UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC:

CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA.

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO

Período: Janeiro a Julho de 2015.

( ) PARCIAL (X) FINAL

Título do Projeto de Pesquisa: Análise da genômica Funcional de Corynebacterium pseudotuberculosis Biotipos Ovis e Equi sob diferentes condições de estresse biologicamente relevantes.

Nome do Orientador: Adriana Carneiro Ribeiro

Titulação do Orientador: Doutor

Faculdade: Biotecnologia

Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas

Laboratório: Centro de Genômica e Biologia de Sistemas

Título do Plano de Trabalho: Montagem e anotação funcional dos genomas de linhagens de Corynebacterium pseudotuberculosis biovar equi e ovis. Nome do Bolsista: Diego Freire Barreto Curso do Bolsista: Biotecnologia

Tipo de Bolsa: PIBIC/ CNPq

Resumo do relatório parcial A Corynebacterium pseudotuberculosis é um microrganismo patogênico, Gram-positivo, anaeróbio facultativo, pertencente ao filo Actinobacteria que constitui o grupo CMNR (Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia e Rhodococcus). Esta bactéria é classificada em dois biovares: equi e ovis de acordo com a capacidade de redução de grupos nitrato pela enzima nitrato redutase. O patógeno é causador da doença linfadenite caseosa (LC) caracterizada por causar necrose caseosa dos linfonodos externos e internos em pequenos ruminantes como ovinos e caprinos, e linfangite ulcerativa (LU) que causa abcessos nos vasos linfáticos, principalmente do peitoral e das patas traseiras em equinos, bovinos, bubalinos e camelídeos. Este organismo gera perdas econômicas no setor do agronegócio devido à perda da qualidade de lã, leite, carne e carcaça de animais. Com isso, a realização de estudos para compreender os mecanismos de virulência contribuirá para o desenvolvimento de vacinas eficazes contra este patógeno. Com o objetivo geral de realizar a montagem, anotação funcional e análise comparativa entre de C. pseudotuberculosis biovar ovis linhagem 226 e C. pseudotuberculosis biovar equi linhagem E19 a partir de dados oriundos da plataforma Ion Torrent já foram concluídas as etapas de avaliação da qualidade das sequências pelo software FastQC com valor Phred acima de 20, montagem de novo dos genomas pelo software MIRA e SPAdes, utilização do programa Lasergene para a extensão dos contigs, fechamento de gaps in sílico pelo software CLC Genomics Workbench, anotação automática das linhagens através do software RAST e curadoria manual com o programa Genome Browser Artemis. Após a conclusão dessas etapas obteve-se um único contig para a linhagem 226 com 2.337.820 pb com o valor de N50 igual a 2.337.820 e um total de 370.840.598 leituras. Na anotação funcional foi obtido um total de 4 clusters contendo 5S, 16S e 23S totalizando 12 rRNAs, 49 tRNAs e 72 pseudogenes, e o número total de CDS foi de 2.138. Na linhagem E19 obteve-se um único contig com 2.367.956 pb, totalizando 557.925.027 leituras utilizando o montador SPAdes, e o valor de N50 de 2.367.956. A anotação funcional identificou 2.272 CDS, e foram detectados 12 rRNAs, 48 tRNAs e 10 pseudogenes.

1. Introdução

A Corynebacterium pseudotuberculosis é um microrganismo patogênico com importância na

área médico-veterinária, sendo causador de diversos prejuízos econômicos, principalmente no

agronegócio, devido à perda da qualidade de lã, leite, carne e carcaça de animais (ARSENAULT et

al., 2003). Este patógeno é uma bactéria Gram-positiva pertencente ao filo Actinobacteria, e constitui

o grupo CMNR (Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia e Rhodococcus), o qual possui

características comuns, tais como: organização da parede celular caracterizada pela presença de um

grande complexo polimérico composto por peptídeoglicanos, arabinogalactanos e ácido micólico; e

46 a 74% de conteúdo G+C. É um patógeno intracelular facultativo com formas pleomórficas, não

esporulante, não capsulado, sem mobilidade e contém fímbrias. É uma bactéria anaeróbica

facultativa e que apresenta o crescimento ótimo à 37ºC e com pH entre 7,0 e 7,2 (DORELLA, 2006).

