universidade federal do espÍrito santo centro de...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPRITO SANTO
CENTRO DE CIENCIAS AGRRIAS
PROGRAMA DE PS GRADUAO EM CINCIA E TECNOLOGIA DE
ALIMENTOS
ALESSANDRA CASAGRANDE RIBEIRO
EFEITO DA ADIO DE LEO ESSENCIAL DE PIMENTA ROSA (Schinus
terebinthifolius Raddi) MICROENCAPSULADO EM QUEIJO MINAS FRESCAL
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincia e Tecnologia de Alimentos do Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Esprito Santo, como parte das exigncias para obteno do Ttulo de Mestre em Cincia e Tecnologia de Alimentos.
Orientadora: DSc. Mirela Guedes Bosi Co-orientadora: DSc. Patrcia Campos Bernardes
Co-orientadora: DSc. Pollyanna Ibrahim Silva
ALEGRE- ES
2015
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i
Ao meu filho Felipe,
meu maior incentivador,
amor incondicional.
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ii
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a DEUS por nunca me abandonar,
Aos meus pais por sempre me apoiarem,
Ao meu filho Felipe pelo amor e carinho,
Aos meus irmos e tios por estarem sempre torcendo por mim,
Aos meus avs por me inspirarem,
Aos meus amigos da UFES por encherem esses dias de alegria, companheirismo
e aprendizado, especialmente: Ariane, Carla, Carmelita, Gisela, Marcela, Paula e
Sabrina,
Joyce e ao Andr por fazerem parte deste trabalho,
CAPES pela to esperada Bolsa,
UFES e ao PCTA pela oportunidade de um curso de ps-graduao,
AGROROSA, pela gentil doao da pimenta rosa,
minha orientadora Mirela por toda dedicao, carinho, ensinamentos e
pacincia,
s minhas co-orientadoras: Patrcia e Pollyana por estarem sempre presentes
colaborando, incentivando e acrescentando este projeto,
Ao professor Srgio por toda ateno dedicada,
Aos professores Adilson, Christiano, Ren e Sukarno pela contribuio neste
trabalho,
Ao Toninho pelo apoio,
Aos tcnicos: Amanda, Eduardo, Letcia e Mariza por estarem sempre disponveis
a nos atender,
Edivnia pelo carinho especial,
E tantos outros que tornaram este momento possvel.
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Formulaes utilizadas para microencapsulao. _______________ 25
Tabela 2: Dados mdios de extrao de leo essencial de pimenta rosa. _____ 36
Tabela 3: Composio do leo essencial de pimenta rosa ________________ 37
Tabela 4: Valores mdios e respectivos desvio padro da atividade antioxidante
do leo essencial de pimenta rosa. __________________________________ 38
Tabela 5: Valores mdios e desvio padro () do halo de inibio (cm) do leo
essencial de pimenta rosa e antibiticos para o microrganismo S. aureus. ____ 40
Tabela 6: Caracterizao fsico-qumica das 3 formulaes de microcpsulas de
leo essencial de Pimenta Rosa ____________________________________ 42
Tabela 7: Dimetro mdio (m) das partculas das 3 formulaes de
microcpsulas de leo essencial de pimenta rosa _______________________ 43
Tabela 8: Parmetros de cor das trs formulaes de microcpsulas ________ 50
Tabela 9: Soma de ordens para as formulaes A, B, C e D de queijo Minas
Frescal adicionado 0,005; 0,010; 0,015 e 0,020%, de leo essencial de pimenta
rosa respectivamente e a diferena entre elas. _________________________ 52
Tabela 10: Mdias e desvios padro de acidez titulvel e pH do leite utilizado nos
trs processamentos do experimento. ________________________________ 53
Tabela 11: Mdia e desvio padro acidez titulvel e pH dos queijos produzidos
nos trs processamentos do experimento _____________________________ 53
Tabela 12: Mdias e desvios padro da composio centesimal do leite utilizado
no experimento. _________________________________________________ 54
Tabela 13: Composio centesimal dos queijos produzidos: mdias e desvios
padro dos 3 processamentos ______________________________________ 55
Tabela 14: Parmetros do perfil de textura instrumental dos queijos controle (CO)
e queijo adicionado de leo essencial de pimenta rosa microencapsulado (OEPR)
______________________________________________________________ 56
Tabela 15: Parmetros de cor na formulao de queijo controle (CO) e queijo
adicionado de leo essencial de pimenta rosa microencapsulado (OEPR) ____ 58
Tabela 16: Mdias das contagens de coliformes; Escherichia coli; fungos e
leveduras nos queijos _____________________________________________ 59
Tabela 17: Log da contagem de S.aureus dos queijos CO e OEPR em cada
tempo. ________________________________________________________ 60
Tabela 18: Mdias e seus respectivos desvios padro das notas dos julgadores
no teste sensorial de aceitao _____________________________________ 62
Tabela 19: Mdias e seus respectivos desvios padro da inteno de compra dos
julgadores. _____________________________________________________ 65
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iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Pimenta rosa (Fonte FAES e SENAR, 2009) ____________________ 9
Figura 2: Esquema bsico microencapsulao spray dryer (adaptao ASCHERI,
1997). _________________________________________________________ 13
Figura 3: Representao esquemtica das atividades realizadas no experimento.
______________________________________________________________ 18
Figura 4: Ficha para o teste de ordenao-preferncia (adaptao Minim, 2010) 34
Figura 5: Modelo de Ficha de avaliao utilizada no teste de aceitao sensorial
(adaptao de Minim, 2010) ________________________________________ 35
Figura 6: Crescimento de S. aureus diferentes concentraes (50%, 25%, 12,5%,
6,25%, 3,125%, 1,56%, 0,78%, 0,39% e 0%) de leo essencial de pimenta rosa
aps 11 horas de incubao. _______________________________________ 41
Figura 7: Imagens de microscopia eletrnica de varredura (MEV) da formulao
01 (Fo1), aumento 1000, 2000, 8000 e 20000 vezes. ____________________ 44
Figura 8: Espectro de Energia Dispersiva (EDS) obtido da formulao 01 ____ 45
Figura 9: Imagens de microscopia eletrnica de varredura (MEV) da formulao
02 (aumento 1000, 2000 e 8000 vezes). ______________________________ 46
Figura 10: Espectro de energia dispersiva (EDS) obtido da formulao 02. ___ 46
Figura 11: Imagens de microscopia eletrnica de varredura (MEV) da formulao
03 (aumento 1000, 2000 e 8000 vezes). ______________________________ 47
Figura 12: Espectro de energia dispersiva (EDS) obtido da formulao 03 ____ 48
Figura 13: Difratograma das Formulaes 01 (Fo1), 02 (Fo2) e 03 (Fo3). _____ 49
Figura 14: Contagem de S.aureus no queijo Minas Frescal CO e OEPR (Log
UFC.g-1 de queijo). _______________________________________________ 60
Figura 15: Distribuio de frequncias para o atributo aparncia ___________ 63
Figura 16: Distribuio de frequncias para o atributo sabor. ______________ 63
Figura 17: Distribuio de frequncias para o atributo textura ______________ 64
Figura 18: Distribuio de frequncias para o atributo impresso global ______ 64
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RESUMO
Ribeiro, Alessandra Casagrande. : Efeito da adio de leo essencial de pimenta
rosa (Schinus terebinthifolius Raddi) microencapsulado em queijo Minas Frescal.
(Dissertao Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos) Universidade
Federal do Esprito Santo, Alegre - ES. Orientadora: DSc. Mirela Guedes Bosi.
Co-orientadoras: DSc. Patrcia Campos Bernardes e DSc. Pollyanna Ibrahim
Silva.
A pimenta rosa o fruto da aroeira (Schinus terebinthifolius Raddi), uma planta
nativa do Brasil. A extrao e caracterizao do seu leo essencial viabiliza a sua
utilizao industrial. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da adio de
leo essencial de pimenta rosa em queijo Minas Frescal . Foram identificados
95,36% dos constituintes do leo essencial, sendo o -careno-3 o compontente
majoritrio. O leo essencial de pimenta rosa apresentou caractersticas
antioxidante (2,53 0,28 mols de trolox por mL de leo) e antimicrobiana para o
desenvolvimento de Staphylococcus aureus. Foi observado, no teste de difuso
em gar, a formao do halo de inibio de 1,35 0,32 cm, e na anlise de
concentrao inibitria mnima, o valor de 3,13%. O leo essencial sensvel
degradao no meio em que se encontra, portanto necessita de processos
tecnolgicos para assegurar sua ao. Para proteger o leo essencial foi
realizada a microencapsulao por meio da secagem por spray dryer. O leo foi
microencapsulado utilizando trs formulaes com diferentes concentraes de
goma arbica, maltodextrina e amido modificado como papel de parede. As
microcpsulas obtidas foram analisadas quanto s suas caractersticas fsico-
qumicas e morfolgicas e foi selecionada uma formulao para posterior adio
ao queijo Minas Frescal. A formulao com 5% de amido modificado, 10% de
maltodextrina e 5% de goma arbica foi selecionada. Para definio da
concentrao de leo essencial que foi utilzada no queijo, foi realizado teste
sensorial de ordenao-preferncia, visto que a concentrao inibitria mnima
(3,13%) era muito alta para ser utilizada nos queijos. A formulao com 0,01% de
leo essencial foi a preferida e utilizada para fabricao dos queijos. Foram
elaborados e caracterizados os queijos controle (CO) e o queijo com adio das
microcpsulas de leo essencial de pimenta rosa (OEPR). Em relao s
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vi
caractersticas fsico-qumicas, os queijos CO e OEPR s apresentaram diferena
significativa em relao umidade (P= 0,0021; =0,05). O queijo OEPR teve boa
aceitao sensorial com mdia de aceitao global de 7,6 0,97, no
apresentando diferena significativa, ao nvel de 95% de confiana, do queijo
controle (7,6 1,18). Para avaliar a capacidade do leo essencial de pimenta rosa
microencapsulado em inibir o desenvolvimento de S. aureus, foram inoculadas
nos queijos CO e OEPR concentraes iniciais de 106 UFG.g. Os queijos foram
armazenados em BOD temperatura de 4 1 C at realizao das anlises, que
ocorreram nos tempos: 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 30 dias. Houve reduo de 1,53 ciclos
Log no queijo adicionado de leo essencial de pimenta rosa. De acordo com os
resultados obtidos, conclui-se que o leo essencial de pimenta rosa uma
alternativa vivel de utilizao em queijo Minas Frescal , devido ao seu potencial
antioxidante, antimicrobiano e sua aceitao sensorial.
Palavras chaves: Staphylococcus aureus, microencapsulao, secagem por
atomizao.
