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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
DENISE MARIA DE LIMA E SILVA
AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DO ÓLEO VEGETAL ORIUNDO
DA EXTRAÇÃO DE ASTAXANTINA A PARTIR DA FARINHA E DO RESÍDUO DE
CAMARÃO (LITOPENAEUS VANNAMEI)
NATAL/RN
2016
1
DENISE MARIA DE LIMA E SILVA
AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DO ÓLEO VEGETAL ORIUNDO
DA EXTRAÇÃO DE ASTAXANTINA A PARTIR DA FARINHA E DO RESÍDUO DE
CAMARÃO (LITOPENAEUS VANNAMEI)
Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de Pós-Graduação em Nutrição, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Nutrição. Orientadora: Profª. Drª. Cristiane Fernandes de Assis
NATAL/RN
2016
2
Serviços técnicos
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Lima e Silva, Denise Maria de.
Avaliação da capacidade antioxidante do óleo vegetal oriundo
da extração de astaxantina a partir da farinha e do resíduo de
camarão (Litopenaeus Vannamei) / Denise Maria de Lima e Silva. -
2017.
70f.: il.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em
Nutrição. Natal, RN, 2017.
Orientadora: Profa. Dra. Cristiane Fernandes de Assis.
1. Óleo natural - Dissertação. 2. Astaxantina - Dissertação.
3. Carotenoide - Dissertação. 4. Antioxidante - Dissertação. 5.
Óleo pigmentado - Qualidade - Dissertação. 6. Cefalotórax
(Camarão) - Dissertação. I. Assis, Cristiane Fernandes de. II.
Título.
RN/UF/BCZM CDU 665.219:613.268
3
DENISE MARIA DE LIMA E SILVA
AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DO ÓLEO VEGETAL ORIUNDO
DA EXTRAÇÃO DE ASTAXANTINA A PARTIR DA FARINHA E DO RESÍDUO DE
CAMARÃO (LITOPENAEUS VANNAMEI)
Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de Pós-Graduação em Nutrição, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Nutrição.
APROVADA EM ___ de _________________ de ______
Profª. Drª. Lúcia de Fátima Campos Pedrosa
Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Nutrição
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
BANCA EXAMINADORA
Profª. Drª. Cristiane Fernandes de Assis Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Orientadora
Profª. Drª. Thaís Souza Passos Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Membro Externo
Profª. Drª. Samara Alvachian Cardoso Andrade Universidade Federal de Pernambuco - UFPE
Membro Externo
4
Dedico esse trabalho a Deus, a meus
pais Antônio Bondade e Maria de
Fátima e a meu noivo Felipe Galvão.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus, pois sem ele a realização desse sonho não seria possível.
Aos meus pais Antônio Bondade e Maria de Fátima, que sempre me
incentivaram a lutar pelos meus sonhos e por todo amor e carinho durante todos esses
anos.
Ao meu noivo Felipe Galvão, por me apoiar durante essa jornada e por ser
meu porto seguro em todos os momentos.
A minha tia Antônia Lima (Dida), que me recebeu em sua casa como uma
filha e que sempre acreditou no meu crescimento profissional e pessoal.
Aos meus familiares, que de forma direta e indireta me ajudaram na
construção desse trabalho, assim como acreditaram no meu sucesso.
Aos meus amigos, em especial a Fabiana Coimbra, Penha Cabral e
Séphora Louyse, por todo carinho e ajuda que me deram durante esse tempo e pela
certeza que essa amizade se perpetuará por muitos anos.
Aos professores do PPGNUT, que brilhantemente se dedicam a passar o
conhecimento a seus alunos de forma simples e natural.
Ao PPGNUT, em especial a professora Lúcia Pedrosa, por toda dedicação
aos alunos do programa, assim como por todo auxílio e incentivo.
A minha orientadora Cristiane Assis, por ter sido uma companheira na
construção desse trabalho, assim como por todo apoio quanto educadora e amiga.
A professora Karla Suzanne, que é mais que uma colaboradora nesse
trabalho, por todo carinho dedicado e por ser esse exemplo de profissional, amiga e
mãe.
As professoras Thaís Souza, Kátia Gomes e Roberta Targino pela
disponibilidade e ajuda que foram fundamentais para o incremento desse trabalho.
A turma nota 100, por todos os momentos compartilhados e pela torcida do
sucesso um do outro.
As alunas de iniciação científica Ana Paula, Helen Francisca, Lídia
Rodrigues, Mariana Mesquita e Nathália Oliveira, por toda ajuda e dedicação na
construção desse trabalho.
6
“A maior recompensa para o trabalho do homem não é o que ele ganha com isso, mas o
que ele se torna com isso”. John Ruskin
7
RESUMO
A astaxantina é encontrada naturalmente em resíduos de camarão e pode ser extraída
de diversas formas, dentre elas tem-se a extração com óleo vegetal, o qual contribui
para a estabilidade, retardando a oxidação. O óleo de soja por sua vez apresenta
como vantagens a excelente otimização de extração e o baixo custo. Objetivou-se
com esse estudo, avaliar as características físicas e físico-químicas e a capacidade
antioxidante de óleos vegetais pigmentados, oriundos da extração da astaxantina a
partir do resíduo de camarão (Litopenaeus vannamei). Os óleos pigmentados do
resíduo de camarão (OR) e da farinha do resíduo de camarão (OF) obtidos foram
avaliados quanto ao teor de astaxantina, características físicas e físico-químicas e
capacidade antioxidante. As amostras de OR e OF apresentaram um teor de
astaxantina respectivamente de 70,9 e 264,7 µg/g, sendo a desidratação a
responsável por esse aumento de 3,7 vezes. Do mesmo modo, seu poder antioxidante
está diretamente associado com o teor de astaxantina. No teste da Capacidade de
Absorção de Radicais de Oxigênio (ORAC), OR e OF exibiram uma atividade
antioxidante de 0,4957 e 0,4840 µmol eq trolox/g, respectivamente. Entretanto,
algumas caraterísticas físicas e físico-químicas de OF apresentaram alterações.
Diante do exposto, os óleos pigmentados oriundo dos resíduos de camarão
apresentam um significativo potencial para uso em alimentos como um antioxidante
natural devido ao poder antioxidante, e ao baixo custo de obtenção.
Palavras-Chaves: Cefalotórax, pigmento natural, carotenoide, bioatividade e
qualidade de óleo.
8
ABSTRACT
Astaxanthin is found naturally in shrimp residues and can be extracted in varying ways.
The extraction with vegetable oil contributes to stability from this carotenoid, retarding
its oxidation. The advantages of the soybean oil are excellent extraction optimization
and low cost.The objective of this study was to evaluate the physical and physical-
chemical characteristics and the antioxidant capacity of the pigmented oils obtained
from the extraction of astaxanthin from the shrimp waste (litopenaeus vannamei). The
obtained pigmented oils of the shrimp waste (OW) and of the shrimp waste flour (OF)
were evaluated for astaxanthin content, physical and physico-chemical characteristics
and antioxidant capacity. The samples of OW and OF showed an astaxanthin content
of 70.9 and 264.7 μg / g, respectively, where the decrease in moisture was responsible
for this increase of 3.7 times. Likewise, its antioxidant power is directly associated with
the astaxanthin contente. In the Oxygen Radical Absorption Capacity (ORAC) test,
OW and OF exhibited an antioxidant activity of 0.4957 and 0.4840 μmol eq trolox / g,
respectively. However, some physical and physico-chemical characteristics of OF
presented changes. Therefore, the pigmented oils from shrimp waste present a
significant potential for the use in food as a natural antioxidant due to its antioxidant
power, as well as the low price to obtain it.
Key words: Cephalothorax, natural pigment, carotenoids, bioactivity, oil quality.
9
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Fluxograma do beneficiamento de camarão........................................ 20
Figura 2. Estrutura química da astaxantina......................................................... 21
Figura 3. Fluxograma de obtenção das amostras............................................... 29
Figura 4. A: Resíduo de camarão triturado. B: Farinha do resíduo de
camarão...............................................................................................................
30
Figura 5. A: Óleo pigmentado do resíduo de camarão (OR). B: Óleo pigmentado
da farinha do resíduo de camarão (OF) ...............................................................
31
Figura 6. Fluxograma de obtenção dos extratos.................................................. 33
10
LISTA DE TABELAS
Table 1. Physical and physico-chemical characteristics of pigmented oils with
astaxanthin (OW and OF) and soybean oil (SO) as analyzed by different
methods...............................................................................................................
58
Table 2. Antioxidant activity of pigmented oils with astaxanthin (OW and OF)
and soybean oil (SO) as analyzed by the different antioxidant tests……………...
59
Table 3. Antioxidant activity of methanolic layer of pigmented oils with
astaxanthin (OWML and OFML) and soybean oil (SOML) as analyzed by different
antioxidant tests...................................................................................................
60
Table 4. Antioxidant activity of the lipid layer of pigmented oils with astaxanthin
(OWLL and OFLL) and soybean oil (SOLL) as analyzed by different antioxidant
tests.....................................................................................................................
