée,

nous nous intéresserons aux travaux déjà décrits concernant le rétinol et ses esters.

46

Cette technique permet cependant la comparaison des structures obtenues en solution et à

l'état solide et apporte de nombreuses informations sur l'influence de la maille cristalline et du

solvant sur la structure tridimensionelle du complexe d'inclusion.

2.2.1.2 Diagrammes de solubilité de phase

Cette approche, telle que développée par Higuchi et Connors [Higuchi, 1965], est très

couramment utilisée pour l'évaluation de l'utilisation potentielle des cyclodextrines afin

d'augmenter la solubilité de composés hydrophobes en milieu aqueux. Elle permet en effet

d'obtenir le profil de la courbe de solubilité de la molécule invitée en fonction de la

concentration en cyclodextrines et donc de prouver l'augmentation de la solubilité en présence

de cyclodextrines. Le principe de cette méthode consiste à ajouter le composé invité en

quantité excédentaire à des solutions de cyclodextrines de concentrations croissantes, puis à

doser la quantité de composé invité dissous. Un diagramme de solubilité de l'invité en

fonction des concentrations de cyclodextrines peut ainsi être établi. Deux types de

diagrammes sont généralement observés : types A et B.

Dans le diagramme de type A, la solubilité de l'invité augmente avec la concentration en

cyclodextrines. Il y a formation d'un ou plusieurs complexes solubles. Dans le diagramme de

type B, la solubilité du composé d'inclusion est inférieure à celle de la CD pure : la solubilité

de l'invité augmente dans la première partie de la courbe à cause de la formation du composé

d'inclusion, mais quand la limite de solubilité est atteinte, la formation accrue de composé

d'inclusion provoque sa précipitation, représentée par un plateau. Lorsque l'excès de principe

actif est consommé, on observe une décroissance qui serait liée à l'inclusion du principe actif

dissout et à sa précipitation concomitante. La mesure de la constante d'équilibre par la

méthode de solubilité de phase nécessite la connaissance de la stoechiométrie réelle du

composé d'inclusion : lorsque le diagramme est de type B, le composé peut être isolé et sa

stoechiométrie vérifiée; lorsque le diagramme est de type A, il est préférable de déterminer la

stoechiométrie par une autre méthode. En effet si plusieurs complexes coexistent ou si le

complexe n'est pas de stoechiométrie 1:1, la méthode de solubilité de phase fait appel à des

hypothèses ou à des approximations qui ne permettent pas d'obtenir des constantes d'équilibre

apparentes exactes.

Il faut savoir que cette technique ne donne en aucun cas une preuve directe de la réalité

de l'inclusion. En effet un procédé d'interaction autre que l'inclusion peut provoquer

l'augmentation de solubilité observée. Les stoechiométries et les constantes d'affinités

obtenues à partir du diagramme de phase peuvent amener des erreurs non négligeables car le

47

processus théorique de solubilisation est très simplifié dans cette approche. De plus, lors de la

détermination de la constante d'association, cette technique ne tient pas compte des éventuels

phénomènes pouvant entrer en compétition avec l'inclusion (dimérisation, "solution solide").

2.2.1.3 Techniques d'analyse de l'état solide

Deux approches sont communément utilisées pour mettre en évidence le phénomène

d'inclusion dans les cyclodextrines : l'analyse calorimétrique différentielle (Differential

Scanning Calorimetry) et la diffraction sur poudre [Frömming, 1994].

Elles reposent toutes deux sur l'observation des différences entre le mélange physique

simple des deux composés et le complexe d'inclusion potentiel. Ces deux méthodes sont

faciles à mettre en oeuvre, nécessitent de faibles quantités de composés et sont donc assez

populaires. La diffraction des rayons X permet de déterminer les propriétés structurales des

composés d'inclusion et de les comparer à celles des produits isolés. La DSC quant à elle

permet de comparer les propriétés thermiques des produits isolés et des complexes présumés.

L'observation de nouveaux pics ou la disparition d'un accident thermique de la molécule

invité donne des indices sur la présence d'un éventuel complexe, sans apporter de preuve de sa

réalité [Perly, 1991]. En effet ces méthodes ont pour but de montrer l'existence d'interactions

existant au sein de la maille cristalline et tout phénomène provoquant le passage à l'état

amorphe conduira à la modification du spectre de poudre et du thermogramme.

Par exemple le fait de lyophiliser une solution contenant deux molécules n'interagissant

pas entre elles donnera un composé amorphe. Ce composé qui est en fait une "solution-solide"

ne présentera plus les caractéristiques individuelles de chaque composé mais cela ne signifie

pas qu'il y ait des interactions spécifiques et encore moins une inclusion.

2.2.1.4 Techniques spectrophotométriques

Presque toutes les méthodes optiques existantes ont été utilisées pour caractériser les

phénomènes d'inclusion. Certaines comme la spectroscopie IR ne constituent pas une méthode

de choix pour la détection des complexes d'inclusion [Saenger, 1980]. La spectrophotométrie

d'absorption ou de fluorescence (lorsque la molécule le permet) et le dichroïsme circulaire

sont les plus fréquemment utilisés [Song, 1992]. L'avantage majeur est leur très haute

sensibilité intrinsèque. Cependant, les résultats obtenus peuvent conduire à des interprétations

48

erronées car seule la molécule invitée est observée. De plus ces techniques ne permettent pas

de distinguer clairement l'inclusion d'une autre interaction.

Le dichroïsme circulaire utilise la capacité qu'ont les molécules non symétriques

d'absorber différement des photons polarisés et nécessite des conditions particulières :

- existence d'un centre de symétrie ou centre chiral

- présence d'un chromophore (ce que n'ont pas les CD)

- absence de racémique

C'est une méthode intéressante dans l'étude des phénomènes d'inclusion car en pénétrant

dans la CD, la molécule invitée prend une conformation figée si elle vibrait lentement ou une

conformation différente de celle qu'elle présentait à l'état libre [Jourdain, 1990].

Par rapport au dichroïsme circulaire, la spectrophotométrie d'absorption ou de

fluorescence présente l'avantage d'être quantitative puisque le signal observé peut être

interprété en terme de pourcentage de complexe. De plus ces techniques sont très appréciées

pour déterminer la stoechiométrie en utilisant la méthode de Job [Job, 1928] et celle de Benesi

et Hildebrand [Hildebrand, 1949].

2.2.1.5 Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)

La RMN utilise le principe de l'aimantation de certains noyaux atomiques présentant une

distribution anisotropique de charges, le spin. Placés dans un champ magnétique (B0), ils

interagissent avec lui.

Trois grands types d'interactions sont considérés entre les spins et les champs

magnétiques qui conduisent aux trois principaux paramètres de RMN (Fig. 16 ) :

- le couplage scalaire a lieu à travers les liaisons covalentes et est caractérisé par la

constante de couplage,

- le couplage dipolaire s'exprime à travers l'espace et donne des informations sur les

proximités spatiales,

- le déplacement chimique s'exprime en ppm et est caractéristique de

l'environnement de chaque noyau.

En effet soumis à BO, les noyaux ne perçoivent pas tous le même champ magnétique. Le

champ magnétique extérieur induit une circulation d'électrons autour du noyau considéré et en

retour, cette circulation de charges produit un champ magnétique très faible. Il en résulte que

le champ au voisinage de chaque noyau est différent. La RMN du proton permet d'identifier

une molécule d'après le déplacement chimique de ses protons. Toute modification de

49

l'environnement du noyau, comme par exemple l'approche d'une autre molécule provoquera

des modifications de son déplacement chimique. Ceci est particulièrement intéressant pour les

cyclodextrines pour lesquelles il est possible de repérer les variations de déplacements

chimiques des protons situés à l'intérieur de la cavité (H3, H5). Lorsqu'il y a inclusion, ceux-ci

sont les plus affectés alors que les protons situés à l'extérieur sont peu affectés [Gunther, 1993

; Duchêne, 1985].

Figure 16 . Shéma de principe des interactions magnétiques en RMN

Comparé aux techniques présentées ci-dessus, la RMN est la seule qui offre la possibilité

d'observer les deux espèces en présence simultanément en solution. C'est un facteur

décisif dans l'évaluation précise des procédés impliqués dans l'inclusion et des éventuels

phénomènes en compétition avec celle-ci. Leur absence de prise en compte dans les calculs

théoriques peut conduire à des résultats erronés tant sur le plan de la stoechiométrie que des

constantes d'association. La RMN est intrinsèquement quantitative, puisque l'aire des pics est

directement proportionnelle aux nombres de noyaux, mais elle est relativement peu sensible

comparée aux techniques spectrophotométriques. Avec l'amélioration des techniques de

détections, l'augmentation de la puissance des champs magnétiques (pour la RMN haute

résolution jusqu'à 18 T) et l'arrivée de la RMN bidimensionnelle, cet écart de sensibilité s'est

réduit mais reste significatif : la RMN travaille habituellement à des concentrations de l'ordre

de 10-3-10-4 M alors que la spectroscopie UV atteint sans problème 10-6 M et la

spectrophotométrie de fluorescence 10-10 M.

La RMN, en plus d'amener une preuve de la réalité de l'inclusion, permet de déterminer

les proximités spatiales entre les protons de l'hôte et ceux de la molécule invitée, et donne

donc des informations concernant la structure tridimensionnelle du complexe [Perly, 1991].

50

La RMN permet de déterminer la stoechiométrie et la cinétique de l'inclusion dans tous

les cas de figure :

- complexe précipité

- complexe soluble avec cinétique d'échange rapide ou lent en utilisant la méthode de Job

et celle de Benesi et Hildebrand, bien que ces 2 méthodes, utilisables avec d'autres techniques

de caractérisation dont les techniques spectrophotométriques, ne bénéficient pas avec la RMN

de la même sensibilité.

La RMN permet de montrer les changements de conformation de la cyclodextrine dûs à

la formation du complexe, même en solution, ce que la cristallographie ne permet pas

[Djedaïni-Pilard, 1990 ; Inoue, 1989]. Réciproquement on peut mettre en évidence les

modifications chimiques ou conformationnelles de la molécule incluse [Wouessidjewe, 1989 ;

Djedaïni-Pilard, 1990]

La RMN apparaît donc comme la technique permettant la description la plus complète du

phénomène d'inclusion, lorsqu'il a lieu. C'est ce qui a motivé notre choix en tant que

principale technique de caractérisation dans notre étude.

2.2.2 Essais d'inclusion du rétinol et/ou de ses esters dans les cyclodextrines naturelles

ou modifiées

2.2.2.1 Essais de complexation avec l'αCD

Munoz-Botella et coll. [Munoz-Botella, 1996] rapportent, au cours d'une étude

impliquant plusieurs types de CD, un essai de complexation du rétinol avec l'αCD ; aucun

résultat positif n'a été obtenu.

2.2.2.2 Essais de complexation avec la γCD

La précédente étude n'a pas non plus montré de résultat positif avec la γCD.

Par contre, plus récemment, un brevet concernant des complexes de γCD et de rétinol a

été déposé [Moldenhauer, 1998]. Les auteurs y décrivent la préparation d'un éventuel

complexe par mélange à chaud (55°C) du rétinol et d'une solution aqueuse de CD (β ou γ)

sous atmosphère protégée. Puis agitation 72h, filtration et séchage. D'après les revendications

posées dans ce texte, il semble que seule la γCD se soit montrée efficace.

51

2.2.2.3 Essais de complexation avec la βCD

Le rétinol, l'acétate et le palmitate de rétinol sont les premiers exemples rapportés de

stabilisation de vitamines par les cyclodextrines [Schlenk, 1958].

Frömming et coll. [Fromming, 1988] ont étudié la complexation de l'acétate de rétinol

avec la βCD. La préparation se fait en mélangeant la vitamine A dans l'éthanol à une solution

aqueuse de βCD, le tout sous atmosphère azotée et à l'abri de la lumière. Cette méthode, par

co-précipitation, fut retenue par les auteurs car c'est la seule qui se soit montrée reproductible.

Les auteurs obtiennent un précipité qu'ils caractérisent par plusieurs méthodes : spectroscopie

UV et IR, 1H-RMN, diffraction des rayons X, DSC, chromatographie liquide et couche mince

(CCM). Après lavages par l'éthanol et l'eau, pour éliminer les espèces libres, et après séchage

la spectroscopie UV (dans l'éthanol à 326 nm) donne une concentration en acétate de rétinol

qui correspondrait à une stochiométrie 5:2 (βCD: rétinol). Ce chiffre est confirmé par

l'intégration des pics du spectre RMN (dans le d6-DMSO).

La disparition des pics spécifiques de chaque espèce sur le diffractogramme montre

l'existence d'une nouvelle structure cristalline dans le précipité. En DSC, la disparition du pic

endothermique de l'acétate de rétinol dans le complexe lavé seul (et non dans le mélange

physique témoin, ni dans le complexe non lavé) semble indiquer la possibilité d'un

phénomène d'inclusion puisque la molécule est toujours présente lors du dosage (Fig. 17). De

même en CCM, les taches caractéristiques de l'acétate de rétinol disparaissent seulement dans

le cas du complexe lavé. Ce phénomène pourrait être dû à la dégradation de la vitamine A.

Mais la présence d'acétate de rétinol sous forme inchangée dans le complexe fraîchement

préparé est démontrée par spectroscopie IR et par CCM après extraction par le chloroforme.

52

Figure 17 . Thermogramme DSC de (a) acétate de vitamine A (b) βCD (c) mélange physique (d) complexe

d'inclusion non lavé (e) complexe d'inclusion lavé.

Les auteurs ont utilisé la spectrophotométrie UV pour déterminer la quantité de vitamine

A dégradée sur une période de plusieurs semaines. Ils affirment que la décomposition de la

vitamine A est plus rapide dans le complexe qu'à l'état pur cristallisé (Fig. 18).

Figure 18. Stabilité de l'acétate de vitamine A : ∗ acétate de vitamine A recristallisé, composé

d'inclusion βCD/acétate de vitamine A non lavé, composé d'inclusion lavé. E326/E250 représente la

proportion de produit intact.

Sans le démontrer, les auteurs ont pu montrer qu'il existait de fortes présomptions

concernant la formation du complexe d'inclusion.

Un autre ester de la vitamine A, le palmitate, a été étudié avec la βCD [Palmieri, 1992].

L'étude du complexe potentiel est réalisée par 2 méthodes : diagramme de solubilité de phase

et spectroscopie de fluorescence. Le diagramme de solubilité (Fig. 19) montre clairement que

la solubilité du palmitate augmente avec la concentration en βCD jusqu'à atteindre un plateau

(saturation de la cyclodextrine). Le spectre de fluorescence amène à la même conclusion en

53

montrant une augmentation de l'intensité du pic du palmitate avec la concentration en βCD.

En utilisant ces méthodes les auteurs décrivent une stochiométrie 2:1 (βCD:palmitate) à forte

concentration en βCD et 1:1 à faible concentration. On peut interpréter ce résultat en posant

l'hypothèse suivante: formation d'un complexe 1:1 et après complexation de toute la vitamine

A, addition d'une deuxième βCD sur chaque complexe.

βCD + Hôte → complexe 1:1

complexe 1:1 + βCD → complexe 2:1

Figure 19. Diagramme de solubilité de phase du complexe palmitate de vitamine A/βCD

Une étude a été menée par Wadstein et coll., [Wadstein, 1993] sur l'utilisation des βCD

pour améliorer la pénétration cutanée de plusieurs esters de rétinol. Dans leur brevet les

auteurs décrivent un complexe de stochiométrie 2:1 (βCD:ester) et déclarent améliorer

significativement la pénétration cutanée de ces esters en les rendant artificiellement

hydrosolubles.

2.2.2.4 Essais de complexation avec les CD chimiquement modifiées

Guo et coll. [Guo, 1995] ont travaillé sur la complexation du rétinol avec la per-(2,6-O-

diméthyl)-βcyclodectrine (Dimeb-CD). Cette dernière est synthétisée au sein de leur

laboratoire. Le complexe potentiel est obtenu en introduisant le rétinol et la CD dans un

mélange méthanol/eau (1/10). Les auteurs indiquent que d'après la littérature la présence de

méthanol n'influence pas la constante d'association et ils posent comme hypothèse l'existence

d'une stoechiométrie 1:1 pour calculer cette constante. Les constantes d'association calculées

pour le rétinol, le rétinal et l'acide rétinoïque sont très proches. Une structure est alors

54

proposée pour ce complexe : la partie terminale de la chaîne aliphatique n'est pas impliquée

dans le phénomène d'inclusion et celui-ci concerne plutôt la partie cyclique de la molécule.

Les calculs de la constante d'association reposant sur de simples hypothèses, ces conclusions

sont sujettes à caution. La caractérisation du complexe potentiel obtenu se fait par

spectroscopie UV dans l'eau et celle-ci montre que le déplacement de la bande d'absorption

caractéristique du rétinol correspond à celle observée dans la littérature dans le n-octanol et

dans des micelles. L'intensité de la bande d'absorption augmente avec la concentration en CD

indiquant une augmentation de la solubilité en milieu aqueux du rétinol en leur présence.

Okada et coll. [Okada, 1990] ont utilisé la 6-O-α-D-glucopyranosyl -β-cyclodextrine (G-

βCD) pour former un complexe avec le rétinol. Celle-ci, de par l'ajout d'une unité

glucopyranose, possède une solubilité en milieu aqueux supérieure à celle de la molécule

native et un pouvoir hémolytique plus faible. Ici les auteurs montrent bien par la construction

du diagramme d'Higuchi que la solubilité du rétinol augmente avec la concentration en G-

βCD ce qui est caractéristique d'un complexe de stoechiométrie supérieure à 1:1. Les auteurs

ont comparé, en utilisant les diagrammes de solubilité de phases, le pouvoir solubilisant de la

G-βCD avec celui de la Dimeb-CD et de la βCD. Les graphiques obtenus montrent que le

pouvoir solubilisant de la βCD est le plus faible et qu'avec la Dimeb-CD, un phénomène de

précipitation du composé formé à lieu lorsque la température augmente. Par contre avec la G-

βCD le composé formé reste soluble même à haute température. La stabilité en solution

aqueuse étudiée par HPLC indique que le rétinol se dégrade très rapidement (-50% en 4 jours)

sous l'action de la lumière et légèrement moins vite dans le noir.

Norwig et coll. [Norwig, 1988] ont utilisé la RMN du proton pour étudier la formation

d'un complexe entre la Dimeb-CD et l'acétate de rétinol. Les auteurs indiquent que le système

acétate de rétinol/Dimeb-CD présente des modifications des déplacements chimiques des

protons portés par les trois groupements méthylés du cycle de la vitamine A, ce qui indiquerait

que la partie cyclique de la vitamine A est incluse dans la CD. Mais ce spectre a été réalisé

dans un mélange D2O/d6-DMSO alors que celui de l'acétate de rétinol seul a été réalisé dans le

d6-DMSO. Ceci rend difficile l'interprétation des résultats car le fait de changer de solvant

implique toujours des variations de déplacement chimique des signaux de RMN.

Munoz-Botella et coll. [Munoz-Botella, 1996] ont étudié l'utilisation possible des

cyclodextrines pour augmenter le signal du rétinol dans les méthodes spectroscopiques

utilisant la fluorescence et l'absorption dans l'UV, à température ambiante. L'objectif est

d'augmenter la sensibilité de la méthode en améliorant la solubilité en milieu aqueux.

55

En spectroscopie UV, la bande caractéristique du rétinol dans les solvants organiques se

situe autour de 300-400 nm. Or, avec plusieurs rétinoïdes dont l'acétate de rétinol, en présence

d'HP-βCD et de βCD on obtient, en solution aqueuse, un spectre d'émission et d'exitation de

fluorescence de meilleure résolution que celui obtenu avec l'acétate dans l'éthanol ou l'hexane.

L'intensité de l'émission est même supérieure à celle obtenue seul dans l'éthanol (Fig. 20).

Considérant l'insolubilité dans l'eau de ce composé, ce résultat indique une influence de la CD

sur la solubilisation et donc sur la sensibilité de détection.

Figure 20 . Spectre d'exitation et de fluorescence de l'acétate de rétinol sous différentes conditions : 1

acetate de rétinol-βCD; 2 acetate de rétinol-HP-βCD; 3 acétate de rétinol dans l'éthanol.

Avec le rétinol par contre les auteurs ont rencontré de nombreuses difficultés pour obtenir

de bonnes intensités d'absorption et de fluorescence. L'intensité du spectre de fluorescence est

en effet plus faible que celle du rétinol en solvant organique. Les auteurs expliquent ce

phénomène par l'existence possible de liaisons hydrogènes avec les CD.

La stabilisation à long terme des vitamines complexées a été vérifiée : la diminution de

l'intensité du fluorescence après 20 jours n'a pas dépassé 15%. Il semblerait que les forces

mises en jeu entre CD et molécule invitée limitent les mouvements de cette dernière et donc

réduisent le phénomène d'isomérisation des rétinoïdes. Les auteurs, observant que le

comportement des composés obtenus avec le 13-cis-rétinal et le rétinal est identique,

suggèrent que la partie cyclique de la molécule est incluse dans la cavité de la CD. Même si

la réalité de l'inclusion n'a pas été démontrée, cette expérience démontre l'influence très

positive des CD pour augmenter la sensibilité de techniques de détection en milieu aqueux.

McCormack et coll. [McCormack, 1998] se sont intéressés à la formation de complexes

HP-βCD/rétinol et à leur encapsulation dans des liposomes. L'objectif étant de modifier la

pharmacocinétique, après administration intra-veineuse (IV), de complexes d'inclusion grâce

56

à leur encapsulation dans les liposomes. En effet, de manière générale, après injection IV les

complexes CD/principe actif sont rapidement dissociés par des phenomènes de dilution et de

compétition décrits dans la littérature [Mesens, 1993 ; Pitha, 1993]. Les CD sont totalement

excrétées en 24h avec une partie du principe actif, le reste étant fortement métabolisé.

L'inclusion du complexe dans la phase aqueuse d'un liposome permettrait d'éviter ces

inconvénients puisque le complexe d'inclusion resterait intact et que les liposomes sont

majoritairement captés par le foie et la rate [McCormack,1998]. Les auteurs ont utilisé pour

cette expérience des radiomarqueurs (3H pour le rétinol et 14C pour les CD) et une technique

de détection appropriée.

Le rétinol est solubilisé dans un mélange chloroforme/éthanol et resolubilisé dans une

solution aqueuse de CD après évaporation du solvant organique. Des mesures de

radioactivités ont mis en évidence la présence du rétinol dans le surnageant obtenu après

centrifugation, ce qui indique la formation potentielle d'un complexe d'inclusion. Le

surnageant est utilisé pour la phase d'encapsulation dans les liposomes et les mesures de

radioactivité sanguine, effectuées après injection intra-veineuse à des rats, montrent la

présence de rétinol. Ceci confirme la présence d'une interaction forte entre la CD et le rétinol

amenant l'inclusion de ce dernier dans les liposomes. Quant à l'étude pharmacocinétique

même, elle a montré que l'encapsulation augmente la durée de circulation du complexe dans

l'organisme et ralentit sa dissociation.

⇒ Ces différents exemples montrent que les complexes rétinol (ou esters de rétinol)/

cyclodextrine ont été étudiés à maintes reprises. Aucun résultat positif concernant l'αCD n'a

été décrit, mais concernant la γCD, la βCD et les βCD chimiquement modifiées une

amélioration de la solubilité a été mise en évidence et le phénomène d'inclusion est fortement

soupçonné. Ceci ouvre des perspectives intéressantes. Cependant, aucune preuve catégorique

concernant la stoechiométrie et la structure tridimensionnelle des différents composés obtenus

n'a été apportée.

Au vu des résultats exposés ci-dessus et de l'intérêt du rétinol dans les domaines

pharmaceutiques et cosmétiques, nous souhaiterions préparer des complexes d'inclusion

hydrosolubles et stables à long terme avec les cyclodextrines naturelles ou modifiées.

Il semble en effet que cette approche puisse non seulement apporter une solution au

problème de solubilisation du rétinol dans les milieux aqueux, mais aussi, éventuellement,

ralentir sa dégradation, ce qui serait un progrès majeur.

57

3. TRAVAUX PERSONNELS

58

3. TRAVAUX PERSONNELS

INTRODUCTION

Nous avons choisi de diviser ce travail de thèse en deux grands chapitres.

Le premier chapitre traite des résultats obtenus lors de l’inclusion du propionate de

vitamine A (PVA) dans des cyclodextrines conventionnelles, c’est à dire commerciales. Le

PVA est le dérivé de vitamine A que nous avons utilisé dans toutes les études car il est plus

stable que la vitamine A pure et permet une utilisation plus facile à l’échelle du laboratoire.

Nous avons tout d’abord utilisé les cyclodextrines naturelles αCD, βCD et γCD dont les

résultats concernant la formation de complexes avec le PVA, la solubilisation et/ou la

stabilisation du PVA sont présentés dans l’article n° 1. Ce premier article ne traite pas du

travail de thèse à proprement dit mais de celui effectué lors du DEA précédent la thèse.

Toutefois, ce travail étant essentiel pour aborder la suite et n’ayant pas encore été publié, il

nous a semblé important de l’incorporer dans ce manuscrit.

La solubilisation du PVA par ces 3 CD naturelles n’ayant pas été obtenue, nous nous

sommes alors tourné vers une cyclodextrines modifiée possédant une solubilité accrue : la

Rameb (heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose randomisée). La complexation du

PVA par la Rameb nous a permis d’obtenir un complexe soluble dans l’eau et stable. A partir

de là, nous nous sommes tournés vers une application biologique de ce complexe, ce qui nous

a amené à étudier la pénétration du complexe dans des échantillons de peau humaine, après

application cutanée. Ce travail a fait l’objet d’un brevet et de deux articles présentés ici :

article n° 2 et article n° 3. Dans l’article n° 2 sont décrits uniquement les résultats de dosage

du PVA, alors que l’article n° 3 contient en plus les résultats de dosage de la Rameb.

Une discussion reprenant l’ensemble des résultats de ce chapitre est présentée ensuite.

Le deuxième chapitre est consacré à l’utilisation de cyclodextrines synthétisées au sein de

notre laboratoire et caractérisées par le greffage, sur une et une seule fonction hydroxyle

primaire, d’une molécule de cholestérol. Ces dérivés monofonctionnalisés possèdent

d’étonnantes propriétés d’interactions avec les membranes biologiques, ce qui pourrait être un

59

avantage pour nous puisque nous cherchons un nouveau vecteur capable d’emmener le PVA

dans la peau.

Le premier article de ce chapitre, article n° 4, ne concerne pas directement le PVA mais

est consacré à l’étude des interactions entre un film phospholipidique modèle et de la Dimeb-

Chol qui est le dérivé obtenu en greffant un cholestérol sur la Dimeb (heptakis-(2,6-di-O-

methyl)cyclomaltoheptaose) par l’intermédiaire d’un bras espaceur. Ce dernier permet de

donner une certaine souplesse et est absolument nécessaire pour son insertion dans les

bicouches. Nous montrerons que ce composé, tout en conservant ses propriétés d’inclusion,

peut s’insérer dans un film modèle de phospholipides.

Le second article de ce chapitre, article n° 5, concerne le dérivé βChol, obtenu en

greffant un cholestérol sur la βCD, sans bras espaceur. Après une étape d’acétylation des

hydroxyles libres de la partie cyclodextrine on obtient un composé hautement hydrophobe, la

Chol-βCD acétylée ou Chol-βCD-Ac. Cette molécule possède des propriétés physico-

chimiques permettant d’obtenir, par la technique adéquate, des nanosphères ou des

nanocapsules. Nous montrerons qu’il est possible d’obtenir des nanoparticules chargées en

PVA et, de la même façon que pour le complexe Rameb/PVA, d’étudier la pénétration de ce

composé dans des échantillons de peau humaine.

Nous terminerons par une discussion générale avant de conclure.

Nous conseillons aux lecteurs qui ne seraient pas familiers avec la peau et les études de

perméabilité cutanées de se rapporter d’abord à l’annexe 1. La même réflection s’applique

pour les dosages immunoenzymatiques, que nous avons utilisés pour le dosage de la Rameb

dans les échantillons biologiques et dont le principe est rappelé dans l’annexe 2.

60

CHAPITRE 1

61

3.2Chapitre 1

3.2.2 Article n°1

Complexation of vitamin A propionate by natural cyclodextrins

S. Weisse, B. Perly, J-P. Dalbiez, F. Djedaïni-Pilard

Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry (soumis)

Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry

62

COMPLEXATION OF VITAMIN A PROPIONATE BYNATURAL CYCLODEXTRINS

SANDRINE WEISSE, BRUNO PERLY, JEAN-PIERRE DALBIEZ, and FLORENCEDJEDAÏNI-PILARD

Key words: cyclodextrins β and γ - vitamin A - inclusion complex - chemicalstabilization

corresponding author: Florence Djedaïni-PilardLaboratoire des GlucidesUniversité de Picardie-Jules Verne33, rue Saint Leu80 039 Amiens, CedexFrancetel/fax 00 33 (0)3 22 82 75 62mail: florence.pilard@sc.u-picardie.fr

COMPLEXATION OF VITAMIN A PROPIONATE BY

NATURAL CYCLODEXTRINS

Sandrine Weisse a, Bruno Perly a, Jean-Pierre Dalbiez a and Florence Djedaïni-Pilard b*

a Service de Chimie Moléculaire, CEA Saclay, F-91191 Gif sur Yvette, Franceb Université de Picardie Jules Verne, Laboratoire des Glucides, EA 2082, 33 rue St Leu, F-

80039 Amiens, France

Abstract. Vitamin A propionate (PVA) is a highly unstable and poorly water soluble

molecule which has a real interest in therapeutic. In the presence of βCD or γCD, inclusion

complex are formed. NMR study was performed to demonstrate the reality of inclusion and

determine the stoichiometry of each complex: 1/1 for the γCD/PVA complex and 2/1 for the

63

βCD/PVA complex. A stability study using NMR and HPLC indicated that βCD induces an

accelerated degradation of vitamin A propionate, but on the contrary, γCD can protect it very

efficaciously for many months.

Key words: cyclodextrins β and γ - vitamin A - inclusion complex.- chemical stabilization

INTRODUCTION

In the therapeutic field, the efficiency of a drug depends partially on its physical properties.

Among those, two are essential : first, a good aqueous solubility and second, a long term

chemical stability. When a molecule does not fit those criteria, its use becomes more

complicated and thus its application are limited. Vitamin A (retinol) is an interesting example

of such molecule. Indeed, it is highly unstable in the presence of oxygen, light or heat and

shows a very low solubility in water. At the present time, vitamin A and derivatives have a

real interest in therapeutic [1] : their main indications are irritant dermatitis, superficial burns

and wounds, cornea traumas, as well as some cases of asthenia and emaciation. It is also used

in cancer therapy, for its role in cellular growth and differentiation [2] and in cosmetology to

regulate the cellular metabolism of skin and thus prevent wrinkles formation.

Therefore, despite the fact that there is already many commercial forms available, researchers

are still looking for new pharmaceutical tools to improve its stability and solubility.

For this purpose, many methods have been tried. Most of them deal with the use of anti-

oxidizer in solutions or emulsions of micro-particles [3-8]. Those techniques gave very few

satisfactory results in term of improvement of the stability of vitamin A and derivatives and

no results concerning the water solubility improvement. A more efficient protection could be

obtained by physically protecting the vitamin A from its environment. This could be achieved

by using bio-compatible cyclo-oligosaccharides such as cyclodextrins to form supramolecular

water soluble complexes. Indeed, some examples of attempts of inclusion of vitamin A or its

esters in cyclodextrins have already been reported [9-14] but some discrepancies are found in

the literature. For example, Munoz-Botella and coll. [14] established in their work that the

αCD cannot complex retinol or its derivatives. For γCD, a patent based on the work of

Moldenhauer and coll. [11] describes the preparation of a complex by mixing with retinol or

some of its derivatives at 55°C. The authors claimed a good stabilizing effect on the retinol or

its derivatives. The βCD has the longest history of complexation with retinoids as it was first

tried by Shlenk and coll. (1958) [9] who reported the possible formation of βCD inclusion

compounds with vitamin A alcohol, acetate and palmipate in a patent, by which they hoped to

64

achieve a stabilizing effect. Fromming and coll. [10], using vitamin A acetate and βCD,

obtained a precipitate that they charaterized by UV and IR spectroscopy, 1H- NMR, DSC,

HPLC, CCM and SAXS. They clearly demonstrated that PVA remains intact in the

precipitate, along with the CD after several washings with ethanol and water. It is also

indicated a 5/2 βCD/PVA stoichiometry. Other authors [12,13] indicated a 2/1 stoichiometry.

Two main raisons can be involved to rationalize theses differences: the mode of preparation

and purification of the solid complex and the physical techniques used to derive the

stoichiometry of the inclusion complexes and the chemical integrity of the guest molecule.

We report here on the possible formation of inclusion complexes between vitamin A

propionate and natural cyclodextrins (αCD, βCD and γCD). We had to replace vitamin A

(retinol) by one of its ester since the alcohol is too unstable. The vitamin A propionate (PVA)

(Figure 1) was chosen among several retinol esters after a preliminary study assessing their

efficiency on human fibroblasts growth. For each cyclodextrin we will determine, by NMR,

HPLC and Mass spectrometry, the existence of an inclusion complex, then characterize it in

term of stoichiometry, and study its stability versus several parameters like presence or

absence of light, temperature and oxygen.

EXPERIMENTAL

Material

Vitamin A propionate (2.5 Mio I.E/g) was obtained from BASF (Germany). β-cyclodextrins

and α,γ-cyclodextrins were gifts from Roquette (France) and Wacker (Germany), respectively.

All chemicals were purchased from Fluka and used without further treatments, and deuterated

solvents were from Euriso-Top (Saclay-France).

Preparation of inclusion complexes

The potential for each cyclodextrin to form a complex in water with vitamin A propionate was

assayed during preliminary studies. The CD/drug mixtures were prepared by mixing

accurately weighted quantities in water, the final concentration of CDs and vitamin A

propionate being 10 and 20 mM respectively. The mixtures were stirred during a few hours

then centrifugated for 10 mn at 6000 rpm. The aqueous solutions were filtered on Millex-SG

0.22µm then freeze-dried before redissolution of 10mg in 0.4 mL of D2O for NMR

investigations. The precipitates, if present, were washed three times by centrifugation with

65

water and ether to eliminate the free species (host and guest), then dried slowly under a stream

of nitrogen and freeze-dried before redissolution of 10mg in 0.4mL d6-dmso.