A C. pseudotuberculosis é classificada em biovares, equi e ovis. Essa classificação é

determinada pela presença da enzima nitrato redutase, o qual o biovar equi apresenta redução de

nitrato positiva e já foi isolada de cavalos (ALEMAN M, 1996), bovinos (YERUHAM, 2003) e

bubalinos (SILVA et al, 2012), e o biovar ovis apresenta redução de nitrato negativa, e pode ser

isolada de ovinos e caprinos, mas também já foram isoladas a partir de suínos (MANUELA et al,

2014) e humanos (DORELLA, 2006).

Este patógeno é causador da doença linfadenite caseosa em pequenos ruminantes como

ovinos e caprinos. Porém, pode acometer outros hospedeiros, como humanos, causando a linfadenite

subaguda a crônica (DORELLA, 2006; FONTAINE & BAIRD, 2008). A infecção em humanos é

um evento raro, e em todos os casos relatados tem sido ligada à exposição a C. pseudotuberculosis

no trabalho pecuário ou afins. Cerca de 30 casos de infecção humana já foram descritos na literatura

(D'AFONSECA, 2011). Já a linfangite ulcerativa é mais frequente em equinos, bovinos, bubalinos e

camelídeos. A linfadenite caseosa é caracterizada pela presença de necrose caseosa nos linfonodos

externos e/ou internos, e linfangite ulcerativa afeta os vasos linfáticos causando abscessos,

particularmente no peitoral e nas patas traseiras (HASSAN, 2012; DORELLA, 2006).

2. Justificativa

A C. pseudotuberculosis, agente etiológico da linfadenite caseosa e linfangite ulcerativa,

causa graves perdas econômicas no agronegócio. Devido sua importância na área da saúde e

veterinária, a realização de estudos para compreender os mecanismos de virulência contribui para a

elucidação de novos alvos terapêuticos contra este patógeno. Sendo assim, o sequenciamento,

montagem, anotação funcional e análise comparativa de diferentes biovares desta bactéria infectando

diferentes hospedeiros auxiliará a identificar possíveis novos alvos vacinais compartilhados pelas

diferentes linhagens, bem como uma melhor compreensão das bases moleculares de sua virulência.

3. Objetivos

3.1 Objetivo Geral

Realizar a montagem, anotação funcional e análise comparativa entre de C.

pseudotuberculosis biovar ovis linhagem 226 e C. pseudotuberculosis biovar equi linhagem E19 a

partir de dados oriundos da plataforma Ion Torrent PGM™.

3.2 Objetivos Específicos

• Montar os genomas de duas linhagens de C. pseudotuberculosis biovares ovis e equi, através

da estratégia de montagem ab initio;

• Ordenar e orientar os contigs obtidos a partir das melhores montagens;

• Realizar o fechamento de gaps in silico para obtenção da sequência final do genoma;

• Realizar a predição in silico do conteúdo gênico do genoma e identificar os elementos

estruturais que compõem o genoma (rRNA, tRNAs e pseudogenes);

• Classificar as proteínas de acordo com as categorias do Gene Ontology;

• Averiguar a conservação da ordem gênica entre as duas linhagens de C. pseudotuberculosis;

• Identificar genes ortólogos e únicos entre os genomas das duas linhagens de C.

pseudotuberculosis.