61
11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
=O Carbonila
AAPH Dicloreto de 2,2’-azobis (2-amidinopropano)
ANOVA Análise de variância
BHA 2,3-terc-butil-4-hidroxianisol
BHT 2,6-diterc-butil-p-creso
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CL Camada lipídica
CM Camada metanólica
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CO2 Dióxido de carbono
D Fator de diluição
DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazil
E Coeficiente de extinção
Fe2+ Ferrocianeto
Fe3+ Ferricianeto
G Grama
HAT Transferência de Átomo de Hidrogênio
Kg/ha/ano Quilo por habitante por ano
Kg Quilo
mg Miligrama
mL Mililitro
mM Milimolar
mPa Milipascal
NBT Nitrozul de tetrazólio
nm Nanômetro
nM Nanomolar
º C Graus celsius
O2 Oxigênio
OF Óleo pigmentado da farinha do resíduo de camarão
OF-CL Camada lipídica do óleo pigmentado da farinha do resíduo de camarão
OF-CM Camada metanólica do óleo pigmentado da farinha do resíduo de
camarão
12
OH Hidroxil
OR Óleo pigmentado do resíduo de camarão
ORAC Capacidade de Absorção de Radicais de Oxigênio
OR-CL Camada lipídica do óleo pigmentado do resíduo de camarão
OR-CM Camada metanólica do óleo pigmentado do resíduo de camarão
OS Óleo de soja
OS-CL Camada lipídica do óleo de soja
OS-CM Camada metanólica do óleo de soja
RMCD metil-β-ciclodextrina metilada randomizada
RN Rio Grande do Norte
SET Transferência de um Elétron
TCA Ácido tricloroacético
TCA Avaliação da Capacidade Antioxidante Total
Trolox Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico
V Volume de óleo pigmentado recuperado
Vit. C / g Vitamina C por grama
W Peso em gramas de resíduos
λmax Comprimento de onda máxima
μL Microlitro
μmol Micromol
13
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 15
2 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA ....................................................................................... 17
3 OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 18
3.1 OBJETIVO GERAL ...................................................................................................................... 18
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 18
4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................................... 19
4.1 CARCINICULTURA ..................................................................................................................... 19
4.1.1 Importância econômica e panorama da produção no estado do RN ....................... 19
4.1.2 Beneficiamento de camarão e produção de resíduos .................................................. 19
4.2 CAROTENOIDES PRESENTES NOS RESÍDUOS DE CAMARÃO ................................... 21
4.2.1 Astaxantina .............................................................................................................................. 21
4.2.1.1 Propriedades físico-químicas .............................................................................................. 21
4.2.1.2 Função Biológica: bioatividade antioxidante ..................................................................... 22
4.2.1.3 Formas de obtenção da astaxantina a partir de resíduos de camarão ........................ 22
4.3 ÓLEOS .......................................................................................................................................... 23
4.3.1 Caracterização física e físico-química .............................................................................. 23
4.3.2 Determinação da capacidade antioxidante ..................................................................... 25
5 METODOLOGIA ............................................................................................................................. 29
5.1 MATÉRIA-PRIMA ........................................................................................................................ 29
5.2 OBTENÇÃO DOS ÓLEOS PIGMENTADOS ........................................................................... 30
5.3 QUANTIFICAÇÃO DA ASTAXANTINA NO ÓLEO PIGMENTADO ..................................... 31
5.4 CARACTERIZAÇÃO FÍSICA E FÍSICO-QUÍMICA DO ÓLEO PIGMENTADO .................. 32
5.5 CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DO ÓLEO PIGMENTADO ................................................ 32
5.5.1 Obtenção dos extratos.......................................................................................................... 32
5.5.2 Avaliação da Capacidade Antioxidante total (TCA) ...................................................... 33
5.5.3 Teste do Poder Redutor ........................................................................................................ 33
5.5.4 Sequestro do Radical hidroxil (OH) ................................................................................... 34
5.5.5 Atividade Antioxidante utilizando DPPH· ........................................................................ 34
5.5.6 Capacidade de Absorção de Radicais de Oxigênio (ORAC) ...................................... 35
5.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................................ 35
6 ARTIGO ............................................................................................................................................ 36
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................................................... 61
14
REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 63
15
1 INTRODUÇÃO
O camarão ocupa um lugar de destaque na economia pesqueira mundial,
devido seu volume de produção (cerca de 20% no mercado mundial) e a ampla
distribuição geográfica1. Dados da FAO mostram que em 2013 a produção mundial
alcançou 3,314,447 toneladas.2
A espécie de camarão Litopenaeus vannamei, também chamado de
camarão branco do Pacífico, é responsável por 90% da produção mundial. Na
carcinicultura brasileira é o mais utilizado (95%) devido entre outros fatores a sua
acelerada taxa de crescimento em altas densidades e a sua elevada capacidade de
se adaptar às condições climáticas das diversas regiões do país.3
Os resíduos de camarão gerados pelo processamento industrial são
geralmente eliminados sem nenhum tipo de beneficiamento, o que pode levar a perda
de compostos valiosos, tais como proteínas, lipídeos, quitina, carotenoides, minerais
e compostos aromáticos, assim como podem gerar problemas ambientais devido à
sua decomposição.4 Diante disso, tem-se aumentado consideravelmente o interesse
em pesquisas que visam a recuperação desses compostos.5
O principal carotenoide encontrado nos resíduos de camarão é a
astaxantina (3,3’- diidroxi-β,β-caroteno-4,4’-diona), um pigmento oxicarotenoide de
cor vermelho-alaranjado presente no meio marinho, sendo produzido por algas
(Haematococcus pluvialis) e leveduras (Phaffi rhodozyma). Estes organismos iniciam
uma cadeia alimentar, seguido por outros animais que são incapazes de sintetizar
esse carotenoide, como zooplâncton, insetos e crustáceos, e por fim os peixes, que
através de sua alimentação adquirem esse pigmento.6
A astaxantina não apresenta atividade pró-vitamina A como alguns
carotenoides. Entretanto possui inúmeras propriedades farmacológicas importantes
devido sua função antioxidante, que podem estar envolvidas na prevenção ou no
tratamento de várias doenças relacionadas com danos oxidativo, como câncer,
diabetes, hipertensão, obesidade, doenças de pele, aterosclerose, catarata, e no
processo de envelhecimento. Por outro lado, ainda é muito limitado o número de
pesquisas sobre os efeitos adversos da alta ingestão de astaxantina, sendo
necessárias, portanto, investigações adicionais sobre o assunto.7
Esse efeito protetor da astaxantina contra enfermidades relacionado ao seu
elevado potencial antioxidante, o qual previne não só a oxidação lipídica relacionada
16
ao estresse oxidativo como também exerce um papel na expressão gênica e na
indução da comunicação entre células. Foi encontrado, ainda, que sua capacidade
em sequestrar radicais livres é o dobro do β-caroteno e 80 vezes maior que a do α-
tocoferol.8
Diante do exposto, visando o aproveitamento de resíduos gerados pela
indústria de camarão, se faz necessário estudos que se propõem a extrair a
astaxantina com óleo vegetal a partir da farinha e do resíduo de camarão (óleo
pigmentado) gerando assim, um produto de valor agregado livre de resíduos de
solventes orgânicos, comumente utilizados na extração de carotenoides e que pode
ser utilizado em alimentos e/ou preparações, com possíveis efeitos benéficos ao
organismo humano.
17
2 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA
A carcinicultura é a atividade de maior crescimento entre os setores de
produção animal, entretanto, um dos problemas causados por essa atividade é o
descarte dos resíduos de forma indiscriminada no meio ambiente, acumulando assim
milhares de toneladas por ano.5 Dentre os componentes presentes nesses resíduos
de camarão têm-se a astaxantina, um pigmento da classe dos carotenoides que
possui diversas funções biológicas.9
Dessa forma, levando-se em consideração o desperdício de toneladas de
resíduos de camarão de grande potencial econômico, devido aos altos teores de
nutrientes como, por exemplo, os pigmentos carotenoides (astaxantina), buscam-se
alternativas tanto para diminuir o impacto ambiental dessa prática como também para
a sua utilização na indústria. Dentro dessa perspectiva, o aproveitamento desse
resíduo com utilização da astaxantina pela indústria de alimentos poderia melhorar e
proteger a qualidade dos óleos vegetais, assim como prolongar a vida de prateleira
dos mesmos.
Existe na literatura estudos que abordam a extração da astaxantina com
óleo vegetal a partir de resíduos de camarão, porém são escassos os que utilizam
especificamente os resíduos de camarão da espécie Litopenaeus vannamei, espécie
esta que é a mais criada e comercializada Brasil. Além disso, a atividade antioxidante
dos resíduos de camarão já foi investigada, contudo, não há pesquisas que avaliam a
capacidade antioxidante do óleo pigmentado, rico em astaxantina, a partir de resíduos
de camarão da espécie Litopenaeus vannamei.
Dessa forma, o presente estudo apresenta como hipótese que o óleo
pigmentado com astaxantina, extraída de resíduo de camarão (Litopenaeus
vannamei), possui atividade antioxidante e que o método de extração do pigmento
carotenoide não altera as características físicas e físico-química do óleo extrator.
18
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar as propriedades físicas, físico-químicas e antioxidantes do óleo
vegetal pigmentado com astaxantina, obtido a partir do resíduo de camarão
(Litopenaeus vannamei).
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Obter um óleo pigmentado a partir da extração de astaxantina presente nos
resíduos de camarão e na farinha dos resíduos de camarão;
• Quantificar o carotenoide, astaxantina, existente nos óleos pigmentados;
• Caracterizar os métodos físicos e físico-químicos dos óleos pigmentados;
• Avaliar a capacidade antioxidante dos óleos pigmentados e de suas
frações.
19
4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1 CARCINICULTURA
4.1.1 Importância econômica e panorama da produção no estado do RN
A partir dos anos setenta o Brasil apresentou um aumento significativo na
produção de camarão como resultado do início do cultivo de camarão da espécie
Macrobrachium amazonicum, sendo logo seguido pelas espécies nativas
Farfantepenaeus brasiliensis e Macrobrachium japonicus. Entretanto foi em 1984, com
a criação da Associação Brasileira de Criadores de Camarão (ABCC) e a inserção da
espécie Litopenaeus vannamei, que a carcinicultura no Brasil voltou a crescer, devido
principalmente a boa adaptação da espécie para esta atividade.1
Em 2006, a região Nordeste apresentou 97,5% de produção e 97,0% de
venda de camarão, e isso se deve ao maior número de estabelecimentos aquícolas
que produzem camarões. Assim como devido a suas extensas áreas costeiras
apropriadas para o cultivo, tecnologia própria, regularidade da oferta e preferência do
mercado externo pelo camarão cultivado. Gerando 50 mil empregos diretos e indiretos
em áreas carentes de oportunidades nessa região.10
A produção de camarão marinho no Brasil em 2011 foi de 69.571 toneladas,
com uma produtividade média, de 3.505 Kg/ha/ano. Com destaque para a região
Nordeste que representou 98,8% da produção brasileira. Sendo o estado do Rio
Grande do Norte (RN) o segundo maior produtor nacional (17,825 toneladas) segundo
a Associação Brasileira de Criadores de Camarão.11
4.1.2 Beneficiamento de camarão e produção de resíduos
O beneficiamento do camarão se dá pela eliminação das impurezas
provenientes dos viveiros, classificação por faixa de tamanho, seguido da embalagem
e congelamento. Quando não vendidos inteiros, os camarões são encaminhados para
as linhas de produção de camarões descabeçados (sem cefalotórax, porém com
exoesqueleto) e a de camarões descascados por completo (filé)12 (Figura 1).
Os resíduos gerados por esse beneficiamento podem corresponder até
65% do peso inicial do camarão e, quando descartados de forma inadequada podem
20
contribuir significativamente para problemas ambientais. Além disso, a eliminação
desses resíduos gera custos adicionais às empresas e, consequentemente, reduz a
margem de lucro do sistema de produção.4
Figura 1: Fluxograma do beneficiamento de camarão.
