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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

LAURA LICIA MARCOS DA COSTA

TOXICIDADE ORAL AGUDA E AVALIAÇÃO DOS EFEITOS PRESSÓRICOS

E RENAIS CAUSADOS PELA QUINONA ONCOCALIXONA A ISOLADA DA

Auxemma oncocalyx.

FORTALEZA

2016

1




Auxemma oncocalyx

Dissertação apresentada à Coordenação

do Programa de Pós-Graduação em

Farmacologia do Departamento de

Fisiologia e Farmacologia da Faculdade

de Medicina da Universidade Federal do

Ceará, como requisito parcial para a

obtenção do título de mestre em

Farmacologia.

Orientadora:

Prof. Drª. Helena Serra Azul Monteiro

Co-orientadora:

Prof. Drª. Renata de Sousa Alves

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará

Biblioteca UniversitáriaGerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

C873t Costa, Laura Lícia Marcos da. Toxicidade oral aguda e avaliação dos efeitos pressóricos e renais causados pela quinona oncocalixona Aisolada da Auxemma oncocalyx / Laura Lícia Marcos da Costa. – 2016. 72 f. : il. color.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2016. Orientação: Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro. Coorientação: Profa. Dra. Renata de Sousa Alves.

1. Oncocalixona A. 2. Auxemma oncocalyx. 3. Toxicidade aguda. 4. Pressão arterial. 5. Perfusão renal.I. Título. CDD 615.1

2




Auxemma oncocalyx

Dissertação apresentada à Coordenação

do Programa de Pós-Graduação em

Farmacologia do Departamento de

Fisiologia e Farmacologia da Faculdade

de Medicina da Universidade Federal do

Ceará, como requisito parcial para a

obtenção do título de mestre em

Farmacologia. Área de concentração:

Farmacologia.

Orientadora:

Prof. Drª. Helena Serra Azul Monteiro

Co-orientadora:

Prof. Drª. Renata de Sousa Alves

Aprovada em: ____/____/____

BANCA EXAMINADORA

________________________________________________

Prof.ª Dr.ª Helena Serra Azul Monteiro (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará (UFC)

________________________________________________

Prof.ª Dr.ª Renata de Sousa Alves (Co-orientadora)


________________________________________________

Prof.ª Dr.ª Daniele Macêdo Gaspar


________________________________________________

Prof.ª Dr.ª Alice Maria Costa Martins


3

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Liduina e Manoel, meu namorado Paulo, e aos meus familiares e demais

amigos pelo apoio e incentivo nos momentos mais difíceis.

À Prof.ª Dr.ª Helena Serra Azul Monteiro, pelo meu acolhimento como orientanda, por

todos os conhecimentos compartilhados e confiança em mim depositada para a

realização do projeto.

À minha co-orientadora Prof.ª Dr.ª Renata de Sousa Alves, pelo grande apoio, desde a

graduação, grande incentivadora para meu ingresso no mestrado, e pela contribuição

direta em todos os momentos deste trabalho.

À Prof.ª Dr.ª Otília Deusdênia Loiola Pessoa, que gentilmente cedeu a substância para

realização do estudo e que muito colaborou no exame de qualificação com ideias e

sugestões para aprimoramento da escrita deste trabalho.

À Prof.ª Dr.ª Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista, juntamente à equipe do seu

laboratório, pela colaboração na realização do processamento histológico, leitura e

interpretação das lâminas, bem como pela grande contribuição na avaliação do texto de

qualificação.

Aos professores integrantes da banca de defesa, Prof.ª Dr.ª Daniele Macêdo Gaspar e

Prof.ª Dr.ª Alice Maria Costa Martins, por terem aceitado o convite de prontidão, bem

como por todas as sugestões feitas para a melhoria do trabalho.

A toda a equipe de professores, pós-graduandos, alunos de iniciação científica do

LAFAVET-UFC e agregados, com especial agradecimento aos amigos Pedro,

Adelvane, Natacha, Junior, Alejandra, João Alison, Rafinha, Sílvia Helena, Paloma,

Dayana e Letícia, pela grande ajuda nos experimentos.

À Universidade Federal do Ceará (UFC) e ao Programa de Pós-graduação em

Farmacologia, pela oportunidade da realização do trabalho e pelo suporte prestado.

4

RESUMO

Auxemma oncocalyx, da família Boraginaceae, é uma árvore característica do nordeste

brasileiro conhecida popularmente como "pau branco". A investigação química do

extrato hidroalcóolico do caule da planta permitiu o isolamento de várias quinonas,

dentre elas a oncocalixona A (onco-A). Estudos farmacológicos para esta quinona

apontaram atividade antitumoral, antimitótica, analgésica, antiedematogênica,

antiagregante plaquetária e antidiabética. Contudo, assim como outras substâncias

oriundas do metabolismo secundário de plantas, as quinonas podem causar

consideráveis reações tóxicas. A ausência de dados toxicológicos in vivo da substância e

seu potencial para utilização clínica motivaram a execução deste trabalho, o qual

objetivou investigar a toxicidade aguda in vivo da onco-A e avaliar os efeitos

pressóricos e renais dessa quinona, como possíveis órgãos-alvo de toxicidade. Iniciou-

se com o teste de dose limite estabelecido nos protocolos de nº 420, 423 e 425 da

OECD, de toxicidade oral aguda, com a administração de onco-A 2000 mg/Kg v.o, em

camundongos Swiss fêmeas, para determinação da DL50 e observação quanto a sinais de

toxicidade por 14 dias. Dosagens dos níveis plasmáticos de ureia, creatinina e ácido

úrico foram realizadas, bem como análise histológica dos principais órgãos (coração,

pulmão e rim) após 14 dias. A avaliação dos efeitos da onco-A na pressão arterial média

foi realizada em ratos Wistar machos normotensos anestesiados, submetidos a

concentrações cumulativas da substância (30, 100, 300 e 1000 µg/Kg) i.v. Os níveis

plasmáticos de ureia, creatinina, ácido úrico, TGO, TGP, fosfatase alcalina e CK-Total

foram avaliados nesses animais, além da análise histológica de coração e rins. Para

avaliação da função renal, ratos Wistar machos foram excisados cirurgicamente e

perfundidos com solução de Krebs-Henseleit modificada, em três concentrações de

onco-A (1, 3 e 10 µg/mL). Os dados foram comparados estatisticamente considerando

p<0,05. A onco-A apresentou uma DL50>2000mg/Kg, indicando ser uma substância de

baixa letalidade. A substância reduziu a pressão arterial média de forma significativa

nas duas últimas concentrações (300 e 1000 µg/Kg). O tratamento com onco-A não

alterou os parâmetros bioquímicos avaliados in vivo. Na perfusão de rim isolado, a

onco-A aumentou a Pressão de Perfusão (PP) nas três concentrações estudadas, com

aumento proporcional da Resistência Vascular Renal (RVR). O Ritmo de Filtração

Glomerular (RFG) apresentou diminuição transitória com onco-A 1 µg/mL, aumento no

grupo 3 µg/mL, e redução irreversível com 10 µg/mL. O Fluxo Urinário (FU) aumentou

em todos os grupos estudados, ao passo que os percentuais de transporte tubular total de

sódio (%TNa), cloreto (%TCl-) e potássio (%TK

+) apresentaram-se reduzidos. A

análise histológica dos órgãos coletados nos protocolos realizados evidenciou

significativa toxicidade da substância. Os resultados encontrados mostraram baixa

letalidade da substância em uma exposição aguda, entretanto esta induziu alterações

morfológicas indicativas de dano tecidual, redução da pressão arterial e alterações em

todos os parâmetros funcionais renais, evidenciando o potencial tóxico desta quinona.

Palavras-chaves: Oncocalixona A. Auxemma oncocalyx. Toxicidade aguda. Pressão

arterial. Perfusão renal.

ABSTRACT

ACUTE ORAL TOXICITY AND EVALUATION OF BLOOD PRESSURE AND

RENAL EFFECTS INDUCED BY ONCOCALYXONE A, QUINONE ISOLATED

FROM Auxemma oncocalyx

Auxemma oncocalyx belongs to the Boraginaceae family, which is a characteristic tree

of the Brazil northeastern region and popularly known as "pau branco". The chemical

investigation of hydroalcoholic heartwood extracts resulted in the isolation of several

quinones, including oncocalyxone A (onco-A). Pharmacological studies of this quinone

showed antitumor, antimitotic, analgesic, antiedematogenic, antiplatelet and antidiabetic

activities. However, such as other substances from plant secondary metabolism,

quinones can leads toxic reactions. The absence of in vivo toxicological data and the

possibility of the clinical use led to execution of this study. This study aimed to

investigate the acute toxicity in vivo of onco-A, blood pressure and renal effects of this

quinone as potential target organ for toxicity. The experiments started with limit test,

established in OECD guidelines nº 420, 423 and 425, from acute oral toxicity, when

onco-A 2000 mg/Kg was administered by gavage in female Swiss mice to determine

LD50 and signs of toxicity were observed for 14 days. Biochemical levels of urea,

creatinine and uric acid were mensured, even as histological analysis of the main organs

(heart, lung and kidney) after 14 days. Effects in mean arterial blood pressure was

performed in anesthetized normotensive male Wistar rats, underwent to cumulative

concentrations of the substance (30, 100, 300 and 1000 mg/ Kg) i.v. Plasma levels of

urea, creatinine, uric acid , SGOT, SGPT, alkaline phosphatase and CK-Total were

determined in these animals, even as heart and kidney histopathology. To assessment of

renal fuction, kidneys from male Wistar rats were surgically excised and perfused with

modified Krebs-Henseleit, in three onco-A concentrations (1, 3 and 10 ug / ml). Data

were statistically compared considering P<0.05.Onco-A shown LD50> 2000mg / kg,

indicating low lethality. The substance reduced mean arterial blood pressure

significantly in the last two concentrations. Onco-A treatment didn't affectedthe

biochemical parameters analysed in vivo experiments. Histopathological analysis

showed significative signs of toxicity in all evaluated organs for each performed

protocols. The isolated kidney perfusion showed an increase in perfusion pressure (PP)

in all three onco-A concentrations tested (1, 3 and 10 μg / mL), with a proportional

increase in renal vascular resistance (RVR). Glomerular Filtration Rate (GFR) showed a

transitional decreased in the group 1 μg / mL, increased in 3 μg / mL, and persistent

decrease in 10 μg / mL. Urinary Flow (FU) increased in three concentrations tested,

while percentage of the total tubular transport of sodium (%TNA) chloride (%TCl-) and

potassium (%TK+) showed reduction. The results demonstrate that onco-A has low

lethality on acute exposure, however, promoted many morphological changes

suggesting tecidual damage, hipotension, and modified all parameters assessed in renal

perfusion, proving the toxicity potential of this quinone.

Keywords: Oncocalyxone A. Auxemma oncocalyx. Acute toxicity. Blood pressure.

Renal perfusion.

6

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AINES Anti-inflamatórios não esteroidais

ATC Acute Toxic Classic Method

BALT Tecido Linfóide Associado a Mucosa

BioPPQ Pirroloquinolina quinona

CEPA Comissão de Ética e Pesquisa Animal

CK-Total Creatina quinase toal

DL50 Dose letal média

E.P.M Erro Padrão da Média

ECA Enzima Conversora de Angiotensina

EROs Espécies Reativas de Oxigênio

FDA Food and Drug Administration

FDP Fixed Dose Procedure

FU Fluxo Urinário

GSH Glutationa reduzida

HE Hematoxilina-Eosina

IRA Insuficiência Renal Aguda

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

LACT Laboratório de análises clínicas e Toxicológicas

LAFAVET Laboratório de Farmacologia de Venenos e Toxinas

LAFIPLAM II Laboratório de Análise Fitoquímica de Plantas Medicinais II

LRA Lesão Renal Aguda

MEC Laboratório de Morfologia Experimental e Comparada

MitoQ Mitoquinona Q

OECD Organization for Economic Cooperation and Development

Onco-A Oncocalixona A

PP Pressão de Perfusão

RFG Ritmo de Filtração Glomerular

RVR Resistência Vascular Renal

SNC Sistema Nervoso Central

TEM Transição epitelial-mesenquimal

TGO Transaminase glutâmico-oxalacética

TGP Transaminase glutâmico-pirúvica

7

%T Percentual de Transporte Tubular Total

UDP Up and Down Procedure

UECE Universidade Estadual do Ceará

UFC Universidade Federal do Ceará

UV-Vis Espectroscopia no ultravioleta visível

8

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 10

1.1 Produtos naturais e estudos toxicológicos ....................................................... 10

1.2 Quinonas: classificação e propriedades químicas .......................................... 11

1.2.1 Potencial farmacológico/toxicológico das quinonas ......................................... 12

1.2.2 Oncocalixona A: 1,4-benzoquinona isolada do pau-branco ............................ 13

1.3 Estudos de Toxicidade Oral Aguda ................................................................ 15

1.4 Principais alterações biológicas induzidas por substâncias tóxicas ............... 17

1.4.1 Alterações pressóricas sistêmica ....................................................................... 17

1.4.2 Alterações na fisiologia renal ........................................................................... 19

2 JUSTIFICATIVA ............................................................................................. 22

3 OBJETIVOS ..................................................................................................... 23

3.1 Geral ................................................................................................................. 23

3.2 Específicos ......................................................................................................... 23

4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 24

4. 1 Substâncias utilizadas ....................................................................................... 24

4.1.1 Onco-A .............................................................................................................. 24