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vii
ABSTRACT
Ribeiro, Alessandra Casagrande. Effect of microencapsulated essential oil of pink
pepper (Schinus terebinthifolius Raddi) addition on Minas Frescal cheese.
(Dissertao Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos) Universidade
Federal do Esprito Santo, Alegre - ES. Advisor: Mirela Guedes Bosi. Co- Advisor:
Patrcia Campos Bernardes e Pollyanna Ibrahim Silva.
Pink pepper is the fruit of the pepper tree (Schinus terebinthifolius Raddi), a
native plant from Brazil. The extraction and characterization of its essential oil
enables its industrial use. This work aimed to evaluate the effect of essential oil of
pink pepper addition on Minas Frescal cheese. 95.36% of constituents of essential
oil were identified, and the -carene-3 was the major compontente. Pink pepper
essential oil showed antioxidant (2.526 0.277 mols per ml Trolox oil) and
antimicrobial characteristics regarding the development of Staphylococcus aureus.
It was observed in the agar diffusion test, the formation of inhibition zone of 1.35
0.322 cm, and in the minimum inhibitory concentration analysis, the value of
3.13%. Essential oil is sensitive to degradation, so it requires technological
processes to ensure its action. In order to protect the essential oil, it was
microencapsulated with the use of a spray dryer. To microencapsulate it, three
wallpaper formulations were developed using different concentrations of gum
arabic, modified starch and maltodextrin. The microcapsules were analyzed
according to their physical, chemical and morphological characteristics and a
formulation was selected to be added to Minas Frescal cheese. The formulation
with 5% modified starch, 10% of maltodextrin and 5% arabic gum was selected. In
order to define the cheese essential oil concentration, it was conducted a sensory
test-ordering preference and the formulation with 0.01% essential oil was the most
preferred. Control cheese (CO) and cheese with addition of pink pepper essential
oil microcapsules (OEPR) were prepared and characterized. Concerning physico-
chemical characteristics, CO and OEPR cheeses only differed on moisture. OEPR
cheese presented good sensory acceptance. Global acceptance means were 7.6
0.97, with no significant difference (p> 0.05) compared to control cheese (7.6
1.18). To evaluate the effect of pink pepper essential oil on inhibiting the
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development of S. aureus, the oil was inoculated in CO and OEPR cheeses with
initial concentrations of 106 CFU.g-1. The cheeses were stored in BOD at
temperature of 4 1 C during the period of time of analysis: 0, 3, 6, 9, 12, 15 and
30 days. Results showed reduction of 1.53 cycles Log in cheese with the addition
of pink pepper essential oil. According to these results, pink pepper essential oil is
a feasible alternative of addition in Minas Frescal cheese due to its antioxidant and
antimicrobial potential, and its sensory acceptance.
Key words: Staphylococcus aureus, microencapsulation, spray drying.
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SUMRIO
1 INTRODUO ............................................................................................. 1
2 OBJETIVOS ................................................................................................. 4
2.1 Objetivo geral .............................................................................................. 4
2.2 Objetivos especficos ............................................................................. 4
3 REVISO BIBLIOGRFICA ........................................................................ 5
3.1 Queijo Minas Frescal ................................................................................. 5
3.2 Gastroenterite estafiloccica ................................................................. 6
3.3 Pimenta rosa ............................................................................................ 8
3.4 Microencapsulao ............................................................................... 11
3.4.1 Secagem por atomizao ............................................................... 13
3.4.2 Material de parede .......................................................................... 14
4 MATERIAL E MTODOS........................................................................... 18
4.1 Extrao do leo essencial de pimenta rosa ...................................... 19
4.2 Caracterizao do leo essencial de pimenta rosa............................ 20
4.2.1 Composio qumica ...................................................................... 20
4.2.2 Atividade antioxidante ................................................................... 21
4.2.3 Atividade antimicrobiana ............................................................... 23
4.3 Microencapsulao do leo essencial de pimenta rosa .................... 24
4.4 Caracterizao fsico-qumica das microcpsulas ............................ 25
4.4.1 Atividade de gua ........................................................................... 26
4.4.2 Umidade .......................................................................................... 26
4.4.3 Higroscopicidade ............................................................................ 26
4.4.4 Microscopia eletrnica de varredura ............................................ 26
4.4.5 Difrao de raios x .......................................................................... 26
4.4.6 Cor ................................................................................................... 27
4.5 Elaborao do queijo Minas Frescal ................................................... 27
4.6 Caracterizao do queijo Minas Frescal ............................................. 30
4.6.2 Anlises microbiolgicas dos queijos .............................................. 32
4.6.3 Anlises sensoriais ............................................................................ 33
5 RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................. 36
5.1 Extrao do leo essencial de pimenta rosa .......................................... 36
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5.2 Caracterizao do leo essencial de pimenta rosa............................ 36
5.2.1 Composio qumica ...................................................................... 36
5.2.2 Atividade antioxidante ................................................................... 38
5.2.3 Atividade antimicrobiana ............................................................... 39
5.3 Microencapsulao do leo essencial de pimenta rosa .................... 42
5.3.1 Caracterizao fsico-qumica e morfolgica das microcpsulas de
leo essencial de pimenta rosa .................................................................. 42
5.3.2 Microscopia eletrnica de varredura ................................................ 43
5.3.3 Difrao de raios x .............................................................................. 48
5.3.4 Cor ........................................................................................................ 50
5.4 Elaborao e caracterizao do queijo Minas Frescal ....................... 51
5.4.1 Acidez titulvel e pH ....................................................................... 52
5.4.2 Composio centesimal do leite e do queijo Minas Frescal ........... 53
5.4.3 Anlises microbiolgicas .............................................................. 59
5.4.4 Teste de aceitao sensorial ......................................................... 62
6 CONCLUSES .......................................................................................... 66
7 PERSPECTIVAS FUTURAS ...................................................................... 67
REFERNCIAS ............................................................................................... 68
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1 INTRODUO
O Minas Frescal um queijo no maturado com elevada atividade de gua
(Aw) e alto teor de nutrientes. Estas caractersticas o tornam favorvel para o
desenvolvimento de microrganismos, o que pode causar riscos sade do
consumidor. Dentre os microrganismos capazes de se desenvolver em queijo
Minas Frescal, Staphylococcus aureus tem sido bastante pesquisado, pois neste
produto h relatos de surtos causados por este microrganismo (ROCHA et. al.,
2006; SENGER; BIZANI, 2011; SOARES et al, 2008; WALSTRA, 2006).
O uso de conservantes uma alternativa obteno de produtos seguros
do ponto de vista microbiolgico. Porm, tem-se preferido produtos alimentcios
com um mnimo de conservantes, o que tem levado os pesquisadores a buscar
alternativas para atender a essa demanda. A adio de leo essencial extrado
de plantas (galhos, folhas e sementes), por suas propriedades antimicrobianas,
uma maneira encontrada para exercer esse controle (AZEVEDO et al., 2012;
BURT, 2004; HOLLEY; PATEL, 2005; OLIVEIRA et al., 2013; SOARES et al.,
2008).
A pimenta rosa o fruto da aroeira (Schinus terebinthifolius Raddi), uma
planta nativa do Brasil, pertencente famlia Anacardiaceae e que possui outros
nomes comuns como: aroeira-vermelha, aroeira-mansa, aroeira-branca, aroeira-
da-praia, aroeira-do-serto, araguaraba, fruto-de-sabi e rvore-da-pimenta
(BAGIO, 1988; SILVA-LUZ; PIRANI, 2015). Ocorre desde o Nordeste, passando
pelos cerrados, chegando ao Rio Grande do Sul e estendendo pela Argentina e
Paraguai. Seu plantio desponta como alternativa para a diversificao agrcola. A
extrao de seu leo essencial viabiliza sua utilizao industrial, conferindo sabor
peculiar ao produto ao qual adicionado (BAGIO, 1988; FAES e SENAR, 2009;
SILVA-LUZ; PIRANI, 2015). No entanto, sua composio, atividade
antimicrobiana e ao antioxidante precisam ser mais bem investigadas. leos
essenciais de organo, alecrim, louro tm sido usados com sucesso para
controlar reaes de oxidao em alimentos (OLMEDO et al., 2013; ARAJO,
2011; DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010).
A oxidao um fenmeno natural que ocorre em alimentos e bebidas,
sendo responsvel por uma srie de alteraes que levam perda do valor
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2
nutricional, alterao das caractersticas sensoriais e formao de compostos
txicos (ARAJO, 2011). Os efeitos da oxidao afetam a maioria dos
componentes no alimento, incluindo micronutrientes e os macronutrientes. A
utilizao de substncias qumicas capazes de fornecer proteo contra a
oxidao uma alternativa para reduzi-la (ARAJO, 2011; BOROSKI et al., 2012;
OLMEDO et al., 2013; TRAJANO; 2010). Os antioxidantes, alm de retardar a
rancidez oxidativa, protegem carotenoides, vitaminas e outros compostos
insaturados. A atividade antioxidante est relacionada com estrutura e
composio qumica e os leos essenciais possuem compostos com
caractersticas qumicas propcias para atuarem como antioxidantes (ARAJO,
2011; DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010). Dentre estes compostos esto
os hidrocarbonetos, lcoois e compostos carbonlicos.
Diversos constituintes qumicos dos leos essenciais so fotossensveis e
podem sofrer processos oxidativos nas condies ambientais. Alm disso, estes
compostos so de baixa massa molecular e apresentam grande volatilidade.
Assim para utiliz-los torna-se necessrio a aplicao de mtodos que ajudem a
preservar seus princpios ativos. A microencapsulao uma tcnica que permite
a proteo dos princpios ativos contra reaes de degradao e permite a
liberao desses compostos de maneira controlada. Na microencapsulao, as
substncias nos estados slido, lquido ou gasoso so revestidas por um agente
encapsulante, obtendo partculas de dimenses microscpicas (ASCHERI et.al,
2003; BRASILEIRO, 2011).
Um dos processos mais utilizados para microencapsular partculas
alimentcias a secagem em Spray-Dryer. Nele, o leo essencial de pimenta rosa
ou outro material ativo a ser encapsulado misturado ao material encapsulante
formando uma emulso. Ao ser atomizado dentro do secador, ocorre a
evaporao do lquido do agente encapsulante com a formao da membrana ao
redor das gotas do material ativo. O processo dividido em trs etapas: preparo
de uma emulso, homogeneizao e atomizao em cmara de secagem
(DZIEZAK, 1988; GHARSALLAOUI et al., 2007). Esse processo apresenta
algumas vantagens sobre os outros mtodos de encapsulao as propriedades e
a qualidade do produto so mais eficientemente controladas; podem ser usados
produtos sensveis ao calor como leos essenciais; h possibilidades de grandes
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3
produes em operao contnua com equipamentos simples; produo de
partculas relativamente uniformes e esfricas; boa eficincia e baixo custo do
processo.
Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi produzir queijo Minas Frescal
adicionado de leo essencial de pimenta rosa microencapsulado, a fim de verificar
o efeito do leo essencial nas caractersticas fsico-qumicas, microbiolgicas e
sensrias do queijo.
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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar o efeito da adio do leo essencial de pimenta rosa microencapsulado
em queijo Minas Frescal nas suas caractersticas fsico-qumicas, sensoriais e
microbiolgicas.
2.2 Objetivos especficos
Extrair o leo essencial de pimenta rosa.
Determinar a composio qumica do leo essencial de pimenta rosa.
Avaliar a atividade antioxidante do leo essencial de pimenta rosa.
Determinar a atividade antimicrobiana do leo essencial de pimenta rosa
para o desenvolvimento de Staphylococcus aureus: teste de difuso em gar e
concentrao inibitria mnima (CIM).
Microencapsular o leo essencial.
Determinar as caractersticas fsico-qumicas e morfolgicas das
microcpsulas.
Elaborar o queijo Minas Frescal com leo essencial de pimenta rosa
microencapsulado.
Avaliar por meio de teste de ordenao-preferncia o queijo Minas Frescal
com diferentes concentraes de leo essencial de pimenta rosa
microencapsulado.
Determinar as caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas do queijo
Minas Frescal adicionado de leo essencial microencapsulado.
Verificar a eficincia do leo essencial de pimenta rosa microencapsulado
em inibir o desenvolvimento de S. aureus no queijo Minas Frescal.
Avaliar a aceitao sensorial do queijo Minas Frescal adicionado de leo
essencial de pimenta rosa microencapsulado.
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3 REVISO BIBLIOGRFICA
3.1 Queijo Minas Frescal
Segundo Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade para Leite e
Derivados da Portaria n 146 de 07/03/1996 do Ministrio da Agricultura, Pecuria
e Abastecimento (MAPA) entende-se por queijo o produto fresco ou maturado que
se obtm por separao parcial do soro do leite ou leite reconstitudo (integral,
parcial ou totalmente desnatado) ou de soros lcteos, coagulados pela ao fsica
do coalho, de enzimas especficas, de bactria especfica, de cidos orgnicos,
isolados ou combinados, todos de qualidade apta para uso alimentar, com ou sem
agregao de substncias alimentcias e/ou especiarias e/ou condimentos,
aditivos especificamente indicados, substncias aromatizantes e matrias
corantes (BRASIL, 1996).
O queijo o produto gelatinizado obtido pela agregao da casena por
ao de enzimas ou por alterao do pH. No processo tradicional de fabricao
de queijo Minas adicionada a enzima quimosina (renina) ao leite. Por ser um
produto classificado como fresco, est pronto para o consumo logo aps sua
fabricao segundo mesma portaria do MAPA (BRASIL, 1996).
A alta atividade de gua e composio nutricional o torna propcio ao
desenvolvimento de diversos microrganismos, inclusive bactrias patognicas. A
qualidade inicial do leite a primeira condio a ser observada na produo de
queijo, pois um nmero inicial elevado de bactrias patognicas, no ter
destruio eficiente pelos processos de beneficiamento. Todo o leite utilizado na
fabricao de queijo Minas dever ser pasteurizado. O desenvolvimento de
bactrias em leite pasteurizado est relacionado com condies de
armazenamento inadequadas: temperaturas superiores s estabelecidas pela
legislao ou prtica higinicas inaceitveis (ROCHA; BURITI; SAAD, 2006;
VIERA et al., 2008;).
Na microbiota capaz de se desenvolver no queijo Minas Frescal esto
bactrias patognicas, que podem causar infeco (ingesto de microrganismo
que podem se multiplicar e disseminar em tecidos e rgos) ou toxinfeco
alimentar (pela a ingesto de toxinas). Os sintomas dessas doenas alimentares
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variam desde diarreia, vmitos, febre, flatulncia at abortos. Alguns exemplos de
bactrias que podem estar presentes no queijo Minas Frescal so: S. aureus,
Salmonella spp, Shigella spp e Listeria spp (VIEiRA et al., 2008).
Por estar associado a infeces no bere, S. aureus pode estar presente
no leite cru e, devido a falhas no processo de fabricao, ser transmitido aos
queijos (ASPERGER; ZANGERL, 2011). Pasteurizao inadequada, ou utilizao
de leite cru no processamento dos queijos so possveis maneiras desta
contaminao ocorrer. Outra forma de contaminao seria atravs de
manipulao inadequada. Os manipuladores nas fbricas de processamento de
lcteos tambm podem ser hospedeiros deste microrganismo e, por falhas nos
programas de boas prticas de fabricao, contaminar os queijos. Se houver
produo de enterotoxinas haver intoxicao estafiloccica (FOX, 1988; VIEIRA
et al., 2008; WALSTRA, 2006).
A produo de alimentos seguros, que no causem danos sade do
consumidor, um dos alvos a serem alcanados pela indstria alimentcia.
Portanto, aliado a boas prticas de fabricao, o uso de substncias que reduzam
o desenvolvimento microbiano, a oxidao de lipdios e com isso as alteraes
indesejveis nos alimentos vem atender a essa demanda.
3.2 Gastroenterite estafiloccica
A gastroenterite estafiloccica causada pela ingesto de alimentos que
contenham uma ou mais enterotoxinas, produzidas por algumas espcies e
linhagens de estafilococos. Embora a produo de enterotoxinas esteja associada
a Staphylococcus aureus coagulase e ternonucleases (TNase) positivos, algumas
espcies que no produzem estas enzimas podem produzir enterotoxinas (JAY,
2005).
S. aureus um importante patgeno oportunista que tem impacto sobre a
sade humana. Embora seja conhecido por causar infeces de pele e dos
tecidos moles, ele tem capacidade de infectar quase todos os sistemas e rgos
do corpo humano, muitas vezes com consequncias fatais devido variedade de
seus fatores de virulncia (BOSE; BAYLES, 2013). Os fatores de virulncia so
estruturas, produtos ou estratgias que as bactrias utilizam para driblar o
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sistema de defesa do hospedeiro e causar uma infeco. Alguns esto
relacionados com a colonizao do microrganismo e outros com as leses
causadas pelo organismo, por exemplo, as toxinas como o caso do estafilococo
(TRABULSI; ALTERTHUM, 2008).
O gnero Staphylococcus inclui mais de 30 espcies, sendo 18 delas de
real e potencial interesse em alimentos. Dessas 18 espcies e subespcies
somente 6 so coagulase positiva e produzem nuclease termoestvel (TNase).
Das coagulases negativas, 10 demonstraram capacidade de produzir
enterotoxinas, mas no produzem nucleases, ou se produzem, elas so
termossensveis. Estafilococos produtores de enterotoxina, em particular, S.
aureus, so provavelmente a principal causa de doena de origem alimentar em
todo o mundo (ASPERGER; ZANGERL, 2011).
O desenvolvimento de S. aureus em alimentos est relacionado a casos de
intoxicao alimentar pela ingesto de enterotoxina. Enterotoxinas so protenas
produzidas por algumas espcies de estafilococos. Geralmente os alimentos
associados so: carne (bovina, suna e aves), e seus subprodutos (presunto,
salsichas e salames), saladas com presunto ou frango ou batata, cremes de
recheio de produtos panificados e produtos lcteos, com destaque para os queijos
(APHA, 2001).
S. aureus um patgeno associado a infeces em animais. (APHA,
2001). Ele pode colonizar e infectar a glndula mamria de vacas. A adeso ao
epitlio escamoso e mido fundamental para colonizao de S. aureus
(FOSTER, 2011). Este microrganismo pode expressar uma srie de protenas de
superfcie, que interagem com a superfcie das clulas epiteliais escamosas, e
que contribuem para o processo infeccioso. Estas protenas promovem a
aderncia matriz extracelular, a evaso de respostas imunes e invaso das
clulas epiteliais. Alm disso, elas inibem a migrao de neutrfilos e danificam as
membranas das clulas hospedeiras, incluindo fagcitos.
Portanto o leite e produtos lcteos, especialmente os queijos, podem ser
contaminados por este microrganismo quando no existem boas prticas de
higiene, incluindo o controle de mastite; ou o leite no pasteurizado
adequadamente. Aps a contaminao com estafilococos enterotoxignica, a
intoxicao alimentar pode acontecer quando o desenvolvimento abundante e
http://www.infoescola.com/microbiologia/fatores-de-virulencia-adesao-invasao-e-sideroforos/
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8
formao de enterotoxina ocorrem durante a produo e armazenamento destes
produtos lcteos (ASPERGER; ZANGERL, 2011).
Devido s suas caractersticas e sua constituio qumica, o leo essencial
desponta como uma alternativa para controlar o desenvolvimento de
microrganismos, alm da oxidao de lipdios. Porm so necessrios estudos
que investiguem sua ao antimicrobiana, antioxidante e os efeitos de sua
utilizao em alimentos.
3.3 Pimenta rosa
A aroeira (Schinus terebinthifolius Raddi) uma planta nativa do Brasil,
pertencente famlia Anacardiaceae e possui outros nomes comuns como:
aroeira-vermelha, aroeira-de-remdio, aroeira-mansa, aroeira-branca, aroeira-da-
praia, aroeira-do-serto, araguaraba, fruto-de-sabi e rvore-da-pimenta (BAGIO,
1988; SILVA-LUZ; PIRANI, 2015). Ocorre desde o Nordeste (Alagoas, Bahia,
Cear, Paraba, Pernambuco, Piau, Rio Grande do Norte, Sergipe) passando
pelos cerrados (Mato Grosso do Sul), regio sudeste (Esprito Santo, Minas
Gerais, Rio de Janeiro, So Paulo) chegando regio sul (Paran, Rio Grande do
Sul, Santa Catarina) e se estendendo pela Argentina e Paraguai (SILVA-LUZ;
PIRANI, 2015). Seu plantio desponta como alternativa para a diversificao
agrcola, pois uma espcie que permite o sistema integrado de produo
agroflorestal. A espcie florestal (aroeira) atua como elemento bsico para
amenizao ambiental e diversificao da produo agrcola (BAGIO, 1988).