Entretanto esses resíduos contêm diversos compostos bioativos como
proteínas, quitinas, minerais e carotenoide que apresentam elevado potencial quando
recuperados.13 Ao mesmo tempo, os resíduos de camarão se caracterizam como a
matéria-prima mais barata para a recuperação de carotenoides e, consequentimente,
poderia ser uma melhor alternativa aos carotenoides sintéticos e outros corantes
artificiais de cor amarelo-alaranjado.14
Por ser considerado um material altamente perecível, devido à
contaminação bacteriana, os resíduos de camarão devem ser rapidamente
processados para evitar as alterações bioquímicas, as quais interferem na
estabilidade dos carotenoides.15 Estes resíduos podem ser aproveitados de diversas
maneiras, como para a fabricação de farinha16, produção de ração para peixes17,
elaboração de silagem15, fabricação de embalagens ativas de alimentos9 e extração
de pigmentos carotenoides (astaxantina) utilizando óleo vegetal14 e solventes
orgânicos.18
21
4.2 CAROTENOIDES PRESENTES NOS RESÍDUOS DE CAMARÃO
4.2.1 Astaxantina
4.2.1.1 Propriedades físico-químicas
Os carotenoides são compostos poliisoprenóides que são divididos em
duas classes, dependendo do tipo de elemento químico que contém, sendo elas,
xantofilas (oxigênio) e carotenos (hidrocarbonetos). Nas xantofilas, o oxigênio pode
estar presente como grupos hidroxilas, grupos carbonilas ou como uma combinação
de ambos.6 Nos crustáceos, os carotenoides são encontrados na forma de
carotenoproteínas, que são complexos estáveis de carotenoides ligado a uma
lipoproteína de alta densidade.19
A astaxantina é o principal pigmento carotenoide encontrado naturalmente
em crustáceos marinhos, sendo responsável pela típica coloração alaranjada dos
mesmos. Na espécie de camarão Litopenaeus vannamei, a astaxantina se apresenta
aproximadamente 50, 30 e 20% na forma de diéster, monoéster e livre,
respectivamente.20
A estrutura química da astaxantina é caracterizada por uma longa cadeia
hidrocarbonada, com duplas ligações conjugadas (cadeia poliénica) com um anel
aromático benzénico em cada extremidade da cadeia contendo um grupo hidroxilo
(OH) e um grupo carbonilo/cetónico (=O) (Figura 2).21
Figura 2. Estrutura química da astaxantina.
22
4.2.1.2 Função Biológica: bioatividade antioxidante
A capacidade antioxidante da astaxantina é atribuída a sua estrutura
química, que apresenta a habilidade de sequestrar oxigênio atômico,
efotossensibilizantes e eliminar radicais livres. Além disso, estudos mostram que a
atividade antioxidante da astaxantina é 10 vezes maior que a da zeaxantina, luteina,
cantaxantina e β-caroteno.21
A astaxantina possui inúmeras propriedades, as quais se destacam a
atividade antioxidante, antiinflamatória, imunomoduladora, anticâncer, antidiabetes,
prevenção de doenças cardiovasculares, prevenção de catarata e na bioatividade
contra Helicobacter pylori.7 Vale ressaltar, portanto, que essa potente atividade
antioxidante relacionada à astaxantina, tem sido mostrada tanto em animais quanto
em ensaios clínicos e, tem aplicações promissoras para a saúde humana e nutrição.6
Devido suas propriedades antioxidantes, tem-se aumentando o número de
estudos na área da biotecnologia, com o intuito de se obter a astaxantina a partir de
fontes naturais. Uma vez que, esse composto é utilizado em várias aplicações
comerciais como em nutracêuticos, fármacos, alimentos e rações animais sob a forma
de cápsula, gel, comprimido, pó, biomassa, creme, bebida energética, óleo e extrato.7
Além disso, há indícios de um potencial de mercado para carotenoides naturais
aplicados a refrigerantes, sorvetes, sobremesas, doces, produtos cárneos e
alimentação para animais de estimação e de aquicultura.22
4.2.1.3 Formas de obtenção da astaxantina a partir de resíduos de camarão
Com o objetivo de se obter a astaxantina a partir dos resíduos de camarão,
tem-se utilizado vários métodos para extrair esse carotenoide, como o processo de
hidrólise enzimática23, ensilagem fermentativa24, fluido supercrítico (CO2)1, extração
com solventes orgânicos18, e óleos vegetais.14
O método de hidrólise enzimática tem como objetivo a recuperação de três
componentes principais: quitina, proteínas e pigmentos carotenoides por meio da
utilização de enzimas proteolíticas, que quebram as ligações entre as proteínas e os
carotenóides (carotenoproteínas), que são complexos estáveis. Entretanto, alguns
23
fatores podem interferir na eficiência desse processo, como a concentração de
substrato, pH, temperatura e a duração da hidrólise.23
Na ensilagem fermentativa, utiliza-se bactérias produtoras de ácido láctico
que estabilizam os carotenoides e melhoram sua recuperação. Assim durante o
processo de fermentação, as proteínas se liquefazem obtendo-se um licor rico em
proteínas e carotenoides. Vale ressaltar ainda, que este processo depende de vários
fatores como a escolha e a concentração dos hidrocarbonetos, pH, temperatura,
tempo e condições aeróbias ou anaeróbias.24
A extração utilizando dióxido de carbono supercrítico apresenta como
vantagem o processamento de materiais a uma temperatura baixa, o qual evita a
degradação dos compostos, assim como a fácil separação do solvente por
aquecimento ou diminuição da pressão. Por outro lado, ressalta-se que devido sua
baixa solubilidade em compostos apolares tem-se adotado a adição de um co-
solvente para intensificar a extração.1
Sendo um composto lipofílico, a astaxantina pode ser solubilizada em
diclorometano, clorofórmio, acetona e metanol, uma vez que apresenta uma parte
solúvel em solventes polares e outra em solventes apolares.21 Diante disso, o método
de extração por solvente orgânico proposto por Sachindra et al.18, utiliza uma mistura
de solventes polar e não-polar (isopropanol e hexano). Uma vez que estes podem ser
utilizados nas indústrias de alimentos como transportador ou solventes de extração.
No que se diz respeito a extração da astaxantina em óleo vegetal, este
apresenta como vantagem o fato de não ser necessária à eliminação do solvente, o
que poderia acarretar na degradação térmica do pigmento, uma vez que o produto é
obtido de uma mistura entre o óleo vegetal e o extrato rico em astaxantina. Além disso,
o óleo obtido pode ser utilizado na alimentação com o duplo objetivo de transportar
pigmentos carotenoides, bem como fonte de energia e lipídios.14
4.3 ÓLEOS
4.3.1 Caracterização física e físico-química
Nos últimos anos têm surgido inúmeras razões para impulsionar os estudos
sobre as características físicas e químicas de óleos comestíveis. Visto que estes são
24
frequentemente utilizados em cozinhas domésticas e industriais, assim como na
indústria de alimentos, cosméticos e materiais farmacêuticos e lubrificantes.25
A qualidade dos óleos vegetais pode ser investigada por meio da análise
seu estado de oxidação, o qual pode ser avaliado por diversas técnicas analíticas,
dependendo da complexidade das reações químicas envolvidas na oxidação e do tipo
de compostos produzidos. O método analítico é o mais utilizado e abrange tanto a
análise instrumental, quanto os testes indiretos. Este, estuda a quantidade e
composição dos compostos primários, como hidroperóxidos e dienos conjugados,
assim como dos secundários de oxidação, como aldeídos, cetonas, álcoois e
hidrocarbonetos. As demais técnicas avaliam a perda de ácidos graxos insaturados,
vitaminas e antioxidantes normalmente presentes nos óleos.26
A densidade de um lipídeo é definida como a massa requerida para ocupar
um volume específico, a qual pode ser modificada quando ocorre mudança na
concentração dos ácidos graxos.27,28 Quanto menor a densidade, menor o peso
molecular e mais alto o grau de insaturação dos ácidos graxos.29 Este método é
utilizado para identificar adulterações e determinar o conteúdo de óleo em produtos
oleosos.30
A determinação da viscosidade dos óleos vegetais é outro parâmetro
utilizado. Esta aumenta com o tamanho da cadeia dos ácidos graxos e diminui com o
aumento da temperatura e do grau de insaturação.31,32 Além disso, a maioria dos óleos
apresenta viscosidade intermediária, geralmente entre 30-60 mPa, à temperatura
ambiente, e um comportamento newtoniano, ou seja, viscosidade constante a
qualquer valor de taxa de cisalhamento (variação de velocidade com variação de
altura – distância da superfície que provoca o cisalhamento).28,33
O índice de refração afere o desvio da luz dos óleos a temperatura
específica (25ºC para óleos) e está relacionado com o grau de insaturação, com os
compostos de oxidação e o tratamento térmico.27,34 Além disso, correlaciona-se
diretamente com o índice de iodo, podendo ser usado como um procedimento
alternativo para o controle do processo de hidrogenação de óleos insaturados.32 Na
caracterização de óleos vegetais o referido método é utilizado como critério de
qualidade e identidade, o qual se eleva com o aumento da cadeia e com o grau de
insaturação dos ácidos graxos e decresce com o aumento da temperatura.30
O índice de acidez identifica o estado de conservação dos óleos por meio
da mensuração da hidrólise dos triglicerídeos em glicerol e ácidos graxos.27,30 Essa
25
decomposição é acelerada pelo aquecimento, luz e racidez hidrolítica, podendo estar
relacionada intimamente com a natureza e a qualidade da matéria prima, com a
qualidade e grau de pureza do óleo, com o processamento, e principalmente, com as
condições de conservação do óleo.29
O índice de peróxido é um indicador sensível do grau de oxidação inicial do
óleo, advertindo sobre a deterioração do sabor e odor.29 Além disso, este está
relacionado diretamente com a rancidez oxidativa, a qual ocorre em ácidos graxos
insaturados na presença de oxigênio.27
O índice de saponificação mede indiretamente o peso molecular dos ácidos
graxos uma vez que este é inversamente proporcional ao peso molecular dos ácidos
graxos.32,35 Essa determinação é útil na identificação de amostras desconhecidas e
na tentativa de identificar adulterações por outras gorduras com índices de
saponificação bem diferentes como os óleos de coco (255), dendê (247), manteiga
(225) ou por adição de parafina, que tem um índice mínimo.30
O índice de iodo mensura o grau de insaturação dos óleos, uma vez que
as duplas ligações dos ácidos graxos têm o poder de fixar iodo.27 Quanto maior o