4.2 Animais experimentais ..................................................................................... 24

4.3 Desenho experimental ...................................................................................... 25

4.3.1 Toxicidade oral aguda - Teste da dose limite (2000mg/Kg) ............................... 25

4.3.1.1 Protocolo experimental ...................................................................................... 25

4.3.1.2 Dosagens bioquímicas ........................................................................................ 26

4.3.2 Efeitos na Pressão Arterial Média de ratos anestesiados ................................... 26

4.3.2.1 Técnica cirúrgica ................................................................................................ 26

4.3.2.2 Protocolo experimental ....................................................................................... 27

4.3.2.3 Dosagens bioquímicas ......................................................................................... 28

4.3.3 Perfusão de Rim Isolado..................................................................................... 28

4.3.3.1 Sistema utilizado e solução perfusora .................................................................. 28

4.3.3.2 Técnica cirúrgica ................................................................................................ 30

9

4.3.3.3 Protocolo experimental ....................................................................................... 31

4.3.3.4 Dosagens bioquímicas ......................................................................................... 32

4.3.3.5 Determinação dos parâmetros funcionais renais ................................................. 32

4.4 Análise histológica ............................................................................................. 34

4.5 Análise estatística .............................................................................................. 34

5 RESULTADOS ................................................................................................. 35

5.1 Toxicidade Oral Aguda da onco-A ................................................................... 35

5.1.1 Observações experimentais, acompanhamento do peso corporal dos animais e

mensuração da DL50 ...................................................................................................... 35

5.1.2 Avaliação dos níveis séricos de ureia, creatinina e ácido úrico nos

camundongos submetidos ao protocolo de Toxicidade Oral Aguda, após os 14 dias

experimentais ................................................................................................................. 36

5.1.3 Análise histológica .............................................................................................. 38

5.1.3.1 Análise histológica do tecido renal (córtex e medula) .......................................... 38

5.1.3.2 Análise histológica do tecido pulmonar ............................................................... 39

5.1.3.3 Análise histológica do tecido cardíaco ................................................................ 40

5.2 Efeitos da onco-A na pressão arterial média de ratos normotensos

anestesiados ................................................................................................................... 41

5.2.1 Avaliação dos níveis séricos de ureia, creatinina, ácido úrico, TGO, TGP,

fosfatase alcalina e CK-total, após a realização do protocolo de pressão arterial

média .............................................................................................................................. 42

5.2.2 Análise histológica.............................................................................................. 46

5.2.2.1 Análise histológica do tecido cardíaco ................................................................ 46

5.2.2.2 Análise histológica do tecido renal (córtex e medula) .......................................... 47

5.3 Efeitos da onco-A na perfusão de rim isolado de ratos ................................... 48

5.3.1 Análise histológica dos rins perfundidos com onco-A ........................................ 56

6 DISCUSSÃO .................................................................................................... 57

7 CONCLUSÃO .................................................................................................. 65

REFERÊNCIAS .............................................................................................. 66

10

1 INTRODUÇÃO

1.1 Produtos naturais e estudos toxicológicos

Os produtos naturais tem sido considerado, ao longo dos tempos, uma

importante fonte para o desenvolvimento de novos fármacos. Mesmo com as diversas

estratégias e metodologias disponíveis atualmente para a síntese e descoberta de novas

moléculas, a química de produtos naturais ainda representa uma área de sucesso,

historicamente comprovada (VIEGAS JR et al., 2006).

O Brasil, por um dos países com a maior biodiversidade do planeta, não pode

abdicar de sua importância no desenvolvimento e pesquisa de novas substâncias

isoladas ou sintetizadas a partir de produtos naturais (PINTO et al., 2002).

Estima-se que 30% das novas substâncias a serem avaliadas por seu potencial

terapêutico são de origem natural ou foram desenvolvidos por síntese química planejada

a partir de produtos naturais. Neste contexto, cabe destacar plantas, fungos, insetos,

organismos marinhos e bactérias como importantes fontes de substâncias

biologicamente ativas (VEIGA-JUNIOR; MELO, 2008).

Nesta perspectiva, a química dos produtos naturais tem ganhado grande

notoriedade, e se associado à outras áreas da ciência para a descoberta e aplicabilidade

desses compostos. Dentre as áreas de essencial interface se encontra a toxicologia, uma

vez que, uma substância não se exime de efeitos tóxicos por ser de origem natural. Esse

pressuposto tem sido amplamente considerado, principalmente quando se trata de

substâncias com potencial terapêutico, na qual esta avaliação é realizada quanto a

diferentes critérios, para categorização dos riscos de exposição (PUPO; GALLO;

VIEIRA, 2007).

A investigação quanto ao potencial tóxico de substâncias é realizada por meio de

estudos de toxicidade, nos quais podem ser avaliados, dentre outros aspectos: a relação

dose-efeito, estrutura química-efeito e os mecanismos envolvidos no estabelecimento e

desenvolvimento destes efeitos. Esses estudos visam garantir segurança para

terapêutica, o desenvolvimento de estratégias para redução de toxicidade, a exemplo do

melhoramento molecular ou de formulação, bem como alternativas para tratamento e

prevenção desses efeitos (LIMA et al., 2014).

11

1.2 Quinonas: classificação e propriedades químicas

Quinonas são consideradas uma importante classe de produtos naturais, sendo

encontradas abundantemente na natureza em plantas, fungos, bactérias e artrópodes.

Esta classe química representa uma variada família de metabólitos secundários

envolvidos em diversos processos químicos e biológicos, destacando-se como

componentes fundamentais da cadeia de transporte de elétrons e na fotossíntese

(MONKS et al., 1992; ABRAHAM et al., 2011).

Os compostos desta classe se caracterizam estruturalmente pela presença de sub-

estruturas redox acopladas a diversos sistemas cíclicos ou heterocíclicos e radicais

substituintes. Sua classificação depende do tipo de anel quinônico, sendo designadas

benzoquinonas, naftoquinonas, antraquinonas e fenantraquinonas (Figura 1).

Figura 1 - Estrutura química principal do sistema aromático para classificação das

quinonas.

Fonte: SOUSA, 2012.

A atividade biológica das quinonas podem ter influência de sua estrutura química,

como do núcleo quinoide, dos seus substituintes e dos diferentes arranjos isoméricos

(MONKS; JONES, 2002).

As cadeias hidrofóbicas desses compostos permitem sua ligação a membranas

celulares e proteínas, e suas estruturas de anéis conjugados precisam ser reduzidas para

12

se tornarem mais estáveis, funcionando como moléculas aceptoras de elétrons

(MADEO; ZUBAIR; MARIANNE, 2013).

A metabolização das quinonas é catalisada por enzimas redutases e realizadas na

presença de oxigênio molecular, levando a formação de EROs, como o anion radical

superóxido (O2), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (OH-) (MADEO;

ZUBAIR; MARIANNE, 2013).

A produção de EROs pode causar dano celular por meio de reações de alquilação

com lipídeos, proteínas e DNA. Os efeitos citotóxicos destas reações dependem do

indutor químico, da suscetibilidade do tecido exposto e de outros fatores que

influenciam a eletroquímica do ambiente (MADEO; ZUBAIR; MARIANNE, 2013).

1.2.1 Potencial farmacológico/toxicológico das quinonas

A exposição humana a quinonas pode ocorrer através da dieta, do uso de

medicamentos ou pela poluição atmosférica (MONKS; JONES, 2002). Há registros,

desde a antiguidade, de utilização de plantas atualmente conhecidas por conter

compostos quinônicos como corantes e na medicina popular (BAYEN, et al. 2007).

Substâncias contidas em plantas como o rhubarb e aloe tem sido usadas como purgantes

há mais de 4000 anos (BENTLEY; CAMPBELL, 1974).

Ao longo da história, vários outros benefícios medicinais foram acrescidos a esta

classe química, como propriedades antibiótica, antitumoral, antiparasitária,

anticoagulante, dentre outras (ABRAHAM et al., 2011). Assim, o interesse na pesquisa

em isolamento e síntese de novos compostos derivados de quinonas vem ganhando

impacto científico, pelo seu considerável potencial biológico-toxicológico (YAMAGO;

HASHIDUME; YOSHIDA, 2002).

Dentre os fármacos com propriedades anticâncer, as quinonas representam uma

das maiores classes de agentes antitumorais com fortes candidatos para uso clínico

(ASCHE, 2005). Entretanto o grande inconveniente destes compostos, como a maioria

dos quimioterápicos, está relacionado a citotoxicidade não ser direcionada apenas às

células cancerígenas, o que limita o avanço de muitas pesquisas (COSTA-LOTUFO et

al., 2002).

Há ainda quinonas com efeito antioxidante. Um exemplo é a co-enzima Q10 e sua

forma reduzida, o ubiquinol. Essa quinona é o único antioxidante lipídeo-solúvel

sintetizado endogenamente, e atua inibindo a peroxidação lipídica (LITARRU; TIANO,

13

2007). Outras quinonas podem ainda apresentar comportamento dual: pro-oxidante em

concentrações micromolares e anti-oxidante quando em doses sub-micromolares, como

é o caso da MitoQ e plastoquinonas, as quais apresentam ação específica a nível

mitocondrial (SKULACHEV et al., 2009).

Em suma, os compostos dessa classe podem ser tóxicos ou protetores em

diferentes sistemas biológicos. onde vários fatores devem ser considerados em relação a

sua bioatividade, tendo apenas começado a serem explorados (MADATHIL et al.,

2012).

1.2.2 Oncocalixona A: 1,4-benzoquinona isolada do pau-branco

A Auxemma oncocalyx TAUB. pertencente a família Boraginaceae. Conhecida

popularmente como pau branco, a árvore é característica da Caatinga, no nordeste

brasileiro, onde apresenta distribuição mais expressiva no estado do Ceará. A madeira é

comumente usada para fins de construção, devido à sua alta resistência à decomposição.

A casca do caule da árvore tem efeito adstringente e utilizada na medicina

popular para o tratamento de cortes e feridas, sendo esta atividade atribuída a alantoína

presente em quantidades significativas nas cascas da planta (BRAGA, 2001).

Figura 2- A. oncocalyx (Pau-branco).

Fonte: BARRETO et al., 2013.

14

A investigação química dos extratos do cerne do caule de A. oncocalyx resultou

no isolamento de várias quinonas (PESSOA et al., 1993; 1995), sendo o primeiro

componente isolado do extrato etanólico denominado oncocalixona A [rel-8α-Hidroxi-

5-hidroximetil-2-metoxi-8αβ-metil-7, 8, 8, 9-tetrahidro-1,4-antracenadiona],

evidenciado na Figura 3. Esta trata-se de um sólido amorfo de coloração vermelho-

escuro, responsável pela cor do cerne do caule da planta, tendo sido obtida em

quantidades significativas (PESSOA et al., 1995).

Figura 3 - Estrutura química da onco-A.

Fonte: COSTA et al., 2008.

A onco-A é uma 1,4-benzoquinona conjugada a uma dienona e seu anel α,β-

bisdienônico a confere propriedade oxirredutora (MALTA, 2000). Esta propriedade a

possibilita funcionar como um aceptor nucleofílico de proteínas, se ligando a

grupamentos tióis protéicos, conforme evidenciado em experimentos de reação com a

N-acetilcisteína, bem como levar a produção de espécies reativas de oxigênio, a

conferindo propriedade pró-oxidante (COSTA et al., 2012).

Os efeitos biológicos desta quinona tem sido extensivamente estudados, sendo

descritas atividades antiedematogênica e analgésica (FERREIRA et al., 2004),

antidiabética (SIVAGNANAM; KALAIVANAN; RAJAMANICKAM, 2013) e

antiagregante plaquetária (FERREIRA et al., 2008).

Os principais estudos desta substância se destacam na área da oncologia, por esta

apresentar atividade antiproliferativa em linhagens de células tumorais (LEYVA et al.,

2000), no qual a atividade citotóxica está relacionada a dano direto ao DNA e morte

celular por apoptose (SBARDELOTTO, 2013).

Costa-Lotufo et al. (2002) em um estudo de alterações no desenvolvimento do

ouriço do mar, um modelo para detecção de citotoxicidade, teratogenicidade e atividade

15

antineoplásica de novos compostos, encontrou alta toxicidade da onco-A relacionada a

sua atividade antimitótica.

1.3 Estudos de Toxicidade Oral Aguda

Vários são os fatores que podem influenciar no desenvolvimento de toxicidade

por exposição a uma substância. Alguns aspectos dependem do sistema biológico, como

idade, peso corpóreo, gênero, genética, estados nutricionais e patológicos são fatores

decisivos para a intensidade e manifestação dos sinais tóxicos. Outros fatores estão

relacionados a concentração, potência, estado de dispersão das partículas na formulação,

e principalmente à frequência da exposição e via de administração. Também exercem

influência no grau de toxicidade de substâncias, características de solubilidade nos

fluídos orgânicos, afinidade e sensibilidade do tecido ou órgão (MACEDO, 2012).

No que se refere à frequência de exposição ao agente tóxico, os estudos de

toxicidade podem ser classificados em agudo, sub-agudo, sub-crônico e

crônico(PARASURAMAN, 2011).

Estudos de toxicidade aguda avaliam uma única exposição a uma substância e o

aparecimento de alterações biológicas de forma imediata, em até 14 dias após a

exposição (PARASURAMAN, 2011).

Para exposições repetidas à uma substância, utilizam-se os estudos de toxicidade

sub-aguda e sub-crônica, com duração média de até 28 dias e 90 dias, respectivamente

(PARASURAMAN, 2011).

