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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA CLÍNICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
Investigação farmacológica dos mecanismos de ação
gastroenteroprotetores do Ácido Centipédico, um diterpeno de
Egletes viscosa Less., em modelos experimentais.
Marjorie Moreira Guedes
FORTALEZA-CE
2010
Marjorie Moreira Guedes
Investigação farmacológica dos mecanismos de ação
gastroenteroprotetores do Ácido Centipédico, um diterpeno de
Egletes viscosa Less., em modelos experimentais.
Tese de doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Ciências Médicas da Universidade
Federal do Ceará como requisito parcial
para obtenção do título de Doutor em
Ciências Médicas.
Orientador: Prof. Dr. Vietla
Satyanarayana Rao.
Co-orientadora: Profa. Dra Fávia
Almeida Santos.
Fortaleza
2010
G958i Guedes, Marjorie Moreira
Investigação farmacológica dos mecanismos de ação
gastroenteroprotetores do ácido centipédico, um diterpeno de
Eglites Viscosa Less., em modelos experimentais / Marjorie
Moreira Guedes. – Fortaleza-Ce, 2010.
190 f. : il. Orientador: Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará.
Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal do Ceará
1. Diterpenos 2. Antioxidantes 3. Gastroenterologia I. Rao,
Vietla Satayanarayana (Orient.) II. Título.
CDD: 615.32
MARJORIE MOREIRA GUEDES
Investigação farmacológica dos mecanismos de ação
gastroenteroprotetores do Ácido Centipédico, um diterpeno de
Egletes viscosa Less., em modelos experimentais.
Esta tese foi submetida como parte dos
requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em Ciências Médicas, outorgado pela Universidade Federal do Ceará, e encontra-se à disposição dos interessados na Biblioteca setorial da referida Universidade.
A citação de qualquer trecho desta tese é permitida, desde que realizada de acordo com as normas da ética científica.
Data da aprovação: 30 de março de 2010.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________
Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao (Orientador) Universidade Federal do Ceará
______________________________________________
Profa. Drª. Glória Isolina Boente Pinto Duarte Universidade Federal do Pernambuco
______________________________________________
Prof. Dr. Domingos Tabajara de Oliveira Martins Universidade Federal do Mato Grosso
______________________________________________
Profa. Drª. Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal Universidade Federal do Ceará
______________________________________________
Profa. Drª. Adriana da Rocha Tomé Universidade Estadual do Ceará
Prepara-se o cavalo para o dia da batalha,
porém do SENHOR vem a vitória.
Provérbios 21:31
A Deus, pelo cuidado e todas as
bênçãos concedidas.
AGRADECIMENTOS
A Jesus por permitir todas as relizaçãos de minha vida.
Ao Professor Vietla Satyanarayana Rao pela confiança em mim depositada,
pela orientação, incentivo e amizade durante a realização deste trabalho, meu
muitíssimo obrigado.
À professora Flávia Santos pela co-orientação e colocações sempre
oportunas.
A todos os meus amigos da Pós-graduação que passaram pelo LPN durante
minha estada por lá, obrigada pela amizade e parceria durante os experimentos.
Ao professor Aldo Ângelo Lima e sua aluna de doutorado Eunice Bobô, pela
colaboração nesse trabalho.
Ao professor Edilberto Rocha Silveira pelo fornecimento da droga usada
nesse trabalho.
A todos os bolsistas do LPN pelo auxílio e amizade.
Às técnicas Nísia, Marta e Anyssa pelo apoio na parte experimental.
Às funcionárias da pós-graduação em Ciências Médicas, Ivone e Rita.
Aos meus familiares que sempre me deram total suporte nos momentos mais
necessários.
Ao meu esposo Sânzio, homem de Deus e companheiro fiel, pelo incentivo
sempre oportuno e à minha filha Alice, recompensa divina diária.
Aos amados irmãos em Cristo pelo fundamental e necessário apoio espiritual.
A Capes e ao INCT, pelo apoio financeiro.
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas Lista de quadro Lista de Tabelas Lista de Figuras RESUMO ABSTRACT 1.INTRODUÇÃO 27 1.1. Fisiologia Gastrintestinal 27 1.1.1. Fisiologia da Secreção e Motilidade Gastrintestinal 28 1.2. Distúrbios gastrintestinais 30 1.2.1. Mecanismos de Defesa da Mucosa Gástrintestinal 37 1.3. Modelos experimentais em gastroenteroproteção 40 1.4. Plantas Medicinais e desordens gastrintestinais 42 1.5. Diterpenos 45 1.6. Egletes viscosa Less. 47 2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS 54 2.1. Justificativa 54 2.2. Objetivos geral e específicos 57 3. MATERIAIS 59 3.1. Material Botânico 59 3.2. Animais Experimentais 59 3.2.1. Aspectos éticos 59 3.3. Drogas e Reagentes 60 3.4. Equipamentos 62 4. MÉTODOS 63 4.1. Obtenção do Ácido Centipédico 63 4.2. Lesão gástrica induzida por etanol 66 4.2.1. Estudo do envolvimento dos neurônios aferentes primários sensíveis à capsaicina na gastroproteção do AC
66
4.2.2. Estudo do envolvimento do óxido nítrico na gastroproteção do AC 67 4.2.3. Estudo do envolvimento das prostaglandinas na gastroproteção do AC
67
4.2.4. Estudo do envolvimento dos canais de potássio ATP-dependentes na gastroproteção do AC
68
4.2.5. Estudo da ação do Ácido Centipédico sobre os grupos sulfidrilas não protéicos (NP-SH)
69
4.2.6. Avaliação da peroxidação lipídica 69 4.2.6.1. Dosagem de malonildealdeído (MDA) 69 4.2.6.2. Dosagem de superóxido dismutase (SOD) 71 4.2.7. Determinação de muco da mucosa gástrica 72 4.3. Lesão gástrica induzida por etanol acidificado 73
4.3.1. Estudo do envolvimento dos receptores opiódes na gastroproteção do AC
73
4.3.2. Estudo do envolvimento dos receptores α2-adrenérgicos na gastroproteção do AC
74
4.4. Atividade anti-secretória gástrica 75 4.5. Esvaziamento gástrico 76 4.6. Avaliação da atividade de AC sobre Helicobacter pylori 77 4.7. Lesão gástrica crônica induzida por Ácido Acético 78 4.8. Lesão intestinal induzida por indometacina em ratos 79 4.8.1. Dosagem de Catalase 80 4.8.2. Dosagem de Mieloperoxidase 80 4.9. Cultura de células epiteliais intestinais (IEC-6) 81 4.9.1. Migração celular em cultura de células intestinais (IEC-6) 81 4.9.2. Proliferação celular em cultura de células intestinais (IEC-6) 82 4.10. Toxicidade aguda 84 4.11. Análise estatística 85 5. RESULTADOS
86
5.1. Obtenção do Ácido Centipédico 86 5.2. Efeito gastroprotetor do Ácido Centipédico na lesão gástrica induzida por etanol em camundongos
87
5.2.1. Efeito gastroprotetor do Ácido Centipédico na lesão gástrica induzida por etanol: papel dos neurônios aferentes primários sensíveis à capsaicina
90
5.2.2. Efeito gastroprotetor do Ácido Centipédico na lesão gástrica induzida por etanol: papel do óxido nítrico
93
5.2.3. Efeito gastroprotetor do Ácido Centipédico na lesão gástrica induzida por etanol: participação das prostaglandinas
96
5.2.4. Efeito gastroprotetor do Ácido Centipédico na lesão gástrica induzida por etanol: papel dos canais de potássio ATP - dependentes
99
5.2.5. Efeito gastroprotetor do Ácido Centipédico na lesão gástrica induzida por etanol: papel dos grupos sulfidrilas não protéicos (NP-SH) gástricos
102
5.2.6.Efeito gastroprotetor do Ácido Centipédico na lesão gástrica induzida por etanol: ação sobre a peroxidação lipídica.
105
5.2.6.1. Dosagem de malonildealdeído (MDA) 105 5.2.6.2. Dosagem de superóxido dismutase (SOD) 108 5.2.7. Efeito gastroprotetor do Ácido Centipédico na lesão gástrica induzida por etanol: ação sobre a produção de muco
111
5.3. Efeito do Ácido Centipédico na úlcera gástrica induzida por etanol acidificado em camundongos
114
5.3.1. Efeito gastroprotetor do Ácido Centipédico na lesão gástrica induzida por etanol: papel dos receptores opioides
117
5.3.2. Efeito gastroprotetor do Ácido Centipédico na lesão gástrica induzida por etanol: papel dos receptores α2-adrenérgicos
120
5.4. Efeito do Ácido Centipédico sobre a secreção gástrica no modelo de ligação do piloro em ratos
123
5.5. Efeito do Ácido Centipédico sobre o esvaziamento gástrico em ratos 127 5.6. Efeito do Ácido Centipédico sobre Helicibacter pylori 130 5.7. Efeito curativo do Ácido Centipédico na lesão gástrica crônica 131
induzida por ácido acético em ratos 5.7.1. Efeito curativo do Ácido Centipédico na lesão gástrica crônica induzida por ácido acético em ratos: achados histológicos
134
5.8. Efeito do Ácido Centipédico sobre úlceras intestinais induzidas por indometacina em ratos.
139
5.8.1. Análise de parâmetros bioquímicos 139 5.8.1.1. Função renal (dosagem de ureia e creatinina) 139 5.8.1.2. Função hepática (dosagem de TGO e TGP) 141 5.8.2. Quantificação das úlceras – Análise Macroscópica 143 5.8.3. Ação sobre a peroxidação lipídica 146 5.8.3.1. Dosagem de malonildialdeido 146 5.8.3.2. Dosagem de catalase 149 5.8.3.3. Dosagem de Mieloperoxidase 152 5.8.3.4. Determinação de grupos sulfidrílicos não-proteicos 155 5.8.4. Efeito do Ácido Centipédico na lesão intestinal induzida por indometacina em ratos: Achados histológicos
158
5.9. Efeito do Ácido Centipédico sozinho ou associado a indometacina sobre a migração celular de células intestinais (IEC-6)
160
5.10. Efeito do Ácido Centipédico sozinho ou associado a indometacina sobre a proliferação celular de células intestinais (IEC-6)
162
5.11. Estudo da toxicidade aguda do Ácido Centipédico. 164 6. DISCUSSÃO 166 7. CONCLUSÕES 197
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 199 9. ANEXO – ARTIGOS PUBLICADOS 228
LISTA DE ABREVIATURAS
% Percentagem
± Mais ou menos
® Marca registrada
5-HT Serotonina
5-HT4 Receptores serotoninérgicos do tipo 4
AC Ácido Centipédico
Ach Acetilcolina
AINEs Antiinflamatórios não-esteroidais
AMPc Adenosina Monofosfato cíclico
ANOVA Análise de variância
ATP Adenosina trifosfato
Ca2+ Íon cálcio
CA Centipedic Acid
CCK Colecistocinina
CCK2 Receptor de colecistocinina tipo 2
CCl4 Tetracloreto de carbono
CEPA Comitê de Ética em Pesquisa Animal
CGRP Peptídio Relacionado ao Gene da Calcitonina
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
cNOS Óxido nítrico sintase constitutiva
COX Ciclooxigenases
COX-1 Ciclooxigenase tipo 1
COX-2 Ciclooxigenase tipo 2
COX-3 Ciclooxigenase tipo 3
CLSI Clinical and Laboratory standards Institute
Da Daltons
DL50 Dose letal 50%
DMEM Meio Dulbecco
DNA Ácido desoxiribonucleico
E.P.M. Erro padrão da média
EDTA Ácido Etilenodiaminotetraacético sal dissódico
eNOS Óxido nítrico sintase endotelial
EP3 Receptor prostanóide tipo 3
ERO Espécies reativas de oxigênio
et al. ...e colaboradores
G Grama
Gi Proteína G inibitória
GSH Glutationa reduzida
H Hora
H2 Receptor de histamina tipo 2
H+, K+-ATPase Bomba de prótons
HCl Ácido clorídrico
HTAB Brometo de hexadeciltrimetilamônio
IBD Doença Inflamatória Intestinal
i.p. Intraperitoneal
IgE Imunoglobulina E
IL-10 Interleucina 10
iNOS Óxido nítrico sintase induzível
IV Infravermelho
KATP Canais de potássio sensíveis a ATP
KCl Cloreto de potássio
Kg Quilograma
L Litros
L-NAME NG-nitro-L-arginina-metilester
M (µM) Molar (micro molar)
M- Meio sem glutamina
M3 Receptor muscarínico tipo 3
MDA Malonildealdeído
MeOH Metanol
mg Miligrama
min Minuto
mL Mililitro
mm2 Milímetros quadrados
MPO Mieloperoxidase
NAC N-acetilcisteína
NaOH Hidróxido de sódio
NK2 Receptor de taquicininas tipo 2
nm Nanômetros
nmoles Nanomoles
cNOS Óxido nítrico sintase constitutiva
nNOS Óxido nítrico sintase neuronal
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
NP-SH Grupos sulfidrílicos não-protéicos oC Grau centígrado
P Nível de significância
P.A. Para análise
PIV Peptídio Vasoativo Intestinal
PGE2 Prostaglandina E2
PGI2 Prostaciclina
PGs Prostaglandinas
PKA Proteína Kinase A
PKC Proteína Kinase C
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RPM Rotações por minuto
s.c. Sub-cutâneo
SNC Sistema Nervoso Central
SNE Sistema Nervoso Entérico
SOD Superóxido dismutase
SST Somatostatina
TBA Ácido tiobarbitúrico
TCA Ácido tricloroacético
TGI Trato gastrintestinal
TGO Transaminase Glutâmico Oxalacética
TGP Transaminase Glutâmico Pirúvica
TNB Ácido trinitrobenzeno sulfônico
TRPV1 Canal de potencial transiente tipo vanilóide subtipo 1
TPA 13-acetato de 12-o-tetradecanoil-forbol
U.S.A. United States of America
UV Ultravioleta
v.o. Via oral
Vs Versus
α Alfa
β Beta
∆ Delta
µg Micrograma
µL Microlitro
µM Micromolar
LISTA DE QUADROS
QUADRO PÁGINA
QUADRO 1. Sumário de alguns dos principais terpenos descritos
na literatura com atividade antiulcerogênica
46
LISTA DE TABELAS
TABELA PÁGINA
TABELA 1. Cromatografia em Coluna de EVBFLC. 64
TABELA 2. Efeito do Ácido Centipédico e N-acetilcisteína no
modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em
camundongos.
88
TABELA 3. Efeito do pré – tratamento com capsazepina na
gastroproteção Ácido Centipédico à lesão gástrica
induzida por etanol absoluto em camundongos..
91
TABELA 4. Efeito do pré – tratamento com L-NAME na proteção
gástrica do Ácido Centipédico à lesão gástrica
induzida por álcool em camundongos.
94
TABELA 5. Efeito do pré – tratamento com indometacina na
gastroproteção do Ácido Centipédico à lesão
gástrica induzida por etanol absoluto em
camundongos.
97
TABELA 6. Efeito do pré – tratamento com glibenclamida na
proteção do Ácido Centipédico frente às lesões
gástricas induzidas por etanol absoluto em
100
camundongos.
TABELA 7. Efeito do Ácido Centipédico e N-acetilcisteína sobre
os níveis de grupos sulfidrilas não protéicos (NP-SH)
no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em
camundongos.
103
TABELA 8. Efeito do Ácido Centipédico e N-acetilcisteína sobre
os níveis de malonildealdeído no modelo de úlcera
gástrica induzida por etanol em camundongos.
106
TABELA 9. Efeito do Ácido Centipédico e N-acetilcisteína sobre
os níveis de Superóxido dismutase no modelo de
úlcera gástrica induzida por etanol em
camundongos.
109
TABELA 10. Efeito do Ácido Centipédico e Misoprostol sobre os
níveis de muco no modelo de úlcera gástrica
induzida por etanol em camundongos.
112
TABELA 11. Efeito do Ácido Centipédico e lansoprazol sozinhos
ou associados nas lesões gástricas induzidas por
etanol acidificado em camundongos.
115
TABELA 12. Efeito do pré – tratamento com naloxona na
gastroproteção do Ácido Centipédico frente às
lesões gástricas induzidas por etanol acidificado em
camundongos.
118
TABELA 13. Efeito do pré – tratamento com ioimbina
gastroproteção do Ácido Centipédico frente às
lesões gástricas induzidas por etanol acidificado
121
camundongos.
TABELA 14. Efeito do Ácido Centipédico e cimetidina sobre o
volume secretório gástrico e acidez gástrica total em
ratos com piloro ligado.
124
TABELA 15. Efeito do Ácido Centipédico e atropina sobre o
esvaziamento gástrico em ratos.
128
TABELA 16. Efeito do Ácido Centipédico e ranitidina sobre lesão
gástrica crônica induzida por ácido acético em ratos
(7 e 14 dias de tratamento).
132
TABELA 17. Efeito do ácido Centipédico, ranitidina e celecoxibe
sobre as alterações morfológicas observadas em
úlcera crônica induzida por ácido acético.
138
TABELA 18. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona no
modelo de úlcera intestinal induzida por
indometacina em ratos: função renal.
140
TABELA 19. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona no
modelo de úlcera intestinal induzida por
indometacina em ratos: função hepática.
142
TABELA 20. Efeito do Ácido centipédico e dexametasona sobre o
número de úlceras intestinais pontuais e
longitudinais induzidas por indometacina em ratos.
144
TABELA 21. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre
os níveis de malonildealdeído no modelo de úlcera
intestinal induzida por indometacina em ratos.
147
TABELA 22. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre 150
os níveis de catalase nas lesões intestinais induzidas
por indometacina em ratos.
TABELA 23. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre
os níveis de mieloperoxidase nas lesões intestinais
induzidas por indometacina em ratos.
153
TABELA 24. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre
os níveis de grupos sulfidrilas não-proteicos nas
lesões intestinais induzidas por indometacina em
ratos.
156
LISTA DE FIGURAS
FIGURA PÁGINA
FIGURA 1. Mecanismos de defesa e injúria da mucosa gástrica. 32
FIGURA 2. Parte aérea de Egletes viscosa. 49
FIGURA 3. Estrutura química do Ácido Centipédico. 64
FIGURA 4. Método de extração do Ácido Centipédico. 65
FIGURA 5. Efeito do Ácido Centipédico e N-acetilcisteína no
modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em
camundongos.
89
FIGURA 6. Efeito do pré – tratamento com capsazepina na
gastroproteção Ácido Centipédico à lesão gástrica
induzida por etanol 96% em camundongos.
92
FIGURA 7. Efeito do pré – tratamento com L-NAME na proteção
gástrica do Ácido Centipédico à lesão gástrica
induzida por álcool em camundongos.
95
FIGURA 8. Efeito do pré – tratamento com indometacina na
gastroproteção do Ácido Centipédico à lesão gástrica
induzida por etanol absoluto em camundongos.
98
FIGURA 9. Efeito do pré – tratamento com glibenclamida na
proteção do Ácido Centipédico frente às lesões
gástricas induzidas por etanol absoluto em
camundongos.
101
FIGURA 10. Efeito do Ácido Centipédico e N-acetilcisteína sobre
os níveis de grupos sulfidrilas não protéicos nas
lesões gástricas induzidas por etanol em
104
camundongos.
FIGURA 11. Efeito do Ácido Centipédico e N-acetilcisteína sobre
os níveis de malonildealdeído nas lesões gástricas
induzidas por etanol em camundongos.
107
FIGURA 12. Efeito do Ácido Centipédico e N-acetilcisteína sobre
os níveis de Superóxido dismutase no modelo de
úlcera gástrica induzida por etanol em camundongos.
110
FIGURA 13. Efeito do Ácido Centipédico e Misoprostol sobre os
níveis de muco no modelo de úlcera gástrica induzida
por etanol em camundongos.
113
FIGURA 14. Efeito do Ácido Centipédico e lansoprazol sozinhos
ou associados nas lesões gástricas induzidas por
etanol acidificado em camundongos.
116
FIGURA 15. Efeito do pré - tratamento com naloxona na
gastroproteção do Ácido Centipédico frente às lesões
gástricas induzidas por etanol acidificado em
camundongos.
119
FIGURA 16. Efeito do pré - tratamento com ioimbina
gastroproteção do Ácido Centipédico frente às lesões
gástricas induzidas por etanol acidificado
camundongos
122
FIGURA 17. Efeito da administração intraduodenal do Ácido
Centipédico e cimetidina no volume secretório
gástrico em ratos.
125
FIGURA 18. Efeito da administração intraduodenal do Ácido 126
Centipédico e cimetidina na acidez total gástrica em
ratos.
FIGURA 19. Efeito do Ácido Centipédico e atropina sobre o
esvaziamento gástrico em ratos.
129
FIGURA 20. Avaliação da ação do Ácido Centipédico sobre
Helicobacter pylor in vitroi .
130
FIGURA 21. Efeito do Ácido Centipédico e ranitidina sobre lesão
gástrica crônica induzida por ácido acético em ratos
(7 e 14 dias de tratamento).
133
FIGURA 22. Achados histológicos de AC, ranitidina e celecoxibe
em modelo de úlcera crônica induzida por ácido
acético (7 e 14 dias de tratamento).
136
FIGURA 23. Efeito do Ácido centipédico e dexametasona sobre o
número de úlceras intestinais pontuais e longitudinais
induzidas por indometacina em ratos.
145
FIGURA 24. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre
os níveis de malonildealdeído no modelo de úlcera
intestinal induzida por indometacina em ratos.
148
FIGURA 25. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre
os níveis de catalase nas lesões intestinais induzidas
por indometacina em ratos.
151
FIGURA 26. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre
os níveis de mieloperoxidase nas lesões intestinais
induzidas por indometacina em ratos.
154
FIGURA 27. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre 157
os níveis de grupos sulfidrilas não-proteicos nas
lesões intestinais induzidas por indometacina em
ratos.
FIGURA 28. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre
as lesões intestinais induzidas por indometacina:
achados histológicos.
159
FIGURA 29. Ação do Ácido Centipédico e indometacina sozinhos
ou associados na migração das células IEC-6 após
24 horas de exposição.
161
FIGURA 30. Ação do Ácido Centipédico e indometacina sozinhos
ou associados na proliferação das células IEC-6 após
24 horas de exposição.
163
FIGURA 31. Determinação da DL50 do Ácido Centipédico em
camundongos após 72 h de observação.
165
RESUMO
Investigação farmacológica dos mecanismos de ação gastroenteroprotetores
do Ácido Centipédico, um diterpeno de Egletes viscosa Less., em modelos
experimentais. Autora: Marjorie Moreira Guedes. Orientador: Prof. Dr. Vietla
Satyanarayana Rao. Tese de Doutorado. Programa de Pós-Graduação em Ciências
Médicas. Departamento de Clínica Médica. Universidade Federal do Ceará, 2008.
Ácido Centipédico (AC), um diterpeno isolado Egletes viscosa Less. (Asteraceae), foi
avaliado em modelos experimentais de lesão gástrica aguda e crônica, e, em modelo de
lesão intestinal. AC (50 e 100 mg/kg, v.o.) atenuou significativamente as lesões gástricas
induzidas por etanol (53 e 79% de inibição). Na dose de 50 mg/kg mostrou envolvimento do
óxido nítrico, prostaglandinas, canais de potássio ATP-dependente, mas de receptores
TRPV1. O diterpeno diminuiu significativamente a depleção dos grupos sulfidrilas não-
proteicos e SOD e diminuiu a formação de MDA, associados à administração de etanol. AC
aumentou ainda os níveis de muco gástrico. No modelo de etanol acidificado AC (50 e 100
mg/kg, v.o.) e lansoprazol (30 mg/kg, v.o.) atenuaram significativamente as lesões gástricas.