índice de iodo, maior a capacidade de absorção de iodo e consequentemente maior o
número de insaturações, o que aumenta a possibilidade de rancidez por oxidação.30
Por outro lado, sua redução é indicativo de quebra das duplas ligações resultantes de
reações de polimerização, ciclização e oxidação, associada a um aumento do ponto
de fusão e, principalmente a incorporação de gorduras saturadas ao óleo.29 Vale
ressaltar que a determinação do índice de iodo é importante para a classificação de
óleos e gorduras e para o controle de alguns processamentos.30
4.3.2 Determinação da capacidade antioxidante
Radicais livres são moléculas ou átomos produzidos continuamente
durante os processos metabólicos e atuam como mediadores na transferência de
elétrons em várias reações bioquímicas. A oxidação, por sua vez é definida como
sendo a conversão de uma substância química em um derivado com menor número
de elétrons.36 Os antioxidantes, são substâncias que presentes em baixas
concentrações conseguem atrasar ou inibir a oxidação de radicais livres de maneira
eficaz, podendo ser encontrados naturalmente em alimentos.37
26
Os antioxidantes presentes em óleos vegetais, tais como os tocóis (α-, β-,
γ- e δ-tocoferol e tocotrienol), carotenoides, compostos fenólicos e esteróis,
apresentam potencial efeito na prevenção de doenças crônicas, uma vez que são
capazes de proteger sistemas biológicos contra a ação de espécies reativas de
oxigênio e nitrogênio. Assim como protegem os óleos vegetais contra a ação de
radicais livres que desencadeiam a peroxidação lipídica, principal forma de
degradação dos óleos vegetais. Por isso, existe um crescente interesse por métodos
capazes de avaliar a ação de compostos antioxidantes presentes nos óleos vegetais.38
Nos últimos anos tem-se aumentado significativamente o número de
estudos sobre os radicais livres e o desenvolvimento de novos ensaios para avaliação
da capacidade antioxidante de diversos compostos. Uma vez que, estes radicais livres
estão associados diretamente ao efeito deletério sobre as células e sua relação com
surgimento de inúmeras doenças, agindo como causador ou agravante.39
Existem dois tipos de mecanismo de reação que são utilizados nos ensaios
analíticos que determinam a capacidade antioxidante de um composto, que são a
Transferência de Átomo de Hidrogênio (HAT – Hydrogen Atom Transfer) e
Transferência de um Elétron (SET - Single Electron Transfer). Ambos têm como
objetivo determinar o efeito protetor da amostra contra os radicais livres, entretanto
eles se diferenciam quanto ao radical iniciador, à cinética da reação e às reações
laterais.38
Para a análise da atividade antioxidante de óleos vegetais, preconiza-se a
utilização de duas ou mais técnicas para a determinação da capacidade antioxidante
de um composto, uma vez que existem diversos tipos de radicais livres e diferentes
sítios de ação. Assim, tornando-se difícil que apenas um único método seja capaz de
representar de forma segura e precisa a verdadeira capacidade antioxidante de uma
substância.40 Além disso, a determinação da capacidade antioxidante dos óleos
vegetais é considerada um desafio analítico, uma vez que a maioria dos ensaios foi
desenvolvido para a compostos hidrofílicos. E deste modo, são necessárias
adaptações nos ensaios de capacidade antioxidante de óleos vegetais.38
A análise da Avaliação da Capacidade Antioxidante Total (TCA) é um
método colorimétrico que consiste na redução do fosfato de molibdênio, que passa de
uma coloração amarela para verde, com pico de absorção máxima em 695 nm. O
referido método possui como vantagem a de avaliar a capacidade antioxidante tanto
de componentes lipofílicos quanto de hidrofílicos.41
27
No teste do poder redutor, o ferricianeto de potássio (Fe3+) é reduzido a
ferrocianeto de potássio (Fe2+) à uma temperatura de 50 ºC, que na presença do
cloreto de ferro forma uma coloração azul-esverdeada conhecida como azul da
Prússia, que pode ser lida espectrofotometricamente a 700 nm. 42
No método do sequestro do radical hidroxil (OH), o radical O2•− produzido
reduz o nitrozul de tetrazólio (NBT) em pH 7,4 e temperatura ambiente, levando a
geração do formazan, acompanhada por uma mudança de coloração de amarelo
pálido do NBT para uma coloração púrpura do formazan, sendo lida
espectrofotometricamente em 560 nm. Deste modo, as moléculas que atuam como
antioxidante reagem com O2•− inibindo a produção do formazan.43
No ensaio para avaliar a atividade sequestrante do radical 2,2-difenil-1-
picril-hidrazil (DPPH) os compostos antioxidantes agem como doador de átomos de
hidrogênio, sequestrando o radical DPPH e o reduzindo a hidrazina. A substância
formada produz um decréscimo da absorbância a 515 nm e muda a coloração de
violeta a amarelo pálido.39
No método da capacidade de absorção de radicais de oxigênio (ORAC -
Oxygen Radical Absorbance Capacity) o radical, gerado pela reação do dicloreto de
2,2’-azobis (2-amidinopropano) (AAPH) com oxigênio atmosférico, reage com o
indicador fluorescente formando um produto não fluorescente, que pode ser medido
por espectrofotometria com máxima emissão de fluorescência em 575 nm e 578 nm.
Este ensaio avalia a atividade antioxidante por meio da inibição da oxidação, induzida
pelo radical peroxil, por transferência de átomos de hidrogênio (HAT). A atividade
antioxidante é determinada, portanto, pela diferença entre a área da amostra subtraída
pela área do branco, medida pelo decaimento da fluorescência com a adição da
substância antioxidante no decorrer do tempo, sendo os resultados expressos em
unidade de ORAC ou equivalentes de Trolox.40
Os óleos vegetais são hidrofóbicos e não se misturam ao meio aquoso,
peculiar aos ensaios de capacidade antioxidante. Dessa forma, são necessárias
adaptações nos ensaios de capacidade antioxidante para amostras cujos
componentes majoritários sejam lipídeos, como o uso de diferentes solventes, adoção
de diferentes pontos-finais da reação e maneiras de expressar os resultados.38
O ensaio da ORAC tem sido utilizado para a determinação da capacidade
antioxidante da fração polar de óleos vegetais ricos em compostos fenólicos.
Entretanto, esse ensaio pode ser adaptado para estimar a capacidade antioxidante de
28
ambas as frações dos óleos vegetais, utilizando o mesmo gerador de radicais e sonda
molecular, introduzindo apenas o uso da β-ciclodextrina aleatoriamente metilada
como meio de dispersão para os antioxidantes lipofílicos na solução aquosa do
ensaio. Dessa forma, por ser uma molécula anfipática, a β-ciclodextrina metilada
tornar os óleos vegetais mais compatíveis com os ensaios que utilizam solventes
polares, uma vez que aumenta a solubilidade dos compostos lipossolúveis em
água.38,40
29
5 METODOLOGIA
Essa pesquisa trata-se de um estudo descritivo de caráter transversal.
5.1 MATÉRIA-PRIMA
Os resíduos (cefalotórax) de camarão Litopenaeus vannamei utilizados
para a obtenção das amostras de óleo pigmentado foram obtidos de uma empresa de
beneficiamento de camarão no estado do Rio Grande do Norte (RN), Brasil. Foram
acondicionados em caixas isotérmicas e encaminhados diretamente ao Laboratório
de Análise de Alimentos do Departamento de Nutrição da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte – UFRN.
Para a obtenção dos óleos pigmentados do resíduo de camarão (OR) e da
farinha do resíduo de camarão (OF), 3 Kg da amostra foram divididos em duas
porções iguais. A primeira foi triturada usando um processador doméstico (Philips
Walita, Mod. 6000W) e armazenada a -20 ºC até o momento da sua utilização. E a
segunda passou por um processo de secagem a 70 ºC em estufa ventilada (TECNAL,
Mod. TE-394/1) por 8 horas e a seguir triturada para a obtenção da farinha de resíduo
de camarão, segundo Damasceno (2007), e foi armazenada a 10 ºC até o momento
da obtenção do óleo pigmentado com astaxantina (Figuras 3 e 4).
Figura 3. Fluxograma de obtenção das amostras.
30
Figura 4. A: Resíduo de camarão triturado. B: Farinha do resíduo de
camarão.
5.2 OBTENÇÃO DOS ÓLEOS PIGMENTADOS
A obtenção dos óleos pigmentados a partir do resíduo de camarão (OR) e
da farinha do resíduo de camarão (OF) foi realizada de acordo com método de
Sachindra e Mahendrakar.14
Para OR, 10 g do resíduo de camarão foram homogeneizados com 20 mL
de óleo de soja com posterior aquecimento sem agitação (Marconi, Dubinoff, Mod.
MA-093/1) a 70°C por 2 horas. Em seguida foram filtrados utilizando uma gaze e
centrifugados (FANEM, Excelsa 4, Mod. 280R) a 3000 G por 10 minutos a 25 ºC. Por
fim, a camada de óleo pigmentado, sobrenadante, foi separada com o auxílio de uma
pipeta (Figura 5).
E para OF, 10 g da farinha do resíduo de camarão foram homogeneizados
com 40 mL de óleo de soja, devido à baixa umidade da amostra, e estes foram
submetido a aquecimento sem agitação (Marconi, Dubinoff, Mod. MA-093/1) a 70 °C
por 2 horas. Em seguida, foram filtrados utilizando uma gaze e centrifugados (FANEM,
Excelsa 4, Mod. 280R) a 3000 g por 10 minutos a 25ºC. A camada de óleo
pigmentado, sobrenadante, foi separada com o auxílio de uma pipeta (Figura 5).
31
Figura 5. A: Óleo pigmentado do resíduo de camarão (OR). B: Óleo
pigmentado da farinha do resíduo de camarão (OF).
Para os testes físicos, físico-químicos e capacidade antioxidante os óleos
pigmentados foram extraídos em maiores quantidades e armazenados a -20 ºC até o
momento das análises.
Destaca-se que, apesar do óleo de soja comercial apresentar antioxidantes
sintéticos, este foi escolhido para extrair a astaxantina devido, principalmente, à sua
boa otimização de extração14 e seu baixo custo.
5.3 QUANTIFICAÇÃO DA ASTAXANTINA NO ÓLEO PIGMENTADO
O teor de astaxantina dos óleos pigmentados (OR e OF) foi determinado
segundo o método proposto por Chen e Meyers.44 O conteúdo de carotenoides das
amostras foi medido espectrofotometricamente (HACH, Mod. DR-500) em λmax
(500nm), utilizando o óleo de soja como branco, e o teor de astaxantina foi expresso
como carotenoides totais em astaxantina usando a equação: Carotenóides (μg/g) = A
x V x D x 106/ 100 x W x E. Onde: A= absorvância na λmax, V= volume de óleo
pigmentado recuperado, D= fator de diluição, W= peso em gramas de resíduos e E=
coeficiente de extinção.