For the long term stability studies, the complexes were prepared on a larger scale :

100 mL of a 10mM βCD and 20mM vitamin A propionate solution in water.

20 mL of a 50mM γCD and 100mM vitamin A propionate solution in water.

Once the resulting complexes were washed and freeze-dried, each one was divided in 4

batches to study the influence of light, temperature and oxygen on the vitamin A propionate

(Table I). We did the same repartition for the drug alone. Each batch was studied periodically

by 1H-NMR and HPLC over a period of 24 months.

STORAGE

CONDITIONS

Vitamin A

propionate

alone

Complex

βCD/PVA

Complex

γCD/PVA

25°C, natural light VA βA γA25°C, dark VB βB γB 4°C, dark VC βC γC 4°C, dark , under

Argon

VD βD γD

Table I. batches considered in the stability study

NMR Techniques1H-NMR experiments were performed at 500.13 MHz using a Bruker DRX500 spectrometer

using the pulse programs available from the Bruker library. All measurements were performed

at 25°C under careful temperature regulation (+/- 0.1K). Chemical shifts are given relative to

external tetramethylsilane (TMS=0 ppm) and calibration was performed using the signal of

the residual protons of the solvent as a secondary reference. All NMR data were processed

and plotted using the UXNMR program and an INDY work station (Silicon graphics). Scalar

correlations (COSY, Relay experiments) were processed in the absolute value mode after

zero-filling resulting in a 1K×1K data matrix. For dipolar correlations (NOESY experiment),

the phase sensitive (TPPI) sequence was used and processing resulted in a 1K × 1K matrix.

The stoichiometry of solid complexes was obtained by digital integration of the signals of the1H-NMR spectrum of the washed precipitates, performed in d6-dmso.

To determine the influence of the concentrations of the CD on the solubility of vitamin A

propionate, we prepared solutions containing a fixed amount of vitamin A propionate (2mM

66

for the βCD/PVA complex and 20mM for the γCD/PVA complex) and increased

concentrations of CDs up to their solubility limits (2, 5, 10 and 17mM for the of βCD and 50,

20, 100 and 200mM for the γCD). (Tables II and III)

The aqueous solutions obtained after 24h mixing were washed two times with 300µL ether to

remove free vitamin A propionate. Since neither the complex nor the CD are soluble in ether,

all the CD remains in the solution, either in free form or in complexed form. The solutions

were freeze-dried and 10mg dissolved in 0.4mL d6-dmso for 1H-NMR study: integration of

the signals allowed to calculate [PVA]t/[CD]t where [PVA]t represents the initial

concentration of vitamin A propionate and [CD]t the initial concentration of CD. Then the

concentration of the complex which is estimate equal to that of [PVA]t as long as there is a

large excess of CD (according to Benesi-Hildebrand hypothesis [15]).

HPLC

Analytical HPLC was carried out with a Waters Delta Prep 3000 chromatograph equipped

with an LSED detector and a Nova-Pack C18 WATERS column, elution with methanol

(Chromasolv filtered on Millicup PTFE 0,5µm ) at 1ml/mn. An UV detector was used

(WATERS Lambda Max at 340 nm) in the case where the interesting peaks were overlapped

by the peak of the CD with LSED, as CDs do not appear with UV detection.

Mass Spectrometry

Electrospray mass spectrometry analysis were performed in positive mode on a Micromass

Quattro II. Samples were dissolved in a mixture of water-acetonitrile 1:1 (v:v) at a

concentration of 0.01 mg.ml-1 and infused into the electrospray ion source. The capillary

voltage was set to 4 Kv.

RESULTS AND DISCUSSION

First of all, the aspect of the aqueous solutions obtained after 24h mixing with αCD, βCD and

γCD respectively, is informative : the first one leads to a cloudy, homogeneous solution with a

yellow oily upper layer whereas the use of βCD and γCD lead to a white suspension with a

precipitate and a yellow oily upper layer. After centrifugation there were more precipitate in

the last two but no precipitate with αCD. This observation alone suggests that an insoluble

67

complex is formed with βCD and γCD. However these preliminary results and the possible

presence of a soluble complex in all supernatants have yet to be proved by the NMR studies.

Determination of the inclusion phenomena by NMR study

The first NMR experiments were dedicated to the complete assignment of the protons of pure

vitamin A propionate in d6-dmso (Figure 1). The following bidimensional experiments were

used to complete the 1H-NMR spectrum: COSY, COSY relay and NOESY.

The 1H-NMR spectra in d6-dmso (Figure 2) of the precipitates obtained previously indicate

that both the CD (βCD or γCD) and the vitamin A propionate are present. Comparison of the1H-NMR spectra of the guest alone (Fig 1) and of the precipitates (Fig 2) shows also that the

chemical integrity of vitamin A propionate is preserved. Since all the free drug has been

eliminated by ether washings, as described in experimental section, it should be assessed that

presence of vitamin A propionate was induced by inclusion process with βCD and γCD. But

to prove it, experimental evidence of the reality of inclusion must be given. This is fully

supported by the observation of the NMR spectra of the complexes in water at high dilution

(Figure 3) : larger differences are observed upon inclusion of vitamin A propionate and most

signals of the CD host are shifted upfield. Shifts are due mainly to the anisotropic effects of

the double bonds and the carbonyl group. It is noteworthy that NMR allows clear distinction

between inclusion and any other possible external interaction processes, with large effects

observed on the proton located in the hydrophobic cavity (H3 and H5), clearly proving

inclusion [16,17]. On the other hand, protons located on the outside experience no or very

small shifts.

Figure 1. 1H-NMR spectrum of vitamin A propionate in d6-dmso at 298 K and 500 MHz

(10mM)

OCOC 2H5

12

3

4

5

67 9 11 13 15

8 10 12 14

1.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5 ppm

H11

H10

H7, H8, H12

H14

H15

HDO

d6-dmsoCH2

acetone

H4

Methyls9 13 1

H3H2

CH3

Methyl 5

1 1 3 1 2 33 3 2 2 922

68

OCOC 2H5

12

3

4

5

67 9 11 13 15

8 10 12 14

1.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5 ppm

H11

H10

H7, H8, H12

H14

H15

HDO

d6-dmsoCH2

acetone

H4

Methyls9 13 1

H3H2

CH3

Methyl 5

1 1 3 1 2 33 3 2 2 922

69

Figure 2. 1H-NMR spectra of (a) the βCD/PVA and (b) the γCD/PVA complexes in d6-dmso

at 298 K and 500 MHz (10mg in 0.4cc)

1.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5 ppm

PVA PVA

0.5 0.5 1.5 14 7 1 7 28 1 1 3X1.5 1 1 4.5

PVAPVA

OH2 OH3OH6 H1 H3 H5

H6 H6' H2 H4

betaCD

1.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5 ppm

gammaCD

1 1 3 16 1 8 2 8 32 2 2 33 3 2 2 9

PVAPVA

(a)

(b)

70

Figure 3. partial 1H-NMR spectra (in D2O at 298K and 500 MHz) of (a) γCD alone (b)

γCD/PVA complex

In the case of αCD, no precipitate is formed when vitamin A propionate is added which lead

to two hypothesis : no inclusion complex is formed or there is a water soluble inclusion

complex. The aqueous solution was freeze-dried and dissolved in D2O. The 1H-NMR

spectrum in D2O does not show any signals of the protons of vitamin A propionate, indicating

that the first assumption is correct, and in accordance with results obtained by Munoz-Botella

[14].

Determination of the stoichiometry

Since both complexes exhibit low solubility in water, a reliable determination cannot be

obtained in aqueous media using the Job’s continuous variation method [18 ] due to the low

signal-to-noise ratio. The spectra of the complexes, purified as described in the experimental

section, were therefore recorded in d6-dmso to derive the molecular ratio, since vitamin A

propionate and cyclodextrins exhibits high solubility in this solvent. It should be pointed out

3.553.603.653.703.753.803.853.903.954.004.05 ppm

3.553.603.653.703.753.803.853.903.954.004.05 ppm

(a)

(b)

H3 H5 H2 H4

71

that under these conditions, solvation of the cyclodextrin by dmso molecules induces

dissociation of the inclusion complexes [19]. The present spectra allow, however, a very

accurate determination of the stoichiometry in the original complex. Digital integration of

relevant lines from the vitamin A propionate (H15, H10 or H11 for example) and from the

cyclodextrin (OH2, H1 or H6) confirms the stoichiometry of the considered complex.

Integration of the signals of the 1H-NMR spectrum in d6-dmso of βCD/PVA and γCD/PVA

complexes (Figure 2) allowed to determine easily and without any doubt the CD/PVA ratio

in the complex. The results are : 1/1 complex for γCD/PVA and 2/1 complex for βCD/PVA.

This 2/1 stoichiometry for the βCD/PVA complex has already been reported for other vitamin

A esters such as palmitate and acetate [12, 13].

These results are in adequacy with the size of the cavities of the CDs : since the βCD is

smaller it is possible that the part of the vitamin A propionate molecule that remains outside

can be included in a second βCD.

Influence of the concentration of CD on the solubility of PVA in water

In water, the formation of the complex follows this equilibrium : PVA + nCD ↔ X , where X

represents the PVA/CD complex (with a 1/n stoichiometry). Therefore the association

constant is equal to : k = [X] ([PVA] [CD]n)-1 where [X], [PVA] and [CD] represent the

concentration of inclusion complex and free species in solution respectively. If the total

concentration of vitamin A propionate [PVA]t remains constant and always very low

compared to that of the CD, [CD]t, then we can estimate that the concentration of the

complexes is equal to the vitamin A propionate concentration as already demonstrate by

Benesi and Hildebrand [15].

[PVA]t = [X] + [PVA] and [CD]t = [X] + n [CD]

if [CD]t >> [PVA]t then [PVA]t ≡ [X]

The method described in the experimental section satisfied this condition ([CD]t >> [PVA]t)

and led to the determination of the concentration of complexes for [γCD]t/[PVA]t ratio of

2.5, 5 and 10 and [βCD]t/[PVA]t ratio of 2.5, 5 and 8.5. Several signals of the vitamin A

propionate were digitally integrated on the 1H-NMR spectrum performed in D2O, the

calibration being made on the signal of anomeric proton (H1) of the CD for which the

concentration [CD]t is known and equal to its initial concentration. The concentration of

complexes in water is deduced to the mean value obtained from the integration of the vitamin

A propionate signals. (Tables II and III)

72

[PVA]t

mM[γCD]t mM [X] mM [PVA]t mM [βCD]t/

[PVA]t

[X] mM

200 1,1 17 0,1320 100 1,3 2 10 0,13

50 0,58 5 0,12

Table II and III: concentrations used to determine the influence of the concentration of CD on

the concentration of the resulting complex (X). The concentration of PVA is constant and

fixed to 2mM for the βCD/PVA complex and to 20mM for the γCD/PVA.

These results indicate that, in both case, once the [CD]t/[PVA]t ratio reaches 5, the

concentration of complexes does not increase anymore. This allowed us to determine the best

conditions to prepare the complexes. It should be noticed that the concentration of the

γCD/PVA complex is ten times higher that of the βCD/ PVA complex and reaches a

maximum of 1mM in the presence of 5 equivalents of γCD. It should be stressed here that the

solubility of PVA alone in water is absolutely null.

Stability studies

NMR and HPLC were found to be very appropriate to show any chemical modifications of the

vitamin A propionate alone and in presence of βCD and γCD. A careful NMR analysis has

been performed in d6-dmso in all cases as described in the experimental section (storage in

natural light or in the dark, both at 25°C and at 4°C) to check the molecular integrity of the

host and the guest molecules, even if desincluding solvent such as dmso was used. The main

interest of NMR in this case is that any new signal on the spectrum indicates chemical

modification of the guest. Morever, since the assignment of the molecule is clear, it is possible

to know which moiety of vitamin A propionate was affected. We performed this analysis after

10 days, 30 days, 60 days, 6 months and 24 months. Also the HPLC survey was added. This

method could complete the NMR study since each new peaks to appear stands for a molecule

with a different polarity, though giving us possible information on the number and the nature

of the degradation products.

We have summarized the main results in table IV.

VA VB VC VD βA βB βC βD γA γB γC γDJ+10 + - - - + + - - - - - -J+30 ++ - - - ++ + + - -/+ - - -

73

J+60 ++ + - - ++ ++ + + -/+ - - -J+180 +++ + + - +++ +++ ++ ++ -/+ -/+ -/+ -J+730 +++ ++ + + +++ +++ +++ +++ + -/+ -/+ -/+

Table IV. Batches degradation: (-) no degradation (-/+) specific chemical modification of the

ester group, (+) light degradation, (++) intense degradation , (+++) complete degradation.

This table shows only the rate of the degradation process for each batches, but we must

underlined here that the degradation profile of vitamin A propionate in the βCD/ PVA

complex is very different from that of vitamin A propionate in the γCD/PVA complex, and

none of them matches the degradation profile of vitamin A propionate alone (for HPLC and

NMR).

For the drug alone, batch VA (25°C and light), the modifications of the 1H-NMR spectrum

indicated that chemical modifications first appeared on the side chain and quickly gained the

complete skeleton of the molecule. After 60 days, only the terminal CH2 was preserved, and

by 6 months the degradation was complete (Figure 4 b). Batches VB, VC, and VD exhibited

no observable modifications at all until 60 days. It seems that natural light is the main factor

of degradation process of vitamin A propionate alone. For the vitamin A propionate in the

βCD/ PVA complex, the first signs of degradation appeared after 30 days on the ring and on

the terminal ester in the form of secondary signals at the basis of the signals of the protons of

vitamin A propionate. As those secondary peaks get bigger, those of vitamin A propionate are

reduced until all the specific signals of the molecule disappeared (6 months) (Figure 4 c). It

happened faster on the batches βA and βB (at 25°C) than on the batches βC and βD (at 4°C),

but the result was the same: there was no vitamin A propionate left after 6 months. For the

vitamin A propionate in the γCD/PVA complex, NMR spectra indicate that the only part of

the molecule affected by chemical modifications was the terminal ester group: secondary

signals could be seen after 30 days on batch γA and after 180 days for γB, γC and γD. The

chemical modification increased slightly (Figure 4 a) with time but no other signs of

degradation appeared, even after 24 months : the major part of the molecule remains

unaffected in the presence of γCD and the guest molecule must keep its biological properties.

The HPLC survey (data not shown) also shows different degradation profiles for PVA alone,

in the βCD/ PVA complex and in the γCD/PVA complex in agreement with NMR studies.

The reference chromatogram of vitamin A propionate shows a single peak with a retention

74

time (Tr) of 3.6 mn but the same chromatogram after 60 days storage under light and air at

25°C (batch VA) shows many new peaks induced by possible degradation products : peak

Tr 0.8 mn, peak Tr 1.45 mn, peak Tr 2,4 mn, peak Tr 6.2 mn, peak Tr 16.8 mn,

peak Tr 19.2, peak Tr 22 mn, peak Tr 24.2 mn, peak Tr 29.6mn. Some peaks (,

, ) exhibiting smaller retention times than the peak of PVA can be attributed to more polar

molecules and conversely, peaks exhibiting longer retention times (, , , , , )

correspond to less polar products. For VB (same recording and injection parameters) those

peaks are less important and they are barely present for VC and VD. By sixth months there is

no more vitamin A propionate in VA but VC and VD are well conserved. For βA, the same

peaks as those present for VA appeared after 60 days, but one of them (peak 5) is much more

higher. βB, βC and βD are absolutely similar to βA and after 6 months vitamin A propionate

disappeared from the chromatograms of the four batches indicating complete degradation of

the molecule, like previously observed with NMR. Finally for γCD/PVA, after 60 days the

four batches (γΑ, γB, γc, γD) are similar : smaller peaks and are present but the less

polar degradation products observed with VA batches are absent. After 6 months, there is no

noticeable changes on the chromatogram. Since the inclusion phenomena with βCD has a

great impact on peak 5, we attempted to determine the nature of this specific derivative. It was

isolated by semi-preparative HPLC and studied by Mass Spectrometry : the product has a high

Molecular Weight, 1121 g/Mol, which means its not a derivative of the molecule but some

kind of aggregate, the nature and structure of which remain unknown.

All those results, NMR and HPLC provide us with valuable information. First of all, when

regarding the vitamin A propionate alone, the comparison between the spectra of VA, VB,

VC, VD shows that protecting vitamin A propionate from light decreases the degradation

rates and almost stopped it. This is quite a surprise since oxygen and temperature are

supposed to play a more active role, but it must be reminded that the product we use is

commercial and contains a conservative agent (antioxidant). However, the major effect of

light on degradation is confirmed by data from the literature which states that the double

bonds rearrangements are induced by light [20, 21]. The effect of temperature is less

important but still relevant as batches at 4°C (dark) show slight amelioration compared to

those at 25°C (dark).

The most interesting point of this study is the effects of the inclusion in cyclodextrins. It must

be emphasized here that the degradation profile of vitamin A propionate in the βCD/ PVA

propionate is different from that of vitamin A propionate alone. Inclusion in the βCD lead to a

75

faster degradation which does not match the natural degradation profile of the molecule. This

phenomenon occurs in all the storage conditions, indicating it is not caused by exterior factors

but by the inclusion in βCD it-self. This was already suspected with another ester of vitamin

A like the acetate [9,10]. On the contrary, it is clear the inclusion in γCD allows to slow down

the degradation process and keep a major part of the guest unaffected for at least 6 month,

even in the presence of light or oxygen. This is in accordance with the stabilizing effect of

γCD observed by Moldenhauer et al. [11] on retinol and its derivatives.

Figure 4. Partial 1H-NMR spectra of (a) γCD/PVA complex (b) vitamin A propionate (c)

βCD/PVA complex, after 6 months storage at 25°C under light ( d6-dmso, 298K , 500 MHz)

76

Figure 5. Estimated structure of (a) the γCD/PVA complex (b) the βCD/PVA complex

(a)

1.01.21.41.61.82.02.22.4 ppm

1.01.21.41.61.82.02.22.4 ppm

1.01.21.41.61.82.02.22.4 ppm

(a)

(b)

(c)

77

(b)

To explain the different behaviour of the vitamin A propionate in the 2 complexes, it should

be reminded that the stoichiometry of the βCD/PVA complex is 2/1 while that of the

γCD/PVA complex is 1/1. If a vitamin A propionate molecule is included in 2 βCD

simultaneously, we can suppose that each one comes to one of the extremity , the secondary

face looking at each other (as the inclusion must start by the secondary and larger face) (Fig

5b). Therefore, the specific and very important degradation process of the vitamin A

propionate in the βCD/PVA complex can be explained by the action of the two secondary

hydroxyl rings. Indeed, chemical modifications of the guest molecule induced by the CD have

already been described in the literature, especially for βCD. Thus, it was clearly demonstrated

in the βCD /spironolactone complex that the secondary hydroxyls of βCD lead to the thiol

78

analog of spiranolactone [22]. A 1/2 complex was indeed obtained with spironolactone and

βCD and it was shown by NMR that this steroid is s-desacetylated quantitatively in the

inclusion process. Evidence has been given showing that this chemical modifications is

directly related to the inclusion. Attempt to explain this phenomenon involve the possible

catalytic effect of the secondary hydroxyls of the cyclodextrins. A very strong hydrogen bond

(OH2-OH3) would explain the high acidity of OH groups of βCD [23].

In the γCD/PVA complex, it is reasonable to think that the bigger part of the molecule is

included in the CD, as the inner cavity is large enough, and so protected from exterior factors.

As the NMR spectra show that only the terminal ester is affected by degradation, we can

suppose that this part of the molecule remains outside the cavity and is not protected or is

attacked by the secondary hydroxyls of the γCD (Figure 5a).

CONCLUSION

We were able to demonstrate that vitamin A propionate can be included in both βCD and

γCD, resulting in solid complexes with 2/1 and 1/1 stoichiometriy respectively .

Then, the HPLC and NMR studies showed that inclusion in βCD not only accelerate the

degradation process of vitamin A propionate but also modify it since the derivatives obtained

are different from those that appeared in the case of vitamin A propionate alone. On the other

hand , inclusion in γCD allows to slow down the degradation process really significantly and

to keep the major part of the molecule unmodified for several months, even in the worse

storage conditions.

ACKNOWLEDGMENT

We gratefully acknowledge LVMH-GIE, Branche Parfums et Cosmetiques (C. DIOR, St Jean

de Braye, France) for the financial support and especially J. C. Archambault, P. André and

Professor P. Rollin (ICOA, Orléans, France) for helpful discussions.

REFERENCES

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79

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[5.] M. Froix, S. Nacht, M. Pukshansky (Advanced Polymers Systems, Inc.): European

Patent EP 0781551A1 (1996).

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[23.] R. Breslow, S. D. Dong : Chem. Rev. 98, 1997 (1998).

80

Chapitre 1

3.2.3 Brevet FR0201241

Utilisation cosmétique ou dermatologique de la vitamine A ou de ses esters, en

association avec une β-cyclodextrine diméthylée

J-C. Archambault, F. Djedaïni-Pilard, F. Ouvrard-Baraton, S. Weisse

81

1H19103 Cas 82 FR0

FG/187

BREVET D'INVENTION

__________________

Utilisation cosmétique ou dermatologique de la vitamine A ou de ses esters, enassociation avec une β-cyclodextrine diméthylée.

__________________

Déposants : LVMH RECHERCHE

COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE

__________________

Inventeurs :

Jean-Christophe ARCHAMBAULT

Florence DJEDAINI-PILARDFrançoise OUVRARD-BARATON

Sandrine WEISSE

La présente invention concerne l'utilisation dans le domaine de la cosmétiqueet de la dermatologie d'associations de β-cyclodextrines partiellement méthylées etde vitamine A ou d'esters de vitamine A.

82

Depuis de nombreuses années, la vitamine A et ses esters, notammentl’acétate et le palmitate, sont très largement utilisés en cosmétique et endermatologie pour améliorer l’état général de la peau. Les actions de la vitamine Asont bien connues dans ces domaines d’application. Elle régule notamment lemétabolisme cellulaire de la peau et, de ce fait, préserve ou restaure un bon étatphysiologique cutané. La vitamine A permet ainsi d’améliorer le tonus, la fermeté etl’élasticité de la peau qui tendent à diminuer avec l’âge ou par des effets de stress.En particulier, la vitamine A ou ses esters sont couramment utilisés pour retarderl’apparition des rides ou pour en atténuer leur profondeur. La vitamine A estégalement utilisée avantageusement pour le soin des peaux dites grasses. Endermatologie, la vitamine A agit efficacement pour favoriser la cicatrisation de lapeau, ainsi que dans le traitement des peaux à tendance acnéique.

Cependant l’utilisation de tels composés est limitée en pratique par desproblèmes de stabilité, de solubilité en milieu aqueux mais aussi de pénétration dansla peau. En effet, l’utilisation de la vitamine A ou de ses esters n’a d’intérêt encosmétique et en dermatologie que si ces actifs sont biodisponibles au niveau duderme et/ou de l’épiderme.

Les problèmes techniques rencontrés pour réaliser leur solubilisation, leurstabilisation et leur pénétration dans la peau ont donc fait l’objet de nombreuxdéveloppements. Des méthodes ont été décrites pour solubiliser en milieux aqueuxet stabiliser la vitamine A ou ses esters. Mais les résultats obtenus ne sont passatisfaisants en terme de pénétration dans les couches plus profondes de l’épidermeréduisant d’autant la biodisponibilité des actifs incorporés dans les compositionscosmétiques et dermatologiques antérieures.

Les cyclodextrines α, β et γ, ci-après désignées par α-CD, β-CD et γ-CD,sont décrites depuis longtemps en tant que vecteur d’actifs de toutes sortes,capables de piéger certaines petites molécules de nature hydrophobe. En particulier,les cyclodextrines sont décrites pour capter et protéger les vitamines lipophiles, lesarômes.

Il est connu de l’art antérieur, dans le document WO 9421225, descompositions cosmétiques utilisant comme agent de pénétration une ß-cyclodextrineafin de former des complexes d’inclusion d’esters de vitamine A, en particulier depalmitate.

Cependant, l’utilisation de laβ-cyclodextrine pour réaliser cette inclusionprésente un inconvénient majeur. En effet, il s’avère que la vitamine A incluse dansla β-cyclodextrine n’est pas protégée et se dégrade même plus rapidement que lavitamine A non incluse. Ce phénomène a été prouvé par Karl-Heinz Frömming et al.(Acta Pharm. Technol. (1988) 34 (3) 152-155) au moyen de différentes techniques :

83

spectrophotométrie UV, spectroscopie RMN, etc… Ainsi l’utilisation de la β-cyclodextrine ne semble pas pouvoir résoudre tous les problèmes techniquesévoqués ci-dessus pour une utilisation cosmétique ou dermatologique de la vitamineA ou de ses esters.

Pour améliorer la stabilité de la vitamine A ou de ses esters, il a étéproposé d’utiliser la γ-cyclodextrine comme molécule hôte (US 5985296). Toutefois lecomplexe d’inclusion de la vitamine A dans la γ-cyclodextrine présente une solubilitéen milieu aqueux très médiocre, ce qui en limite sérieusement son intérêt pour uneapplication cosmétique ou dermatologique.

Il est également connu du document EP 0649653 A1 l’utilisation de β-CDpartiellement méthylées comme promoteur d’absorption dans des compositionspharmaceutiques pour l’administration transcutanée de principes actifs.

Ce document n’incite manifestement pas l’homme du métier à utiliser uneβ-cyclodextrine partiellement méthylée comme vecteur de pénétration de principesactifs dans la peau sans passage transcutané, en vue d’applications cosmétiques.

Par ailleurs, la demande de brevet FR 2484252 décrit un procédé depréparation de solutions aqueuses de composés organiques biologiquement actifsinsolubles ou peu solubles dans l’eau, tels que la vitamine A (ou rétinol) et sesesters, par inclusion dans des β-cyclodextrines partiellement méthylées, en particulierdiméthylées. Il y est précisé que ces solutions aqueuses sont stables. A titred’exemple, un procédé est décrit pour inclure l’acétate de vitamine A dans l’heptakis-(2,6-di-O-méthyl)-β-cyclodextrine. Toutefois le complexe d’inclusion ainsi formé estensuite incorporé dans une préparation pharmaceutique administrable par voie orale.Ce document incite l’homme du métier à administrer les vitamines liposolublescomme la vitamine A par voie orale sous forme de solutions aqueuses, le détournantainsi d’une utilisation topique.

D’autres auteurs ont préparé des complexes d’inclusion de différentsrétinoïdes et de leurs esters dans des cyclodextrines en particulier dans la 2,6-di-O-méthyl-β-cyclodextrine ou « DM-β-CD », pour réaliser des études de solubilité dansl’eau et de stabilité (S. Muňoz Botella, et al., Analyst (1996) 121, 1557-1560). Descomplexes d’inclusion avec le rétinol et le rétinyl acétate dans la DM-β-CD ont étépréparés et étudiés. Les observations par la technique de fluorescence ont montréque ces complexes présentaient une excellente stabilité sur le long terme

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Enfin, le document US 5484816 décrit la préparation d’une compositionpour le traitement de la peau, dans laquelle la stabilité de la vitamine A estgrandement améliorée. Cet effet positif sur la stabilité est obtenu notamment parl’inclusion de la vitamine A ou de son ester dans différentes cyclodextrines, modifiéesou non, en particulier dans une méthyle β-cyclodextrine.

Les inventeurs de la présente invention ont maintenant découvert demanière tout à fait surprenante que l'utilisation de β-cyclodextrines diméthylées et,en particulier de produits commerciaux tels que les DIMEB ou les RAMEB définis ci-après, en association avec de la vitamine A ou un de ses esters classiquement utilisésen cosmétique et en dermatologie, permettait de préparer des compositionscosmétiques ou dermatologiques dans lesquelles la vitamine A ou son ester setrouvait sous une forme particulièrement stable et soluble, caractérisées après leurapplication par une remarquable rétention de la vitamine A ou de ses esters dans lapeau, tout en évitant leur passage transdermique.

Ainsi donc, la présente invention fournit des compositions cosmétiques oudermatologiques à base de vitamine A ou d'un de ses esters cosmétiquement oudermatologiquement acceptables qui permettent une excellente rétention de cet actifdans la peau. La constatation particulièrement surprenante de ce qu'aucun passagetransdermique de vitamine A ou de son ester n'avait lieu présente un avantageconsidérable puisqu'il permet de focaliser toute l'activité biologique de la compositionsur la libération de l'agent actif au niveau de la peau qui est la zone visée selon laprésente invention.

Avant d'aborder la description proprement dite détaillée de l'invention, ilsemble bon de donner un certain nombre de définitions de termes employés tout aulong de la présente description.

Les cyclodextrines (CD) sont des composés cycliques encore désignés parcycloamyloses ou cycloglucanes constitués d'un enchaînement de motifs glucose (6motifs glucose pour l'α-cyclodextrine, 7 pour la β-cyclodextrine et 8 pour la γ-cyclodextrine).

Par "β-cyclodextrine diméthylée", au sens de l'invention, on entend lesdérivés méthylés de la β-cyclodextrine possédant un groupe méthoxy sur, enmoyenne, deux des trois positions 2, 3 et 6 de chacun des 7 motifs glucose.Statistiquement, les « β-cyclodextrines diméthylées » selon l’invention présentent undegré de substitution des protons des groupes hydroxy des motifs glucose par desradicaux méthyle compris entre 10 et 16, et de préférence compris entre 11 et 15.

Dans cette famille de β-cyclodextrines diméthylées, on distinguera enparticulier le dérivé diméthylé dont tous les motifs glucose possèdent un groupe

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méthoxy sur chacune des positions 2 et 6, désigné sous le nom d’heptakis-(2,6-di-O-méthyl)-β-cyclodextrine ou encore DIMEB, qui présente donc un degré desubstitution défini ci-dessus égal à 14, et parmi les produits commerciaux existantdans la famille des β-cyclodextrines diméthylées, le RAMEB qui est un mélange deplusieurs β-cyclodextrines dont chaque unité glucose est statistiquementdiméthylée.Le degré de substitution moyen du RAMEB par les radicaux méthyle estd'environ 12,6, ainsi que cela est notamment indiqué dans le document WO0145615.

Selon l'une de ses caractéristiques essentielles, la présente inventionconcerne l'utilisation d’au moins une β-cyclodextrine diméthylée dans laquelle chaquemolécule de β-cyclodextrine est substituée par 10 à 16 groupements méthyles, entant qu’un agent favorisant la pénétration dans l’épiderme et la rétention dans lapeau de la vitamine A ou de ses esters cosmétiquement ou dermatologiquementacceptables, pour la préparation d’une composition cosmétique ou dermatologiquerenfermant de la vitamine A ou au moins un de ses esters cosmétiquement oudermatologiquement acceptables.

En effet, la présente invention résulte, comme exposé précédemment dufait que ses inventeurs ont mis en évidence, notamment comme cela ressort desexemples qui suivent, que le recours à une β-cyclodextrine diméthylée telle quedéfinie précédemment permettait d'améliorer grandement l’absorption de la vitamineA ou de ses esters par la peau tout en évitant un passage transdermique etd'augmenter ainsi sa biodisponibilité.

Les β-cyclodextrines diméthylées utilisables selon l'invention encombinaison avec de la vitamine A ou un de ses esters peuvent être toutes les β-cyclodextrines diméthylées telles que définies ci-dessus.

Toutefois, on recourra de préférence à des β-cyclodextrines présentant undegré de substitution compris entre 11 et 15, c'est-à-dire à des β-cyclodextrinessubstituées par 11 à 15 radicaux méthyle.

Selon une caractéristique particulièrement avantageuse, on recourra àl'heptakis-(2,6-di-O-méthyl)-β-cyclodextrine ou DIMEB.

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Selon une autre variante avantageuse de l'invention, on utilisera, à titre deβ-cyclodextrines diméthylées, des β-cyclodextrines statistiquement diméthylées surchaque glucose, couramment commercialisées sous le nom de RAMEBtelles quedéfinies ci-dessus. L'invention pourra être mise en oeuvre avec de la vitamine Asous sa forme alcool (rétinol). Toutefois, on choisira de préférence d'utiliser sesesters. Tous les esters de la vitamine A classiquement utilisés en cosmétique et endermatologie pourront être utilisés selon la présente invention. On choisira depréférence l'acétate, le palmitate ou le propionate de vitamine A.

Comme cela est déjà connu dans la littérature, la vitamine A et ses estersforment aisément des complexes d'inclusion avec les β-cyclodextrines, en particulieravec les β-cyclodextrines alkylées telles que la DIMEB et la RAMEB.

Ainsi, pour préparer les complexes d'inclusion pour la mise en œuvre del'invention, on peut utiliser l'un des procédés décrits, en particulier celui décrit dansle document FR 2484252. Selon ce procédé, on dissout d'une façon générale la β-cyclodextrine diméthylée dans de l'eau puis on ajoute à la solution obtenue lavitamine A ou son ester, soit directement, soit sous forme d'une solution organiquemiscible à l'eau, et on évapore ensuite le solvant, de façon à récupérer le complexed'inclusion sous forme solide.

Selon une autre variante, on peut également récupérer le complexed'inclusion en solution avant toute évaporation, ou bien le complexe d'inclusion sousforme solide obtenu à l'étape précédente peut être solubilisé à nouveau en milieuaqueux pour son utilisation ultérieure dans le cadre de la présente invention.

Il est également possible d'utiliser les procédés de préparation décrits par S.Muňoz Botella, et al. (Analyst (1996) 121, 1557-1560). Par exemple, selon le principedu premier de ces procédés on introduit dans un ballon rotatif le rétinol dissout dansl'hexane, puis on évapore de solvant de façon à former une fine pellicule de rétinolsur les parois du ballon. On introduit alors dans le ballon une solution aqueuse de β-cyclodextrine diméthylée, puis on agite cette solution pendant 24 à 48 heures pardes moyens magnétiques.

De tels procédés de préparation s'avèrent particulièrement intéressantspuisqu'ils permettent d'obtenir des solutions aqueuses, le cas échéant sous forme degels, de la vitamine A et de ses esters.

Selon un aspect de l'invention, les complexes d'inclusion définis ci-dessuspeuvent être utilisés aussi bien sous forme de solutions aqueuses, de gels aqueux ouencore sous forme de poudre sèche pour être incorporés dans des compositionscosmétiques ou dermatologiques.