Nesse modelo, a associação de AC (50 mg/kg) com lansoprazol (30 mg/kg) potenciou o
efeito dessas drogas. AC mostrou em seu mecanismo, envolvimento de receptores opioides
e α2-adrenérgicos. AC (50 mg/kg v.o.) diminuiu significativamente o volume secretório e a
acidez total gástrica e não alterou o esvazimento gástrico em ratos. AC (7.9, 15.8 e 31.6
mM) não inibiu Helicobacter pylori. No modelo de úlcera gástrica crônica induzida por ácido
acético, AC (50 mg/kg v.o.) diminuiu de forma significativa a área lesionada tanto em 7 como
em 14 dias de tratamento. Os achados histológicos mostraram maior atividade fibroblástica
no grupo tratado com AC, observando-se boa perfomance do diterpeno no processo
cicatrizante quando verificados parâmetros de hemorragia, edema, congestão, esfoliação,
infiltrado, necrose e angiogênese. No modelo de úlcera intestinal induzida por indometacina
(10 mg/kg v.o.) por três dias, não foram verificadas alterações renais (ureia e creatinina)
nem hepáticas (TGO e TGP). O tratamento com AC (50 mg/kg) diminuiu de maneira
significativa o número de úlceras longitudinais (>5mm), mas não o número de úlceras
pontuais (<5mm). AC demonstrou ação antioxidante através da diminuição dos níveis de
MDA e MPO e restauração dos níveis de NP-SH e catalase. Em cultura de células
intestinais (IEC-6), AC (12.5, 25, 50 e 100 µM) mostrou ação pró-migratória, e, sua
associação (25; 50 e 100 µM) com indometacina 250 µM, mas não com 1000 µM, reverteu a
toxicidade da indometacina. AC (6,25, 12,5, 25, 50, 100 e 200 µM) sozinho não
mostrou diferença estatística sobre a proliferação celular de IEC-6. No entanto em
associação, o diterpeno (12,5, 25, 50, 100 mm) protegeu significativamente IEC-6 da
toxicidade da indometacina (250 e 1000 µM). Estes dados sugerem que o diterpeno
ácido centipédico tem o potencial gastroenteroprotetor possivelmente relacionado a
um mecanismo principalmente antioxidante e que poderia ser um agente terapêutico
eficaz no tratamento de úlceras gastrintestinais e efeitos colaterais aos AINEs.
Palavras-chave: Ácido centipédico, diterpeno, antioxidante, gastroenteroproteção.
ABSTRACT
Pharmacological investigations on the mechanisms of gastroenteroprotective
of centipedic acid, a diterpene from Egletes viscosa Less. in experimental
models. Author: Marjorie Moreira Guedes. Advisor: Prof. Dr. Vietla Satyanarayana
Rao. Doctoral thesis. Post-Graduate Program in Medical Science. Departamento of
Clinic Medicine, UFC, 2008.
Centipedic Acid (CA), a diterpene isolated from Egletes viscosa Less. (Asteraceae)
was evaluated in experimental models of acute and chronic gastric injury and
intestinal injury. CA (50 and 100mg/kg, po) significantly attenuated the gastric lesions
induced by ethano. In the mechanistic study, (CA 50 mg/kg) its gastroprotection was
shown to involve nitric oxide, prostaglandins, potassium channels ATP-dependent,
but not TRPV1 receptors. The diterpene was able to decrease significantly the
ethanol associated depletion of NP-SH and SOD levels, and increased MDA
formation. Besides, CA enhanced the gastric mucus significantly. In the model of
acidified ethanol orally administreted CA (50 and 100mg/kg, po) and lansoprazol
(30mg/kg po) markedely attenuated the gastric lesions. In this model, the
combination of AC (50 mg/kg) with lansoprazole (30 mg/kg) showed the potentiation
on their effects. In the study of action mechanism, CA shown involvement of opioid
receptors and α2-adrenergic receptors. CA (50 mg/kg po) decreased significantly the
secretory volume and gastric acidity but failed to modify the gastric emptying in rats.
CA (7.9, 15.8 e 31.6 mM) did not demonstrate anti-Helicobacter pylori activity in vitro.
In the model of chronic gastric ulcer induced by acetic acid, CA (50 mg/kg po)
decreased significantly the injured area as much as in 7 to 14 days of treatment. The
histological findings evidenced greater fibroblastic activity in the group treated with
CA, indicating that it aids in healing process as judged from the recorded parameters
of hemorrhage, edema, congestion, exfoliation, infiltration, necrosis and
angiogenesis. In the model of intestinal ulcers induced by indomethacin (10mg/kg po)
for three days, no changes in the kidneys function (urea and creatinine) or liver
enzymes (AST and ALT) were observed. CA (50mg/kg) treatment decreased
significantly the number of longitudinal ulcers (>5mm), but not the number of pointed
ulcers (<5mm). CA demonstrated an antioxidant effect by reducing the levels of MDA
and MPO and by restoring the levels of NP-SH and catalase activity. In intestinal
cells (IEC-6) culture, CA (12.5, 25, 50 and 100 µM) showed pro-migratory action, and
its association (25, 50 and 100µM) with 250 µM indomethacin, but not with 1000 µM,
mitigated the toxicity of indomethacin. CA (6.25, 12.5, 25, 50, 100 and 200 µM) alone
showed no statistical difference on cell proliferation of IEC-6. However, in
association, CA (12.5, 25, 50, 100 mM) significantly protected the IEC-6 cells from
indomethacin (250 and 1000 µM) toxicity. These data suggest that CA diterpene has
the gastroenteroprotective potential possibly related to an antioxidant mechanism
and it could be an effective therapeutic agent for the treatment of gastrointestinal
ulcerations and side effects to NSAIDs.
Keywords: Centipedic acid, diterpene, antioxidant gastroenteroprotection.
27
1. INTRODUÇÃO
1.1. FISIOLOGIA GASTRINTESTINAL
Além de sua função principal na digestão e absorção dos alimentos, o trato
gastrintestinal é um dos sistemas endócrinos mais importantes no corpo. Possui sua
rede neuronal integrativa, o sistema nervoso entérico, que contém aproximadamente
o mesmo número de neurônios da medula espinhal (RANG et al., 2003).
As suas funções dependem de propriedades inerentes à musculatura lisa
intestinal, reflexos de neurônios intrínsecos no intestino e no sistema nervoso central
(SNC), efeitos parácrinos de mediadores químicos e hormônios gastrintestinais.
Porém, a maioria de suas funções é autônoma e controlada predominantemente
pelo sistema nervoso entérico (SNE) através de dois plexos intramurais principais no
trato - o plexo mioentérico (plexo de Auerbach) e o plexo de Meissner (RANG et al.,
2003; HOOGERWERF & PASRICHA, 2006). Os neurônios no interior dos plexos
secretam acetilcolina, noradrenalina, e também serotonina (5-HT), purinas, óxido
nítrico e uma variedade de peptídios farmacologicamente ativos. O plexo entérico
contém neurônios sensoriais que respondem a estímulos mecânicos e químicos
(RANG et al., 2003).
Os hormônios do trato gastrintestinal incluem tanto secreções endócrinas
quanto parácrinas. As secreções endócrinas (substâncias liberadas na corrente
sangüínea) são principalmente peptídeos sintetizados por células endócrinas
existentes na mucosa, sendo o mais importante a gastrina. As secreções parácrinas,
ou hormônios locais, muitas das quais consistem em peptídios reguladores, são
liberadas por células especializadas, que se distribuem por toda a parede do trato
gastrintestinal. Esses hormônios atuam sobre as células vizinhas e, no estômago, o
mais importante deles é a histamina. Algumas dessas secreções parácrinas também
28
atuam como neurotransmissores (RANG et al., 2003; HOOGERWERF &
PASRICHA, 2006).
1.1.1. FISIOLOGIA DA SECREÇÃO E MOTILIDADE GASTRINTESTINAL
A secreção de ácido gástrico é um processo contínuo e complexo, em que
múltiplos fatores centrais e periféricos contribuem para uma meta comum: a
secreção de H+ pelas células parietais. Os fatores neuronais (acetilcolina),
parácrinos (histamina) e endócrinos (gastrina) regulam a secreção de ácido. Seus
receptores específicos (M3, H2 e CCK2, respectivamente) localizam-se na membrana
basolateral das células parietais no corpo e fundo gástricos. Nessas células o AMP
cíclico e as vias dependentes de Ca2+ ativam a H+, K+-ATPase (a bomba de
prótons), que efetua a troca de íons hidrogênio e potássio através da membrana
celular parietal. Essa bomba gera o maior gradiente iônico conhecido nos
vertebrados, com um pH intracelular de cerca de 7,3 e um pH intracanalicular de
cerca de 0,8 (HOOGERWERF & PASRICHA, 2006).
A gastrina é o indutor mais potente da secreção de ácido. A liberação de
gastrina é estimulada por múltiplas vias, incluindo ativação do SNC, distensão local
e componentes químicos do conteúdo gástrico. A gastrina estimula a secreção ácida
indiretamente ao induzir a liberação de histamina pelas células enterocromafins; um
efeito direto sobre as células parietais também desempenha um papel menos
importante (HOOGERWERF & PASRICHA, 2006).
A somatostatina (SST) inibe a secreção de ácido gástrico. A acidificação do
pH luminal gástrico para valores menores que três estimula a liberação de SST que,
por sua vez, suprime a produção de gastrina em uma alça de retroalimentação
negativa. As células produtoras de SST estão diminuídas em pacientes com
29
infecção por Helicobacter pylori, e a conseqüente redução do efeito inibitório da SST
podem contribuir para produção excessiva de gastrina (SCHUBERT, 2007).
A mucosa do intestino, desde o duodeno até o reto, produz secreções que
contêm muco, eletrólitos e água. O muco nas secreções protege a mucosa de danos
mecânicos. A natureza das secreções e os seus mecanismos de controle variam em
diferentes segmentos do intestino.
A motilidade gastrointestinal é um evento complexo, envolvendo interação
entre vias neurais, hormonais e neuromusculares, promovendo o movimento aboral
do material alimentar. A atividade gastrointestinal envolve elevado grau de
organização entre vias centrais e periféricas, neurônios e vias neurais, além das vias
motoras necessárias para regular a motilidade intestinal (MELO et al., 2007).
Várias subtâncias endógenas desempenham papel na regulação da
motilidade gastrointestinal. Gastrina, colecistocinina (CCK), motilina, substância P, 5-
Hidroxitriptamina (5-HT) e o hormônio inibidor da liberação de gastrina (bombesina)
estimulam a motilidade. Por outro lado, secretina, glucagon, peptídeo intestinal
vasoativo (PIV), encefalina e o hormônio inibidor da secreção de somatostatina
inibem a motilidade. Estas substâncias regulam a motilidade do TGI através de sua
ação em neurotransmissores, atuando em receptores da dopamina tipo 2 (D2),
receptores 5-HT e receptores opioides presentes no plexo mioentérico (EVANS,
1998; SASAKI et al., 2003). Além agentes supracitados, encontramos ainda a ação
da grelina (CHEN, et al., 2009), melatonina (KANDIL et al., 2010) e leptina (HATA et
al., 2009) sobre a motilidade do trato gastrintestinal.
30
1.2. DISTÚRBIOS GRASTRINTESTINAIS
O trato gastrintestinal (TGI) é um dos sistemas do organismo de importância
fundamental, considerando sua função de provê-lo de água, eletrólitos e alimentos
(GUYTON & HALL, 2006).
A úlcera péptica é uma lesão profunda da mucosa, onde tanto os
componentes do tecido epitelial e conectivo, incluindo miofibroblastos subepiteliais,
como células do músculo liso, vasos e nervos, podem ser destruídos (MILANI &
CALABRÒ, 2001).
As úlceras ocorrem freqüentemente no duodeno (úlcera duodenal), onde mais
de 95% estão localizadas na sua primeira porção, e 90% próximo à junção do piloro
com a mucosa duodenal. No estômago (úlcera gástrica), as úlceras se localizam
mais comumente no antro (60%) e na junção do antro com o corpo, na pequena
curvatura (25%). A incidência de úlceras gástricas parece ser ligeiramente maior em
homens em relação às mulheres (1,3: 1), sendo que a faixa etária de maior
ocorrência das úlceras duodenais é de 30-55 anos, e das úlceras gástricas é de 50-
70 anos (ABITBOL, 2007).
A úlcera duodenal é mais freqüente nas populações ocidentais, e as úlceras
gástricas são mais comuns nos países orientais, particularmente o Japão. Embora
menos prevalente do que a úlcera duodenal, a úlcera gástrica (0,1% da população
em países desenvolvidos) apresenta maior grau de mortalidade e morbidade
associados, resultantes de hemorragias, perfurações e obstruções (SIVRI, 2004).
Historicamente, a doença da úlcera péptica estava focalizada em
anormalidades na secreção ácido gástrica e de pepsina, e na supressão ácida como
estratégia de tratamento. Hoje, a hipersecreção gástrica associada com a Síndrome
de Zollinger-Ellison, hiperplasia das células-G, um aumento na quantidade de
31
células parietais e a ausência de equilíbrio fisiológico entre hormônios gástricos
antagonistas, gastrina e somatostatina têm importante resultado na doença da
úlcera péptica; entretanto, a estimulação da secreção de ácido clorídrico e pepsina
podem estar relacionadas com hipersensibilidade colinérgica e ação parassimpática,
funcionando como co-fator em danos erosivos na mucosa gastrintestinal (YUAN et
al., 2006).
Fatores como fumo, álcool, estresse, uso de medicamentos, faixa etária,
infecção pela H. pylori, hereditariedade de afecções pépticas, entre outros, podem
desempenhar diferentes papéis na gênese da doença (SAUL, 2007). A patogenia
da doença ulcerosa péptica é mais bem representada como um complexo cenário
envolvendo o desequilíbrio entre os fatores de defesa da mucosa (bicarbonato,
muco, prostaglandinas, fluxo sanguíneo, óxido nítrico, fatores de crescimento, etc.) e
fatores agressivos que compreendem os agentes químicos, que podem ser
endógenos (HCl, pepsina) ou exógenos (etanol, antiinflamatórios não esteroidais), e
agentes biológicos (Helicobacter pylori) (FIGURA 1) (NATALE et al., 2004).
32
FIGURA 1. Mecanismos de defesa e injúria da mucosa gástrica (Adaptado de
ROBBINS & COTRAN, 2005).
Nos últimos anos, a infecção H. pylori e as drogas antiinflamatórias não-
esteroidais (AINES) foram identificadas como as duas principais causas de úlcera
péptica e intestinais. Diversos estudos mostram que mais de 90% dos pacientes
com úlcera duodenal e 70% daqueles que apresentam úlcera gástrica estão
infectados por H. pylori (SIVRI, 2004). Essa infecção pode resultar em
comprometimento na produção de somatostatina pelas células D e, com o decorrer
do tempo, em redução da inibição da produção de gastrina, resultando em aumento
da produção de ácido e redução da produção duodenal de bicarbonato
(HOOGERWERF & PASRICHA, 2006).
Os AINES também estão freqüentemente associados a úlceras (em até 60%
dos pacientes, particularmente naqueles com complicações, como sangramento). A
lesão tópica causada pela presença do fármaco no lúmen parece desempenhar um
33
papel menos importante na patogenia dessas úlceras. Os efeitos desses fármacos
são, em vez disso, mediados por via sistêmica; o elemento crítico consiste na
supressão da forma constitutiva da ciclooxigenase (COX-1) na mucosa e na
produção diminuída das prostaglandinas citoprotetoras, a PGE2 e a PGI2 (GANOC,
2003; HOOGERWERF & PASRICHA, 2006).
A mucosa intestinal está suscetível a uma série de agressões que podem
comprometer a integridade deste tecido muito importante tanto na barreira como em
suas funções de absorção de nutrientes. Essas agressões incluem doença
inflamatória intestinal, úlceras por AINE, infecções e radioterapia e quimioterapia
usadas no tratamento do câncer. A recuperação rápida da barreira e função
absortiva é essencial para o tratamento e/ou recuperação de tais insultos (RUTHING
& MECKLING-GILL, 1999).
Vários fatores são postulados como elemento patogênico da ulceração do
intestino delgado induzida por AINEs, incluindo invasão de enterobactérias, ativação
de neutrófilos, e óxido nítrico (superprodução de NO), além de deficiência de
prostaglandinas (PG) (ROBERT & ASANO, 1977; FANG et al., 1977; WHITTLE,
1981, WITTLE et al., 1995; WEISSENBORN, 1985; YAMADA et al., 1993).
Prostaglandina E2 (PGE2) não é apenas um mediador chave da inflamação,
mas também um regulador da homeostase da mucosa gastrointestinal através de
sua influência em diversas funções e mediadores (HARRIS et al., 2002; ROCCA
&FITZGERALD, 2002; TSUTSUMI et al., 2002). PGE2 aumenta a síntese de
interleucina 10 (IL-10) e modula a resposta imune intestinal a dieta (NEWBERRY et
al., 1999; MONTELEONE et al., 1999) Indometacina é um dos antiinflamatórios não-
esteróides (AINE) que reduzem a produção de PGE2 através da inibição das
cicloxigenases (COXs), COX-1 e COX-2 (ROCCA &FITZGERALD, 2002).
34
Embora os AINEs sejam úteis por sua ação analgésica e propriedades
antiinflamatórias, a maior limitação de seu uso é o dano gastrintestinal. Por exemplo,
o tratamento em longo prazo com AINEs provoca inflamação do intestino delgado
semelhante à doença de Crohn em 70% dos pacientes que recebem essas drogas
(BJARNASON et al., 1993; DAVIES et al., 2000; MAIDEN et al., 2005). Além disso, a
administração de AINEs pode causar recaída imediata de doença inflamatória
intestinal (IBD) e outras doenças que acompanham as lesões da mucosa
(KAUFMAN & TAUBIN, 1987; WILSON et al., 1990). Estes dados indicam que os
métodos para a redução de enteropatia são necessários e importantes na terapia de
AINEs.
A cicatrização das úlceras apesar do uso contínuo de AINES é possível com a
administração de agentes supressores da secreção ácida, habitualmente em doses
mais elevadas e por um período consideravelmente mais longo do que os esquemas
padrões (p. ex., 8 semanas ou mais). Nessa situação os inibidores da bomba de
prótons são superiores aos antagonistas dos receptores H2 e aos análogos das
prostaglandinas (misoprostol) na promoção da cicatrização das úlceras ativas (taxas
de cicatrização de 80 a 90% para os inibidores da bomba de prótons versus 60 a
75% para os antagonistas dos receptores H2) e na prevenção da recidiva das
úlceras gástricas e duodenais em caso de administração contínua de AINES
(LANZA, 1998; HOOGERWERF & PASRICHA, 2006).
As doenças do trato gastrintestinal relacionadas ao álcool possuem um papel
importante na gastroenterologia clínica. A lesão da mucosa gástrica ocorre devido a
uma diminuição de função da barreira de muco, a principal proteção contra o ácido
gástrico. Altas concentrações de etanol levam a um aumento da permeabilidade
epitelial, como conseqüência de mudanças da diferença de potencial celular que é
35
causado pela re-difusão de íons H+ através da mucosa lesada pelo álcool
(SIEGMUND et al., 2003). O etanol também induz estresse oxidativo, danos ao DNA
e diminuição dos grupamentos sulfidrílicos não-protéicos (GSH) das células que é
um dos mais importantes fatores de proteção da mucosa gástrica (REPETTO &
LLESUY, 2002).
O pantoprazol ou o lansoprazol, por via intravenosa constituem claramente a
terapia preferida para pacientes com úlceras hemorrágicas agudas. O benefício
teórico da supressão máxima da secreção de ácido nesse contexto consiste na
aceleração da cicatrização da úlcera subjacente. Além disso, um pH gástrico mais
elevado aumenta a formação de coágulo e retarda a sua dissolução
(HOOGERWERF & PASRICHA, 2006). Atualmente, estes agentes anti-secretórios
representam uma das melhores opções na terapia contra úlcera péptica (GISBERT,
2005), entretanto seu uso prolongado tem sido associado à incidência de fraturas e
câncer (YANG et al., 2006; LEEDHAM et al., 2007).
O emprego de inibidores seletivos da COX-2, como alternativa para evitar os
efeitos pró-ulcerogênicos dos demais AINEs, tem sido largamente reduzido em
virtude da possível associação desses fármacos a eventos cardiovasculares
adversos. Adicionalmente, diversos autores têm especulado acerca da contribuição
da COX-2 nos mecanismos de defesa da mucosa gastrintestinal e de cicatrização de
úlceras (JUGDUTT, 2007).
Outra alternativa consiste na utilização de pró-bióticos. Muitos alimentos,
geralmente de origem vegetal e alguns produtos lácteos, foram avaliadas em relação
aos seus efeitos protetores da mucosa gástrica. As propriedades antioxidantes e
antiinflamatórias exercidas pelos probióticos podem estabilizar a função de barreira
gástrica e diminuir a inflamação da mucosa (GOTTELAND et al., 2006). Além disso,
36
há participação da microbiota local na proteção contra lesões gástricas (ELLIOT et
al., 1998)
Várias estratégias têm sido utilizadas no desenvolvimento de novos AINEs
para poupar o trato gastrintestinal. Uma é apenas desenvolver AINEs que inibem a
COX-2, exercendo uma atividade antiinflamatória, mas poupando a síntese das
prostaglandinas na mucosa do trato gastrointestinal. Outra estratégia de AINEs
poupadores gastrintestinais é o acoplamento de uma molécula liberadora de óxido
nítrico aos AINEs padrão (ARAI et al., 1993; WALLACE, 1997; MIZOGUCHI et al.,
2001).
Dispepsia não-ulcerosa, ou dispepsia funcional, é um termo que se refere a
uma desordem gastrintestinal cujos sintomas são semelhantes aos da úlcera em
pacientes que não apresentam ulceração gastroduodenal franca. Isso pode ocorrer
em associação com gastrite (com ou sem infecção por H. pylori) ou com o uso de
AINES, porém a patogenia dessa síndrome permanece controvertida. No entanto,
três importantes fatores parecem estar envolvidos: a) anormalidades da motilidade
gastrintestinal, b) aumento da sensibilidade a estímulos provenientes do lúmen do
tubo digestivo e c) anormalidades da esfera psicoemocional. Estas alterações
podem resultar em retardo do esvaziamento gástrico, que ocorre em cerca de
metade dos casos de dispepsia funcional (TRONCON, 2001).
Embora o tratamento empírico da dispepsia funcional com agentes
supressores da secreção ácida seja utilizado rotineiramente em pacientes com
dispepsia não-ulcerosa, não há evidências convincentes de seu benefício em
estudos clínicos controlados (HOOGERWERF & PASRICHA, 2006).