32
A astaxantina padrão (Sigma-Aldrich, EUA) foi dissolvida no óleo de soja e
utilizada para determinar o coeficiente de extinção (E) da astaxantina em λmax,
medida espectrofotometricamente à 500nm.
5.4 CARACTERIZAÇÃO FÍSICA E FÍSICO-QUÍMICA DO ÓLEO PIGMENTADO
Para a caracterização física dos óleos pigmentados foram realizadas as
análises de densidade, a qual foi estimada com o auxílio de um densímetro (Anton
Paar, Mod. DMA 4500M) a 25ºC; de viscosidade absoluta, determinado com o auxílio
de um viscosímetro (Brookfield, Mod. R/S Rheometer) a 25ºC; e índice de refração45
em triplicata. E para a caracterização físico-química dos mesmos foram realizadas as
análises de teor de acidez, índice de peróxido, índice de saponificação45 e índice de
iodo46 em triplicata.
Ressalta-se que o óleo de soja (OS) também foi analisado, a fim de se
conhecer suas características iniciais, além de funcionar como um controle ao
processo de extração da astaxantina.
5.5 CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DO ÓLEO PIGMENTADO
5.5.1 Obtenção dos extratos
Os extratos dos óleos pigmentados do resíduo de camarão (OR) e da
farinha do resíduo de camarão (OF), assim como do óleo de soja (OS), utilizado como
controle, foram obtidos de acordo com o método proposto por Espı´n et al.,47 Mesurou-
se 5 mL de cada óleo e estes foram misturados a 5 mL de metanol sob agitação
vigorosa (ACB Labor, Mod. AC-045) durante 20 minutos e centrifugado (FANEM,
Excelsa 4, Mod. 280R) a 3000 G durante 10 minutos a 25 ºC. Em seguida, recuperou-
se a camada metanólica (CM 1), sobrenadante, com o auxílio de uma pipeta e
reservada. A camada lipídica (CL), precipitado, adicionou-se mais 5 mL de metanol e
repetiu-se os mesmos procedimentos. A camada metanólica (CM 2) foi retirada e
misturada com CM 1, formando um extrato metanólico. Foram obtidos dois extratos
de cada óleo (CM e CL), os quais foram armazenados a -20 ºC (Figura 6).
33
Vale ressaltar que em todos os testes para analisar a capacidade
antioxidante foram analisados tanto os óleos (OR, OF, OS), quanto suas frações
(ORCM, ORCL, OFCM, OFCL, OSCM, OSCL).
Figura 6. Fluxograma de obtenção dos extratos.
5.5.2 Avaliação da Capacidade Antioxidante total (TCA)
Para a avaliação da capacidade antioxidante total utilizou-se o método
proposto por Prieto et al.41 Foram adicionados 100 μL da solução estoque de
molibidato de amônio-ácido sulfúrico, 100 μL da solução estoque de fosfato de sódio,
100 μL do extrato metanólico, camada lipídica ou óleo pigmentado e 700 μL de água
destilada em um tubo de ensaio. Os tubos foram agitados e incubados em banho-
maria (QUIMIS, Mod. Q334M-28) a 90º C por 90 minutos e medido
espectrofotometricamente (Bioespectro, Mod. SP-220) a 695 nm, em triplicata. Foi
preparado um branco nas mesmas condições. Foi construída uma curva padrão com
diferentes concentrações de ácido ascórbico, e os resultados foram expressos em mg
de vit. C / g de amostra.
5.5.3 Teste do Poder Redutor
O teste do poder redutor foi realizado segundo a metodologia de Wang.42
34
Foram adicionados 100 μL da solução de ferricianeto de potássio e 200 μL do extrato
metanólico, camada lipídica ou óleo pigmentado em um tubo de ensaio. Os tubos
foram agitados e incubados em banho-maria (QUIMIS, Mod. Q334M-28) a 50º C por
20 minutos. Em seguida, foram adicionados 180 μL da solução de ácido tricloroacético
(TCA) 10%, 20 μL da solução de cloreto de ferro e 1,5 mL de tampão fosfato 200 mM
(pH 6,6) aos tubos. Agitou-se os tubos e suas absorbâncias foram medidas
(Bioespectro, Mod. SP-220), em triplicata, a 700 nm. Para o branco adicionou-se 200
μL de tampão fosfato 200 mM pH 6,6 no lugar do extrato (ou óleo). Foi construída uma
curva padrão com diferentes concentrações de ácido ascórbico, e os resultados foram
expressos em mg de vit. C / g de amostra.
5.5.4 Sequestro do Radical hidroxil (OH)
O sequestro do radical hidroxil foi avaliado de acordo com a metodologia
proposta por Smirnoff e Cumbes.43 Foram adicionados 750 μL do reagente em todos
os tubos, inclusive no branco e no controle, e 50 μL do extrato metanólico, camada
lipídica ou óleo pigmentado, para o branco e o controle foram adicionados 50 μL de
tampão fosfato 150 mM (pH 7,4). Nos tubos teste e controle foram adicionados 200
μL de peróxido de hidrogênio 30% e no branco foram adicionados 200 μL de tampão
fosfato. Os tubos foram agitados e incubados em banho-maria (QUIMIS, Mod. Q334M-
28) a 37º C por 60 minutos e suas absorbâncias medidas a 510 nm, em triplicata. Os
resultados foram expressos em % de inibição.
5.5.5 Atividade Antioxidante utilizando DPPH·
A atividade antioxidante foi determinada de acordo com método proposto
por Brand-Wiliams et al.48 As amostras OR, OF, OS, ORCL, OFCL e OSCL foram diluídos
em hexano na proporção de 2:1 para a obtenção da solução estoque, enquanto os
extratos metanólicos foram diluídos diretamente no metanol. Em uma placa de 96
poços, adicionou-se 40 µL da solução estoque em octoplicata e 200 µL da solução de
2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) (24 mg de DPPH em 100 mL de metanol),
aguardou-se 25 minutos no escuro e a absorbância foi lida no espectrofotómetro
(ASYS, Mod. UVM-340), em triplicata, a 510 nm. Foi construída uma curva padrão
35
com diferentes concentrações de Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-
carboxílico), e os resultados foram expressos em µM Trolox eq. / g de amostra.
5.5.6 Capacidade de Absorção de Radicais de Oxigênio (ORAC)
A determinação da atividade antioxidante pelo método ORAC foi realizado
de acordo com Ganske e Dell.49 As amostras OR, OF, OS, ORCL, OFCL e OSCL foram
diluídos em metil-β-ciclodextrina metilada randomizada em acetona/água 1:1 v/v a 7%
(RMCD) na proporção de 1:1 para a obtenção da solução estoque, enquanto os
extratos metanólicos foram diluídos diretamente no tampão de fosfato de potássio 10
mM (pH 7,4). Em uma microplaca de poliestireno de 96 poços, específica para reações
de fluorescência, foram adicionados a cada poço 20 μL do padrão Trolox ou das
amostras previamente diluídos, 120 μL de fluoresceína dissódica 10 nM e 60 μL de
dicloreto de 2,2’-azobis (2-amidinopropano) (AAPH) 240 mM. Para o branco, foram
adicionados a cada poço 20 μL de tampão de fosfato de potássio 10 mM (pH 7,4)
(branco) e 120 μL de fluoresceína dissódica 10 nM.
A intensidade da fluorescência foi monitorada a 37 °C logo após a adição
do AAPH a cada ciclo de 90 segundos, por 120 ciclos através de leitor de microplacas
(FLUOstar OPTIMA, Mod. BMG LABTECH), em triplicata, com os seguintes filtros:
excitação 485 nm e emissão a 520 nm. Os resultados foram obtidos com base na área
sob a curva de decaimento da fluoresceína ao longo do tempo e da área útil sendo
expressos em μmol de equivalentes de Trolox por g de amostra.
5.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram analisados pela análise de variância (ANOVA) utilizando o
teste de Tukey para comparação entre as médias ao nível de significância de 5% com
o auxílio do software Assistat 7.7 beta.
36
6 ARTIGO
O artigo intitulado “Physical and physical-chemical characterization and
evaluation of antioxidant capacity of the pigmented oils obtained from the extraction of
astaxanthin from the shrimp (Litopenaeus vannamei) waste” foi submetido para
publicação no periódico “ Food Chemistry” que possui fator de impacto 3.391 e Qualis
A2 da CAPES para a área de nutrição.