Il est également apparu que la composition cosmétique ou dermatologiquepréparée selon l'invention peut être préparée sous différentes formes, en particuliersous forme de gel aqueux, de lotion, d'émulsion et de poudre. Il s'agira en particulier

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de produits cosmétiques de soin ou de maquillage traitant, destinés en particulier àlutter contre l'apparition des effets du vieillissement actinique ou chronologique, telsque les rides, la perte de l'élasticité et de la tonicité de la peau, ou encore destinésau soin des peaux grasses. Il s'agira également de préparations dermatologiques,notamment destinés à favoriser la cicatrisation cutanée ou au traitement des peaux àtendance acnéique.

Selon une autre de ses caractéristiques essentielles, la présente inventionconcerne un procédé de soin cosmétique destiné à améliorer la pénétration dansl’épiderme et la rétention dans la peau de la vitamine A ou de ses esterscosmétiquement acceptables, caractérisé en ce qu’il comprend l’application sur lapeau d’une composition cosmétique contenant une association de β-cyclodextrinesdiméthylées et de vitamine A ou d’au moins un de ses esters cosmétiquementacceptables, les composants de ladite association étant tels que définisprécédemment.

EXEMPLES

Exemple 1 : Préparation d'un gel aqueux contenant un complexed'inclusion du propionate de vitamine A dans la RAMEB (ou diméthyl β-cyclodextrine commerciale):

L'ester de vitamine A utilisé est le propionate de vitamine A, ci-aprèsdésigné par PVA

A 10 ml d'une solution 50 mM de RAMEB, on ajoute 200 µl d’une solutionacétonique 1M de PVA, pour obtenir une concentration finale 20 mM en PVA.

On laisse sous hotte ventilée et sous agitation pendant 24 heures.

On centrifuge ensuite pendant 6 minutes à 6000 tours/minutes lessolutions obtenues. La solution obtenue après cette opération est limpide, de couleurjaune pâle et ne contient pas de précipité.

La phase aqueuse est filtrée sur Millex-SG 0,22 µm, congelée etlyophilisée.

On obtient ainsi une poudre. Celle-ci peut être utilisée sous cette formedans la préparation d'une composition cosmétique ou dermatologique, ou bien, selonles besoins, être facilement remise en solution en milieu aqueux.

Le milieu aqueux précité peut être un gel aqueux, comme par exemple ungel d'hydroxyéthylcellulose (Natrosol®, Hercules Inc. Etats-Unis) à 1,8% dans l'eau.

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Selon le présent exemple, on ajoute à 10 g (75%) de gel aqueuxd'hydroxyéthylcellulose défini ci-dessus, 3,3 g (25%) de solution aqueuse ducomplexe d'inclusion préparé ci-dessus sous forme de poudre, soit une quantité de24 mg de PVA (soit environ 0,72% de PVA final).

Exemple 2 : Pénétration du PVA dans l’épiderme

Le but de cette étude est de comparer la pénétration et la répartition duPVA dans de l'épiderme humain frais, selon qu'il se présente sous forme d'uncomplexe d'inclusion avec une diméthyl β-cyclodextrine ou avec une γ-cyclodextrine,ainsi qu'incorposé dans un gel en l'absence de toute cyclodextrine.

1. Préparation des gels

On prépare les gels suivants.

a) Gel de base

Ce gel est constitué d'hydroxyéthylcellulose (Natrosol®, Hercules Inc.Etats-Unis) à 1,8% en poids dans l'eau..

b) Gel selon l'invention à base de RAMEB et de PVA (gel RAMEB)

Le gel RAMEB est le gel préparé à l'exemple 1 ci-dessus.

c) Gel comparatif à base de PVA et de γ-cyclodextrine (gel gamma)Le gel gamma est constitué à partir de 10 g (75 %) de gel base auxquels on

ajoute 3 ml (25 %) d’une suspension aqueuse à 32 mg/ml de complexe d’inclusion γ-CD/PVA préparé suivant le même procédé que celui exposé à l'exemple 1 ci-dessussoit 24 mg de PVA théorique (soit environ 0,72 % de PVA final).

d) Gel témoin

Le gel témoin est constitué de 25 g de gel base (75 %) auxquels onajoute d'abord un mélange de 60 mg de PVA (soit environ 0,72 % de PVA final) et de0,83 g de Tween 60 (polyéthylène (20) sorbitan monostéarate : Uniqema) (soit2,5 % de Tween 60 final) et ensuite 7,5 g d’eau.

L’étude de pénétration dans l'épiderme s’effectue à l’aide de cellules deFrantz modifiées d’une surface de 2 cm2 et d’un volume de 4,2 ml. Le liquiderécepteur est constitué de tampon phosphate du commerce (Sigma) (10 nM, NaCl120 mM, KCI 2,7 mM, pH 7,4), d’azoture de sodium 0,1 % du commerce (Sigma)d’éthanol à 20 % et de solubilisant LRI (polyoxyéthylène polyoxypropylène butyléther, huile de ricin hydrogénée polyéthylénée, eau purifiée : Wackherr colorants) à4 %.

Au cours d’une même expérience, les 3 gels (RAMEB, gamma et témoin)sont appliqués respectivement sur 5 fragments de peau (cellules de Frantz modifiée)de façon occlusive.

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Après 24 heures de contact, l’excédent de gel à la surface cutanée est lavéà l’aide de coton-tiges. Les coton-tiges ainsi que la partie supérieure de la cellulesont immergés dans 10 ml d’isopropanol et soumis aux ultrasons pendant 15 minpuis agités durant 2 heures. Les solutions sont diluées au 1/10 et filtrées sur 0,2 µmavant dosage. Le stratum corneum est recueilli par 7 strippings (D’Squam, Evidermcorporation, Dallas) successifs (pression 300 g.cm-2, durée 12 s). Le PVA est extraitpar solubilisation dans 2 ml de méthanol pendant 1 nuit à 4°C puis agitation 2 heureset enfin filtration sur filtre de 0,2µm avant dosage. Le PVA est extrait de l’épidermepar solubilisation de ce dernier dans 1 ml de méthanol pendant 1 nuit à 4°C puisagitation 2 heures et enfin filtration 0,2 µm avant dosage. Les dosages du PVA sonteffectués par HPLC. Les chromatogrammes sont réalisés sur un chromatographeBECKMAN système Gold avec une colonne Lichrosher 125-4 RP18 (5µM) de chezMERCK. On utilise un détecteur à barrettes d’iode BECKMAN. La phase mobile utiliséeest acétonitrile/eau 90/10 avec un débit de 1ml.min-1.

Les résultats de dosage en PVA dans les différents compartiments de lapeau, obtenus avec les trois gels décrits dans l’exemple 3, sont regroupés sur lafigure 3.

On constate que le pourcentage de PVA ayant pénétré la peau estbeaucoup plus élevé pour le gel de RAMEB/PVA et, ce, quelque soit le compartimentconsidéré. Le gel obtenu à partir du complexe γ-CD/PVA est moins efficace que le geltémoin. Pour le gel de RAMEB/PVA, on constate également que le pourcentage dePVA dans l’épiderme est du même ordre de grandeur que celui dans le stratumcorneum, ce qui traduit une grande efficacité en terme de pénétration. Par contre,pour les deux autres gels le pourcentage de PVA dans l’épiderme est beaucoup plusfaible.

Exemple 3 : Influence du témoin

Une étude, identique à celle décrite dans l’exemple 5, est effectuée avecle gel RAMEB/PVA, tel que décrit dans l’exemple 4, et le PVA seul en milieu huileux.Le milieu huileux est une huile de carnation (Witco-Rewo) contenant 0,75 % de PVA.Les résultats de dosage en PVA dans les différents compartiments de la peaumontrent que l’on dose dix fois plus de PVA dans le liquide récepteur lorsque celui-ciest sous forme de complexe d’inclusion RAMEB/PVA. On peut donc en conclure quele gel de RAMEB/PVA permet une excellente pénétration du PVA dans l’épidermecomparativement au PVA seul, quelque soit la formulation de ce dernier.

Exemple 4 : Pénétration du PVA dans la peau humaine : passage transdermique

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Cette étude, réalisée sur peau humaine fraîche, est destinée à comparer lapénétration et la répartition du PVA au travers du revêtement cutané humain(stratum corneum, épiderme et derme) et en fonction du gel.

Les gels utilisés sont le gel témoin et le gel de RAMEB/PVA tels décritsdans l’exemple 4.

L’étude s’effectue à l’aide de cellules de Frantz modifiées d’une surface de2 cm2 et d’un volume de 4,2 ml.

Le liquide récepteur est constitué de tampon phosphate 10mM, NaCl 120mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4 (Sigma), d’azoture de sodium 0,1 % (Sigma), d’éthanol à20 % et de LRI (polyoxyéthylène polyoxypropylène butyl éther, huile de ricinhydrogénée polyéthylénée, eau purifiée : Wackherr colorants) à 4%.

Au cours d’une même expérience, les 2 gels sont appliquésrespectivement sur 8 fragments de peau (cellules de Frantz modifiée) de façonocclusive.

Après 24 heures de contact, l’excédent de gel à la surface cutanée est lavéà l’aide de coton-tiges.

Les coton-tiges ainsi que la partie supérieure de la cellule sont immergésdans 10 ml d’isopropanol et soumis aux ultrasons pendant 15 minutes puis agitésdurant 2 heures.

Les solutions sont diluées au 1/10 et filtrées sur filtre de 0,2 µm avantdosage.

Le stratum corneum est recueilli par 7 strippings successifs (pression300 g.cm-2, durée 12 s). Le PVA est extrait par solubilisation dans 2 ml de méthanolpendant 1 nuit à 4°C puis agitation 2 heures et enfin filtration sur filtre de 0,2 µmavant dosage.

Une fois le stratum corneum retiré, on sépare l’épiderme du derme àl’aide d’un scalpel.

Le PVA est extrait de l’épiderme par solubilisation de ce dernier dans 1 mlde méthanol pendant 1 nuit à 4°C puis agitation 2 heures et enfin filtration sur filtrede 0,2 µm avant dosage.

Les dosages du PVA sont effectués par HPLC. Les chromatogrammes sontréalisés sur un chromatographe BECKMAN système Gold avec une colonne Lichrosher125-4 RP18 (5 µM) de chez Merck. On utilise un détecteur à barrettes d’iodeBECKMAN. La phase mobile utilisée est acétonitrile/eau 90/10 avec un débit de1ml.min-1.

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Les dosages en PVA dans les différents compartiments de la peau ont étéeffectués. Aucune trace de PVA n’a été détectée dans le liquide récepteurcontrairement aux résultats obtenus dans l’exemple 5.

On peut donc conclure que la présence du derme inhibe le passage duPVA dans le liquide récepteur.

Le gel RAMEB/PVA ne favorise pas le passage transdermique du PVA.

REVENDICATIONS

1. Utilisation de dérivés méthylés de la β-cyclodextrine dits β-cyclodextrines diméthylées, possédant un groupe méthoxy sur, en moyenne, deuxdes trois positions 2, 3 et 6 de chacun des 7 motifs glucose et présentantstatistiquement un degré de substitution des protons des groupes hydroxy des motifsglucose par des radicaux méthyle compris entre 10 et 16, et de préférence comprisentre 11 et 15, en tant qu’agent favorisant la pénétration et la rétention de lavitamine A ou de ses esters cosmétiquement ou dermatologiquement acceptablesdans la peau.

2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites β-cyclodextrines diméthylées sont essentiellement constituées d’heptakis-(2,6-di-O-méthyl)-β-cyclodextrine, encore connue sous le nom de DIMEB.

3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites β-cyclodextrines diméthylées comprennent essentiellement des β-cyclodextrinesstatistiquement diméthylées sur chaque motif glucose, communément dénomméesRAMEB, ayant un degré de substitution de l’ordre de 12,6.

4. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce quela vitamine A ou au moins l'un de ses esters et la β-cyclodextrine diméthylée sontintroduits dans la composition cosmétique ou dermatologique sous la forme decomplexes d’inclusion de ladite vitamine A ou de son ester avec lesdites β-cyclodextrines diméthylées, telles que décrites dans l'une des revendications 1 à 3.

5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce quela composition contient à titre d’agent actif de la vitamine A et/ou au moins un esterde vitamine A, ledit agent actif étant au moins partiellement inclus dans une β-cyclodextrine diméthylée telle que définie dans l'une des revendications 1 à 3.

6. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce quela composition est sous la forme d’un gel, d’une lotion, d’une émulsion ou d’unepoudre.

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7. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce quela composition est une composition cosmétique contenant de … à … % en poids devitamine A ou d’ester de vitamine A par rapport au poids total de ladite composition.

8. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce quela composition est une composition dermatologique contenant de … à … UI devitamine A pour 100 g de ladite composition.

9. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce queledit ester de vitamine A est choisi dans le groupe constitué de l’acétate, dupropionate et du palmitate de vitamine A.

10. Composition cosmétique ou dermatologique destinée à une applicationtopique sur la peau, caractérisée en ce qu’elle est sous la forme d’un gel, d’unelotion, d’une émulsion ou d’une poudre et en ce qu’elle contient à titre d’agent actifune association de β-cyclodextrines diméthylées et de vitamine A ou d’au moins unde ses esters cosmétiquement ou dermatologiquement acceptables, les composantsde ladite association étant tels que définis dans l'une des revendications 1 à 4.

11. Procédé de soin cosmétique, notamment destiné à réguler lemétabolisme cellulaire de la peau et/ou à préserver ou restaurer un bon étatphysiologique cutané et/ou à améliorer le tonus, la fermeté et l’élasticité de la peauet/ou à retarder l’apparition des rides ou en atténuer la profondeur et/ou à réaliser lesoin des peaux grasses, , caractérisé en ce qu’il comprend l’application sur la peaud’une composition cosmétique contenant une association de β-cyclodextrinesdiméthylées et de vitamine A ou d’au moins un de ses esters cosmétiquementacceptables, les composants de ladite association étant tels que définis dans l’unedes revendications 1 à 4.

Utilisation d’une association de vitamine A ou d’au moins un de ses estersdermatologiquement acceptables et d’une β-cyclodextrine diméthylée, lescomposants de ladite association étant tels que définis dans l’une des revendications1 à 4, pour la fabrication d’une composition dermatologique à activité cicatrisante oupour le traitement des peaux à tendance acnéique.

93

Chapitre 1

3.2.4 Article n° 2

New aqueous gel based on soluble cyclodextrin/vitamin A inclusion complex

S. Weisse, B. Perly, J-P. Dalbiez, F. Ouvrard-Baraton

J-C. Archambault, P. André, P. Rollin, F. Djedaïni-Pilard .

Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry

Special Issue 11th International Symposium on Cyclodextrins (sous presse)

94

Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry

Special issue

New aqueous gel based on soluble cyclodextrin/vitamin A inclusion complex

Key Words : Rameb-CD, vitamin A propionate, skin absorption.

Corresponding author :

WEISSE Sandrine

Bat 125 SCM/DRECAM

CEA SACLAY

91191 Gif sur Yvette

France

tel 00 (0)1 69 08 32 70

fax 00 (0)1 69 08 98 06

mail : weisse@scm.saclay.cea.fr

New aqueous gel based on soluble cyclodextrin/vitamin A inclusioncomplex

S. Weisse *1, B. Perly 1, J-P. Dalbiez 1, F. Ouvrard-Baraton 3,

J-C. Archambault 3 , P. André 3 , P. Rollin 4, F. Djedaïni-Pilard 2.

* corresponding author : weisse @scm.saclay.cea.fr tel 00 33 (0)1 69 08 32 70 fax - 98 06

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1 Service de Chimie Moléculaire, Bat 125, CEA Saclay, F-91191

Gif sur Yvette Cedex, France 2 University of Picardie Jules Verne, Laboratoire des Glucides,

33 rue St Leu, F-80039 Amiens, France3 LVMH – Laboratoire de recherche et développement – Branche Parfums et Cosmétiques,

45800 St jean de Braye, France4 ICOA – University of Orléans, 45065 Orléans, France

ABSTRACT: Rameb (randomized dimethyl β-cyclodextrin ) was mixed up with vitamin A

propionate (PVA) (molar ratio 10/1 in water) and a water soluble complex was formed and

studied by HPLC and NMR (structure, concentration and stability of PVA). Then solution

was used to form an aqueous gel. The skin absorption of PVA through stratum corneum,

epidermis and dermis of human skin (on modified Franz cells) was assayed by HPLC and was

compared to that of a reference gel (or oil) without cyclodextrin. The solution obtained

contain a maximum of 10mg/mL PVA (if saturated with Rameb) and the PVA can remain

stable up to 90 days in solution, and up to 1 year if freeze-dried (storage at 4°C, in the dark).

The results of the different experiences of skin distribution were statistically analyzed and

show that when complexed with Rameb, the amount of PVA that penetrate each skin layers

is significantly higher compared to pure PVA. The results also show that PVA can not pass

through the dermis and reach the circulation.

KEY WORDS: Rameb, cyclodextrin, vitamin A propionate, skin absorption.

INTRODUCTION

Retinol (vitamin A) has important functions related to vision, reproduction, growth and

epithelium proliferation [1] and therefore represents a high interest for pharmaceutical and

cosmetic industries, but it is not water soluble and very unstable in the presence of light and

oxygen, which limit its use.

We propose here to use cyclodextrins and in this case randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)

cyclomaltoheptaose (Rameb) to improve the stability, the aqueous solubility and the dermal

bioavailability of an ester of vitamin A and form an aqueous gel containing vitamin A

propionate (PVA) to be tested on human skin.

EXPERIMENTAL

Materials

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Vitamin A propionate A or PVA (2.5 Mio I.E/g) was obtained from BASF (Germany) and

randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose (Rameb) from WACKER

(Germany). It is randomized dimethyl-β-cyclodextrin, but for the NMR experiments we used

highly purified homogeneous randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose [2]

in order to visualize precisely the different protons of the CD. All chemicals were purchased

from Fluka and used without further treatments. Deuterated solvents were purchased from

Euriso-Top (Saclay-France).

Preparation of inclusion complexes

The CD/drug mixtures were prepared by mixing accurately weighted quantities in water. The

mixtures were stirred during a few hours then centrifugated for 10 min. at 6000 rpm. The

aqueous solutions were filtered on Millex-SG 0.22 µm then freeze-dried before redissolution

of 10 mg in 0.4 mL D2O for NMR study. The precipitates, if present, were washed many times

by centrifugation with water and ether to eliminate the free species, then dried slowly under a

stream of nitrogen and freeze-dried before redissolution of 10 mg in 0.4 mL d6-dmso.

NMR Studies1H-NMR experiments were performed at 500.13 MHz using a Bruker DRX500 spectrometer

using the pulse programs available from the Bruker library. All measurements were performed

at 25°C under careful temperature regulation (+/- 0.1K). Chemical shifts are given relative to

external tetramethylsilane (TMS=0 ppm) and calibration was performed using the signal of

the residual protons of the solvent as a secondary reference. All NMR data were processed

and plotted using the UXNMR program and an INDY work station (Silicon graphics). Scalar

correlation (COSY, Relay experiments) were processed in the absolute value mode after zero-

filling resulting in a 1K×1K data matrix. For dipolar correlation (ROESY experiment), the

phase sensitive (TPPI) sequence was used and processing resulted in a 1K × 1K matrix.

HPLC

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For the stability study of the Rameb/PVA solution, analytical HPLC was carried out with a

Waters Delta Prep 3000 chromatograph equipped with an LSED detector and a Nova-Pack

C18 WATERS column, by elution of methanol (Chromasolv filtered on Millicup PTFE

0,5µm ) at 1mL/mn. An UV detector was used (WATERS Lambda Max at 340 nm) in the

case where the interesting peaks were covered by those of the CD with LSED (since CD is not

detectable by UV). For the assays following the skin absorption experiments, we used a

BECKMAN system Gold chromatograph with a Merck Lichrosher 125-4 RP18 (5 µM)

column and a Beckman led array detector, mobile phase was acetonitrile/water 90/10 v/v at

1mL/mn-1.

Mass Spectrometry

The integrity of molecular structure was confirmed by Mass Spectrometry (MS) using

electrospray infusion mode performed in positive mode on a Q-TOF Spectrometer(Micromass

UK).

Preparation of aqueous gels

We prepared an aqueous solution of the complex, with initial concentrations of PVA and

Rameb being respectively 40 mM and 400 mM, then 1.8% w/w Natrosol

(hydroxyethylcellulose, Hercules. Inc. USA) was added to form the gel. A reference aqueous

gel without CD was prepared with water, Natrosol (1.8 % w/w) , PVA and polysorbate 60

(2.5% w/w). The final concentration of PVA and Rameb in both gels was determined

precisely for each experiment (Table I). In one case (S5) we used as reference an oil (carnation

oil, Witco-Rewo) containing 0.75% PVA. In one case (S7) we used all the skin layers

including the dermis, to check if the CD or the PVA can pass in the blood.

S2 S4 S5 S7 S8%PVA w/w

% Rameb w/w

Rameb/PVA gel

0.72

47.3

0.76

50

0.96

53.3

0.86

48

0.45

25

% PVA w/w

% Rameb w/w

reference

0.72

no

aqueous gel

0.72

no

aqueous gel

0.75

no

oil

0.81

no

aqueous gel

0.45

30

aqueous gel

Table I: composition of the batches for each skin penetration experiment

Skin penetration study

98

This study was performed on fresh human skin pieces. It is well known that the main barrier

function of the skin is played by the upper epidermis called stratum corneum (or horny layer

made of layers of dead keratinocytes surrounded by lipidic sheets) and, on a smaller scale, by

the epidermis (alternate lipophilic and hydrophilic layers). Therefore we chose to remove the

hypodermis (fat) and dermis because those thick layers would stored the PVA and prevent us

from having detectable amount in the receptor liquid. The purpose of this study must

determine the amount of vitamin A propionate which penetrate into the different layers of the

skin, from our CD made aqueous gel and a reference gel or oil. We used a device containing

15 Franz-type cells (surface 2 cm2, receptor liquid volume 4.2mL) in a 37°C thermostatic

bath. For each experiment a different skin batch was used. The receptor liquid contains

phosphate buffer 10 mM, NaCl 120 mM, KCL 2.7 mM, pH 7.4 (Sigma) sodium azide 0.1%

w/w, ethanol (20% v/v) and a surfactant (polyoxyethylene polyoxypropylene butyl ether,

polyethylated hydrogenated castor oil, purified water : Wackherr colorants) 4% v/v. On each

cell, exactly 1g of gel was deposited (always 8 cells for the Rameb/PVA gel and 7 cells for the

reference) and covered with Parafilm . After 24 hours, the cells were dismantled, the excess

gel on the surface was removed and the skins were treated as follows: the stratum corneum

was collected by the stripping method (7 strippings, pression 300 g/cm2, time 12 sec.,

D’Squam , Eviderm corporation, Dallas) and the PVA extracted by solubilization in 2 mL

methanol and after 2 hours stirring, filtered (0.22µm) then assayed by HPLC. For the

epidermis, the PVA was extracted by solubilization in 2 mL methanol and after 2 hours

stirring, filtered ( 0.22 µm) then assayed by HPLC. The receptor liquid was assayed directly

by HPLC. The gels were submitted to the following treatments before PVA assays: 250 µL

were sampled and sonicated in 25 mL isopropanol to release PVA from the cellulose matrix,

then filtered on 0.22µm filter. A sample of each gel was kept to be assayed in time and

determine long term stability of PVA in the gels. The percentage of initial amount of PVA

that has penetrated is calculated from the concentration found in each layer. The results of the

PVA assays were statistically analyzed using the StatAdvisor Software. This procedure uses a

multifactor analysis of variance. The F-Test in the Anova table allows to identify the

significant factors and for each one, the Multiple Range Test determine which means are

significantly different from which other and which Confidence Interval must be applied to this

conclusion.

RESULTS AND DISCUSSION

99

Determination of the inclusion phenomena by NMR study

The solution obtained after 24h mixing is clear, yellow and no precipitate can be seen. After

centrifugation there is no change. Therefore two assumptions can be proposed : there is no

inclusion complex, or there is a water soluble inclusion complex. The 1H-NMR study of the

aqueous phase in D2O (after filtration and freeze-drying) shows that vitamin A propionate,

like Rameb is present in the aqueous phase. When comparing this spectrum with that of

Rameb alone, registered in the same conditions, we noticed that the inner protons of the CD

(H3 and H5) experience a chemical shift (0.04 ppm) which is significant of the inclusion

phenomenon [3] (data not shown).

The Rameb/PVA complex being water soluble, it is possible to perform a bidimensional

NMR experiment (T-Roesy) to identify the protons of the vitamin A propionate molecule

which are implicated in the inclusion phenomenon i.e those who show cross-peaks with the

inner protons of the CD. Indeed, the cross-peaks indicate a spatial proximity (<4 ) of those

protons. The 2D spectrum (Figure I) shows intense cross-peaks between the aliphatic protons

of vitamin A propionate and the H3, H5 protons of the CD. Therefore, we can assume that

the aliphatic cycle is involved in the inclusion process, while the vinyl moiety appears to stay

outside the cavity. This hypothesis agreed with the results obtained by Guo and coll. [4].

100

Figure I: T-Roesy (spin lock 300ms, attenuation 22dB) of the Rameb/PVA complex in D2O at

500 MHz (20mM)

We also noticed that the 1H-NMR spectrum of vitamin A propionate in the complex (in D2O)

is different from that of vitamin A propionate alone (in d6-dmso). The different solvents and

the interactions with the CD explain those differences (chemical shift, shape) at some point

but not entirely. First of all, it is necessary to check that vitamin A propionate does not

experience any major chemical modification due to its inclusion in the CD. In order to do so

we performed a HPLC analysis : the chromatogram confirmed the chemical integrity of the

molecule in the complex.

Then, the following assumption can be made: the complexation process follow the equation :

[Rameb] + [PVA] ↔ [C] with binding constant K = [C]/([PVA] [Rameb]n)-1

where [Rameb] et [PVA] represent the concentrations of the free forms and [C] the

concentration of the complex. In solution there is always a part of free vitamin A propionate,

the amount of which depends on the initial concentrations of [PVA]t and [Rameb]t. And this

free vitamin A propionate is not protected by the cavity of the CD and therefore experiences a

quick degradation process in aqueous solution, which might explain the differences on the 1H-

NMR spectrum. So it is important to determine the optimized conditions for the preparation

of the complex i.e the [Rameb]t/[PVA]t ratio where the amount of free [PVA] is as small as

possible. As the result, information is provided about batches studied previously and whether

or not they contain a certain amount of free PVA that would be unstable and would explain

the difference between the NMR spectra of free PVA and complexed PVA. Therefore, the

influence of the concentration of Rameb on the final concentration of complex was studied.

Determination of the influence of the concentration of Rameb

When K is known or can be estimated, it is possible, for any mixing with known initial

concentrations, to determine [C], and then the free amount of [PVA] and [Rameb] in solution

by resolving the following:

K = [C]/([PVA] [Rameb]n)-1 with [PVA] = [PVA]t - [C] and [Rameb] = [Rameb]t - [C]

The solution is written : [C] = (D - (D2 - 4.K2.[PVA]t.[Rameb]t)0,5).2K-1

with D = K.[PVA]t + K.[Rameb]t + 1

Based on previous studies concerning water soluble complexes poorly stable in solution, it is

possible to estimate that: 500<K<1000 [5]. The value of n will be estimated as 1 and

confirmed later.

101

For [Rameb]t = [PVA]t = 20 mM and K = 500, we have in solution 27% free vitamin A

propionate, which then experienced oxidation in the aqueous middle and as a consequence

signs of degradation appear on the 1H-NMR spectrum. On the other side when [Rameb]t > 10

[PVA]t, only less than 1% free Vitamin A propionate are found, whatever value we use for K.

The complexes which correspond to the following concentrations have been prepared and

studied by HPLC and 1H-NMR: [PVA]t = 0.02M and [Rameb]t = 0.02M, 0.05M, 0.1M, 0.2M,

0.3M, 0.4M. The results (data not shown) clearly show that for [Rameb]t = [PVA]t = 20mM

the complex is highly degraded whereas it is not for [Rameb]t = 10 [PVA]t : we can conclude

that the whole vitamin A propionate is, at any given time, protected in the inclusion complex.

In those conditions, using a solution saturated with Rameb, the maximal solubility reached for

PVA is 10mg/mL.

Determination of the stoichiometry

The determination of the stoichiometry in the case of a water soluble complex can be done

using the method of Job [6] which is based on the measurement of the chemical shifts of the

protons of the CD and those of the guest molecule for a ratio r = [Rameb]/([Rameb]+[PVA])

going from 0 to 1. In our case, this method cannot be used because it is necessary to maintain

r close to 1 to obtain a stable complex. Hence, two other methods were used : Mass

Spectrometry and the Higuchi and Connors method [7].

Mass Spectrometry was carried out in Electrospray mode (ESI-MS), because it is the most

accurate technique for non covalent associations. This technique detects complexes according

to their molecular weight which allows the stoichiometry to be found simultaneously. The

sample we used for this analysis is the same as the one used for the 1H-NMR in D20. The 1/1

stoichiomietry of the complex is clearly established by the presence of peaks m/z = 1665 for

[Rameb + PVA + Na]+ and m/z = 845 for [Rameb + PVA + 2Na]2 (data not shown). The

Higuchi and Connors method uses solubility phase diagrams and in this case we can see that

the concentration of solubilized vitamin A propionate grow almost with a linear way (water

soluble complex) with a slope close to 1 (0.98 for the last three points) which indicates a 1/1

stoichiometry. This results are in accordance with those obtained by Mass Spectrometry and

with the geometry of the complex described by the T-Roesy experiment.

We have established in a previous paper [9] that βCD form a 2/1 (βCD/PVA) complex with

PVA.

102

The result obtained for the Rameb/PVA complex can be justified by the larger cavity of the

Rameb, due to its methyl groups on each face, which allow a bigger part of the vitamin A

propionate to be included. Furthermore, it has been showed that in a 2/1 inclusion complex

with βCD, the dimer were most of the time stabilized by hydrogen bonds between the

secondary hydroxyls, which is no longer possible with Rameb.

Stability Study

We have previously demonstrated that the mass action law requires the presence of 10

equivalents of Rameb as initial concentration to obtain a stable complex. Once this is

established, all complexes were prepared according to this law and the influence of the

environment (light, heat, oxygen) was studied on several batches by HPLC and 1H-NMR.

The results show that in aqueous solution the vitamin A propionate remains stable for 60 days

if protected from light and at 4°C, but only 15 days if kept at 25°C under natural light. We

also studied the complex in its freeze-dried form : the vitamin A propionate can remain stable

6 months even without any protection (kept at 25°C under natural light) and more than a year

when protected from light, at 4°C (Figure II). As post freeze-drying solubilization is very easy,

this results can provide a new way for vitamin A propionate storage. It should be noted that

the vitamin A propionate alone is stable less than 10 days at 25°C under natural light.

The results of PVA assays in the different gels show a loss of 10 to 20% in 2 months and over

80% in six months in the Rameb/PVA gel. The homogeneity of the gel stays unchanged. In

the reference gel, there is a phase separation and complete degradation of the PVA in less than

15 days.

Figure II: 1H-NMR spectra (500MHz, 298K, D2O) of the Rameb/PVA complex (20mM) in

solution at T0 and after 7 months (freeze-dried form stored at 4°C in the dark).

1.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5 ppm

1.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5 ppm

pva

Rameb/pva D2O 298k

To

T+7 months

103

Skin penetration study

The results of PVA assays for each experiment are presented in Table II .

It must be emphasized here that the different experiments can not be compared directly since

each concerns a different skin batch and the diversity of human skin precludes comparison.

So, the later can only be made within the results of one experiment.

Experiment Stratum Corneum Epidermis Receptor LiquidS2 Reference

S2 Rameb/PVA

mean

standard deviation

mean

standard deviation

0.378

0.086

0.612

0.427

0.139

0.154

0.516

0.374

0

0

0.003

0.004S4 Reference

S4 Rameb/PVA

mean

standard deviation

mean

standard deviation

0.618

0.41

0.864

0.317

0.051

0.025

0.145

0.181

0.017

0.032

0.066

0.08S5 Reference

S5 Rameb/PVA

mean

standard deviation

mean

standard deviation

0.034

0.037

0.36

0.224

0.113

0.151

0.132

0.235

0.003

0.009

0.019

0.022S7 Reference

S7 Rameb/PVA

mean

standard deviation

mean

standard deviation

0.174

0.189

0.221

0.118

0.112

0.052

0.062

0.044

0

0

0

0

Table II: Amount of PVA found in the stratum corneum, the epidermis and the receptor phase

(as % of initial amount of PVA and using 8 values for the Rameb/PVA gel and 7 values for

the reference gel for each experiment)

Some fairly outstanding observations can be made from those results. A statistical

multifactors analysis of variance was performed on each experiments (all cells) and shows

104

that in each case, except the S7 experiment, the amount of vitamin A propionate that

penetrates in the skin (all layers considered) is significantly higher when the molecule is

included in the Rameb/PVA complex (Confidence Interval 95%). If the different

compartments are analyzed individually the 95% Confidence Interval cannot always be

maintained and sometimes drops to 86 % (for significant difference between the reference and

the Rameb/PVA gel) as the number of data is smaller and therefore the Confidence Interval is

higher. However, there is no doubt concerning the effects on inclusion in the Rameb : it leads

to higher skin penetration.

In the case of the S7 experiment, no meaningful difference was noticed between the reference

gel and the Rameb/PVA gel in term of quantitative penetration of vitamin A propionate. The

reason is we kept the dermis but could not find a way to extract the PVA from this very thick

layer. Therefore the dermis was not assayed and the only conclusion that can be drawn is that

the PVA do not penetrate farther than dermis, since no PVA was recovered in the receptor

liquid. Most of the PVA is probably stuck in the dermis where, like in epidermis, it is

converted in active retinoids i.e the form that will bind with the cellular receptor [8]. The

important point of this experiment is that PVA cannot reach the circulation after topical

application of the gel.

CONCLUSION

A very stable and soluble complex can be formed between Rameb-CD and the vitamin A

propionate. An aqueous gel based on this solution significantly improves the amount of

vitamin A that penetrates the different layers of human skin and it was proven not to reach the

circulation.

References

[1] M. H. Zile and M. E. Cullum: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 172, 139 (1983).

[2] C.M. Spencer, J.F. Stoddart, R. Zarzycki: J Chem. Soc. Perkin Trans II, 1323-1330 (1987).