4. Materiais e Métodos

4.1 Organismo do estudo

Para este trabalho foi selecionado uma linhagem de cada biovar de C. pseudotuberculosis. A

linhagem 226 foi caracterizada bioquimicamente como nitrato redutase negativa (ovis), esta

linhagem foi a primeira isolada a partir de abscessos de um caprino na Califórnia (EUA) e foi

adquirida por meio de parcerias entre o Centro de Genômica e Biologia de Sistemas (UFPA),

Laboratório de Genética Celular e Molecular (UFMG) e a Universidade da Califórnia. E a linhagem

do biovar equi foi isolada de um equino no Chile, não tendo seu local de abcesso informado, obtida

através de parcerias entre o Centro de Genômica e Biologia de Sistemas (UFPA), Laboratório de

Genética Celular e Molecular (UFMG) e a Universidade do Chile.

4.2 Sequenciamento e Tratamento De Dados

As linhagens 226 e E19 de C. psedotuberculosis foram sequenciadas pela plataforma Ion

Torrent PGM™ (Personal Genome Machine) (www.lifetechnologies.com) com o chip 318. Utilizou-

se o software FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/) para avaliar a qualidade das

sequências, e para trimar as leituras com qualidade Phred acima de 20 foi usado o software FastX

Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html).

4.3 Montagem

A montagem de novo dos dois genomas foi realizada pelo software MIRA (CHEVREUX et

al., 2004) e SPAdes (BANKEVICH et al., 2012), e, após, utilizou-se o Lasergene

(www.dnastar.com) para a extensão dos contigs. O programa Mauve (DARLING et al., 2010)

ordenou os contigs e gerou o scaffold. Os gaps foram fechados in silico pelo software CLC

Workbench (www.clcbio.com).

4.4 Anotação

A anotação automática das linhagens 226 e E19 foram feitas através da plataforma web

RAST (AZIZ et al., 2008), sendo realizada a curadoria manual com o programa Genome Browser

Artemis. E a análise funcional foi realizada com o programa Blast2GO (Rutherford et al., 2000),

onde descreve os processos e funções biológicas.

4.5 Análise comparativa

A análise comparativa entre as linhagens 226 e E19 foi feita através do programa PGAP,

onde foram identificados os genes ortólogos e únicos, utilizado como arquivo de entrada os arquivos

no formato .nuc, .pep e .function, gerados a partir do arquivo embl, sendo os parâmetros utilizados

pelo PGAP: e-value de 0.00001, identidade de 80% e cobertura de 90%. Para a conservação da

ordem gênica com o programa Gepard foram utilizados os arquivos em formato fasta das linhagens

226 e E19 para geração do dotplot. Para a predição de ilhas de patogenicidade foi feita a análise com

o programa GIPSy (SOARES et al., 2012). Utilizou-se o programa Artemis Comparison Tool (ACT)

(CARVER et al., 2008) e o software Gepard (KRUMSIEK et al., 2007) para visualização da sintenia

entre as linhagens bem como análise das regiões gênicas entre as mesmas.

5. Resultados

O sequenciamento da linhagem 226 gerou um total de 370.840.598 leituras, e após a etapa de

montagem e extensão das leituras pelos softwares MIRA, e Lasergene (REF) obteve-se um único

contig com 2.337.820 pb com o valor de N50 igual a 2.337.820. Na anotação funcional foi obtido um

total de 4 clusters contendo 5S, 16S e 23S totalizando 12 rRNAs, 49 tRNAs e 72 pseudogenes, e o

número total de CDS foi de 2.138. Na linhagem E19, após o sequenciamento obteve-se 557.925.027

leituras utilizando o montador SPAdes, após foi gerado um contig com 2.367.956 pb e o valor de

N50 de 2.367.956. Na anotação funcional foram identificadas 2.272 CDS, e foram detectados 12

rRNAs, 48 tRNAs e 10 pseudogenes (Tabela 1).

Tabela 1. Características genômicas das linhagens 226 e E19.