Quanto a toxicidade crônica, o aparecimento de efeitos tóxicos ocorrem após um

longo período de tempo de exposição à substância. Para tanto, os estudos experimentais

de toxicidade crônica tem uma faixa de duração média de 6 a 24 meses


Os testes de toxicidade aguda utilizam em geral três vias de administração: oral,

dérmica e inalatória. A escolha da via de administração depende das características

físicas e químicas da substância teste e da via predominante de exposição por humanos.

A via oral é a mais utilizada para avaliação pré-clinica de novos agentes terapêuticos,

por ser a via mais comumente utilizada para a administração de fármacos


Em geral, os testes de toxicidade oral aguda são realizados com uma única dose

administrada no animal, geralmente roedores, por ser o modelo experimental mais

16

amplamente difundido, sendo recomendado a utilização de fêmeas, em virtude da maior

susceptibilidade a efeitos tóxicos no gênero decorrente de suas alterações hormonais

fisiológicas (HAYES, 2007).

Nestes testes, o efeito da dose da substância administrada é observado quanto à

manifestação de sinais patológicos no animal. Ademais, estes estudos permitem a

investigação da dose letal média tóxica de uma substância (DL50), que é a dose de um

agente tóxico, obtida estatisticamente, capaz de produzir a morte de 50% dos animais de

um grupo experimental (HAYES, 2007). Assim, um agente será tanto mais tóxico,

quanto menor for sua DL 50.

O teste da DL50 foi realizado pela primeira vez em 1927 por Trevan para avaliar

substâncias que seriam utilizadas por seres humanos como a Digitallis e a insulina. Na

década de 70, este teste começou a ser empregado amplamente como base de

comparação e classificação da toxicidade de substâncias, chegando a tornar-se pré-

requisito para a aprovação de novos fármacos, aditivos alimentares, ingredientes,

cosméticos, produtos domésticos, químicos industriais e pesticidas por grandes agências

reguladoras, como o FDA (do inglês " Food and Drugs Administration") (STAMMATI

et al., 2005).

A limitação dos estudos para testes de DL50 nesta época se referia ao alto

número de animais experimentais necessários para a sua realização, o que esbarrava em

questões bioéticas polêmicas (BOTHAM, 2002). Alternativas à esses métodos foram

desenvolvidas e estabelecidos protocolos para a minimização da utilização de animais.

Os atuais protocolos de toxicidade oral aguda compreendem as diretrizes da

Organização para Cooperação Econômica e Desenvolvimento (OECD, do inglês

Organization for Economic Cooperation and Development): diretriz 420 - Teste de

doses fixas (FDP, do inglês "Fixed Dose Procedure") (OECD, 2001), diretriz 423 -

Toxicidade aguda de classe (ATC, do inglês "Acute Toxic Classic Method" ) (OECD,

2001) e a diretriz 425 - Método "Up and Down" (UDP, do inglês "Up and Down

Procedure") (OECD, 2008).

O teste de dose fixa (OECD, 2001) é utilizado para identificar a menor dose que

causa toxicidade evidente. Neste teste são estabelecidas doses fixas de 5, 50, 300 e 2000

mg/Kg, 5 animais por dose, e o animal experimental é observado por 14 dias, quanto a

sua sobrevivência e aparecimento de efeitos tóxicos. Estas doses foram fixadas de forma

que sejam moderadamente tóxicas, e que doses letais sejam evitadas.

17

O método de toxicidade aguda de classe (OECD, 2001) é similar ao anterior,

sendo utilizadas as mesmas doses, entretanto contam com apenas 3 animais por dose,

sendo necessário 2 a 4 doses para a determinação da toxicidade aguda da substância. Da

mesma forma que o FDP, o ATC é utilizado para identificar a menor dose que causa

toxicidade evidente. Desta forma, os testes FDP e ATC determinam apenas a faixa

estimada da DL50, mas não mensuram o valor exato desta.

Quanto ao teste "Up and Down"(OECD, 2008), este é assim dominado por conta

da progressão de doses estabelecidas para o teste. É estabelecido uma dose inicial de

175 mg/Kg e observado o padrão de sobrevivência do animal em 48 h, e a escolha da

dose para o próximo animal é feita com base na sobrevivência ou morte do primeiro, na

qual a dose é aumentada ou diminuída em um fator de 3,2. Este método é o mais

indicado pelas agências reguladoras por utilizar um menor número de animais. bem

como por permitir estimar de forma precisa a DL50.

Nestes protocolos de toxicidade, está também estabelecido a possibilidade de

realização do teste de dose limite, no qual se inicia com a maior dose permitida,

geralmente 2000 mg/Kg, ou excepcionalmente, 5000 mg/Kg. Se o primeiro animal

morre em 48 h, realiza-se o teste principal. Se o animal sobrevive, continua-se com a

mesma dose para o próximo animal, sendo o teste finalizado com a sobrevivência de 3

animais consecutivos na dose limite.

A escolha do método deve ser feita com base do entendimento claro da proposta

e quanto a resposta que se quer ser obtida.

1.4 Principais alterações biológicas induzidas por substâncias tóxicas

1.4.1 Alterações pressóricas sistêmicas

A pressão arterial é de extrema importância para uma avaliação inicial e

estimativa útil do estado cardiovascular (KOEPPEN; STANTON, 2009). Algumas

classes de fármacos atualmente no mercado, como alguns agentes quimioterápicos,

apresentam cardiotoxicidade como efeito adverso, e por vezes, seu uso tem restrição em

pacientes com desordens pressóricas (KALIL FILHO et al., 2011).

A pressão arterial é definida como a força que o fluxo sanguíneo exerce sobre as

paredes dos vasos, sendo determinada diretamente pelo volume sanguíneo e pela

18

complacência arterial, os quais são afetados pelo débito cardíaco (frequência cardíaca x

débito sistólico) e a resistência periférica (KOEPPEN; STANTON, 2009).

O ciclo cardíaco conta com dois extremos na pressão arterial: a pressão arterial

sistólica, e a pressão arterial diastólica, em decorrência de contração e relaxamento

ventricular, respectivamente. A diferença entre a pressão sistólica e a pressão diastólica

é denominada pressão de pulso. Outro parâmetro derivado é a pressão arterial média, a

qual representa a razão entre a área sobre a curva da pressão arterial e a duração do ciclo

cardíaco.

Quando o débito cardíaco se mantém constante, o aumento da resistência

periférica leva ao aumento da pressão arterial média. Quando a complacência arterial é

constante, o aumento da resistência periférica leva a aumentos proporcionais da pressão

sistólica e diastólica, de forma que a pressão de pulso não se altera. Entretanto este

comportamento linear não existe para a complacência arterial. O aumento da pressão

arterial média implica na diminuição da complacência arterial e elevação da pressão de

pulso (KOEPPEN; STANTON, 2009).

Alterações na pressão arterial são frequentemente detectadas durante as

intoxicações agudas. A hipotensão está relacionada à substâncias depressoras do SNC,

bem como em situações de reação anafiláticas, já a hipertensão pode ser resultado do

efeito de substâncias vasoativas diretas ou indiretas (SCHNELLMANN, 2008).

Muitos xenobióticos com ação pro oxidante estão relacionados ao

desenvolvimento de toxicidade sistêmica por dano direto às células musculares lisas da

estrutura vascular, comprometendo a resistência dos vasos, por redução da capacitância

venosa, destruição de capilares teciduais e angiogênese compensatória

(SCHNELLMANN, 2008).

Para a manutenção da pressão em seus níveis fisiológicos o organismo dispõe de

mecanismos regulatórios de curto, médio e longo prazos (MOHRMAN; HELLER,

2011).

A ativação de barorreceptores são reflexos rápidos à variação de pressão. Os

barorreceptores arteriais, receptores de alta pressão, que se localizam no arco aórtico e

seios carotídeos, ao serem estimulados ativam o núcleo do trato solitário, no bulbo,

levam a redução da pressão arterial média através do sistema nervoso autônomo. Outros

receptores periféricos e centrais, assim como os dos centros altos do SNC, como

hipotálamo e córtex atuam sobre os centros medulares cardiovasculares para a regulação

da pressão arterial média (MOHRMAN; HELLER, 2011).

19

Como mecanismo compensatório a médio prazo, nos casos de redução dos

níveis pressóricos tem-se o papel da liberação de renina pelas células justaglomerulares

renais. A renina está relacionada à conversão do angiotensinogênio em angiotensina I, a

qual sofre ação da enzima conversora de angiotensina (ECA) para a formação de

angiotensina II, potente vasoconstrictor que reforça as ações do barorreflexo

(KOEPPEN; STANTON, 2009).

A autorregulação da pressão arterial promovida pelos vasos sanguíneos

compreendem ajustes a longo prazo e ocorrem a nível endotelial, metabólico e

miogênico (CONSTANZO, 2014).

A resposta do endotélio se dá através de substâncias liberadas por este, o óxido

nítrico e outros fatores de relaxamento derivado do endotélio, as quais modulam o

músculo liso vascular, ajustando o tônus vascular de acordo com as mudanças na

pressão arterial, adaptando os vasos sanguíneos às mudanças na demanda de perfusão

deste (MONCADA, 2006).

O controle metabólico é alterado conforme a demanda e /ou necessidade de um

órgão, ou seja, respostas vasodilatadoras ou vasoconstritoras são efetuadas conforme o

catabolismo ou anabolismo dos tecidos corporais. Como exemplos de metabólitos

vasodilatadores produzidos nos tecidos podem ser citados CO2, H+, K

+, lactato e

adenosina (CONSTANZO, 2014).

Por último, tem-se o controle miogênico. Este controle se baseia na propriedade

que o músculo liso vascular tem de se contrair ou relaxar, de acordo com as alterações

na pressão transmural. Esta função é atribuída à células altamente especializadas

contendo canais iônicos e proteínas contráteis e reguladoras. O músculo liso vascular

controla a resistência periférica total, o tônus arterial e venoso, além do fluxo sanguíneo

(CONSTANZO, 2014).

Interferências nesses processos fisiológicos de autoajuste podem decorrer de

efeitos tóxicos ocasionados por fármacos, levando a alterações pressóricas agudas,

redução da eficácia das drogas anti-hipertensivas ou o agravamento de uma hipertensão

preexistente ( SCHNELLMANN, 2008).

1.4.2 Alterações na fisiologia renal

A integridade funcional do sistema renal é vital para a homeostasia do

organismo, uma vez que os rins constituem a principal rota de excreção de metabólitos,

20

regulação do volume de líquido extracelular, composição eletrolítica, manutenção do

equilíbrio ácido-base, síntese e liberação de hormônios, e metabolismo de substâncias

(FERGUSON; VAIDYA; BONVENTRE, 2008).

Os rins, mais especificamente os néfrons, suas unidades morfofuncionais, são

responsáveis por filtrar diariamente cerca de 150-180 litros de plasma circulante,

recebendo aproximadamente 25% do débito cardíaco (BONVENTRE et al., 2011). Este

fato o faz ser um órgão que entra em contato direto com xenobióticos substâncias

químicas ou seus metabólitos carreados pela circulação sistêmica e livremente

filtrados, em quantidades relativamente altas (PERAZELLA, 2009).

Cada segmento do néfron pode ser alvo específico de agentes tóxicos, em

virtude de características anatômicas e funcionais particulares de cada segmento. Dentre

essas particularidades podem ser citadas diferenças quanto ao fluxo sanguíneo,

transporte e acúmulo de substâncias, propriedades físico-químicas do epitélio, sítios de

reatividade celular ou molecular, balanço entre reações de bioativação e detoxificação,

energética celular e mecanismos de reparo celular (SCHNELLMANN, 2008).

Uma das manifestações mais comuns de dano nefrotóxico é a Insuficiência

Renal Aguda (IRA), caracterizada por um abrupto declínio da função renal por redução

da taxa de filtração glomerular (TFG), levando a um aumento dos níveis séricos de

compostos nitrogenados, como ureia e creatinina, e de resíduos de hidrogênio

(SCHNELLMANN, 2008). Há ainda novos marcadores preditores de nefrotoxidade

aguda, como a dosagem de KIM-1 na urina, entretanto ainda com utilização restrita em

estudos pré-clínicos.

Classificada de acordo com a localização da lesão, a IRA pode ser dividida em

pré-renal quando a lesão ocorre em um sistema anterior aos rins; intrarrenal quando

a lesão ocorre no próprio rim, afetando os vasos sanguíneos, glomérulos ou túbulos; e

pós-renal: quando ocorre obstrução do sistema coletor de urina (EATON; POOLER,

2006).

O termo Lesão Renal Aguda (LRA) tem uma abordagem mais ampla, uma vez

que abrange desde pequenas alterações na função renal secundárias ao dano, até

situações que necessitam de terapia de substituição renal. Felizmente, na maior parte

dos casos são danos reversíveis, uma vez que os rins possuem sistemas compensatórios

e de reparo (SCHNELLMANN, 2008).

21

Mecanismos compensatórios são necessários em virtude da perda de massa renal

funcional. Como exemplo pode ser citado o aumento da TFG e do fluxo sanguíneo

glomerular nos néfrons remanescentes não lesados, com proporcional aumento da

reabsorção tubular de água e solutos, para que o equilíbrio seja mantido e a função renal

global permaneça normal até que ocorra a reversão do dano (SCHNELLMANN, 2008).