37
1.2.1. MECANISMOS DE DEFESA DA MUCOSA GASTRINTESTINAL
A mucosa gastrintestinal tem vários meios pelos quais resiste a ferimentos
causados por fatores intrínsecos e extrínsecos, incluindo o ácido gástrico,
antiinflamatórios não esteróides e Helicobacter pylori. Uma melhor compreensão dos
mecanismos de defesa e lesões gastroduodenais fornece uma nova visão sobre
potenciais alvos terapêuticos (NAYEB-HASHEMI, 2009).
A concentração extremamente elevada de H+ no lúmen gástrico requer
mecanismos vigorosos de defesa para proteger o esôfago e o estômago. A principal
defesa do esôfago é proporcionada pelo esfíncter esofágico inferior, que impede o
refluxo do conteúdo gástrico ácido para dentro do esôfago. A secreção de uma
camada de muco constitui importante defesa na proteção das células epiteliais
gástricas. O muco gástrico é formado por 95% de água e 5% de glicoproteínas
(REPETTO, 2002), é solúvel quando secretado, porém forma rapidamente um gel
insolúvel que reveste toda a superfície mucosa do estômago, retarda a difusão de
íons e impede a lesão da mucosa por macromoléculas, como a pepsina
(HOOGERWERF & PASRICHA, 2006).
A secreção de bicarbonato pelas células epiteliais gástricas é um dos
mecanismos de defesa da mucosa contra os efeitos nocivos do ácido. Ela é
regulada por diversos fatores tais como prostaglandinas, óxido nítrico, neurônios
aferentes sensíveis a capsaicina, peptídeos e fatores neuronais (AIHARA et al.,
2007).
As prostaglandinas endógenas têm um importante papel mediando muitos
aspectos da defesa da mucosa gastrintestinal (MAITY et al., 2003). As
prostaglandinas são sintetizadas a partir do ácido araquidônico, através das enzimas
ciclooxigenases (COX). Há duas formas de ciclooxigenase, a COX-1 e a COX-2
38
(HOOGERWERF & PASRICHA, 2006). Enquanto a isoforma COX-1 (constitutiva)
produz a maior parte das prostaglandinas na mucosa normal, a COX-2 (induzida)
atua como um fator importante na cicatrização das úlceras. Inicialmente acreditou-se
que a COX-2 contribuía para a cicatrização das úlceras unicamente através da
produção de prostaglandinas. Entretanto, estudos sugerem que a inibição da COX-2
aumenta o tempo de cicatrização das úlceras tanto por via dependente quanto
independente de prostaglandinas (PERINI et al., 2003).
A prostaglandina E2 (PGE2) e a prostaciclina (PGI2) constituem as principais
prostaglandinas sintetizadas pela mucosa gastrintestinal. Atuam sobre o receptor
prostanoide EP3 nas células parietais e estimulam a via G inibitória (Gi), diminuindo,
assim, o AMP cíclico intracelular e a secreção de ácido gástrico. A PGE2 também
pode evitar a lesão gastrintestinal através de efeitos citoprotetores, que incluem a
estimulação da secreção de muco e bicarbonato e o aumento do fluxo sanguíneo da
mucosa (HOOGERWERF & PASRICHA, 2006; AIHARA et al., 2007).
O estômago protege a si próprio da lesão ácida por diversos mecanismos que
exigem um fluxo sanguíneo adequado, devido à elevada atividade metabólica e
necessidade de oxigênio da mucosa gástrica. A elevação do fluxo sangüíneo é
importante quando a barreira protetora mucosa do estômago é rompida e ocorre
retrodifusão de íons H+ para as células da mucosa (MAITY et al., 2003). Atribui-se o
controle do fluxo sanguíneo gastrintestinal principalmente às prostaglandinas
endógenas (FUNATSU et al., 2007).
O óxido nítrico (NO) tem sido reconhecido recentemente como um mediador
fundamental nos mecanismos de defesa gastrintestinal, devido a sua habilidade de
aumentar o fluxo sangüíneo da mucosa e a produção de muco, além de inibir a
aderência de neutrófilos às células endoteliais (CORUZZI et al., 2000). O NO é
39
sintetizado pela NO sintase (NOS) a partir do oxigênio molecular (O2) e L-arginina.
Existem três isoformas conhecidas da NOS: uma forma induzida - iNOS (expressa
em macrófagos, células de Kupffer, neutrófilos, fibroblastos, músculo liso vascular e
células endoteliais em resposta a estímulos patológicos como microrganismos
invasores) e duas dita constitutivas (cNOS), que estão presentes em condições
fisiológicas no endotélio (eNOS) e nos neurônios (nNOS) (CHO, 2001; UCHIDA et
al., 2001).
Recentes estudos demonstram que o NO atua de maneira bifásica na
resposta ulcerogênica da mucosa gastrintestinal dependendo da isoforma da NOS,
ou seja, o NO produzido pela cNOS apresentaria um efeito protetor, e o NO
originário da iNOS teria um efeito pró-ulcerogênico (NISHIO et al., 2006). O NO
também é importante no controle da secreção ácida e alcalina, no fluxo sangüíneo
da mucosa gastrintestinal e na secreção de muco (BAYIR et al., 2006).
A geração de espécies reativas de oxigênio (ERO) ocorre durante o
metabolismo celular normal e está relacionada com a patogênese de diversas
doenças (AGNIHOTRI et al., 2007). As ERO causam inflamação e morte celular
através da modulação das vias de transdução de sinal, por afetar as enzimas redox-
sensíveis e fatores de transcrição, por auxiliar a atividade de proteases e por
estimular a expressão de mediadores inflamatórios e moléculas de adesão (UZUN et
al., 2005).
Os compostos sulfidrílicos estão envolvidos na manutenção da integridade
gastrintestinal, principalmente quando as ERO estão envolvidas na patofisiologia da
lesão tecidual. A glutationa reduzida (GSH) atua como um varredor de radicais livres
e substâncias tóxicas ingeridas na alimentação e/ou produzidas diretamente no TGI.
Dessa forma, a manutenção dos níveis de GSH contribui para integridade da
40
mucosa gastrintestinal. GSH participa em muitos aspectos do metabolismo oxidativo,
incluindo remoção de hidroperóxidos, proteção contra radiação ionizada,
manutenção do padrão fisiológico de proteínas sulfidrílicas e condensação com
xenobióticos ou compostos reativos endógenos, para ajudar na sua detoxificação e
excreção (SHIRIN et al., 2001).
Outros componentes da defesa gastrintestinal são os fatores de crescimento
que estimulam importantes elementos celulares de cicatrização da úlcera como a
angiogênese, formação de tecido de granulação e reepitelização, mas sua
especificidade e potência variam (SZABO & VINCZE, 2000; TÉTREAULT et al.,
2008).
1.3. MODELOS EXPERIMENTAIS EM GASTROENTEROPROTEÇÃO.
É importante o papel desempenhado pelos modelos animais na busca de novas
drogas. Considerando que a etiologia das úlceras é multifatorial, as lesões na
mucosa gastrintestinal podem ser induzidas por diferentes modelos experimentais,
utilizando diversos mecanismos (SAMONINA et al., 2004).
A formação de lesões ulcerativas em modelos experimentais, assim como as
ocorrentes em humanos, envolve a explicação clássica, de que elas são provocadas
por um desbalanço entre os fatores protetores e lesivos da mucosa gastrintestinal
(MAITY et al., 2003). Esse desbalanço pode ser induzido de diversas maneiras seja
por mecanismos nervosos (estimulação vagal), substâncias químicas ou pela
realização de procedimentos cirúrgicos.
Estudos anteriores destacam os diversos mecanismos de lesão induzida pelo
etanol na mucosa gástrica, cada uma das quais está aberta para a manipulação
farmacológica. A úlcera gástrica induzida por etanol ocorre predominantemente na
41
porção glandular do estômago, sendo resultante de uma ação necrotizante direta
além da redução dos fatores de defesa como secreção de bicarbonato e muco
(RUJJANAWATE et al., 2005).
Um dos fatores que desempenham um papel primordial nas muitas vias de
danos induzidos por etanol é o estresse oxidativo que resulta na geração espécies
reativas de oxigênio. Antioxidantes intracelulares, tais como a glutationa (NP-
SH/GSH) são fundamentais para a proteção celular do tecido gástrico (LIRA et al.,
2009). O tratamento agudo com etanol que promove estresse oxidativo pode ainda,
aumentar os níveis de malonildealdeído e causar depleção dos níveis dos grupos
sulfidrilas não-proteicos e superóxido dismutase (REPETTO et al., 2002), levando
também ao impedimento à síntese de prostaglandinas (KWIECIEN, 2002).
Outro modelo utilizado na indução de úlceras gástricas é o de etanol acidificado.
Etanol acidificado é um agente ulcerogênico bem conhecido e foi usado no estudo
para produzir danos à mucosa gástrica por causar áreas de hiperemia focal e
hemorragia. O uso de HCl leva a uma potencialização da úlcera provocada pelo
etanol. Além do mais, etanol intragástrico aumenta a permeabilidade vascular
causando dano aos capilares próximos da superfície luminal e não na profunda
mucosa muscular que pode indicar um papel importante no dano ao fluxo
sanguíneo, e assim produzindo lesões por etanol acidificado (ADEYEMI et al, 2006).
Ácido acético (20%) é outro agente usado em modelo de úlcera crônica que,
muito se assemelha a úlceras em humanos tanto em termos de características
patológicas como em mecanismos de cura, é utilizado para desenvolver novas
drogas anti-úlcera que possam potencialmente prevenir a reincidência da úlcera ou
melhorar sua cicatrização (GÜNAL, 2003; OKABE, 2005).
42
A injeção de uma solução de ácido acético (20%) na camada submucosa
gástrica permite na indução consistente de úlceras penetrantes. A solução ácida
necrosa a mucosa, produzindo úlceras profundas de formato arredondado (OKABE
& AMAGASE, 2005).
Outro modelo utilizado para indução de lesões tanto no estômado como no
intestino é a administração de indometacina em única dose ou em doses múltiplas. A
inibição da ciclooxigenase pela indometacina, um anti-inflamatório não-esteroidal,
promove a diminuição da produção de prostaglandinas, que são responsáveis pela
manutenção da integridade da mucosa gástrica através da inibição da secreção
ácida, estimulação da secreção de muco e bicarbonato, inibição da ativação de
mastócitos, diminuição da aderência leucocitária ao endotélio vascular, inibição da
apoptose, aumento ou manutenção do fluxo sangüíneo da mucosa (ATAY et al.,
2000).
1.4. PLANTAS MEDICINAIS E DESORDENS GRASTRINTESTINAIS
As plantas medicinais têm sido usadas como tratamentos tradicionais
para inúmeras doenças humanas durante milhares de anos e
em muitas partes do mundo. Em termos históricos, a pesquisa com plantas
medicinais tomou impulso após o isolamento da morfina no século XIX. As plantas
possibilitaram a descoberta de vários medicamentos, como os alcalóides
bisindólicos vimblastina e vincristina isolados de Catharanthus roseus G., a atropina,
obtida de Atropa belladona e também a lactona sesquiterpênica artemisina isolada
de Artemisia annua L., utilizada como antimalárico (BALUNAS et al., 2005).
Plantas e seus derivados são as maiores fontes de drogas, movimentando
cerca de 30% do mercado farmacêutico mundial (KIRKPATRICK, 2002). Entre os
43
anos de 1981 e 2002, de 877 novas moléculas introduzidas no mercado, em torno
de 49% eram substâncias isoladas de produtos naturais, semi-sintéticos ou
moléculas sintetizadas tomando como modelo estruturas de origem natural
(NEWMAN et al., 2003). Nas zonas rurais dos países em desenvolvimento
continuam a ser utilizados como a principal fonte da medicina (CHITME, 2003).
No Brasil, 20% da população são responsáveis por 63% do consumo de
medicamentos alopáticos; os 80% restantes encontram nos produtos de origem
natural, especialmente as plantas medicinais, a única fonte de recursos terapêuticos
(FOGLIO et al., 2006). Nosso país possui uma enorme biodiversidade, detendo
aproximadamente um terço da flora mundial. Dessa forma, nossas espécies vegetais
demonstram o enorme potencial do estudo de plantas para a descoberta de novas
moléculas terapeuticamente úteis (YUNES et al., 2001).
A existência de cerca de 500.000 espécies de plantas que ocorrem em todo o
mundo, das quais apenas 1% teve seu potencial fitoquímico investigado, é grande
fonte de interesse para descobrir novos compostos bioativos (COWAN, 1999 &
KALEMBA, 2003).
Várias plantas medicinais têm sido usadas para o tratamento de distúrbios
gastrintestinais. A primeira droga sistematicamente efetiva contra úlceras gástricas,
a carbenoxolona, foi descoberta como resultado de pesquisas com Glycyrrhiza
glabra (Alcaçuz), comumente usada pelos indígenas (AKTAR & MUNIR, 1989).
Em recentes publicações têm sido evidenciada a ação protetora do trato
gastrintestinal de produtos derivados de plantas medicinais (BRZOZOWSKI et al.,
2005; NAVARRETE et al., 2005; NARAYAN et al., 2005; ANDREO et al., 2006; DA
ROCHA LAPA et al., 2007, ANDREA et al., 2009). Os compostos obtidos a partir de
plantas medicinais com atividade antiulcerogênica apresentam estruturas químicas
44
diversas e distintos mecanismos de ação (SCHMEDA-HIRSCHMANN & YESILADA,
2005).
O extrato obtido a partir das folhas e frutos de Sapindus saponaria L., rico em
triterpenos pentacíclicos, apresentou atividade antiulcerogênica e anti-secretória
gástrica, diminuindo a concentração de ácido clorídrico e o pH gástrico (MEYER et
al., 2002). Lactonas sesquiterpênicas com atividade antiulcerogênica foram isoladas
de Artemisia douglasiana (GUARDIÃ et al., 1994). Dihidro-epideoxiartenuína b,
isolada de Artemisia annua, apresentaram ação antiulcerogênica, estimulando a
produção de muco através do aumento dos níveis gástricos de prostaglandinas
(FOGLIO et al., 2002; DIAS, 2004). Ecabet sodium demonstrou capacidade de
reepitelização retal, pelo aumento de prostaglandina E2 em paciente submetido à
radioterapia (AKIKO et al, 2009).
Estudos realizados em nosso Laboratório de Produtos Naturais da
Universidade Federal do Ceará evidenciaram a ação protetora do TGI de uma
variedade de plantas medicinais e de seus princípios ativos, dentre eles podemos
citar a ação gastroprotetora do guaraná (Paullinia cupana Mart.) (CAMPOS et al.,
2003), do 1,8-cineol (SANTOS et al., 2001), da resina bruta e da mistura contendo α-
e β-amirina isolada de Protium heptaphyllum (OLIVEIRA et al., 2004a; OLIVEIRA et
al., 2004b), do lupeol um triterpeno pentacíclico isolado da casca do caule de
Cenostigma macrophyllum (LIRA, 2009) e também da ação protetora do óleo de
copaíba de Copaifera Langsdorff em modelo de colite (PAIVA et al., 2004) dentre
outros.
Com o objetivo de assegurar o acesso, uso correto de plantas medicinais e
fitoterápicos pela população, bem como a utilização sustentável da biodiversidade
brasileira e o desenvolvimento da indústria nacional, foi aprovado no dia 22 de junho
45
de 2006 a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos pelo governo
federal (BRASIL, 2006). Essa política vem sedimentar o uso dessas substâncias ou
plantas nas prescrições médicas, em conjunto à Relação Nacional de Plantas
Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS).
Portanto, as plantas medicinais e seus metabólitos secundários, como
terpenos e flavonóides, apresentam importância como agentes terapêuticos, no
tratamento de desordens gastrintestinais tais como úlceras, gastrites e diarréias
(SCHMEDA-HIRSCHMANN & YESILADA, 2005).
1.5. DITERPENOS
Os terpenos representam uma classe de metabólito secundário amplamente
distribuída no reino vegetal. Possuem uma composição molecular típica (C20H30),
sendo formados por duas ou mais unidades isoprênicas. Estudos recentes indicam
que di, tri e tetraterpenos são biossintetizados na célula dentro dos cloroplastos
(NABETA et al., 1995).
Estes compostos representam a segunda classe com maior número de
constituintes ativos obtidos de plantas, perdendo apenas para os flavonóides, e são
divididos em monoterpenos (10 carbonos), sesquiterpenos (15 carbonos), diterpenos
(20 carbonos), sesterpenos (25 carbonos), triterpenos (30 carbonos) e tetraterpenos
(40 carbonos) (SEIGLER, 1981; DI STASI, 1996).
Diversos terpenos, incluindo lactonas sesquiterpênicas, diterpenos e
triterpenos já foram avaliados cientificamente quanto ao seu potencial
antiulcerogênico, conforme se pode verificar no quadro a seguir (BARBASTEFANO,
2007).
46
Quadro 01. Sumário de alguns dos principais terpenos descritos na literatura com atividade antiulcerogênica
Composto Classificação Origem
Trans- crotonina Lactona sesquiterpênica Croton cajucara Onodorpicrina Lactona sesquiterpênica Arctium lappa
Ferruginol Diterpeno Prumnopitys andina Ácido Oleanólico Triterpeno Fabiana imbricata
Ácido Glicirretinico Triterpeno Glycyrrhiza glabra Theasaponina Saponina triterpênica Camellia sinensis
Os diterpenos constituem uma grande e diversificada classe de metabólitos
secundários que podem ser considerados como resultados de fatores naturais.
Possuem esqueleto básico com 20 átomos de carbono e derivam biogeneticamente
do pirofosfato de geranil geranila, que resulta do encadeamento cabeça-cauda de
quatro unidades de isopreno (TORSSELL, 1983).
Existem cerca de 2500 diterpenos conhecidos que pertencem a 20 principais
tipos estruturais. Dentre esse tipos encontramos formas acíclicas , monocíclicas,
bicíclicas (clerodanos), tricíclicas (kauranos) entre outras. Essa classe de terpenos é
encontrada em todas as famílias de plantas (SEIGLER, 2009).
Há varias décadas as propriedades farmacológicas dos diterpenos vêm sendo
determinadas, entre elas: antibiótica (NAKANISHI, 1974), antitumoral (SENILH et al.,
1998; ADOLF et al., 1985), antiinflamatória (BRAQUET, 1988), anti-reumática (GU et
al., 1995) e antiulcerogênica (SHIRAKABE et al., 1995). Foram descritas também
atividades vasodilatadora (DUARTE et al., 1992; LAMBERTE et al., 1994) e
vasoconstritora (BAZAN et al., 1993; MIRANDA et al., 1998).
Dentre os diterpenos biologicamente ativos estudados incluem-se: forskolin,
com atividade hipotensora e um ativador específico e reversível das isoformas
particulada e solúvel da adenilil ciclase (SEAMON et al., 1981; DALY, 1981); ésteres
47
de forbol, isolados inicialmente de plantas do gênero Croton que são ativadores de
proteína quinase C e têm sido largamente utilizados para o estudo das funções
biológicas, propriedades e distribuição desta enzima e na investigação da
carcinogênese química (NISHIZUKA, 1986; CHUANG, 1989) e cleonol com
atividades hipotensora, espasmolítica inespecífica, cronotrópica positiva e
vasodilatadora (DUBEY et al., 1974). Eles apresentam importância química e
comercial por que o seu uso leva à pesquisa de novos produtos farmacêuticos
(DZEROSKI et al., 1998).
Diterpenos com interesse particular em gastroproteção pode-se citar os
clerodanos (trans-desidrocrotonina de Croton cajucara e aparisthman de
Aparisthmium cordatum), os labdanos (solidagenone de Solidago chilensis, 15-
acetoxylabd-8 (17)-en-19-ol), bem como 15 ,19-diacetoxylabd-8 (17)-en de Araucaria
araucana), abietano (ferruginol de Prumnopitys ena), e Jatrophone de Jatropha
isabelli, que pode desempenhar um papel importante na descoberta de drogas, bem
como, no fornecimento de estruturas de vanguarda no desenvolvimento de
moléculas sintéticas (IZQUIERDO et al., 2007; PERTINO et al., 2007; SEPÚLVEDA
te al., 2005; VUORELA et al., 2004.)
1.6. Egletes viscosa Less.
Família: Asteraceae Nomes comuns:
Macela-da-terra, para diferenciá-la da macela verdadeira (Achyrocline
satureoide), ou simplesmente macela, losna-do-mato (Minas gerais), macela-do-
campo (Paraíba) e botancela (Peru).
48
Espécies botânicas correlatas
Egletes liebmannii Sch, Egletes glabrata, Egletes cassini, Egletes florida
Shinners, Egletes prostrata.
Distribuição geográfica:
A família Asteraceae, com cerca de 1535 gêneros e aproximadamente 23000
espécies, representa cerca de 10% da flora mundial (BREMER 1994), e vem sendo
intensivamente estudada nos últimos 25 anos não somente quanto à sua morfologia,
anatomia, ontogenia e ecologia, mas também quanto a sua fitoquímica e
citogenética (BREMER 1996, HIND & BEENTJE 1996).
No Brasil, onde se encontra boa parte da diversidade de Asteraceae, ainda
são necessários levantamentos florísticos intensivos, uma vez que o trabalho de
Baker (1873-1884) é o último tratamento formal da família Asteraceae. Egletes
viscosa Less, pertencente a esta família, cresce em toda a América intertropical. No
Brasil encontra-se distribuída em todo o território com predominância da região
nordeste onde apresenta largo uso popular; é a única erva silvestre comumente
encontrada às margens das lagoas, açudes e cursos d’água (SOUZA, 1998).
Descrição Botânica:
Pequena erva silvestre, amarga, aromática, anual de folhas pinatífidas de 2 a
5 cm de comprimento no ápice dos ramos. Invólucro largo campanulado, brácteas
pilosas, lanceoladas e agudas. Coroa alva lingulada, lanceolada aguda, aquênio
quadrangular de ápice dentado. Os capítulos florais, que são utilizados para
preparação de chás, aparecem de um a três meses depois do ressurgimento da
planta. Quando totalmente desenvolvidos são globoides e medem de três a seis
milímetros de diâmetro e apresentam um anel externo de pequenas pétalas
esbranquiçadas (língulas) e uma parte central amarela (FIGURA 2).
49
Fonte: Acervo do professor Edilbreto Rocha Silveira
FIGURA 2. Parte aérea de Egletes viscosa (macela).
Cultivo:
Para cultivá-la, as sementes devem ser deixadas, inicialmente, por um
período de quatro a seis semanas, imerso em água, para quebra da dormência, e
então semeado.
Material Vegetal Usado:
São utilizados os capítulos florais (conjunto de flores), também conhecidos
como cabecinhas, sendo facilmente encontrados no mercado (MATOS, 1990).
Esses capítulos florais são amplamente utilizados pela população brasileira na forma
de chás preparados na hora do uso ou de tinturas (MATOS, 2000).
O chá é preparado na ocasião do uso, na proporção de 1 a 2g (uma colher
das de chá) para uma xícara de água fervente (MATOS, 1998).
50
A tintura é preparada com 20 gramas de capítulos florais em 1000ml de álcool
e usada na forma de quarenta gotas diluídas em água com açúcar (MATOS, 2000).
Possui ação preventiva na gastrite desenvolvida por abuso de bebidas e
alimentos na dose de uma a duas xícaras de chá ou 30 a 40 gotas da tintura diluídas
em água antes dos exageros alimentares. Para aliviar os sintomas da enxaqueca,
dispepsia, azia, indigestão e diarréia, usa-se a mesma dose, que pode ser repetida
até três vezes ao dia (MATOS, 2000).