O fruto da Aroeira conhecido como pimenta rosa, ou poivre-rose na
Frana; pink pepper nos Estados Unidos da Amrica. A pimenta rosa possui
sabor peculiar, bastante apreciado na culinria internacional, sendo a produo
nacional praticamente voltada para exportao. A pimenta rosa, por sua cor
atrativa utilizada para decorar pratos, conferindo-lhes requinte. Portanto os
frutos com injrias ou verdes so descartados. Uma alternativa para utilizao
destes frutos seria a extrao do seu leo essencial (BERTOLDI, 2006).
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Figura 1: Pimenta rosa (Fonte FAES e SENAR, 2009)
Para conseguirem proteo contra inimigos potenciais tais como bactrias,
fungos, vrus, nematoides, caros, insetos, mamferos ou animais herbvoros, os
vegetais desenvolveram sistemas de defesas. O primeiro nvel de defesa envolve
a superfcie da planta (cutcula e periderme). O segundo nvel est relacionado a
um grupo de diversos compostos vegetais, existentes apenas no reino vegetal e
conhecidos como metablitos secundrios (TAIZ; ZEIGER, 2013).
Sabe-se que muitos produtos do metabolismo secundrio tm funes
importantes nos vegetais: eles agem como atrativos para polinizao; protegem
as plantas contra herbvoros e contra a infeco por microrganismos patognicos,
entre outras funes (TAIZ; ZEIGER, 2013). Apesar de no apresentar funo
direta no crescimento e desenvolvimento dos vegetais os metablitos secundrios
geralmente desempenham papel fundamental nas funes vitais das plantas
como: fotossntese, respirao, transporte de solutos, translocao, sntese de
protenas, assimilao de nutrientes entre outros (TAIZ; ZEIGER, 2013). Os
metablitos secundrios podem ser divididos em 3 grupos quimicamente distintos:
terpenos, compostos fenlicos e compostos nitrogenados.
Os leos essenciais fazem parte dos metablitos secundrios, importante
grupo de constituintes dos vegetais e so responsveis pelos seus odores
aromticos caractersticos (BIZZO; HOVELl; REZENDE, 2009). Os leos
essenciais compreendem uma mistura complexa de hidrocarbonetos, alcois e
compostos carbonlicos. Os hidrocarbonetos, por sua vez, so uma mistura de
substncias volteis, os terpenos e em menor frequncia, esquiterpenos
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(ARAUJO, 2011; PAWLOWSKI et al., 2012). A extrao do leo essencial da
pimenta rosa viabiliza sua utilizao industrial, conferindo seu sabor ao produto ao
qual adicionado (BAGIO, 1988; BERTOLDI, 2006; FAES e SENAR, 2009;
PAWLOWSKI et al., 2012).
Entre as diferentes classes de produtos naturais encontrados em leos
essenciais, os terpenos esto associados aos danos no processo de diviso
celular, sntese de ATP e anormalidades cromossmicas o que pode estar
envolvido no seu mecanismo antimicrobiano (PAWLOWSKI et al., 2012).
Outra caracterstica que vem sendo associada aos leos essenciais a
capacidade antioxidante. O estresse oxidativo caracterizado pelo desequilbrio
entre a produo de radicais livres e a sua inativao pelos sistemas de defesa do
organismo. Est sujeito de ocorrer em todos os organismos expostos a ambientes
oxigenados. O oxignio atmosfrico possui baixa energia de ativao inicial,
porm durante o metabolismo do oxignio, podem ser produzidas espcies
altamente reativas causadoras de danos a biomolculas. Em alimentos, isto pode
provocar a oxidao de lipdios, pigmentos, vitaminas e protenas, acarretando
perda de sabor, descolorao e perda de nutrientes importantes, alm de
formao de compostos carcinognicos. Logo os sistemas biolgicos, animais e
vegetais, desenvolveram diversas defesas antioxidantes, a fim de se proteger da
oxidao (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010; DECKER, 2002).
Os alimentos que so derivados de diferentes tecidos biolgicos contm
uma srie de diferentes sistemas de defesa para prevenir os efeitos prejudiciais
das espcies reativas do oxignio, como os radicais superxido (O2-.),
hidroperoxila (HO2.), hidroxila (OH) e o perxido de hidrognio (H2O2)
(FERREIRA; MATSUBARA, 1997). Porm durante o processamento as espcies
reativas podem aumentar levando a um descontrole oxidativo, resultando em
perda de qualidade, diminuio de tempo de conservao e formao de
compostos txicos. Para garantir a qualidade e segurana dos alimentos so
adicionados antioxidantes aos alimentos processados (DAMODARAN; PARKIN;
FENNEMA, 2010; DECKER, 2002).
Os antioxidantes utilizados em alimentos podem ser sintticos ou naturais.
Em geral os antioxidantes sintticos so estruturas fenlicas, e os naturais so
compostos fenlicos, quinonas, lactonas e os polifenis. Nos mecanismos de
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controle de oxidao de lipdios esto envolvidos os bloqueadores da reao em
cadeia (doadores de hidrognio) e os complexadores de metais. Os bloqueadores
so classificados em dois grupos: doadores e receptores de eltrons (ARAJO,
2011). Os antioxidantes doadores de eltrons ou hidrognio competem pelo
radical formado, diminuindo a velocidade da reao de oxidao. A eficincia da
atuao dependente da estrutura qumica e estabilidade do radical formado. Os
antioxidantes receptores de eltrons competem com o oxignio triplete pelo
radical livre, reduzindo a formao de radicais, principalmente o radical peroxil
(ARAJO, 2011).
O segundo mecanismo envolve a complexao de metais, catalisadores da
reao de oxidao de lipdios. um mecanismo definido como preventivo, pois
no ocorre interao entre radicais e sim complexao de ons metlicos, inibindo
com isso a decomposio dos perxidos (ARAJO, 2011).
A busca por uma alimentao mais saudvel e natural, com o mnimo de
conservantes ou aditivos sintticos tem incentivado as pesquisas para encontrar
aditivos ou antioxidantes eficazes e de baixo custo (DECKER, 2002). Alm dos
esforos para reduo da deteriorao oxidativa, busca-se o desenvolvimento de
tcnicas de processamento de alimentos que ajudem a preservar antioxidantes
endgenos. Estes compostos tambm tm sido associados a benefcios para a
sade (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010; DECKER, 2002).
Portanto o leo essencial de pimenta rosa pode ser uma alternativa vivel
para o controle da oxidao de lipdios e do desenvolvimento de microrganismos,
dentre estes o S. aureus, patgeno associado toxinfeces alimentares.
3.4 Microencapsulao
Uma das grandes dificuldades tecnolgicas em relao aos leos
essenciais a preservao de suas caractersticas fsico-qumicas, sensoriais e
aromticas durante o processamento e estocagem, pois possuem grande parte
dos componentes sensveis ao calor e oxidao, alm de serem altamente
volteis. Alm disso, os leos essenciais podem reagir com outros ingredientes na
formulao alterando suas propriedades (MLLER, 2011). A cor, o sabor e o odor
originais dos alimentos geralmente so os mais afetados pelos mtodos
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tradicionais de processamento. Com isso, se torna necessrio implantar mtodos
que preservam estas caractersticas, alm de deixar componentes nutricionais
mais bio-acessveis. Uma maneira encontrada para a aplicao dos leos
essenciais a microencapsulao.
Microencapsulao o processo de empacotamento de materiais ativos
(slidos, lquidos ou gasosos), as quais podem liberar o contedo de forma
controlada e sob condies especficas (REBELLO, 2009). As microcpsulas
podem ser descritas como embalagens extremamente pequenas, compostas por
um polmero como material de parede e um material ativo chamado de ncleo. As
microcpsulas so empregadas para melhorar o desempenho do material ativo ou
possibilitar novas aplicaes (ARSHADY, 1993).
A microencapsulao tem a funo de preservar os componentes como
aromas e vitaminas dos alimentos. A perda destes nutrientes traz prejuzos ao
seu valor nutricional, alm de afetar suas caractersticas sensoriais,
transformando o alimento em um produto distante do produto original (REBELLO,
2009).
As microcpsulas tm a capacidade de modificar e melhorar a aparncia e
as propriedades de uma substncia. Sua utilizao visa a atender s
necessidades especficas da indstria de alimentos como reduzir a reatividade do
ncleo com o ambiente; facilitar a manipulao do material encapsulado;
promover liberao controlada de determinadas substncias; mascarar sabor e
odor desagradveis e promover a diluio homognea do material encapsulado
em uma formulao alimentcia (REBELLO, 2009).
Alm dos leos essenciais, existem outros compostos para os quais a
microencapsulao utilizada, dentre os quais: pigmentos, compostos de sabor,
nutrientes, enzimas, conservantes, acidulantes, probiticos, entre outros
(MLLER, 2011).
Diversos mtodos tm sido utilizados na elaborao das microcpsulas,
tais como: spray drying ou secagem por atomizao, coacervao, liofilizao,
secagem em leito em espuma, spray cooling, extruso, extruso centrfuga,
recobrimento em leito fluidizado, lipossomas e complexao por incluso
(REBELLO, 2009).
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Conforme o tamanho, as cpsulas podem ser classificadas em 3
categorias: macro (> 5000 m), micro (0,2- 5000 m) e nano cpsulas (< 0,2 m).
As cpsulas podem ser divididas em dois grupos: aquelas nas quais o ncleo
nitidamente centralizado, envolto em um filme bem definido de material de
parede, caracterizando as verdadeiras microcpsulas; e aquelas nas quais o
ncleo disperso na regio matricial, denominada as microesferas (PINTO,
2012).
3.4.1 Secagem por atomizao
A secagem por atomizao tambm conhecida como secagem por
asperso consiste na transformao do material do estado lquido para o slido,
atravs da disperso de gotculas que entram em contato com ar quente dentro
de uma cmara. Essa tcnica a mais utilizada pela indstria de alimentos. O
material que dever ser seco pode estar sob a forma de soluo, suspenso,
emulso ou pasta. A microencapsulao por atomizao conforme ilustrado na
Figura 2, envolve as operaes de emulsificao do material ativo com uma
soluo aquosa do material de parede, atomizao dentro da cmara de
secagem, seguida de secagem das gotculas atomizadas (ASCHERI, 1997).
Figura 2: Esquema bsico microencapsulao spray dryer (adaptao ASCHERI,
1997).
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Como a evaporao da gua acontece rapidamente, a temperatura dentro
do ncleo no ultrapassa 100 C, com temperaturas geralmente em torno de 60
C, reduzindo a ocorrncia de alteraes indesejveis nos compostos
termossensveis. Esta considerada a principal vantagem da atomizao
(AZEREDO, 2005).