Associado a esses mecanismos compensatórios, as células dos néfrons lesados

podem sofrer morte celular, por necrose ou apoptose, ou serem subletalmente atingidas

e submetidas a mecanismos de reparo e adaptação.

A perda de néfrons pode resultar em aumentos adaptativos nas pressões e nos

fluxos glomerulares dos néfrons funcionais com vistas ao aumento da TFG de todo o

rim. Essas alterações podem ocasionar ao longo do tempo glomérulo-esclerose focal e

ocasionar atrofia tubular e fibrose intersticial, bem como ocasionar danos mecânicos aos

capilares, afetando sua permeabilidade. (SCHNELLMANN, 2008).

A perda de polaridade celular e integridade da junção oclusiva, causada por dano

direto às proteínas de membrana das células tubulares, gerando o desprendimento de

células viáveis e nãoviáveis no lúmem tubular pode resultar em formação de cálculo e

obstrução tubular.

Quanto aos principais mecanismos de reparo celular, estes estão relacionados

com processos de desdiferenciação, proliferação, migração e diferenciação celular. A

agressão tóxica ao néfron pode induzir desdiferenciação/rediferenciação de células

epiteliais dos túbulos renais e fibroblastos intersticiais, transformando-os em

miofibroblastos, num processo caracterizado por deposição de colágeno intersticial e

recrutamento temporário de macrófagos para regulação da resposta imune e resolução

do dano. Esse processo tem sido denominado transição epitelial-mesenquimal (TEM)

(SCHNELLMANN, 2008; PERAZELLA, REILLY JR, 2015).

Entre os atores de risco que contribuem com a incidência ou severidade da lesão

renal podem ser destacados fatores genéticos e hereditários, idade, depleção de volume

sanguíneo, choque séptico, hipotensão e doença renal preexistente. Uma lesão não

reversível pode levar a necessidade de implantação de terapia dialítica e transplante

renal (ZIMNER-RAPUCH et al., 2013).

Outros fatores também envolvidos no agravamento da lesão renal incluem

inibição ou ativação de fatores de crescimento, aumento da deposição de matriz

extracelular, geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), e acúmulo de lipídios na

membrana (SCHNELLMANN, 2008).

22

2 JUSTIFICATIVA

Estudos de screening toxicológico tem grande importância para o

desenvolvimento de novos fármacos e para a extensão da investigação do potencial

terapêutico para moléculas já existentes (PARASURAMAN, 2011).

Apesar dos avanços de metodologias alternativas in vitro, como cultura de

células, os estudos de toxicidade substâncias em modelo animal ainda não puderam ser

completamente abolidos, tendo em vista a complexidade da resposta um sistema

biológico (VALADARES, 2006).

Compostos da classe química das quinonas apresentam como grande

inconveniente o desenvolvimento de toxicidade, relacionadas a efeitos adversos

sistêmicos e sítio específicos, o que limita o avanço de pesquisas e a restrição de sua

utilização clínica (MONKS; JONES, 2002; ABRAHAM et al., 2011; MADATHIL et

al., 2012; BOLTON et al, 2000).

Neste sentido, as promissoras possibilidades de utilização da onco-A na

terapêutica, o conhecimento sobre a toxicidade das quinonas e a ausência de dados

toxicológicos in vivo para a substância, foram os principais fatores motivadores para a

execução deste trabalho.

23

3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Avaliar toxicidade oral aguda e os efeitos pressóricos e renais da onco-A em modelos

animais in vivo e ex vivo.

3.2 Específicos

Investigar a toxicidade oral aguda da onco-A por meio da determinação da DL50

pelo Teste da dose limite;

Estudar os efeitos da onco-A na pressão arterial média de ratos anestesiados;

Identificar possíveis alterações em parâmetros bioquímicos séricos (ureia,

creatinina, ácido úrico, TGO, TGP, fosfatase alcalina e CK-Total) dos animais

submetidos protocolos de tratamento in vivo com a substância;

Avaliar os efeitos da onco-A sobre os parâmetros funcionais renais em um

modelo ex vivo de perfusão de rim isolado de rato;

Caracterizar as alterações histológicas promovidas pela onco-A nos órgãos

coletados nos protocolos experimentais: rins, coração e pulmão.

24

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4. 1 Substâncias utilizadas

4.1.1 Onco-A

A onco-A foi isolada por cromatografia em gel de sílica a partir do extrato

etanólico do cerne do caule da A. oncocalyx coletada em Pentecoste - Ceará (COSTA et

al., 2012). A espécie foi identificada pelo prof. Edson P. Nunes e uma exsicata se

encontra depositada no Herbário Prisco Bezerra do Departamento de Biologia da

Universidade Federal do Ceará (Nº. 18459).

A preparação do extrato, o método de isolamento e a caracterização química

foram descritas por Pessoa et al. (1993, 1995). A estrutura deste composto foi

determinada por meio de técnicas espectrométricas como UV-Vis, infravermelho,

espectometria de massa e combinação de métodos 1D e 2D de ressonância magnética

nuclear.

A substância foi gentilmente cedida pelo Laboratório de Análise Fitoquímica de

Plantas Medicinais II (LAFIPLAM II) sob a supervisão da Profª. Dra. Otília Deusdênia

Loiola Pessoa, para investigação farmacológica.

4.2 Animais experimentais

Todos os nossos experimentos foram realizados de acordo com as

recomendações do Comitê de Ética em Pesquisa com Animais (CEPA) da Universidade

Federal do Ceará, sob o número 32/15.

Foram utilizados ratos Wistar machos para os experimentos de pressão arterial

média e perfusão renal, enquanto que para o teste de toxicidade oral aguda foram

utilizados camundongos Swiss fêmeas, ambos provenientes do Biotério do

Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC. Os animais foram acondicionados

em caixa de polipropileno, mantidos em ambiente com temperatura controlada de

22±2°C, luminosidade (ciclo claro/escuro 12/12 horas), umidade e circulação de ar

controlados, acesso a ração padrão e água “ad libitum”, com jejum prévio de 8h para

ratos e 2h para camundongos antes do inicio dos protocolos experimentais.

25

4.3 Desenho experimental

Inicialmente foi realizado o teste de toxicidade oral aguda para estimação da

DL50 e identificação de órgãos-alvo, segundo o teste da Dose Limite descrita nos

protocolos de de Toxicidade oral aguda nº 420, 423 e 425 da OECD. Para avaliação da

atividade pressórica in vivo da substância, foram realizados experimentos de pressão

arterial média em ratos anestesiados, com a administração de onco-A in bolus por via

intravenosa, em concentrações cumulativas da substância. Os ensaios in vivo contaram

com análise bioquímica de plasma e histopatologia dos principais órgãos. Para a

avaliação dos efeitos renais, foram realizados experimentos de perfusão de rim isolado

de rato, a fim de avaliar possíveis alterações nos parâmetros funcionais renais após a

adição da substância no sistema de perfusão ex vivo. Para todos os experimentos, os

grupos experimentais tratados com onco-A foram comparados a um grupo controle não

tratado. As concentrações utilizadas obedeceram a intervalos de meia escala logarítmica

e foram estabelecidas com base em dados da literatura de estudos com substâncias

isoladas (SILVA NETO, 2012; OECD, 2008).

4.3.1 Toxicidade oral aguda - Teste da dose limite (2000mg/Kg)

4.3.1.1 Protocolo experimental

Para a realização do Teste da Dose Limite (2000mg/Kg) foram utilizados

camundongos swiss fêmeas, pesando entre 20 a 25g, submetidos a um jejum prévio de

2h.

A onco-A foi administrada na dose de 2000mg/Kg por uma cânula de gavagem

em um volume de 2mL/Kg. Com a sobrevivência do primeiro animal em 48h, esta dose

foi repetida em três animais consecutivos. A interpretação realizada para o teste é que a

DL50 será maior que 2000mg/Kg se três animais ou mais sobrevivem. Se três animais

morrem, é realizado o teste principal.

Após a administração de cada dose, os animais foram observados por 15, 30 e 60

minutos bem como após 24 horas e diariamente por um total de 14 dias, quanto a

presença de sinais indicativos de toxicidade, como alterações físicas ou

comportamentais que pudesse sugerir que os animais apresentavam um quadro de dor

ou estresse.

26

A variação de peso corporal foi registrada. Ao final do experimento os animais

sobreviventes foram anestesiados com cetamina (100mg/Kg) e xilasina (10mg/Kg) para

coleta de sangue venoso para posteriores análises bioquímicas; bem como a retirada dos

órgãos (rim, coração e pulmão) para análise histológica.

4.3.1.2 Dosagens bioquímicas

Em decorrência de limitações quanto ao volume de plasma de camundongos,

foram realizadas apenas as dosagens de três parâmetros bioquímicos (ureia, creatinina e

ácido úrico). As dosagens foram realizadas no Laboratório de Análises Clínicas e

Toxicológicas (LACT) da Instituição, com kits de reagentes da marca Bioclin, em

equipamento Mindray BS120.

4.3.2 Efeitos na Pressão Arterial Média de ratos anestesiados

4.3.2.1 Técnica cirúrgica

Ratos Wistar machos, pesando entre 250-300 g, foram submetidos a um jejum

prévio de 8h e anestesiados com cetamina (100mg/Kg) e xilazina (10mg/Kg) para a

realização do procedimento cirúrgico.

O primeiro passo do procedimento consistiu na traqueostomia, na qual a traqueia

foi isolada e uma curta cânula de polietileno (PE 120) inserida, permitindo um fluxo

respiratório espontâneo e evitando a fácil aspiração de eventuais secreções brônquicas.

Após a traqueostomia, um cateter de polietileno (PE10 conectado a PE50)

preenchido com heparina (500 UI.mL-1

em salina) foi implantado na aorta abdominal

para registro da Pressão Arterial Média. Outro também preenchido com heparina (500

UI.mL-1

em salina) foi implantado na veia cava inferior (para administração de drogas),

ambos 1 cm abaixo da artéria renal, conforme técnica descrita previamente (LAHLOU

et al., 1999; SIQUEIRA, 2005), ilustrada na Figura 4.

O cateter aórtico foi então acoplado a um transdutor de pressão piezo-elétrico

(Braile BXSN) que é acoplado a um sistema de amplificação de sinal com interface

USB (DATAQ DI-148U), utilizando o software de aquisição de dados WinDaq/Lite

para o cálculo direto da pressão arterial média.

27

Figura 4 - (A) Traqueostomia. (B) Localização anatômica da artéria e veia femural e

posicionamento dos cateteres arterial (vermelho) e venoso (azul).(C) Implantação do

cateter na artéria e veia femural. (D) Registro da pressão arterial média no sistema de

aquisição de dados.

Fonte: Adaptado de Jersepen, Knupp, Northcott (2012).


Após o acoplamento do cateter da aorta abdominal ao sistema foi permitida a

estabilização da pressão arterial média por um período de 15 a 20 minutos, o qual foi

considerado como controle interno, para avaliação da pressão basal do animal, após o

qual se iniciou o período teste.

A onco-A foi injetada manualmente in bolus no volume de 0,1 mL, seguido de

injeção de 0,2 mL de solução salina. Cada animal recebeu uma série crescente de doses

da onco-A (30, 100, 300 e 1000 µg/Kg) através do cateter intravenoso em intervalos de

5 minutos cada, e o curso temporal das alterações de pressão arterial média foi

registrado.

(B) (A)

(C) (D)

28

Após o período experimental foi realizado eutanasia do animal por

exsanguinação e laparotomia transversal e longitudinal para coleta de sangue e órgãos

(coração e rim). O protocolo utilizado encontra-se resumido na Figura 5.

Figura 5 - Representação esquemática do experimento de pressão arterial média.


Alíquotas de sangue venoso foram coletadas para a realização de dosagens

bioquímicas de creatinina, ureia, ácido úrico, TGO (transaminase glutâmico-

oxalacética), TGP (transaminase glutâmico-pirúvica) e creatina quinase (CK-Total). As

dosagens foram realizadas no Laboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas (LACT)

da Instituição, com kits de reagentes da marca Bioclin, em equipamento Mindray

BS120.

4.3.3 Perfusão de Rim Isolado

4.3.3.1 Sistema utilizado e solução perfusora

A técnica da perfusão de rim isolado tem o objetivo de subsidiar um maior

entendimento dos mecanismos de controle da função renal, de modo a avaliá-lo sem a

interferência sistêmica (NIZET, 1975). O sistema utilizado consiste em perfusão com

recirculação em dois subsistemas, inicialmente in situ, e logo em seguida em circuito

fechado para perfusão in vitro, mantidos em temperatura de 37 ºC (FONTELES et al.,

1983; MONTEIRO; FONTELES, 1999).

Este sistema permite a manutenção constante de parâmetros funcionais renais

com utilização de albumina bovina a 6% na solução perfusora.

A solução perfusora empregada nos experimentos de perfusão renal foi a de

Krebs-Henseleit modificada concentrada 20x contendo as seguintes substâncias com

29

suas respectivas concentrações: 114.0 mM de NaCl; 4.96mM de KCl; 1.24 mM de

KH2PO4; 0.5 mM de MgSO4.7H2O; 24.99 mM de NaHCO3; 2.10 mM de CaCl2.2H2O;

3.60 mM de glicose e albumina bovina a 6% peso por volume (FONTELES, 1998). Esta

solução foi dialisada com albumina, com o objetivo de retirar substâncias contaminantes

como piruvatos, citratos e lactatos (HANSON; BALLAR, 1968; COHEN; KOOK;

LITTLE,1977; ROSS, 1978). Após 48 horas de diálise, a solução perfusora foi

acrescida com 0,15g de inulina. O pH da solução foi ainda ajustado entre os valores de

7,3 e 7,4.