Componentes Químicos Principais
Egletes viscosa Less vem sendo sujeito de estudos químicos farmacológicos
realizados na UFC há mais de uma década. A composição do óleo essencial foi
determinada (CRAVEIRO, 1992), bem como a fração não volátil, rica em diterpenos
furânicos e um flavonóide, a ternatina.
O estudo fitoquímico da planta realizado no Departamento de Química
Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará revelou a presença de
componentes voláteis: o óleo essencial isolado da macela mostrou a presença do o
β-pineno e do acetato de trans-pinocarveíla como os componentes mais abundantes
(CUNHA, 2000). Também foram isolados componentes não voláteis: ácido
centipédico (componente majoritário) e lactona do ácido hawtriwaico que são
diterpenos furânicos. Do extrato etanólico foi retirado um flavonóide, a 5,4’- dihidroxi-
3,7,8,3’-tetrametoxiflavona, designada comumente de ternatina.
Usos Medicinais:
Os capítulos florais são obtidos de forma extrativista e comercializados para
uso no tratamento caseiro de problemas digestivos e intestinais, cólicas, gases, azia,
má digestão, diarréia e enxaqueca, bem como nos casos de irregularidades
menstruais (LORENZI & MATOS, 2002).
51
Estudos farmacológicos:
Vários estudos farmacológicos vêm sendo desenvolvidos com os
componentes ativos principais da macela. Uma variedade de atividades biológicas já
foi identificada para a Lactona do Ácido Hawtriwaico, para o Ácido Centipédico, para
a Ternatina e para o óleo essencial de Egletes viscosa.
Nos estudos farmacológicos experimentais a ternatina apresentou atividade
hepatoprotetora em modelos de hepatotoxicidade induzidos por CCl4 e Aflatoxina B1
(RAO, 1994, SOUZA, 1999), ação inibidora da motilidade e secreção intestinal assim
como atividade antidiarreica (RAO, 1997), atividade anti-anafilática e anti-
inflamatória (SOUZA, 1992); atividade esta ligada a inibição da migração neutrofílica
e modulação da ação dos macrófagos (RAO, 2003). Além de ação antitrombótica
(SOUZA, 1994) e agindo ainda na uroproteção, inibindo a cistite hemorrágica
induzida por ciclofosfamida (VIEIRA, 2004). De acordo com os protocolos da NCI, a
ternatina também apresenta moderada atividade contra o HIV (Lima, 1996),
possuindo também atividade antiproliferativa de células humanas in vitro (PESSOA,
2000).
O óleo essencial possui atividade antibacteriana contra cepas resistentes de
Staphylococcus aureus in vitro, também foi demonstrada atividade antinociceptiva
em modelos de contorções abdominais e formalina e anticonvulsivante (SOUZA,
1998).
O Ácido centipédico e a Lactona do Ácido Hawtriwaico possuem ação
gastroprotetora em modelos de úlcera induzidas por etanol e indometacina e seus
mecanismos de ação demonstraram ter participação do óxido nítrico,
prostaglandinas e abertura de canais de potássio-ATP-dependente (GUEDES,
2002). Os diterpenos têm ainda atividade antinociceptiva (GUEDES, 2002), assim
52
como atividade relaxante em jejuno isolado de rato nas contrações induzidas por
acetilcolina e serotonina (SIMÕES, 1989). Verificou-se ainda que a Lactona é capaz
de inibir inflamação neurogênica pelo envolvimento de receptores TRPV1
capsaicina-dependentes, adenosina endógena e canais de potássio dependentes de
ATP (MELO, 2006). Outros estudos demonstraram a atividade antiinflamatória dos
diterpenos em dermatite induzida por TPA em camundongos (CALOU, 2008) e ação
antiproliferativa de linhagens de células cancerosas humanas in vitro com inibição da
síntese de DNA (PESSOA, 2000).
Outro diterpeno isolado de Egletes viscosa Less , Ácido Centipédico,
caracterizado como sendo de cadeia acíclica. Simões (1989) mostrou a atividade
relaxante do Ácido Centipédico em jejuno isolado de rato, nas contrações induzidas
por Ach e 5-HT. Dentre outras propriedades farmacológicas desse diterpeno
encontramos a gastroproteção (GUEDES, 2002), analgésica (MELO, 2006) e
antiinflamatória (CALOU, 2008).
Estudos toxicológicos:
Estudos pré-clínicos já foram realizados com um componente isolado da
planta, a ternatina. Esse flavonóide, apresentando a mesma característica do seu
grupo, demonstrou possuir baixa toxicidade (HAVSTEEN, 1983), mesmo quando
administrada em doses 20 vezes maior que a dose terapêutica, não provocou
nenhuma mudança comportamental, fisiológica ou morfológica, não sendo possível
nem mesmo se determinar a DL50. O tratamento em longo prazo com doses
terapêuticas também não provocou nenhuma alteração biológica, bioquímica,
hematológica ou histológica.
O extrato hidroalcoólico de macela mostrou baixa toxicidade e sua DL50 para
camundongos foi determinada em 2500mg/Kg. Também foi feita a toxicidade
53
subcrônica não havendo alteração dos parâmetros bioquímicos e histológicos em
ratos tratados por 30 dias com o extrato (Guedes, 2002).
A Lactona do Ácido Hawtriwaico demonstrou atividade antiproliferativa de
linhagens de células humanas in vitro com inibição da síntese de DNA (PESSOA,
2000).
54
2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
2.1. JUSTIFICATIVA
A doença ulcerosa péptica, as gastroenteropatias associadas às drogas
antiinflamatórias não-esteroidais e o estilo de vida associado ao álcool e fumo
representam alguns dos principais problemas que afetam negativamente a qualidade
de vida. Atualmente, os fármacos com ação anti-secretória gástrica, como os
inibidores da bomba de prótons, representam uma das principais opções na terapia
destas patologias (GISBERT et al., 2005), porém o uso prolongado destes agentes
está associado a incidência de fraturas e câncer (YANG et al., 2006; LEEDHAM et
al., 2007).
Gastroenteropatias associadas à AINES continuam sendo um grave problema
clínico que não foi solucionado com a introdução dos inibidores seletivos da COX-2.
A indicação do tratamento com esses fármacos está em declínio devido aos efeitos
colaterais cardíacos de certos inibidores da COX-2 (JUGDUTT et al., 2007). Alguns
agentes quimioterápicos como cisplatina e bifosfonatos como o alendronato podem
induzir à dispepsia gástrica (NELSON et al., 1993, GRAHAM, 2002).
Nos dias atuais há uma busca ativa para descobrir novos e alternativos
agentes com utilidade no combate à dispepsia gástrica e à úlcera péptica. Assim
sendo, ainda existe um vasto campo para pesquisa de novos agentes
farmacológicos úteis no combate à doença ulcerosa péptica e às gastroenteropatias
associadas aos AINES.
A utilização das plantas como medicamento para o tratamento das
enfermidades que acometem a espécie humana, remonta à idade antiga (CALIXTO,
2001). São inúmeros os exemplos de medicamentos que foram desenvolvidos, direta
ou indiretamente, a partir de fontes naturais, especialmente de plantas
55
(FARNSWORTH & BINGEL, 1997; CALIXTO, 2001; NEWMAN et al., 2003; BOLDI,
2004).
Diterpenos formam uma grande classe de metabólitos secundários isolados
de plantas que possuem um amplo espectro de perfil farmacológico, que incluem
anti-inflamatório antitumoral, antimicrobiana, antiespasmódica, citotóxicos e
propriedades gastroprotetoras (AMBROSIO et. al, 2006; FUJITA et al. 1988).
Em várias partes do Brasil, o chá ou decocção preparados a partir de
capítulos florais de Egletes viscosa (Asteraceae) são usados como remédio popular
para o tratamento de problemas digestivos e intestinais (CORRÊA, 1984).
Investigações farmacológicas identificaram as propriedades anti-inflamatória,
hepatoprotetora, antidiarreica e gastroprotetora de ternatina (RAO et al., 1997;
SOUZA et al., 1999) e efeitos anti-inflamatório e antinociceptivo de tanabalin (MELO
et al., 2006), substâncias isoladas de Egletes viscosa.
Em estudo anterior, foram estabelecidos os efeitos gastroprotetores do Ácido
centipédico e tanabolin em lesões gástricas induzidas por indometacina e etanol,
validando o uso tradicional da Egletes Viscosa (GUEDES et al., 2002). No entanto,
havia necessidade de desvendar os mecanismos que envolvem a proteção
gastrintestinal da planta tão disseminada popularmente.
O alto custo dos medicamentos é um fator de fundamental importância, que
muitas vezes limita a utilização destes produtos e que justifica a busca por
novas alternativas eficazes e seguras com plantas medicinais para o tratamento das
dispepsias e outras lesões gastrintestinais.
Aliado ao que já foi descrito, deve-se salientar que diversas drogas (princípios
ativos) que hoje se encontram disponíveis no mercado farmacêutico, vieram
56
diretamente de plantas ou as mesmas serviram de doadoras de moléculas para
síntese de novas drogas.
Dessa maneira, a importância deste estudo, se justifica na investigação da
ação gastroenteroprotetora do Ácido Centipédico, tendo como base suas atividades
farmacológicas já descritas, em modelos animais de úlcera gastrintestinal, bem
como os possíveis mecanismos de ação envolvidos.
57
2.2. OBJETIVOS
GERAL
Prosseguindo com os estudos acerca do potencial protetor do Ácido
centipédico sobre o trato gastrintestinal, esse trabalho teve por objetivo investigar a
ação gastroenteroprotetora do Ácido Centipédico em modelos agudos e crônicos de
lesão gastrintestinal em animais.
ESPECÍFICOS
Em camundongos:
� Estudar a atividade gastroprotetora do Ácido Centipédico no modelo agudo de
lesão gástrica induzida por etanol (participação do receptor TRPV1, do óxido
nítrico, das prostaglandinas e dos canais de potássio ATP - dependentes);
verificando sua ação anti-oxidante sobre a produção dos grupos sulfidrílicos
não-protéicos (NP-SH) gástricos; assim como no nível de peroxidação
lipídica, através da dosagem de malonildealdeído e superóxido dismutase na
mucosa gástrica;
� Avaliar a ação do Ácido Centipédico sobre o nível de produção de muco na
mucosa gástrica em modelo de lesão gástrica induzida por etanol;
� Verificar a atividade gastroprotetora do Ácido Centipédico no modelo agudo
de lesão gástrica induzida por etanol acidificado e analisar a participação dos
receptores α2-adrenérgicos e opioides;
� Identificar a DL50 do ácido centipédico para camundongos.
Em ratos:
� Estudar o efeito do Ácido Centipédico sobre a secreção gástrica, utilizando o
modelo de ligadura do piloro;
58
� Verificar a ação do Ácido centipédico sobre o esvaziamento gástrico.
� Avaliar a ação cicatrizante do Ácido Centipédico em modelo de úlcera crônica
induzida por ácido acético.
� Verificar o potencial efeito protetor do Ácido Centipédico contra lesões
intestinais induzidas por indometacina, analisando parâmetros de estresse
oxidativo (MDA, NP-SH, Mieloperoxidase, Catalase) e alterações histológicas,
além de sua ação sobre a função renal e hepática.
Em Helicobacter pylori:
� Estudar a ação do Ácido Centipédico sobre Helicobacter pylori;
Em cultura de células intestinais (IEC-6):
� Estudar a ação do Ácido Centipédico e sua associação com indometacina
sobre a proliferação e migração celular de células intestinais (IEC-6).
59
3. MATERIAIS
3.1. MATERIAL BOTÂNICO
O diterpeno Ácido Centipédico foi extraído dos capítulos florais da macela que
foram cultivados no Departamento de Fitotecnia do Centro de Ciências Agrárias da
UFC. As sementes obtidas para o cultivo foram adquiridas no mercado herbário de
Fortaleza. A extração foi realizada no Departamento de Química Orgânica e
Inorgânica da UFC.
3.2. ANIMAIS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados camundongos albinos (Mus musculus), variedade Swiss
Webster, adultos, machos, pesando entre 25-30 g e ratos albinos (Rattus
norvegicus), variedade Wistar, adultos, machos, pesando entre 180-200 g,
provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da
Universidade Federal do Ceará. Os animais foram acondicionados em caixas de
polipropileno, à temperatura ambiente de 22-24 oC, com ciclos de claro/escuro de 12
em 12 h, recebendo ração padrão e água “ad libitum”. Os animais foram colocados
em jejum de sólidos 18h antes da realização dos experimentos em caixas sem
maravalha.
3.2.1. ASPECTOS ÉTICOS
Os protocolos utilizados neste trabalho possuem aprovação do Comitê de
Ética em Pesquisa Animal (CEPA) do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará (Protocolo nº40/07).
60
3.3. DROGAS E REAGENTES
PRODUTO ORIGEM
Ácido clorídrico P.A. Merck, Brasil
Ácido Etilenodiaminotetraacético sal dissódico (EDTA) Proanalysi, Brasil
Ácido tricloroacético P.A. Sigma, USA
Ácido trinitrobenzeno sulfônico - TNB Sigma, USA
Álcool etílico absoluto P.A. Synth, Brasil
Capsaicina Sigma, USA
Capsazepina Sigma, USA
Carboximetilcelulose Merck, Brasil
Celecoxibe (Celebra®) Pfizer
Cimetidina (Tagamet®) SmithKline Beecham, Brasil
Ciproeptadina (Periatin®) Prodome, Brasil
Cloreto de sódio Vetec, Brasil
Dexametasona Schering-Plough
Diazóxido Sigma, USA
Dimetilfulfóxido (DMSO) Reagen, Brasil
Ester metil NG nitro-L-arginina (L-NAME) Sigma, USA
Éter etílico Labsynth, Brasil
Fenolftaleína Reagen, Brasil
61
Formaldeído P.A. Sigma, USA
Glibenclamida Sigma, USA
Glicose Vetec, Brasil
Glutation reduzido Sigma, USA
Hidróxido de sódio Reagen, Brasil
Indometacina (Indocid®) Merck, Brasil
Lansoprazol (Prazol®) Medley, Brasil
L-arginina Sigma, Brasil
N-Acetilcisteína (Fluimucil®) Zambon, Brasil
Omeprezol Sigma, Brasil
Ranitidina (Label®) Achè
Sulfato de atropina Sigma, Brasil
Sulfato de Morfina (Dimorf®) Cristália, Brasil
Tween 80 Sigma, USA
Vermelho de fenol Reagen, Brasil
62
3.4. EQUIPAMENTOS
EQUIPAMENTO ORIGEM
Balança para animais (mod. MF-6) Filizola, Brasil
Balança analítica (mod. AX-200) Shimadzu, Japão
Centrifuga refrigerada, modelo CT 5500 DR CIENTEC®, Brasil
Freezer –75ºC Legaci System®
Lavadora ultrasônica, modelo USC 700 UNIQUE®
Material cirúrgico ---
Pipetas automáticas Jencons®
Seringas plásticas B-D-Plastipak
Vidrarias Pirex, U.S.A.
Flow Cytometer COULTER® EPICS® XL-MCL™
63
4. MÉTODOS
4.1. OBTENÇÃO DO ÁCIDO CENTIPÉDICO.
O isolamento e caracterização do Ácido Centipédico foi realizada pelo Prof. Dr.
Edilberto Rocha Silveira do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da
Universidade Federal do Ceará.
Capítulos florais (2.580 g) de E. viscosa, adquiridas no Departamento de
Fitotecnia da UFC , previamente secos e moídos, foram submetidos a extração com
clorofórmio. Após filtração e destilação sob pressão reduzida, 200,86 g (7,79 %) de
extrato foi obtido e denominado EVBFLC.
EVBFLC foi adsorvido em 300 g de sílica gel, pulverizado e acondicionado
sobre uma camada de 50 g de gel de sílica em funil cilíndrico. Após eluição com
hexano seguido de clorofórmio, acetato de etila e etanol, as frações foram separas
conforme a Tabela 1.
Cerca de 56,87 g de EVBFLC-H foram dissolvidos em 100 mL de etanol e
acondicionados em balão de 1000 mL, junto com 300 mL de NH4OH sob agitação.
Após 24 horas 700 mL de água destilada foi adicionado à mistura. A retirada da
gordura foi extraída com éter de petróleo (5 X 100 mL). A solução aquosa contendo
os sais dos ácidos, foi acidificada com HCl até pH 2 e extraída com diclorometano (6
x 100mL). A fase orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro e o solvente
destilado sob pressão reduzida, obtendo-se 30,75 g de um óleo amarelo claro
denominado EVBFLC-1. Com rendimento de 1,19%.
64
EVBFLC-1 foi caracterizado como sendo Ácido Centipédico (Fig. 3).
FIGURA 3. Estrutura química do Ácido Centipédico.
TABELA 1. Cromatografia em Coluna de sílica de EVBFLC.
Eluente
Volume
(mL)
Frações
Aspecto
Peso (g)
Hexano
2.000
EVBFLC-H
Graxa verde escuro
91,87
Clorofórmio 2.800 EVBFLC-C Graxa verde escuro 66,79
Acetato de etila 2.000 EVBFLC-A Graxa marrom escuro 38,94
Etanol 800 EVBFLC-E Graxa amarelo escuro 3,62
Total: 201,22
Rendimento: 100,18 %
65
Isolamento do Ácido Centipédico
Capítulos Florais
1. Moagem 2. Extração com CHCl3
Extrato Clorofórmico
Cromatografia filtrante em sílica Fração Fração Fração Fração Hexânica Acetato Metanólica Clorofórmica de etila Extração com NH4OH Fase Fase Aquosa Orgânica 1. Acidificação com HCl (pH 2) 2. Extração com CH2Cl2
Fase Fase Aquosa Orgânica 1. Na2SO4 (anidro) 2. Destilação Ácido Centipédico FIGURA 4. Método de extração do Ácido Centipédico .
66
4.2. LESÃO GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL.
A atividade antiulcerogênica do Ácido Centipédico foi primeiramente avaliada
no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em camundongos (ROBERT et al.,
1979).
Camundongos, em jejum de sólidos de 18h, foram divididos em grupos de 8
animais, tratados com veículo (3% de Tween 80 em água destilada, 10 mL/kg, v.o.),
Ácido Centipédico (AC -12,5, 25, 50 e 100mg/kg; v.o.) ou N-acetilcisteína (NAC - 300
mg/kg, i.p.). Uma hora após os tratamentos com veículo e Ácido Centipédico, e 30
minutos após o tratamento com N-acetilcisteína, os animais receberam 0,2 mL de
etanol 96% via oral.
Decorridos 30 minutos, os animais foram sacrificados; os estômagos
retirados, abertos pela grande curvatura, lavados com solução salina 0,9 % e
comprimidos entre dois vidros de relógio para uma melhor visualização. A área de
lesão gástrica glandular foi determinada com o auxílio de um programa de
planimetria computadorizada (ImageJ). Os dados foram expressos em termos de
porcentagem de área lesada em relação à área total do corpo gástrico.
4.2.1. ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DOS NEURÔNIOS AFERENTES
PRIMÁRIOS SENSÍVEIS À CAPSAICINA NA GASTROPROTEÇÃO DO AC.
Camundongos divididos em grupos de 8 animais foram pré-tratados com
veículo (3% de Tween 80 em água destilada, 10 mL/kg, v.o.), AC (50 mg/kg; v.o.) 1h
antes ou capsaicina (5 mg/kg; i.p.) 30 minutos antes de receberem etanol 96% (0,2
mL/animal; v.o.).
A participação dos neurônios sensoriais sensíveis à capsaicina foi investigado
segundo MATSUDA et al. (1999). Foi administrado aos animais capsazepina (5
67
mg/kg; i.p.) 30 min antes do AC (50 mg/kg; v.o.) ou capsaicina (5 mg/kg; i.p.). Após
30 min. da administração da capsaicina e 1 h após a administração do AC os
animais receberam etanol 96% (0,2 mL/animal; v.o.).
Os animais foram sacrificados 30 minutos após a administração do etanol, e a
área de lesão gástrica glandular determinada pelo método descrito anteriormente em
4.2.
4.2.2. ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DO ÓXIDO NÍTRICO NA
GASTROPROTEÇÃO DO AC.
Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais e pré-tratados com
veículo (3% de Tween 80 em água destilada, 10 mL/kg, v.o.), AC (50 mg/kg; v.o.) 1 h
antes ou L-arginina (450 mg/kg; i.p.) 30 minutos antes de receberem etanol 96% (0,2
mL/animal; v.o.).
O envolvimento do óxido nítrico foi avaliado pela administração de L-NAME
(20 mg/kg; i.p.) 30 min antes do AC (50 mg/kg; v.o.) ou L-arginina (450 mg/kg; i.p.).
Após 30 min da administração da L-arginina e 1 h após a administração do AC os
animais receberam etanol 96% (0,2 mL/animal; v.o.) (MATSUDA et al., 1999).
Decorridos 30 minutos da administração do etanol, os animais foram
sacrificados; os estômagos foram retirados e a área de lesão gástrica determinada
como descrito anteriormente em 4.2.
4.2.3. ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DAS PROSTAGLANDINAS NA
GASTROPROTEÇÃO DO AC.
Camundongos divididos em grupos de 8 animais foram pré-tratados com
veículo (3% de Tween 80 em água destilada, 10 mL/kg, v.o.), AC (50 mg/kg; v.o.) ou
68
misoprostol (0,016 mg/kg, v.o.) 1h antes de receberem etanol 96% (0,2 mL/animal;
v.o.).
A participação das prostaglandinas foi investigada através da administração
de indometacina (10 mg/kg; v.o.) 2 horas antes do AC (50 mg/kg; v.o.) ou
misoprostol (0,016 mg/kg, v.o.). Após 1 h da administração do AC ou misoprostol os
animais receberam etanol 96% (0,2 mL/animal; v.o.).
Os animais foram sacrificados 30 minutos após a administração do etanol, e a
área de lesão gástrica glandular determinada de acordo com o método descrito
previamente em 4.2.
4.2.4. ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DOS CANAIS DE POTÁSSIO ATP-
DEPENDENTES NA GASTROPROTEÇÃO DO AC.
Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais e pré-tratados com
veículo (3% de Tween 80 em água destilada, 10 mL/kg, v.o.), AC (50 mg/kg; v.o.) 1h
antes ou diazóxido (3 mg/kg; i.p.) 30 minutos antes de receberem etanol 96% (0,2
mL/animal; v.o.).
O papel dos canais de K+ ATP-dependentes foi investigado pela
administração de glibenclamida (5 mg/kg; i.p.) 30 min antes do AC (50 mg/kg; v.o.)
ou diazóxido (3 mg/kg; i.p.). Após 30 min da administração do diazóxido e 1 h após a
administração do AC os animais receberam etanol 96% (0,2 mL/animal; v.o.)
(RAHGOZAR et al., 2001)
Após 30 min da administração do etanol, os animais foram sacrificados e a
área de lesão gástrica glandular determinada através do método descrito
anteriormente em 4.2.
69
4.2.5. ESTUDO DA AÇÃO DO ÁCIDO CENTIPÉDICO SOBRE OS GRUPOS
SULFIDRILAS NÃO PROTEICOS (NP-SH).