Características genômicas C.pseudotuberculosis 226 C.pseudotuberculosis E19

GenBank ID CP010889 CP012136

Tamanho (pb) 2.337.820 2.367.956

% Conteúdo GC 52,18% 52,1%

% Codificante 84,7% 86,6%

Genes 2.271 2.272

Proteínas 2.138 2.112

Operons de RNA 4x 4x

Número de tRNA 49 48

Pseudogenes 72 10

Na análise comparativa entre as linhagens verificou-se a presença de 1.754 genes ortólogos,

ou seja, os genes comuns encontrados nas duas espécies. Além disso, foram identificados 186 genes

únicos da linhagem 226 e 358 genes únicos da linhagem E19 (Figura 1). Entre os genes ortólogos

destacamos o gene rpoB que é um dos genes utilizados para a identificação de espécies de Coryne-

bacterium pseudotuberculosis. De acordo com Khamis et al, 2004 foi identificada uma região dentro

da sequência do gene com alto grau de polimorfismo, delimitada por sequências conservadas que

podem ser usadas como primers universais para amplificação por PCR e sequenciamento. Dentre os

genes únicos destacamos o gnlD da linhagem E19 que codifica a PII uridilil-tranferase, sendo esse

responsável por adenilar a proteína PII, uma proteína de transdução de sinal que possui papel funda-

mental no metabolismo de nitrogênio em bactérias e archaea (MIKE MERRICK, 2014). Na linha-

gem 226 destacamos o gene Cp226_0206 o qual codifica uma proteína similar a transposase. De

acordo com Daniel et al, 2015, as transposases são enzimas que catalisam o processo de movimenta-

ção de certos elementos do DNA (transposons) de uma molécula de DNA para outra, sendo assim

passando informação genética para os cromossomos em ordem de conferir uma nova função ou subs-

tituir um gene defeituoso.

Figura 1. Diagrama de Venn dos genes ortólogos e únicos das linhagens 226 e E19.

Por meio da análise do programa Blast2GO foram identificados os processos e funções

biológicas para as linhagens, sendo que para a linhagem 226 foram identificados 43 funções

moleculares (Figura 2) e 37 processos biológicos (Figura 3), e para a linhagem E19 foram

encontrados 44 funções moleculares (Figura 4) e 37 processos biológicos (Figura 5).

Figura 2. Funções moleculares da C. pseudotuberculosis linhagem 226. A figura mostra as 14

funções mais representadas. Dados obtidos pelo programa Blast2GO (nível 3 do Gene Ontolgy).

Figura 3. Processos biológicos da C. pseudotuberculosis linhagem 226. A figura mostra as 15

funções mais representadas. Dados obtidos pelo programa Blast2GO (nível 3 do Gene Ontolgy).

0   100   200   300   400   500   600  

ligação  a  composto  orgânico  cíclico  ligação  a  composto  orgânico  heterocíclico  

ligação  a  íon  hidrolase  

ligacão  a  pequenas  moléculas  transferase  

ligação  a  derivados  de  carboidrato  oxidoredutase  

transportador  transmembrana  ligase  liase  

transportador  de  substrato  específico  ligação  a  cofator  

isomerase  

Número  de  genes  

Função  Biológica    

Funções  moleculares  da  C.  pseudotuberculosis  linhagem  226  

0   100   200   300   400   500   600   700   800   900  

processo  metabólico  de  substâncias  orgânicas  processo  metabólico  celular  

processo  metabólico  primário  processo  celular  de  organismo  único  

processo  metabólico  de  organismo  único  processo  metabólico  de  compostos  de  nitrogênio  

processo  biossintéPco  estabelecimento  de  localização  localização  de  organismo  único  

regulação  de  processos  biológicos  processo  catbólico  

resposta  celular  a  esRmulo  resposta  a  estresse  

organização  de  componente  celular  mePlação  

Número  de  genes  

Processos  B

iológicos  

Processos  biológicos  da  C.pseudotuberculosis  linhagem  226  

Figura 4. Funções moleculares da C. pseudotuberculosis linhagem E19. A figura mostra as

15 funções mais representadas. Dados obtidos pelo programa Blast2GO (nível 3 do Gene Ontolgy).

Figura 5. Processos biológicos da C. pseudotuberculosis linhagem E19. A figura mostra as 15

funções mais representadas. Dados obtidos pelo programa Blast2GO (nível 3 do Gene Ontolgy).