105

[3] F. Djedaïni-Pilard and B. Perly: New trends in cyclodextrins and derivatives, Ed. D.

Duchêne, Paris (1991) p.215

[4] Q-X. Guo, T. Ren, Y-P. Fang, Y-C. Liu: J. Incl. Phenom. Mol. Recognit. Chem 22, 251

(1995).

[5] K.A Connors: Chem. Rev. 97, 1325-1357 (1997).

[6] P. Job: Ann. Chim. 9, 113 (1928).

[7] T. Higuchi, K.A. Connors: Adv. Anal. Chem. Instr. 4, 117-211 (1965).

[8] G.J. Fisher and J.J. Voorhees: The FASEB J. 10,1004 (1996)

[9] S. Weisse, B.Perly, J-P. Dalbiez, F. Djedaïni-Pilard: J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem.

106

Chapitre 1

3.2.5 Article n° 3

Comparative assay of Rameb-CD and vitamin A propionate in skin layers following

topical application of the Rameb/PVA inclusion complex

S. Weisse, F. Djedaïni-Pilard, F. Ouvrard-Baraton, B. Perly and C. Créminon

STP Pharma (soumis)

107

Comparative assay of Rameb-CD and vitamin A propionate in skin layers following

topical application of the inclusion complex

S. Weisse1, F. Djedaïni-Pilard2, F. Ouvrard-Baraton3, B. Perly1 and C. Créminon4

1 Service de Chimie Moléculaire, DSM/DRECAM, CEA Saclay, F-91191 Gif sur Yvette Cedex, France 2 Université de Picardie Jules Verne, Laboratoire des Glucides, EA 2082 33 rue St Leu, F-80039 Amiens, France3 LVMH – Laboratoire de recherche et développement – Branche Parfums et Cosmétiques, 45800 St Jean de Braye, France4 Service de Pharmacologie et d’Immunologie, DSV/DRM, CEA Saclay, F-91191Gif sur Yvette Cedex, France

INTRODUCTION

Retinol or vitamin A is a molecule of vital importance for the human body since it is

required in many physiological functions [1-3]. Vitamin A plays a key role in cellular

differentiation and therefore influences many processes like reproduction (for the growth of

the embryo as well as the development of placenta and sexual cells), immunity (for the

differentiation of white cells) and also epitheliums development. Vitamin A is also required to

form retinal pigments which are essential to night vision. Its role in cellular differentiation

also gives vitamin A a great importance in oncology [4-5] as it has been shown that it can be

used to inhibit carcinogenesis, and in dermatology (against acne, photo-aging, psoriasis,

melanoma…).

As such, this molecule represents a high interest for pharmaceutical and cosmetic

industries, but there are drawbacks : it is not water soluble and very unstable in the presence

of light and oxygen, which limit its use. We described in previous papers [6-7] the use of

randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose (also named per-(2,6-O-dimethyl)-

β-cyclodextrin or Rameb) to form a water soluble 1/1 complex with vitamin A propionate

(vitamin A alcohol or retinol is to unstable to be used here) and therefore improve the

stability, the aqueous solubility and the dermal bioavailability of this ester of vitamin A.

We report here on further experiments and especially on the Rameb enzyme

immunoassay used to investigate the penetration of this CD in the different layers of the skin

using the same biological samples as for the HPLC assay of the ester of vitamin A. This

108

comparative assay of both vitamin A and Rameb will hopefully bring new data for a better

understanding the behaviour of this type of complex following cutaneous application.

EXPERIMENTAL

Material

Vitamin A propionate A or PVA (2.5 Mio I.E/g) was obtained from BASF (Germany)

and randomized heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose (Rameb) from WACKER

(Germany). All chemicals were purchased from Fluka and used without further treatments.

Purification of acetylcholinesterase (AchE), for the enzyme immunoassay, from electric

organs of the electric eel Electrotrophorus electricus, preparation of the G4 form used, and

measurements of its activity were performed as previously described [8-9]. Solid-phase EIA

was performed on 96-well microtiter plates (Immunoplate Maxisorp, Nunc, Denmark) using

automatic Titertek microtitration equipment (washer, dispenser, and reader) from Labsystems

(Les Ulis, France). All reagents used for immunoassays were diluted in the following buffer

(EIA buffer): 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.9% NaCl, 1 mM

EDTA, 0.1% bovine serum albumine (BSA) and 0.01% sodium azide. A 10mM phosphate

buffer containing 0.05% Tween 20 was used for all washing steps.

Fig 1. Vitamin A propionate

OCOC2H5

109

Fig 2. heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose (Rameb)

Preparation of inclusion complexes

The CD/drug mixtures were prepared by mixing accurately weighted quantities in

water. As already described [6], the mixtures were stirred during a few hours then

centrifugated for 10 min. at 6000 rpm. The aqueous solutions were filtered on Millex-SG 0.22

µm. The initial ratio of [CD] to [PVA] in the solution (before filtration) is always equal to 10

to ensure good long term stability of the complex,

Preparation of aqueous gels

We prepared an aqueous solution of the complex, with initial concentrations being 40

mM and 400 mM for PVA and Rameb respectively, then 1.8% w/w Natrosol

(hydroxyethylcellulose, Hercules. Inc. USA) was added to form the gel. A reference aqueous

gel without CD was prepared with water, Natrosol (1.8 % w/w) , PVA and polysorbate 60

(2.5% w/w). The final concentration of PVA in both gels was determined precisely for each

experiment (Table I). A total of 6 experiment are presented here under the name S2, S4, S5,

S6, S7 and S8. Rameb was only assayed for 3 experiments (S5, S6, S7) due to time

restriction. In one case (S5) we used an oil as reference (carnation oil, Witco-Rewo)

containing 0.75% PVA. In one case (S8) we used a physical mixture of PVA and Rameb in an

aqueous gel (no complex) as reference.

S2 S4 S5 S6 S7 S8Gel

Rameb/PVA

% PVA w/w

% Rameb w/w

0.72

47.3

0.76

50

0.96

53.3

0.70

45.45

0.86

48

0.45

25

( O M e ) 7

( O M e ) 7O H 7

β - C D

6

23

110

reference

gel (or oil)

% PVA w/w

% Rameb w/w

form

0.72

no

aqueous

gel

0.72

no

aqueous

gel

0.75

no

oil

0

46.87

aqueous

gel

0.81

no

aqueous

gel

0.45

30

aqueous

gel

Table I : composition of the batches for each skin penetration experiment

Skin penetration study

This study was performed on fresh human skin pieces. It is well known that the main

barrier function of the skin is played by the upper epidermis called stratum corneum (or horny

layer made of layers of dead keratinocytes surrounded by lipidic sheets) and, on a smaller

scale, by the epidermis (alternate lipophilic and hydrophilic layers). Therefore, as described in

the litterature [10] we chose to remove the hypodermis (fat) and dermis because those thick

layers would stored the PVA and prevent us from having detectable amount in the receptor

liquid. The purpose of this work is to determine the amount of vitamin A propionate and

Rameb which penetrates into the different layers of the skin, from our CD made aqueous gel

and a reference gel or oil. In one case (S7) we used all the skin layers including the dermis, to

check whether the CD or the PVA can pass in the blood. We used a device containing 15

Franz-type cells (surface 2 cm2, receptor liquid volume 4.2mL) in a 37°C thermostatic bath.

For each experiment a different skin batch was used. The receptor liquid contains phosphate

buffer 10 mM, NaCl 120 mM, KCL 2.7 mM, pH 7.4 (Sigma) sodium azide 0.1% w/w, ethanol

(20% v/v) and a surfactant (polyoxyethylene polyoxypropylene butyl ether, polyethylated

hydrogenated castor oil, purified water : Wackherr colorants) 4% v/v. On each cell, exactly 1g

of gel was deposited (always 8 cells for the Rameb/PVA gel and 7 cells for the reference) and

covered with Parafilm . After 24 hours, the cells were dismantled, the excess gel on the

surface was removed and the skins were treated as follows: the stratum corneum was collected

by the stripping method (7 strippings, pression 300 g/cm2, time 12 sec., D’Squam , Eviderm

corporation, Dallas) and the PVA extracted by solubilization in 2 mL methanol and after 2

hours stirring, filtered (0.22µm) then assayed by HPLC. For the epidermis, the PVA was

extracted by solubilization in 2 mL methanol and after 2 hours stirring, filtered ( 0.22 µm)

then assayed by HPLC. The receptor liquid was assayed directly by HPLC. The gels were

submitted to the following treatments before PVA assays: 250 µL were sampled and sonicated

in 25 mL isopropanol to release PVA from the cellulose matrix, then filtered on 0.22µm filter.

A sample of each gel was kept to be assayed in time and determine long term stability of PVA

111

in the gels. The percentage of initial amount of PVA that has penetrated is calculated from the

concentration found in each layer. The results of the PVA assays were statistically analyzed

using the StatAdvisor Software. This procedure uses a multifactor analysis of variance. The

F-Test in the Anova table allows to identify the significant factors and for each one, the

Multiple Range Test determine which means are significantly different from which other and

which Confidence Interval must be applied to this conclusion.

HPLC

For the vitamin A propionate assays following the skin absorption experiments, we

used a BECKMAN system Gold chromatograph with a Merck Lichrosher 125-4 RP18 (5 µM)

column and a Beckman led array detector, mobile phase was acetonitrile/water 90/10 v/v at

1mL/mn-1. Detection of PVA at 325 nm, retention time is 9 mn.

Competitive enzyme immunoassays (EIA)

βCD and γCD enzyme immunoassays have been previously described [11-12]. The

protocol for heptakis-(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose (Dimeb) is the same. For the

production of antibodies, heptakis-(2-O-methyl)hexakis-(6-O-methyl)6-mono-amino-6-deoxy-

cyclomaltoheptaose (Dimeb mono-amine, see [13]) was covalently linked to bovine serum

albumine (BSA) using a glutaraldehyde as linker, as previously described [11].

For the preparation of the enzymatic tracer, heptakis-(2-O-methyl)hexakis-(6-O-

methyl)6-mono-amino-6-deoxycyclomaltoheptaose was covalently coupled to AchE using the

heterobifunctional reagent N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-

carboxylate (SMCC) as previously described [11]. This method involved the reaction of the

thiol groups previously introduced into heptakis-(2-O-methyl)hexakis-(6-O-methyl)6-mono-

amino-6deoxy cyclomaltoheptaose (by reaction of its primary amino group with N-

succinimidyl-S-acetylthioacetate (SATA) in alkaline medium) with maleimido groups

incorporated into the enzyme.

Competitive EIA was performed as described elsewhere for various molecules [14-15].

Microtiter plates were coated with mouse monoclonal anti-rabbit IgG antibodies in order to

ensure separation of bound and free moieties of the enzymatic tracer during the

immunological reaction. Before use, the plates were washed with 0.01 M phosphate buffer

(pH 7.4) containing 0.05% Tween 20. The total volume of immunological reaction was

150µL, each component (enzymatic tracer, diluted rabbit polyclonal antisera and CD

standards) being added in a 50 µL volume diluted in EIA buffer. Dimeb mono-amine-AchE

112

enzyme conjugates was used at a concentration of 1 Ellman units/mL (for Ellman unit

definition see [12]). The working dilution for the rabbit antiserum was determined by

performing serial dilution experiments. After 18h incubation at 4°C, the plates were washed

and the enzyme activity of the bound immunological complex was revealed by addition of

200µL/well of Ellman reagent. After 2h of gentle shaking in the dark at room temperature, the

absorbance at 414 nm in each plate was measured automatically. Results are given in terms of

(B/B0)*100 as a function of the dose (logarithmic scale), B and B0 representing the bound

enzyme activity in the presence or absence of competitor, respectively. A linear log-logit

transformation was used to fit the standard curve [16]. All experiments were done in duplicate

and quadruplicate for B0. The limit of detection for the Rameb was established at 0.1ng/mL.

The EIA was performed on the same biological samples as used for PVA assays so that

comparison of the results would be possible.

RESULTS AND DISCUSSION

As preliminary study, we performed a skin penetration study comparing the

penetration of PVA in different aqueous gels : one containing the Rameb/PVA complex,

another containing the γCD/PVA complex (not soluble in water see [17]) and one with the

PVA alone. The results (Fig. 3) indicate that the concentration of PVA in the skin layers

increases in the order Rameb/PVA >PVA alone > γCD/PVA. It indicates that the inclusion in

the Rameb enhances the penetration of PVA in the skin but that the γCD decrease this

phenomenon. These preliminary results, lead us to focus the skin penetration study on the

Rameb/PVA complex, since the assays on guest and host could be performed by HPLC and

immunoassays respectively.

Fig 3 . Amount of PVA found in the stratum corneum, the epidermis and the receptor

liquid (as % of initial amount of PVA and using 5 values for the Rameb/PVA gel, 5 values for

the γCD/PVA gel and 5 values for the reference gel without CD)

113

Before presenting the results, one point must be clarified. Heptakis-(2,6-di-O-methyl)

cyclomaltoheptaose or Dimeb is a very pure compound whereas the randomized form, Rameb,

is a mixture of several compounds exhibiting different degrees of methylation (between 11

and 16) as demonstrated by Mass spectrometry studies [18, 19]. (Fig 4)

Electrospray ionisation of RAMEB (infusion at 5 µl.min-1 of a 0.01 mg.ml-1 solution in

water/acetonitrile 50:50 containing 0.1 % trifluoroacetic acid) with positive ion detection

leads to a series of protonated molecules, [M+H]+, at m/z values depending on the number of

methyl groups in each of the individual sugar unit of the β-cyclodextrin. The mass spectra

reflect the average distribution of the methyl groups in all of the individual sugar unit of the

RAMEB molecule and consequently if the components having 9 (m/z 1261) to 14 (m/z 1331)

methoxy groups (0-Me) are included in the calculation (the relative intensities of components

outside this group are too low to be reliable) the degree of substitution per sugar unit (DS) can

be calculated [18, 19].

DISTRIBUTION OF PVA AFTER 24H CONTACT

0,000%

0,200%

0,400%

0,600%

0,800%

1,000%

1,200%

reference Rameb Gamma

% o

f PVA

strat.corneumepidermisreceptor liquidtotal skin

114

1220 1240 1260 1280 1300 1320 1340 1360 m/z

%

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

1345

1331

1317

1311

1303

1297

1289

1283

1276

1261

1247

Fig 4 . Electrospray (ESI) ionisation mass spectra of RAMEB

([M+H]+ ions region)

It has already been proven during the settings of the first CD immunoassays that no

cross reaction occured between the different CD [11]. The specific immunoassay we used

here was developed for Dimeb, using heptakis-(2-O-methyl)hexakis-(6-O-methyl)6-mono-

amino-6deoxy cyclomaltoheptaose to create the hapten. Therefore, we had to check the

hability of the antiDimeb-antibodies to recognize Rameb as well. We used series of known

concentrations of Rameb and Dimeb and compared the results and sensibility of the assay. Fig

5 shows the calibration curves obtained for Rameb and Dimeb It appeared the antiDimeb-

antibodies also recognized Rameb. However, the 100*B/B0= f(C) curve indicated that the

assay is 10 times less sensitive with Rameb than with Dimeb (B/B0 50%, which represents the

zone where the assay gives maximum precision is 1.5ng/mL for Rameb and 0.15ng/mL for

12 0-Me

13 0-Me

11 O-Me

115

Dimeb). The limit of detection was established at 0.1ng/mL for Rameb. The cause of this loss

of sensibility is the heterogeneous composition of Rameb, which only contains a small

amount of pure Dimeb, mixed up with many other under or over methylated species. Those

methylated species are not recognized by the antiDimeb-antibodies with the same sensibility

as Dimeb and therefore, the sensibility towards Rameb is the mean of all the sensibility

towards those different methylated species.

Fig 5 . Calibration curve for Rameb and Dimeb (2-Me-β-CD) – B/B0 = 50% indicates

the zone of maximum precision

Skin penetration study

The results of PVA assays performed by HPLC for each experiment are presented in

Table II. They are expressed as percentage recovered from the initial amount of PVA

deposited on the cell (since we know the exact amount of PVA in each gel).

It must be emphasized here that the different experiments can not be compared directly

since each concerns a different skin batch and the diversity of human skin precludes

comparison. So, the later can only be made within the results of one experiment. We will first

discuss the results of the PVA assays.

Some fairly outstanding observations can be made from those results. A statistical

multifactors analysis of variance was performed on each experiments (all cells) and shows

0.01 0.1 1 10 1000

20

40

60

80

100 RAM EB

2-M e -β -CD

Competitor (ng/ml)

B/B

0 (%

)

116

that in each case, except the S7 experiment, the amount of vitamin A propionate that

penetrates in the skin (all layers considered) is significantly higher when the molecule is

included in the Rameb/PVA complex (Confidence Interval 95%). If the different

compartments are analyzed individually the 95% Confidence Interval cannot always be

maintained and sometimes drops to 86 % (for significant difference between the reference and

the Rameb/PVA gel) as the number of data is smaller and therefore the Confidence Interval is

higher. However, there is no doubt concerning the effects on inclusion in the Rameb : it leads

to higher skin penetration.

Experiment Stratum Corneum Epidermis Receptor LiquidS2 Reference

S2 Rameb/PVA

mean

standard deviation

mean

standard deviation

0.378

0.086

0.612

0.427

0.139

0.154

0.516

0.374

0

0

0.003

0.004S4 Reference

S4 Rameb/PVA

mean

standard deviation

mean

standard deviation

0.618

0.41

0.864

0.317

0.051

0.025

0.145

0.181

0.017

0.032

0.066

0.08S5 Reference

S5 Rameb/PVA

mean

standard deviation

mean

standard deviation

0.034

0.037

0.36

0.224

0.113

0.151

0.132

0.235

0.003

0.009

0.019

0.022

117

S7 Reference

S7 Rameb/PVA

mean

standard deviation

mean

standard deviation

0.174

0.189

0.221

0.118

0.112

0.052

0.062

0.044

0

0

0

0S8 Rameb +PVA

S8 Rameb/PVA

mean

standard deviation

mean

standard deviation

0.34

0.28

1.01

0.95

0.134

0.11

0.36

0.46

0.006

0.01

0.034

0.051

Table II . percentage of initial amount of PVA recovered in each skin layer for

experiments S2, S4, S5, S7, S8.

In the case of the S7 experiment - PVA alone versus Rameb/PVA on epidermis and

dermis - no meaningful difference was noticed between the reference PVA gel and the

Rameb/PVA gel in term of quantitative penetration of vitamin A propionate. The reason is

that we kept the dermis but could not find a way to extract efficiently the PVA from this very

thick layer. Therefore the dermis was not assayed and the only conclusion that can be drawn is

that the PVA do not penetrate farther than dermis, since no PVA was recovered in the receptor

liquid. Most of the PVA is probably stored in the dermis where, like in epidermis, it is

converted in active retinoids i.e the form that will bind with the cellular receptor [20]. The

important point of this experiment is that PVA doesn’t reach the circulation after topical

application of the gel, at least after 24h. This doesn’t mean that PVA can not pass in the

circulation since some small blood vessels are present in the dermis. But the dermis acts as a

reservoir by keeping the PVA and it is very likely that the majority of the drug will be

metabolized before reaching the small vessels. Furthermore, we have no indication concerning

the ability of PVA to pass through the vessels membranes.

In experiment S8 we compared the results of the Rameb/PVA complex with those of a

physical mixture containing the same amount of Rameb and PVA, but both in the free forms.

These results suggest that the total amount of PVA recovered in the stratum corneum,

epidermis and receptor liquid is greater when the 2 compounds are in the form of inclusion

complex. This result is important because it gives us some clue about the role of the

cyclodextrin. As seen in the literature, the CD are often use, in topical application, as a

penetration enhancer [21-24]. First, it was believed that this property was due to their ability

to complex cholesterol and lipids and therefore disorganize biological membranes. But since a

118

few years, researchers have established, using pretreatment of skin with CD, that in order to

have an increasing effect on the amount of drug penetrating the skin, the CD must be used as

an inclusion complex with the drug. The results of experiment S8 corroborate this

conclusion : the physical mixture of CD and PVA gives statistically significantly lower

penetration in the skin, in comparison with the CD/PVA complex. The mechanism of

penetration enhancing of the CD as been studied by Loftsson et al. [22] : the CD act as true

carriers by keeping lipophilic drugs, such as PVA, in aqueous solution and then deliver them

to the skin surface where they partition from the CD cavity into the skin. This can be

explained by the classical model of double diffusion membrane i.e aqueous then lipophilic.

So, the penetration enhancer effect of the CD comes from its ability to solubilise the drug and

make it available at the surface of the skin. This explains why we did not observed such an

effect in the preliminary study, with the γ-CD/PVA complex which is absolutely not soluble in

water. It also would means that the penetration of the PVA probably occurs after its release

from the cyclodextrin.

But we can now wonder what happens to the CD?

The main results of the Rameb immunoassays are presented in Table III and Fig 6.

Stratum Corneum Epidermis Receptor LiquidS5 Rameb/PVA mean

standard deviation

0.262

0.186

0.349

0.758

0.053

0.037S6 Reference

S6 Rameb/PVA

mean

standard deviation

mean

standard deviation

0.302

0.08

0.236

0.132

0.1

0.055

0.035

0.02

0.061

0.116

0.033

0.071S7 Rameb/PVA mean

standard deviation

0.096

0.068

0.02

0.014

0.001

0.001

Table III : Amount of Rameb found in the stratum corneum, the epidermis and the

receptor liquid (as % of initial amount of PVA and using 8 values for the Rameb/PVA gel and

7 values for the reference gel for each experiment). In the S6 experiment, Rameb is present

both in the reference gel and the Rameb/PVA gel.

119

Fig 6 . Graphical representation of the amount of Rameb found in the stratum

corneum, the epidermis and the receptor liquid (as % of initial amount of PVA and using 8

values for the Rameb/PVA gel and 7 values for the reference gel for each experiment). In the

S6 experiment, Rameb is present both in the reference gel and the Rameb/PVA gel.

These results shows us that, like vitamin A propionate, a significant amount of Rameb

penetrates in every skin layers and reach the receptor liquid (S5, S6, S7). However, in the S7

experiment, the amount of Rameb recovered is obviously much lower than in the two other

experiments and even though a real comparison cannot be made between the batches because

of human variability, it is clear that the presence of the dermis (S7) induced a loss in all

compartments. Since it was not possible to extract correctly the CD from the dermis, this layer

was not assayed but from the results of the other compartments, we can suppose that the

majority of the CD is stored in the dermis. This experiment also teaches us that a very small

amount of Rameb can diffuse in the dermis and reach the blood within 24h, as shown by the

presence of Rameb in the receptor liquid. This is in accordance with previous published

results [25] indicating that Dimeb is capable of transdermal absorption in small quantities, and

rapidly excreted by urine.

Distribution of RAMEB in skin layersPercentages recovered (%)

00,10,20,30,40,50,60,7

S6 RAMEB S6 RAMEB/PVA S5 S7

Receptor LiquidumEpidermisTotal skin

120

With the S6 experiment, using a gel containing Rameb only as reference, we have the

opportunity to compare the influence of the complexation with PVA on the penetration of the

Rameb: a statistical multifactors analysis of variance was performed and demonstrated that

there is no significant difference between the results of the Rameb gel and the results of the

Rameb/PVA gel (Confidence interval 91%), when regarding all skin layers together. This

result supports the theory that the CD is a vehicule used to take the drug from the aqueous

phase to the lipophilic barrier where it should release it. However, it should be reminded that

the ratio Rameb/PVA in the complx is 10 and a large majority of CD is under free state.

Hence, this study indicates that both PVA and Dimeb can penetrate in the skin. The

amount is significant but only represents a small part of the amount applied. The important

point is that in this case, Rameb acts as a penetration enhancer by significantly increasing the

amount of PVA penetrating the different layers of skin. The question that arises is whether or

not the PVA and Dimeb penetrate as a inclusion complex and if not, when does the separation

happens. To try to answer this question we calculated the ratio [Rameb]/[PVA] for each layers

(after 24h contact) and for the three experiments where Rameb was assayed. Since this ratio is

initially equal to 10 in the solution and in the gel, any significant variation of the ratio in the

skin layers would indicate that one species penetrates more rapidly and that the complex is

therefore separated. Of course, since the Rameb is present in the gel in the free form for 9/10

and in the complexed form for 1/10, this assumption can only be made if the behaviour of

Rameb in the skin is the same whether its free or complexed. This was proven with the results

of the S6 experiment. The values we obtained for the [CD]/[PVA] ratio in the different

experiment shows very important variations (data not shown), ranging from 5 to 50.

Unfortunately, no major tendency can be obtained from those data that would indicate where

the separation happens and which species permeates more quickly. We can only conclude that

the complex is broken in the skin, probably in the stratum corneum since this is the layer

where the ratio is closer to 10. This supports the previous hypothesis about the role of the

cyclodextrin : it acts as a carrier to facilitate the permeation from the aqueous media on the

skin to the stratum corneum, which is responsible for the barrier function of the skin. Once in

the epidermis, the complex is in a medium containing alternate lipophilic and hydrophilic

layers, and it is very likely that the complex is broken and the PVA diffuses according to its

partition coefficient. The dermis which contains cells, fibers and nerves in an aqueous

mucopolysaccharidic medium, is an ideal environment for the diffusion of the very

hydrophilic Rameb, but not for the highly lipophilic PVA which might explain why no traces

121

of PVA were found beyond the dermis whereas a small amount of Rameb can pass in the

blood.

CONCLUSION

This work demonstrated that complexation of vitamin A propionate with Dimeb

enhances its penetration through the different compartments of skin and should allow to

decrease the quantity of PVA in the final formulation. The other advantage of this form is that

the complex is stable in aqueous media. It shows also that the Rameb, which act as a

penetration enhancer, penetrate in the skin as well and, for a very small amount, reach the

blood vessels. It appeared from those results that PVA and CD are separated at some level in

the skin, however no conclusion could be made regarding the location of the dissociation.

Acknowledgments

The expert technical assistance of M.-C. Nevers on immunoassays trough out this

work was essential and particularly appreciated.

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25- Gerlocsy, A., Antal, S. & Szejtli, J. (1988). Int. Symp. on cyclodextrins, Munich.

3.1.5 DISCUSSION

124

3.2.6 DISCUSSION

Nous allons reprendre au cours de cette discussion, l’ensemble des informationsrecueillies dans les articles de ce premier chapitre.

Commençons tout d’abord par les études de complexation du propionate de vitamine A

par les cyclodextrines. Le but était de trouver un moyen de stabiliser et solubiliser le PVA

dans les formes pharmaceutiques, et à cet égard, seule la Rameb s’est montrée efficace. En

effet, l’αCD ne forme aucun complexe, comme cela a été prouvé par la comparaison des

spectres RMN 1H dans D2O de l’αCD seule et en présence de PVA. En revanche, βCD et γCD

donnent un complexe insoluble dans l’eau, mis en évidence par l’analyse RMN 1H dans le d6-

dmso du solide obtenu après centrifugation du mélange aqueux CD/PVA. Ces deux

complexes, bien que d’apparence similaire, sont en fait très différents. L’intégration des

signaux RMN de la CD et du PVA montre que le complexe γCD/PVA est de stoechiométrie

1/1 alors que le complexe βCD /PVA est de stoechiométrie 2/1.

Cette différence de structure a des conséquences sur la stabilité des 2 complexes. En

effet, on observe, par RMN et par HPLC, une dégradation très rapide du PVA dans le

complexe βCD /PVA. Le phénomène est plus rapide que dans le cas du PVA seul et ne touche

pas les mêmes sites de la molécule. A l’opposé, le PVA dans le complexe γCD/PVA reste

stable à très long terme. Ceci s’explique par le fait que la géométrie du complexe 2/1 de

βCD/PVA est très différente de celle du complexe 1/1 de γCD/PVA. Les 2 βCD qui

complexent le PVA sont vraisemblablement situées à chaque extrémités en se faisant face par

le coté des hydroxyles secondaires (car l’inclusion se fait en général par la face secondaire) et

ce grand nombre de fonctions hydroxyle crée une zone de haute réactivité chimique qui

pourrait être responsable d’une dégradation accélérée du PVA. La CD jouerait le rôle d’une

enzyme.

Devant l’échec de l’utilisation des 3 CD naturelles pour améliorer la solubilité du PVA,

nous nous sommes tournés vers des CD fonctionnalisées possédant une plus grande solubilité

aqueuse. Notre choix s’est porté sur la per-(2,6-O-dimethyl)-β-cyclodextrin (Dimeb) dont la

solubilité est plus de 25 fois supérieure à celle de la CD parente, soit 400 mM et qui possède

l’avantage d’exister dans le commerce (sous forme d’un mélange contenant de nombreux sous

produits plus ou moins méthylés, la Rameb). De plus, nous possédons une méthode de dosage

125

sensible de la Dimeb (dosage immunoenzymatique par compétition), ce qui nous permet

d’envisager des dosages après absorption dans les milieux biologiques.

Avec la Dimeb, il se forme un complexe 1/1 parfaitement soluble dans l’eau et stable à

long terme. Ces résultats très positifs nous ont permis de préparer un gel aqueux contenant le

complexe Rameb/PVA et d’étudier la pénétration cutanée des 2 espèces et l’influence de la

complexation (on utilise la Rameb pour ces études car elles demandent une grande quantité de

CD et la Dimeb, composé pur, est très difficile à obtenir). Ceci est possible grâce au « double

outil » de dosage dont nous disposons, HPLC et dosage immunoenzymatique.

Après avoir vérifié la stabilité du PVA après la mise en gel, nous avons mené une série

d’études au cours desquelles le gel est déposé sur des échantillons de peau, disposées sur des

cellules de Franz. Comme cela a été décrit dans la littérature [voir Annexe1 ou Schaefer,

1982] on peut utiliser dans les études in vitro de diffusion à travers la peau, une ou plusieurs

ou l’ensemble des couches cutanées (stratum cornéum ou couche cornée, épiderme, derme).

Etant donné que le rôle de barrière de la peau est assuré principalement par le stratum

cornéum (couche la plus superficielle de l’épiderme) et à moindre mesure par l’épiderme,

nous avons choisi, en règle générale, de ne tenir compte que de ces 2 couches et de retirer le

derme, couche très épaisse, afin d’être sur d’avoir des quantités mesurables dans le liquide

recepteur. Après 24 heures de contact, on dose le PVA (HPLC) et la CD (dosage

immunoenzymatique) dans le stratum cornéum, l’épiderme et le liquide récepteur situé sous la

peau dans la cellule de Franz.

La première étude, décisive pour la suite des opérations, comparait 3 gels aqueux : le

premier contenant le complexe γCD/PVA (stable mais insoluble dans l’eau et solubilisé par

du Tween 80), le second contenant le complexe Rameb/PVA et le troisième le PVA seul,

solubilisé par du Tween 80. Le dosage du PVA dans le stratum cornéum, l’épiderme et le

liquide récepteur a montré que la complexation par la Rameb provoquait une augmentation

très significative de la quantité de PVA dans la peau alors que la complexation par la γCD n’a

pas cet effet. Ces résultats s’accordent avec l’hypothèse émise par l’équipe de T. Loftsson

[Màsson, 1999] dans leurs efforts pour expliquer le rôle de promoteur d’absorption des CD, et

qui montre la CD comme un vecteur qui agit en solubilisant les principes actifs lipophiles et

permet leur diffusion du milieu aqueux extérieur vers la couche cornée puis l’épiderme. Avec

le complexe γCD/PVA, insoluble dans l’eau, on n’observe pas d’effet promoteur d’absorption

de la CD. Toutes les études suivantes ont été réalisées avec le gel de Rameb/PVA et un gel de

référence (PVA sans CD). Dans un souci de variété nous avons aussi testé une solution

126

huileuse de PVA comme référence. Les résultats ont confirmé une nette augmentation de la

pénétration du PVA avec le gel contenant le complexe Rameb/PVA par rapport au PVA libre,

qu’il soit sous forme de gel aqueux ou de solution huileuse.

Dans une expérience, et une seule, nous avons utilisé les 3 couches cutanées c’est à dire

stratum cornéum, épiderme et derme. Les résultats ont montré alors qu’après 24 heures

aucune trace de PVA n’est retrouvé dans le liquide récepteur. Cela ne signifie pas que celui-ci

ne pourrait pas éventuellement passer dans le sang puisqu’in vivo le derme est traversé par de

très petits vaisseaux sanguins. Cela signifie que le PVA ayant atteint le derme y est stocké ou

y diffuse très lentement. Théoriquement donc le PVA pourrait se trouver en contact avec ces

petits vaisseaux sanguins, mais là encore il reste à prouver qu’il pourrait passer la membrane

constituant les vaisseaux.

Nous avons aussi pu en apprendre plus sur le comportement de la cyclodextrine dans la

peau. Tout d’abord la CD pénètre en quantité très significative, mais faible par rapport à la

quantité initiale déposée car, comme le PVA, elle est confrontée à la barrière du stratum

cornéum. Les résultats de dosage d’une étude comparant le gel Rameb/PVA à un gel

contenant la CD seule indiquent que celle-ci a le même comportement qu’elle soit appliquée

sous forme complexée ou sous forme libre. En effet, les quantités retrouvées dans la peau ne

sont pas significativement différentes. Ceci signifie soit que le complexe a les mêmes

propriétés physico-chimiques que la CD seule, ou bien que le complexe se dissocie très tôt,

dans les premières couches de l’épiderme. Pour comprendre de quelle façon la CD influence

la pénétration du PVA, nous avons réalisé une étude opposant le gel contenant le complexe

Rameb/PVA à un gel contenant un mélange physique de Rameb et PVA, sous formes libres. Il

en résulte une pénétration significativement plus importante avec le complexe. La

solubilisation du PVA par la CD est donc essentielle pour améliorer l’absorption du PVA. Ce

résultat était attendu puisque l’on sait déjà qu’un complexe insoluble n’est pas efficace.

Il a longtemps été décrit que le pouvoir de promoteur d’absorption des CD était dû, tout

comme leur pouvoir hémolytique, à leur aptitude à capter le cholestérol des membranes

biologiques. Ceci est vrai mais ne concerne que les CD vides et non les complexes.