Grupos de 8 camundongos cada, em jejum de sólidos de 18 horas, foram pré-
tratados com AC (50 mg/kg; v.o.), NAC (300 mg/kg, i.p.) ou veículo (3% de Tween
80 em salina 0,9%, 10 mL/kg). Uma hora após os tratamentos com veículo e AC, e
30 min após o tratamento com NAC, os animais receberam 0,2 mL de etanol 96%
por via oral. Um grupo controle normal, que recebeu apenas solução salina, e não
etanol, foi incluído.
Trinta minutos após a administração do etanol, os animais foram sacrificados
e um segmento glandular de cada estômago foi retirado, pesado e homogeneizado
em EDTA gelado (0,02 M, pH 8,9), obtendo-se um homogenato a 10%. Uma
alíquota de 4 mL de cada amostra foi retirada e adicionado 3,2 mL de água destilada
e 0,8 mL de ácido tricloroacético - TCA 50% em solução aquosa. Em seguida, os
tubos de ensaio contendo a mistura foram centrifugados a 3000 rpm por 15 minutos.
Um volume de 2 mL foi retirado do sobrenadante e adicionado 4 mL de Tris (0,4M,
pH 8,9) e 0,1 mL de DTNB (0,01M).
A absorbância foi medida em de 5 minutos a 412 nm. A concentração de NP-
SH foi calculada através de uma curva de calibração de glutationa reduzida (GSH) e
os resultados expressos em µg de NP-SH/g de tecido (SEDLACK & LINDSAY,
1968).
4.2.6 AVALIAÇÃO DA PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA:
4.2.6.1. DOSAGEM DE MALONILDEALDEÍDO (MDA).
A atividade antioxidante foi medida pela dosagem das substâncias reativas
com o ácido Tiobarbitúrico (TBA), um indicador de peroxidação lipídica (AGAR et
70
al.,1999). Nesta reação, duas moléculas de TBA reagem estequiometricamente com
uma molécula de MDA para formar uma solução de cor rosa, que tem absorbância
máxima, em pH ácido, de 532 a 535 nm.
Grupos de 8 camundongos cada, em jejum de sólidos de 18 horas, foram pré-
tratados com AC (50 mg/kg; v.o.), NAC (300 mg/kg, i.p.) ou veículo (3% de Tween
80 em salina 0,9%, 10 mL/kg). Uma hora após os tratamentos com veículo e AC, e
30 min após o tratamento com NAC, os animais receberam 0,2 mL de etanol 96%
por via oral. Um grupo controle normal, que recebeu apenas solução salina, e não
etanol, foi incluído.
Trinta minutos após a administração do etanol, os animais foram sacrificados
e um segmento glandular de cada estômago foi retirado, pesado e homogeneizado
em tampão KCl 10% (pH 7.4) numa concentração de 1 g de peso molhado do
estômago para 60 mL de tampão. 250 µl do homogenato foram introduzidos em
tubos de ensaio e incubados em banho de água a temperatura de 37ºC por 60
minutos. Após a incubação, 400 µl de ácido perclórico 35% foi adicionado, a fim de
parar a peroxidação, os tubos foram agitados e centrifugados a 14000 rpm por 10
minutos. Em seguida 600µl do sobrenadante foram adicionados a 200µl de ácido
tiobarbitúrico 1,2%. A mistura foi levada ao banho de água por 30 minutos a uma
temperatura variável de 95 - 100ºC. Em seguida a solução foi retirada e colocada
para esfriar a temperatura ambiente. A absorbância das amostras foi realizada a um
comprimento de onda de 532 nm. A curva padrão foi obtida por diluições em série
(1; 0,5; 0,25; 0,12; 0,06; 0,03 mM) utilizando uma solução de MDA. A concentração
de MDA foi expressa em nmoles/g de tecido (AGAR et al., 1999).
71
4.2.6.2. DOSAGEM DE SUPERÓXIDODISMUTASE (SOD).
A dosagem de SOD foi baseada na inibição da formação do nitrito a partir do
hidroxilamônio na presença de um gerador de 02 (ELSTNER & HEUPEL, 1976).
Grupos de 8 camundongos cada, em jejum de sólidos de 18 horas, foram pré-
tratados com AC (50 mg/kg; v.o.), NAC (300 mg/kg, i.p.) ou veículo (3% de Tween
80 em salina 0,9%, 10 mL/kg). Uma hora após os tratamentos com veículo e AC, e
30 min o tratamento com NAC, os animais receberam 0,2 mL de etanol 96% por via
oral. Um grupo controle normal, que recebeu apenas solução salina, e não etanol, foi
incluído.
Trinta minutos após a administração do etanol, os animais foram sacrificados
e um segmento glandular de cada estômago foi retirado, pesado e homogeneizado
em tampão fosfato 65mM, pH 7,8 (1 mL). À amostra (sobrenadante do homogenato
tecidual a 10% com tampão fosfato) (0,5 mL) foi adicionado Xantina 1,5 µmol (0,1
mL); Cloreto de hidroxilamônio 1µmol (0,1 mL); Xantina oxidase (40 µg proteína) (0,3
mL). Após a adição de xantina oxidase, a mistura foi colocada em banho de água
fria (25° C), durante 20 min. 0,5 mL da mistura foi retirada e adicionada a Ácido
sulfanílico 0,01 mM (0,75 mL); α- naftilamina 0,001mM (0,75 mL). A densidade
óptica foi lida em 530 nm (usar como branco a água no lugar da mistura). SOD
(Sigma) foi utilizada como padrão, que adicionado na mistura de reação produz uma
inibição na formação de nitrito. A curva de atividade unidade vs percentagem de
inibição foi medida com quantidades conhecidas de SOD purificada que contem
3600 unidades/mg de proteína. Aproximadamente 1/5 da unidade de atividade
produzirão inibição de 50% da oxidação do cloreto de hidroxilamônio. A quantidade
da atividade da SOD das amostras foi calculada usando esta curva.
72
4.2.7. DETERMINAÇÃO DE MUCO DA MUCOSA GÁSTRICA.
Lesões gástricas foram induzidas por etanol, e, para esse ensaio, foram
incluídos os grupos veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), AC
(50mg/kg v.o.) e misoprostol (0,016 mg/kg, v.o.). Uma parte da mucosa gástrica
(exatamente pesada) foi incubada em 10 ml de solução de Alcian Blue 0,1%, onde
permaneceu corando por 2 horas. O excesso de Alcian Blue foi removido com
sacarose 0,25 mol/L (duas vezes lavadas sucessivamente, a primeira por 15 min e a
segunda durante 45 min). O corante complexado com o muco da parede glandular
foi extraído com 5 ml de cloreto de magnésio (0,5 mol/l), agitando-se
intermitentemente, cada segmento, por 1 minuto a cada 30 min durante 2 h. Foram
misturados 3 ml da solução sobrenadante azul obtida com 3 ml de éter etílico e
agitou-se vigorosamente até a formação de uma emulsão. Centrifugou-se a 3600
rpm x 10 min para separar a fase aquosa, descartando-se o resíduo. A concentração
de Alcian Blue nas amostras, foi determinada por leitura espectrofotométrica a 598
nm.
A concentração de Alcian Blue ligado ao muco foi determinada por interpolação
na curva padrão do corante e expressa em µg de Alcian Blue/ml/g de tecido.
73
4.3. LESÃO GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL ACIDIFICADO.
Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais cada, em jejum de
sólidos de 18h, e foram pré-tratados, via oral, com veículo (3% de Tween 80 em
água destilada, 10 mL/kg), Ácido Centipédico (AC - 25, 50 e 100 mg/kg; v.o.) ou
lansoprazol (LANZO - 30 mg/kg, v.o.). Uma hora após os tratamentos os animais
receberam 0,2 mL de uma solução 0,3M de HCl em etanol 60% (EtOH/HCl) e após
1h foram sacrificados (MIZUI et al., 1987). Os estômagos foram retirados e a área de
lesão gástrica glandular determinada por planimetria e os dados expressos em
termos de percentagem. A associação do AC com LANZO (30mg/kg, v.o.) foi
realizada para verificar uma possível potenciação entreo efeito das drogas.
4.3.1. ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DOS RECEPTORES OPIÓIDES NA
GASTROPROTEÇÃO DE AC.
Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais e pré-tratados com
veículo (3% de Tween 80 em água destilada, 10 mL/kg, v.o.), AC (50 mg/kg; v.o.) 1h
antes, ou morfina (5 mg/kg; s.c.) 30 min antes de receberem EtOH/HCl (0,2
mL/animal; v.o.).
O papel dos receptores opioides foi investigado pela administração de
naloxona (2 mg/kg; i.p.) 15 min antes do AC (50 mg/kg; v.o.) ou morfina (5 mg/kg;
s.c.). Após 30 min da administração da morfina e 1 h após a administração do AC os
animais receberam EtOH/HCl (0,2 mL/animal; v.o.) (GYIRES et al., 2000).
Após 1h da administração do etanol acidificado, os animais foram sacrificados
e a área de lesão gástrica glandular determinada através do método descrito
anteriormente para o modelo de úlcera por etanol (4.2.).
74
4.3.2. ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DOS RECEPTORES α2-adrenérgicos NA
GASTROPROTEÇÃO DO AC.
Camundongos foram divididos em grupos de 8 animais e pré-tratados com
veículo (3% de Tween 80 em água destilada, 10 mL/kg, v.o.), AC (50 mg/kg; v.o.) ou
clonidina (0,05 mg/kg; v.o.) 1h antes de receberem EtOH/HCl (0,2 mL/animal; v.o.).
O papel dos receptores α2-adrenérgicos foi investigado pela administração de
ioimbina (2 mg/kg; s.c) 20 min antes do AC (50 mg/kg; v.o.) ou clonidina (0,05
mg/kg; v.o.). Após 1 h da administração da clonidina e do AC os animais receberam
EtOH/HCl (0,2 mL/animal; v.o.) (GYIRES et al., 2000)
Após 1h da administração do EtOH/HCl, os animais foram sacrificados e a
área de lesão gástrica glandular determinada através do método descrito
anteriormente para o modelo de úlcera por etanol (4.2.).
75
4.4. ATIVIDADE ANTISECRETÓRIA GÁSTRICA.
Ratos em jejum de 18 horas, com livre acesso à solução de glicose 5 %,
foram anestesiados com xilazina (10 mg/kg, i.p.) e ketamina (90 mg/kg, i.p.), fixados
em decúbito dorsal e realizada a tricotomia da parede abdominal. Através de uma
incisão de 2 cm na região epigástrica, o estômago foi localizado e o piloro amarrado.
Administrou-se o tratamento, AC (50 mg/kg), cimetidina (100 mg/kg) ou veículo (3%
de Tween 80 em salina 0,9%), todos por via intraduodenal, em um volume de 2,5
mL/kg, imediatamente após a ligadura do piloro. Foram suturadas a parede do
abdômen e a pele. Transcorridas 4 horas da cirurgia, os animais foram sacrificados,
a cárdia foi amarrada para evitar perda do material secretado e o estômago foi
removido. Os estômagos foram lavados com água destilada, secos com papel de
filtro e mantidos em béquer sobre placa de gelo. Seccionou-se o estômago ao longo
da grande curvatura, e o suco gástrico foi recolhido em tubos de ensaio imersos em
gelo. Os tubos foram centrifugados a 3500 rpm por 30 min. O sobrenadante do suco
gástrico foi transferido para uma proveta e o volume foi verificado. A acidez total foi
determinada através de titulação com NaOH 0,1 N utilizado-se fenolftaleína 2%
como indicador ácido-básico (REITMAN et al., 1970).
76
4.5. ESVAZIAMENTO GÁSTRICO.
Grupos de 6 ratos cada, em jejum de sólidos de 18 h, foram pré-tratados com
veículo (3% de Tween 80 em água destilada, 10 mL/kg, v.o.), Ácido Centipédico (50
mg/kg, v.o.) ou atropina (3 mg/kg, v.o.). Decorridos 45 minutos dos tratamentos os
animais receberam vermelho de fenol (0,5 mg/kg). Após 15 min da administração
do vermelho de fenol os animais foram sacrificados, o piloro e a cárdia amarrados e
os estômagos removidos, lavados externamente, abertos ao longo da grande
curvatura e o conteúdo gástrico coletado. A superfície interna do estômago foi
lavada utilizando 7 mL de água destilada. Em seguida, o volume obtido foi
centrifugado a 1500 rpm por 15 minutos. A 1 mL do sobrenadante foi adicionado 1
mL de NaOH 1N. As amostras foram levadas ao espectrofotômetro e as
absorbâncias medidas a 560 nm.
Os resultados foram interpolados em uma curva padrão de vermelho de fenol
(25; 12,5; 6,25; 3,215 µg/mL em NaOH 1N) usada para calcular a concentração do
corante retido no estômago (GUPTA & BRANS, 1978). Os resultados foram
expressos em µg de vermelho de fenol retidos no estômago.
77
4.6. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE AC SOBRE HELICOBACTER PYLORI.
Foram utilizadas no estudo uma cepa padrão (TX30A) proveniente da
Universidade de Tennesse, USA, cedida pelo Dr. Atherton . Testes de identificação
foram realizados para a verificação de características morfológicas, bioquímicas e de
crescimento. A microscopia da colônia foi verificada pela coloração através do
método de Gram. Os testes bioquímicos utilizados na identificação das cepas foram
oxidade, catalase e urease. O crescimento sob condições de microaerofilia também
foi avaliado.
Foi realizado um screening preliminar do Ácido Centipédico, testando-o frente
à linhagem 26695 de H. pylori. A suspensão bacteriana foi inoculada em meio BHI
ágar (brain-heart infusion) suplementado com 10 % de sangue de carneiro
desfibrinado e 0,25 % de extrato de levedura. 10 µl de AC (7.9 mM; 15.8 mM e 31.6
mM) foi adicionado em placa previamente inoculada. DMSO 0,5% em água destilada
(veículo) também foi testado para avaliar a possível interferência do veículo. A placa
foi incubada nas condições de microaerobiose a 37° C por 72 h. Após este período
foram feitas as medições dos halos de inibição. Os ensaios foram realizados em
duplicata (CLSI, 2003).
78
4.7. LESÃO GÁSTRICA CRÔNICA INDUZIDA POR ÁCIDO ACÉTICO.
Este método baseia-se no estudo de Takagi et al. (1969), onde se observou
que o ácido acético era capaz de produzir na mucosa gástrica do rato uma lesão
bem definida envolvendo a camada muscular, de cicatrização demorada,
semelhante à úlcera péptica humana.
Grupos de 6 ratos cada, em jejum de sólidos de 18 horas, foram anestesiados
e submetidos à laparotomia abdominal na região epigástrica. Após exposição do
estômago, foi injetada na camada submucosa da porção glandular uma solução de
ácido acético 20% (0,02 mL). O local da injeção foi pressionado com compressa de
solução salina durante aproximadamente 1 minuto para evitar o extravasamento da
solução injetada. O estômago foi lavado cuidadosamente com solução salina e, em
seguida, a parede abdominal foi suturada. Após a recuperação da anestesia, os
grupos de animais foram devidamente mantidos em gaiolas.
Depois de 48h da cirurgia foi iniciado o tratamento dos animais que
receberam por via oral, solução salina, AC (50 mg/Kg), ranitidina (50 mg/Kg) ou
celecoxibe (20 mg/Kg). No 7º ou 14º dia de tratamento os animais foram
sacrificados, seus estômagos retirados, analisados histologicamente e dado escores
de zero a três (0=ausente, 1= leve, 2=moderado, 3=intenso) para os parâmetros de
hemorragia, edema, congestão, esfoliação, infiltrado inflamatório, necrose e
angiogênese. Foi verificada a área lesionada por planimetria, conforme descrito em
4.2.
79
4.8. LESÃO INTESTINAL INDUZIDA POR INDOMETACINA EM RATOS.
Grupos de 7 ratos cada, em jejum de sólidos por 18h, foram pré-tratados com
AC (50 mg/kg, v.o.) ou dexametasona (3 mg/kg, v.o.) duas horas antes da
administração de indometacina (10 mg/kg, v.o.), durante três dias consecutivos. Um
grupo tratado apenas com veículo, por três dias, foi adicionado como controle
normal.
No quarto dia foram retiradas amostras de sangue para a dosagem de uréia e
creatinina, para analisar possível toxicidade renal, e, dosagem de TGO e TGP, para
analisar possíveis danos hepáticos. As dosagens foram realizadas através de kits
segundo instruções de seus fabricantes.
Os animais foram então sacrificados por deslocamento cervical. O abdômen
foi aberto e o intestino delgado foi retirado e lavado com salina para a retirada de
algum resíduo alimentar. O intestino foi aberto pela borda anti-mesentérica e
colocado em um aparato para que as úlceras formadas fossem então contadas em
todos os grupos tratados. Foi contado o número de úlceras menores que 5 mm de
comprimento e o número de úlceras maiores que 5 mm (SOMASUNDARAM et al.,
2002).
Amostras do intestino foram retiradas e homogeneizadas para análise de
parâmetros de estresse oxidativo (MDA que é produto da peroxidação, MPO usada
como indicador de enzima pró-oxidante, NP-SH e Catalase como enzimas de defesa
antioxidante).
Outras amostras foram ainda retiradas para avaliação microscópica das
úlceras (Hematoxilina, Eosina).
Como as metodologias de NP-SH e Malonildealdeido já foram descritas, nos
limitaremos pela descrição apenas da determinação da Catalase e Mieloperoxidase.
80
4.8.1. DOSAGEM DE CATALASE.
A atividade da catalase foi medida de acordo com o método descrito por Aebi,
1974. 20 µL do homogenato intestinal a 5% em tampão fosfato (50 mM, pH 7) foram
adicionados a 2 mL de tampão fosfato de potássio (50 mM, pH 7) contendo H2O2 10
mM. A atividade da catalase foi definida como a quantidade da enzima requerida
para decompor 1 nmol de H2O2 por min, a 25 °C e pH 7. A absorbância foi lida em
espectrofotômetro a 230 nm. Os resultados foram expressos como milimols por
minuto por grama de tecido (mmol/min/g tecido).
4.8.2. DOSAGEM DE MIELOPEROXIDASE (MPO).
Amostras de intestino foram imediatamente congeladas em nitrogênio liquido.
Após o congelamento foram homogeneizadas em solução de Brometo de
hexadeciltrimetilamônio 0,5% (HTAB) em tampão fosfato 50 mM pH 6.0 (1 ml por 50
g do tecido). O homogenato foi submetido a três ciclos de congelamento, 5 min. (-
70° C) e descongelamento (15 s no sonicador). As amostras foram então
centrifugadas a 4000 rpm (4°C) por 15 min. para remover o material insolúvel. A
MPO contida no sobrenadante (0,1ml) foi analisada por espectrofotômetro após a
adição de 2,9 ml de tampão fosfato (50 mM, pH6) contendo 0,16 7mg/ml de
hidrocloreto de θ – dianisidine e 0,0005% de peróxido de hidrogênio. As cinéticas de
mudança na absorbância a 470 nm foram medidas no tempo 0 e 5 min (BRADLEY
et al.,1982).
81
4.9. CULTURA DE CÉLULAS EPITELIAIS INTESTINAIS IEC-6.
A célula epitelial intestinal de rato (IEC- 6) é derivada da cripta do jejuno de
ratos normais. A linhagem celular IEC-6 foi desenvolvida por Quaroni et al. (1979).
As células utilizadas nesse trabalho foram obtidas da American Type Culture
Collection (ATCC, Rockville, MD).
IEC-6 foi colocada em meio de cultura de base que consistiu em
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) suplementado com soro fetal bovino
inativado 5%, insulina 95% (10 µg/ml), penicilina 100 U/ml, estreptomicina (100
µg/ml) e piruvato de sódio 1mM. As células foram mantidas em frascos de tecido
cultura a 37 ° C em atmosfera úmida com 5% de CO2 no ar. As células foram
semeadas a uma densidade de aproximadamente 6,25x104 células/cm2 e foram
cultivadas a uma monocamada confluente, antes da introdução de meios contendo
tratamentos experimentais.
4.9.1. MIGRAÇÃO CELULAR EM CULTURA DE CÉLULAS EPITELIAIS
INTESTINAIS (IEC-6).
O ensaio da migração celular seguiu modelo já descrito (BRITO et al., 2005;
MCCORMACK et al, 1992). As células IEC-6 foram semeadas em placa de cultura
contendo seis poços em uma concentração de 105 células/mL em meio de cultura
padrão (com glutamina). Ao atingirem a confluência (depois de 24 h), após retirar
50% do meio de cultura de cada poço, foi feito um risco no centro do poço ao longo
de uma distância de 30 mm na monocamada de células com uma lâmina estéril,
arrastando-se as células para a borda do poço (no sentido da esquerda para direita).
Após a ranhura, lavou-se duas vezes as células com tampão salina fosfato estéril
(PBS) (1 mL/poço) e incubadas com meio sem glutamina suplementado ou não com
82
concentrações crescentes de AC (12.5-100 µM) ou indometacina (250-1000 µM), ou,
associando-se as concentrações de AC (12.5-100 µM) a duas concentrações de
indometacina (250 e 1000 µM) para verificar o comportamento do diterpeno frente a
esse agente lesivo celular. Posteriormente as placas foram incubadas a 37ºC em 5%
de CO2. Depois de 24 h, a coluna com maior taxa de migração foi selecionada e as
células foram observadas em microscópio invertido (Nikon E400, Japan) em um
aumento de 100x, fotografadas e contadas com o auxílio de uma grid ocular,
seguindo o modelo adotado por Brito et al., 2005.
4.9.2. PROLIFERAÇÃO CELULAR EM CULTURA DE CÉLULAS EPITELIAIS
INTESTINAIS (IEC-6).
A proliferação celular foi medida indiretamente usando o Kit de proliferação
celular, sal tetrazólio WST-1 adquirido da ROCHE (Mannheim, Germany) de acordo
com as instruções do fabricante. As células IEC-6 foram cultivadas em placa
contendo 96 poços em uma concentração de 4 x 104 células/mL em 100 mL de meio
padrão (meio com glutamina) na incubadora a 370C em 5% de CO2. Após atingirem
confluência de 20 a 30%, em torno de 48h, as células foram lavadas duas vezes
com solução tampão fosfato estéril para remoção de todo o meio de cultura e
incubadas com meio (sem glutamina) suplementado ou não com AC (6.25 – 200
µM), indometacina (250-1000µM) ou a associação do AC (12.5-100µM) com o
agente lesivo indometacina (250 e 1000 µM). Após 24 horas (370C em 5% de CO2),
as células foram incubadas por 2 horas com 10µL do sal tetrazólio WST-1. A
absorbância foi medida pelo ELISA com filtro de 450 nm. Esse composto tetrazólico
modificado é reduzido a formazan (marcador solúvel em água) por células
metabolicamente ativas, sob ação de uma desidrogenase. A produção de formazan
83
é proporcional ao número de células viáveis na cultura e foi observada duas horas
após a adição dos reagentes, com o auxílio do leitor de ELlSA. Essa análise é uma
medida indireta da proliferação celular em função do tempo.
84
4.10.TOXICIDADE AGUDA.
Cinqüenta camundongos foram distribuídos em cinco grupos de dez animais
cada, aos quais foram administradas, por via oral, doses crescentes de AC (100,
300, 1000, 1500 e 2000mg/kg, 0,1 ml/10g de peso). O grupo controle recebeu
igual volume de veículo (3% de Tween 80 em água destilada, 0,1 mL/kg, v.o.). Os
animais foram observados 30, 60, 90, 120, 150 e 180 min após a administração
do AC, e no período de 72 horas após o tratamento.