As substâncias dialisáveis foram mantidas constantes, com oxigenação adaptada

ao próprio sistema, a qual consiste em mistura carbogênica com 95% de oxigênio e 5%

de CO2. A inulina presente na solução perfusora é utillizada para medida do ritmo de

filtração glomerular.

Figura 6 - Desenho esquemático do sistema de perfusão de rim isolado.

Fonte: Adaptado de LAFAVET-UFC.

30

A calibração do sistema foi realizada antes de cada experimento com uma

solução de cloreto de sódio a 0,9% mantida a 37°C. Foram observados para cada

unidade da bomba de perfusão (1, 2, 3, 4 e 5) a pressão de perfusão (mmHg), o fluxo da

solução no sistema (L/min) e o volume de solução coletado em um minuto (mL/min).

4.3.3.2 Técnica cirúrgica

A técnica cirúrgica utilizada seguiu o método descrito por Balhlmann et al.

(1967), Nishiitsutji-Uwo et al. (1967), Ross (1978) e Fonteles et al. (1983).

Ratos Wistar machos (n=6) pesando entre 250-300g foram anestesiados com

tiopental sódico na dose de 50mg/Kg de peso corporal. A veia femoral foi isolada para a

administração de manitol (100mg/mL – 3 mL independentemente do peso) a fim de

facilitar a visualização e a fixação da cânula ao ureter.

Após assepsia da parede abdominal, procedeu-se a uma laparotomia

longitudinal e transversal no abdome para uma melhor observação das estruturas

anatômicas.

As vísceras foram rebatidas e as gorduras foram divulsionadas para

identificação do ureter, o qual foi dissecado para inserção de uma cânula de polietileno

PE-30. A artéria mesentérica superior, artéria renal e a aorta foram identificadas e

dissecadas. O rim direito foi descapsulado, e o fluxo sanguíneo local da artéria renal e

aorta foram interrompidos para introdução de uma cânula metálica na artéria

mesentérica superior até a artéria renal, onde foi fixada.

Durante o procedimento cirúrgico, uma parte da solução já oxigenada

(40mL) foi desviada para o sistema de perfusão in situ, com o intuito de perfundir o rim

ainda in vivo, evitando qualquer isquemia ao órgão. Logo após, o rim foi transportado

para o sistema de perfusão in vitro, sem a interrupção do fluxo.

31

Figura 7 - (A) Identificação das artérias mesentérica e renal. Rim extirpado com artéria

renal e ureter canulados. (B) Transferência para o sistema de perfusão.

Fonte: LAFAVET – UFC.


Os experimentos foram iniciados após a estabilização e adaptação do órgão às

novas condições. Após os 30 minutos iniciais, considerados como controle interno, foi

adicionada a onco-A à solução perfusora no sistema, em três diferentes concentrações, e

observadas as mudanças nos parâmetros renais até os 120 minutos. Para tal

monitorização, foram registrados a pressão de perfusão e o fluxo de perfusão em

manômetro e fluxômetro, respectivamente, simultaneamente as coletas de amostras de

urina e perfusato de forma intercaladas a cada cinco minutos em um período total de

120 min, conforme esquematizado na Figura 8.

Amostras de urina e perfusato foram congeladas a -20 °C para posterior

dosagem de sódio, potássio, cloreto, inulina e osmolaridade, importantes no cálculo dos

parâmetros da função renal.

(B) (A)

32

Figura 9 - Representação esquemática do experimento de perfusão renal.


Com as amostras de urina e perfusato foram realizadas dosagens de sódio,

potássio e cloreto por meio do dosador de eletrólitos 9180 (Roche, Brasil). A inulina do

perfusato e da urina foi determinada por hidrólise direta, conforme Walser et al. (1955)

e Fonteles et al. (1983), com modificações que reduziram as quantidades de amostras e

reagentes utilizados. A osmolaridade das amostras de urina e perfusato foram medidas

utilizando um osmômetro (Osmômetro de Pressão a Vapor - modelo WESCOR® Vapro

5520).

4.3.3.5 Determinação dos parâmetros funcionais renais

Em posse de todos os dados obtidos, permitiu-se avaliar nos três grupos tratados

com concentrações em escala logarítmica, os efeitos da substância sobre a pressão de

perfusão (PP), resistência vascular renal (RVR), ritmo de filtração glomerular (RFG),

fluxo urinário (FU) e transporte de eletrólitos (Na+, K

+ e Cl

-), frente ao grupo controle.

Os cálculos para os parâmetros funcionais renais estão descritos no Quadro 1.

33

Quadro 1 - Cálculos para determinação dos parâmetros funcionais renais.

1. FU (mL.g-1

. min-1

) = Fluxo urinário

FU = (Peso do volume urinário / Peso do rim esquerdo) x 10

2. PP (mmHg) = Pressão de perfusão. Leitura em manômetro

3. RFG (mL.g-1

.min-1

) = Ritmo de filtração glomerular

RFG = (DOU in / DOP in x FU) sendo DOU in = densidade ótica da inulina na urina e DOP in =

densidade ótica da inulina no perfusato

4. FPR (mL.g-1

.min-1

) = Fluxo de perfusão renal (registrado a cada 10 min/peso do rim/intervalo de

tempo)

5. RVR (mmHg/mL.g-1

.min-1

) = Resistência vascular renal

RVR = PP (mmHg) / FPR

6. FNa+ (μEq.g

-1. min

-1) = Sódio filtrado

FNa+ = RFG x PNa+ (PNa+ = Concentração de sódio no perfusato)

7. ENa+ (μEq.g

-1. min

-1) = Sódio excretado

ENa+ = FU x UNa+ (UNa+ = Concentração de sódio na urina)

8. TNa+ (μEq.g

-1. min

-1) = Sódio transportado

TNa+ = FNa+ - ENa+

9. %TNa+ = Percentual de sódio transportado

%TNa+ = TNa+ x 100 / FNa+

10. FK+ (μEq.g

-1. min

-1) = Potássio filtrado

FK+ = RFG x PK+ (PK+ = concentração de potássio no perfusato)

11. EK+ (μEq.g

-1. min

-1) = Potássio excretado

EK+ = FU x UK+ (UK+ = Concentração de potássio na urina)

12. TK+ (μEq.g

-1. min

-1) = Potássio transportado

TK+ = FK+ - EK+

13.TK+ = Percentual de potássio transportado

%TK+ = TK+ x 100 / FK+

14. TCl- (μEq.g-1

. min-1

) = Cloreto transportado

TCl – = FCl – - ECl –

15. % TCl- = Percentual de cloreto transportado

% TCl – = TCl – x 100 / F TCl –

Fonte: MARTINEZ-MALDONADO; OPVA-STITZER, 1978.

34

4.4 Análise histológica

Após cada protocolo experimental, os órgãos coletados nos experimentos de

toxicidade oral aguda (rins, pulmões e coração), pressão arterial média (coração e rins),

e perfusão renal (rins perfundidos e não perfundidos) foram armazenados inicialmente

em formol tamponado a 10% por 24 h, seguido de armazenamento em álcool 70% até o

posterior exame histológico.

Os fragmentos obtidos foram submetidos ao processamento histológico

convencional: desidratação, diafanização, e, em seguida, cortados em uma espessura de

3-5μm. Foi realizada coloração de hematoxilina-eosina (HE) e as lâminas analisadas

através de um microscópio óptico Nikon Eclipse Ni, Software Nis 4.0.

Todas as lâminas dos órgãos analisados foram confeccionadas e avaliadas pela

Profa. Dra. Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista, no Laboratório de Morfologia

Experimental e Comparada (MEC), da Faculdade de Veterinária da Universidade

Estadual do Ceará.

4.5 Análise estatística

Para análise de dados foi utilizado o software estatístico GraphPad® Prism v6.0.

O nível de significância utilizado foi *p<0,05.

Os resultados dos experimentos de Pressão Arterial Média em ratos anestesiados

foram analisados através dos testes estatísticos (ANOVA e Teste t de Student).

Para as dosagens bioquímicas realizadas nos experimentos de Toxicidade Oral

Aguda e de Pressão arterial média, os resultados foram analisados utilizando Teste t de

Student.

Nos ensaios de perfusão renal, todas as tabelas e gráficos que avaliaram os

parâmetros renais foram estudados de acordo com a variável tempo e os dados

compilados em intervalos de 30min (30, 60, 90 e 120). As diferenças entre os tempos de

um mesmo grupo foram comparadas utilizando teste t de Student. Já as diferenças entre

tempos iguais entre os grupos foram comparadas por Análise de Variância Fator Duplo

(Two-Way ANOVA), seguida de pós-teste de Bonferroni.

35

5 RESULTADOS

5.1 Toxicidade Oral Aguda da onco-A

5.1.1 Observações experimentais, acompanhamento do peso corporal dos animais e

mensuração da DL50

Foi realizado o teste de dose limite estabelecido nos protocolos de nº 420, 423 e

425 da OECD, de toxicidade oral aguda. Onco-A na dose de 2000mg/Kg foi

administrada por gavagem no primeiro animal, e após 48h foi verificado a

sobrevivência deste (Animal 1). Diante deste resultado, foram testados

consecutivamente 3 animais. Os Animais 2 e 3 sobreviveram aos 14 dias da

administração, ao passo que o Animal 4 morreu cerca de 2h e 30 min depois da

gavagem.

Destacando-se que três animais consecutivos sobreviveram no teste da dose

limite, de 2000mg/Kg, estima-se uma DL50 ˃ 2000 mg/Kg (Tabela 1).

Tabela 1 - Dados brutos dos experimentos realizados utilizando o Teste da Dose Limite

(2000mg/Kg)

Nº Animal Morte/Sobrevivência

1 o 2 o 3 o 4 x

* X = morreu, o = sobreviveu

Durante o período de experimentação, foi observado que nas primeiras 24 h todos

os animais tratados com a substância apresentaram urina com a coloração vermelho-

escuro, característica da onco-A, inclusive o animal que morreu.

Conforme descrito no protocolo experimental, as observações foram realizadas

em 15, 30, 60 min e 24h após a administração da substância. Entretanto a morte do

animal 4 foi detectada 2h e 30 min depois, ou seja, após as observações de 60 min, e até

este tempo não havia sido detectada nenhuma alteração comportamental no animal que

indicasse toxicidade. Os animais que sobreviveram não manifestaram nenhuma outra

alteração durante os 14 dias experimentais.

36

Os animais sobreviventes foram acompanhados quanto ao peso corporal durante

os 14 dias de tratamento, conforme evidenciado na Figura 10, apresentando variação

ponderal compatível com o considerado normal para fêmeas de mesma idade: 21g a

26,5g de peso médio para 3,5 e 6 semanas de vida, respectivamente (Biotério FCF-

IQ/USP, 2013).

Quadro 2 - Acompanhamento do peso corporal (g) dos camundongos submetidos ao

teste de toxicidade oral aguda - Teste da Dose Limite (onco-A 2000 mg/Kg)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

18

20

22

24

26

28

30Animal 1

Animal 2

Animal 3

Dias

Pes

o d

os

anim

ais

(g)

5.1.2 Avaliação dos níveis séricos de ureia, creatinina e ácido úrico nos camundongos

submetidos ao protocolo de Toxicidade Oral Aguda, após os 14 dias experimentais

Os níveis plasmáticos de ureia, creatinina e ácido úrico foram avaliados após 14

dias. Conforme se verifica nas Figuras 11, 12 e 13, o tratamento com onco-A não

provocou alterações estatisticamente significativas em nenhum dos parâmetros

avaliados.

Figura 11 - Níveis plasmáticos de ureia em camundongos tratados com onco-A 2000

mg/kg, ou tratados com salina (controle), submetidos ao protocolo de toxicidade oral

aguda. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste t não pareado.

Média do valor de normalidade (mg/dL): 53 ± 2,1 (PINHEIRO et al., 1998).

UREIA

SALINA

ONCO

-A

0

20

40

60

mg

/dL

37

Figura 12 - Níveis plasmáticos de creatinina em camundongos tratados com onco-A

2000 mg/kg, ou tratados com salina (controle), submetidos ao protocolo de toxicidade

oral aguda. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste t não pareado.

Média do valor de normalidade (mg/dL): 1,2 ± 0,08 (PINHEIRO et al., 1998).

CREATININA

SALIN

A

ONCO-A

0.0

0.5

1.0

1.5

mg

/dL

Figura 13 - Níveis plasmáticos de ácido úrico em camundongos tratados com onco-A

2000 mg/kg, ou tratados com salina (controle), submetidos ao protocolo de toxicidade

oral aguda. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste t não pareado.

Média do valor de normalidade (mg/dL): 1,8 ± 0,33 (DINIZ et al., 2006).

ACIDO URICO

SALIN

A

ONCO-A

0

1

2

3

4

mg

/dL

38

5.1.3 Análise histológica

5.1.3.1 Análise histológica do tecido renal (córtex e medula)

Figura 14 - Fotomicrografias das alterações no tecido renal, induzidas pela onco-A

(2000mg/Kg), após 14 dias, nos camundongos submetidos ao teste de toxicidade oral

aguda. Grupo controle sem alterações: córtex (A) e medula (B) normais, objetiva 20x.