3.4.2 Material de parede
A seleo do material de parede adequado crtica para o sucesso da
microencapsulao. O material correto evita interaes qumicas, oxidao e
volatilizao do ncleo alm de maximizar a reteno do leo essencial aps o
processo de secagem. Os materiais de parede no devem reagir com o material
ativo do ncleo e devem ser seguros para o uso em alimentos (AZEREDO, 2005;
FERNANDES et al., 2014). Alm disso, para encapsulao de leos, os materiais
de parede devem possuir capacidade de formar e estabilizar emulses,
proporcionando uma pelcula em torno da superfcie das gotculas de leo da
emulso durante a homogeneizao, formando uma barreira ao oxignio, principal
responsvel pela oxidao (GARTI, 2008).
Existe uma grande variedade de materiais de parede utilizados para a
microencapsulao. Polmeros naturais como protenas (gelatina, protenas do
soro de leite, caseinato de sdio e protena de soja), pequenas molculas de
hidratos de carbono (emulsionantes, amidos e amidos modificados, sacarose,
glicose, lactose, maltodextrina), gomas (goma arbica, xantana, guar) entre outros
(GARTI, 2008). Os polmeros naturais tm sido preferidos nestes aspectos, sendo
compatveis com formulaes alimentcias (FERNANDES et al., 2014).
A goma arbica considerada um excelente material de parede, mas
problemas relacionados utilizao desse material tm levado a estudos que
indiquem substitutos. Seu custo elevado e fornecimento limitado esto entre os
principais problemas. O amido modificado e a maltodextrina tornaram-se uma
alterativa vivel para a substituio da goma arbica, devido alta disponibilidade
e baixo custo.
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A goma arbica um dos materiais mais utilizados para compor as
paredes das microcpsulas (FERNANDES et al., 2014). um biopolmero
extrado de um arbusto, Accia Senegal, encontrado principalmente na frica. A
goma arbica uma mistura complexa de diferentes biopolmeros, com pelo
menos trs fraes principais com alto massa molecular. Tem sido proposto que a
frao surfactante ativa consiste em arabinogalactanos ramificados ligados
cadeia de um polipeptdio. A cadeia polipeptdica tem grupos laterais hidrofbicos,
responsveis pela sua adsoro dos lipdios na superfcie. J a outra poro
hidroflica dos blocos de arabinogalactano se posiciona na fase aquosa formando
uma camada interfacial. A esta camada creditada a estabilidade contra a
agregao das gotculas, principalmente por meio de repulso estrica, mas com
alguma contribuio da repulso eletrosttica (KASAPIS, 2009; DICKISON, 2003).
No entanto, quando comparada a outros biopolmeros de superfcie, a
goma arbica tem baixa afinidade pelas interfaces leo-gua. recomendada sua
utilizao em concentraes elevadas ou juntamente com outros biopolmeros
para formao de emulses estveis (DICKISON, 2003; KASAPIS, 2009).
Problemas frequentes associadas com variaes de qualidade, tm levado
a pesquisas para investigar fontes alternativas de emulsificantes de biopolmeros
para uso em alimentos (ASCHERI, 1997; ASCHERI; MARQUEZ; MARTUCCI,
2003; FERNANDES et al., 2014; KASAPIS, 2009).
Os amidos naturais costumam ter pouca atividade de superfcie por serem
molculas predominantemente hidroflicas. No entanto, a sua modificao qumica
ir produzir emulsionantes altamente eficazes. Geralmente esta modificao
feita anexando grupos laterais hidrfobos ao longo de suas estruturas (NILSSON;
BERGENSTAHL, 2006; TRUBIANO, 1995). Estes amidos modificados so
amplamente utilizados como emulsionantes na indstria de bebidas,
frequentemente como um alternativa ou substituio goma arbica. Um dos
amidos modificados mais utilizado um derivado de octenilsuccinato de milho
ceroso. O amido modificado consiste principalmente em amilopectina
quimicamente modificada para conter grupos laterais aninicos e no polares
(ASCHERI, 1997; I; ASCHERI; MARQUEZ; MARTUCCI, 2003; FERNANDES et
al., 2014).
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Estes grupos laterais apolares se prendem s superfcies das gotculas
lipoflicas, enquanto as cadeias de amido polares posicionam direcionadas para a
fase aquosa (KASAPIS, 2009), caracterstica fundamental de um bom
emulsificante. Estas cadeias de amido polimricas hidroflicas protegem as
gotculas da coalescncia, atravs principalmente de repulso estrica; embora a
repulso eletrosttica tambm possa desempenhar algum papel. Esta
modificao tambm confere ao material excelente capacidade de reteno de
volteis durante a atomizao no atomizador (ROCHA et al., 2012) .
Como o mecanismo dominante de estabilizao das emulses adicionadas
de amido modificado a repulso estrica, estas se tornam resistentes a
alteraes do pH, a fora inica e temperatura (CHANAMAI; MCCLEMENTS,
2002).
Da mesma maneira que a goma arbica, o amido modificado possui baixa
atividade interfacial quando comparado com protenas ou agentes tensoativos.
Por isso deve tambm ser usado em grandes concentraes (recomenda-se 1:1 a
proporo de amido e leo nas emulses leo em gua) para garantir que todas
as superfcies das gotculas sejam revestidas adequadamente (KASAPIS, 2009).
A maltodextrina qualificada como um polmero sacardeo no doce, que
consiste em unidades de D-glicose ligadas principalmente por cadeias -1,4 com
dextrose equivalente (DE) menor que 20. Apresenta-se em p branco ou soluo
concentrada obtida a partir da hidrlise parcial do amido com cido ou enzimas.
A sua utilizao como material de parede de ingredientes alimentcios tem sido
pesquisada, pois oferece vantagens em relao a outros materiais de parede:
custo relativamente baixo, aroma e sabor neutros, baixa viscosidade em altas
concentraes de slidos e uma boa proteo do ncleo contra reaes de
oxidao. A sua limitao ao uso est relacionada sua baixa capacidade de
emulsificao e reteno de compostos volteis, sendo recomendada a sua
utilizao com outros materiais de parede (FERNANDES et al., 2014).
Entre suas propriedades funcionais podemos destacar a capacidade de
formao de pelcula em torno do material ativo, protegendo-o; baixa
higroscopicidade; baixa viscosidade e boa dissoluo em gua, facilitando com
isso a reidratao do material encapsulado. medida que se aumenta o nmero
de dextroses equivalentes da maltodextrina aumenta-se sua higroscopicidade
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porm, sua viscosidade diminui (ASCHERI, 1997; I; ASCHERI; MARQUEZ;
MARTUCCI, 2003).
Este estudo avaliou o efeito de goma arbica, amido modificado e
maltodextrina na composio, caractersticas fsico-qumicas e morfologia das
micropartculas de leo essencial de pimenta rosa.
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4 MATERIAL E MTODOS
As atividades foram divididas em trs etapas: Etapa 1 Extrao e
caracterizao do leo essencial de pimenta rosa; Etapa 2 Microencapsulao
do leo essencial de pimenta rosa; Etapa 3 Fabricao do queijo Minas Frescal
adicionado de leo essencial de pimenta rosa microencapsulado juntamente com
sua caracterizao fsico-qumica; anlises microbiolgicas e teste de aceitao
sensorial do produto elaborado.
A representao esquemtica com as etapas do estudo e suas respectivas
fases mostrada na Figura 3.
Figura 3: Representao esquemtica das atividades realizadas no experimento.
Para caracterizao do leo essencial de pimenta rosa, o experimento foi
conduzido segundo delineamento inteiramente casualizado com trs repeties;
Extrao do leo essencial
Caracterizao do leo essencial
Composio qumica
Atividade antioxidante
Atividade antimicrobiana
Microencapsulao
Elaborao do Queijo Minas
Caracterizao fsico-qumica
Anlises microbiolgicas
Anlises sensoriais
Caracterizao das microcpsulas
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sendo todas as anlises foram realizadas em duplicata. Foram calculadas as
mdias e respectivos desvios padro. As anlises estatsticas foram realizadas
utilizando o Excell e o programa estatstico SAEG (2007) DEMO.
Para a caracterizao das microcpsulas o delineamento foi inteiramente
casualizado com trs repeties. As anlises foram realizadas em duplicata e
foram calculadas as mdias e respectivos desvios padro. Os resultados foram
analisados utilizando a Anlise Estatstica Univariada (ANOVA) para verificar a
existncia de diferena significativa e por fim foi realizado teste de comparao de
mdias, Tukey, nvel de 95 % de confiabilidade para verificar a existncia de
diferena entre as trs formulaes de microcpsulas.
A caracterizao fsico-qumica, microbiolgica e sensorial dos queijos
produzidos tambm ocorreu sob o delineamento inteiramente casualizado com
trs repeties e todas as anlises foram realizadas em duplicata e tiveram
calculadas as mdias e os respectivos desvios padro calculadas. Os dados
mdios da composio centesimal do queijo Minas Frescal com microcpsulas de
leo essencial e controle foram comparados, utilizando o teste t ao nvel de 95 %
de probabilidade e os resultados analisados para se verificar a existncia de
diferena significativa entre os tratamentos. Para avaliao dos dados
microbiolgicos em relao ao tempo foram calculadas mdias e desvios padro.
Os resultados obtidos pelo teste de ordenao-preferncia foram analisados pelo
teste de Friedman ao nvel de 5% de probabilidade, utilizando-se a Tabela de
Newel e McFarlane, conforme Minim (2011). Os resultados da aceitao sensorial
foram tabulados e as mdias obtidas foram comparadas, utilizando o teste t ao
nvel de 5 % de probabilidade. Os resultados foram analisados para se verificar a
existncia de diferena significativa entre os tratamentos.
4.1 Extrao do leo essencial de pimenta rosa
A extrao do leo essencial foi realizada no Laboratrio de Operaes
Unitrias do Centro de Cincias Agrrias, da Universidade Federal do Esprito
Santo (UFES), em Alegre, ES.
Os frutos in natura foram fornecidos pela empresa AgroRosa Ltda,
exportadora de pimenta rosa, localizada na cidade de So Mateus, ES. Esses
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frutos foram selecionados e desidratados pela mesma empresa, utilizando
equipamentos eletrnicos, segundo sua densidade e colorao, sendo que frutos
verdes, pretos e de alta densidade foram excludos do processo de secagem. Os
frutos recebidos foram embalados em sacos de polietileno de alta densidade e
armazenados temperatura ambiente, em local seco e arejado at sua utilizao.