Os parâmetros observados foram: motilidade, respiração, contorção, ataxia,
tremor, convulsão, postura, ereção da cauda, catalepsia, estereotopia, ptose
palpebral, piloereção, cianose, salivação, lacrimejamento, diarréia, analgesia,
anestesia, sudorese, sedação, coma e morte. A DL50 foi então determinada como
sendo a dose capaz de matar 50% do número de animais tratados.
85
4.11. ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada com auxílio do programa Graph Pad Prism
4.0 (USA). Os resultados foram expressos como a média ± erro padrão da média
(E.P.M.) ou mediana. Foi realizada análise de variância (ANOVA) uma via seguida
pelo teste de Student Newman Keul, para dados paramétricos, e teste de Kruskall-
Wallis seguido do teste de Dunns, para dados não paramétricos. As diferenças
foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05.
86
5. RESULTADOS
5.1. OBTENÇÃO DO ÁCIDO CENTIPÉDICO
A obtenção do ácido centipédico a partir dos capítulos florais de Egletes
viscosa Less teve um rendimento de aproximadamente 1,19%.
Isolamento do Ácido Centipédico
Capítulos Florais
1. Moagem 2. Extração com CHCl3
Extrato Clorofórmico
Cromatografia filtrante em sílica Fração Fração Fração Fração Hexânica Acetato Metanólica Clorofórmica de etila Extração com NH4OH Fase Fase Aquosa Orgânica 1. Acidificação com HCl (pH 2) 2. Extração com CH2Cl2
Fase Fase Aquosa Orgânica 1. Na2SO4 (anidro) 2. Destilação Ácido Centipédico (1,19%)
87
5.2. EFEITO PROTETOR DO ÁCIDO CENTIPÉDICO NA LESÃO GÁSTRICA
INDUZIDA POR ETANOL EM CAMUNDONGOS
Os efeitos do Ácido Centipédico e da N-acetilcisteína sobre as lesões
gástricas induzidas por etanol estão demonstrados na Tabela 2 e Figura 5.
O etanol promoveu intensos danos à mucosa gástrica sob a forma de erosões
hemorrágicas no grupo de animais que recebeu apenas o veículo. A área lesionada
(mm2), expressa como percentual em relação à área total do corpo gástrico, no
grupo controle foi de 63.78 ± 4.37.
Das doses testadas, AC (50 e 100 mg/kg) inibiu significativamente (p<0,001) a
lesão gástrica induzida pelo etanol (30.11 ± 7.37 e 13.19 ± 3.93 respectivamente), o
que corresponde a uma inibição de 52.79 e 79.31%. Este efeito apresentou dose
dependência nas doses de 50 e 100 mg/kg.
NAC (300 mg/kg), fármaco de referência, também inibiu significativamente
(p<0,01) as lesões gástricas (31.62±4.54) quando comparada ao controle em
50.42%.
Visto que a dose de 50 mg/kg do AC foi a menor dose que apresentou maior
proteção no modelo de lesão gástrica induzida por etanol, esta dose foi selecionada
para o estudo dos possíveis mecanismos de ação envolvidos na gastroproteção do
AC.
88
TABELA 2. Efeito do Ácido Centipédico e N-acetilcisteína no modelo de úlcera
gástrica induzida por etanol em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
ÁREA DE LESÃO GÁSTRICA
(%)
% INIBIÇÃO
Controle (veículo)
- 63.78 ± 4.37 -
12,5 58.30 ± 5.71 8.59
AC
25 52.51 ± 6.00 17.67
50 30.11 ± 7.37*** 52.79
100 13.19 ± 3.93*** 79.31
NAC 300 31.62±4.54** 50.42
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8
animais/grupo. Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg) e AC (12,5, 25, 50
100mg/kg) foram administrados por via oral e N-acetilcisteína (NAC - 300 mg/kg) por
via intraperitoneal, 1 hora ou 30 minutos, respectivamente, antes da administração de
etanol 96% (0,2 mL/animal v.o.). Os animais foram sacrificados 30 minutos após a
administração do etanol. **p<0,01; ***p<0,001 vs controle veículo (ANOVA e Teste de
Student Newman Keul, como teste post hoc).
89
Controle 12.5 25 50 100 3000
20
40
60
80
Ácido Centipédico
mg/kg
NAC
***
***
**
Áre
a L
es
ion
ada
(%
)
FIGURA 5. Efeito do Ácido Centipédico e N-acetilcisteína nas lesões gástricas
induzidas por etanol em camundongos. Os valores representam a média ± erro
padrão da média (E.P.M.) para 8 animais/grupo. Os animais foram tratados com
veículo (3% de Tween 80, v.o.), AC (12,5, 25, 50 100mg/kg) e NAC (300 mg/kg, i.p.)
1 hora ou 30 minutos, respectivamente, antes da administração de etanol 96% (0,2
mL/animal, v.o.). Os animais foram sacrificados 30 minutos após a administração do
etanol. **p<0,01; ***p<0,001 vs controle veículo (ANOVA e Teste de Student
Newman Keul, como teste post hoc).
90
5.2.1. EFEITO GASTROPROTETOR DO ÁCIDO CENTIPÉDICO NA LESÃO
GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL: PAPEL DOS NEURÔNIOS AFERENTES
PRIMÁRIOS SENSÍVEIS À CAPSAICINA
Os grupos tratados com capsaicina (5 mg/kg, i.p.) ou com AC (50
mg/kg, v.o.) apresentaram uma diminuição significativa (p<0,01) na injúria gástrica
provocada pelo etanol (9.83 ± 2.16; 10,53 ± 1,87, respectivamente) quando
comparados ao grupo controle veículo (43.02 ± 3.35). O tratamento com
capsazepina (5 mg/kg, i.p.) promoveu uma reversão significativa (p<0,05) na
gastroproteção da capsaicina (31,68 ± 2,56), mas não do AC (TABELA 3 e FIGURA
6).
91
TABELA 3. Efeito do pré – tratamento com capsazepina na proteção gástrica
do Ácido Centipédico no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em
camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
ÁREA DE LESÃO GÁSTRICA
(%)
Controle (veículo)
- 43.02 ± 3.35
AC 50 9.83 ± 2.16b
Capsaicina 5 10.53 ± 1.87a
Capsaicina + Capsazepina 5 + 5 31.68 ± 2.56c
AC + Capsazepina 50 + 5 32.69 ± 6.35
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais/grupo.
Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), AC (50 mg/kg v.o.) ou
capsaicina (5 mg/kg, i.p.). Capsazepina (5 mg/kg, i.p.) foi administrada 30 minutos
antes dos tratamentos com Ácido Centipédico ou capsaicina. Etanol 96% (0,2
mL/animal, v.o.) foi administrado 1 hora ou 30 minutos após os tratamentos com AC ou
capsaicina, respectivamente. bp<0.001 vs controle; ap<0.01 vs. Controle; cp<0,05 vs
capsaicina (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
92
Controle AC Capsaicina AC Capsaicina0
10
20
30
40
50
Capsazepina
b a
c
Áre
a L
es
ion
ad
a (
%)
FIGURA 6. Efeito do pré – tratamento com capsazepina na gastroproteção
Ácido Centipédico à lesão gástrica induzida por etanol 96% em camundongos.
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8
animais/grupo. Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), AC
(50mg/kg, v.o.) ou capsaicina (5 mg/kg, i.p.). Capsazepina (5 mg/kg, i.p.) foi
administrada 30 minutos antes dos tratamentos com Ácido Centipédico ou
capsaicina. Etanol 96% (0,2 mL/animal, v.o.) foi administrado 1 hora ou 30 minutos
após os tratamentos com AC ou capsaicina, respectivamente. bp<0.001 vs controle;
ap<0.01 vs. Controle; cp<0,05 vs capsaicina (ANOVA e Teste de Student Newman
Keul, como teste post hoc).
93
5.2.2. EFEITO GASTROPROTETOR DO ÁCIDO CENTIPÉDICO NA LESÃO
GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL: PAPEL DO ÓXIDO NÍTRICO
O tratamento dos animais com L-Arginina (450 mg/Kg, i.p.) ou com AC
(50mg/kg, v.o.) promoveu uma inibição significativa (p<0,01) do percentual de área
lesionada (9,25 ± 2.47; 10.89 ± 3.08, respectivamente), quando comparado ao grupo
controle veículo (34.44 ± 2.14). O pré-tratamento com L-NAME (20 mg/kg, i.p.)
atenuou significativamente (p<0,01) a inibição da lesão gástrica promovida pelo AC
(28.09 ± 5.4) e pela L-arginina (29.64 ± 4.58) (TABELA 4 e FIGURA 7).
94
TABELA 4. Efeito do pré – tratamento com L-NAME na gastroproteção do
Ácido Centipédico no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em
camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
ÁREA DE LESÃO GÁSTRICA
(%)
Controle (veículo)
- 34.44 ± 2.14
AC 50 9.25 ± 2.47a
L-Arginina 450 10.89 ± 3.08a
L-Arginina + L-NAME 450 + 20 29.64 ± 4.58b
AC + L-NAME 50 + 20 28.09 ± 5.4c
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais/grupo.
Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), AC (50 mg/kg, v.o.) ou
L-Arginina (450 mg/kg, i.p.). L-NAME (20 mg/kg, i.p.) foi administrado 30 minutos antes
dos tratamentos com AC ou L-Arginina. Etanol 96% (0,2 mL/animal, v.o.) foi
administrado 1 hora ou 30 minutos após os tratamentos com AC ou L-Arginina,
respectivamente. a p<0,01 vs controle, bp<0,05 vs L-arginina, cp<0,01 vs AC (ANOVA e
Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
95
Controle AC L-arginina AC L-arginina0
10
20
30
40
L-NAME
a
b c
a
Áre
a L
esio
nad
a (%
)
FIGURA 7. Efeito do pré – tratamento com L-NAME na proteção gástrica do Ácido
Centipédico à lesão gástrica induzida por etanol em camundongos. Os valores
representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais/grupo. Os
animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), AC (50 mg/kg, v.o.) ou L-
Arginina (450 mg/kg, i.p.). L-NAME (20 mg/kg, i.p.) foi administrado 30 minutos antes
dos tratamentos com AC ou L-Arginina. Etanol 96% (0,2 mL/animal, v.o.) foi
administrado 1 hora ou 30 minutos após os tratamentos com AC ou L-Arginina,
respectivamente a p<0,01 vs controle, bp<0,01 vs AC, cp<0,05 vs L-arginina (ANOVA e
Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
96
5.2.3. EFEITO GASTROPROTETOR DO ÁCIDO CENTIPÉDICO NA LESÃO
GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL: PARTICIPAÇÃO DAS PROSTAGLANDINAS
Os grupos tratados com misoprostol (0.016 mg/kg, v.o.) ou com AC (50mg/kg,
v.o.) apresentaram uma diminuição significativa (p<0,001) na injúria gástrica
provocada pelo etanol (7.12 ± 0,94; 16.60 ± 4.90, respectivamente) quando
comparados ao grupo controle veículo (35.71 ± 5.49). O pré-tratamento com
indometacina (10 mg/kg, v.o.) promoveu uma reversão significativa (p<0,05; p<0,01
respectivamente) na gastroproteção do misoprostol (28.52 ± 2.91) e também do AC
(25.70 ± 1.45) (TABELA 5 e FIGURA 8).
97
TABELA 5. Efeito do pré – tratamento com indometacina na gastroproteção do
Ácido Centipédico no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em
camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
ÁREA DE LESÃO GÁSTRICA
(%)
Controle (veículo)
- 35.71 ± 5.49
Misoprostol 0.016 7.12 ± 0,94a
AC 50 16.60 ± 4.90b
Misoprostol + Indometacina 0.016 + 10 28.52 ± 2.91c
AC + Indometacina 50 + 10 25.70 ± 1.45d
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais/grupo.
Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), AC (50 mg/kg, v.o.) ou
misoprostol (0,016 mg/kg, v.o.). Indometacina (10 mg/kg, i.p.) foi administrada 2 horas
antes dos tratamentos com AC ou misoprostol. Etanol 96% (0,2 mL/animal, v.o.) foi
administrado 1 hora após os tratamentos com AC ou misoprostol. a p<0.001 vs controle; b
p<0.01 vs. controle; c p<0,05 vs Misoprostol; d p<0,01 vs AC (ANOVA e Teste de Student
Newman Keul, como teste post hoc).
98
Controle Misoprostol AC AC Misoprostol0
10
20
30
40
50
a
b
Indometacina
cd
Áre
a L
esio
nad
a (%
)
FIGURA 8. Efeito do pré – tratamento com indometacina na gastroproteção do
Ácido Centipédico à lesão gástrica induzida por etanol absoluto em
camundongos. Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.)
para 8 animais/grupo. Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80,
v.o.), AC (50 mg/kg, v.o.) ou misoprostol (0,016 mg/kg, v.o.). Indometacina (10
mg/kg, i.p.) foi administrada 60 minutos antes dos tratamentos com AC ou
misoprostol. Etanol 96% (0,2 mL/animal, v.o.) foi administrado 1 hora após os
tratamentos com AC ou misoprostol. a p<0.001 vs controle; b p<0.01 vs. controle; c
p<0,01 vs AC; d p<0,05 vs Misoprostol (ANOVA e Teste de Student Newman Keul,
como teste post hoc).
99
5.2.4. EFEITO GASTROPROTETOR DO ÁCIDO CENTIPÉDICO NA LESÃO
GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL: PAPEL DOS CANAIS DE POTÁSSIO ATP -
DEPENDENTES
O tratamento dos animais com diazóxido (3 mg/kg, i.p.) ou com AC (50 mg/kg,
v.o.) promoveu uma redução significativa (p<0,001; p<0,01 respectivamente) da
lesão gástrica induzida pelo etanol (8.97 ± 2.00; 14.28 ± 1.53, respectivamente),
quando comparado ao grupo controle veículo (31.94 ± 5.86%). O pré-tratamento
com glibenclamida (5 mg/kg, i.p.) reverteu significativamente (p<0,001; p<0,01) a
gastroproteção do AC (34.05 ± 5.23) e do diazóxido (33.84 ± 2.89) (TABELA 6 e
FIGURA 9).
100
TABELA 6. Efeito do pré – tratamento com glibenclamida na gastroproteção do
Ácido Centipédico no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em
camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
ÁREA DE LESÃO GÁSTRICA
(%)
Controle (veículo)
- 31.94 ± 5.86
AC 50 8.97 ± 2.00a
Diazóxido 3 14.28 ± 1.53b
Diazóxido + Glibenclamida 3 + 5 33.84 ± 2.89c
AC + Glibenclamida 50 + 5 34.05 ± 5.23d
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais/grupo.
Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), AC (50 mg/kg, v.o.) ou
diazóxido (3 mg/kg, i.p.). Glibenclamida (5 mg/kg, i.p.) foi administrada 30 minutos antes
dos tratamentos com AC ou diazóxido. Etanol 96% (0,2 mL/animal, v.o.) foi administrado
1 hora ou 30 minutos após os tratamentos com AC ou diazóxido, respectivamente. a
p<0.001 vs controle; b p<0.01 vs. Controle; c p<0,001 vs Diazóxido; d p<0,01 vs AC
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
101
Controle AC Diazóxido AC Diazóxido0
10
20
30
40
50
b
Glibenclamida
cd
a
Áre
a L
esio
nad
a (%
)
FIGURA 9. Efeito do pré – tratamento com tratamento com glibenclamida na
proteção do Ácido Centipédico frente às lesões gástricas induzidas por etanol
em camundongos. Os valores representam a média ± erro padrão da média
(E.P.M.) para 8 animais/grupo. Os animais foram tratados com veículo (3% de
Tween 80, v.o.), AC (50 mg/kg, v.o.) ou diazóxido (3 mg/kg, i.p.). Glibenclamida (5
mg/kg, i.p.) foi administrada 30 minutos antes dos tratamentos com Ácido
Centipédico ou diazóxido. Etanol 96% (0,2 mL/animal, v.o.) foi administrado 1 hora
ou 30 minutos após os tratamentos com AC ou diazóxido, respectivamente. a
p<0.001 vs controle; b p<0.01 vs. Controle; c p<0,01 vs AC; d p<0,001 vs Diazóxido
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
102
5.2.5. EFEITO GASTROPROTETOR DO ÁCIDO CENTIPÉDICO NA LESÃO
GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL: PAPEL DOS GRUPOS SULFIDRILAS NÃO
PROTÉICOS (NP-SH) GÁSTRICOS
Os animais que receberam etanol mostraram significativa redução (p<0,001)
nos níveis de NP-SH (213.90 ± 15.91µg/g de tecido) quando comparado ao controle
que recebeu apenas o veículo (429.00 ± 42.11µg/g de tecido). AC (50 mg/kg) foi
capaz de atenuar a depleção dos grupos sulfidrilas produzida pelo etanol (366.30 ±
31.10µg/g de tecido) de forma significativa (p<0,01). A NAC (300 mg/kg) inibiu
significativamente (p<0,001) a depleção dos grupos sulfidrilas (304.1 ± 21.56µg/g de
tecido) produzida pelo etanol (TABELA 7 e FIGURA 10).
103
TABELA 7. Efeito do Ácido Centipédico e N-acetilcisteína sobre os níveis
de grupos sulfidrilas não protéicos (NP-SH) no modelo de úlcera gástrica
induzida por etanol em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
NP-SH
(µg/g tecido)
Controle (veículo) - 429.00 ± 42.11
Controle (etanol) - 213.90 ± 15.91a
AC 50 366.30 ± 31.10b
NAC 300 304.1 ± 21.56c
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os
níveis gástricos de glutationa (NP-SH) de 8 animais/grupo. Os níveis foram
analisados 30 minutos após a administração oral de etanol. Veículo (3% de Tween
80 em salina 0,9%, 10 mL/kg) e AC (50 mg/kg) foram administrados por via oral e
(300 mg/kg) por via intraperitoneal, 1 hora antes da administração de etanol 96%
(0,2 mL/animal v.o.). ap<0,001 vs controle veículo; bp<0,01 vs controle etanol;
cp<0,05 vs controle etanol (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste
post hoc).
104
Controle Veículo 50 3000
100
200
300
400
500
a
b
c
Ácido Centipédico
mg/kg
NAC(salina)
Etanol
NP
-SH
(µµ µµ
g/g
)
FIGURA 10. Efeito do Ácido Centipédico e N-acetilcisteína sobre os níveis de
grupos sulfidrilas não protéicos nas lesões gástricas induzidas por etanol em
camundongos. Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.)
para 8 animais/grupo. Os níveis de glutationa foram analisados 30 minutos após a
administração oral de etanol. Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween
80, v.o.), AC (50 mg/kg, v.o.) ou NAC (300 mg/kg, i.p.) 1 hora antes da
administração de etanol 96% (0,2 mL/animal). ap<0,001 vs controle salina; bp<0,01
vs controle etanol; cp<0,05 vs controle etanol (ANOVA e Teste de Student Newman
Keul, como teste post hoc).
105
5.2.6 EFEITO GASTROPROTETOR DO ÁCIDO CENTIPÉDICO NA LESÃO
GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL: AÇÃO SOBRE A PEROXIDAÇÃO
LIPÍDICA.
5.2.6.1 DOSAGEM DE MALONILDEALDEÍDO (MDA).
Os animais que receberam etanol mostraram significativo aumento (p<0,001)
nos níveis de malonildealdeído (90,27 ± 10,25 nmol/g de tecido) quando comparado
ao controle que recebeu apenas o veículo (54,53 ± 6,22 nmol/g de tecido). AC (50
mg/kg) foi capaz de atenuar a produção de malonildealdeído produzida pelo etanol
(37.58 ± 3.26nmol/g de tecido) de forma significativa (p<0,001). A N-acetilcisteína
(300 mg/kg) inibiu significativamente (p<0,001) o aumento nos níveis de
malonildealdeído (31,73 ± 4,65 nmol/g de tecido) produzida pelo etanol (TABEÇA 8
e FIGURA 11).
106
TABELA 8. Efeito do Ácido Centipédico e N-acetilcisteína sobre os níveis de
malonildealdeído no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em
camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
MALONILDEALDEÍDO
(nmol/g tecido)
Controle (veículo) - 54.53 ± 6.22
Controle (etanol) - 90.27 ± 10.25 a
AC 50 37.58 ± 3.26b
NAC 300 31.73 ± 4.65c
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os
níveis gástricos de malonildealdeído de 8 animais/grupo. Os níveis foram
analisados 30 minutos após a administração oral de etanol. Veículo (3% de Tween
80 em salina 0,9%, 10 mL/kg) e AC (50 mg/kg) foram administrados por via oral e
NAC (300 mg/kg) por via intraperitoneal, 1 hora antes da administração de etanol
96% (0,2 mL/animal v.o.). ap<0,01 vs controle veículo; b,cp<0,001 vs controle
etanol (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
107
Controle Veículo 50 3000
20
40
60
80
100
120
Ácido Centipédico
mg/kg
NAC
Etanol
b c
nm
ol/
g d
e te
cid
oa
FIGURA 11 Efeito do Ácido Centipédico e N-acetilcisteína sobre os níveis de
malonildealdeído nas lesões gástricas induzidas por etanol em
camundongos. Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.)
para 8 animais/grupo. Os níveis de malonildealdeído foram analisados 30 minutos
após a administração oral de etanol. Os animais foram tratados com veículo (3%
de Tween 80, v.o.), AC (50 mg/kg, v.o.) ou NAC (300 mg/kg, i.p.) 1 hora antes da
administração de etanol 96% (0,2 mL/animal). ap<0,01 vs controle; b,cp<0,001 vs
controle etanol (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
108
5.2.6.2. DOSAGEM DE SUPERÓXIDO DISMUTASE (SOD)
Os animais que receberam etanol mostraram significativa diminuição (p<0,05)
nos níveis de superóxido dismutase (5.32 ± 0.36 U SOD/mg proteína) quando
comparado ao controle que recebeu apenas o veículo (8.58 ± 0.52 U SOD/mg
proteína). AC (50 mg/kg) foi capaz de aumentar SOD (11.27 ± 0.19 U SOD/mg
proteína) de forma significativa (p<0,001). A N-acetilcisteína (300 mg/kg) também
aumentou SOD significativamente (p<0,05) (7.78 ± 1.24 U SOD/mg proteína) quando
comparada ao grupo etanol (TABELA 9 E FIGURA 12).
109
TABELA 9. Efeito do Ácido Centipédico e N-acetilcisteína sobre os níveis de
Superóxido dismutase no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em
camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
SOD
(Unidade de SOD/mg
proteína)
Controle (veículo) - 8.58 ± 0.52
Controle (etanol) - 5.32 ± 0.36 a
AC 50 11.27 ± 0.19b
NAC 300 7.78 ± 1.24c
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os
níveis gástricos de superóxido dismutase de 8 animais/grupo. Os níveis foram
analisados 30 minutos após a administração oral de etanol. Veículo (3% de Tween
80 em salina 0,9%, 10 mL/kg) e AC (50 mg/kg) foram administrados por via oral e
NAC (300 mg/kg) por via intraperitoneal, 1 hora antes da administração de etanol
96% (0,2 mL/animal v.o.). ap<0,05 vs veículo; bp<0,001 vs etanol, cp<0,05 vs
etanol (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
110
Controle Veículo AC NAC0
5
10
15
Etanol
a
c
SO
D (
U/m
g p
rote
ína) b
FIGURA 12. Efeito do Ácido Centipédico e N-acetilcisteína sobre os níveis de
Superóxido dismutase no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em
camundongos. Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média
(E.P.M.) para os níveis gástricos de superóxido dismutase de 8 animais/grupo. Os
níveis foram analisados 30 minutos após a administração oral de etanol. Veículo
(3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg) e AC (50 mg/kg) foram administrados
por via oral e NAC (300 mg/kg) por via intraperitoneal, 1 hora antes da
administração de etanol 96% (0,2 mL/animal v.o.). ap<0,05 vs veículo; bp<0,001 vs
etanol, cp<0,05 vs etanol (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste
post hoc).