35
PHYSICAL AND PHYSICAL-CHEMICAL CHARACTERIZATION AND EVALUATION 1
OF ANTIOXIDANT CAPACITY OF THE PIGMENTED OILS OBTAINED FROM THE 2
EXTRACTION OF ASTAXANTHIN FROM THE SHRIMP (LITOPENAEUS 3
VANNAMEI) WASTE 4
5
Denise Maria de Lima e Silva*a, Penha Patrícia Cabral Ribeirob, Karla Suzanne 6
Florentino da Silva Chaves Damascenoc, Cristiane Fernandes de Assisd 7
8
a Student of Postgraduate Degree in Nutrition, Department of Nutrition. Federal 9
University of Rio Grande do Norte - UFRN, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. Email 10
address: [email protected] 11
b Student of Postgraduate Degree in Nutrition, Department of Nutrition. Federal 12
University of Rio Grande do Norte - UFRN, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. Email 13
address: [email protected] 14
c Professor of Postgraduate Degree in Nutrition, Department of Nutrition. Federal 15
University of Rio Grande do Norte - UFRN, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. Email 16
address: [email protected] 17
d Professor of Postgraduate Degree in Nutrition, Department of Nutrition. Federal 18
University of Rio Grande do Norte - UFRN, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. Email 19
address: [email protected] 20
21
Abstract 22
The objective of this study was to evaluate the physical and physical-chemical 23
characteristics and the antioxidant capacity of the pigmented oils, obtained from the 24
extraction of astaxanthin from the shrimp waste (Litopenaeus vannamei). The obtained 25
36
pigmented oils of the shrimp waste (OW) and of the shrimp waste flour (OF) were 26
evaluated for astaxanthin content, physical and physico-chemical characteristics and 27
antioxidant capacity. The samples of OW and OF showed an astaxanthin content of 28
70.9 and 264.7 μg / g, respectively, where the decrease in moisture was responsible 29
for this increase of 3.7 times. In the Oxygen Radical Absorption Capacity (ORAC) test, 30
OW and OF exhibited an antioxidant activity of 0.4957 and 0.4840 μmol eq trolox / g, 31
respectively. However, some physical and physico-chemical characteristics of OF 32
presented changes. Therefore, the pigmented oils from shrimp waste present a 33
significant potential for the use in food. 34
35
Keywords: Cephalothorax, natural pigment, carotenoids, bioactivity, oil quality. 36
37
Chemical compounds studied in this article: 38
Astaxanthin (PubChem CID: 5281224); DPPH (PubChem CID: 2735032); Trolox 39
(PubChem CID: 6541354); AAPH (PubChem CID: 1969); Fluorescein (PubChem CID: 40
16850); Trichloroacetic Acid (PubChem CID: 6421); Molybdate of Ammonium 41
(PubChem CID: 61578). 42
43
1 Introduction 44
The shrimp processing industry generates large amounts of waste, 45
especially the cephalotorax, which cause environmental problems when improperly 46
disposed in nature (Kandra, Challa, Jyothi & Kalangi, 2012). Nevertheless, these waste 47
have a considerable amount of functional compounds as protein, lipids, chitin and 48
carotenoids pigments (Parjikolaei, El-Houri, Fretteé & Christensen, 2015). Thus, one 49
has increased the numbers of studies which seek the use of industrial waste through 50
37
the technology in order to reduce the consequences of its accumulation on the 51
environment and the recovery of valuable compounds, as the astaxanthin (Mezomo, 52
Martínes, Maraschin & Ferreira, 2013). 53
The astaxanthin (3,3-di-hidroxi-β,β-caroteno4,4-diona) is the main 54
carotenoid which is present in the shrimp waste, where it can be found in its free or 55
esterified form (Mezomo, Maestri, Santos, Maraschin & Ferreira, 2011). Because of its 56
substance which is considered a bioactive natural one, the astaxanthin generates 57
numerous scientific and commercial applications, since it can be used in several areas, 58
as in the pharmaceutical industry, used as cell markers and as antioxidant; in the 59
cosmetics industry, used as color agents and antioxidant; and in the food industry, 60
used as supplement and as additives on the feeding of salmonids, shrimp and lobster 61
to intensify the flesh pigmentation (Sanches-Silva et al., 2013), and in the chicken feed 62
to increase the yellow color of egg yolk (Amado, Vázquez, Murado & Gonzáles, 2015). 63
Because of the search for new natural sources of astaxanthin, several 64
methods have been used to extract the astaxanthin from the shrimp waste, such as 65
enzymatic hydrolysis (Holanda & Netto, 2006), fermentation process (Sachindra & 66
Bhaskar, 2008), organic solvents (Sachindra, Bhaskar & Mahendrakar, 2006) and 67
ultrasound (Macias-Sanchez, Mantell, Rodríguez, Martínez, Lubían & Monteiro, 2009). 68
However, these methods are expensive and can trigger a process of structural change 69
leading to a loss of functionality or nutritional deterioration of astaxanthin (Parjikolaei 70
et al., 2015). Therefore stand out a sustainable technique, which use vegetable oils to 71
the extraction of astaxanthin. Since this technique present as advantage due to the 72
fact that the oil used as solvent for the extraction already presents synthetic 73
antioxidants (0,01% de BHA + BHT, 50/50) in its commercial form, which avoid the 74
38
oxidation of the carotinoids pigments (Franco-Zavaleta, Jim´enez-Pichardo, Tomosini- 75
Campocosi & Guerrero-Legarreta, 2005). 76
The objective of this research was to characterize the properties physical and 77
physic-chemical and to evaluate antioxidant capacity of the pigmented oils obtained in 78
the extraction of the astaxanthin from shrimp waste (Litopenaeus vannamei), with 79
vegetable oil. 80
81
2 Methodology 82
2.1 Raw material 83
The raw material used was waste (cephalotorax) of shrimp Litopenaeus 84
vannamei, obtained from a processing company of shrimp in the State of Rio Grande 85
do Norte (RN), Brazil. The shrimp waste were packed in cool boxes and sent to 86
Laboratory of Food Analysis of nutrition department at the Federal University of Rio 87
Grande do Norte (UFRN). For the obtention of pigmented oils from shrimp waste (OW) 88
and from the shrimp waste flour (OF), 3 Kg of the sample were divided into two Equal 89
portions. The first one was grinded and crushed in a blender (Philips Walita, Mod. 90
6000W) and stored at a -20 ºC until the time of its using. And the second went portion 91
was dried at at 70 ºC in ventilated oven (TECNAL, Mod. TE-394/1) per 8 hours and 92
then it was crushed to obtain the OF, according to Damasceno (2007), and it was 93
stored at 10 ºC until the time of the obttention of pigmented oil with astaxanthin. 94
95
2.2 The obtention of pigmented oils 96
The obtention of pigmented oils from shrimp waste (OW) and from the 97
shrimp waste flour (OF) was conducted according to the method by Sachindra and 98
Mahendrakar (2005). 99
39
To OW, 10 g of the shrimp waste were homogenized with 20 mL of soybean 100
oil with heating without shaking (Marconi, Dubinoff, Mod. MA-093/1) at 70 °C per 2 101
hours. Then they were filtrated using lint and centrifuged (FANEM, Excelsa 4, Mod. 102
280R) at 3,000 xg of 10 minutes at 25 ºC. Finally, the pigmented oil, supernatant, was 103
separated with a pipette. 104
To obtain OF, 10 g from the shrimp waste flour were homogenized with 40 105
mL of soybean oil, because of low humidity of the sample. And these were heaed 106
without shaking (Marconi, Dubinoff, Mod. MA-093/1) at 70 °C per 2 hours. Then they 107
were filtrated using lint and centrifuged (FANEM, Excelsa 4, Mod. 280R) at 3,000 xg 108
for 10 minutes at 25 ºC. Finally, the pigmented oil, supernatant, was separated with a 109
pipette. 110
For the physical, physical-chemical and antioxidant tests the pigmented oils 111
were extracted in larger quantities and stored at -20 ºC until the analysis. 112
It shows that, despite the commercial soybean oil presenting synthetic 113
antioxidants, it was selected to extract the astaxanthin, especially, because of its good 114
optimization of extraction (Sachindra & Mahendrakar, 2005), its very low cost and the 115
not to generation residue of organic solvents that would need to be evaporated. 116
117
2.3 Quantification of astaxanthin of the pigmented oil 118
The content of astaxanthin on pigmented oils (OW and OF) was determined 119
according to the proposed method by Chen and Meyers (1984). The content of 120
carotenoids from the samples were measured spectrophotometrically (HACH, Mod. 121
DR-500) in λmax (500nm), using the soybean oil as control, and the contents of 122
astaxanthin was expressed as total carotenoids in astaxanthin using the equation: 123
carotenoids (μg/g) = A x V x D x 106/ 100 x W x E. Where: A= Absorbance on λmax, 124
40
V= volume of pigmented oil recovered, D= dilution factor, W= weight in grams of waste 125
and E= extinction coefficient. 126
The standard astaxanthin (Sigma-Aldrich, EUA) was dissolved on soybean 127
oil and used to determine the extinction coefficient (E) from astaxanthin in λmax, 128
measured spectrophotometrically at 500 nm. 129
130
2.4 Physical and physico-chemical characterization of the pigmented oil 131
To the physical characterization of the pigmented oils was performed the 132
analyses of density, using a densimeter (Anton Paar, Mod. DMA 4500M) at 25 ºC; of 133
viscosity, determined with absolute viscometer (Brookfield, Mod. R/S Rheometer) at 134
25 ºC; and refractive value (AOCS, 1990) in triplicate. To their physico-chemical 135
characterization were performed the analyses of acidity level, peroxide, saponification 136
(AOCS, 1990) and iodine values (AOCS, 1995), in triplicate. 137
The soybean oil (SO) was analyzed too, in order to know their baseline 138
characteristics, in addition to work as a processing control of extraction of the 139
astaxanthin. 140
141
2.5 Antioxidant capacity of the pigmented oil 142
2.5.1 To obtain the extracts 143
The pigmented oil extracts from the shrimp waste (OW) and from the shrimp 144
waste flour (OF), as and the soybean oil (SO), used as control, were obtained 145
according to the proposed method by Espín, Soler-Rivas and Wichers (2000). One 146
measured 5 mL of each oil and they were mixed with 5 mL of methanol under vigorous 147
shaking (ACB Labor, Mod. AC-045) during 20 minutes and centrifuged (FANEM, 148
Excelsa 4, Mod. 280R) at 3,000 xg for 10 minutes at 25 ºC, and then, one recovered 149
41
the methanolic layer (ML 1), supernatant, with a pipette and other one. To the lipid 150
layer (LL), precipitated, one added more 5 mL of methanol and the procedure was 151
repeated. The methanolic layer (ML 2) was removed and mixed with ML 1, forming a 152
methanolic extract. Two extracts of each oil were obtained (ML and LL), which were 153
stored at -20 ºC (Figure 1). 154
It is important to note that antioxidant capacity tests analyzed the oil (OW, 155
OF, SO) and their factions (OWML, OWLL, OFML, OFLL, SOML, SOLL). 156
157
2.5.2 Determination of Total Capacity Antioxidant (TCA) 158
To evaluate the total antioxidant capacity was used the proposed method 159
by Prieto, Pineda and Aguilar (1999). Were added 100 μL of 4 mM ammonium 160
molybdate/0.6 M sulfuric acid and 100 μL of 28 mM sodium phosphate, 100 μL of 161
methanolic extract, lipid layer or pigmented oil and 700 μL of distilled water in a test 162
tube. The tubes were mixed and incubated in water bath (QUIMIS, Mod. Q334M-28) 163
at 90 ºC for 90 minutes and the absorbance was measured at 695 nm using a 164