O leo essencial de pimenta rosa foi extrado por hidrodestilao, utilizando
um sistema Clevenger. Os frutos foram modos em moinho Cadence (MDR301)
para facilitar a extrao e colocados em balo volumtrico de 2000 mL, na
proporo de 450 g de frutos modos para 1200 mL de gua destilada. A mistura
foi aquecida at ebulio, e aps condensao, o leo separou-se da gua devido
diferena de densidade. Aps trs horas de extrao, o leo foi recolhido do
sistema de Clevenger para um balo de decantao. Com ajuda de uma pipeta de
Pasteur, o leo foi retirado do balo e colocado em tubo de centrifugao. Em
seguida, o leo foi centrifugado a 1500 rpm por 15 minutos utilizando centrfuga
Fanem/Excelsa II e armazenado temperatura de 5 1 C, em frasco mbar
envolto em folha de alumnio.
4.2 Caracterizao do leo essencial de pimenta rosa
O leo essencial foi caracterizado quanto sua composio qumica,
atividade antioxidante e ao antimicrobiana para o microrganismo S. aureus.
4.2.1 Composio qumica
A determinao da composio qumica do leo essencial de pimenta rosa
foi realizada na Central Analtica, do Centro de Cincias Agrrias, da
Universidade Federal do Esprito Santo (UFES), em Alegre, ES.
O leo essencial obtido foi submetido anlise por cromatografia gasosa
acoplada espectrometria de massa (CG-MS), utilizando aparelho modelo QP-
PLUS-2010 (SHIMADZU). A coluna cromatogrfica utilizada foi do tipo capilar de
slica fundida com fase estacionria Rtx-5MS, de 30 m de comprimento e 0,25
mm de dimetro interno. As condies operacionais foram: fluxo de gs de arraste
(He) de 1 mL.min-, temperatura do injetor e do detector de 220 C e 300 C
respectivamente. A temperatura inicial da coluna foi 60 C aumentando de 2 C
-
21
por minuto at 240 C, permanecendo constante por 30 minutos. Injetou-se 1 L
de cada amostra preparada a partir de 10 L de leo essencial de pimenta rosa,
diludo em 1 mL de hexano (ADAMS, 2007).
A identificao dos compostos foi realizada por comparao dos espectros
de massa obtidos experimentalmente com o banco espectral Wiley, 7 Edio ou
por comparaes dos espectros de massas obtidos com os existentes na
biblioteca NIST e tambm pelo ndice de reteno relativo (ADAMS, 2007).
A quantificao dos constituintes qumicos do leo essencial foi realizada
por cromatografia em fase gasosa em equipamento SHIMADZU GC-2010 Plus,
equipado com detector de ionizao de chama (CG-DIC) de acordo com mtodos
descritos por PINHEIRO et al. (2013) e Rondelli et al. (2012). O gs de arraste
utilizado foi o nitrognio e a coluna capilar Rtx-5MS, 30 m de comprimento e 0,25
mm de dimetro interno. As temperaturas do injetor e do detector foram fixadas
em 240 C e 250 C, respectivamente. Uma quantidade de 10 mg da amostra foi
diluda em diclorometano (1 mL) e injetou-se 1 L da mistura.
4.2.2 Atividade antioxidante
O Laboratrio de Qumica de Alimentos do Centro de Cincias Agrrias, da
Universidade Federal do Esprito Santo (UFES), em Alegre, ES foi utilizado para
determinao da atividade antioxidante do leo essencial de pimenta rosa.
Para o ensaio ABTS foi utilizado o trolox como referncia. Dentre os
mtodos antioxidantes utilizados in vitro, optou-se pelo ensaio ABTS (2,2-
azinobis 3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato), segundo adaptao do mtodo descrito
por Re et al. (1999). A atividade antioxidante do leo essencial foi determinada
pela descolorao do ABTS, medindo a reduo do ction radical (ABTS+) como
porcentagem da inibio da absorbncia a 734 nm.
A diminuio da absorbncia do radical ABTS+ produzido pela oxidao
ABTS pela amostra proporcional concentrao de substncias antioxidantes
presentes, e est representado pelas equaes 2 e 3.
+ 228 + (equao 02)
+ + () + + + (equao 03)
max = 734 nm
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22
Para a determinao da atividade antioxidante do leo essencial de
pimenta rosa foi utilizada uma soluo estoque de ABTS (7 mM). Para o seu
preparo foram necessrios 0,0979 g de ABTS e gua destilada para completar o
volume de balo volumtrico de 25 mL. Em seguida, preparou-se a soluo de
persulfato de potssio (2,45 mM), em que foram utilizados 0,1672 g de persulfato
de potssio e gua destilada completando um balo volumtrico de 250 mL. Para
o preparo do radical misturaram-se 10 mL da soluo estoque de ABTS e 10 mL
de soluo persulfato de potssio, deixando reagir por 16 horas no escuro. A
diluio do radical foi realizada ajustando a sua absorbncia a 0,700; por meio da
adio de lcool absoluto.
Para construo da curva analtica foram utilizadas as concentraes de
200 M, 150 M, 130 M, 110 M, 90 M, 70 M, 50 M, 30 M, 10 M e 0 M da
soluo padro de trolox. Para todas as diluies foi utilizado lcool absoluto.
Em tubos de ensaio coletou-se 0,5 mL da amostra de cada concentrao e
foram adicionados 3,5 mL de radical ABTS, colocando-se para reagir por 6
minutos envoltos de folha de alumnio e no escuro. Aps este tempo foi feita a
leitura em espectrofotmetro a 734 nm. A partir dos valores obtidos construiu-se
uma curva com linha de tendncia linear e observou-se o R2.
Aps ajustar a curva padro, o leo essencial de pimenta rosa foi
adicionado, em balo volumtrico, nos volumes de 0,5 mL; 0,3 mL e 0,1 mL
completando-se o balo para 10 mL de lcool absoluto. Logo em seguida,
transferiu-se 0,5 mL de cada balo para tubos de ensaio e foi adicionado radical
ABTS deixando reagir por 6 minutos, envoltos em folha de alumnio e no escuro.
Aps este tempo, fez-se a leitura em espectrofotmetro a 734 nm e foi analisado
se os valores obtidos estavam dentro dos pontos da curva padro.
Os clculos para determinao da atividade antioxidante foram feitos com
base na equao do grfico da curva padro e na quantidade de leo essencial
utilizada para reduo do radical ABTS em cada amostra, considerando as
diluies realizadas, sendo os valores obtidos expressos em mols de trolox por
mL de leo essencial.
-
23
4.2.3 Atividade antimicrobiana
A determinao da ao antimicrobiana do leo essencial de pimenta rosa
foi realizada no Laboratrio de Microbiologia de Alimentos do Centro de Cincias
Agrrias, da Universidade Federal do Esprito Santo (UFES), em Alegre. Foram
utilizadas cepas de S. aureus provenientes da coleo do mesmo Laboratrio.
A cepa utilizada foi estocada durante toda a realizao do experimento sob
refrigerao (3,0 1,0 C) em meio de cultura de congelamento (para cada 100
mL de gua destilada: 15 mL de glicerol; 0,5 g de peptona bacteriolgica; 0,3 g de
extrato de levedura e 0,5 g de NaCl; pH 7,3 1,0). Para a ativao e utilizao
das cepas, foi transferida uma alquota para tubos de ensaio ou tubos Falcon
contendo caldo infuso crebro e corao (BHI). Foi realizado um repique neste
meio de cultura com incubao a 37,0 C, por 24 horas para ativao da cultura.
Para a padronizao do nmero de clulas utilizou-se mtodo descrito por
Valeriano et. al (2012). As cepas foram inicialmente inoculadas em tubo de ensaio
ou tubo Falcon contendo 7 mL do caldo infuso crebro e corao (BHI)
incubados a 37 C. Em seguida, a partir do BHI, foram realizadas estrias simples
para verificao da morfologia do microrganismo. A cultura foi estriada em placas
contendo PCA e incubada a 37 C por 24 horas. Das colnias formadas na
superfcie do PCA, foi retirada uma alada e transferida para um tubo de ensaio
contendo 7 mL de BHI e incubada a 37 C, at atingir 1 x 108 UFC.mL-1.
Para determinao da atividade antimicrobiana do leo essencial de
pimenta rosa foi utilizado o mtodo de difuso em gar segundo adaptao do
mtodo de Filho (2010). O meio de cultura utilizado foi o Mueller Hinton (MH).
Uma camada do inculo de S. aureus na concentrao 1 x 108 UFC.mL-1 foi
depositada na superfcie das placas com o meio de cultura. Em seguida, 10 L do
leo essencial de pimenta rosa foram transferidos para os discos. Para se
comparar os halos obtidos foi utilizado como controle negativo do crescimento
bacteriano a mistura de antibiticos: sulfato de neomicina, sulfato de paromicina,
cido nalidxico. Para controle positivo utilizou-se gua destilada. As placas foram
incubadas a 37 C, por 24 horas e aps esse perodo, os halos de inibio
formados foram medidos com o auxlio de um paqumetro.
-
24
Para determinar a concentrao inibitria mnima (CIM) foi utilizado o
mtodo de microdiluio em placas de Elisa. Nas placas de Elisa de fundo U
foram depositados na fileira A 100 L de BHI duplo concentrado com 0,1% de
tween 80, 100 L de leo essencial de pimenta rosa e 100 L do inculo diludo
a 106. Na fileira B transferiram-se 100 L da fileira A, 100 L do caldo BHI
concentrao normal com 0,1% de tween 80 e 100 L do inculo, na fileira C
transferiram-se 100 L da fileira B, o caldo BHI de concentrao normal com 0,1%
de tween 80 e 100L do inculo, dessa forma transferindo-se para a fileira
seguinte at a fileira H os mesmos compostos, ou seja, reduziu-se a concentrao
de leo essencial de uma fileira para outra em 50%. Aps completar os poos
com caldo BHI e leo essencial foi adicionado o inculo de S. aureus de forma
que cada poo ficasse com uma concentrao de 5x105 UFC.mL-1. Para leitura do
branco, os poos foram adicionados apenas de meio de cultura e leo essencial.
Foram feitos controles positivos para o crescimento de microrganismo e controles
para verificar a esterilidade dos meios de cultura. As leituras foram feitas em
leitor de Elisa Thermo Scientific, nos intervalos de trinta minutos nas quatro
primeiras leituras, nas 12 seguintes foram feitas de hora em hora. Ao final da
anlise a menor concentrao que apresentou atividade antimicrobiana
observada pela medida de absorbncia foi definida como CIM.
O experimento foi realizado com trs repeties e os resultados expressos
como a mdia e o desvio padro das mdias dos trs valores. A atividade
antibacteriana foi caracterizada pelo comprimento do crescimento bacteriano,
observado pela formao de halo de inibio.