0   100   200   300   400   500   600  

ligação  a  composto  orgânico  cíclico  ligação  a  composto  orgânico  heterocíclico  

ligação  a  íon  hidrolase  

ligacão  a  pequenas  moléculas  transferase  

ligação  a  derivados  de  carboidrato  oxidoredutase  

transportador  transmembrana  ligase  liase  

transportador  de  substrato  específico  ligação  a  cofator  

isomerase  consPtuinte  estrutural  do  ribossomo  

Número  de  genes  

Processos  

Funções  moleculares  da  C.pseudotuberculosis  linhagem  E19  

0   100   200   300   400   500   600   700   800   900  

processo  metabólico  de  substância  orgânica  

processo  metabólico  primário  

processo  metabólico  de  organismo  único  

processo  biosintéPco  

localização  de  organismo  único  

resposta  celular  a  esRmulo  

resposta  a  estresse  

mePlação  

Número  de  genes  

Processos    

Processos  biológicos  da  C.pseudotuberculosis  linhagem  E19  

Através da análise de sintenia realizada pelo ACT, nota-se alta conservação da ordem gênica

entre as linhagens (figura 6), não havendo regiões de inversões entre os genomas. Apesar do alto

grau de sintenia, na figura 7 é possível identificar algumas regiões de quebras, isto porque os

genomas pertencerem a biovares diferentes.

Figura 6. Análise da sintenia entre as linhagens 226 e E19 de C. pseudotuberculosis gerada pelo

programa ACT.

Figura 3. Gráfico dotplot da análise da sintenia entre as linhagens 226 e E19.

Pelo programa Gipsy foi identificado oito ilhas de patogenicidade para a linhagem 226.

Os principais genes foram localizados na ilha 1, dentre estes o gene pld que é descrito na literatura

como um dos principais genes relacionados a virulência de C. pseudotuberculosis, codificador da

proteína fosfolipase-D (MANUELA et al, 2014). Também foi encontrado o operon fagABC e fagD

que estão envolvidos no sistema de absorção do ferro e está relacionado com a persistência da

bactéria durante o processo de infecção (MARIANA, 2014), e o gene cas5, que é associado à

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) e que confere resistência a

fagos e plasmídeos (DHAWAN et al, 2015).

Na C. pseudotuberculosis linhagem E19 foram identificadas nove ilhas de patogenicidade.

Assim como na linhagem 226, os principais genes relacionados a patogenicidade para a cepa E19

foram encontrados na ilha 1, contendo os mesmos genes que a cepa 226. Entretanto, houve

diversidade no número de bases que consistem cada ilha e no número de genes em cada ilha, sendo

14 na linhagem 226 e 20 na linhagem E19. Este resultado, bem como a análise de sintenia e

conservação da ordem gênica, já era esperado devido à proximidade entre as linhagens em questão.

6. Conclusão

Através da análise comparativa das linhagens 226 e E19, obteve-se novas informações que

contribuirão para a melhor compreensão dos mecanismos de virulência da bactéria Corynebacterium

pseudotuberculosis, a qual possui grande importância para as áreas da saúde, veterinária e do

agronegócio. Sendo assim, o sequenciamento, montagem e análise comparativa de diferentes

biovares infectando diferentes hospedeiros irão contribuir para uma identificação de possíveis novos

alvos vacinais.

7. Referências bibliográficas

Atieh Khamis, Didier Raoult, and Bernard La Scola. rpoB Gene Sequencing for Identification

of Corynebacterium Species. Journal Of Clinical Microbiology, Sept. 2004, p. 3925–3931.

Aleman M, Spier SJ, Wilson WD, Doherr M.

Corynebacterium pseudotuberculosis infection in horses: 538 cases (1982-1993). Journal of the

American Veterinary Medical Association 209(4), (804-809), 1996

Arsenault J, Girard C, Dubreuil P, Daignault D, Galarneau J-R, Boisclair J, Simard C, and

Bélanger D. Prevalence of and carcass condemnation from maedi–visna, paratuberculosis and

caseous lymphadenitis in culled sheep from Quebec, Canada. Preventive Veterinary Medicine, 59(1-

2), 67–81. 2003.