Nos animais tratados com onco-A, observou-se: (C) Degeneração glomerular (seta

preta) e degeneração tubular hidrópica, com tumefação das células tubulares (setas

cinzas), objetiva 40x. (D) Atrofia glomerular (seta preta), objetiva 60x. (E) degeneração

tubular hidrópica (seta preta) e depósito de proteína de Tamm-Horsfall na luz tubular

(seta cinza), objetiva 40x. (F) Infiltração gordurosa (seta preta) e infiltrado inflamatório

discreto (seta cinza), objetiva 10x. Coloração HE. Microscópio Nikon Eclipse Nis,

Software Nis 4.0.

.

A B

C D E F

39

5.1.3.2 Análise histológica do tecido pulmonar

Figura 15 - Fotomicrografias das alterações no tecido pulmonar, induzidas pela onco-A


aguda. (A) Grupo controle sem alterações, objetiva 20x. Nos animais tratados com

onco-A, observou-se: (B) Hemorragia discreta (seta branca), infiltrado inflamatório(seta

preta) e edema (seta cinza), nos álveolos pulmonares, objetiva 40x (C) Destaque para a

hemorragia intra-alveolar (setas pretas), objetiva 60x. (D) Hiperplasia do tecido linfóide

associado aos brônquios (BALT) (setas pretas), objetiva 10x. (E) Vaso congesto (seta

branca), hemorragia (seta preta) e atelectasia alveolar (seta cinza), objetiva 20x.

Coloração HE. Microscópio Nikon Eclipse Nis, Software Nis 4.0.

A

a

B

C D

E

40

5.1.3.3 Análise histológica do tecido cardíaco

Figura 16 - Fotomicrografias das alterações no tecido cardíaco, induzidas pela onco-A


aguda. (A) Grupo controle sem alterações, objetiva 20x. Nos animais tratados com

onco-A, observou-se: (B) Presença de vasos sanguíneos congestos (seta preta), objetiva

40x (C) Área de necrose mais eosinofílica (setas pretas), objetiva 10x. (D) Área de

necrose, com destaque para as células anucleadas e eosinofílicas (setas pretas), objetiva

40x. (E) Presença de infiltrado inflamatório (seta branca), edema (seta preta) e necrose

(seta cinza), objetiva 20x. (F) Destaque para o infiltrado inflamatório (seta branca),

edema (seta preta) e células necróticas (seta cinza), objetiva 40x. Coloração HE.

Microscópio Nikon Eclipse Nis, Software Nis 4.0.

A B

C D

E F

41

5.2 Efeitos da onco-A na pressão arterial média de ratos normotensos anestesiados

Administrações consecutivas in bolus de doses crescentes de onco-A (30 µg/Kg,

100 µg/Kg, 300 µg/Kg, 1000 µg/Kg,) ocasionaram redução significativa da pressão

arterial média em ratos anestesiados, nas últimas duas doses (300 µg/Kg, 1000 µg/Kg),

em comparação ao grupo controle, tratado com salina, bem como às médias pressóricas

antes do tratamento com onco-A e na dose de 30 µg/Kg, conforme ilustrado na Figura

17.

As médias dos grupos controle (n=6) foram (93,01 ± 8,75; 93,18 ± 8,56; 92,32 ±

9,23; 91,72 ± 9,97; 90,92 ± 10,41) e tratados com onco-A (n=6) nas doses de 30 µg/Kg,

100 µg/Kg, 300 µg/Kg, 1000 µg/Kg, respectivamente: 87,17 ± 11,60; 83,22 ± 12,62;

77,24 ± 15,03; 66,66* ± 22,79; 56,46** ± 26,06 (*p<0,05; **p<0,01)

Figura 17 - Efeitos da administração de onco-A, in bolus, na pressão arterial média de

ratos normotensos anestesiados. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados

por ANOVA e Teste t de Student, com *p < 0,05 e **p<0,01.

0 30 100

300

1000

50

60

70

80

90

100Controle

Onco-A

*

**

Dose (g/Kg)

Pre

ss

ão

Art

eri

al

mé

dia

(m

mg

H)

42

5.2.1 Avaliação dos níveis séricos de ureia, creatinina, ácido úrico, TGO, TGP,

fosfatase alcalina e CK-total, após a realização do protocolo de pressão arterial

média

Os níveis plasmáticos de ureia, creatinina, ácido úrico, TGO (transaminase

glutâmico-oxalacética), TGP (transaminase glutâmico-pirúvica), fosfatase alcalina e

CK-Total (Figuras 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24, respectivamente) foram avaliados após os

experimentos de pressão arterial média, não sendo detectado nenhuma alteração

significativa nestes parâmetros, quando em comparação com o grupo controle (salina)

e/ou com a média do valor de normalidade para a espécie.

Figura 18 - Níveis plasmáticos de ureia em ratos tratados com onco-A administrada in

bolus, ou salina (controle), após os experimentos de pressão arterial média. Dados

expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste t não pareado. Média do valor

de normalidade (mg/dL): 61,7 ± 1,65 (PINHEIRO et al., 1998).

UREIA

SALIN

A

ONCO-A

0

20

40

60

mg

/dL

43

Figura 19 - Níveis plasmáticos de creatinina em ratos tratados com onco-A

administrada in bolus, ou salina (controle), após os experimentos de pressão arterial

média. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste t não pareado com

*p < 0,05 em comparação ao grupo controle (salina). Média do valor de normalidade

(mg/dL): 0,7 ± 0,04 (DINIZ et al., 2006).

CREATININA

SALIN

A

ONCO-A

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

*

mg

/dL

Figura 20 - Níveis plasmáticos de ácido úrico em ratos tratados com onco-A


média. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste t não pareado.

Média do valor de normalidade (mg/dL): 1,6 ± 0,1 (DINIZ et al., 2006).

ACIDO URICO

SALIN

A

ONCO-A

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

mg

/dL

44

Figura 21 - Níveis plasmáticos de TGO (transaminase glutâmico-oxalacética) em ratos

tratados com onco-A administrada in bolus, ou salina (controle), após os experimentos

de pressão arterial média. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste

t não pareado. Média do valor de normalidade (U/L): 78,2 ± 2,62 (DINIZ et al., 2006).

TGO

SALIN

A

ONCO-A

0

50

100

150

U/L

Figura 22 - Níveis plasmáticos de TGP (transaminase glutâmico-pirúvica) em ratos

tratados com onco-A administrada in bolus, ou salina (controle), após os experimentos

de pressão arterial média. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste

t não pareado. Média do valor de normalidade (U/L): 59 ± 4,47 (DINIZ et al., 2006).

TGP

SALIN

A

ONCO-A

0

20

40

60

U/L

45

Figura 23 - Níveis plasmáticos de fosfatase alcalina em ratos tratados com onco-A


média. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste t não pareado.

Média do valor de normalidade (U/L): 166 ± 7,06 (DINIZ et al., 2006).

FOSFATASE ALCALINA

SALIN

A

ONCO-A

0

50

100

150

200

U/L

Figura 24 - Níveis plasmáticos de creatina quinase (CK Total) em ratos tratados com

onco-A administrada in bolus, ou salina (controle), após os experimentos de pressão

arterial média. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste t não

pareado. Média do valor de normalidade (U/L): 571,7 ± 325,8 (HOOPER et al., 2007).

CKTOTAL

SALIN

A

ONCO-A

0

200

400

600

800

U/L

46

5.2.2 Análise histológica

5.2.2.1 Análise histológica do tecido cardíaco

Figura 25 - Fotomicrografias das alterações no tecido cardíaco, induzidas pela onco-A

em ratos submetidos ao protocolo experimental de pressão arterial média. (A) Grupo

controle sem alterações, corte longitudinal e transversal, objetiva 10x. No grupo tratado

com onco-A, observou-se: (B) Presença de hemorragia (seta preta) e infiltrado

inflamatório no pericárdio (setas cinzas), objetiva 20x. (C) Área de necrose (setas

pretas) e infiltrado inflamatório discreto(seta cinza), objetiva 20x. (D) Área de necrose,

com destaque para as células anucleadas das fibras cardíacas (setas pretas), objetiva

40x. (E) Presença de vasos sanguíneos congestos (seta preta) e infiltrado inflamatório

no pericárdio (seta cinza), objetiva 20x. (F) Presença de matriz extracelular e

fibroblastos (seta preta), objetiva 20x. Coloração HE. Microscópio Nikon Eclipse Nis,

Software Nis 4.0.

A

E F

D C

B

47

5.2.2.2 Análise histológica do tecido renal (córtex e medula)

Figura 26 - Fotomicrografias das alterações no tecido renal, induzidas pela onco-A em

ratos submetidos ao protocolo experimental de pressão arterial média. (A) Grupo

controle sem alterações, córtex renal, objetiva 20x. No grupo tratado com onco-A,

observou-se: (B) Degeneração tubular hidrópica tubular (seta cinza) e depósito de

material proteináceo na luz tubular (seta preta), objetiva 40x. (C) Presença de vaso

sanguíneo congesto (seta cinza), edema intersticial (seta preta) e degeneração tubular

(seta branca), objetiva 40x. (D) Infiltrado inflamatório moderado na região

periglomerular (seta preta), objetiva 40x. (E) Fibrose intersticial (seta branca) e

hemorragia (seta preta), objetiva 40x. Coloração HE. Microscópio Nikon Eclipse Nis,

Software Nis 4.0.

A B

C D

E

48

5.3 Efeitos da onco-A na perfusão de rim isolado de rato

Após a administração da onco-A foram observadas alterações na fisiologia renal

nos parâmetros avaliados. Considerou-se como controle interno o tempo 30min do

grupo tratado, por ser um período em que ainda não havia sido administrada a onco-A, e

controle externo o grupo perfundido durante todo protocolo experimental apenas com a

solução de Krebs-Henseleit modificada.

Pode-se observar um aumento na pressão de perfusão (PP) aos 60, 90 e 120min

nos três grupos estudados (onco-A nas concentrações 1 µg/mL, 3µg/mL e 10µg/mL)

quando comparados ao controle interno destes grupos, e aumento significativo para os

tempos 90 e 120min quando comparados ao grupo controle externo (Tabela 2 e Figura

27).

Verifica-se na Tabela 3 e Figura 28 que este aumento da PP foi acompanhado do

aumento significativo da resistência vascular renal (RVR) para o grupo de 1µg/mL nos

tempos 60 e 90min em comparação ao controle interno, e para o tempo de 120min em

relação ao grupo controle externo. No grupo de concentração 3µg/mL não houve

alteração estatisticamente significante neste parâmetro. Entretanto, na concentração de

10µg/mL apresentou-se novamente tendência de aumento, com significância para os

tempos 60, 90 e 120min, quando comparadas ao controle interno do grupo.

Em relação ao fluxo urinário (FU), a onco-A promoveu aumento significativo

deste parâmetro nos três grupos estudados (1 µg /mL, 3µg/mL e 10µg/mL) nos três

tempos avaliados (60, 90 e 120min), quando comparados com o controle interno de

cada grupo. Em comparação ao grupo controle externo, este aumento também mostrou-

se estatisticamente significativo para os grupos perfundidos com onco-A 1g/mL e

3µg/mL, nos tempos 90 e 120min, conforme observa-se na Tabela 4 e Figura 29.

Já o ritmo de filtração glomerular (RFG), Tabela 5 e Figura 30, encontrou-se

reduzido no grupo 1 µg /mL (aos 90min, em comparação com o controle interno),

aumentado no grupo 3 µg/mL (aos 120min, em comparação ao controle interno do

grupo e ao grupo controle externo) e reduzido no grupo 10 µg/mL (aos 60, 90 e 120min

em comparação com o controle interno do grupo).

Por último, os percentuais de transporte tubular total de sódio (%TNa), cloreto

(%TCl-) e potássio (%TK+) apresentaram-se reduzidos nos três grupos estudados (1 µg

/mL, 3µg/mL e 10µg/mL), nos três tempos avaliados (60, 90 e 120min), quando

49

comparados ao controle interno de cada grupo e ao grupo controle externo (Tabelas 6, 7

e 8; Figuras 31, 32 e 33, respectivamente).

Tabela 2 – Pressão de Perfusão (PP) em rim isolado de rato na presença da onco-A

(1μg/mL, 3 μg/mL e 10 μg/mL).

PP (mmHg)

Tempo Controle 1 μg/mL 3 μg/mL 10 μg/mL

30 114,50±2,15 110,50±2,59 115,70±4,07 115,40±1,43

60 116,50±3,27 129,50±4,17* 131,60±5,87* 135,90±2,83*

90 113,40±2,72 145,40±8,16*# 139,40±8,73*# 145,60±1,29*#

120 109,40±2,18 188,20±14,42*# 145,10±9,60*# 147,30±1,36*#

Os dados são expressos em média ± E.P.M. com análise por teste t de Student ou Two-Way ANOVA e

pós-teste de Bonferroni. *P<0,05, comparação entre os diferentes tempos 60, 90 e 120 e o controle

interno do grupo (tempo 30); #P<0,05, comparação com controle externo na mesma faixa de tempo.

Figura 27 – Efeitos promovidos pela onco-A na Pressão de Perfusão (PP) em rim

isolado de rato nas concentrações de 1 μg/mL, 3 μg/mL e 10 μg/mL. *p<0,05,

comparação entre os diferentes tempos 60, 90 e 120 e o controle interno do grupo

(tempo 30); #P<0,05, comparação com controle externo na mesma faixa de tempo.