111
5.2.7 EFEITO GASTROPROTETOR DO ÁCIDO CENTIPÉDICO NA LESÃO
GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL: AÇÃO SOBRE A PRODUÇÃO DE MUCO
GÁSTRICO
Os animais que receberam etanol mostraram significativa diminuição (p<0,05)
nos níveis de muco gástrico (15,97 ± 1,03µg Alcian Blue/g tecido) quando
comparado ao controle que recebeu apenas o veículo (26,37 ± 3,51µg Alcian Blue/g
tecido). AC (50 mg/kg) foi capaz de aumentar a produção de muco de forma
significativa (p<0,001) quando comparado ao grupo etanol, (43,45 ± 3,20 µg Alcian
Blue/g tecido). O misoprostol (0,016mg/kg), usado como controle positivo, também
aumentou significativamente (p<0,001) os níveis de muco gástrico (41,27 ± 0,96µg
Alcian Blue/g tecido) (TABELA 10 e FIGURA 13).
112
TABELA 10. Efeito do Ácido Centipédico e Misoprostol sobre os níveis de
muco no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
MUCO
(µg Alcian blue/g decide)
Controle (veículo) - 26.37 ± 3.51
Controle (etanol) - 15.97 ± 1.03a
AC 50 43.45 ± 3.20 b
Misoprostol 0,016 41.27 ± 0.96 b
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os
níveis gástricos de muco de 8 animais/grupo. Os níveis foram analisados 30
minutos após a administração oral de etanol. Veículo (3% de Tween 80 em salina
0,9%, 10 mL/kg), AC (50 mg/kg) e Misoprostol (0,016 mg/kg) por via oral, 1 hora
antes da administração de etanol 96% (0,2 mL/animal v.o.). ap<0,05 vs veículo;
bp<0,001 vs veículo e etanol (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como
teste post hoc).
113
Controle ETOH AC Misoprostol0
10
20
30
40
50 b
Mu
co (µµ µµ
g a
lcia
n b
lue/
g t
ecid
o)
b
a
FIGURA 13. Efeito do Ácido Centipédico e Misoprostol sobre os níveis de
muco no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol em camundongos.
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os
níveis gástricos de muco de 8 animais/grupo. Os níveis foram analisados 30
minutos após a administração oral de etanol. Veículo (3% de Tween 80 em salina
0,9%, 10 mL/kg), AC (50 mg/kg) e Misoprostol (0,016 mg/kg) por via oral, 1 hora
antes da administração de etanol 96% (0,2 mL/animal v.o.). ap<0,05 vs controle;
bp<0,001 vs controle e etanol (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como
teste post hoc).
114
5.3. EFEITO DO ÁCIDO CENTIPÉDICO NA ÚLCERA GÁSTRICA INDUZIDA POR
ETANOL ACIDIFICADO EM CAMUNDONGOS
Os efeitos do Ácido Centipédico e do lansoprazol sobre as lesões gástricas
induzidas por etanol acidificado estão demonstrados na Tabela 11 e figura 14.
A administração de etanol acidificado promoveu grandes lesões hemorrágicas
na mucosa gástrica no grupo controle que recebeu apenas veículo (47.00 ± 4.32).
AC, nas doses testadas de 50 e 100mg/kg, foi capaz de atenuar
significativamente (p<0,001) o dano à mucosa gástrica induzida pelo etanol
acidificado (23.45 ± 3.07; 9.51 ± 2.67 ; respectivamente), inibindo em 50.16 e
79.76% as lesões.
Da mesma forma lansoprazol (30 mg/kg), fármaco de referência, reduziu
significativamente (20.91 ± 2.55) as lesões gástricas (p<0,001) induzidas pelo etanol
acidificado em 55.38%.
A associação do AC (50mg/Kg) com lansoprazol (30mg/Kg) demonstrou
potenciação dos efeitos das drogas, atenuando significativamente (p<0,001) o dano
à mucosa gástrica induzida pelo etanol acidificado (6.19 ± 2.28), inibindo em 86.82%
as lesões.
115
TABELA 11. Efeito do Ácido Centipédico e lansoprazol sozinhos ou
associados nas lesões gástricas induzidas por etanol acidificado em
camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
ÁREA DE LESÃO GÁSTRICA
(%)
% INIBIÇÃO
Controle
(ETOH/HCl) - 47.00 ± 4.32 -
AC
25 38.90 ± 5.50 17.23
50 23.45 ± 3.07a 50.16
100 9.51 ± 2.67 a 79.76
Lansoprazol 30 20.91 ± 2.55 a 55.38
AC + lansoprazol 50+30 6.19 ± 2.28 a,b,c 86.82
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8
animais/grupo. Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%, 10 mL/kg), AC (25, 50 e
100mg/kg, v.o.) e lansoprazol (30 mg/kg, v.o.) foram administrados por via oral, 1 hora
antes da administração de uma solução de 0,3M de HCl em etanol 60% (0,2 mL/animal
v.o.). Os animais foram sacrificados 1 hora após a administração do etanol acidificado.
ap<0,001 vs ETOH/HCl, bp<0,001 vs AC 50, cp<0,05 vs lansoprazol (ANOVA e Teste de
Student Newman Keul, como teste post hoc).
116
ETOH/HCl 25 50 100 30 50 +300
20
40
60
a,b,c
a
Ácido Centipédico AC + Lanzo
Lanzo
a
a
Áre
a le
sio
nad
a (%
)
FIGURA 14. Efeito do Ácido Centipédico e lansoprazol sozinhos ou associados
nas lesões gástricas induzidas por etanol acidificado em camundongos. Os
valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais/grupo.
Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), AC (25, 50 e
100mg/kg, v.o.) e lansoprazol (30 mg/kg, v.o.) 1 hora antes da administração de uma
solução de 0,3M de HCl em etanol 60% (0,2 mL/animal, v.o.). Os animais foram
sacrificados 1 hora após a administração do etanol acidificado. ap<0,001 vs
ETOH/HCl, bp<0,001 vs AC 50, cp<0,05 vs lansoprazol (ANOVA e Teste de Student
Newman Keul, como teste post hoc).
117
5.3.1. EFEITO GASTROPROTETOR DO ÁCIDO CENTIPÉDICO NA LESÃO
GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL ACIDIFICADO: PAPEL DOS RECEPTORES
OPIÓIDES
O tratamento dos animais com morfina (5 mg/kg, s.c.) ou com AC (50 mg/kg,
v.o.) promoveu uma redução significativa (p<0,001) da lesão gástrica induzida pelo
etanol acidificado (4.62 ± 1.02; 6.34 ± 0.98, respectivamente), quando comparado ao
grupo controle veículo (28.10±2.24). O pré-tratamento com naloxona (2 mg/kg, i.p.)
reverteu significativamente a gastroproteção do AC (18.02 ± 2.43) e da morfina
(21.72 ± 3.87) (p<0,01 e p<0,001, respectivamente) (TABELA 12 e FIGURA 15).
118
TABELA 12. Efeito do pré – tratamento com naloxona na gastroproteção do
Ácido Centipédico no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol
acidificado em camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
ÁREA DE LESÃO GÁSTRICA
(%)
Controle (ETOH/HCl) - 28.10±2.24
AC 50 6.34± 0.98a
Morfina 5 4.62 ± 1.02a
AC +Naloxona 50 +2 18.02 ± 2.43b
Morfina + Naloxona 5 + 2 21.72 ± 3.87c
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais/grupo.
Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), AC (50 mg/kg, v.o.) ou
morfina (5mg/Kg, s.c.). Naloxona (2mg/Kg, i.p.) foi administrada 30 minutos antes dos
tratamentos com AC ou morfina. 0,3M de HCl em etanol 60% (0,2 mL/animal v.o.) foi
administrado 1 hora ou 30 minutos após os tratamentos com AC ou morfina,
respectivamente. a p<0.001 vs controle; b p<0.01 vs. AC; c p<0,001 vs morfina (ANOVA e
Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
119
Controle AC Morfina AC Morfina0
10
20
30
40
a
c
b
Naloxona
a
Áre
a L
esio
nad
a (%
)
FIGURA 15. Efeito do pré – tratamento com naloxona na proteção do Ácido
Centipédico frente às lesões gástricas induzidas por etanol acidificado em
camundongos. Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.)
para 8 animais/grupo. Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80,
v.o.), AC (50 mg/kg, v.o.) ou morfina (5 mg/kg, s.c.). Naloxona (2 mg/kg, i.p.) foi
administrada 30 minutos antes dos tratamentos com AC ou morfina. 0,3M de HCl em
etanol 60% (0,2 mL/animal v.o.) foi administrado 1 hora ou 30 minutos após os
tratamentos com AC ou morfina, respectivamente. a p<0.001 vs controle; b p<0.01
vs. AC; c p<0,001 vs morfina (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste
post hoc).
120
5.3.2. EFEITO GASTROPROTETOR DO ÁCIDO CENTIPÉDICO NA LESÃO
GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL ACIDIFICADO: PAPEL DOS RECEPTORES
α2-adrenérgicos
O tratamento dos animais com clonidina (0,05 mg/kg, v.o.) ou com AC (50
mg/kg, v.o.) promoveu uma redução significativa (p<0,01; p<0,001 respectivamente)
da lesão gástrica induzida pelo etanol acidificado (8.25 ± 1.73; 8.27 ± 0.91,
respectivamente), quando comparado ao grupo controle veículo (19.26±1.50). O pré-
tratamento com Ioimbina (2 mg/kg, s.c.) reverteu significativamente (p<0,05) a
gastroproteção do AC (12.43 ± 1.87) e da clonidina (15.29 ± 1.52) (TABELA 13 e
FIGURA 16).
121
TABELA 13. Efeito do pré – tratamento com ioimbina na gastroproteção do Ácido
Centipédico no modelo de úlcera gástrica induzida por etanol acidificado em
camundongos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
ÁREA DE LESÃO GÁSTRICA
(%)
Controle (ETOH/HCl) - 19.26±1.50
AC 50 8.27± 0.91a
Clonidina 0.05 8.25 ± 1.73b
Clonidina + Ioimbina 0.05 + 2 15.29 ± 1.52d
AC + Ioimbina 50 + 2 12.43 ± 1.87c
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais/grupo.
Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80, v.o.), AC (50 mg/kg, v.o.) ou
clonidina (0,05mg/kg,v.o.). Ioimbina (2 mg/kg, s.c.) foi administrada 30 minutos antes dos
tratamentos com AC ou clonidina. 0,3M de HCl em etanol 60% (0,2 mL/animal v.o.) foi
administrado 1 hora os tratamentos com AC ou clonidina. a p<0.001 vs controle; a
p<0.001 vs controle; b p<0.01 vs. Controle; c p<0,05 vs AC; d p<0,05 vs clonidina (ANOVA
e Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
122
Controle AC Clonidina AC Clonidina 0
5
10
15
20
25
a b
dc
Ioimbina
Áre
a L
esio
nad
a (%
)
FIGURA 16. Efeito do pré – tratamento com ioimbina na gastroproteção do
Ácido Centipédico frente às lesões gástricas induzidas por etanol acidificado
camundongos. Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.)
para 8 animais/grupo. Os animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80,
v.o.), AC (50 mg/kg, v.o.) ou clonidina (0,05 mg/kg, v.o.). Ioimbina (2 mg/kg, s.c.) foi
administrada 30 minutos antes dos tratamentos com AC ou Ioimbina. 0,3M de HCl
em etanol 60% (0,2 mL/animal v.o.) foi administrado 1 hora após os tratamentos com
AC ou clonidina. a p<0.001 vs controle; b p<0.01 vs. Controle; c p<0,05 vs AC; d
p<0,05 vs clonidina (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post
hoc).
123
5.4. EFEITO DO ÁCIDO CENTIPÉDICO SOBRE A SECREÇÃO GÁSTRICA NO
MODELO DE LIGAÇÃO DO PILORO EM RATOS
A administração intraduodenal do AC (50 mg/kg), em ratos com piloro ligado
por 4 horas, diminuiu significativamente (p<0,01) o volume secretório gástrico (2.55 ±
0.34mL), quando comparado ao controle (4,72 ± 0,39 mL).
AC também foi capaz de inibir, significativamente (p<0,001), a acidez total
gástrica (55.50 ± 15.62µEq/h) em relação ao grupo controle (128,9 ± 9,38 µEq/h).
Cimetidina (100 mg/kg), um conhecido antagonista H2, não alterou o volume
secretório gástrico em comparação com o controle. Já a acidez total gástrica foi
significativamente reduzida (p<0,001) também pela cimetidina (27,32 ± 3,71 µEq/h),
quando comparada ao controle (TABELA 14 e FIGURAS 17 e 18).
124
TABELA 14. Efeito do Ácido Centipédico e cimetidina sobre o volume
secretório gástrico e acidez gástrica total em ratos com piloro ligado.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Volume Secretório
Gástrico (mL)
Acidez Total Gástrica
(µEq/h)
Controle (veículo) - 4.72 ± 0.39 128,9 ± 9,38
AC 50 2.55 ± 0.34a 55.50 ± 15.62b
Cimetidina 100 3.58 ± 0.64 27.32 ± 3.71 b
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais
do volume secretório gástrico (mL) e da acidez gástrica total (µEq/h). Veículo (3% de
Tween 80 em salina 0,9%), AC (50 mg/kg) e cimetidina (100 mg/kg) foram administrados
por via intraduodenal, imediatamente após a ligação do piloro. Os animais foram
sacrificados 4 horas após a ligação do piloro. ap<0,01 vs controle normal; bp<0,001 vs
controle normal (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
125
Controle AC Cimetidina0
1
2
3
4
5
6
a
Volu
me
secr
etóri
o g
ástr
ico (
mL)
FIGURA 17. Efeito da administração intraduodenal do Ácido Centipédico e
cimetidina no volume secretório gástrico em ratos. Os valores representam
a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Veículo (3% de
Tween 80 em salina 0,9%), AC (50 mg/kg) e cimetidina (100 mg/kg) foram
administrados por via intraduodenal, imediatamente após a ligação do piloro.
Os animais foram sacrificados 4 horas após a ligação do piloro. ap<0,01 vs
controle normal (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post
hoc).
126
Controle Ácido Centipédico Cimetidina0
20
40
60
80
100
120
140
b
Aci
dez
To
tal
( µµ µµE
q/h
)
b
FIGURA 18. Efeito da administração intraduodenal do Ácido Centipédico e
cimetidina na acidez total gástrica em ratos. Os valores representam a média ±
erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Veículo (3% de Tween 80 em
salina 0,9%), AC (50 mg/kg) e cimetidina (100 mg/kg) foram administrados por via
intraduodenal, imediatamente após a ligação do piloro. Os animais foram
sacrificados 4 horas após a ligação do piloro. bp<0,001 vs controle normal (ANOVA e
Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
127
5.5. EFEITO DO ÁCIDO CENTIPÉDICO SOBRE O ESVAZIAMENTO GÁSTRICO
EM RATOS
Os efeitos do AC e atropina sobre o esvaziamento gástrico em ratos estão
demonstrados na Tabela 15 e Figura 19.
Os animais que receberam vermelho de fenol (0,5 mg/kg) e foram tratados
apenas com veículo, apresentaram uma média de 29,62 ± 2,33 µg/mL de corante
por estômago. AC na dose de 50 mg/kg não alterou o esvaziamento gástrico (23,54
± 2,26 µg/mL) em comparação com o grupo controle. O antagonista dos receptores
muscarínicos, atropina (3 mg/kg) diminuiu o esvaziamento gástrico, aumentando de
forma significativa (p<0,001) a concentração média de corante por estômago (60,17
± 5,34 µg/mL).
128
TABELA 15. Efeito do Ácido Centipédico e atropina sobre o esvaziamento
gástrico em ratos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
VERMELHO DE FENOL
(µg/mL)
Controle (veículo) - 29.62 ± 2.33
AC 50 23.54 ± 2.26
Atropina 3 60.17 ± 5.34a
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média
(E.P.M.) do conteúdo gástrico de vermelho de fenol (µg/mL) para 6
animais/grupo. Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%), AC
(50mg/kg) e atropina (3 mg/kg) foram administrados por via oral 45
minutos antes do vermelho de fenol. Os animais foram sacrificados 15
minutos após a administração do vermelho de fenol. ap<0,001 vs
Controle (veículo) (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como
teste post hoc).
129
Controle Atropina AC0
20
40
60
80
a
Ver
mel
ho
de
Fen
ol
( µµ µµg
/mL
)
FIGURA 19. Efeito do Ácido Centipédico e atropina sobre o esvaziamento
gástrico em ratos. Os resultados são expressos como média ± erro padrão da
média (E.P.M.) do conteúdo gástrico de vermelho de fenol (µg/mL) para 6
animais/grupo. Veículo (3% de Tween 80 em salina 0,9%), AC (50mg/kg) e
atropina (3 mg/kg) foram administrados por via oral 45 minutos antes do vermelho
de fenol. Os animais foram sacrificados 15 minutos após a administração do
vermelho de fenol. ap<0,001 vs Controle (veículo) (ANOVA e Teste de Student
Newman Keul, como teste post hoc).
130
5.6. Efeito do Ácido Centipédico sobre Helicobacter pylori
Após um período de 72h de incubação das placas inoculadas com H. pylori,
não foi verificada a formação de halo de inibição por nenhuma das doses testadas
do Ácido Centipédico. Não foi observada interferência do veículo.
FIGURA 20. Avaliação da ação do Ácido Centipédico sobre Helicobacter pylori in vitro .
AC 31.6 mM
AC 15.8 mM
AC 7.9 mM
DMSO 0,5%
131
5.7. EFEITO CURATIVO DO ÁCIDO CENTIPÉDICO NA LESÃO GÁSTRICA
CRÔNICA INDUZIDA POR ÁCIDO ACÉTICO EM RATOS.
O tratamento dos animais com AC ou ranitidina (50 mg/kg, v.o.) promoveu
uma redução significativa (p<0,001) da lesão gástrica induzida pelo ácido acético
(2,49 ± 0,64% e 8,07 ± 1,64,respectivamente), quando comparados ao grupo
controle veículo (24,49 ± 2,54) após 7 dias de tratamento. Celecoxibe, usado como
controle negativo não foi capaz de regenerar a área lesionada nesse mesmo período
(22,43 ± 3,34) (TABELA 16 FIGURA 21).
Após 14 dias de tratamento foi verificada redução significativa (p<0,001) da
lesão gástrica induzida pelo ácido acético nos animais tratados com AC ou ranitidina
(50 mg/kg, v.o.) (1,24 ± 0,95 e 5,91 ± 2,21, respectivamente) quando comparados ao
grupo controle veículo (20,05 ± 1,36). Os animais tratados com celecoxibe
apresentaram menor capacidade de regeneração (18,32 ± 1,87) (TABELA 16,
FIGURA 22).
132
TABELA 16. Efeito do Ácido Centipédico e ranitidina na lesão gástrica
crônica induzida por ácido acético em ratos (7 e 14dias de tratamento)
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
LESÃO
GÁSTRICA
(%)
7 dias
% INIBIÇÃO
LESÃO
GÁSTRICA
(%)
14 dias
% INIBIÇÃO
Controle - 24.49 ± 2.54 - 20.05 ± 1.36 -
Ranitidina 50 8.07 ± 1.64a 67.04 5.91 ± 2.21b 70.52
Celecoxibe 20 22.43 ± 3.34 21.43 18.32 ± 1.87 17.65
AC 50 2.49 ± 0.64 a 89.83 1.24 ± 0.95b 93.81
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo.
Os animais foram operados e após 48h, tratados com salina, AC ou ranitidina (50
mg/kg, v.o.) ou celecoxibe (20mg/Kg, v.o.). Após 7 e 14 dias de tratamento os animais
foram sacrificados. ap<0.001 vs controle 7 dias; bp<0.001 vs controle 14 dias (ANOVA e
Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
133
Controle RanitidinaCelecoxibe AC Controle RanitidinaCelecoxibe AC0
10
20
30
7 dias
a
14 dias
b
a bÁre
a le
sio
nad
a (%
)
FIGURA 21. Efeito do Ácido Centipédico e ranitidina sobre lesão gástrica
crônica induzida por ácido acético em ratos (7 e 14 dias de tratamento). Os
valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6
animais/grupo. Os animais foram operados e após 48h, tratados com salina, AC
ou ranitidina (50 mg/kg, v.o.) ou celecoxibe (20mg/Kg, v.o.). Após 7 e 14 dias de
tratamento os animais foram sacrificados. ap<0.001 vs controle 7 dias; bp<0.001 vs
controle 14 dias (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
134
5.7.1. EFEITO CURATIVO DO ÁCIDO CENTIPÉDICO NA LESÃO GÁSTRICA
CRÔNICA INDUZIDA POR ÁCIDO ACÉTICO EM RATOS: ACHADOS
HISTOLÓGICOS (7 e 14 dias de tratamento de AC, Ranitidina e Celecoxibe)
No grupo controle, após 7 dias de tratamento com salina, observou-se intenso
foco inflamatório com predominância de polimorfonucleares e espessamento fibroso
da região submucosa. O epitélio apresenta áreas com princípio de necrose onde é
possível observar células com degeneração hidrópica e núcleos picnóticos, além de
discreta desorganização da arquitetura do mesmo.
No grupo controle, após 14 dias de tratamento com salina, observou-se
intenso foco inflamatório, com predomínio de PMN e indícios de fibrose (processo de
reparo) devido à presença de inúmeros fibroblastos. Observou-se, ainda, áreas com
angiogênese bem característica (FIGURA 22 A e B).
No grupo AC, após 7 dias de tratamento, foi encontrado úlcera em franco
processo de reparo, observado pela intensa formação de novos vasos e atividade
fibroblástica e discreta presença de células inflamatórias. Após 14 dias de
tratamento, houve intenso remodelamento fibroso (FIGURA 22 C e D).
Os animais tratados com Ranitidina, após 7 dias de tratamento, foi observada
a formação de úlcera, porém com franco processo de reparo, traduzido pela grande
quantidade de novos vasos e intensa atividade fibroblástica. Após 14 dias de
tratamento, houve a preservação do epitélio com reparo completo da úlcera
(FIGURA 22 E e F).
No grupo celecoxibe, após 7 dias de tratamento, foi achado úlcera com
intenso foco inflamatório com restos de polimorfonucleares na superfície da mesma.
Foi observado processo de reparo.
135
No grupo celecoxibe, após 7 dias de tratamento, houve a formação da úlcera
com intenso foco inflamatório e presença de restos de polimorfonucleares na
superfície da mesma. Foi observado processo de reparo. Após 14 dias de
tratamento, verificou-se intenso processo inflamatório acarretando retardo no
processo de reparo observado pelo grande número de eosinófilos e baixa atividade
fibroblástica (FIGURA 22 G e H).