spectrophotometer (Bioespectro, Mod. SP-220), in triplicate. A white one was 165
prepared under the same conditions. Was built a standard curve with different 166
concentrations of ascorbic acid, and the results were expressed as mg of vit. C / g 167
sample. 168
169
2.5.3 Reducing power assay 170
Its was conducted according to procedure basead on Wang et al. (2007). 171
Were added 100 μL of the potassium ferricyanide solution and 200 μL of the 172
methanolic extract, lipid layer or pigmented oil into a test tube. The tubes were mixed 173
and incubated in water bath (QUIMIS, Mod. Q334M-28) at 50 ºC for 20 minutes. Then, 174
42
were added to the tubes 180 μl of the 10 % trichloroacetic acid solution (TCA), 20 μL 175
ferric chloride solution and 1.5 mL of 200 mM phosphate buffer pH 6.6. The tubes were 176
mixed and their absorbances were measured (Biospectro, Mod. SP-220) in triplicate 177
at 700 nm. To the control was added 200 μl of 200 mM phosphate buffer pH 6.6 in the 178
place of the extract (or oil). The antioxidant capacity was expressed as ascorbic acid 179
equivalent. 180
181
2.5.4 Hydroxyl radical scavenging 182
The Hydroxyl radical scavenging was evaluated according to the 183
methodology proposed by Smirnoff and Cumbes (1989). 750 μl of the reagent was 184
added to all tubes, including on the white and on the control. And 50 μl of the 185
methanolic extract, lipid layer or pigmented oil, was added to the white and the control 186
50 μl of 150 mM phosphate buffer pH 7.4. In the test tubes and control were added 187
200 μL of hydrogen peroxide 30 % and was added in the control 200 μL of phosphate 188
buffer. The tubes were mixed and incubated in a water bath (QUIMIS, Mod. Q334M-189
28) at 37 °C for 60 minutes and their absorbances measured at 510 nm in triplicate. 190
The results were expressed as % of inhibition. 191
192
2.5.5 Inhibition activity radical DPPH· 193
The antioxidant activity was determined according to the proposed method 194
by Brand-Wiliams, Cuvelier and Berset (1995). To obtain the stock solution, the 195
nonpolar samples (OW, OF, SO, OWLL, OFLL and SOLL) were diluted in hexane on the 196
proportion of 2:1, and the polar samples (OWML, OFML and SOML) were diluted in 197
methanol P.A., while the methanolic extracts were diluted directly in methanol. Was 198
added in 96-well microplates, 40 μL of the stock solution in octoplicate and 200 μL of 199
43
the solution 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) (24 mg of DPPH in 100 mL methanol), 200
one waited 25 minutes on the dark and the absorbance was read in the 201
spectrophotometer (ASYS, Mod. UVM-340) in triplicate at 510 nm. A standard curve 202
was built with different concentrations of acid 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-203
2-carboxylic (Trolox), and the results were expressed in μmol Trolox eq. / g of sample. 204
205
2.5.6 Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) 206
The determination of the antioxidant activity through the ORAC method was 207
developed according to Ganske and Dell (2006). The nonpolar samples (OW, OF, SO, 208
OWLL, OFLL and SOLL) were diluted in randomly methylated β-cyclodextrin solution 7% 209
(w/v) in acetone:water (1:1) (RMCD) at the ratio of 1:1 to the stock solution, and the 210
polar samples (OWML, OFML and SOML) were diluted in potassium phosphate buffer 10 211
mM (pH 7.4). In a 96-well polystyrene microplate specifically for fluorescence 212
reactions, were added to each well 20 μL of the trolox standard or from the previously 213
diluted samples, 120 μl of 10 nM disodium fluorescein and 60 μl of 2,2'-azobis (2-214
amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) 240 mM. Were added to each well 20 μL of 215
potassium phosphate buffer 10 mM (pH 7,4) (control) to the and 120 μL of disodium 216
fluorescein 10 nM. 217
The fluorescence intensity (485 nm excitation and 528 nm emission) was 218
monitored at 37 °C shortly after the addition of AAPH to each cycle of 90 seconds, for 219
120 cycles through the microplate readers (FLUOstar OPTIMA, Mod. BMG 220
LABTECH), in triplicate by dilution. The results were obtained based on the area under 221
the decay curve of fluorescein over time and the usable area being expressed in μmol 222
of Trolox equivalents per g of sample. 223
224
44
2.6 Statistical analysis 225
The results were organized in tables and submitted to descriptive statistics 226
using the software Assistat 7.7 beta. To verify if there was a significant difference 227
between the three oils analyzed, was performed analysis of variance (ANOVA) with 228
averages analysis using the Tukey test at a significance level of 5 %. 229
230
3 Results and discussion 231
3.1 Quantification of astaxanthin in pigmented oil 232
The astaxanthin content found in OW and OF was respectively 70.9 and 233
264.7 μg / g sample, that is, the dehydration of waste led to an increase of 3.7 times 234
of astaxanthin. The significant difference (p <0.05) in the carotenoid content among 235
the samples was mainly due to the thermal treatment used to obtain the flour, which in 236
addition to concentrating the astaxanthin due to the decrease in moisture, also it makes 237
more accessible due to the breaking of their bonds with the proteins. The increase of 238
temperature leads to an irreversible denaturation of the carotenoproteins, developing 239
a more intense orange color and that shows about 1.6 times more astaxanthin content 240
than the samples that did not undergo this process (Sanches-Silva et al., 2013). 241
This difference in the concentration of astaxanthin in the samples can also 242
be observed in studies with extraction through organic solvents (hexane and 243
isopropanol). Seabra, Damasceno, Silva, Gomes and Pedrosa (2014) found a 244
carotenoids concentration on the shrimp waste fresh and on the shrimp waste flour 245
(Litopenaeus vannamei), of 42.74 e 98.51 μg/g, respectively. 246
Other authors also extracted the astaxanthin of shrimp waste from several 247
species in different types of oils and they obtained different results: 4.8 mg/ 100g-1 on 248
the in natura waste. In linseed oil (Pu, Bechtel & Sathivel, 2010); 24.8 μg/g on the in 249
45
natura waste (Penaeus indicus) in soybean oil (Sachindra et al., 2005); 131.7 μg/g on 250
the dehydrated waste (Panaeus monodon) in palm oil (Handayani, Dewi, Indraswati & 251
Ismadji, 2008). 252
Thus, when comparing the values found with other studies which use the 253
same extraction method, it is possible to see that OF presented the highest content in 254
relation to other one. This evidence shows that the shrimp waste of the specie 255
Litopenaeus vannamei presents a higher amount of astaxanthin compared to the other 256
species. 257
Several factors are related to a variation on the astaxanthin content, such 258
as, the extraction method, type of solvent used (its polarity and solubility in 259
astaxanthin), the size of the waste particles, proportion of the wastes and oil and 260
shrimp species used (Parykolaei et al., 2015). 261
The extraction of astaxanthin using vegetable oils contributes to its stability 262
since it provides a protective barrier to oxygen, however delaying the oxidation 263
processes. In addition, the extraction oil serves as an excellent carotenoids 264
transporter; lipid and energy source when it is applied in foods supplements and 265
salmonidae diets (Pu et al., 2010; Mezzomo et al., 2011). 266
The shrimp waste are already used in several industry sectors as sources 267
of carotenoids with different functions (Sanches-Silva et al., 2013), however there are 268
no reports in the literature of the pigmented oils use with this carotenoid. So, before 269
the high astaxanthin content on the pigmented oils, it presents a significant potential 270
for use in human food, in foods or preparations as a natural antioxidant. 271
272
3.2 Physical and physic-chemical characterization of pigmented oils 273
46
In the case of physical parameters, the density varied significantly (p <0.05) 274
among the samples and the viscosity was significantly higher in OF (Table 1). In 275
addition, OW and OF showed a significant difference in the refractive index in relation 276
to SO. The changes in physical characteristics of oils can be associated with the 277
carotenoids isomerization process. According to Zeb and Murkovic (2011), due to high 278
levels of unsaturation, the carotenoids are susceptible to degradation during their 279
heating process, being one of the first observed changes. 280
In the case of quality characteristics, the acid content of both pigmented oil 281
samples (OW and OF) were significantly higher (p <0.05) than the control sample (SO). 282
And the OF acidity was higher (p <0.05) than the OW (Table 1). This fact can be 283
attributed to the time used to obtain the flour from the waste, as well as the exposure 284
to high temperature for a certain time, which lead to the triggering of hydrolytic 285
reactions that produce free fatty acids and diglycerides (Crosa et al., 2014). This finding 286
corroborates the viscosity results, where no change is observed in relation to the 287
control oil (SO). Unlike the present study, some authors did not find change in acidity 288
on samples of edible oils incorporated with astaxanthin obtained from algae 289
(Haematococcus pluvialis) and submitted to 70 and 90 ºC (Rao, Sarada & Gokare, 290
2007) and added linseed oil of astaxanthin from shrimp waste (L. setiferus) and 291
submitted to 70 °C (Pu et al., 2010). 292
Though, there was no significant change in the peroxide value (Table 1), 293
which suggests that the extraction process of astaxanthin did not change the degree 294
of peroxidation from the pigmented oils. This effect is due to the protective action of 295
natural antioxidants, such as astaxanthin against the formation of peroxides and 296
therefore the oxidative rancidity (Rao et al., 2007). This finding corroborates the study 297
47
by Pu et. al (2010), which evaluated the stability of linseed oil added of astaxanthin 298
and did not find changes in the peroxide value. 299
In the case of identity characteristics, OF showed a significantly higher 300
saponification value (p <0.05) than the other oils (Table 1), mainly due to the thermal 301
process to obtain the shrimp waste flour. This temperature increase triggered the 302
release of short-chain fatty acids, which was also evidenced by acidity value analysis. 303
There was no significant change in the iodine value (Table 1), thus showing 304
that there was no change in the degree of unsaturation of the oils. The iodine value 305
tends to decrease when the oil undergoes an oxidation process due to the decrease 306
of the polyunsaturated fatty acids. However, this process is slowed by the presence of 307
astaxanthin due to its natural antioxidant properties (Núñez-Gastélum et al., 2011). 308
309
3.3 Antioxidant capacity of pigmented oil 310
The samples of OF and its fractions, OFLL and OFML, obtained the best 311
antioxidant capacity (p <0.05) (Table 2, 3 and 4) in most performed tests. The presence 312
of antioxidant activity on these samples is probably due to the high content of 313
astaxanthin (264.7 μg/g of sample), obtained through the applied thermal processing 314
to the waste. This heating was enough to make astaxanthin more available in the food 315