30 60 90 120

0

50

100

150

200

250Controle

1 g/mL

3 g/mL

10 g/mL*

#

#

## #

* ** * *

*

* *

#

Tempo (min.)

Pre

ss

ão

de

P

erf

us

ão

(mm

Hg

)

50

Tabela 3 – Resistência Vascular Renal (RVR) em rim isolado de rato na presença da

onco-A (1 μg/mL, 3 μg/mL e 10 μg/mL).

RVR (mmHg/mL.g-1.min-1)




Figura 28 – Efeitos promovidos pela onco-A na Resistência Vascular Renal (RVR) em

rim isolado de rato nas concentrações de 1 μg/mL, 3 μg/mL e 10 μg/mL. *P<0,05,



30 60 90 120

0

5

10

15Controle

1 g/mL

3 g/mL

10 g/mL

*

*

**

* *

#

Tempo (min.)

Re

sis

tên

cia

V

as

cu

lar

Re

na

l

(mm

Hg

/mL

.g-1

.min

-1)


30 6,15±0,35 6,30±0,37 6,02±0,55 6,03±0,23

60 6,29±0,35 7,37±0,47* 6,96±0,63 7,08±0,24*

90 6,67±0,42 8,41±0,81* 7,38±0,78 7,58±0,24*

120 6,20±0,31 10,89±1,23*# 7,64±0,77 7,67±0,22*

51

Tabela 4 – Fluxo Urinário (FU) em rim isolado de rato na presença da onco-A (1

μg/mL, 3 μg/mL e 10 μg/mL).

FU (mL.g-1.min-1)


30 0,13±0,009 0,13±0,011 0,13±0,024 0,12±0,009

60 0,13±0,006 0,19±0,031* 0,25±0,055* 0,17±0,009

90 0,14±0,005 0,30±0,064*# 0,37±0,070*

# 0,18±0,008*

120 0,14±0,008 0,46±0,090*# 0,51±0,097*

# 0,19±0,010*




Figura 29 – Efeitos promovidos pela onco-A no Fluxo Urinário (FU) em rim isolado de

rato nas concentrações de 1 μg/mL, 3 μg/mL e 10 μg/mL. *P<0,05, comparação entre os

diferentes tempos 60, 90 e 120 e o controle interno do grupo (tempo 30); #P<0,05,

comparação com controle externo na mesma faixa de tempo.

30 60 90 120

0.0

0.2

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0.6

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3 g/mL

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52

Tabela 5 – Ritmo de Filtração Glomerular (RFG) em rim isolado de rato na presença da

onco-A (1 μg/mL, 3 μg/mL e 10 μg/mL).

RFG (mL.g-1.min-1)


30 0,56±0,02 0,65±0,07 0,60±0,09 0,73±0,04

60 0,59±0,02 0,39±0,04* 0,60±0,13 0,40±0,02*

90 0,58±0,02 0,53±0,09 0,86±0,16 0,41±0,03*

120 0,60±0,04 0,86±0,19 1,13±0,20*# 0,48±0,03*




Figura 30 – Efeitos promovidos pela onco-A no Ritmo de Filtração Glomerular (RFG)

em rim isolado de rato nas concentrações de 1 μg/mL, 3 μg/mL e 10 μg/mL. *P<0,05,



30 60 90 120

0.0

0.5

1.0

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1 g/mL

3 g/mL

10 g/mL

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Tempo (min.)

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(mL

.g-1

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-1)

53

Tabela 6 – Percentual de Transporte Tubular Total de Sódio (%TNa+) em rim isolado

de rato na presença da onco-A (1 μg/mL, 3 μg/mL e 10 μg/mL).

% TNa+


30 85,41±0,71 87,35±0,62 82,36±1,23 86,45±1,20

60 83,53±0,64 69,43±1,30*# 67,07±1,46*

# 69,19±2,70*

#

90 83,86±0,68 69,31±0,97*# 68,34±3,54*

# 62,53±1,29*

#

120 83,82±0,31 64,94±1,40*# 62,59±2,60*

# 66,23±0,96*

#




Figura 31 – Efeitos promovidos pela onco-A no Percentual de Transporte Tubular

Total de Sódio (%TNa+) em rim isolado de rato nas concentrações de 1 μg/mL, 3 μg/mL

e 10 μg/mL. *P<0,05, comparação entre os diferentes tempos 60, 90 e 120 e o controle

interno do grupo (tempo 30); #P<0,05, comparação com controle externo na mesma

faixa de tempo.

30 60 90 120

0

20

40

60

80

100Controle

1 g/mL

3 g/mL

10 g/mL*

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Tempo (min.)

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54

Tabela 7 – Percentual de Transporte Tubular Total de Cloreto (%TCl-) em rim isolado


% TCl-


30 80,06±0,45 84,30±0,79 80,11±1,14 84,08±1,14

60 81,38±1,08 63,23±1,49 61,89±1,37 60,94±1,10

90 78,45±0,70 63,31±0,81 59,00±1,46 56,52±1,54

120 78,94±0,95 60,03±1,21 56,11±2,91 62,11±1,44





Total de Cloreto (%TCl-) em rim isolado de rato nas concentrações de 1 μg/mL, 3

μg/mL e 10 μg/mL. *P<0,05, comparação entre os diferentes tempos 60, 90 e 120 e o

controle interno do grupo (tempo 30); #P<0,05, comparação com controle externo na

mesma faixa de tempo.

30 60 90 120

0

20

40

60

80

100Controle

1 g/mL

3 g/mL

10 g/mL*

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Tempo (min.)

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55

Tabela 8 – Percentual de Transporte Tubular Total de Potássio (%TK+) em rim isolado


%TK+


30 69,39±2,70 70,77±2,99 59,77±3,71 71,27±2,90

60 68,43±2,37 45,60±4,33 38,30±3,19 40,87±2,43

90 71,89±2,01 51,78±3,96 35,30±3,73 40,72±3,06

120 73,84±1,71 51,85±3,62 36,09±4,36 49,19±2,91





Total de Potássio (%TK+) em rim isolado de rato nas concentrações de 1 μg/mL, 3

μg/mL e 10 μg/mL. *P<0,05, comparação entre os diferentes tempos 60, 90 e 120 e o

controle interno do grupo (tempo 30); #P<0,05, comparação com controle externo na

mesma faixa de tempo.

30 60 90 120

0

20

40

60

80

100Controle

1 g/mL

3 g/mL

10 g/mL

Tempo (min.)

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56

57

6. DISCUSSÃO

Estudos toxicológicos têm a finalidade de assegurar ou refutar a aplicabilidade

clínica de um fármaco para investigação de sua segurança, o que se dá através de testes

para avaliação de efeitos agudos ou crônicos, sistêmicos ou sítio-específicos. O balanço

entre os efeitos terapêuticos e toxicológicos de um composto químico tem grande

relevância quando se pretende investigar a sua aplicabilidade farmacológica

(LANGMAN; KAPUR, 2006).

Com base neste entendimento foi investigada a toxicidade oral aguda da onco-A,

para determinação de sua DL50. No teste da dose limite, a onco-A apresentou uma DL50

> 2000 mg/Kg, em virtude da sobrevivência de três animais seguidos, indicando ser

uma substância de baixa letalidade.

Quanto as observações realizadas durante o período experimental de 14 dias para

os animais sobreviventes, não foram encontradas alterações comportamentais, bem

como mudanças no peso corpóreo, o que poderiam representar sinais visuais de

toxicidade sistêmica.

Sivagnanam, Kalaivanan e Rajamanickam (2013), em um estudo para

investigação da atividade antidiabética da onco-A isolada da planta Prenanthes

sarmantosus, administraram por via oral 200mg/Kg da substância em camundongos não

diabéticos (n=12), de ambos os sexos, comparados ao grupo controle que recebeu

apenas água. Os animais foram observados por 72 h, não havendo mortalidade nem

alterações comportamentais durante o período observado, o que corrobora com os

achados do presente trabalho, embora a dose utilizada tenha sido 10 vezes abaixo da

dose utilizada neste, 2000mg/Kg.

A coloração vermelho-escuro da urina de todos os animais tratados nas primeiras

24 h, cor característica da onco-A, é um indicativo de que a eliminação da substância se

dá por via renal.

A onco-A pertence a classe das quinonas e estas apresentam a capacidade de

reagir com nucleófilos celulares, como grupos sulfidrilas proteicos e não proteicos.

Muitas das reações da glutationa (GSH) envolvem grupos sulfidrilas. A conjugação

desses eletrófilos com a GSH, no processo de formação de tioeter, é geralmente

associada a desintoxicação e excreção. Compostos conjugados com a GSH são

normalmente excretados na urina na forma de conjugados de cisteina ou ácido

mercaptúrico (MONKS et al., 1992).

58

Nakano et al. (2014) em um estudo de toxicidade oral aguda em ratos com o

BioPQQ, pirroloquinolina quinona, um ingrediente de suplementos alimentícios,

observaram fezes com coloração esverdeada em alguns dos animais tratados com

BioPQQ, o que foi atribuído à coloração da substância teste e às suas altas doses nas

formulações.

O tratamento com onco-A não provocou alterações estatisticamente

significativas em nenhum dos parâmetros bioquímicos avaliados nos camundongos

submetidos ao teste de toxicidade oral aguda após o protocolo de 14 dias (ureia,

creatinina e ácido úrico), bem como dos ratos submetidos ao protocolo de pressão

arterial média (ureia, creatinina, ácido úrico, TGO, TGP, fosfatase alcalina e CK-total),

quando comparação com o grupo controle e/ou média dos valores de normalidade para

a espécie.

A creatinina é um conhecido biomarcador de IRC e IRA, estando relacionada à

perda significativa da função renal, e a redução de pelo menos 30% do RFG. Desta

forma, a concentração de creatinina sérica se eleva tardiamente em condições clínicas

de dano renal (KALIL FILHO et al., 2011).

Kramer et al. (2007) em um estudo com um modelo de nefrotoxicidade induzida

por doxorrubicina, quimioterápico de uso clínico pertencente à classe das quinonas, não

encontrou alterações nos níveis de creatinina e ureia séricas após 6 semanas da

administração de 1,75 mg/Kg da substância pela veia caudal, quando comparado com o

grupo controle não tratado. Entretanto, detectou alterações em outros parâmetros

indicativos de nefrotoxicidade que se alteram mais precocemente, como proteinúria e

marcadores de dano tubular (Kin-1 e osteopontina).

Os níveis plasmáticos de ácido úrico não apresentaram alterações

estatisticamente significativas nos grupos tratados com onco-A, entretanto, alguns

animais apresentaram em isolado aumento pronunciado deste parâmetro.

O ácido úrico é o primeiro produto oriundo do metabolismo de ácidos nucleicos,

sendo excretado pelos rins. Os ácidos nucleicos são constituintes do DNA da célula e

metabolizados em situação de lise celular. O dano tecidual promovido por substâncias

citotóxicas pode levar a um aumento dos níveis séricos deste metabólito (CROSS,

2013).

Apesar da ausência de alterações nos parâmetros bioquímicos de função renal

avaliados, o tratamento com onco-A mostrou sinais indicativos de dano glomerular e

59

tubular, bem como a presença de infiltrado inflamatório, na análise histológica do tecido

renal.

Devido ao alto metabolismo basal e ao seu papel no processo de detoxificação

de substâncias, os rins são particularmente sensíveis ao estresse oxidativo induzido por

quinonas. EROs tem grande importância como mediadores da sinalização intracelular,

estando relacionado aos processos de necrose e apoptose, e a perda de função celular,

envolvidos no dano glomerular e tubular (BONVENTRE, 2010).

A nefropatia induzida por algumas quinonas, como a doxorrubina, está

relacionada a fibrose intersticial por toxicidade direta na estrutura glomerular, levando a

alterações na permeabilidade glomerular e ao descolamento focal dos podócitos na

membrana basal glomerular (KRAMER et al., 2009; SCHNELLMANN, 2008).

Em resposta ao dano direto tubular induzido por nefrotoxicantes, as células

epiteliais tubulares sofrem uma rápida perda da integridade do citoesqueleto e de sua

polaridade, caracterizado por dilatação e degeneração celular hidrópica, perda da borda

em escova, bem como processos de necrose ou apoptose (KUMAR; ABBAS.; ASTER,

2010).

O processo de necrose no túbulo proximal está ainda associado aos achados

microscópicos de hemorragia intratubular, nos rins isolados perfundidos, proteína de

Tamm Hoursfall na luz tubular, nos animais submetidos ao teste de toxicidade oral

aguda, e fibrose instersticial, nos protocolos de pressão arterial média e perfusão de rim

isolado.

Mertens et al. (1991), após administração intravenosa de clorohidroquinonas

conjugadas com a glutationa, os compostos DC-[GSyl]HQ e TC-[GSyl]HQ, em ratos

Sprague-Dawley, nas doses 50-200 μmol/Kg, detectaram necrose tubular de maneira

dose-dependente e que a gama-GT tem um papel importante no metabolismo destes

compostos, onde a inibição desta enzima aumentou a biodisponibilidade renal desses

conjugados e a consequente nefrotoxicidade induzida por estes.

A avaliação histológica do tecido pulmonar após 14 dias também indicou

pronunciados sinais de toxicidade causados pela onco-A, com destaque para a presença

de hemorragia alveolar, infiltrado inflamatório, hiperplasia BALT e atelectasia alveolar.