4.3 Microencapsulao do leo essencial de pimenta rosa
Antes da sua utilizao nos queijos, o leo essencial de pimenta rosa foi
microencapsulado segundo adaptao do mtodo descrito por Ascheri; Marquez;
Martucci, (2003) utilizando o mtodo fsico de secagem por spray dryer. Essa
etapa ocorreu no Laboratrio de Operaes Unitrias do Centro de Cincias
Agrrias, da Universidade Federal do Esprito Santo (UFES), em Alegre.
Os materiais escolhidos para utilizao neste experimento foram a goma
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25
arbica, amido modificado e maltodextrina, devido s suas propriedades como
excelentes agentes microencapsulantes de leos essenciais. A soluo do
material de parede (goma arbica, maltodextrina, amido modificado e gua), nas
suas devidas propores (Tabela 1), foi preparada no dia anterior do preparo da
emulso e mantida por 8-12 horas, temperatura ambiente, para assegurar
saturao das molculas dos polmeros. Para o preparo da emulso, o leo
essencial de pimenta rosa foi adicionado progressivamente soluo do material
de parede sob agitao constante (3500 rpm/ 10 minutos) utilizando um
liquidificador Walita RI2044. A emulso foi utilizada como lquido de alimentao
no processo de secagem por pulverizao.
Foram utilizadas trs combinaes de goma arbica; maltodextrina e amido
modificado conforme Tabela 1 abaixo.
Tabela 1: Formulaes utilizadas para microencapsulao.
Ingrediente (%) Fo1 Fo2 Fo3
Goma arbica 10 5
Maltodextrina 10 10 10
Amido modificado - 10 5
leo essencial 5 5 5
gua 75 75 75
Fonte: adaptado Ascheri et al. (2003)
A secagem ocorreu nas seguintes condies: temperatura de entrada do ar
de 175 C, temperatura de sada do ar menor que 60 C e vazo do lquido de
alimentao de 0,8 L/h. A quantidade de leo nas emulses foi de 5%. Foram
realizadas anlises para caracterizao fsico-qumica e morfolgica das
microcpsulas conforme descrito no item abaixo, 4.4.
4.4 Caracterizao fsico-qumica das microcpsulas
Foram realizadas as seguintes anlises nas microcpsulas obtidas:
umidade, atividade de gua, higroscopicidade, microscopia eletrnica de
varredura, difrao de raio x e cor.
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26
4.4.1 Atividade de gua
A atividade de gua (Aw) foi mensurada por meio de leitura direta no
equipamento Labmaster, Novasina, com temperatura controlada de 25 0,5 C.
4.4.2 Umidade
A determinao da umidade das microcpsulas foi realizada pelo mtodo
gravimtrico (perda por dessecao temperatura em 105C, at obteno de
massa constante segundo AOAC, 2005).
4.4.3 Higroscopicidade
A higroscopicidade foi determinada segundo adaptao do mtodo
proposto por Fernandes; Borges; Botrel, 2013. As amostras de p de cada
tratamento (aproximadamente 1 g) foram colocadas em dessecador com uma
soluo saturada de NaCl (75,29% de umidade relativa) a 25 C. Aps uma
semana, as amostras formam pesadas, e a higroscopicidade expressa como g de
umidade absorvida por 100 g de slidos secos (g/100 g).
4.4.4 Microscopia eletrnica de varredura
As anlises de microscopia eletrnica de varredura foram realizadas no
Laboratrio de Microscopia do Departamento de Fsica da Universidade Federal
de Viosa (UFV), em Viosa, MG.
As anlises microscpicas foram conduzidas com algumas modificaes do
mtodo descrito por Binning et al. (1986), citado por Ferreira (2006). Os ps
(microcpsulas) foram fixados em uma fita adesiva dupla-face, montada em bases
com 1 cm dimetro e 1 cm de altura, revestidos com ouro sob vcuo e
examinados no microscpio eletrnico de varredura. O microscpio foi operado a
20 KV e foram feitas ampliaes de 800-20.000 vezes.
4.4.5 Difrao de raios x
As anlises de difrao de raios x foram realizadas no Laboratrio de
Difrao de raios X do Departamento de Fsica da Universidade Federal de
Viosa (UFV), em Viosa, MG.
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Para obter informaes acerca da estrutura (cristalina ou amorfa) das
microcpsulas de leo essencial de pimenta rosa, foi utilizado o difratmetro de
raios X da marca Bruker , modelo D8 Discover , com radiao de cobre a 40 KV,
30 mA, velocidade de varredura de 1/seg sob ngulo 2 variando de 4 a 45.
4.4.6 Cor
Devido importncia da cor para aceitao dos produtos pelos
consumidores foram realizadas anlises de cor nas microcpsulas com auxlio de
um colormetro KONICA MINOLTA (modelo: CM-5) em sistema tridimensional L*,
a* e b*, em que L* indica a luminosidade, que varia do preto (l* = 0) ao branco (l*
= 100), a* consiste no eixo que varia do vermelho ao verde, e b* varia do amarelo
ao azul. Alm disso, foram observados os valores de h (ngulo de tonalidade
cromtica), c* (saturao de cor).
As amostras de cada formulao (Fo1, Fo2 e Fo3) foram devidamente
colocadas em placas de acrlico e levadas porta de reflectncia do colormetro
para leitura. As leituras foram realizadas em duplicata.
4.5 Elaborao do queijo Minas Frescal
A elaborao e a caracterizao fsico-qumica, sensorial e microbiolgica
do queijo Minas Frescal foi realizada nos laboratrios de Tecnologia de Produtos
Agrcolas (TPA), Qumica de Alimentos, Anlise Sensorial e Microbiologia de
Alimentos do Centro de Cincias Agrrias, da Universidade Federal do Esprito
Santo (UFES), em Alegre, ES.
O leite utilizado no processamento foi proveniente da rea experimental do
Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Esprito Santo,
localizado em Rive-Alegre, ES. O leite, ao ser recebido no Laboratrio de
Tecnologia de Produtos Agrcolas (TPA), passou por anlises fsico-qumicas de
determinao da acidez titulvel e pH. Foi coletada uma amostra para realizao
posterior das anlises de protenas, gordura, extrato seco total (EST) e cinzas.
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28
O leite foi ento pasteurizado (65 C por 30 minutos). O queijo foi fabricado
por coagulao enzimtica do leite com adio de cloreto de clcio (0,02% em
relao ao volume de leite), cido ltico (0,04%) e coalho (0,1%).
Os queijos foram salgados aps a dessoragem, antes da enformagem.
Para o queijo adicionado de leo essencial de pimenta rosa microencapsulado, a
adio ocorreu juntamente com o sal. Foi utilizada a concentrao de leo
essencial de pimenta rosa que teve preferncia no teste de ordenao descrito no
item 4.6.1. Na Figura 4 apresentado o fluxograma do processo de fabricao do
queijo.
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29
Figura 4: Fluxograma da fabricao do queijo Minas Frescal com e sem adio de leo essencial de pimenta rosa microencapsulado.
Pasteurizao do leite
Resfriamento
Adio de cido ltico, cloreto de clcio e coalho
Coagulao
Corte da massa
Mexedura
Dessoragem
Queijo teste
Adio de leo essencial microencapsulado e sal
Queijo controle
Adio de sal
Enformagem
Armazenamento sob refrigerao
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30
4.6 Caracterizao do queijo Minas Frescal
4.6.1 Anlises fsico-qumicas
Foram realizadas no leite utilizado no trs processamentos e nos queijos
produzidos anlises de acidez titulvel e pH e composio centesimal para sua
caracterizao.
4.6.1.1 Acidez titulvel e pH
A acidez titulvel foi determinada com a titulao da amostra de leite,
utilizando soluo Dornic (soluo de hidrxido de sdio na concentrao de
0,111N) como titulante, na presena do indicador fenolftalena (soluo se
fenolftalena na concentrao de 1 %). O resultado foi expresso em porcentagem
de cido ltico (AOAC, 2005).
O pH foi medido em pHmetro digital de bancada ION LAB (modelo: pH
B500), segundo metodologia indicada pela AOAC (2005).
4.6.1.2 Composio centesimal do leite e queijo Minas Frescal
Para determinao da composio centesimal do leite utilizado no
processamento dos queijos foram realizadas as anlises de: extrato seco total,
teor de gordura, protena, cinzas e carboidratos.
A anlise de extrato seco total do leite e umidade do queijo Minas Frescal
foram determinadas com a secagem em estufa a 105 C ( 2 C) at massa
constante. Para a anlise do leite, foram utilizados 5 mL da amostra misturado a
10 gramas de areia purificada, e para a anlise do queijo, foram utilizados 5 g da
amostra (AOAC, 2005).
O teor de gordura do leite e dos queijos foi determinado pelo Mtodo de
Gerber, o qual se baseia na digesto total dos componentes orgnicos, exceto a
gordura, por meio da adio de cido sulfrico, lcool isoamlico; utilizando para o
leite butirmetro de leite e para o queijo butirmetro de queijo, com sua posterior
centrifugao. A leitura da camada amarelo-clara, obtida aps a centrifugao, foi
feita dentro da escala graduada dos butirmetros que corresponde porcentagem
de gordura da amostra (AOAC, 2005).
O teor de protena foi determinado segundo o teor de nitrognio total da
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31
amostra, obtido pelo mtodo de Kjeldahl, que se baseia na digesto com cido
sulfrico do nitrognio da amostra, transformando-se em sulfato de amnio, o qual
segue para a etapa de destilao com liberao da amnia. A amnia liberada
fixada em uma soluo cida e, posteriormente, titulada. O valor total de protena
na amostra de leite determinado pela multiplicao da porcentagem de
nitrognio total pelo fator de correo 6,38 (AOAC, 2005).
O teor de cinzas obtido por incinerao foi determinado com a transferncia
de 5g (massa exato) da amostra para um cadinho, previamente aquecido a 550
C (10 C). Em seguida, o cadinho com a amostra seca foi carbonizado em
chapa aquecedora e incinerado em mufla a 550 C (10 C), at que o material se
tornou branco ou cinza claro. O material foi colocado em dessecador por cerca de
20-30 minutos para esfriar e pesado novamente (AOAC, 2005).
A quantificao do teor de carboidratos do leite foi realizada por diferena
de acordo com a seguinte equao: Carboidrato (%) = % Extrato Seco Total (%
Gordura + % Protena + % Cinzas) (AOAC, 2005).
4.6.1.3 Cor
Foram realizadas medidas de cor nos queijos segundo mesmo mtodo
descrito no item 4.4.6. Cada amostra de queijo Minas Frescal controle (CO) e
adicionado de leo essencial de pimenta rosa (OEPR) foi devidamente colocada
em placa de acrlico e levada porta de reflectncia do colormetro para leitura.
As leituras foram realizadas em duplicata para cada processamento. Foram
calculadas as mdias e desvios padro de cada parmetro avaliado.