Toutefois si la constante d’association du complexe est plus faible que l’affinité du

cholestérol pour la cavité de la cyclodextrine, alors il y aura dissociation du complexe, et la

CD et le principe actif diffusent dans la peau en fonction de leur propriétés respectives. Afin

de déterminer plus précisément à quel stade se fait la dissociation du complexe, nous avons

utilisé le rapport [Rameb]/[PVA], [Rameb] et [PVA] correspondant aux concentrations

127

molaires, calculé pour les 3 expériences où la CD est dosée. Ce rapport est initialement de 10

dans la solution et donc dans le gel, puisque l’obtention d’un complexe stable nécessite la

présence de 10 équivalents de Rameb pour un équivalent de PVA. En solution il y a un

échange rapide entre la PVA libre et complexé, mais après la mise en gel ce n’est plus le cas

et donc 9/10 de la CD se trouve sous forme libre. Si l’on admet que la CD a le même

comportement dans la peau qu’elle soit sous forme libre ou complexée au PVA, ce qui a été

démontré en comparant la pénétration de la Rameb après application du complexe et d’un gel

de CD libres, alors toute variation du rapport [Rameb]/[PVA] dans la peau indique que l’une

des deux espèces passe plus vite et donc qu’il y a eu dissociation. Ce rapport reste proche de

10 dans le stratum corneum mais subit d’importantes variations dans l’épiderme et le liquide

récepteur.

Malheureusement, les chiffres dans les 3 expériences sont très disparates, leurs écart-

types importants et aucune tendance majeure ne ressort. On ne peut donc pas savoir quelle

espèce pénètre plus rapidement. La seule vraie conclusion qui en ressort est que le complexe a

effectivement été dissocié. Dans l’étude de pénétration sur peau totale, c’est à dire en présence

du derme, aucune trace de PVA n’est retrouvé dans le liquide récepteur, alors qu’une faible

fraction de la quantité de CD passe le derme et est donc susceptible d’atteindre les vaisseaux

sanguins. Le derme est constitué d’un ensemble de cellules, nerfs, fibres noyés dans une phase

mucopolysaccharidique aqueuse. La Rameb, hydrosoluble et amphiphile, peut donc

facilement diffuser au travers alors que le PVA, lipophile, ne traverse pas cette couche épaisse

et y est stocké comme dans un réservoir ou métabolisé.

L’ensemble de ces résultats n’amène pas une preuve formelle de la dissociation du

complexe dans la peau mais fournit assez de raisons pour le soupçonner fortement. La limite

nous est imposée par les techniques disponibles à l’heure actuelle. En effet, il n’existe pas de

technique de dosage permettant de différencier la forme libre de la CD du complexe.

L’immunologie ne nous permet que de doser la CD libre car la liaison de l’anticorps sur la CD

provoque la dissociation du complexe. En effet les constantes de complexation (de l’ordre de

103) sont largement inférieures aux constantes d’association anticorps-antigène (jusqu’à 1012).

[Créminon, 1994]

En regardant le comportement de la Rameb dans la peau et son influence sur la

pénétration du PVA, on peut se demander ce que l’on observerait avec une CD encore plus

amphiphile et donc ayant plus d’affinité pour les membranes biologiques. Notre choix s’est

porté sur un dérivé de cholestéryl-cyclodextrine (une CD monofonctionnalisée par une

128

molécule de cholestérol). En effet il a été montré que les cholestéryl-cyclodextrines (CD-chol)

possédaient de remarquables propriétés d’interaction avec les membranes biologiques. Nous

espérons, en utilisant une βCD-cholestéryl modifiée de façon à augmenter son hydrophobicité,

pouvoir préparer des nanoparticules capables d’être chargées en PVA, et étudier leur

pénétration dans la peau.

129

CHAPITRE 2

130

3.3 CHAPITRE 2

INTRODUCTION

Un grand nombre de CD chimiquement modifiées ont été synthétisés afin d’améliorer

ou modifier certaines propriétés de ces molécules hôtes [Wenz, 1994].

Notre attention s’est portée sur les CD amphiphiles, qui sont obtenues en ajoutant un

ou plusieurs groupements hydrophobes. De tels composés peuvent s’insérer dans des systèmes

lipidiques tels que les membranes naturelles ou artificielles grâce à leur partie hydrophobe.

Les CD modifiées appelées « bouquets » (Fig. 21a), portant plusieurs chaînes polyoxyéthylène

ou polyméthylène sur la face primaire et la face secondaire de la CD, ont montré qu’elles

s’incorporaient en grande quantité dans différents types de vésicules lipidiques de DMPC ou

de lécithine d’œuf. Il apparaît que leur mode d’incorporation dans les bicouches n’est pas

unique et rassemble différentes positions allant de transmembranaire à hémimembranaire

[Jullien, 1993]. De nombreux exemples d’auto organisation de CD amphiphiles portant des

chaînes hydrophobes sur une ou deux faces ont été rapportés, que ce soit une organisation en

multicouches ou monocouches stables à l’interface air/eau ou des films de Langmuir-Blodgett

[Parrot-Lopez, 1992 ; Tchoreloff, 1995].

Figure 21. Représentation shématique de a) CD « bouquet » b) CD « bilboquet » c) insertion de la βChol dans une bicouche lipidique

Kawabata et coll. [Kawabata, 1988] ont utilisé la per(6-dodecylamino-6-deoxy)-βCD

et la per(6-alkylsulfonyl-6-deoxy)-βCD pour former des films de Langmuir-Blodgett stables.

a b c

131

Ils ont montré que la couronne de la cyclodextrine se place parallèlement au film alors que les

chaines alkyles lui sont perpendiculaires. Les auteurs se sont ensuite intéressés à la formation

de ces mêmes films avec des complexes d’inclusion composés de la per(6-dodecylamino-6-

deoxy)-βCD et d’azobenzène (hôte). Ils ont rapporté des observations corroborant le fait que

l’azobenzène retrouvé dans le film de Langmuir-Blodgett est inclus dans la cavité de la CD et

peut même dans ces conditions subir une isomérisation cis-trans parfaitement réversible, ce

qui n’est pas le cas lorsque la molécule s’insère seule dans le film [Tanaka, 1987 ; Yabe,

1988]. Dans le même esprit, Taneva et coll. [Taneva, 1988] ont utilisé les dérivés (6-déoxy-6-

hexadecylamino) de l’αCD, la βCD et la γCD et étudié leur association avec le cholestérol

lors de la formation de monocouches mixtes (à l’interface air/eau) montrant que dans un cas,

le dérivé γCD, le cholestérol entrait dans la cavité de la CD alors qu’avec les dérivés βCD et

αCD le cholestérol ne s’inclue pas et se place, dans la monocouche, entre les chaînes alkyles

greffées sur la CD.

Plus récemment, il a été démontré que l’incorporation dans les membranes peut se

faire aussi avec des dérivés amphiphiles monosubstitués. Les molécules « cup and ball » ou

« bilboquet » (Fig. 21b) obtenues par substitution nucléophile, sur la face primaire de la βCD,

avec une diamine alcane N-protégée par un groupement volumineux (tert-butyloxycarbonyl) à

l’extrémité, pour éviter l’auto-inclusion de la chaîne, peuvent s’incorporer dans des systèmes

organisés tels des vésicules phospholipidiques et garder leur propriétés d’inclusion [Lin,

1998]

132

D’un autre côté, la substitution linéaire par un cholestérol donne des molécules

possédant de très bonnes propriétés d’incorporation dans les membranes phopholipidiques.

Ceci a été obtenu avec le dérivé 6-(cholest-5-en-3β-ylamido)succinyl-amino-6-

deoxycyclomaltoheptaose, ou Chol-βCD (Fig. 22b), et pour lequel la présence du bras

espaceur (succinyl) entre la CD et le cholestérol est essentielle pour donner de la souplesse au

composé et éviter la désagrégation de la membrane. L’incorporation des Chol-βCD dans une

membrane modèle de DMPC se fait préférentiellement les unes près des autres créant ainsi

deux phases séparées et thermodynamiquement stables au sein de la bicouche (Fig. 21c). Par

la suite, la méthylation en position 2 et 6 de la partie cyclodextrine de ces composés a permis

d’obtenir des dérivés solubles dans l’eau (Chol-Dimeb, Fig. 22a) car ils ont la propriété de

s’auto-organiser spontanément en milieu aqueux pour donner des micelles composés de 24

unités. Ces micelles parfaitement sphériques, sont tapissés à la surface par les CD et

conservent les propriétés d’inclusion de la cavité de la CD. [Auzély-Velty, 1999 ;2000 ;2001]

Figure 22. Structures de a) Chol-Dimeb b) Chol-βCD “avec bras” c) Chol-βCD “sans bras”

6

ONH

HOHO O

OH

HOOHO

O

CHMe2

COO

Me

Me

6

ONH

HOO

OM e

HOOMeO

O

CHM e2

NH

Me

Me

COCO

MeO

6

ON H

HOHO O

O H

HOOHO

O

CHM e2

NH

Me

Me

C OCO

a) b)

c)

133

Par la suite, de nombreuses études ont montré que des cyclodextrines amphiphiles

pouvaient former des nanoparticules (nanosphères et nanoparticules) stables. Ainsi, les CD

appelées “CD à jupes” (ou “skirt-shaped CD”) sont préparées à partir d’αCD, de βCD et de

γCD en greffant sur les hydroxyles de la face secondaire des chaines carbonées de longueurs

variables (C2-C14). Insolubles dans l’eau, elles possèdent des propriétés de tensio-actifs et

peuvent facilement donner naissance à des nanoparticules, comme cela a été montré avec la

βCD-C6, la βCD-C12, la βCD-C14 et la γCD-C6 par Skiba et coll. [Skiba,1993 ; Skiba,

1996 ; Duchêne, 1996]. En fonction de la technique de préparation, on peut obtenir au choix

des nanosphères ou des nanoparticules. Pour les nanosphères on utilise le plus souvent la

nanoprécipitation qui consiste à dissoudre la CD dans un solvant miscible à l’eau (éthanol,

acétone), à injecter la solution dans l’eau puis à retirer le solvant par évaporation sous vide, ce

qui donne spontanément des agrégats. Dans ces conditions, on obtient avec les 3 CD citées

précédemment des nanosphères dites blanches (car non chargées en principe actif)

parfaitement stables et donc ne nécessitant pas l’ajout d’un tensioactif supplémentaire

(stabilisant). Notons que l’on utilise une technique légèrement différente lorsque l’on est

obligé d’utiliser un solvant non miscible à l’eau pour dissoudre la CD, comme ce fut le cas

avec la γCD-C6. La méthode reste la même mais, dans ce cas précis, il n’a pas été possible de

se passer de tensioactif (Pluronic F68) pour obtenir des nanosphères stables. Dans le cas des

nanocapsules, la phase lipophile constituée de la CD amphiphile et d’une huile (Myglyol 812

ou benzyl benzoate) est dissoute dans l’acétone et ajoutée sous agitation à la phase aqueuse.

Les nanocapsules se forment spontanément et l’acétone est retirée par évaporation sous vide.

Il est possible de charger ces nanoparticules en principe actif (p.a), qu’il soit lipophile

ou hydrophile en le dissolvant dans la phase organique ou aqueuse, respectivement. Dans le

cas des nanosphères, le p.a peut se situer dans la matrice de CD, adsorbé en surface ou encore

dans la cavité de la CD. Pour les nanocapsules, la CD joue le rôle de barrière extérieure et le

p.a est dissout dans l’huile contenue à l’intérieur. Ainsi, plusieurs p.a, hydrophiles ou

lipophiles, ont été encapsulés avec succès dans les CD-jupes : dans des nanosphères, la

doxorubicine (chlorydrate hydrophile), jusqu’à 40% w/w en présence d’un tensioactif [Lechat-

Leroy,1995] et la progestérone (lipophile) jusqu’à 80% w/w en présence de Pluronic F68

[Lemos-Senna, 1998b]. Dans des nanocapsules, en présence de Pluronic F68,

l’indométhacine, la progestérone et l’amphotéricine B ont été encapsulés avec à l’arrivée un

contenu en principe actif de 21.6 % w/w, 7.5 % w/w et 11 % w/w respectivement [Skiba,

1996].

134

Citons aussi les travaux de Ravoo, Darcy et Mazzaglia concernant des βCD

substituées par des groupements aminos et carboxyméthyls sur les faces primaires et

secondaires respectivement (donc une charge positive sur la face primaire et une charge

négative sur la face secondaire) et aboutissant à la formation d’agrégats supramoléculaire dans

l’eau, d’un diamètre inférieur à 300nm et d’environ 20µm de long [Ravoo, 2001].

Nous allons tout d’abord présenter, dans ce deuxième chapitre, de nouveaux résultats

obtenus avec la Chol-Dimeb (Fig. 22a) et concernant son inclusion dans des membranes

modèles de films noirs. Nous avons en effet préparé des films mixtes phopholipides/CD

amphiphiles afin d’étudier leur structure par la technique de réflectivité des rayons X. Ce

travail, basé sur la technique des films noirs [Bélorgey, 1991 ; Benattar, 1992], a été effectué

en collaboration avec le Dr Jean-Jacques Bennatar et son équipe au Service de Physique de

l’Etat Condensé du CEA Saclay.

Les films noirs sont des bicouches particulières puisque les têtes polaires des

phospholipides ou tensio-actifs qui le constituent sont face à face, séparées par une mince

couche d’eau. Ces films sont formés en remontant lentement un cadre métallique plongé dans

une solution de tensio-actifs. Le film se forme entre les extrémités du cadre et s’amincit au fur

et à mesure que l’eau présente à l’intérieur s’écoule (Fig. 23). En dessous de 500 Å, le film est

dit « noir », bien que tout à fait transparent, car il ne réfléchit plus la lumière. La technique de

réflectivité des rayons X consiste à mesurer l’intensité du faisceau de rayon X réfléchie par le

film en fonction de l’angle d’incidence du faisceau par rapport au film, et permet de

déterminer pour chaque constituant du film la densité électronique, l’épaisseur et la rugosité

interfaciale. Grâce à cette technique, nous avons montré qu’il est possible de former un film

noir de Chol-Dimeb. Ce film est très peu stable mais en ajoutant un phospholipide (DMPC) à

la solution nous avons obtenu un film très stable et dont l’épaisseur est maximale pour un

rapport DMPC/CD de 3. Nous avons montré que la Chol-Dimeb conserve ses propriétés

d’inclusion dans le film et permet de rendre celui-ci accessible à un principe actif. On obtient

donc un film modèle pouvant inclure des molécules hydrophobes et mimant une interaction

possible des CD avec des membranes.

135

Figure 23. Formation d’un film noir

Le second article de ce chapitre est consacré aux dérivés acétylés et donc insolubles

dans l’eau, de la Chol-βCD “sans bras” (Fig. 22c), que nous avons synthétisés dans le but

espéré de former des nanoparticules capables d’être chargées en vitamine A. Pour cela, nous

sommes partis d’une Chol-βCD ne possédant pas de bras espaceur entre le cholestérol et la

cyclodextrine et donc plus rigide. Cette Chol-βCD « sans bras », insoluble dans l’eau et les

solvants organiques, a été décrite par Auzely-Velty et coll. et provoque une désorganisation

des bicouches lipidiques. L’acétylation de ces composés permet de les rendre solubles dans les

solvants organiques. Tout d’abord nous présenterons succinctement la synthèse de ces

composés acétylés et la préparation des nanoparticules recherchées. Nous présenterons les

caractéristiques physico-chimiques de ces nanoparticules, seules puis en présence de vitamine

A. Enfin, seront présentés les premiers résultats d’étude de pénétration sur peau obtenus par

application cutanée d’un gel contenant des nanoparticules chargées en PVA.

écoulement de l ’eau

CH3

C O O

CH3C O O P

O -

O

OO N (C H3)3+

Dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC)

136

Chapitre 2

3.3.1 Article n°4

Direct investigation of the vectorisation of amphiphilic cyclodextrins in

phospholipidic films

I. Javierre, M. Nedyalkov, V. Petrova, J.J Benattar,

S. Weisse, R. Auzély-Velty, F. Djedaïni-Pilard, B. Perly.

J. Colloids and Interface Science (sous presse)

137

Direct investigation of the vectorisation properties of amphiphiliccyclodextrins in phospholipid films

Isabelle Javierre, Mickael Nedyalkov 0, Vera Petkova and Jean-Jacques Benattar0

CEA/Saclay, DSM/DRECAM, Service de Physique de l'Etat Condensé, F-91191 Gif sur Yvette Cedex, France

Sandrine Weisse, Rachel Auzély-Velty0, Florence Djedaïni-Pilard0 and Bruno Perly

CEA/Saclay, DSM/DRECAM, Service de Chimie Moléculaire, F-91191 Gif sur Yvette Cedex, France

Abstract

Recently, new cyclodextrin derivatives have been synthesized and were shown to

exhibit strong amphiphilic properties. In this paper, we study the action of these new

amphiphilic cyclodextrins on phospholipids. Mixed phospholipids / cyclodextrin derivatives

films were prepared and studied using X-ray reflectivity for various phospholipids /

cyclodextrins ratios. A molar ratio of 3 provides a highly stable film which molecular

structure has been investigated in detail. The cholesterol tail of the cyclodextrin molecule was

found to be anchored into the phospholipid film. The cyclodextrin moieties exposed to the

aqueous medium are prone to the addition of the guest molecule Dosulepin, making them of

high interest for drug delivery. For this purpose and as an example of potential application,

this cyclodextrin molecular carrier property is also addressed to this complex film

architecture.Key Words: black films; X-ray reflectivity; cyclodextrins; phospholipids; drug delivery

0 Permanent address: Department of Physical Chemistry of the University of Sofia, 1, bull. "JamesBourchier", 1126 Sofia, Bulgaria.

0 Author to whom correspondence should be addressed. Fax : (33) 169 088 786 Phone : (33) 169 087516 Email : benattar@drecam.saclay.cea.fr

0 Present address: Centre de Recherche sur les Macromolécules Végétales, BP53, 38041 GrenobleCedex 9, France.

0 Present address: Université de Picardie-Jules Verne, Laboratoire des Glucides, 33, rue StLeu, F-80039Amiens, France.

Running title: Black films of phospholipids and cyclodextrins

138

Introduction

Newton Black Films (NBF) consist of two walls of surfactant molecules surrounding

an hydration water core. In contrast to the biological membrane structure, the hydrophilic part

of the molecules face in the center of the film. Since this structure was determined by X-ray

reflectivity1, many experiments have been made with different types of molecules2, 3, 4, 5, 6, 7

The NBF is an appropriate model system for studying the interactions between different

molecules and to build more and more complex mixed structures. With biological compounds

one can successfully model liposome/liposome interaction, inter-membrane interactions and

more specific processes. The present experimental approach uses NBF stabilized by

phospholipids as an artificial target to simulate the action of modified amphiphilic

cyclodextrins.

Recently, using X-ray reflectivity, the internal substructure of various phospholipids

black films has been elucidated with a molecular scale resolution 8: the density profile and the

thickness of the zone occupied either by the aliphatic chains or by the hydrophilic groups were

determined. In particularly, DMPC (dimyristoylphosphatidylcholine) or DOPC

(dioleoylphosphatidylcholine) were found to form very stable films whose lifetime was more

than two days with a well-defined structure.

One challenging problem was then to be able to obtain stable mixed film including a

host biological molecule, i.e. a protein, and to understand its structure. Recently, mixed stable

protein/surfactant (BSA9, bovine serum albumin and C12E6, hexaethylene glycol

monodecylether) films were obtained. A general insertion process was found to form a single

protein layer embedded in the free-standing surfactant bilayers by adjusting the protein

chemical potential in bulk. The use of DMPC instead of C12E6 and Lysozyme instead of BSA

led to the same result, but with a larger variety of behaviors10. In this case, the complexity of

the film structure is magnified by the use of biological molecules for both the film and the

host. Nevertheless, the complexity of these mixed films is now controlled and quite well

understood.

Within the context of this study, we use a DMPC free-standing film as a target for a

cyclodextrin molecule. This cyclodextrin is new and is hydrophobically modified11: namely 6I-

(cholest-5-en-3α-ylamido)succinylamido-6I-deoxy-per(2,6-di-O-methyl)-cyclomaltoheptaose

(chol-DIMEB). An analysis12 of its behavior in aqueous solution using surface tension

measurements and light, small-angle X-ray, and neutron scattering techniques proved that it

self-assembles into monodisperse spherical micelles with an average aggregation number of

139

24. These highly water -soluble micelles have been shown to be two-shell objects, the

cyclodextrin moieties being exposed towards the aqueous medium making them prone to the

inclusion of guest molecules in the cavities.

The association of guest molecules in the aggregates of chol-DIMEB has also been

investigated for different water-soluble molecules13. NMR (Nuclear Overhauser Effect

pumping) demonstrated the binding and spatial proximity for these different guests. Using

small angle X-ray and neutron scattering (SAXS and SANS, respectively) the microstructure

at the supramolecular scale of the modified cyclodextrin (chol-DIMEB) micelle – i.e.

aggregation number, charge and volume- in the presence of guest molecules could be defined.

One of the guests, i.e. the neurotropic molecule Dosulepin, is known to interact

with chol-DIMEB micelles13. This molecule forms inclusion complexes with the native14 and

modified15 β-cyclodextrin and is extensively used as a guest model. The selective interaction

of Dosulepin with cyclodextrin cavities of chol-DIMEB micelles has been clearly evidenced

by Diffusion-assisted NOE-pumping experiments. It has been shown that the aggregation

number of the micelle does not change noticeably upon inclusion of this guest. These results

imply that the packing of the chol-DIMEB into spherical micelles is exceptionally robust.

These studies have clearly demonstrated that the inclusion properties of the CD cavities of

chol-DIMEB aggregated into micelles objects are retained. The stability and specificity of the

mixed micelle involving target molecules, such as Dosulepin, make these hydrophobically

modified cyclodextrins good candidates for molecular carriers. Chol-DIMEB can therefore be

of high interest for the targeting of biologically important molecules and especially for the

delivery of drugs.

Up to now, the mixed cyclodextrin/DMPC system has only been investigated on a

macroscopic scale11, using small-angle X-ray scattering, differential scanning calorimetry and31P nuclear magnetic resonance. The mixed system obtained was a lamellar phase, stable and

monophasic only for specific cyclodextrin/DMPC ratios. There is no model membrane

incorporating native cyclodextrin.

In this study, we have used the freestanding film technique to mimic the cyclodextrin

action on a phospholipid bilayer target. Initially, our aim was to check the feasibility of the

formation of a stable mixed cyclodextrin/DMPC film and to determine its structure at a

molecular scale: namely how cyclodextrin is incorporated into the film and what is the

prevalent interaction. Then we took advantage of the cyclodextrin carrier molecule property

to follow in situ the behavior of an active guest molecule, Dosulepin, trapped in the

cyclodextrin cavities.

140

Materials and methods

Materials

Chol-DIMEB (Fig. 1a) has been synthesized in the laboratory as described

previously12. This molecule is composed of a hydrophobic cholesterol tail grafted onto a

methylated cyclodextrin through a succinyl spacer arm. It looks like a white amorphous

powder, is highly water-soluble, and has a critical micelle concentration12 of (5±2)×10-6M.

The chol-DIMEB concentration was 0.438 mg/ml. BASF Pharma (Valenciennes, France)

kindly provided Dosulepin (Fig. 1b), a water-soluble neurotropic substance. It is a tricyclic

molecule with a positively charged aliphatic tail.

The DMPC lipid, whose chemical formula is given in Fig. 1c, has a zwitterionnic

phosphatidylcholine head and 14 carbons hydrophobic tails. It was purchased from SIGMA

and used without further purification. DMPC dispersions in ultra pure water (Millipore Alpha-

Q) were obtained by sonication with ultrasound (VibraCell 72412, Bioblock Scientific) for 15

minutes at 30°C, which is a higher temperature than the transition temperature of DMPC16

(23°C). From the literature17, it is known that such a procedure leads to suspensions of small

unilamellar vesicles (SUV). In all experiments reported here, the concentration of DMPC in

the film forming solution was 0.5 mg/ml. The suspension was stored at 25 °C and used as

soon as possible (maximum conservation time: 3 days). For the mixed solutions, the DMPC

suspension was poured on the appropriate weighted amount of cyclodextrins and stirred for 30

minutes. For the experiments with Dosulepin, we use the same procedure. A large excess of

guest molecule (0.3mg/ml) was used in order to be sure all the cyclodextrin cavities are

occupied by one Dosulepin molecule0. All the experiments were performed at 25±1°C.

The formation of stable films requires dense packed monolayers of amphiphiles at the

film surfaces18. Phospholipids have very low solubility and the kinetics of monolayer

formation is very slow. In order to estimate the time necessary to form a dense molecule

monolayer, surface tension measurements were performed for pure DMPC and pure chol-

DIMEB solutions, and for DMPC/chol-DIMEB mixtures. Surface tension was measured at

0 The DIMEB/Dosulepin complex formation constant is Kc=4610M-1. If [DIMEB]=1mM and

[Dosulepin]=5mM then [DIMEB/Dosulepin complex]=0.94mM. 94% of the cyclodextrin

cavities should theoretically contain one Dosulepin molecule. See Djedaïni, F., Zhao Lin S.,

Perly, B., Wouessidjewe, D., J. Pharm. Sci., 79, 643 (1990).

141

25°C using the Wilhelmy plate method with a Cahn 1000 balance (Ankersmit, U.S.A.). As

shown in Fig. 2, the surface of the solution is saturated with amphiphilic molecules after

approximately 15 h for dispersions of DMPC and 25 h for chol-DIMEB solutions. Then,

surface tension reaches a constant value, 40 mN/m for chol-DIMEB and 30 mN/m for DMPC.

These values are in agreement with previous reports12, 19. For the DMPC/chol-DIMEB

mixture, we observe two steps in the adsorption process. After 15h, a first plateau occurs at 30

mN/m, then the surface tension continues to decrease to a second constant value, 24 mN/m,

which is reached after 25h saturation. However, whereas the value of the first plateau of this

curve corresponds to the value obtained for pure DMPC, the kinetics strongly differs during

the first 6 hours: with pure DMPC, the initial value of surface tension is 60 mN/m when with

the mixture, this initial value is equal to that for pure chol-DIMEB. This change could be

linked to the higher hydrophobicity of the cyclodextrins: at the beginning of the experiment,

the cyclodextrins will partially diffuse to the surface first, then DMPC molecules, which are

more hydrophilic, will reach the surface. The lower value obtained for the surface tension of

the mixed solution indicates that the monolayer is mixed ,i.e., DMPC/chol-DIMEB

monolayer.

Because of the long saturation times, all the experiments were undertaken inside a

sealed box to maintain water vapour saturation. First, we study the pure DMPC and pure chol-

DIMEB films separately, and then mixed films with various DMPC/chol-DIMEB molar

ratios. The (3 : 1) molar ratio of DMPC/chol-DIMEB film experiments will be described in

detail.

X-ray reflectivity technique

The macroscopic vertical films are withdrawn from the cyclodextrin/DMPC mixtures

by lifting a rectangular metallic frame at a slow constant rate. The geometry of the frame is

described elsewhere6 and enables reflectivity measurements to be made at extreme grazing

incidence in the range 7-60 mrad. The minimum incident angle (7 mrad) is only limited by the

size of the meniscus.

The experiments were performed using a high-resolution diffractometer (Nonius,

Optix) described elsewhere20, 21. A copper tube is used as an X-ray source (λ = 1.5405 Å,

(CuKα1 line)). A reflectivity experiment enabled us to measure the ratio R(θ) = Ι(θ)/I0 at

142

various incidence angles θ, between the intensity I0 of the incident beam0 and that Ι(θ)

reflected by the film.

The specular reflectivity is recorded and provides access to the electron density

profile1 along the film normal. As described elsewhere22 and because it is not possible to

directly invert the reflectivity data, we consider the film as a succession of homogeneous

chemical slabs and fit the data with a least-square procedure. Each slab corresponds to a

specific part of the film8 assuming that the molecules stay side-by-side and form a bilayer. For

example, two external slabs would represent the hydrophobic tails, two other slabs would

stand for the polar heads and a fifth slab would correspond to the hydration central layer. Each

slab is characterized by its specific thickness and electron density (noted δ hereafter). In the

real film, the discontinuities between the different part of the bilayer are not so abrupt but are

smoothed using another parameter, the interfacial roughness (variable but identical for each

interface). This roughness accounts for the thermal fluctuations but it is not likely to exclude

the possible influence of additional intrinsic molecular disorder. As it is not easy to

distinguish the two possibilities, a good approximation is to consider the roughness identical

for each interface.

For each slab, the interfacial film roughness, the thickness and density can be derived

from the experimental reflectivity profile through the use of an optical formalism23. The fits of

the experimental reflectivity curves are made using “Parratt 32” software0.

It should be point out that the accuracy of the reconstructed density profile strongly

depends on the homogeneity of the film and on the agreement between the slab model and the

chemical structure of the film. In the present case, it is not be possible to obtain perfect fits

since all the reflectivity profiles are slightly modified by a weak thickness distortion.

We attempt to describe the mixed film using the symmetrical five-slab model.

However, when the experimental accuracy is lower (i.e. short lifetime of the film or disorder

in the film), we use a simpler model, 1- or 3- box model.

NMR Techniques1H-NMR experiments were performed at 500.13 MHz using a Bruker DRX500

spectrometer with a 5 mm reverse broad-band z-axis gradient probe. In all cases, the sample

(10mM of DIMEB and Dosulepin) was prepared in deuterium oxide and measurements were

0 I0 is measured by placing the detector directly at zero incidence, in absence of the frame. A

calibrated aluminum absorber intercalated in the beam path protects the detector.

0 1997-2001 Christian Braun, Hahn-Meitner-Institut

143

performed at 25 °C under careful temperature regulation. NMR spectra were collected using

16 K data points. Chemical shifts are given relative to external tetramethylsilane (TMS = 0

ppm) and calibration was performed using the signal of the residual protons of the solvent as a

secondary reference. 2D experiments were obtained using modified pulse programs available

from the Bruker library. These experiments were run using 2K data points and 512 time

increments. The phase-sensitive (TTPI) sequence was used and processing resulted in a

1K*1K (real-real) matrix. All NMR data was further processed and plotted using the

XWINNMR program (Bruker Analytische Messtechnik) on an INDY workstation (Silicon

graphics).

Results

Pure DMPC films

A DMPC Newton Black Film was formed after one night surface saturation and was

stable for over two days. The reflectivity curve was recorded when the film reached its

equilibrium thickness. As described in a previous paper8, the data were analyzed using a least-

squares fitting procedure with a five-layer model: this model was partly imposed by the shape

of the curve and also took into account the chemical constraint of the DMPC molecule. The

calculated density profile, shown in the inset of Fig. 3, presents large contrasts between the

different part of the film, and originates in the specific DMPC interference fringes. The

overall thickness of the film is 58 ± 1 Å. Similarly as obtained in ref. 8, the first slab whose

thickness is 13.1 Å (δ=2.3×10-6) is allocated to the hydrophobic tails. The intermediate layer

corresponding to the hydrophilic part of the molecules has an extension of 11.5 Å

(δ=3.8×10-6). The thickness of the central core is 8.8 Å (δ=2.7×10-6). The high value of the

electron density of intermediate layers evidences the presence of water hydration molecules

whereas the low value of δ in the central core indicates that only the choline group occupies it.

The value of the interface roughness between these sublayers is 3 Å.

Pure chol-DIMEB films

In spite of the chol-DIMEB amphiphile properties, it was extremely difficult to

form stable film made of these molecules, even if the concentration in the bulk (0.438 mg/ml)

was fifty times the cmc. After 25 hours waiting time for surface saturation, the chol-DIMEB

film drainage is instantaneous and the film reaches its equilibrium thickness. The lifetime of

144

the film was unfortunately less than 1 h. The low accuracy of the reflectivity data recorded for

this film (see Fig. 4) does not allow any detailed structural information. Nevertheless, the

position of the first minimum of the reflectivity curve enables us to determine the wide

thickness of the film (solid line in Fig. 4) through the use of a 1-layer model. The total

thickness is 54 ± 1 Å. In this film, the interface roughness is 3.6 Å.

Mixed DMPC/chol-DIMEB films

Mixed DMPC/chol-DIMEB films were studied with various DMPC/chol-DIMEB

molar ratios R varying from R=∞ to R=0 (R=∞: pure DMPC dispersion, R=0: pure chol-

DIMEB solution). The different thickness of the film extracted from the reflectivity curves

collected for various ratios are reported on Fig. 5. This curve has a bell shape and exhibits a

maximum of thickness (75 ± 1 Å) for the molar ratio 3. From R=∞ (pure DMPC film) up to

R=3, the thickness film rises from 58 ± 1 Å to 75 ± 1 Å as the chol-DIMEB proportion in the

film increases. This rise coincides also with a high stability of the mixed film (more than two

days). If we continue to add chol-DIMEB (from R=3 to R=0), the thickness decreases to 56 ±

1 Å and the film becomes more and more unstable. For the different ratios (R<3 and R>3)

(results not shown in this paper), the shape of the reflectivity curves are quite similar with the

same level of intensity. In contrast, for R=3, the reflectivity curve exhibits a maximum of

intensity and a specific modulation of the Kiessig fringes. This clearly indicates that for this

particular ratio, there are some molecular rearrangements within the film that yields a specific

film structure.

The solid line in Fig. 6 represents the best fit obtained for the film of maximum

swelling. As for DMPC data, a five-layer model was used to fit the experimental data. The

validity of this model will be discussed in the next section. We found an overall thickness of

75 ± 1 Å. A highly modulated electron density within the film (inset of Fig. 6) could be

detected, with, in particular, a very low electron density (δ=2×10-6) in the central core, which

may evidence the absence of any water molecule in this layer of the film. In comparison with

a pure DMPC film, the 15 Å thickness increase observed should therefore be only due to the

mixed structure of the film. A thickness of 13.4 Å was measured for the external layer and of

11.4 Å for the intermediate layer. The central core is 25.5 Å thick. However, the low value of

roughness (3 Å) may support the hypothesis of a homogeneous structure.