Aziz R K, Bartels D, Best A a, DeJongh M, Disz T, Edwards R a, Formsma K, Gerdes S,

Glass E M, Kubal M, Meyer F, Olsen G J, Olson R, Osterman A L, Overbeek R a, McNeil L K,

Paarmann D, Paczian T, Parrello B, Pusch G D, Reich C, Stevens R, Vassieva O, Vonstein V, Wilke

A, and Zagnitko O. The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology. BMC

genomics, 9, 75. 2008.

Bankevich A, Nurk S, Antipov D, Gurevich AA, Dvorkin M, Kulikov AS, Lesin

VM, Nikolenko SI, Pham S, Prjibelski AD, Pyshkin AV, Sirotkin AV, Vyahhi N, Tesler

G,Alekseyev MA, Pevzner PA. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to

single-cell sequencing. Journal of computational biology. v. 19, n5, p. 455-477.

Baird, G. J., Fontaine, M. C.. Corynebacterium pseudotuberculosis and its Role in Ovine

Caseous Lymphadenitis. J Comp Pathol., v. 137, n. 4, p. 179-210. 2007. Revisão.

Chevreux B, Pfisterer T, Drescher B, Driesel A J, Müller W E G, Wetter T, and Suhai S.

Using the miraEST assembler for reliable and automated mRNA transcript assembly and SNP

detection in sequenced ESTs. Genome research, 14(6), 1147–59. 2004.

Daniel P. Godfrey, Christopher M. Singer, Donald J. Jacobs, Irina V. Nesmelova. Mos1

Transposase Thermodynamic Stability and Flexibility. v. 108. Issue 2. Supplement 1. p.521a.

January 2015.

Darling A E, Mau B, and Perna N T. progressiveMauve: multiple genome alignment with

gene gain, loss and rearrangement. PloS one, 5(6), e11147. 2010.

Dorella, F. A, et al. Corynebacterium pseudotuberculosis: microbiology, biochemical

properties, pathogenesis and molecular studies of virulence. Vet. Res., v. 37, p. 201-218. 2006.

D'Afonseca, V.. Pangenoma de Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis e de

espécies do gênero de Corynebacterium. 2011. 313 f. Tese (Doutorado em Genética) – Instituto de

Ciências Biológicas – Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte. 2011.

Fontaine M C, and Baird G J (2008). Caseous lymphadenitis. Small Ruminant Research,

76(1-2), 42–48.

Hassan S. S., Guimarães L. C., Pereira U. de P., Islam A., Ali A., Bakhtiar S. M., Ribeiro D.,

Rodrigues Dos Santos A., Soares S. de C., Dorella F., Pinto A. C., Schneider M. P., Barbosa M. S.,

Almeida S., Abreu V., Aburjaile F., Carneiro A. R., Cerdeira L. T., Fiaux K., Barbosa E., Diniz C.,

Kunin V, Sorek R, Hugenholtz P (2007). Evolutionary conservations of sequence and

secondary structures in CRISPR repeats. Genome biology, 8 (64), R61.

Rocha F. S., Ramos R. T., Jain N., Tiwari S., Barh D., Miyoshi A., Müller B., Silva A.,

Azevedo V.. Complete genome sequence of Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis strain

P54B96 isolated from antelope in South Africa obtained by rapid next generation sequencing

technology. Standards in Genomic Sciences, v. 7, p. 189-199, 2012.

Syed Shah Hassan, Maria Paula C. Schneider, Rommel Thiago Jucá Ramos, Adriana R.