4.6.1.4 Perfil de textura instrumental (TPA)
O perfil de textura instrumental dos queijos CO e OEPR foi determinado
com auxlio do Analisador de Textura Brookfield (Modelo CT3), segundo
adaptao do mtodo descrito por Maruyama et al., 2006. As anlises foram
realizadas em duplicata no terceiro dia de fabricao. Foi realizado teste de dupla
compresso, utilizando probe cilndrico de acrlico com 25 mm de dimetro,
realizando compresso de 80% da altura inicial. A velocidade empregada no teste
e no pr-teste foi de 2 mm.s-1 e no ps teste de 10 mm.s-1. Os queijos estavam
armazenados sob refrigerao at o momento da anlise. Foram retirados
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32
pedaos com as seguintes dimenses: altura de 3,5 cm; comprimento 2,0 cm e
largura 1,0 cm.
As amostras foram analisadas temperatura ambiente (25 C) e os
parmetros de textura determinados foram: dureza, coesividade, gomosidade e
elasticidade. A coleta dos dados e a construo das curvas de perfil de textura
foram realizadas com auxlio do software Texture Pro CT V 1.4 Build 17.
4.6.2 Anlises microbiolgicas dos queijos
Foi inoculado S. aureus nos queijos objetivando verificar o efeito do leo
essencial em inibir o seu desenvolvimento. As cepas utilizadas foram cultivadas
em caldo infuso de crebro e corao (BHI) e incubadas em B.O.D. a 37 C. Os
estoques foram iniciados a partir das culturas do Laboratrio de Microbiologia de
Alimentos do Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Esprito
Santo (UFES) em caldo BHI e estriadas em gar padro para contagem (PCA).
As clulas foram coletadas por centrifugao a 3000 g por 15 minutos,
lavadas em soluo salina peptonada 0,1% e ressuspensas em soro de leite
drenado durante a produo do queijo. Foi feita uma srie de diluies seriadas
em soro de leite e as bactrias foram adicionadas massa do queijo (contagem
inicial 1x105 UFC.g-1). A massa foi homogeneizada manualmente por 2 minutos e
enformada. Os queijos com aproximadamente 100 g foram para incubadora
B.O.D. a 4 C, em embalagens plsticas esterilizadas. Paralelamente, foi
realizado tratamento controle, sem adio de leo essencial.
Para a contagem de S. aureus, coliformes e fungos e leveduras nos queijos
controle (CO) e adicionado de leo essencial de pimenta rosa microencapsulado
(OEPR) foram coletadas amostras de 11g de cada queijo devidamente
homogeneizados em 99 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Estas amostras
foram devidamente diludas e plaqueadas.
Foi utilizado Petrifilm especfico para contagem de S. aureus; Escherichia
coli e coliformes respectivamente. Para a contagem de fungos e leveduras foi
utilizado o meio de cultura gar batata glicose 2%, acidificado com pH prximo a
3,5, e temperatura de incubao de 25 1 C. Para acidificao foi utilizado cido
tartrico 10%. Foi inoculado 1,0 mL das diluies e adio de gar batata glicose
2% acidificado a pH 3,5.
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33
A contagem de coliformes, Eschericia coli e fungos e leveduras ocorreu no
tempo 0. A contagem de S.aureus ocorreu nos tempos 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 30 dias.
Os resultados foram expressos em UFG.g de queijo.
4.6.3 Anlises sensoriais
4.6.3.1. Teste de ordenao-preferncia
O teste de ordenao foi realizado para verificar a formulao mais
preferida pelos julgadores, a fim de definir a concentrao de leo essencial de
pimenta rosa do queijo Minas Frescal. Foi realizado segundo mtodo descrito por
Carneiro e Minim (2010), no Laboratrio de Anlise Sensorial do Centro de
Cincias Agrrias da Universidade Federal do Esprito Santo, em cabines
individuais temperatura ambiente.
Para o teste de ordenao-prefercia, participaram 73 julgadores no
treinados. Foi apresentada aos julgadores, uma bandeja com uma srie de 4
amostras codificadas com nmeros aleatrios de trs dgitos, de maneira
casualizada e balanceada juntamente com uma ficha de avaliao conforme
Figura 5. Estas amostras tiveram as seguintes concentraes de leo essencial:
0,005; 0,010; 0,015 e 0,020%, denominadas FA, FB, FC e FD, respectivamente.
As amostras foram servidas em cubos de aproximadamente 2 cm de aresta e
colocados em pratos descartveis. Foi solicitado aos julgadores que analisassem
sensorialmente as amostras e as ordenassem de acordo com a sua preferncia,
marcando sua resposta na ficha de avaliao. A amostra mais preferida deveria
receber o nmero 1; 2 para a segunda mais preferida, e assim sucessivamente.
-
34
Figura 4: Ficha para o teste de ordenao-preferncia (adaptao Minim, 2010)
4.6.3.2. TESTE DE ACEITAO
Os queijos produzidos foram submetidos a testes de aceitao sensorial.
Participaram 69 julgadores no treinados que avaliaram os seguintes atributos:
aparncia, sabor, textura e impresso global.
Os testes de aceitao foram realizados segundo metodologia descrita por
Reis e Minim (2010) no Laboratrio de Anlise Sensorial da Universidade Federal
do Esprito Santo, em cabines individuais temperatura ambiente.
As amostras foram servidas individualmente, em cubos de
aproximadamente 2 cm de aresta em pratos descartveis e codificadas com 3
dgitos, sendo servidas as duas amostras de forma aleatria e balanceada entre
os consumidores. Junto com cada amostra foi apresentada uma ficha de
avaliao conforme Figura 06.
A aceitao do queijo foi avaliada por meio de escala hednica de nove (9)
pontos sendo a menor nota 1 (desgostei extremamente), e a maior nota 9 (gostei
extremamente).
-
35
Figura 5: Modelo de Ficha de avaliao utilizada no teste de aceitao sensorial
(adaptao de Minim, 2010)
Juntamente com a aceitao sensorial, foi solicitado aos julgadores que
verificassem a inteno de compra do produto. Foi utilizada escala hednica de
cinco (5) pontos, sendo a menor nota 1 (certamente no compraria) e a maior
nota 5 (certamente compraria).
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36
5 RESULTADOS E DISCUSSO
5.1 Extrao do leo essencial de pimenta rosa
Na Tabela 2, esto apresentados dados mdios de extrao do leo
essencial de pimenta rosa. Todas as extraes foram feitas por um perodo de
trs horas. A partir dos dados de extrao calculou-se a densidade do leo. O
rendimento foi calculado comparando a quantidade de leo essencial de pimenta
rosa extrado da massa de pimenta rosa moda.
Tabela 2: Dados mdios de extrao de leo essencial de pimenta rosa.
Pimenta moda
(g)
Volume leo
(cm3)
Massa do
leo
(g)
Densidade
g/cm3
Rendimento
%
466,67 19,66 19,93 2,47 17,21 1,91 0,87 0,05 4,08 0,39%
Clemente (2006), ao extrair leo essencial de frutos maduros de pimenta
rosa, obteve 4,65% de rendimento em relao matria seca, valor muito
prximo ao encontrado no presente estudo. J nos estudos realizados por Bertoldi
(2006) foram encontrados valores mdios em torno de 7%. Com isso, pode-se
concluir que a composio da pimenta rosa varia, influenciando no rendimento da
extrao do seu leo. Alm disso, o mtodo de extrao tambm pode afetar o
seu rendimento.
5.2 Caracterizao do leo essencial de pimenta rosa
5.2.1 Composio qumica
De todo o leo essencial extrado, devidamente homogeneizado, foi
retirada uma amostra para determinao de sua composio qumica. Na Tabela
3 esto apresentados os dados de composio qumica do leo essencial de
pimenta rosa.
Foram determinados os componentes majoritrios do leo essencial, com
identificao de 95,36 % dos constituintes (Tabela 3). Podemos verificar que o -
careno, um monoterpeno, foi encontrado em maior concentrao. Este composto
-
37
se caracteriza pelo sabor doce, pungente, encontrado no leo essencial
(BERTOLDI, 2006).
Tabela 3: Composio do leo essencial de pimenta rosa
Componente tR % (rea)
-careno 3 12,578 42,49
d-limoneno 13,433 15,37
-felandreno 12,257 14,68
-pireno 9,049 10,29
mirceno 11,737 5,70
acetato de benzila 13,223 1,64
Cariofileno 31,854 1,39
-cardineno 36,331 1,29
-terpinoleno 16,326 1,17
Naftaleno 34,353 0,80
-pireno 10,902 0,55
Total 95,36
tR: Tempo de reteno
A composio qumica do leo essencial depende diretamente da
composio dos frutos utilizados para extrao do leo. Lloyd et al. (1977)
caracterizaram os terpenos dos frutos da aroeira (Schinus terebinthifolius Raddi),
concluindo que os componentes majoritrios so: -pireno, -pinene, sabinene,
careno, felandreno, limoneno cymeno e torpinoleno. Pode-se verificar que estes
componentes tambm foram encontrados no presente estudo. A concentrao de
cada componente pode variar de acordo com a regio, poca do ano, horrio de
coleta dos frutos entre outros fatores.
Clemente (2006), ao avaliar ao caracterizar frutos e leo essencial de
pimenta rosa, verificou que a composio varia de acordo com o estado de
-
38
maturao dos frutos, sendo bastante diferente entre frutos verdes e maduros.
Portanto este outro fator a ser considerado na determinao da composio dos
leos essenciais. Ao determinar a composio do leo essencial de pimenta rosa
Pawlowski et al. (2012) tambm encontraram resultados bastante similar aos
encontrados neste trabalho. Portanto as caractersticas do leo essencial
encontrado neste estudo esto relacionadas com os frutos utilizados neste
experimento, seu estgio de maturao, poca de colheita dos frutos e tempo de
secagem.
A atividade antimicrobiana e antioxidante do leo essencial depende da
sua composio. Ao analisar a atividade antioxidante do leo essencial de
pimenta (Piper nigrum), Baghe et al. (2014) constataram que os componentes
como -cariofileno, limoneno, sabinene, -pinene, 3-careno, -pireno esto
relacionados com o potencial antioxidante deste leo. A presena destes
componentes no leo extrado no presente estudo justifica a avaliao de sua
capacidade antioxidante.
5.2.2 Atividade antioxidante
Para a determinao da atividade antioxidante, foi utilizada diluio de 0,5
mL do leo essencial de pimenta rosa em 10 mL lcool etlico absoluto, e a leitura
foi realizada em duplicata. Na Tabela 4 so apresentados os valores mdios de
mols de trolox por mL de leo essencial das trs repeties, assim como o
des