Mixed DMPC/chol-DIMEB films including Dosulepin guest molecule

145

Another component (Dosulepin) was added to the previous mixed DMPC/chol-

DIMEB film (ratio R=3). After at least 30h surface saturation, a black film was formed and it

remained stable over 1 day. Fig. 7 shows the corresponding reflectivity profiles of mixed films

with and without Dosulepin. The spectacular shift of the position of the first minimum

towards small angle wave vectors indicates that Dosulepin is included into the film since the

film thickness is changed and thus its internal structure is modified. It was difficult to interpret

the reflectivity data in terms of layer model, because of the film inhomogeneity as well as the

complexity of the system. However, using a single-layer model, the overall thickness of the

film could be obtained: 100 ± 1 Å. To verify that the thickening observed was only due to

Dosulepin/chol-DIMEB complex formation, a test experiment was carried out. A mixed

Dosulepin/DMPC film was formed with the concentrations 0.3 mg.ml-1 / 0.5 mg.ml-1 vs/vs

Dosulepin/DMPC keeping constant the molar ratio (R = 3). The reflectivity curve is presented

in the inset of Fig. 7. The position of its first minimum coincides with the first minimum of

the pure DMPC curve. Consequently, the Dosulepin molecule should not disturb the DMPC

bilayer arrangement. This qualitatively confirms that the thickening of the DMPC/chol-

DIMEB/Dosulepin mixed film mainly originates in Dosulepin/chol-DIMEB interactions

which probably lead to complexes formation.

Discussion

For the pure chol-DIMEB black film, only one order of the Kiessig fringe is visible in

the reflectivity curve. We were not able to obtain the film structure from the electron density

profile extracted from the low quality reflectivity profile. However, using the knowledge of

the chemical structure of the film-forming molecules and bearing in mind the surfactant

properties of this molecule12, a molecular bilayer arrangement within the film can be

logically suggested (see Fig. 8). The chol-DIMEB molecules have their cavities facing each

other in a central layer of the film whereas the cholesterol moieties are oriented towards the

air. Moreover, the whole thickness found for the inverted black film (54 Å) is in agreement

with the radius of the chol-DIMEB direct micelle (25 Å) observed by Auzély-Velty et al.12

Because of the rather low accuracy of the reflectivity data, it is difficult to estimate a number

of water hydration molecules per chol-DIMEB head group.

146

In another respect, it should be pointed out that a β-cyclodextrin derivative film

structure has already been investigated24 for β-cyclodextrins deposited on silicon wafers. The

β-cyclodextrins film exhibited poor in-plane ordering, mostly due to the corona 7-fold

symmetry, which created holes within the whole surface. Even if, in our case, the β-

cyclodextrin molecule is oppositely grafted and chemically modified, the 7-fold symmetry

molecule remains. Therefore, the presence of intrinsic holes within the bilayer could be

expected and could explain the poor stability of the film over a long period of time.

However, we observed that the stability is considerably increased by addition of

DMPC molecules to the chol-DIMEB film, particularly when the film is composed of 3

DMPC molecules for 1 chol-DIMEB molecule. Furthermore, the thickness of the film is

maximum for this ratio. This striking stability should be linked to a specific molecular

arrangement within the film interfaces. To reproduce the experimental reflectivity data of the

mixed film, a symmetrical five-box model was necessary and, as for the DMPC experiments8,

was imposed by the shape of the curve. The third fringe of the reflectivity curve is intensively

reduced compared with the second fringe (see Fig. 6) but their widths and intensities are

strongly correlated, as demonstrated during the fitting tests. Parameters combining very low

electron density for the central layer and rather high density for the intermediate layers gave

better agreement between the experimental recording and fitting curves. For pure DMPC, the

use of the five-layer model8 was one of the best way to account for the specific shape of the

DMPC reflectivity curve, and in particular the strong reduction of the intensity of the second

fringe. To fit the mixed film, we first supposed that the structure of the DMPC film was only

partially perturbed by the presence of cyclodextrins and we started the fitting procedure with a

five-layer model. (We also tested 1- and 3-box models, but they did not correspond to the

observed data: the simulated reflectivity curves are too regular.) However, the main difficulty

was to reproduce both the very low intensity of the third fringe and the high intensity of the

first fringe. During the fitting process, we attempted to use different five-layer models or even

a seven-layer model in order to correlate the chemically possible constraint of this mixed film

with the experimental reflective intensity. The fitting curve presented in Fig. 6 does not

perfectly reproduce the experimental data. Nevertheless, it corresponds to the best

compromise between a fit which correctly describes the third fringe correlated with the two

first ones (see Fig. 6) and a fit which correctly describes the two first fringes but not the third.

The unique differences between these two fitting curves were not in the thickness of the

different slabs but in the density values of the third layer. This fit quality is reduced due to

weak thickness inhomogeneity over the whole film: the two surfaces of the film are not

147

strictly parallel. This should affect the structure of the film so that it seems likely that no

plausible model could account for this disagreement. Nevertheless, in the microscopic scale,

the structure of the film could quite self-reliantly be determined. The electron density value of

2×10-6 evaluated for the central layer of the mixed DMPC/chol-DIMEB film is in the same

range as that extracted from the pure cyclodextrin film. The central thickness (25.5 Å) is

comparable to the size of the cyclodextrin cavity ( 2 × 11 Å)13. Hence, in the mixed film, the

central core should consist of the cyclodextrin cavities facing each other (see Fig. 9). We keep

for the intermediate and external layers a structure similar to that of DMPC : the electron

density profile acquired for the mixed film has the same shape and is in the same range as that

obtained for the pure DMPC. Moreover, the ratio of the electron density of the intermediate

layer to that of the external layer is quite similar in each case (respectively 1.35 for the mixed

film and 1.43 for the pure DMPC). In the mixed case, the values may be lower because we

have to take into account the steric arrangement of 6 DMPC tails (3 DMPC molecules) around

the grafted cholesterol and the covalent succinyl bond. The surface12 covered by 1

cyclodextrin cavity ring (295 Å2) roughly corresponds to the additional surface of a

cholesterol tail (120 Å2) and 3 DMPC molecules (55 Å2/molecule). Additional experiments0

show that the presence of a cholesterol molecule in pure DMPC film, in the same molar ratio,

did not provoke significant changes in the film thickness or in the density profile. Therefore,

in the mixed film the head of chol-DIMEB provides a specific molecular architecture

responsible of the very high stability. Indeed, owing to the film structure shown in Fig. 9

derived from the electron density profile, it appears the chol-DIMEB insertion process in the

DMPC bilayers can be reduced to a DMPC/cholesterol interaction. The condensing effects of

cholesterol on the physical properties of lipid bilayers have been studied extensively by a

variety of experimental methods25, 26, 27. The cholesterol is known to be a regulator of

membrane ordering28 and to increase the rigidity of lipid bilayers29. However, up to now, what

remains unexplained is the specific molar ratio that leads to the stability in our film. As

previously observed11 : a DMPC/chol-DIMEB lamellar phase was found to be stable for a

molar ratio of 3.6, which remains in the same range as those observed with our black film.

0 Reflectivity curves of pure DMPC and of DMPC/cholesterol mixture were recorded in the

same conditions as for the other experiments. The position of first minimum is the same for

both curves; this suggests that the cholesterol molecule does not significantly disturb the

DMPC film structure.

148

Even if the mixed film structure described above seems to correctly reproduce the real

molecular arrangement within the film, one may wonder if the hydrophobic DMPC tail could

not be short enough to penetrate the hydrophobic cyclodextrin cavity. On the basis of an NMR

analysis upon α-cyclodextrin(α-CD)/phospholipids complexes, it was shown30 that the main

factor governing any interaction between α-CD and lipids was the electrostatic properties of

the lipid headgroup. Fortunately, the interaction was less efficient for the PC headgroup and

the chain inclusion was mostly favored in the bulk phase (aqueous lipid suspension) than in

planar bilayer geometry. One may suppose that these properties remain valid in our case (i.e.

the chain inclusion should be sterically unfavorable). Moreover, it has been already

demonstrated that formation of inclusion complexes between cyclodextrins and phospholipids

can occur31.

The evolution of the reflectivity data (see Fig. 7) upon addition of an active drug

(Dosulepin) suggests another specific molecular arrangement within the film, mostly through

Dosulepin/chol-DIMEB complexes formation as previously mentioned in the Results section.

Assuming the above described mixed DMPC/chol-DIMEB film structure (Fig. 9) is reliable,

we can imagine this four-component-film schematically as being formed by a central layer

gathering the cyclodextrin cavities, each of them holding a Dosulepin molecule, embedded

between two external walls composed of cholesterol/DMPC mixtures, standing for the

“biological” membrane0. Hence, the overall thickness increase should be mostly related to

partial Dosulepin inclusion inside the cyclodextrin hydrophobic cavity. The charged aliphatic

chain remains outside the cavity.

In order to better understand the behavior of the model guest towards the chol-DIMEB

in the mixed DMPC/chol-DIMEB film, we have investigated by 1H-NMR the conformation of

the inclusion of the Dosulepin in DIMEB in aqueous solution. Inclusion in DIMEB is

evidenced by modification of the spectrum of the host molecule as already described13 but no

conformational analysis of Dosulepin/DIMEB inclusion complex has been reported. Further

NMR experiments were performed to investigate the geometry in solution of this inclusion

complex. The T-ROESY sequence is used to prove the interaction of protons of the host and

guest molecules32. As found in many other situations regarding inclusion complexes in water,

0 The DIMEB/Dosulepin complex formation constant is Kc=4610M-1. If [DIMEB]=1mM and

[Dosulepin]=5mM then [DIMEB/Dosulepin complex]=0.94mM. 94% of the cyclodextrin

cavities should theoretically contain one Dosulepin molecule. See Djedaïni, F., Zhao Lin S.,

Perly, B., Wouessidjewe, D., J. Pharm. Sci., 79, 643 (1990).

149

a 300ms spin lock was selected. All non-diagonal peaks are indicative of spatial proximity

between protons. Complex formation was demonstrated by the presence of strong dipolar

cross peaks between protons located in the cavity (H3 and H5) of DIMEB and aromatic

protons of Dosulepin. No other cross peak was observed between protons of Dosulepin and

DIMEB, thus precluding interaction of aliphatic chain with the DIMEB cavity.

Nevertheless, this peculiar Dosulepin/chol-DIMEB complexion is not able to explain

the 25 Å thickness increase (the largest theoretical0 size of the molecule is not more than 9 Å).

The presence of charged molecules and counter-ions in black films modifies the electrostatic

double-layer and entropy confinement forces which results in an increase of the aqueous

interstitial core thickness. Dosulepin is a charged molecule and its presence within the film

could entail this increase. Moreover, this electrostatic repulsion combined with a steric

interaction could be involved in the thickness increase. Besides, neither a five-box model nor

a seven box-model was able to correctly reproduce the experimental reflectivity profile since

very complex interactions could occur in the center of the film.

Conclusion

The present study emphasizes that the X-ray reflectivity technique is sensitive enough

to detect slight molecular changes in Newton Black Film. The effect promoted by inclusion of

cyclodextrins in a DMPC biological membrane model does not entail homogeneous mixed

films at a macroscopic scale but results in a well-defined and organized structure at a

microscopic scale, which remains a five-layer model. The cyclodextrins are anchored in the

membrane through the cholesterol arm making the cavity available for the inclusion of

Dosulepin. Even if some effort is still needed to elucidate the structure of the analogue film

with Dosulepin, the molecular carrier cyclodextrin property is clearly evidenced at molecular

scale. The strategy developed herein should now be extended so as to be able to control the

selective release of the active guest through the aqueous medium.

Acknowledgements: The authors would like to thank C. Braun for the fitting procedure and

Roquette-Frères (Lestrem, France) for the kind gift of the cyclodextrin.

0 The theoretical lengths of the molecule were calculated using chem3D.pro software

simulations.

150

References

151

Figures Captions

Fig. 1 Chemical formulae of the different molecules studied by X-ray reflectivity a:chol-DIMEB (6I-(cholest-5-en-3α-ylamido) succinylamido-6I-deoxy-per (2,6-di-o-methyl)-cyclomaltoheptaose). The cavity is hydrophobic and may trap non-soluble guest molecules. b: Dosulepin, neurotropic commercial drug c: DMPC (dimyristoylphosphatidylcholine)phospholipid composed of two aliphatic chains of 14 carbons and a zwitterionic head.

Fig. 2 Surface tension measurement at 25°C for various solutions () 0.5mg/mlDMPC () 0.438mg/ml chol-DIMEB (ο) 0.5mg/ml DMPC + 0.438 mg/ml chol-DIMEB,versus time.

Fig. 3 X-ray reflectivity intensity collected for DMPC films. In inset, we present theelectron density profile normalized to the electron density of the water, extracted from thedata analysis, versus the film thickness. The high electron density gradient within the film andat the air/film interface implies an important modulation of the reflected intensity with, inparticular, the weak intensity of the second fringe characteristic of the structure of theselipids8.

Fig. 4 X-ray reflectivity intensity collected from a pure chol-DIMEB film. The lack ofaccuracy of these experimental data originates from the short lifetime of this film.Nevertheless the overall thickness could be determined without ambiguity. In inset, wepresent the electron density profile normalized to the electron density of the water, extractedfrom the data analysis, versus the thickness of the film. There is no modulation as we use a 1-box model.

Fig. 5 Thickness extracted from experimental reflectivity curves of mixedDMPC/chol-DIMEB film at various molar ratios R (R=DMPC/chol-DIMEB) versus thismolar ratio R. The bell shape evidences a swelling when more and more cyclodextrinpenetrate the DMPC bilayer with a maximum swelling for R=3.

Fig. 6 Five-layer model fit to the experimental X-ray reflectivity data from aDMPC/chol-DIMEB mixed film (R=3). In inset, we present the electron density profilenormalized to the electron density of the water, extracted from the data analysis, versus thethickness of the film. The peculiar modulation of the electron density observed is specific tothe structure of the film.

Fig. 7 Qualitative effect of Dosulepin on the mixed DMPC/chol-DIMEB film (R=3)measured by X-ray reflectivity : (—) 0.5 mg/ml DMPC + 0.438 mg/ml chol-DIMEB + 0.3mg/ml Dosulepin (----) 0.5 mg/ml DMPC + 0.438 mg/ml chol-DIMEB. The swelling of thefilm is obvious and is mainly ascribed to the Dosulepin/chol-DIMEB complexes occurrenceas Dosulepin alone does not perturb the DMPC bilayer thickness : in inset are presentedreflectivity curves obtained for a pure DMPC film (0.5 mg/ml) and for a DMPC/Dosulepinfilm (0.5 mg/ml DMPC and 0.3 mg/ml Dosulepin); the position of the first minimum of thesetwo curves is rather the same.

Fig. 8 Scheme of a pure amphiphilic cyclodextrin film according to the electrondensity profile extracted from reflectivity experiments. The hydrophilic cyclodextrin cavitiesoccupy the central core of the film with the cholesterol moieties facing the air.

Fig. 9 Proposed structure of a mixed DMPC/chol-DIMEB film with a molar ratio of 3.The cyclodextrin cavities are embedded between two biological membrane-like wallscomposed of cholesterol and DMPC.

152152

153153

Fig. 1I. Javierre et al.

154154

Fig. 2I. Javierre et al.

155155

Fig. 3I. Javierre et al.

156156

Fig. 4I. Javierre et al.

1 0 - 8

1 0 - 7

1 0 - 6

1 0 - 5

1 0 - 4

1 0 - 3

1 0 - 2

1 0 - 1

0 . 0 5 0 . 1 0 . 1 5 0 . 2 0 . 2 5 0 . 3

B C 2Ref

lect

ivity

(I/I

0)

S c a t t e r i n g w a v e v e c t o r Qz

( Å - 1 )

z ( Å )E

lect

ron

dens

ity

ρ/ρw

ater

0

0 . 0 5

0 . 1

0 . 1 5

0 . 2

0 . 2 5

0 . 3

0 . 3 5

0 . 4

0 2 0 4 0 6 0

157157

Fig. 5I. Javierre et al.

50

55

60

65

70

75

80

0 2 4 6 8 10

Thi

ckne

ss (

Å)

Molar ratio R=DMPC/Chol-DIMEB

158158

Fig. 6I. Javierre et al.

10-7

10-6

10-5

10-4

10-3

10-2

10-1

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Ref

lect

ivity

(I/I

0)

Scattering wave vector Qz (Å-1)

z (Å)El

ectr

on d

ensi

ty ρ

/ρw

ater

0

0.10.2

0.3

0.40.5

0.60.70.8

-20 0 20 40 60 80 100

159159

Fig. 7I. Javierre et al.

10 -710 -6

10 -510

-410 -310

-2

0 0.1 0.2 0. 3 0.4 0.5

0.5 m g/ml DMPC + 0.438 m g/ml Chol- DIMEB0.5 m g/ml DMPC + 0.438 m g/ml Chol- DIMEB+ 0. 3 mg/ml Dosulepin

Reflectivity

(I/I0)

Scatte ring wave vecto r Qz (Å -1)

10-810-710-610

-510-410-3

0 0.10.2 0.3 0.40. 5DMPC + D osulepi n

pure DMPC

160160

Z (Å)

elec

tron

den

sity

(ρ/ρ

wat

er)

0 10 20 30 40 50 600

0.2

0.4

Fig. 8I. Javierre et al.

161161

0

elec

tron

den

sity

(ρ/ρ

wat

er) 0.6

0.2

0.4

0.8

010 20 30 40 50 60 70 80 Z (Å)

Fig. 9I. Javierre et al.

162162

Chapitre 2

3.3.2 Article n° 5

Investigations on vitamin A -loaded amphiphilic cyclodextrin nanocapsules :

characterization and topical application

S. Weisse, M. Skiba, F. Djedaïni-Pilard, B. Perly

International Journal of Pharmaceutics (soumis)

163163

Investigations on vitamin A-loaded amphiphilic cyclodextrin

nanocapsules :

characterization and topical application

S. Weisse1, M. Skiba2, P. André4, B. Perly1, F. Djedaïni-Pilard3

1 Service de Chimie Moléculaire, DSM/DRECAM, CEA Saclay, 91191

Gif sur Yvette Cedex, France 2 Université de Rouen, UFR médecine-pharmacie, Lab. de pharmacie galénique, 22 bvd

Gambetta, 76000 Rouen, France3 Université de Picardie Jules Verne, Laboratoire des Glucides,

33 rue St Leu, F-80039 Amiens, France4 LVMH – Laboratoire de recherche et développement – Branche Parfums et Cosmétiques

45800 St Jean de Braye, France.

INTRODUCTION

Since a number of years, a special attention has been paid to the preparation of amphiphilic

cyclodextrins (CD) in order to use them as new compounds for the preparation of carriers

(like nanoparticles [1]) or to insert them in a preformed lipidic matrix such as liposomes.

Among these, the cholesteryl-CD (obtained by grafting a single cholesterol on a CD) have

already proven their interest : it has been shown that cholesteryl-βCD induces a high disorder

into phopholipid bilayers and that cholesteryl-Dimeb forms highly soluble micelles in water,

and still retains its inclusion properties [2,3,4]. We focus here on a new cholesteryl-CD

derivative designed to obtain nanoparticles to be loaded with a lipophilic drug i.e vitamin A

propionate (PVA). The vitamin A loaded particles are then to be used to form a aqueous gel

and study the penetration of the vitamin A propionate after topical application on human skin.

EXPERIMENTAL

Materials

164164

Vitamin A propionate A or PVA (2.5 Mio I.E/g) was obtained from BASF (Germany) and

randomized per-(2,6-O-dimethyl)-β-cyclodextrin (Rameb) from WACKER (Germany). All

chemicals were purchased from Fluka and used without further treatments. Deuterated

solvents were purchased from Euriso-Top (Saclay-France). Pluronic PEF68, a poly(ethylene

oxide)-poly(propylene oxide) block copolymer was chosen as nonionic surfactant.

Synthesis of Heptakis (2,3-di-O-acetyl)-hexakis (6-o-acetyl)-6I-5cholest-5-en-3β-

yloxycarbonyl) amino-6I-deoxycyclomaltoheptaose (Chol-βCD-Ac) (Fig 1)

Synthetic pathway to final compound of Chol-βCD-Ac involved the preparation of 6I-

(cholest-5-en-3b-yloxycarbonyl) amino-6I-deoxy cyclomaltoheptaose () synthetized in four

steps from the parent cyclodextrin as described in [2].

The reaction of 80 equivalents of acetic anhydride in pyridine under standard conditions

offered Chol-βCD-Ac quantitatively : acetic anhydride (985µL, 80 eq.) was added to a

solution of freeze-dried (243.6 mg, 0.157 mmol) in dry pyridine (5 mL). The reaction

mixture was stirred for the dedicated time at room temperature under nitrogen. The reaction

was stopped by addition of methanol (2 mL). The reaction mixture was washed with HCl 1N

(2*20 mL), satured aqueous solution of Na2CO3 (2*20 mL) and water (2*5 mL). After

evaporation of most of the solvant, the crude residual sirup was precipitated by addition of

water. The crude product was isolated by filtration, washed with water and dried.

The chemical structure of Chol-βCD-Ac was assessed using high resolution 1H-NMR and

Mass spectrometry.

Fig 1. Chemical structure of Chol-βCD-Ac

165165

Fig 2. Chemical structure of vitamin A propionate

NMR study

6

ONH

H3COCO O

O

O

CHMe2

COO

Me

Me

OCOCH3H3COCO

OCOCH3

H3COCO

OCOC2H5

166166

1H-NMR experiments were performed at 500.13 MHz using a Bruker DRX500 spectrometer

using the pulse programs available from the Bruker library. All measurements were performed

at 25°C under careful temperature regulation (+/- 0.1K). Chemical shifts are given relative to

external tetramethylsilane (TMS=0 ppm) and calibration was performed using the signal of

the residual protons of the solvent as a secondary reference. All NMR data were processed

and plotted using the UXNMR program and an INDY work station (Silicon graphics). Scalar

correlation (COSY, Relay experiments) were processed in the absolute value mode after zero-

filling resulting in a 1K×1K data matrix. For dipolar correlation (ROESY experiment), the

phase sensitive (TPPI) sequence was used and processing resulted in a 1K × 1K matrix.

HPLC measurement

For all PVA assays we used a BECKMAN system Gold chromatograph with a Merck

Lichrosher 125-4 RP18 (5 µM) column and a Beckman led array detector, mobile phase was

acetonitrile/water 90/10 v/v at 1mL/mn-1. Detection of PVA at 325 nm, retention time is 9

min.

Mass Spectrometry study

High Resolution Mass Spectrometry was performed at the CRMPO at University of Rennes,

France, on a ZabSpec TOF (MicroMass). Electrospray ionisation of Chol-βCD-Ac (infusion

at 5µL/min of a 0.01 mg/mL solution in water-acetonitril 1/1 (v/v)) with positive ion detection

leads to a series of protonated molecules, [M+H]+, at m/z values depending on the number of

acetyl groups in each of the individual sugar unit of the β-cyclodextrin derivative.

Microscopy

Transmission electronic microscopy was performed with a Philips CM2000 with 80kV

tension.

Preparation of the nanoparticles

Nanospheres and nanocapsules of Chol-βCD-Ac were prepared according to the method

developped by Skiba et al [5,6]. Briefly, to obtain nanocapsules loaded with PVA, a lipophilic

phase, constituted by vitamin A propionate and Chol-βCD-Ac is dissolved in acetone and

added under mechanical stirring to an aqeous phase with surfactant (Pluronic PEF 68). The

nanocapsules are formed immediatly, and acetone is removed by evaporation under vacuum

167167

together with part of the water to obtain a suspension of the desired concentration. Unloaded

nanospheres can be obtained exactly in the same way by using a lipophilic phase containing

only the CD dissolved in acetone.

Particles size distribution

The mean nanoparticle size and size distribution were determined by photon correlation

spectroscopy using a Nanosizer instrument N4MD (Beckman Coultronics, Roissy, France)

which analyses the fluctuation in scattered light intensity generated by diffusion of the

nanoparticles in suspension. Experimental conditions were : temperature, 25°C ; reference

index 90° ; viscosity, 0.899 10-3 Pa ; refractive index, 1.33.

Long-term stability study

Fifteen mL aliquots of the nanocapsules suspension prepared as described above were

transferred into ampules which were sealed and stored at 4, 25 and 40°C. Every week, an

ampule was opened and the sample pipetted, diluted to the appropriate concentration with

water and the mean size and size distribution were determined.

Zeta potential

The charge of nanocapsules were obtained from the measurement of electrophoretic mobility

by laser Doppler velocimetry with a Coulter Zetameter Delsa 440 SX. The operating principle

is based on the Doppler shift induced by the movement of particles across interference fringes

which are produced by the intersection of two laser beam. The nanocapsules were suspended

in 10-3 M KCl and measurements were made at 25°C.

Vitamin A content

The vitamin A content of the nanocapsules was analyzed using HPLC as described above,

after dissolution of the nanoparticles in acetonitrile. Encapsulation efficiency (percent) was

estimated from the drug content found in the nanocapsules and the initial drug content added

in the formulations.

Preparation of aqueous gels

For the Rameb/PVA gel, we prepared an aqueous solution of the Rameb/PVA complex as

previously described [7], with initial concentrations of 40 mM and 400 mM for PVA and

Rameb respectively, reaching up to 9 mg/mL PVA. The solution was then diluted to obtain

168168

1mg/mL PVA and 1.8% w/w Natrosol (hydroxyethylcellulose, Hercules. Inc. USA) was

added to form the gel. For the nanocapsules gel, 1.8% w/w Natrosol was added to a solution

containing 0.97 mg/mL PVA.

Skin penetration study

This study was performed on fresh human skin pieces. It is well known that the main barrier

function of the skin is played by the upper epidermis called stratum corneum (or horny layer,

made of layers of dead keratinocytes surrounded by lipidic sheets) and, on a smaller scale, by

the epidermis (alternate lipophilic and hydrophilic layers). Therefore, as described in the

litterature we chose to remove the hypodermis (fat) and dermis because those thick layers

would stored the PVA and prevent us from having detectable amount in the receptor liquid.

The purpose of this work is to determine the amount of vitamin A propionate which

penetrates into the different layers of the skin, from our PVA-loaded nanospheres aqueous gel

and a reference gel. We used a device containing 15 Franz-type cells (surface 2 cm2, receptor

liquid volume 4.2mL) in a 37°C thermostatic bath. The receptor liquid contains phosphate

buffer 10 mM, NaCl 120 mM, KCL 2.7 mM, pH 7.4 (Sigma) sodium azide 0.1% w/w, ethanol

(20%v/v) and a surfactant (polyoxyethylene polyoxypropylene butyl ether, polyethylated

hydrogenated castor oil, purified water : Wackherr colorants) 4% v/v. On each cell, exactly 1g

of gel was deposited (8 cells for the Rameb/PVA gel and 7 cells for the nanocapsules gel) and

covered with Parafilm . After 24 hours, the cells were dismantled, the excess gel on the

surface was removed and the skins were treated as such: the stratum corneum was collected

by the stripping method (7 strippings, pression 300 g/cm2, time 12 sec., D’Squam , Eviderm

corporation, Dallas) and the PVA extracted by solubilization in 2 mL methanol and after 2

hours agitation, filtered (0.22µm) then assayed by HPLC. For the epidermis, the PVA was

extracted by solubilization in 2 mL methanol and after 2 hours agitation, filtered ( 0.22 µm)

then assayed by HPLC. The receptor liquid was assayed directly by HPLC. The gels were

submitted to the following treatments before PVA assays: 250 µL were sampled and sonicated

in 25 mL isopropanol to release PVA from the cellulose matrix, then filtered on 0.22µm filter.

A sample of each gel was kept to be assayed in time and determine long term stability of PVA

in the gels. The percentage of initial amount of PVA that has passed is calculated from the

concentration found in each layer. The results of the PVA assays were statistically analyzed

using the StatAdvisor Software. This procedure uses a multifactor analysis of variance. The

F-Test in the Anova table allows to identify the significant factors and for each one, the

169169

Multiple Range Test determine which means are significantly different from which other and

which Confidence Interval must be applied to this conclusion.

Results and discussion

Characterization of Chol-βCD-Ac

During the development of the synthesis of Chol-βCD-Ac, it was noticed that the percentage

of acetylation depends on the duration time of the acetylation reaction. Since each

cyclodextrin contains 20 hydroxyls (one is taken by the liaison with cholesterol) susceptible to

be acetylated, Mass Spectrometry can indicate exactly how many acetyls are present on each

species and the percentage of each species in the mixture (Fig. 3). The mass spectra reflect the

average distribution of the acetyl groups in all individual units of the Chol-βCD-Ac molecule.

With a reaction time of 8 h, no peracylated compound is formed and the three major

compound are the 14, 15 and 16 acetyls compounds. With 24 h reaction time, a few

peracetylated compounds is formed and the three major compounds are the 16, 17 and 18

acetyls compounds. Finally, with a reaction time of 72 h, the majority of the species formed

are peracetylated (72 %), 19-acetylaed (18%) and 18-acetylated (9%). The different batches

were used to determine the feasibility of nanoparticles. In all cases it was possible to form

blank nanospheres without surfactant. The nanospheres obtained showed a large distribution

of size (50-500nm).Their stability seemed to depend upon the percentage of acetylation and

the presence of some free hydroxyls seemed to be required to stabilize the nanoparticles. This

phenomenon has already been observed with “skirt-shaped” cyclodextrins [8,9]. The more

rapid sedimentation was observed when peracetylated Chol-βCD-Ac was used. Therefore it

was

170170

Fig 3. Mass spectrograms of acetylated species obtained by acetylation of Chol-βCD after a) 8h reactin time b) 72 h reaction time.

decided that all following experiments would use only batches containing no peracetylated

species i.e with acetylation time reaction of 8 h.

NMR analysis was performed in d6-dmso since Chol-βCD-Ac is insoluble in water and

demonstrated that the purified final samples were free of any included by-product of reagent.

The monosubstitution by cholesteryl derivative and the yield of acetylation have been

confirmed by digital integration of the NMR spectra arising from cholesterol, cyclodextrin and

acetyl moieties. The identification of most of the proton signal was derivated from

comparison of the proton signals of , already characterized [2]

Chol-βCD-Ac is highly soluble in acetone, dmso, ether but completely insoluble in water.

Loaded nanocapsules

The general preparation procedure described above allowed us to produce nanoparticles with

high reproducibility from batch to batch. Before choosing the more suitable formulation for

the loaded nanocapsules, many were tested, regarding the size of the formed particles. A few

examples are presented in Table I.

Formulation surfactant (mg) Chol-βCD-Ac

(mg)

PVA size (nm)

A 10 0 7.5 146 ± 78

a) b)

171171

B 10 15 0 105 ± 34C 10 15 7.5 117 ± 43D 10 15 30 145 ± 55E 10 30 30 121 ± 33F 10 30 26.25 131 ± 41G 15 15 7.5 131 ± 34H 15 15 15 121 ± 59I 15 15 30 131 ± 39

Table I : composition and size measurement of preliminary formulations

Since the determination of the feasibility of nanoparticles with Chol-βCD-Ac proved that

nanoparticles without surfactants exhibit a poor stability, 10 or 15 mg surfactants were used

for the preparation of loaded nanocapsules. With the stabilizing effect of the surfactant, we

were able to form 100 nm diameter nanocapsules with low degree of polydispersity. A-D

formulations showed rapid sedimentation (inf. 4 days) and size increased due to the

aggregation of the particles. Formulations E-I exhibited a mean diameter of around 130 nm, a

low degree of polydispersity and a spherical shape of nanocapsules visualized by transmission

electronic microscopy. We chose to use formulations similar to G, H and I (15 mg CD and 15

mg surfactant) to investigate the drug loading ability of our carrier. Results are presented in

Table II.

Formulation Initial drug

content* (mg)Chol-βCD-

Ac content

(mg)

drug loading

(µg/mg CD)

encapsulation

%

mean

diameter

(nm) ± SDF0 7.33 0 2.45 132 ± 36F1 7.33 15 150 30 102 ± 37F2 14.66 15 168 17 107 ± 42F3 18.3 15 270 22 112 ± 27F4 22 15 306 20.8 159 ± 83F5 25.6 15 300 17.5 109 ± 23F6 29.3 15 480 24.5 124 ± 49F7 33 15 564 25.6 129 ± 56F8 36.6 15 600 24.6 141 ± 61

172172

*always for 15 mg surfactant

Table II : Chol-βCD-Ac nanocapsules loaded with vitamin A propionate

Table II shows the influence of the initial content of PVA added in the organic phase. As the

initial amount of PVA increases, the drug loading increase as well, indicating high loading

possibilities for this type of carrier. However, the encapsulation efficiency of the cyclodextrin

does not increase with the concentration of PVA. This phenomenon has already been observed

for nanospheres [10]. The authors indicated that the encapsulation efficiency increase with the

concentration of the drug , reaches a maximum then decreases. In the case of PVA the

maximum encapsulation is obtained with a small quantity, 7.5 mg, and further increase in the

concentration of PVA With respect to particle size measured by the photon correlation

spectroscopy, no significant differences were observed for the above mentioned formulations.

The mean diameter of around 130 nm, the low degree of polydispersity and the spherical

shape of the cyclodextrins nanocapsules were also visualized by transmission electron

microscopy (Fig. 4). The mean diameter of the nanocapsules is very close for all formulations

and therefore independent of the concentration of PVA.

Fig 4. Electron microscopy of a water dropplet containing PVA-loaded nanocapsules of βCholAc.

173173

These results suggest that the external layer of Chol-βCD-Ac is very rigid and do not allow

any swelling of the PVA core. This is probably a consequence of the rigidity of the Chol-

βCD-Ac which was synthetized without a spacer between the cholesterol and the CD.

In the F0 formulation, no CD was used and the nanoparticles formed are made only of PVA

and surfactant. The formation of nanoparticles of PVA alone can also be achieved very easily,

but the nanoparticles tend to aggregates and a water/oil phase separation rapidly occurs. When

using surfactant, the stability of the suspension can be improved by the formation of mixed

micelles but the chemical stability of the PVA is rapidly lost and degradation is caused by

light and oxydation.

The chemical integrity of the PVA in the nanocapsules could not be followed by 1H NMR

since the signals of the PVA are mostly covered by those of the cyclodextrin. Hence, we used

HPLC, and chromatograms obtain by dilution of 7 days old nanocapsules in acetonitril

showed the same peaks as the chromatogram of fresh PVA alone in acetonitril. Some smaller

peaks precede that of PVA and represent vitamin A alcohol and by-products present in the

commercial form we used (data not shown).

The zeta potential is related to the charge on the surface of the particles, and so influences the

properties of the particles, like aggregation or distribution in biological media. The zeta

potential of the nanocapsules without surfactant approches zero. Such dispersions are not

electronically stable and tend to aggregate, as reported above. All loaded nanocapsules

formulations, containing the same concentration of surfactant, exhibit quite the same zeta

potential (- 25 ± 5 mV) indicating that it is most probably located at the surface of the

nanocapsule and must interact with the CD molecules. The negative charge at the surface of

the nanocapsules results in strong repulsion one to another and therefore a stable suspension is

obtained.