Carneiro, Alex Ranieri, Luis Carlos Guimarães, Amjad Ali, Syeda Marriam Bakhtiar, Ulisses de

Pádua Pereira, Anderson Rodrigues dos Santos, Siomar de Castro Soares, Fernanda Dorella, Anne

Cybelle Pinto, Dayana Ribeiro, Maria Silvanira Barbosa, Síntia Almeida, Vinícius Abreu, Flávia

Aburjaile, Karina Fiaux, Eudes Barbosa, Carlos Diniz, Flavia S. Rocha, Rashmi Saxena, Sandeep

Tiwari, Vasudeo Zambare, Preetam Ghosh, Luis G. C. Pacheco, Christopher G. Dowson, Anil

Kumar, Debmalya Barh, Anderson Miyoshi, Vasco Azevedo, and Artur Silva. Whole-Genome

Sequence of Corynebacterium pseudotuberculosis Strain Cp162, Isolated from Camel. J Bacteriol.

v.194 n. 20 p. 5718–5719. 2012.

Krumsiek J, Arnold R, and Rattei T. Gepard: a rapid and sensitive tool for creating dotplots

on genome scale. Bioinformatics (Oxford, England), 23(8), 1026–8. 2007.

Manuela Oliveira, Cynthia Barroco, Carla Mottola, Raquel Santos, Abdelhak Lemsaddek,

Luis Tavares and Teresa Semedo-Lemsaddek. First report

of Corynebacteriumpseudotuberculosis from caseous lymphadenitis lesions in Black Alentejano pig

(Sus scrofa domesticus). BMC Veterinary Research. p. 10-218. 2014.

Manish Dhawan, Manish Sharma and Rajveer Singh Grewal. CRISPR Systems: RNA-

Guided Defence Mechanisms in Bacteria and Archaea. International Journal of Current

Microbiology and Applied Science (2015) 4(6): 187-200.

Mariana Passos Santana. Análise transcricional de Corynebacterium pseudotuberculosis

biovar equi, linhagem 258, a partir de montagem ab initio: um enfoque nos processos biológicos dos

stimulons ácido, térmico e osmótico. UFMG. Dissertação de Mestrado. 2014.

Mike Merrick. Post-translational modification of PII signal transduction proteins. Frontiers in

Microbiology. v. 5. p. 763. 2014.

Rutherford K, Parkhill J, Crook J, Horsnell T, Rice P, Rajandream M a, and Barrell B.

Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics (Oxford, England), 16(10), 944–5.

2000.

Selim, S. A. Review Oedematous Skin Disease of Buffalo in Egypt. J. Vet. Med., p. 241-258.

2001. Revisão.

Silva A, Ramos RT, Ribeiro Carneiro A, Cybelle Pinto A, de Castro Soares S, Rodrigues

Santos A, Silva Almeida S, Guimarães LC, Figueira Aburjaile F, Vieira Barbosa EG, Alves Dorella

F, Souza Rocha F, Souza Lopes T, Kawasaki R, Gomes Sá P, da Rocha Coimbra NA, Teixeira

Cerdeira L, Silvanira Barbosa M, Cruz Schneider MP, Miyoshi A, Selim SA, Moawad MS, Azevedo

V. Complete genome sequence of Corynebacterium pseudotuberculosis Cp31, isolated from an

Egyptian buffalo. J Bacteriol. v. 194 n. 23 p. 6663-4. 2012

Yeruham, D. Elad, S. Friedman, and S. Perl. Corynebacterium pseudotuberculosis infection

in Israeli dairy cattle. 131(2): (947–955), 2003.

8. Dificuldades

Após o sequenciamento das linhagens, o tratamento dos arquivos obtidos para posterior

análise na plataforma PGAP, bem como o processo de análise de dados pelo servidor para gerar os

dados necessários para a plataforma Blast2GO foram etapas que apresentaram um pouco de

dificuldade para serem superadas, visto que determinados arquivos não estavam tratados

corretamente e que, para achar esses erros específicos, foi necessária verificação manual dos

arquivos.

9. Parecer do orientador

DATA: ______/_________/______

_____________________________________________

ASSINATURA DO ORIENTADOR

_____________________________________________

ASSINATURA DO ALUNO