matrix and consequently optimizing its extraction. 316
The exposure to heat of the shrimp waste, through the cooking and drying 317
processes, subsequently improves the recovery of astaxanthin by different solvents 318
(Amado et al., 2015). Thus, researchers choose to lyophilize (Sachindra et al., 2008) 319
or to cook (Cheung, Cheung, & Li-Chan, 2012) the samples before the obtaining the 320
extracts for best results. 321
48
The OW, OWLL and OWML samples, despite having presented lower 322
astaxanthin content, were statistically higher than OF, OFLL and OFML samples only in 323
the analysis of the antioxidant activity using DPPH (Table 2, 3 and 4). Despite being 324
well-established, this method can be influenced by the absorption spectra of the 325
analyzed carotenoids, since they overlap the DPPH radical (Prior, Wu & Schaich, 326
2005). Therefore, one can infer that the data interpretation becomes complex, since 327
this interference may underestimate the antioxidant activity of the pigmented oils. 328
In general, it is possible deduce that the methanolic extract (polar fraction) 329
of all oils obtained the highest values of antioxidant activity (Table 3). This is due to the 330
polar paradox, where lipophilic antioxidants are more efficient in polar means 331
(methanol); however, more studies are needed to prove this effect (Perez-Jiménez et 332
al., 2008). In addition, the astaxanthin presents itself as a water soluble molecule, since 333
it has O2 and OH groups in its chemical structure (xanthophyll) (Franco-Zavaleta et al., 334
2010) and probably a part was extracted with methanol. 335
The found results are similar to other studies which also evaluated the 336
antioxidant capacity of astaxanthin. Sowmya and Sachindra (2012) observed that the 337
extract of shrimp waste (Penaeus indicus) and their respective fractions, particularly 338
the astaxanthin rich fraction, and they showed strong antioxidant activity, detected in 339
different tests. Sachindra et al. (2008) studied the antioxidant activity of carotenoids in 340
lyophilized protein isolates from shrimp waste (Penaeus mondon), and they found a 341
strong antioxidant power. 342
It is noteworthy that there are few studies concerning the evaluation on the 343
antioxidant capacity of astaxanthin in vegetable oil. The current literature only refers to 344
the determination of the antioxidant activity of the shrimp muscle (Litopenaues 345
vannamei) (Silva et al., 2015), or shrimp by-products (Pandalopsis dispar) cooked and 346
49
enzymatically hydrolysed (Cheung et al., 2012), for Instance. Thus, it can be observed 347
that, regardless of the extraction way, the shrimp waste present a natural antioxidant 348
potential. 349
The shrimp waste has other antioxidants, such as phenolics and 350
tocopherols that influence the antioxidant potential of carotenoids, since antioxidants 351
are known to have synergistic action, and these may also be responsible for the 352
elimination of free radicals (Sowmya et al. 2012). However, as the main carotenoid 353
found in the shrimp waste is astaxanthin and the pigment oil presented high contents 354
of carotenoids, it is possible deduce that the expressive antioxidant activity found is 355
mainly due to astaxanthin. 356
The results of the antioxidant capacity identified that, in general, OF 357
presented higher antioxidant activity concerning the other oils and it is possibly due to 358
the higher concentration of astaxanthin. This antioxidant capacity of astaxanthin is 359
attributed to its chemical structure, which is characterized by a long hydrocarbon chain 360
with coupled double bonds (polyene chain) with an aromatic benzene ring at each 361
chain end point containing a hydroxyl (OH) group and a Carbonyl / ketonic (= O) 362
(Franco-Zavaleta et al., 2010). 363
From this perspective, has been increasing in recent years the number of 364
researches focusing on the use of natural antioxidants, such as pure antioxidants or 365
rich extracts in antioxidants (essential oils), in order to protect oils and fats from thermal 366
oxidation (Cavazza, Corti, Mancinelli, Bignardi, & Corradini, 2015). Thus, the 367
astaxanthin could be used as a natural antioxidant in vegetable oils, in order to delay 368
lipid oxidation and increase their shelf life, at the same time would also add functional 369
characteristics beneficial to the human body. 370
50
On the found results concerning the antioxidant properties and physical and 371
physico-chemical characteristics, one can infer that when compared to soybean oil, 372
the pigmented oils, which is rich in astaxanthin, they present a high viability for 373
domestic use and industrial. 374
Conclusion 375
The method used to extract vegetable oil under heating changed some 376
physical and physico-chemical properties of the oils, mainly OF. OW and OF presented 377
a high content of astaxanthin, where the second oil is much more expressive, and this 378
one is directly related to the highest antioxidant power evidenced on the different 379
methods of in vitro analysis. Thus, it is notable that pigmented oils present a 380
considerable potential for commercialization, since it would delay the process of 381
degradation of vegetable oils. 382
383
Interest Conflicts 384
The authors declare that there is no interest Conflicts. 385
386
Acknowledgements 387
The authors thanks Roberta Targino Pinto Correia of the Bioactive 388
Compounds Laboratory of foods of the Federal University of Rio Grande do Norte and 389
Kátia Gomes de Lima Araújo of the Biotechnology Laboratory of Food of the Federal 390
University Fluminense which made available its laboratories. 391
We also want to express our thanks for the financial support from the Conselho 392
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) 393
(MCTI/CNPQ/Universal 14/2014) (National Council for Scientific and Technological 394
51
Development, CNPq in Portuguese) and Improvement Coordination of Higher 395
Education (CAPES) for the scholarship grant. 396
397
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Figure 1. Flowchart for extracting extracts 541
58
Table 1. Physical and physico-chemical characteristics of pigmented oils with 542
astaxanthin (OW and OF) and soybean oil (SO) as analyzed by different methods. 543
ANALYSIS OW OF SO
Density
(Kg/m³)
916.2000b+0.0000 918.0000a+0.0000 916.1000c+0.0000
Viscosity
(Pas)
0.0464b+0.0001 0.0490a+0.0001 0.0463b+0.0001
Refraction
value
1.4665b+0.0006 1.4671b+ 0.0000 1.4648a+0.0006
Acidity level
(mg KOH/g-1)
0.5632b+0.0005 1.9722a+0,0065 0.2816c+0.0006
Peroxide value
(mEq/1000g) 0.5460 a+ 0.0294 0.5899 a+ 0.0987 0.5412a+ 0.0702
Saponification
value
(mg KOH/g-1)
219.1690b+ 1.9285 227.2205a+ 1.3154 216.7492b+ 1.1070
Iodine value
(g de I2/100g)
121.3675a+6.2682 122.4546a+1.9392 122.9232a+4.8741
Caption: abc. The values are shown as means ± standard deviation in triplicates. Averages at the same 544
row, followed by distinctive letters differ significantly (p <0.005) according to the Tukey test (0.05). SO 545
= Soybean oil; OW = Pigmented oil of shrimp waste; OF = Pigmented oil of the shrimp waste flour. 546
59
Table 2. Antioxidant activity of pigmented oils with astaxanthin (OW and OF) and 547
soybean oil (SO) as analyzed by the different antioxidant tests. 548
ANALYSIS OW OF SO
TCA
(mg eq Vit. C/g)
0.0278c+0.0012 0.0729a+0.0023 0.0545b+0.0020
Reducing power
(mg eq Vit. C/g)
0.1468c+0.0069 1.3350a+0.0144 0.1778b+0.0044
Hydroxyl radical
(% of inhibition)
1.9365a+0.3171 2.2381a+0.0825 2.1538a+0.2277
DPPH
(µmol eq trolox/g)
0.0387a+0.0001 0.0381b+0.0000 0.0376c+0.0002
ORAC
(µmol eq trolox/g)
0.4957a+0.0835 0.4840a+0.0643 0.2644b+0.0512
Caption: abc. The values are shown as means ± standard deviation in triplicates. Averages at the same 549
row, followed by distinctive letters differ significantly (p <0.005) according to the Tukey test (0.05). SO 550
= Soybean oil; OW = Pigmented oil of shrimp waste; OF = Pigmented oil of shrimp waste flour. TCA = 551
Total Capacity Antioxidant; DPPH = Inhibition activity radical 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl ; ORAC = 552
Oxygen Radical Absorbance Capacity. 553
60
Table 3. Antioxidant activity of methanolic layer of pigmented oils with astaxanthin 554
(OWML and OFML) and soybean oil (SOML) as analyzed by different antioxidant tests. 555
ANALYSIS OWML OFML SOML
TCA
(mg eq Vit. C/g)
0.0453c+0.0277 0.2242a+ 0.0423 0.0949b+0.0700
Reducing power
(mg eq Vit. C/g)
1.3988b+0.5515 2.9566a+0.2314 1.1513c+0.0967
Hydroxyl radical
(% of inhibition)
30.7302b+0.9002 52.7460a+3.7451 3.8410c+0.5827
DPPH
(µmol eq trolox/g)
0.0393a+0.0000 0.0384b+0.0001 0.0371c+0.0001
ORAC
(µmol eq trolox/g)
0.8185a+0.1044 0.7865a+0.0885 0.2637b+0.0345
Caption: abc. The values are shown as means ± standard deviation in triplicates. Averages at the same 556
row, followed by distinctive letters differ significantly (p <0.005) according to the Tukey test (0.05). SOML: 557
Methanolic layer of soybean oil; OWML: Methanolic layer of the pigmented oil of the shrimp waste flour; 558
OFML: Methanolic layer of the pigmented oil of the shrimp residue flour. TCA = Total Capacity 559
Antioxidant; DPPH = Inhibition activity radical 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl ; ORAC = Oxygen Radical 560
Absorbance Capacity. 561
61
Table 4. Antioxidant activity of the lipid layer of pigmented oils with astaxanthin (OWLL 562
and OFLL) and soybean oil (SOLL) as analyzed by different antioxidant tests. 563
ANALYSIS OWLL OFLL SOLL
TCA
(mg eq Vit. C/g)
0.0210b+0.0021 0.0547a+0.0051 0.0262b+0.0000
Reducing power
(mg eq Vit. C/g)
0.0900b+0.0076 0.1550a+0.0107 0.0971b+0.0001
Hydroxyl radical
(% of inhibition)
1.0000c+0.1429 2.7931a+0.5641 1.9026b+0.0927
DPPH
(µmol eq trolox/g)
0.0349a+0.0004 0.0336b+0.0001 0.0321c+0.0003
ORAC
(µmol eq trolox/g)
0.2792b+0.0548 0.3804a+0.0756 0.2555+0.0457
Caption: abc. The values are shown as means ± standard deviation in triplicates. Averages at the same 564
row, followed by distinctive letters differ significantly (p <0.005) according to the Tukey test (0.05). SOLL: 565
Lipid layer of soybean oil; OWLL: Lipid layer of the pigmented oil of the shrimp waste; OFLL: Lipid layer 566
of the pigmented oil of the shrimp waste flour. TCA = Total Capacity Antioxidant; DPPH = Inhibition 567
activity radical 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl ; ORAC = Oxygen Radical Absorbance Capacity. 568
62
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
As perspectivas de continuidade e/ou ampliação do estudo estão voltadas
para a elaboração de algum produto a base de pescado (linguiça ou hambúrguer) que
utilize o óleo vegetal pigmentado com astaxantina em sua composição, com posterior
análise físico-química, microbiológica, sensorial e composição centesimal.
O estudo apresentou como limitação a não viabilidade tecnológica na
elaboração dos nuggets de peixe voador adicionados de óleo vegetal pigmentado com
astaxantina, sendo necessário portanto, mais testes para a inserção desse óleo em
preparações alimentares.
No que se diz respeito as produções relacionadas à dissertação, o trabalho
intitulado “Caracterização físico-química do óleo vegetal pigmentado obtido a partir do
resíduo de camarão” foi apresentado no Congresso Nacional da Sociedade Brasileira
de Alimentação e Nutrição-SBAN na qualidade de pôster.
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