Estudos com outras quinonas evidenciam o potencial de indução de toxicidade

pulmonar por esta classe química. Kumagai e Taguchi (2007) avaliaram os efeitos

pulmonares in vivo da 9,10-fenantraquinona e da 1,2-naftoquinona, presentes em

partículas do processo de exaustão do diesel, por administração intratraqueal em

60

camundongos. Verificou-se inflamação das vias aéreas associada a antígenos, no desafio

antigênico com ovalbumina, evidenciado pela presença de infiltrado inflamatório e

aumento da expressão pulmonar de citocinas diretamente envolvidas no recrutamento de

células inflamatórias.

Jin et. al (2011) identificaram na análise histopatológica do tecido pulmonar de

camundongos CD-1 tratados com dauricina, significante hemorragia e edema alveolar.

Dauricina é um alcalóide isolado das raízes da planta Menispermum dauricum, e ao ser

metabolizada pelas enzimas CYP3A gera intermediários quinonas metídio, altamente

reativos, responsáveis pela toxicidade pulmonar deste alcaloide.

A avaliação histológica do tecido cardíaco, dos animais tratados com onco-A

submetidos aos protocolos de toxicidade oral aguda e pressão arterial média, indicou a

presença de áreas de necrose, infiltrado inflamatório, edema e congestão vascular.

Antraquinonas, como a doxorrubicina, daunorrubicina, e epirrubicina estão

relacionadas ao desenvolvimento de cardiotoxicidade (SIMUNEK et al., 2009). A

patogênese da cardiotoxicidade destas quinonas está relacionada à formação de EROs

(O2- e H2O2), por meio de reações no ciclo redox, bem como a formação de complexos

com proteínas do metabolismo do ferro. A interação com proteínas reguladoras do ferro

(IRP1 e IRP2) potencializa a cardiotoxicidade dependente de EROs, por transformar

espécies reativas relativamente seguras (O2- e H2O2), em outras mais reativas e tóxicas,

como o radical hidroxila (OH-) ou complexos ferro-peróxido, os quais geram dano ao

DNA, proteínas e lipídeos da membrana dos cardiomiócitos, levando a instauração de

um processo de apoptose ou necrose (ICHIKAWA et al., 2014).

Diante da capacidade limitada de regeneração das células cardíacas, estas

alterações podem deflagrar um processo de remodelação ventricular, o que evidencia a

complexidade do dano (KALIL FILHO et al., 2011).

Grande parte da literatura científica sobre a cardiotoxicidade das quinonas se

referem a ocorrência de cardiomiopatia. No entanto, esta é apenas uma das várias

condições que podem comprometer a função cardiovascular. Outros efeitos sobre a

vasculatura e hemodinâmica sistêmica resultam em isquemia ou alterações na pressão

arterial (ADÃO et al., 2013).

Na avaliação dos efeitos pressóricos sistêmicos, verificou-se que a onco-A

promoveu redução na pressão arterial média de ratos normotensos anestesiados.

Estudos realizados com a para-benzoquinona, um metabólito do benzeno,

verificaram que altas doses da substância induziram decréscimo na pressão arterial e

http://www.elsevier.pt/pt/revistas/revista-portuguesa-cardiologia-334/artigo/cardiotoxicidade-associada-a-terapeutica-oncologica-mecanismos-fisiopatologicos-e-S0870255113000334#bib0035

61

morte devido a paralisia no centro medular. Além disso, evidências de dano renal foram

observadas (DEICHMAN & KEPINGLER, 1963).

Gil-Longo e González-Vázquez (2010) ao avaliar os efeitos do ácido gálico,

verificaram que este polifenol sofre autoxidação não enzimática em solução fisiológica

gerando ânions superóxidos, peróxido de hidrogênio (H2O2) e quinonas. Eles

verificaram que altas concentrações da substância (0,1–0,3 mM), adicionadas de forma

cumulativa em anéis de aorta intactos mantidos em solução fisiológica de Krebs,

promoviam vasorrelaxamento independente do endotélio e que esses efeitos estavam

relacionados ao dano em células do aparato contrátil vascular em virtude dos altos

níveis de H2O2 e quinonas.

Por outro lado, a doxorrubicina está relacionada à divergente modulação do tônus

vascular. Wakabayashi e Groschner (2003) verificaram que o tratamento agudo em ratos

com doxorrubicina ocasionou aumento do tônus arterial. Infusão intravenosa de

doxorrubicina aumentou a pressão arterial em ratos e reduziu o fluxo sanguíneo renal.

Esta quinona está associada ao desenvolvimento de cardiomiopatia com redução do

débito cardíaco e elevação da pressão arterial por mecanismo compensatório (WILDT et

al., 1985).

Os estudos in vivo são importantes para compreensão das alterações fisiológicas

ocasionadas após a administração de uma substância-teste. Entretanto, alguns

mecanismos não conseguem ser elucidados adequadamente devido à grande

complexidade de fatores envolvidos em uma resposta fisiológica (LEGOUIS, 2015).

Com base neste pressuposto, para a investigação dos efeitos nefrotóxicos da

onco-A, também foi realizado estudo de órgão isolado para a elucidação das alterações

renais promovidas pela substância, pois este modelo é ideal para compreensão da

fisiologia renal sem a interferência de mecanismos regulatórios sistêmicos.

Apesar da isenção de interferência sistêmica, é importante ressaltar que o rim

isolado perfundido mantém a grande maioria das propriedades relativas a sua

autorregulação. Neste, um aumento da Pressão de Perfusão (PP) é acompanhado por um

proporcional aumento da Resistência Vascular Renal (RVR) e inalteração do fluxo

sanguíneo renal total (EATON; POOLER, 2006).

A PP aumentou nas três concentrações testadas de onco-A. A RVR teve

incremento para os grupos onco-A nas concentrações de 1 μg/mL e 10 μg/mL, e

manteve-se constante no grupo de concentração 3 μg/mL.

62

Os resultados observados de redução da pressão arterial média, e consequente

redução da resistência vascular sistêmica, nos experimentos in vivo, são conflitantes

com o aumento da PP nos experimentos de rim isolado. Isso pode ser explicado, em

parte, pela complexidade do sistema renal, que é controlado por milhares de vias de

sinalização endócrinas, bem como pelo potencial tóxico da onco-A em causar dano

direto ao DNA da célula, levando a diferentes repostas fisiológicas, em diferentes

sistemas (SCHNELLMANN, 2008; COSTA et al., 2012).

A onco-A promoveu acentuada diurese em rim isolado, evidenciada pelo

aumento do FU nas três concentrações testadas. A substância também reduziu os

transportes iônicos de Na+, K

+ e Cl

-.

Os achados histológicos de degeneração hidrópica tubular e edema peritubular

nos rins perfundidos com onco-A, corroboram com esses resultados.

A perda de polaridade das células com borda em escova do túbulo proximal,

leva a uma instabilidade funcional das proteínas transportadoras presentes na membrana

da célula tubular, o que resulta diretamente na redução dos transportes iônicos. A

degeneração hidrópica, verificada nos achados histológicos dos rins perfundidos com

onco-A, é ocasionada em virtude de uma maior retenção de eletrólitos no citoplasma

das células tubulares, por uma diminuição da reabsorção tubular (BONVENTRE, 2010).

A maior retenção de solutos nos túbulos renais explica o aumento do volume

urinário, devido à maior concentração de solutos na urina (KUMAR; ABBAS.; ASTER,

2013).

Um dos parâmetros mais importantes para a avaliação da função renal é o RFG.

Este apresentou-se diminuído transitoriamente nos rins perfundidos com onco-A 1

µg/mL, aumentado no grupo de concentração 3 µg/mL, e redução irreversível com 10

µg/mL de onco-A.

O RFG é determinado pelo clearance de um marcador glomerular. Na prática

clínica, utilizam-se marcadores indiretos como a creatinina e a cistanina C. Na pesquisa

científica pré-clinica, geralmente se opta por um marcador padrão-ouro de filtração

glomerular, a inulina, de uso inviável em humanos. Esta substância não se liga às

proteínas plasmáticas e é livremente filtrada através da parede do capilar glomerular,

passando completamente inerte pelos túbulos renais. Desta forma, a quantidade de

inulina filtrada é exatamente igual à quantidade excretada na urina, na ausência de lesão

renal (KOEPPEN; STANTON, 2009; EATON; POOLER, 2006).

63

A elevada concentração de eletrólitos na porção final dos túbulos distais está

relacionada a uma resposta fisiológica de ativação de um mecanismo de autorregulação

renal na mácula densa, conhecida como feedback túbulo-glomerular.

A ativação da mácula densa leva a liberação de substância vasoativa no aparelho

justaglomerular os quais se supõem ser a adenosina, ATP ou tromboxano causando

vasoconstricção em arteríola aferente, e redução do RFG (CONSTANZO, 2014).

Enzimas da família NADPH oxidase induzem a produção de EROs nos rins em

situações de alta concentração de NaCl na mácula densa (SEDEEK et al., 2013). A

produção de ânion superóxido, por exemplo, estimula esse mecanismo de feedback

túbulo-glomerular, ativando a mácula densa por despolarização, promovida pelas

isoformas Nox 2 e a Nox 4 dessas enzimas.

Nguyen et al. (2013), em um estudo com compostos derivados de quinonas (AA-

861, tBuBHQ, tBuBQ, eduroquinona), detectou que os compostos desta classe podem

induzir a produção de EROs por meio da regulação positiva de enzimas da família

NADPH oxidase, aumentando sua atividade oxidase.

Essas oxidases são expressas na mácula densa de ratos e estão envolvidas na

vasoconstricção de arteríola aferente, diminuindo o RFG. Outro efeito promovido por

essas enzimas é a redução do NO disponível da mácula densa, o que prejudica a

vasodilatação dependente do endotélio, e consequentemente impede o

reestabelecimento do RFG (LIU et al., 2007).

NADPH oxidases também regulam o transporte de eletrólitos em diferentes

segmentos do néfron, incluindo túbulo proximal e ducto coletor. Dentre os mecanismos

de transporte afetados estão a regulação da bomba Na+-K

+-ATPase nas células do

túbulo proximal, o co-transporte Na+- K

+- 2Cl

- no ramo ascendente da alça de henle e o

transporte de K+ no ducto coletor (SEDEEK et al., 2013).

Outro motivo para a diminuição do RFG, identificado na análise histológica dos

rins perfundidos, é deposição de material proteáceo nos túbulos. O aumento na PP pode

explicar o extravasamento de proteína para o espaço urinário e o dano glomerular

observado.

A redução do RFG também pode estar relacionada a liberação de endotelinas

pelo endotélio vascular renal lesado. As endotelinas são secretadas no compartimento

basolateral do endotélio pelas células mesangiais e tubulares renais e suas ações estão

associadas à vasoconstrição das arteríolas aferentes e eferentes, aumentando a RVR e

reduzindo o RFG (ZANATTA et al., 2008).

64

Zappa et al. (2003) observou lesão nos podócitos glomerulares renais de

pacientes oncológicos tratados pela Mitomicina C, alterando a filtração glomerular, a

qual tem papel central na patogênese do dano renal. Cattel (1985) em um experimento

de perfusão renal in vivo com Mitomicina C também detectou dano glomerular, bem

como trombose e necrose na artéria interlobular.

Javaid et al. (2001) em um estudo com nefrose induzida por doxorrubicina (3

mg/Kg i.p.) em ratos, encontrou redução do RFG após 16 semanas do tratamento.

Estudos morfológicos nestes animais revelaram que a maioria dos glomérulos dos ratos

nefróticos estavam desconectados com o segmento tubular, indicando uma potente ação

nefrotóxica da substância, e que a extensão do dano seria diretamente proporcional a

redução do RFG.

Para o grupo onco-A na concentração intermediária (3 μg/mL), o RFG manteve-

se estável nos dois primeiros tempos após a exposição à onco-A (60 e 90 min), e

apresentou aumento no último tempo (120min), divergindo do comportamento

observado nas outras duas concentrações. Este aumento do RFG pode estar relacionado

a ação de outros mecanismos de autorregulação renal, como os envolvidos na tentativa

de minimizar a excreção renal de sódio. Os efeitos da secreção de renina no aparelho

justaglomerular promovendo o aumento da resistência eferente, por meio dos efeitos da

angiotensina II por ação preferencial e arteríola eferente, podem ter levado ao aumento

do RFG, ao reduzir a saída de sangue no glomérulo e aumentar a resistência nos

capilares glomerulares (CONSTANZO, 2014).

Diante do exposto, os efeitos toxicológicos da Onco-A apresentados neste

trabalho representaram o primeiro passo para a elucidação dos mecanismos relacionados

à toxicidade in vivo dessa quinona. Dessa forma, torna-se necessário a continuidade de

ensaios experimentais com esta molécula, agindo por outras frentes metodológicas

complementares, como avaliação do estresse oxidativo, mediadores inflamatórios, e a

avaliação do papel de metabólitos e ativação enzimática para o estabelecimento dos

efeitos tóxicos, tendo em conta sua promissora utilização na terapêutica anticâncer, por

sua importante atividade citotóxica.

65

7 CONCLUSÃO

A onco-A apresentou baixa letalidade em uma exposição aguda a substância,

evidenciada pela mensuração de uma alta DL50 em camundongos. Entretanto, a

substância induziu alterações morfológicas, mostrando evidências de toxicidade

pulmonar, renal e cardíaca. Esta quinona apresentou efeito hipotensor em ratos

normotensos e alterações em todos os parâmetros funcionais renais, em estudo em órgão

isolado, evidenciando seu potencial tóxico, já relatado para outros compostos da mesma

classe química.

66

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