Since the cholesterol moiety is the more hydrophobic part of the Chol-βCD-Ac, it is probably

oriented towards the oil that constitutes the inner part of the nanocapsules, while the CD

moiety interacted with the external aqueous phase. The Chol-βCD-Ac molecules must

constitute a single layer around the oil dropplet, like a wall, since no swelling of the

nanocapsules was observed when the concentration of CD was increased.

Stability

Long term stability study indicated that nanocapsules could be conserved for 4 months at 25

and 37°C without any change in their diameter or polydispersity index.

174174

Skin penetration studies

We described in previous papers [7,11] the use of the Rameb/PVA complex to form an

aqueous gel and the resulting concentration of PVA and Rameb in the skin following 24h

contact. Since we know the Rameb/PVA gel allow higher penetration of PVA in the skin,

compared to a reference aqueous gel of PVA alone, we choose to use it as reference in this

particular experiment. Batch F8 was chosen to form an aqueous gel because of its high drug

loading. The concentration of PVA in the F8 solution being 0.97 mg/mL, and that of the

Rameb/PVA solution being 9 mg/mL, the latter was diluted to obtain the same concentration

of PVA in the two gels.

Results of the PVA assays in stratum corneum, epidermis and receptor liquid are presented in

Table III, and expressed as % of initial amount of PVA recovered in each layer.

cell number SC Epiderme LR1 0,278 ND 0,0073 1,222 0,091 0,0515 0,407 0,022 0,006

Rameb/PVA 7 0,356 0,028 0,007 gel 9 0,333 0,026 0,079

11 0,444 0,063 ND13 0,422 0,036 0,04715 0,444 0,089 0,009

mean 0,488 0,051 0,029deviation 0,302 0,030 0,029

2 0,240 0,130 0,0214 0,560 0,130 ND

nanocapsule 6 0,234 0,098 0,021 gel 8 0,204 0,085 0,029

10 0,270 0,090 0,05512 0,200 0,070 0,03414 0,190 0,066 0,025

mean 0,271 0,096 0,031deviation 0,130 0,026 0,013

ND = not determined

Table III : Results of the PVA assays in stratum corneum, epidermis and receptor expressed

as % of initial amount of PVA recovered in each layer.

175175

The results, after statistical analysis indicate that there is no meaningful difference between

the two gels, when regarding all compartments together. However, statistically different

results appear when regarding the stratum corneum alone and the epidermis alone. In the

stratum corneum (upper layer), the amount of PVA is significantly higher when using the

Rameb/PVA gel whereas in the epidermis the amount of PVA is significantly higher when

using the PVA-loaded nanocapsules. As a consequence, and based on one experiment only, it

is not possible to determine if one gel induce a greater penetration. But, since we found

different amount of PVA in different layers after 24 h, we can suppose that the difference in

the nature itself of the interaction between PVA and cyclodextrins in the two gels induce a

different rate of permeation in the skin. Indeed, in the Rameb /PVA complex, we are dealing

with direct inclusion and a molecular carrier but in the case of the nanocapsules, the PVA is

stored in the core of the nanocapsules wich represents a particle-like carrier.

Conclusion

Chol-βCD-Ac were proved suitable for the manufacture of nanospheres and nanocapsules.

The oily nature of vitamin A propionate leads to the formation of nanocapsules where PVA

represents the core and Chol-βCD-Ac is located at the surface of the dropplet and represents

an external monolayer which interacts with the surfactant to improve the stability of the

nanocapsules. A reproductible size distribution was obtained, along with long term stability.

The aqueous suspension can be used to form a gel which allow to achieve good penetration, in

the skin, of the PVA encapsulated. Since we know CD in general are able to penetrate in the

skin, investigations should be performed regarding the amount of Chol-βCD-Ac that reach

the different skin layers. Production of specific antibodies directed against this particular

cyclodextrin is presently underways and will allow us to perform enzymatic immunoassays on

skin samples.

176176

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11- Weisse, S., Archambault, J.-C., Ouvrard-Baraton, F. & Djedaïni-Pilard, F.(2002b). Utilisation cosmétique de la vitamine A ou de ses esters, en association avec une b-cyclodextrine diméthylée. FR 02.01241.

177177

3.2.3 DISCUSSION

178178

3.3.3 DISCUSSION

Il semble nécessaire de resituer le premier article de ce chapitre par rapport à la ligne

directrice de ce travail de thèse. Le travail effectué avec la Chol-Dimeb s’intègre dans une

démarche plus fondamentale visant à mieux comprendre les mécanismes d’interactions des

cholestéryl-CD avec des membranes biologiques modèles à l’aide de méthodes physiques.

Cette étude nous a paru nécessaire afin d’essayer de mieux comprendre les différentes

interactions impliquant le trio hôte/invité/membrane. Même si les résultats obtenus sont

encore préliminaires, ils nous permettent de mieux appréhender la structure chimique des CD

capables de s’insérer dans des systèmes organisés (en particulier du point de vue de la balance

hydrophile/hydrophibe). Le travail effectué en utilisant les films noirs nous apprend qu’une

cyclodextrine particulière, la Chol-Dimeb, peut s’insérer dans des films phopholipidiques par

sa partie cholestérol. Cette propriété doit être reliée à la présence du bras espaceur succinique

entre le cholestérol et la Dimeb. En effet, il en résulte une certaine souplesse de la molécule

qui permet d’adapter la position du cholestérol (rotation, fermeture ou ouverture de l’angle de

liaison) à son environnement. Dans ce cas précis, on note que l’épaisseur d’un film de DMPC

augmente avec l’ajout de Chol-Dimeb, en passant par un maximum pour un rapport

DMPC/Chol-Dimeb de 3. Cela signifie qu’il y a réarrangement moléculaire au fur et à mesure

de l’ajout de Chol-Dimeb. Les molécules de DMPC s’arrangent autour du cholestérol de

façon différente en fonction de la quantité de Chol-Dimeb et profitent donc de la souplesse de

ce dernier. La partie cyclodextrine de la Chol-Dimeb est exposée au milieu aqueux, d’abord

dans la solution puis dans le film noir, et reste ouverte à l’inclusion d’une molécule hôte. Le

PVA n’a pas été utilisé dans ces essais car son inclusion dans la Chol-Dimeb n’a pu être

démontré, à cause de son insolubilité dans l’eau.

Ces résultats ne sont bien sur pas transposables à la Chol-βCD-Ac dont les propriétés

physico-chimiques sont très différentes. Toutefois ils permettent de supposer que la partie CD

de la molécule gardera une préférence pour le milieux aqueux et qu’à l’interface phase

hydrophile/phase hydrophobe ces molécules s’orienteront de manière à présenter le

cholestérol à la phase hydrophe. Il s’agit d’un résultat bien connu avec les CD amphiphiles

179179

mais que l’on peut effectivement visualiser et mettre à profit dans le cas des films noirs de

Chol-Dimeb.

La Chol-βCD-Ac est une molécule rigide, car ne possédant pas de bras espaceur, et

absolument insoluble dans l’eau. Comme beaucoup de molécules possédant une partie

hydrophobe et une partie hydrophile, elle s’est révélée parfaitement apte à former des

nanosphères et des nanocapsules. Ces agrégats sont toutefois peu stables en solution et

sédimentent rapidement. Cela est du au fait qu’ils ont une charge de surface quasiment nulle

et ne provoquent donc pas de répulsion électrostatique. Il a donc été nécessaire d’ajouter un

tensioactif afin d’obtenir une bonne stabilité en solution. Par la suite, c’est la nature huileuse

du PVA qui a imposé le choix du vecteur à utiliser. En effet, les premiers essais ont révélé

qu’il était impossible de former des nanosphères chargées en PVA. Par contre, des

nanocapsules remplies de PVA sont obtenues facilement et présentent un diamètre moyen

d’environ 130 nm avec une faible polydispersité. Connaissant les affinités respectives de la

partie cyclodextrine et de la partie cholestérol, il semble raisonnable de penser que la Chol-

βCD-Ac se situe à l’interface eau/huile avec les têtes-cholestérol dirigées à l’intérieur de la

gouttelette d’huile. Le tensio-actif se situe aussi à l’interface eau/huile, comme indiqué par la

chute de potentiel zéta qu’il provoque. Grâce à la formation de ces nanocapsules chargées, on

obtient une suspension aqueuse de PVA dont la concentration peut atteindre 1mg/mL. Ce

chiffre est inférieur à la quantité de PVA que l’on peut solubiliser avec le complexe

Rameb/PVA, mais il est possible que nous n’ayons pas encore atteint la limite en terme de

formulation des nanosphères et une concentration de 1mg/mL permet néanmoins de passer à

l’application biologique. En effet, la limite de détection du dosage par HPLC du PVA (0.1

ppm) impose de faire des essais avec une concentration initiale suffisante. Le dosage du PVA

dans les couches cutanées, après application d’un gel aqueux contenant la suspension de

nanocapsules, démontre que ce vecteur est au moins aussi efficace que le gel à base de

Rameb/PVA pour améliorer la pénétration du PVA dans la peau. Ces deux vecteurs sont

pourtant fondamentalement différents quant à leur nature puisque l’un présente le PVA sous

une forme moléculaire alors que le second amène le PVA sous forme particulaire. Bien

qu’une seule expérience de pénétration sur peau aie été effectuée avec les nanocapsules et ne

nous permette pas d’être catégorique, il semble que ces 2 vecteurs aient néanmoins des

cinétiques de pénétration différentes. En effet, bien que la quantité de PVA totale retrouvée

dans la peau ne soit pas significativement différente dans les 2 cas, il existe des différences

significatives lorsque l’on regarde chaque compartiment séparément. La nature du vecteur

influe donc sur la pénétration du PVA, probablement à la fois sur la vitesse de diffusion dans

180180

la couche aqueuse de surface, et au niveau du passage des couches lipophiles et hydrophiles

alternées de l’épiderme.

Un certain nombre d’investigations restent à mener sur ces nanocapsules chargées en

PVA. Tout d’abord concernant la reproductibilité des résultats de pénétration sur peau

obtenus, d’autres expériences sont nécessaires afin de déterminer clairement les différences de

cinétique pouvant exister par rapport au complexe Rameb/PVA et afin d’établir le profil de

pénétration du PVA.

La stabilité à long terme et l’intégrité chimique du PVA dans les nanocapsules doivent

être confirmées, soit en séparant par chromatographie liquide le PVA de la Rameb avant

analyse RMN pour pouvoir visualiser les signaux du PVA, soit par spectrométrie de masse.

Le dosage des Chol-βCD-Ac dans les échantillons biologiques, dont le principe sera plus

longuement détaillé dans la conclusion, permettrait de connaître le comportement de ce

vecteur par rapport aux membranes biologiques. D’autres principes actifs doivent aussi être

testés pour évaluer l’intérêt général des nanoparticules de Chol-βCD-Ac dans le domaine de la

vectorisation.

181181

CONCLUSION GENERALE

182182

CONCLUSION GENERALE

Au cours de cette étude, de nombreuses techniques ont été utilisées, de nouvelles formes

galéniques de vitamine A mises au point, de nouvelles molécules créées et certaines questions

ont pu trouver leur réponse.

L’objectif de ce travail était de se servir des cyclodextrines, molécules cages dont les

propriétés ne se limitent pas à l’inclusion de molécules hôtes, afin de :

- stabiliser la vitamine A vis à vis de la dégradation par l'oxygène, la température et

surtout la lumière.

- de former un composé hydrosoluble permettant de disposer de nouvelles formulations.

- de s’assurer que le principe actif soit dirigé et reste dans les strates de la peau où

son action sera optimale.

En ce sens, nous pouvons affirmer que l’objectif principal a été atteint.

Après avoir essayer les cyclodextrines naturelles sans obtenir d’augmentation de la

solubilité aqueuse du PVA, l’utilisation de la Rameb nous a permis d’obtenir un complexe

hydrosoluble, de stoechiométrie 1/1 et parfaitement caractérisé par RMN et HPLC. En

déterminant les conditions optimales de préparation, nous avons pu obtenir une solution

aqueuse contenant jusqu’à 9 mg/mL de propionate de vitamine A. La stabilité du PVA dans

cette formulation a été établie sous forme aqueuse et lyophilisée et si elle n’atteint que 15

jours dans le premier cas, elle peut atteindre 6 mois dans le second et ceci dans les pires

conditions de stockage (à la lumière, à 25 °C).

L’obtention de cette solution de propionate de vitamine A a permis de développer un

gel aqueux contenant en moyenne 0.8% de PVA et 50% de Rameb. Ce pourcentage de PVA

semble ridiculement faible par rapport à celui de la Rameb mais c’est dans cette zone de

concentration que la vitamine A est thérapeutiquement active au niveau cutané. Afin de

déterminer si cette nouvelle formulation aqueuse pouvait améliorer la pénétration du PVA

dans la peau, nous avons testé notre gel contre des formulations de référence sur des

échantillons de peau, en utilisant des cellules de Franz.

Les résultats ont montré que la formulation contenant le PVA sous forme de complexe

permettait une augmentation significative de la quantité de PVA retrouvée dans la peau par

183183

rapport aux formulations de référence. La peau étant l’organe cible, nous avons donc amélioré

la biodisponibilité du PVA, et ceci grâce à un procédé de préparation simple et économique.

Mais le PVA n’est pas la seule espèce dont nous avons pu suivre le cheminement au

travers de la peau. Grâce à des anticorps dirigés spécifiquement contre la Dimeb, nous avons

pu déterminer la quantité de Rameb dans les différentes couches cutanées par dosage

immuno-enzymatique. Les études de pénétration sur peau présentent donc un double intérêt

puisque le comportement des CD dans la peau est encore loin d’être parfaitement décrit et

expliqué. On savait déjà que les CD pénétraient de façon non négligeable dans la peau, malgré

leur haut poids moléculaire. Pour certaines CD cela se fait grâce à leur propriété à inclure

certains constituants des membranes phospholipidiques et pour d’autres c’est leur nature

amphiphile qui favorise la pénétration.

De nombreux éléments recueillis au cours de cette étude nous permettent de penser

que le complexe d’inclusion formé permet de faciliter la diffusion du PVA dans la couche

aqueuse en surface de la peau et d’amener une plus grande quantité en contact avec les

couches superficielles de l’épiderme. En effet, nous avons montré que l’effet promoteur

d’absorption de la Rameb n’existe que si le complexe se forme avec le PVA et n’est pas du à

la seule présence de la Rameb dans la forme galénique. De plus, il faut impérativement que le

complexe soit soluble. Une fois dans les couches superficielles de l’épiderme, il semblerait

que la Rameb et le PVA se séparent. En effet, le rapport des concentrations de Rameb et de

PVA, fixe dans le gel, subit d’importantes variations dans l’épiderme et les couches plus

profondes. La Rameb semble ensuite diffuser facilement dans le derme, couche hydrophile, et

au-delà, alors que celui-ci représente un organe de stockage et de métabolisation pour le PVA.

Malheureusement, les outils nous manquent à l’heure actuelle pour déterminer plus

précisément le comportement exact du complexe dans la peau. Cela nécessiterait en effet de

trouver une méthode de dosage différenciant le complexe entier de la Rameb, une fois dans la

peau.

Dans le but d’explorer d’autres propriétés des cyclodextrines en général, nous avons

synthétisé un dérivé de cholestéryl-cyclodextrine, la Chol-βCD-Ac, aux propriétés très

différentes de celles de la Rameb, et à partir duquel il est possible de former des

nanoparticules. L’incorporation de PVA dans des nanocapsules à base de Chol-βCD-Ac s’est

avérée efficace grâce à la nature huileuse du PVA et a ensuite permis de préparer une

suspension aqueuse pouvant contenir jusqu’à 1 mg/mL de PVA. L’étude de la stabilité de la

184184

suspension ne montre aucun signe de sédimentation après 4 mois à température ambiante. Il

est à noter que la présence de quelques hydroxyles libres semble favoriser la stabilité de la

suspension suggérant de possibles interactions des têtes cyclodextrines entre elles.

Nous avons alors pu formuler un gel aqueux à partir de cette suspension de nanocapsules et

tester son efficacité en terme de pénétration de PVA, par rapport au gel contenant le complexe

Rameb/PVA.

Deux objectifs étaient attachés à cette étude.

Tout d’abord évaluer l’intérêt des nanocapsules de Chol-βCD-Ac par rapport au complexe

Rameb/PVA. A ce niveau, une seule expérience n’offre aucune réponse définitive mais nous

permet d’observer que si la quantité totale de PVA retrouvée est très proche, la cinétique de

pénétration impliquée est probablement différente.

Le second objectif était de déterminer le comportement de la Chol-βCD-Ac dans la peau. En

effet, elle possède des propriétés différentes de celles de la Rameb et il est intéressant de

savoir si ses possibles interactions avec les membranes lui confèrent un passage transcutané

différent.

Toutefois, les outils nécessaires pour doser la Chol-βCD-Ac dans nos échantillons

biologiques n’existent pas encore. En effet, les anticorps anti-Chol-βCD-Ac sont actuellement

en cours de production au Service de Pharmacologie et d’Immunologie au CEA Saclay. Pour

cela, nous avons synthétisé et caractérisé l’haptène destiné à être injecté chez le lapin pour

produire la synthèse des anticorps. Cet haptène est l’heptakis(2,3-O-diacétyl)hexakis(6-O-

acétyl)6-monoamino-6-desoxycyclomaltoheptaose.

La suite de ce travail consiste donc à répéter les études de pénétration sur peau effectuées avec

les nanoparticules de Chol-βCD-Ac chargées en PVA afin de doser la Chol-βCD-Ac dans les

échantillons biologiques et d ‘établir le rôle de la modification chimique de la cyclodextrine et

de la forme particulaire sur le comportement de la Chol-βCD-Ac dans la peau.

Par la suite, nous pouvons envisager d’appliquer les résultats obtenus à l’amélioration de

l’utilisation par voie topique d’autres principes actifs à visée thérapeutique cutanée.

185185

ANNEXES

186186

ANNEXE 1 : LA PEAU

La peau, organe complexe, le plus étendu (2 m2) du corps humain et le plus important en

contact avec le milieu extérieur, est une enveloppe de recouvrement qui protège l’individu et

permet sa survie. Anatomiquement, elle est constituée de différentes couches superposées les

unes sur les autres, l’épiderme et le derme reposant sur une couche graisseuse, l’hypoderme.

Les recherches effectuées durant les 20 dernières années dans les domaines de la dermatologie

et de la biologie cutanée ont profondément enrichi les connaissances sur ses mécanismes

physiologiques et modifié la perception de cet organe. La peau est la première ligne de

défense vis-à-vis du monde extérieur mais permet en même temps d’entretenir des relations

avec celui-ci. Son intégrité est nécessaire à la vie tant pour son incidence sur la santé de

l’individu que pour son bien-être. Outre sa fonction barrière, la peau est aussi le siège du

toucher et possède un rôle de synthèse (vitamine D2), d’élimination (principalement fer et

cholestérol par la sueur, le sébum, les poils et les cellules desquamantes) et d’échanges

thermiques et gazeux.

La fonction barrière de la peau est assurée par l’épiderme, continu, souple, fin mais

imperméable et plus particulièrement par la couche cornée ou stratum cornéum qui est la

couche la plus externe. Cette dernière est un « parapluie » qui limite l’entrée des agents

extérieurs tout en participant à l’homéostasie générale de l’organisme en régulant la perte en

eau. C’est aussi une « ombrelle » protégeant du soleil et se modifiant à son contact. Cette

barrière toutefois n’est pas absolue, elle est perméable à pratiquement toutes les substances,

seul le degré de perméabilité varie. Il est lié à l’état physiologique de la peau et aux propriétés

physico-chimique du composé qu’elle est censée restreindre. Notons que la peau protège aussi

contre les traumatismes, mais dans cette fonction « bouclier » l’épiderme intervient peu. En

revanche, l’hypoderme amortit les chocs grâce à l’élasticité de son tissu graisseux et le derme

assure la solidité grâce à ses fibres.

Formation de la peau pendant la grossesse

L’œuf, dès sa fécondation évolue très vite. Rapidement le fœtus est constitué de trois

couches – ou feuillets – plus ou moins concentriques : l’ectoderme qui donnera l’épiderme et

le système nerveux ; le mésoderme qui formera le derme, l’hypoderme et tout le tissu

conjonctif, les os, les articulations, les muscles et la plupart des viscères ; et l’endoderme,

futur tube digestif.

187187

L’épiderme n’est constitué au début que d’une couche de cellules mais très vite d’autres

surviennent qui forment autant de strates. Par ailleurs, sur sa face profonde des bourgeons

apparaissent ; ils s’enfoncent dans la profondeur dermique et sont à l’origine des glandes

sudorales, des poils, des cheveux ainsi que des glandes sébacées et des ongles. Le derme se

développe sous l’épiderme avec l’apparition de nombreuses cellules, fibres, vaisseaux et nerfs

qui lui donneront ses caractéristiques ultérieures. L’hypoderme se constitue au-dessous ; il est

surtout formé de cellules adipeuses

1. Structure de la peau

Figure 24 : représentation d’une coupe de peau

188188

Figure 25 : coupe histologique de la peau humaine (coloration hématoxyline éosine)

(×200)

1.1 L’épiderme

L’épiderme ne comporte pas de vaisseaux, éventuellement quelques petites fibres

nerveuses, mais il est essentiellement constitué de cellules qui sont de trois natures

principales : les kératinocytes, les mélanocytes et les cellules de Langerhans. Son épaisseur

varie largement en fonction du site anatomique ; la moyenne est de 40-50 µm mais elle

augmente jusqu’à 80µm sur le poignet et le dos de la main et jusqu’à 400µm au bout des

doigts.

1.1.1 Les kératinocytes

189189

Les kératinocytes représente 90% des cellules de l’épiderme. Ils existent dans toutes les

couches superposées de l’épiderme mais selon les strates sont sensiblement différents. Dans la

couche inférieure, dite assise basale ou stratum basale, ils ont un grand axe vertical. C’est

dans cette couche, et dans cette couche seulement à l’état normal, qu’ils se divisent. Le

nombre de cellules dans cette couche s’accroissant, certaines sont expulsées vers la couche

supérieure comme peut l’être le noyau d’une cerise pressée entre les doigts. Mais lorsqu’une

cellule monte d’un cran, une autre doit être expulsée vers la troisième couche, etc. Ainsi

progressivement les cellules montent vers la surface et au fur et à mesure de leur progression

elles se modifient. De verticales, elles tendent à devenir horizontales et leur constitution

change fortement : une protéine apparaît progressivement ; d’abord amorphe et appelée

kératohyaline, elle devient rapidement fibreuse et forme donc des brins allongés. Ceux-ci

passent d’une cellule à l’autre : c’est la kératine – ici kératine molle - protéine qui est très

riche en acides aminés soufrés (cystine, cystéine, méthionine). Mais parallèlement le noyau

des cellules s’altère puis disparaît. Les strates supérieures, ou couche cornée ou stratum

corneum, sont donc constituées de cellules mortes, entièrement kératinisées et dénuées de

noyaux, séparées les unes des autres par des lipides : les membranes cellulaires. De ce fait, on

compare souvent la structure de la couche cornée à celle d’un mur dont les briques sont

séparées par le mortier. Plus en surface encore les cellules perdent leur adhérence les unes aux

autres ; elles deviennent ainsi écailleuses puis se séparent et tombent à l’extérieur : c’est la

desquamation. Ces couches desquamantes superficielles joue évidemment un rôle moins

important dans la fonction barrière.

Nous allons nous attarder plus longuement sur la couche cornée ou stratum cornéum

(SC) car son rôle de barrière mais aussi de réservoir est essentiel.

Le mur de brique, cette représentation shématique et statique de la couche cornée, bien

que toujours pertinente, a été quelque peu enrichie. En effet, Rawling [Rawling, 1994] et ses

collaborateurs ont proposé l’existence de molécules actives du point de vue osmotique au

niveau des cornéocytes (kératinocytes de la couche cornée), permettant aux « briques » d’agir

en fait comme des éponges et de gonfler. La structure apparaîtrait donc plus souple, moins

figée. Comme nous le verrons ensuite, le stratum corneum fonctionne aussi comme un

réservoir vis à vis des molécules qui traversent la peau. Morphologiquement, il comprend un

nombre variable de couches en fonction des individus et du site anatomique. Par exemple, on

trouve environ 15 couches au niveau du dos et de l’abdomen (soit environ 10µm d’épaisseur)

mais presque une centaine au niveau du talon de la plante des pieds. Le fait que le SC soit

constitué de multiples couches est un facteur fondamental en ce qui concerne l’inhibition de

190190

la pénétration de la plupart des substances. En effet, ces couches multiples sont

alternativement lipophiles (membranes et kératine sèche) et hydrophiles (contenu des cellules

i.e « natural moisturizing factors », acides aminés et sucres).

La composition biochimique du SC est très hétérogène avec environ 40% de protéines,

15 à 20%, 20 à 25% de substances hydrosolubles et environ 5 à 10% d’eau.

les protéines : les cornéocytes contiennent une quantité importante de kératines

organisées de façon à donner une structure stable extrêmement résistante et relativement

élastique à la cellule. L’ensemble des kératines constitue 80% de la masse totale sèche des

cornéocytes. De nombreuses autres protéines ont été identifiées comme formant une

enveloppe cornifiée très résistante chimiquement et mécaniquement autour des cornéocytes

(filaggrine, involucrine, cornifine, locirine). Le SC comprend également de nombreuses

enzymes catalytiques responsables des nombreuses modifications biochimique de cette

couche épidermique.

les lipides : il existe au moins deux systèmes lipidiques différents dans le SC. Le

premier est responsable de la cohésion et constitué principalement d’acylglycosylcéramides

rattachés aux protéines de la membrane cornifiée des cornéocytes. Le second est responsable

de la fonction barrière et constitue l’espace intercellulaire du SC, i.e un domaine continu ou

baignent les cornéocytes. Cet espace est composé principalement d’un mélange équimolaire

d’acides gras libres, de céramides et de cholestérol organisés en feuillet parallèle à la surface.

Cette composition peut varier avec les individus, l’âge, l’alimentation, les saisons de l’année

et les paramètres de l’environnement. La quantité lipidique intercellulaire varie également en

fonction de la profondeur ; le volume des cornéocytes occupant de moins en moins d’espace

en migrant vers la surface, la surface lipidique devient plus importante mais aussi plus

désordonnée. Le cholestérol qui représente environ 30% des lipides du SC humain pourrait

créer des liaisons covalentes avec l’enveloppe des cornéocytes et induire une certaine

cohésion intercellulaire ; cependant son activité reste très controversée.

l’eau : le SC contient en moyenne 15 à 35% d’eau par rapport à sa masse totale.

Celle-ci serait présente sous forme libre ou plus ou moins liée à des groupements chimiques

pouvant participer à des ponts hydrogènes et donc, logiquement, les propriétés de rétention de

l’eau varie en fonction du type de lipide. Cette eau n’est pas répartie de façon homogène

puisqu’il existe un gradient de concentration de part et d’autre du SC, tant que l’humidité

relative de l’air est inférieure à 100%. L’hydratation des couches cellulaire est plus importante

191191

dans les couches profondes qu’en surface et si le SC contient moins de 10% d’eau, le terme de

déshydratation est employé pour désigner la barrière.

les « natural moisturizing factors » (NMF) : ils représentent 10% du poids sec des

cornéocytes et sont en partie responsables du phénomène complexe et facilement perturbable

qui permet la rétention de l’eau. Le rôle des NMF provient des propriétés physico-chimiques

de ces constituants qui sont hygroscopiques (ac. aminés et dérivés, ac. lactique, urée, sels et

une protéine, la profilaggrine). Ils peuvent donc absorber l’eau atmosphérique et la solubiliser

dans les cornéocytes en jouant le rôle d’humectant. Ainsi ce système permet au SC de

maintenir un niveau d’eau constant au sein des cellules même lorsque les couches

superficielles sont exposées à un environnement sec.

1.1.2 Les mélanocytes

Les mélanocytes sont situés seulement dans la couche basale. Elles sont

particulièrement abondantes sur le visage et les régions génitales mais diminuent avec l’âge

(environ 10% tout les 10 ans). Ces cellules ont une forme étoilée grâce à des prolongements -

les dendrites – qui sont dirigés vers les kératinocytes environnants. Elles fabriquent un

pigment brun ou roux : la mélanine. Ce pigment est à l’état de petits grains – les mélanosomes

– qui se déplacent vers l’extrémité des prolongements cellulaires. Or ces prolongements ont

tendance à pénétrer dans les kératinocytes, et effectivement leur extrémité est absorbée avec

son contenu par les kératinocytes. Ainsi les mélanocytes et les kératinocytes qui lui sont liés –

en général 36 – constituent un ensemble fonctionnel : l’unité épidermique de mélanisation.

1.1.3 Les cellules de Langerhans

Les cellules de Langerhans ont une origine différente : elles proviennent en effet de la

moelle osseuse. Décrites initialement par Langerhans, qui les avait parfaitement dessinées au

siècle dernier, elles sont très difficiles à voir. Leur existence fut donc contestée et même niée

jusqu’à ce qu’elles soient retrouvées de façon indiscutable au microscope électronique dans

les années 1950. Ces cellules constituent environ 7 % des cellules de l’épiderme et sont

situées à tous les niveaux, particulièrement sous la couche cornée, et sont anastomosées entre

elles par des prolongement, d’où leur aspect étoilé. Elles forment donc un réseau situé dans

toute l’épaisseur de l’épiderme et ont la capacité de capter une substance étrangère qui aurait

pénétré : elles sont donc placées aux aguets pour attendre leur proie.

1.2 Le derme et l’hypoderme

192192

1.2.1 Le derme

Il est placé sous l’épiderme. Sa surface, à la jonction de l’épiderme, est hérissée de

saillies fibreuses, vasculaires et nerveuses en forme de cône à sommet arrondi : les papilles

dermiques. Entre elles, dans les dépressions, l’épiderme envoie des projections qui

s’engrènent au derme. Noyés dans une phase aqueuse amorphe de mucopolysaccharides, le

derme contient divers constituants : fibres, cellules et nerfs.

les fibres : très entremêlées, elles sont bien visibles dans les cuirs animaux mais

donnent aussi sa solidité à la peau humaine. Les plus nombreuses, les fibres collagènes, sont

regroupées en faisceaux onduleux, allongés en tout sens et entrecroisés. D’autres, les fibres

élastiques, sont sinueuses et anastamosées entre elles, constituant ainsi un réseau d’orientation

verticale.

les cellules : elles peuvent être très diverses mais les fibroblastes ou cellules

conjonctives sont presque les seules que l’on retrouve dans le derme normal. Ils ont une forme

étoilée grâce à des prolongements qui les réunissent et servent à laisser sortir leurs sécrétions :

les fibres. Les histiocytes, cellules mobiles, participent quant à eux à la défense de

l’organisme.

les vaisseaux : nombreux mais de petit diamètre, artères, veines et lymphatiques sont

situés sur toute la hauteur du derme mais ne pénètrent pas dans l’épiderme.

les nerfs : ils comportent des filets sensitifs qui sont à l’origine des sensations

provenant de la peau, et des filets sympathiques qui jouent un rôle vasomoteur.

1.2.2 L’hypoderme

L’hypoderme est une couche graisseuse plus ou moins découpée en petits amas, les

lobules graisseux, entre lesquels cheminent les vaisseaux et les nerfs. Elle est destinée à

séparer la peau du muscle

1.3 Les annexes épidermiques

Les annexes épidermiques proviennent de prolongement de l’épiderme qui se sont

enfoncés dans le derme, parfois même dans l’hypoderme.

1.3.1 Les glandes sudoripares

On distingue 2 types de glandes sudorales : eccrines et apocrines. Les glandes sudorales

eccrines, de beaucoup les plus nombreuses, se trouvent sur l’ensemble du tégument et sont

beaucoup plus abondantes aux paumes, aux plantes, aux aisselles et à la poitrine. Elles

193193

forment un tube dont la paroi est constituée de cellules épithéliales et qui s’enfonce jusque

dans l’hypoderme. Là, il se recroqueville pour former un peloton qui est la zone sécrétrice de

la sueur. Les glandes sudorales apocrines siègent dans des territoires plus restreints (périnée,

régions inguinales, axillaires et mamellonaires). Leur diamètre est beaucoup plus grand que

celui des glandes eccrines et surtout elles n’atteignent pas la surface mais se jettent dans le

follicule pileux, juste au dessus du canal drainant les glandes sébacées dans l’espace situé

autour du poil.

1.3.2 Les follicules pilo-sébacés

Ils comportent les follicules pileux proprement dits, qui fabriquent les poils, et les

glandes sébacées, qui forment le sébum. Au niveau de la racine du poil, celui-ci est adhérent

au follicule alors que plus en surface, le poil tend à s‘isoler et se libère de ses attaches ; un

espace est crée entre lui et la paroi du follicule - l’espace péripilaire – dans lequel se jettent les

canaux excréteurs des glandes sébacées et apocrines. Le poil lui-même est constitué de

kératine, mais une kératine dure - différente de celle de la couche cornée – car sans graisse.

Les glandes sébacées sont placées au milieu du derme et ne comporte aucun canal : il n’y

existe en effet que des cellules qui fabriquent de la graisse dont elles se bourrent en se

déplaçant vers le canal excréteur qui les emmène dans l’espace péripilaire. Ce sont les cellules

sébacées elles même qui sont excrétées et pas seulement leur contenu.

2. Méthodes de mesure de l’absorption cutanée

Définitions préalables

Absorption : prise de substances par un organisme, au sens large.

Pénétration : entrée d’une substance dans un organe ou une couche précise.

Perméation : pénétration à travers une couche et vers une autre couche

différente fonctionnellement et structurellement.

La voie cutanée est très largement utilisée pour l’administration de médicaments. En

effet, elle offre la possibilité de pouvoir cibler les différentes couches de la peau

(administration percutanée) ou bien la voie sanguine pour une administration systémique du

principe actif (voie transcutanée). Le devenir du principe actif dans la peau dépend des

propriétés de celle-ci mais aussi des caractéristiques physico-chimiques du principe actif, de la

forme galénique choisie et des excipients. Il est donc essentiel de pouvoir étudier le devenir

d’une molécule après son application sur la peau. Il existe pour cela plusieurs approches :

194194

- méthode in vivo chez l’homme

- méthode in vitro chez l’homme

- méthode in vivo chez l’animal

- méthode in vitro chez l’animal

Bien sur, l’approche la plus attractive consiste à faire des expériences in vivo chez

l’homme. Mais le coût, le facteur temps, les connaissances parfois limitées du produit et

surtout les considérations éthiques rendent cette approche très rare. Les études in vitro chez

l’homme sont aussi difficiles à conduire du fait de la rareté de la peau humaine et des

différences que l’on peut observer entre genre, race, âge, site, etc.. Chez l’animal les

expériences in vivo sont tout aussi coûteuses et longues que chez l’homme, ce qui explique

que, au final, la grande majorité des études de perméation sont faîtes in vitro chez l’animal.

Toutefois, les variations de structure et de pilosité de la peau animale, quel que soit l ‘espèce,

font que l’on ne peut espérer les même résultats, en terme de perméabilité, que ceux obtenus

sur peau humaine. Ainsi, aucune conclusion quant à la perméabilité de la peau humaine ne

peut être déduite des résultats obtenus en laboratoire sur l’animal. Bien sur chez certaines

espèces la différence est moins grande et l’on pourra observer des similarités en terme

d’absorption pour certaines substances mais des différences pour d’autres. Avant d’être utilisé

un modèle animal doit donc être validé pour la substance précise à doser.

Une autre voie s’offre aux chercheurs depuis peu : celle des membranes artificielles.

Leur utilisation pour comprendre les aspects mécaniques du processus de capture par la peau

se développe et on retrouve par exemple dans la littérature : Silastic (polydimethyl siloxane),

cellulose acétate et polyuréthane. Mais la peau est un organe complexe, multicouches et

hétérogène et les membranes synthétiques utilisées jusqu’à maintenant sont des systèmes

homogènes monocouche. De ce fait toute comparaison doit être prise avec prudence. Une des

utilisations intéressante des membranes artificielles est de différencier les paramètres physico-

chimiques influants la perméation des paramètres biologiques qui eux dépendent de la peau.

Par exemple on peut étudier l’influence de la solubilité du p.a, du coefficient de partition, du

pH…

Dans la suite de ce chapitre nous nous concentrerons sur les méthodes de mesure pour

les expériences in vitro sur peau humaine, puisque c’est la technique que nous avons

utilisée pour nos gels à base de vitamine A. Le shéma des cellules de Franz, telles que nous

les avons utilisées est présenté à la fin de ce chapitre (Fig. 26).

Les études sur la peau excisée peuvent être conduites pour n’importe quelle substance

pour déterminer sa pénétration, à partir du moment où la méthode de dosage utilisée est assez

195195

sensible. Précisons qu’à ce jour, aucune substance chimiquement définissable ne s’est

montrée absolument incapable de pénétrer dans la peau. Les résultats obtenus sont des

concentrations dans telle ou telle couche mais en aucun cas ne donnent d’information sur la

perméabilité. L’un des grands avantages de cette technique utilisant des morceaux de peau

excisés est que plusieurs expériences peuvent être faite sur le même spécimen (donc même

espèce, genre, âge et site anatomique) et ainsi permettre une comparaison fiable. Ces

expériences sont particulièrement indiquées pour la mesure des paramètres secondaires telle

que l’influence de la forme galénique, de la température, de l’humidité…

Lorsque l’on souhaite étudier la pénétration d’une substance par une technique in vitro,

on peut choisir de mesurer sa concentration dans la peau ou bien la différence entre la

concentration initiale déposée avant et après l’expérience. Toutefois cette dernière approche

concerne de très faibles différences de concentration puisque la peau n’absorbe que de faibles

quantités. La sensibilité de la méthode de dosage doit donc être particulièrement haute ce qui

signifie que la mesure de radioactivité est la méthode de choix pour ces études. La solution la

plus utilisée reste donc de mesurer la concentration dans la peau. La question se pose alors de

choisir sur quelle « peau » faire l’expérience : peau totale (couche cornée + épiderme +

derme), couche cornée seule , couche cornée + épiderme, etc…Il est en effet possible de

séparer chaque couche et d’adapter le support aux résultats attendus. Comme nous l’avons vu

précédemment, c’est l’épiderme qui représente la barrière importante de la peau, tout d’abord

grâce à la barrière que représente la couche cornée et grâce à l’alternance de zones hydrophiles

et lipophiles.

3. Les compartiments de la peau

Les principes de base de pharmacocinétique furent élaborés par Dost et ses collègues

dans les années 1970. Une tentative a été faite pour appliquer certains de ses principes à la

perméabilité cutanée bien que cela soit très difficile de par la nature complexe de la peau. Le

transport de chaleur, le stockage d’énergie, les fonctions nerveuses, etc. sont autant de

fonctions de la peau qui ne sont pas directement liées à la pénétration de molécules étrangères.

Le cheminement d’un principe actif, appliqué à la surface de la peau, jusqu’à la circulation

sanguine puis son excrétion finale peut être décrit comme un système à plus de 10

196196

compartiments, qui est autrement plus compliqué que celui gérant l’absorption intestinale.

Toutefois, toutes les couches n’ont pas la même importance dans ce processus.

La surface de la peau, ainsi que la substance qui y est appliquée représente le premier

compartiment. Si le principe actif est appliqué seul plutôt que dans un véhicule, alors au

moins une petite partie sera dissoute dans l’eau ou le gras de la peau. Le transfert vers les

couches suivantes, à partir de cette forme solide est un phénomène physico-chimique

mesurable, avec des constantes d’équilibration mesurables et un flux opposé constant. Le

second compartiment représente l’effet de premier passage, caractérisé par l’altération de la

majeure partie du principe actif allant ou sortant de la couche cornée, que ce soit par

décomposition chimique ou par réaction enzymatique ou microbiologique.

La couche cornée, le troisième compartiment, est à la fois une membrane par sa

fonction barrière et un volume par sa fonction réservoir. Dans la peau saine, les constantes de

transfert à partir de ce compartiment (vers l’épiderme, la surface, les glandes sudoripares et les

follicules pileux) sont décisives pour la perméabilité totale. En comparaison, les transferts à

partir de l’épiderme sont rapides. La vitesse de libération à partir du véhicule est souvent bien

plus rapide que la perméation de la couche cornée vers l’épiderme, qui représente donc le

facteur limitant.

Toutes les autres étapes, de l’épiderme vers le derme puis le sang ou l’hypoderme et

finalement les urines se font plus rapidement et toujours avec un flux opposé simultané. A

partie de l’épiderme il y a aussi métabolisation (radiolyse, décomposition chimique ou

microbienne, métabolisme actif ou passif) et liaison dans la peau. Par exemple, pour les

substances lipophiles, le gras de l’hypoderme et des glandes sébacées constitue un large

volume de stockage.

4. Aspects qualitatifs et quantitatifs de l’absorption cutanée

La couche cornée, faite de cornéocytes non-vivants fermement lié et de voies de

transport non perceptibles telles les glandes sébacées et sudoripares, peut être envisagée

comme une membrane passive. La plupart des substances la traverseront proportionnellement

au gradient de concentration entre le coté supérieur et inférieur de la membrane. Ainsi on peut

appliquer la loi de Fick, du moins tant que la concentration en surface est grande et la

concentration dans l’épiderme faible. D’après certains auteurs [Garcia, 2001] les relations

concernant la diffusion à travers la couche cornée peuvent être décrites par la formule

simplifiée : J = (Dm*Km)/Th

197197

où J est la quantité de substance pénétrant dans la couche cornée

Dm est la vitesse de diffusion à travers la couche cornée

Km est le coefficient de solubilité véhicule-membrane

Th est l’épaisseur de la couche cornée

La plupart des substances peuvent pénétrer très rapidement dans la couche cornée. La

distribution dans cette couche suit une ligne droite sur une courbe semi-logarithmique

exprimant la concentration en fonction de la profondeur, ce qui signifie qu’initialement de

faibles quantités atteignent les couches profondes, alors qu’un excès considérable reste à la

surface et dans les feuillets les plus externes. Il existe donc un gradient de concentration dans

la couche cornée. On considère qu’il existe un réservoir de principe actif tant que la quantité

de principe actif sur ou dans les couches superficielles et intermédiaires du stratum corneum

est supérieure à celle qui est déjà dans les couches profondes du stratum corneum ou dans

l’épiderme. Il faut savoir que la plus grande partie de ce qui a été appliqué sur la peau ne

pénètre pas dans les cellules vivantes de la peau (75% à 99.5%), mais ce surplus est nécessaire

au gradient de concentration.

Pour parvenir à l’épiderme vivant, c’est à dire traverser le SC, une molécule a trois

possibilités. Elle peut diffuser entre les cellules, à travers les cellules ou à travers les follicules

pilo-sébacés ou les glandes sudoripares. L’importance relative de chacune des voies paraît être

influencée par les caractéristiques du produit appliqué et celles de la surface cutanée.

diffusion intracellulaire : autrefois considérée comme la voie majeur, désormais

controversée

diffusion intercellulaire (espaces lipidiques) : voie préférentielle pour de

nombreuses molécules, même polaires comme l’eau. Les modalités de pénétration

restent encore obscures

diffusion à travers les annexes cutanées : bien que la surface couverte par les annexes

cutanées soit inférieur à 1% de la surface cutanée, l’absence de barrière cornée au niveau de

ces annexes favorise l’absorption des molécules. Cette voie interviendrait au cours des

premières minutes de diffusion des molécules plus ou moins polaires. En fait, elle bénéficie

surtout aux molécules de grande taille et de faible polarité pour lesquelles elle est la seule

issue possible.

Dans l’épiderme, le principe actif se retrouve dans un volume de distribution 10 fois

plus grand (que la couche cornée) dans lequel on ne trouve plus cette alternance de zones

hydrophiles et lipophiles étroitement collées. La résistance à la perméation y est largement

plus faible car le principe actif peut être transporté par les fluides intercellulaires. L’état

198198

d’équilibre est atteint très rapidement. La pénétration plus en profondeur vers le derme est

souvent un phénomène continu car il n’a pas de « barrière » à l’interface épiderme-derme. A

ce niveau, les flux sanguin et lymphatique doit jouer un rôle important sur le transport des

substances, puis qu’ils passent dans le derme.

Figure 26. Représentation shématique

des cellules de Franz utilisées

dans ce travail de thèse.

199199

200200

ANNEXE 2 : DOSAGES IMMUNOENZYMATIQUES

1. Le système immunitaire : présentation des anticorps.

Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour protéger un

organisme des agressions extérieures comme l’intrusion d’organismes pathogènes par

exemple. Ces molécules sont produites par les lymphocytes B en réponse à l’intrusion d’une

molécule étrangère à l’organisme hôte. Ces substances étrangères capables de déclencher une

réponse immunitaire sont dénommées antigènes, et ce sont en générale des composés

possédant des molécules de masse supérieure à 5000 Da. Les molécules plus petites (M<5000

Da) sont appelées haptènes; elles ne sont pas capables à elles seules de déclencher une

réponse immunitaire (on dit qu’elles sont dépourvues d’immunogénicité). Cependant, on sait

produire des anticorps contre ces haptènes en les couplant chimiquement (le plus souvent de

façon covalente) à des antigènes. Le conjugué ainsi formé (appelé immunogène) sera injecté à

un animal et induira une production d’anticorps dirigés, entre autres, contre le motif

hapténique.

Lors de la pénétration de molécules étrangères dans un organisme, les anticorps dirigés

contre ces composés vont se lier à ces intrus, et faciliter ainsi l’éradication de l'organisme

pathogène par les cellules phagocytaires. Un organisme de vertébré produit donc un très grand

nombre d’anticorps différents contre n’importe quel organisme ou molécule reconnus comme

étranger (il est couramment admis, par exemple, que les mammifères peuvent produire

plusieurs milliards d’anticorps différents). Ces différents anticorps se retrouvent sous forme

de mélange dans la circulation sanguine. Ainsi, quand on utilise un plasma ou un sérum

comme source d’anticorps, on parle d’anticorps polyclonaux. On sait depuis 1975 [Köhler,

1975] obtenir des anticorps produits par une seule lignée de lymphocytes (technique

d’hybridation lymphocytaire), et donc tous identiques moléculairement ; on parle alors

d’anticorps monoclonaux.

201201

Figure 27. Représentation schématique d'un anticorps (ici, une molécule

d’immunoglobuline G, encore notée IgG).

Du point de vue structural, les anticorps sont des glycoprotéines constituées d’un

arrangement quaternaire de plusieurs sous-unités peptidiques. On distingue quatre chaînes

protéiques : deux chaînes dites lourdes (nommées VH, H pour Heavy, et dont la masse est

proche de 50 kDa), et deux chaînes légères (nommées VL, L pour Light, de masse moléculaire

environ 25 kDa). Ces quatre polypeptides sont arrangés de manière symétrique, chacune des

chaînes légères étant associée à une chaîne lourde, et l’assemblage global étant assuré par

plusieurs ponts disulfures intra- et inter-catennaires.

On distingue dans les immunoglobulines deux grandes régions : une partie est dite

constante, et l’autre variable. Ce sont les parties constantes, constituées par les parties C-

terminales des polypeptides qui permettent de distinguer les différentes classes

d’immunoglobulines. Ainsi, il existe 5 classes d’immunoglobulines chez les mammifères,

dénommées IgA, IgD, IgE, IgG et IgM, qui se distinguent chacune par la partie constante de

leurs chaînes lourdes, α, β, ε, γ, et µ, respectivement. Ce sont les IgG les plus fréquentes, et ce

sont elles que nous avons utilisées pour les expériences de reconnaissance immunologique.

Les parties variables sont, elles, responsables de la reconnaissance pour un antigène

donné. Elles sont constituées d’une partie des chaînes lourdes, et d’une partie des chaînes

202202

légères (les extrémités N-terminales) qui créent ainsi 2 sites de liaisons par anticorps (voir

schéma de l’IgG). On distingue dans ces parties variables un sous-motif qualifié

«d’hypervariable», et qui est directement impliqué dans l’interaction avec l’antigène. Ces

régions hypervariables sont constituées d’un arrangement conformationel et fonctionnel (le

paratope) spécifique à la liaison avec une partie de l’antigène (l’épitope). Le phénomène pur

de reconnaissance ne met cependant en jeu que quelques uns des acides aminés de ces régions

hypervariables.

2. Obtention des anticorps.

Nous décrirons ici une méthode générale d’obtention d’anticorps dirigés contre des

haptènes, en étudiant plus particulièrement la production d’anticorps anti-cyclodextrines.

Les haptènes sont de petites molécules (M < 5000Da) qui ne suffisent pas à elles seules

à induire une réponse immunitaire chez un mammifère. On fabrique donc un immunogène en

greffant de façon covalente l’haptène sur une protéine étrangère à l’hôte auquel on veut faire

produire des anticorps (typiquement, un lapin). Le système immunitaire va produire des

anticorps dirigés contre l’ensemble des épitopes portés par cette protéine étrangère (KLH +

haptène ou BSA + haptène), et dans cet ensemble d’anticorps, certains seront dirigés contre

l’haptène préalablement greffé.

Pour les cyclodextrines, on utilise les dérivés mono-6-désoxy-6-amino-cyclodextrines

(CD-NH2). Cet haptène est couplé de façon covalente à la Sérum Albumine Bovine (BSA),

protéine étrangère à l’organisme du lapin, en utilisant le glutaraldéhyde comme bras espaceur

(la façon dont le glutaraldéhyde lie les deux molécules n’est pas bien connue, mais le

glutaraldéhyde réagit probablement sous sa forme polymérique). L'agent de couplage réagit en

créant des fonctions imines à partir des fonctions amines primaires de la CD et de la BSA.

NH2 CH3NH2

CD +BSA

IMMUNOGENE

CDBSA

OHC CHON N

Figure 28: Préparation de l'immunogène.

203203

Pour réaliser ceci, 900 nmol d'haptène et 30 mg de BSA sont dissouts dans 2 ml de

tampon phosphate (0.1 M, pH 7.4). On ajoute à cette solution 8 µL de solution aqueuse de

glutaraldéhyde (25 % (v/v)). La solution est agitée durant 16 H à Tamb, puis dialysée contre

deux litres de tampon phosphate 10-1 M. L'immunogène est stocké à - 30 °C jusqu'à

utilisation. Les lapins sont immunisés par injection intradermique de l’immunogène. Afin

d’accroître la réponse immunitaire du lapin, l’immunogène est émulsionné dans de l’adjuvant

de Freund complet [Hoogenraad, 1986]. 1 mg d’immunogène est injecté au lapin. Six

semaines après la première injection, les animaux reçoivent une injection de rappel. Cette

opération est ensuite répétée tous les mois, tandis que l’on vérifie la présence et le titre des

anticorps spécifiques dans les saignées effectuées avant et après chaque rappel.

Ce sont ces protéines générées par le système immunitaire qui sont la base des dosages

immunologiques.

3. Les dosages immunologiques

3.1 Principe

Sous le terme de dosages immunologiques sont regroupées différentes méthodes

d’analyse qui on toutes en commun d’utiliser à la fois des anticorps (Ac) et des molécules

marquées. Les anticorps ont la propriété de former des complexes spécifiques de haute affinité

avec les antigènes (Ag) contre lesquels ils ont été produits. Les dosages immunologiques

exploitent les propriétés de base de l’interaction Ag-Ac. Dans sa forme la plus simple, celle-ci

peut être décrite par l’équilibre suivant :

Ag + Ac → AgAc

Il est admis que cet équilibre obéit à la loi d’action de masse et donc que les

concentrations de ces constituants sont reliées entre elles par la relation :

Kd = [Ag] [Ac] × [AgAc] –1 où Kd est la constante de dissociation du complexe Ag-Ac

De cet équilibre on peut déduire que la concentration des complexes AgAc formés

dépend des concentrations en Ag et en Ac introduites dans la réaction. Si l’on suppose

constante la concentration totale en Ac, on peut montrer qu’il existe une relation

mathématique simple reliant [Ag] à [Ag-Ac]. Cette relation va permettre de mesurer la

concentration en Ag si l’on est capable de mesurer la concentration du complexe formé.

On pourrait alors penser qu’il est possible de mesurer la concentration d’un Ag au

moyen d’un seul équilibre réalisé avec une quantité connue d‘Ac. Ceci serait possible si on

204204

pouvait connaître avec précision la concentration totale en Ac, le Kd et la concentration du

complexe formé. En pratique, ces trois conditions ne sont jamais réalisées en même temps et

tous les dosages immunologiques sont, en fait, des méthodes d’analyses relatives faisant appel

à des courbes d’étalonnage. Celles-ci sont établies en réalisant plusieurs équilibres avec des

concentrations connues et variables d’Ag. En mesurant pour chaque équilibre la quantité de

complexe formé, on va établir une relation expérimentale entre la concentration de l’Ag et

celle du complexe AgAc. C’est à partir de cette relation que l’on va mesurer la concentration

de l’Ag dans un échantillon inconnu traité dans les mêmes conditions expérimentales que les

solutions étalons. Dans ces conditions, il n’est pas nécessaire de travailler dans des conditions

d’équilibre.

Pour effectuer un dosage immunologique, il faut donc pouvoir mesurer la concentration

du complexe AgAc formé. C’est pour rendre plus facile cette mesure que l’on a recours à

l’utilisation de molécules marquées. Il s’agit d’Ag ou d’Ac auxquels on associe un signal les

rendant facilement mesurables au moyen d’une méthode physico-chimique quelconque. De

très nombreux marqueurs ont été décrits mais les plus utilisés sont les marqueurs radioactifs

(dosage radioimmunologiques), les marqueurs fluorescents (dosages fluoroimmunologiques)

et les enzymes (dosages immunoenzymatiques). Nous nous concentrerons sur ce dernier cas

qui est la méthode que nous avons utilisée.

Pour permettre des dosages sensibles, un bon traceur doit pouvoir être détecté à des

concentrations très faibles, c’est à dira posséder une activité spécifique la plus élevée possible.

Il faut aussi que l’opération de marquage respecte les structures essentielles de l’Ac afin que

la stabilité du complexe ne soit pas affectée.

Les enzymes les plus utilisées restent la phosphatase alcaline et la peroxydase de

Raifort. Au laboratoire, nous utilisons plutôt l’acétylcholinesterase ou AchE (E.C 3.1.1.7) en

raison de sa très grande activité catalytique qui confère aux traceurs synthétisés à partir de

cette enzyme des activités spécifiques très élevées souvent comparables à celles des traceurs

radioactifs. La fonction principale de cette enzyme est l’hydrolyse de l’acétylcholine dans la

synapse cholinergique. Pour détecter cette enzyme on utilise le réactif d’Ellman [Ellman,

1961] (Fig.3) qui est un mélange d’acétylthiocholine, un pseudo-substrat de l’AchE, et le

DTNB. L’hydrolyse de l’ acétylthiocholine aboutit à la production de thiocholine qui réagit

avec le DTNB ox., réactif classiquement utilisé pour mesurer les groupements thiols, et

entraîne la formation de DTNB réduit. Ce dernier est un chromophore (λmax 414 nm, εM

13600cm-1.M-1) qui absorbe fortement dans le visible en produisant une couleur jaune.

205205

Acétylthiocholine Thiocholine

AChE CH3COO- + -S-CH2CH2N(CH3)3++ 2H+CH3COS-CH2CH2N(CH3)3

+ + H2O

S

S NO2

O2N

-OOC

COO- SH NO2

COO-

S NO2

COO-

SN+

CH3CH3

CH3

DTNB

DTNBRéduit (coloré)

+-S-CH2-CH2-N

+(CH3)3 +

Figure 29. Principe de la méthode colorimétrique d’Ellman.

Il est courant d’exprimer les concentrations d’AchE en fonction des mesures effectuées

avec la méthode d’Ellman. Une unité Ellman correspond à la quantité d’enzyme produisant un

accroissement d’absorbance d’une unité à 414 nm pendant une minute, dans un volume de 1

mL de milieu Ellman, pour 1 cm de trajet optique à 25°C.

Dans certains cas, la formation de complexe s’accompagne d’une modification du signal

porté par le traceur. Les dosages de ce type sont appelés homogène car la mesure est effectuée

directement sur l’ensemble des constituants de l’équilibre immunologique. A l’opposé on

distingue les dosages hétérogènes, pour lesquels la formation des complexes Ag-Ac ne

modifie pas le signal porté par le traceur. Dans ce cas, pour accéder à la mesure des complexe

Ag-Ac, il faut procéder à une séparation des différents constituants de l’équilibre et

notamment séparer le traceur non complexé de celui engagé dans les complexes Ag-Ac. Cette

séparation, qui doit être effectuée avant la mesure finale, fait presque toujours appel à une

séparation de phase (liquide/solide). Dans la suite de cet exposé nous envisagerons seulement

le cas des dosages hétérogènes que nous avons utilisé.

Nous venons d’examiner les principes de base sur lesquels reposent les dosages

immunologiques et nous avons vu comment la formation de complexes Ag-Ac et l’utilisation

de molécules marquées permettait de mesurer des concentrations d’Ag ou d’Ac. Ces principes

ne sont pas propres aux dosages immunologiques et on pourrait les appliquer, par exemple,

aux dosages faisant intervenir des récepteurs. Si les dosages immunologiques ont connu un

développement si spectaculaire ces trente dernières années, c’est parce qu’ils sont dotés

d’autres propriétés remarquables. Ce sont d’abord des méthodes très générales dans la mesure

où il est possible d’obtenir des Ac contre à peu près n’importe quelle molécule. Le succès des

dosages immunologiques est aussi dû à deux propriétés essentielles de l’interaction Ag-Ac :

spécificité et affinité. C’est grâce à la spécificité des Ac, c’est à dire à leur aptitude à ne

former des complexes qu’avec le seul Ag contre lequel ils ont été produit, que les dosages

206206

immunologiques pourront être effectués dans des milieux biologiques complexes (plasma,

urines, extraits de tissus) sans purification préalable. Et c’est grâce à la grande stabilité des

complexes que les dosages immunologiques pourront être très sensibles. Or ces complexes ne

se formeront de façon mesurable, à de très faibles concentrations, que si la constante de

dissociation de ces complexes le permet. Avec des Kd de l’ordre de 10-9M et pouvant aller

jusqu’à 10-12M, les Ac permettent de mesurer de très faibles concentrations d’Ag. Ainsi, que

ce soit en termes de spécificité ou d’affinité, les Ac sont les réactifs les plus performants

actuellement accessibles aux biologistes avec les sondes nucléotides.

Il ne saurait être question ici de décrire les très nombreuses méthodes faisant intervenir

la relation Ag-Ac. Nous nous bornerons à décrire succinctement le type de dosage hétérogène

que nous avons utilisé : le dosage par compétition.

3.2 Dosage par compétition

Les dosages par compétition mettent en jeu 3 composants: un anticorps (poly ou

monoclonal), un antigène marqué (le traceur) et le même antigène non marqué. Le fait

d’utiliser comme traceur l’antigène marqué est l’une des caractéristiques essentielles des

dosages par compétition. Le traceur (Ag*) et l’antigène (Ag) non marqué sont aptes à se lier

tous les deux aux mêmes anticorps (Ac), et de ce fait, à établir une compétition si la

concentration des sites anticorps est limitante. Le principe de compétition met donc en œuvre

deux équilibres :

Ag* + Ac Ag*Ac Kd*= [Ac][Ag*]/[Ag*Ac]

Ag + Ac AgAc Kd= [Ac][Ag]/[AgAc]

On peut montrer que si la concentration en anticorps et en traceurs est constante, la

concentration en complexe Ag*Ac diminue quand la concentration d’antigènes non marqués

introduite dans l’équilibre augmente, et ceci pour toutes valeurs de Kd et Kd*.

3.2.1 Préparation du traceur pour le dosage par compétition.

Comme indiqué précédemment, un traceur pour dosage par compétition est obtenu en

couplant de façon covalente l’haptène étudié à l’acétylcholinestérase. Il existe de nombreuses

207207

façons de coupler l’haptène sur l’enzyme. La méthode employée dépend uniquement des

fonctions chimiques réactives disponibles sur l’haptène. Dans le cas des cyclodextrines, le

traceur est préparé en exploitant la fonction amine du dérivé mono-6-désoxy-6-amino-

cyclodextrines (CD-NH2), en utilisant le protocole précédemment décrit pour les haptènes

[McLaughlin, 1987] ou pour les protéines [Grassi, 1989].

SATA

NH2OH

NH2

CD

NHCOCH2SH

CD

SMCCA C

h E

NH2

A C

h E

N

O

OO

S

ONH

NH

CD

Traceur CD-G4

A C

h E

N

O

OO

NH

AChE-G4-SMCC

Figure 30. Synthèse du traceur enzymatique CD-AChE-G4.

Le dérivé mono-6-désoxy-6-amino-cyclodextrine (CD-NH2) est d’abord thiolé en faisant

réagir le groupe amine de la CD-NH2 avec le N-succinimidyl-S-acétylthioacétate (SATA) en

milieu alcalin. A une solution de CD-NH2 (1µmol) en tampon borate (1 ml de tampon borate

0.1 M, pH 8.5) on ajoute 50 µl d'une solution de SATA dans le DMF anhydre (2.13 mg, 9.2

µmol). La réaction a lieu à température ambiante durant 30 mn avant purification de la CD-

SATA sur cartouche de SEP-PAK C18. Le dérivé thiolé est élué avec du méthanol, lyophilisé

et repris dans 1.6 ml de tampon phosphate préalablement dégazé (tampon phosphate 0.1 M,

pH 6). On ajoute alors 400 µL d'une solution de chlorure d'hydroxylamine (pH 7). Après 30

mn de réaction, le nombre de fonctions thiols est estimé par colorimétrie, en faisant réagir le

milieu réactionnel avec 0.5 mM de 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoique acide) (DTNB) selon la

procédure décrite par Ellman [Ellman, 1959].

L'acétylcholinestérase (sous sa forme globulaire G4, préalablement extraite à partir des

organes électriques de Gymnote et purifiée par chromatographie d'affinité [Massoulié, 1976])

est de son côté fonctionnalisée par réaction avec le N-succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl)

cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, un agent bifonctionnel), puis purifiée comme

précédement décrit [Grassi, 1989]. Le couplage de la cyclodextrine thiolée (3 nmol) avec

l'AChE fonctionnalisée (0.3 nmol AChE-G4-SMCC) est réalisé en milieu tampon phosphate

(0.1 M, pH 6, 275 µL) durant 3 h à 30°C. Le traceur CD-AChE est alors purifié par filtration

sur gel de sépharose (Biogel A, colonne de 90 x 1.5 cm, éluant tampon EIA).

208208

3.2.2 Mise en œuvre; interprétations.

La mise en œuvre d’un dosage immunoenzymatique par compétition nécessite la

préparation d'un traceur (antigène étudié lié de façon covalente à l’acétylcholinestérase), et

d’avoir à notre disposition un anticorps spécifique de l’antigène étudié (voir le chapitre

concernant la préparation de l’immunogène à partir d’un haptène).

Les dosages immunologiques sont réalisés dans des plaques de microtitration

comprenant 96 puits. Un prétraitement nécessaire à la bonne réalisation du dosage (schéma 1,

fig 30), consiste à recouvrir les puits avec un anticorps monoclonal de souris dirigé contre la

partie constante des immunoglobulines de lapin. La première étape du dosage consiste à

mélanger dans un même puits, une quantité constante de ces anticorps spécifiques de lapin

avec une quantité constante de traceur (antigène-AChE), et une quantité variable de l’antigène

étudié (schéma 2, fig 30). Après l’étape de réaction immunologique (typiquement 18 h à 4 °C)

et après une étape de lavage soigné, on se retrouve dans la situation du schéma 3, où certains

sites sont occupés par une molécule de traceur, ou bien, par une molécule d’antigène,

l’excédant ayant été éliminé par l’étape de lavage.

Figure 31. Principe du dosage immunoenzymatique par compétition.

La quantité d’AChE fixée sur la phase solide est alors détectée par la méthode

colorimétrique d’Ellman en ajoutant dans chacun des puits un mélange d’acétylthiocholine et

209209

de DTNB (schéma 4, fig 30). Après une à deux heures de réaction enzymatique, l’absorbance

(λ= 414 nm) de chaque puits est mesurée à l’aide d’un lecteur approprié.

La réalisation de ces mesures sur une gamme de concentration de l’antigène étudié

conduit à l’obtention de courbe de type B = f([concentration]), B étant l’absorbance du milieu

à 414 nm, pour une concentration donnée d’antigène. Il est cependant plus pratique de

représenter ces courbes sous une forme semi-logarithmique, en traçant 100*B/B0 = f

([concentration]), B0 étant l’absorbance mesurée en absence d’antigène non marqué (figure

31).

Figure 32. Courbe dose-réponse obtenue lors d'un dosage immunologique par

compétition.

Il est à noter que des mesures de liaison non spécifique (absorbance mesurée en absence

d’anticorps spécifiques) sont effectuées à chaque dosage.

On peut estimer grossièrement la sensibilité d’un dosage par la valeur de la

concentration en antigène qui correspond à une valeur de B*100/B0 de 50 % de B0. Cette

valeur caractérise la zone de concentration dans laquelle le dosage présente la précision

maximale. Lors du dosage, on doit donc trouver les dilutions de l’échantillons permettant

d’obtenir des valeurs de concentration compris dans cette zone. (La sensibilité d’un dosage

par compétition est définie de façon plus rigoureuse par la « concentration minimale

détectable », c’est à dire la plus petite concentration d’antigène capable d’induire une

210210

diminution statistiquement significative de la valeur de B0. Expérimentalement, elle est

déterminée en calculant la concentration d’antigène correspondant à B0-3σ, σ étant l’écart

type estimé sur la mesure de B0).

La spécificité d’un dosage peut être évaluée en réalisant des courbes d’étalonnage avec

des substances structuralement et fonctionnellement apparentées. On définit alors le

pourcentage de réaction croisée RC (%) (critère d’Abraham, Abraham, 1974):

[Ag]50%

[analogue] x 100RC (%) =50%

Figure 33. Formule du critère d'Abraham (Abraham, 1974).

[Ag]50% et [analogue]50% représentant respectivement les concentrations d’antigène et

d’analogue qui engendrent un signal de 50 % de B0. La comparaison des valeurs de B/B0 à

50% mesurées pour une série de produits testés dans les mêmes conditions permet d’estimer

l’affinité relative de chacun de ces produits pour les anticorps étudiés.

Dans le cas du dosage de la Rameb, notre limite de détection est de 0.1 ng/mL et le

B/B0 50% correspond à environ 1.5 ng/mL.

La sensibilité d’un dosage dépend de nombreux paramètres et notamment de la

concentration du traceur et de l’Ac. La règle générale est que le dosage sera d’autant plus

sensible que l’anticorps et le traceur sont plus dilués. Cette règle découle du principe de la

compétition, celle-ci s’exerçant plus facilement à l’avantage de l’antigène non marqué, si le

traceur est peu concentré et si la concentration en Ac est limitante. En conséquence, si l’on

veut utiliser un traceur à de très faibles concentrations, il faut que celui-ci possède une activité

spécifique telle qu’à ces concentrations il fournisse encore un signal mesurable. C’est le cas

de l’AchE dont la limite théorique de détection, dans les conditions d’utilisation habituelles

(200µL d’Ellman, trajet optique de 0.44 cm, 1 heure de réaction) est de 1.85 10-18 mole.

Avec des traceurs aussi performants, c’est presque toujours la stabilité du complexe qui

limite les dilutions que l’on peut faire subir à l’Ac. Même s’il est possible dans certains cas

d’influencer la réponse immunitaire, il faut considérer que l’affinité des Ac produits par un

animal échappe en grande partie à l’expérimentateur. Bien entendu, il n’est pas possible de

diluer indéfiniment traceurs et anticorps et il existe, en théorie pour chaque dosage (un traceur

et un Ac donné) une combinaison idéale qu’il conviendrait de déterminer à chaque fois. En

pratique, on opère souvent de façon plus empirique en fixant arbitrairement la concentration

211211

du traceur et en déterminant ensuite par dilutions successives, la concentration minimale

d’anticorps utilisable. C’est la technique que nous avons utilisée.

Pour chaque échantillon, nous avons évalué la qualité du dosage grâce au critère de

répétabilité ou précision intra-essai, qui exprime la variation des résultats au cours d’une

même analyse et est évaluée en dosant systématiquement sur une même plaque chaque

échantillon à 4 concentrations différentes. Pour être pris en compte les résultats doivent bien

sur se situer dans la zone proche du B/B0 50% (généralement 30% < B/B0 < 70%).

212212

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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