A análise de escores demonstrou em todos os parâmetros analisados
(hemorragia, edema, congestão, esfoliação, infiltrado inflamatório, necrose e
angiogênese), melhor desempenho dos grupos tratados com AC e ranitidina durante
7 e 14 dias quando comparados ao grupo controle, e, pior desempenho do grupo
celecoxibe, embora as diferenças entre os mesmos não tenham sido
estatisticamente significativas (TABELA 17).
136
A B
C D
E F
G H
137
FIGURA 22. Achados histológicos de AC, ranitidina e celecoxibe em modelo de
úlcera crônica induzida por ácido acético (7 e 14 dias de tratamento). A e B:
controle salina (7 e 14 dias respectivamente), A: presença de núcleos picnóticos,
B:processo de reparo com presença de fibroblastos (setas); C e D: AC (7 e 14 dias
respectivamente), C: fibroblastos, D: remodelamento fibroso (setas); E e F Ranitidina
(7 e 14 dias respectivamente), E: presença de vasos e fibroblastos, F: reparo da
úlcera (setas); G e H: Celecoxibe (7 e 14 dias respectivamente), G: presença de
polimorfonucleares, H:pesença de eosinófilos (setas) (— 100µm).
138
TABELA 17. Efeito do ácido Centipédico, ranitidina e celecoxibe sobre as
alterações morfológicas observadas em úlcera crônica induzida por ácido
acético.
Grupo Hemorragia
(0-3)
Edema
(0-3)
Congestão
(0-3)
Esfoliação
(0-3)
Infiltrado
(0-3)
Necrose
(0-3)
Angiogênese
(0-3)
Controle
(7 dias) - 2 3 2 3 2 0
Controle
(14 dias) - 2 3 2 2 1 0
AC
(7 dias) - 1 1 1 2 0 2
AC
(14 dias) - 1 1 1 1 0 3
Ranitidina
(7 dias) - 1 2 2 2 1 2
Ranitidina
(14 dias) - 1 1 1 1 0 3
Celecoxibe
(7 dias) - 1 2 3 3 1 1
Celecoxibe
(14 dias) - 1 2 2 2 1 2
Os valores representam a mediana dos escores para 6 animais/grupo. Os animais
foram operados e após 48h, tratados com salina, AC ou ranitidina (50 mg/kg, v.o.) ou
celecoxibe (20 mg/Kg, v.o.). Após 7 e 14 dias de tratamento os animais foram
sacrificados. (Kruskal Wallis).
139
5.8. EFEITO DO ÁCIDO CENTIPÉDICO SOBRE ÚLCERAS INTESTINAIS
INDUZIDAS POR INDOMETACINA EM RATOS.
5.8.1. ANÁLISE DE PARÂMETROS BIOQUÍMICOS 5.8.1.1. FUNÇÃO RENAL (DOSAGEM DE UREIA E CREATININA)
Os efeitos do AC e da Dexametasona sobre os níveis séricos de uréia e
creatinina estão demonstrados na Tabela 18.
A indometacina não alterou os níveis séricos de uréia no grupo de animais
que recebeu apenas o veículo (92.87±8.47 mg/dL) quando comparado ao grupo
normal que recebeu apenas solução salina (90.84±2.11 mg/dL).
AC (50 mg/kg) diminuiu discretamente, porém não significativamente os níveis
séricos de ureia (83.58±8.56 mg/dL) quando comparado ao grupo indometacina
(92.87±8.47 mg/dL).
Dexametasona (3 mg/kg), usado como controle positivo, também diminuiu,
porém não significativamente, os níveis séricos de ureia (80.36±15.07 mg/dL)
quando comparado ao grupo indometacina (92.87±8.47 mg/dL).
A indometacina promoveu aumento significativo (p<0,05) dos níveis séricos
de creatinina no grupo de animais que recebeu apenas o veículo (0.87±0.10 mg/dL)
quando comparado ao grupo normal que recebeu apenas solução salina (0.59±0.02
mg/dL).
Os grupos AC (50 mg/kg) e Dexametasona (3 mg/kg) não conseguiram
reverter os níveis séricos de creatinina (0.85±0.01 e 0.86±0.06 mg/dL,
respectivamente) aumentados pelo AINE quando comparado ao grupo controle.
140
TABELA 18. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona no modelo de úlcera
intestinal induzida por indometacina em ratos: função renal.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
UREIA
(mg/dL)
CREATININA
(mg/dL)
Controle (salina)
- 90.84±2.11 0.59±0.02
Indometacina (veículo) 10 92.87±8.47 0.87±0.10#
Indom + AC 50 83.58±8.56 0.85±0.01#
Indom + Dexametasona 3 80.36±15.07 0.86±0.06#
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6
animais/grupo. Os animais receberam indometacina 10 mg/kg durante três dias, e,
2h antes da administração, foram tratados com veículo, AC (50 mg/kg, v.o.) ou
dexametasona (3 mg/Kg, v.o.). No quarto dia os animais foram sacrificados.
#p<0,05 vs controle (ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post
hoc).
141
5.8.1.2. FUNÇÃO HEPÁTICA (DOSAGEM DE TGO E TGP)
Os efeitos do AC e da Dexametasona sobre os níveis séricos de TGO e TGP
estão demonstrados na Tabela 19.
A indometacina não alterou os níveis séricos de TGO (61.07 ± 3.97U.I./L)
quando comparado ao grupo normal que recebeu apenas solução salina (61.47 ±
4.57 U.I./L).
De maneira similar os grupos AC (50 mg/kg) e Dexametasona (3 mg/kg) não
tiveram alterações significativas nos níveis séricos de TGO (63.99 ± 9.21e 63.16 ±
3.00 U.I./L, respectivamente) quando comparado ao grupo indometacina.
Da mesma forma indometacina não alterou os níveis séricos de TGP (29.64 ±
7.07 U.I/L) quando comparado ao grupo normal que recebeu apenas solução salina
(24.85 ± 4.99 U.I/dL), havendo apenas um discreto aumento de seus níveis.
De maneira similar, os grupos AC (50 mg/kg) e Dexametasona (3 mg/kg) não
alteraram os níveis séricos de TGP (24.09±2.09 e 27.30 ± 3.26 U.I/L,
respectivamente), quando comparado ao grupo indometacina.
142
TABELA 19. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona no modelo de úlcera
intestinal induzida por indometacina em ratos: função hepática.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
TGO
(U.I/L)
TGP
(U.I/L)
Controle (salina)
- 61.47 ± 4.57 24.85 ± 4.99
Indometacina (veículo) 10 61.07 ± 3.97 29.64 ± 7.07
Indom + AC 50 63.99 ± 9.21 24.09 ± 2.09
Indom + Dexametasona 3 63.16 ± 3.00 27.30 ± 3.26
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6
animais/grupo. Os animais receberam indometacina 10 mg/kg durante três dias, e,
2h antes da administração, foram tratados com veículo, AC (50 mg/kg, v.o.) ou
dexametasona (3 mg/Kg, v.o.). No quarto dia os animais foram sacrificados.
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
143
5.8.2. QUANTIFICAÇÃO DAS ÚLCERAS – ANÁLISE MACROSCÓPICA
Os efeitos do AC e da Dexametasona sobre o número de lesões intestinais
induzidas por indometacina estão demonstrados na Tabela 20 e Figura 23.
Foi visualizada maior distribuição das úlceras na região mediana do intestino,
ou seja, no jejuno.
A indometacina promoveu intensos danos à mucosa intestinal sob a forma de
erosões no grupo de animais que recebeu apenas o veículo. O número de úlceras
pontuais (<5mm) foi de 15.33±3.93, significativamente (p<0,001) maior que o grupo
controle salina .
AC (50 mg/kg) mostrou média de 15.67±0.88 úlceras pontuais.
Dexametasona (3 mg/kg) diminuiu de forma significativa (p<0,001) o número de
úlceras <5mm (1.66±1.30) quando comparado ao grupo indometacina.
Quanto ao número de úlceras longitudinais (>5mm), observou-se grande
quantidade destas no grupo indometacina (42.33±7.21).
AC diminuiu de forma significativa (p<0,001) o número de úlceras
longitudinais (12.25±3.96) quando comparado a indometacina (42.33±7.21). De
maneira semelhante, Dexametasona também inibiu a formação de úlceras
longitudinais de forma significativa (p<0,001) (7.33±4.66), quando comparada ao
grupo indometacina.
144
TABELA 20. Efeito do Ácido centipédico e dexametasona sobre o número de
úlceras intestinais pontuais e longitudinais induzidas por indometacina em
ratos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
Nº ÚLCERAS
PONTUAIS
(<5mm)
Nº ÚLCERAS
LONGITUDINAIS
(>5mm)
Controle (salina) - 0
0
Indometacina (veículo) 10 15.33±3.93a
42.33±7.21c
AC 50 15.67±0.88a
12.25±3.96d
Dexametasona 3 1.66±1.30b
7.33±4.66d
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6
animais/grupo. Os animais receberam indometacina 10 mg/kg durante três dias, e,
2h antes da administração, foram tratados com veículo, AC (50 mg/kg, v.o.) ou
dexametasona (3 mg/Kg, v.o.). No quarto dia os animais foram sacrificados.
ap<0.001 vs controle; bp<0,001 vs indometacina, cp<0.001 vs controle; dp<0,001 vs
indometacina (Kruskal-Wallis e Dunns, como teste post hoc).
145
Controle Indometacina AC Dexametasona0
5
10
15
20
25
a
Indometacina
Nú
mer
o d
e ú
lcer
as (
<5m
m)
a
b
Controle Indometacina AC Dexametasona0
20
40
60
c
Indometacina
Nú
mer
o d
e ú
lcer
as (
>5m
m)
dd
FIGURA 23. Efeito do Ácido centipédico e dexametasona sobre o número de
úlceras intestinais induzidas por indometacina em ratos. Os valores
representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6 animais/grupo. Os
animais receberam indometacina 10 mg/kg durante três dias, e, 2h antes da
administração, foram tratados com veículo, AC (50 mg/kg, v.o.) ou dexametasona (3
mg/Kg, v.o.). No quarto dia os animais foram sacrificados. ap<0.001 vs controle;
bp<0,001 vs indometacina, cp<0.001 vs controle; dp<0,001 vs indometacina (Kruskal-
Wallis e Dunns, como teste post hoc).
146
5.8.3. AÇÃO SOBRE A PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA
5.8.3.1. DOSAGEM DE MALONILDIALDEIDO
Os animais que receberam indometacina mostraram aumento nos níveis de
malonildealdeído (17.06±1.83 nmol/g de tecido) quando comparado ao controle que
recebeu apenas solução salina (13.73±0.49 nmol/g de tecido). AC (50 mg/kg) foi
capaz de atenuar a produção de malonildealdeído produzida pelo indometacina
(12.60±0.13 nmol/g de tecido) de forma significativa (p<0,05). A dexametasona (3
mg/kg) também inibiu o aumento nos níveis de malonildealdeído (13.75±0.24 nmol/g
de tecido) produzida pela indometacina (TABELA 21 e FIGURA 24).
147
TABELA 21. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre os níveis de
malonildealdeído no modelo de úlcera intestinal induzida por indometacina em
ratos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
MALONILDIADEIDO
(nmol/g tecido)
Controle (salina)
- 13.73±0.49
Indometacina (veículo) 10 17.99±1.15a
AC 50 12.60±0.13b
Dexametasona 3 13.75±0.24b
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6
animais/grupo. Os animais receberam indometacina 10 mg/kg durante três dias, e,
2h antes da administração, foram tratados com veículo, AC (50 mg/kg, v.o.) ou
dexametasona (3 mg/Kg, v.o.). No quarto dia os animais foram sacrificados.
ap<0,001 vs controle, bp<0.01 vs indometacina (ANOVA e Teste de Student
Newman Keul, como teste post hoc).
148
Controle Indometacina AC Dexametasona0
5
10
15
20
25
b
a
Indometacina
b
MD
A (
nm
ol/
g d
e te
cid
o)
FIGURA 24. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre os níveis de
malonildealdeído no modelo de úlcera intestinal induzida por indometacina em
ratos. Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6
animais/grupo. Os animais receberam indometacina 10 mg/kg durante três dias, e,
2h antes da administração, foram tratados com veículo, AC (50 mg/kg, v.o.) ou
dexametasona (3 mg/Kg, v.o.). No quarto dia os animais foram sacrificados. ap<
0,001 vs controle, bp<0,01 vs indometacina (ANOVA e Teste de Student Newman
Keul, como teste post hoc).
149
5.8.3.2. DOSAGEM DE CATALASE
Os animais que receberam indometacina mostraram significativa redução
(p<0,01) nos níveis de catalase (5.71 ± 2.15 mmol/min/g tecido) quando comparado
ao controle que recebeu apenas solução salina (39.81±3.83 mmol/min/g tecido). AC
(50 mg/kg) foi capaz de atenuar a diminuição dos níveis de catalase pela
indometacina (25.55 ± 1.42 mmol/min/g tecido) de forma significativa (p<0,05).
Dexametasona (3 mg/kg) também reverteu os níveis de catalase significativamente
(p<0,05) (29.48 ± 7.85 mmol/min/g tecido) diminuídos pela indometacina (TABELA
22 E FIGURA 25).
150
TABELA 22. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre os níveis de
catalase nas lesões intestinais induzidas por indometacina em ratos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
CATALASE
(mmol/min/g tecido)
Controle (salina)
- 39.81 ± 3.83
Indometacina (veículo) 10 5.71 ± 2.15a
AC 50 25.55 ± 1.42 b
Dexametasona 3 29.48 ± 7.85 b
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6
animais/grupo. Os animais receberam indometacina 10 mg/kg durante três dias, e,
2h antes da administração, foram tratados com veículo, AC (50 mg/kg, v.o.) ou
dexametasona (3 mg/Kg, v.o.). No quarto dia os animais foram sacrificados.
ap<0,01 vs controle; bp<0,05 vs indometacina (ANOVA e Teste de Student
Newman Keul, como teste post hoc).
151
Controle Indometacina AC Dexametasona0
10
20
30
40
50
Indometacina
aC
atal
ase
(mm
ol/
min
/g t
ecid
o)
b
b
FIGURA 25. Efeito do Ácido Centipédico e Dexametasona sobre os níveis de
catalase nas lesões intestinais induzidas por indometacina em ratos. Os
valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6
animais/grupo. Os animais receberam indometacina 10 mg/kg durante três dias, e,
2h antes da administração, foram tratados com veículo, AC (50 mg/kg, v.o.) ou
dexametasona (3 mg/Kg, v.o.). No quarto dia os animais foram sacrificados.
ap<0,01 vs controle; bp<0,05 vs indometacina (ANOVA e Teste de Student
Newman Keul, como teste post hoc).
152
5.8.3.3. DOSAGEM DE MIELOPEROXIDASE
Os animais que receberam indometacina sozinha (controle veículo)
mostraram aumento significativo (p<0,001) nos níveis de mieloperoxidase (0.607±
0.02) quando comparados ao grupo controle normal (0.053 ± 0.039).
AC (50 mg/kg) e dexametasona (3 mg/kg) reduziram de maneira significativa
(p<0,001) os níveis de mieloperoxidase aumentados pela administração de
indometacina (0.243 ± 0.05 e 0.147 ± 0.10, respectivamente), expressos em
densidade óptica (TABELA 23 E FIGURA 26).
153
TABELA 23. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre os níveis de
mieloperoxidase nas lesões intestinais induzidas por indometacina em ratos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
MIELOPEROXIDASE
(Densidade óptica)
Controle (salina)
- 0.053 ± 0.039
Indometacina (veículo) 10 0.607± 0.02a
AC 50 0.243 ± 0.05b
Dexametasona 3 0.147 ± 0.10b
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6
animais/grupo. Os animais receberam indometacina 10 mg/kg durante três dias, e,
2h antes da administração, foram tratados com veículo, AC (50 mg/kg, v.o.) ou
dexametasona (3 mg/Kg, v.o.). No quarto dia os animais foram sacrificados.
ap<0.001 vs controle; bp<0,001 vs indometacina (ANOVA e Teste de Student
Newman Keul, como teste post hoc).
154
Controle Indometacina AC Dexametasona0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
a
bb
Indometacina
MP
O (
Den
sid
ade
óp
tica
)
FIGURA 26. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre os níveis de
mieloperoxidase nas lesões intestinais induzidas por indometacina em ratos.
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6
animais/grupo. Os animais receberam indometacina 10 mg/kg durante três dias, e,
2h antes da administração, foram tratados com veículo, AC (50 mg/kg, v.o.) ou
dexametasona (3 mg/Kg, v.o.). No quarto dia os animais foram sacrificados.
ap<0.001 vs controle; bp<0,001 vs indometacina (ANOVA e Teste de Student
Newman Keul, como teste post hoc).
155
5.8.3.4. DETERMINAÇÃO DE GRUPOS SULFIDRILA NÃO-PROTEICOS
Os animais que receberam indometacina mostraram significativa redução
(p<0,01) nos níveis de NP-SH (22.57±1.28 µg/g de tecido) quando comparado ao
controle que recebeu apenas solução salina (42.11±1.92 µg/g de tecido). AC (50
mg/kg) foi capaz de atenuar a depleção dos grupos sulfidrilas produzida pela
indometacina (33.59±3.76 µg/g de tecido) de forma significativa (p<0,05).
Dexametasona (3 mg/kg) inibiu significativamente (p<0,05) a depleção dos grupos
sulfidrilas (36.19±3.78 µg/g de tecido) produzida pela indometacina (TABELA 24 e
FIGURA 27).
156
TABELA 24. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre os níveis de
grupos sulfidrilas não protéicos nas lesões intestinais induzidas por
indometacina em ratos.
GRUPOS
DOSE
(mg/kg)
NP-SH
(µg/g)
Controle (salina)
- 42.11±1.92
Indometacina 10 22.57±1.28a
AC 50 33.59±3.76b
Dexametasona 3 36.19±3.78b
Os valores representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 6
animais/grupo. Os animais receberam indometacina 10 mg/kg durante três dias, e,
2h antes da administração, foram tratados com veículo, AC (50 mg/kg, v.o.) ou
dexametasona (3 mg/Kg, v.o.). No quarto dia os animais foram sacrificados.
ap<0.01 vs controle; bp<0,05 vs indometacina (ANOVA e Teste de Student
Newman Keul, como teste post hoc).
157
Controle Indometacina AC Dexametasona0
10
20
30
40
50
Indometacina
NP
-SH
(µµ µµ
g/g
)
a
b b
FIGURA 27. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre os níveis de
grupos sulfidrilas não protéicos nas lesões intestinais induzidas por
indometacina em ratos. Os valores representam a média ± erro padrão da média
(E.P.M.) para 6 animais/grupo. Os animais receberam indometacina 10 mg/kg
durante três dias, e, 2h antes da administração, foram tratados com veículo, AC
(50 mg/kg, v.o.) ou dexametasona (3 mg/Kg, v.o.). No quarto dia os animais foram
sacrificados. ap<0.01 vs controle; bp<0,05 vs indometacina (ANOVA e Teste de
Student Newman Keul, como teste post hoc).
158
5.8.4. EFEITO DO ÁCIDO CENTIPÉDICO NA LESÃO INTESTINAL INDUZIDA POR INDOMETACINA EM RATOS: ACHADOS HISTOLÓGICOS. Os animais que receberam apenas solução salina mostraram as camadas
mucosa, submucosa e serosa bem preservadas e presença de muco no epitélio
(característica normal nessa porção intestinal), representados pela figura 28-A.
No grupo que recebeu apenas indometacina (FIGURA 28-B), observou-se
foco inflamatório com predomínio de linfócitos e área de necrose das camadas
mucosa e submucosa (evidente formação de úlcera). Foram vistas áreas de
hemociderose e discreto edema.
Os animais tratados com indometacina que receberam AC (FIGURA 28-D)
apresentaram discreto princípio de necrose. As camadas mucosa e submucosa
foram preservadas, verificando-se ainda a presença de muco. Embora a úlcera não
tenha característica histopatológica clássica (necrose e exsudação), a presença de
debris celulares demonstra o princípio da formação da mesma.
No grupo tratado com indometacina que recebeu dexametasona (FIGURA 28-
C) há integridade da camada submucosa com discreta presença de edema.
159
FIGURA 28. Efeito do Ácido Centipédico e dexametasona sobre as lesões
intestinais induzidas por indometacina: achados histológicos. A: controle salina
(seta mostra preservação da mucosa intestinal; grupo não recebeu indometacina); B:
indometacina (seta mostra formação de úlcera com processo de necrose (células
sem núcleos (necrose); C: dexametasona (seta mostra formação de edema); D: AC
(seta mostra início da formação das úlceras com células necróticas) (— 100µm).
A B
C D
160
5.9. EFEITO DO ÁCIDO CENTIPÉDICO SOZINHO OU ASSOCIADO À INDOMETACINA SOBRE A MIGRAÇÃO CELULAR DE CÉLULAS INTESTINAIS (IEC-6).
Após o dano mecânico, realizado pelo arraste da monocamada de células
IEC-6 para a borda do poço e a exposição dessas células ao AC (12.5, 25, 50 e 100
µM) durante 24 horas, observou-se um aumento significativo na migração celular
com um aumento do número de células de (170±10.0; 173±3.33; 180±0.0; 220±9.12,
respectivamente) em relação ao meio sem glutamina (M-) (136.7±12.02) (FIGURA
29-A).
Indometacina, agente deletério de células IEC-6, nas concentrações
estudadas (250, 500 e 1000 µM), diminuiu significativamente o número de células na
migração celular nas três concentrações estudadas (80±5.77; 77.5±2.5; 30.0±0.0
respectivamente), de maneira dose-dependente quando comparadas ao meio sem
glutamina (M-) (136.7±12.02) (FIGURA 29-B).
O fato das concentrações de 250 e 500µM da indometacina não terem
mostrado diferença entre elas, nos fez associar AC (12.5, 25, 50 e 100 µM) apenas
com a menor ou a maior concentração do AINE (250 e 1000 µM). Na associação de
AC com indometacina 250 µM, o diterpeno foi capaz de proteger IEC-6 da toxicidade
do AINE de forma significativa nas concentrações de 25, 50 (p<0,01,
respectivamente) e 100 µM (p<0,001), de maneira concentração-dependente,
quando comparado a indometacina (250 µM) (65±5.0; 95±5.0; 110±10.0; 216±8.19,
respectivamente). No entanto, na associação de AC (12.5, 25, 50 e 100 µM) com
indometacina 1000 µM, ácido centipédico não conseguiu reverter o efeito da alta
dose de indometacina (36.67±3.33; 26.67±3.33; 50.00±5.77; 23.33±8.1,
respectivamente) (FIGURA 29-C).
161
M- DMSO 12,5 25 50 1000
50
100
150
200
250
Ácido Centipédico
µµµµM
* ** **
***N
úm
ero
de
célu
las
mig
ran
do
/mm
2
A
M- 250 500 10000
50
100
150
200
Indometacina
******
***
µµµµM
B
Nú
mer
o d
e cé
lula
s m
igra
nd
o/m
m2
M- DMSO 250 1000 12,5 25 50 100 12,5 25 50 1000
50
100
150
200
250
##
Indometacina 250µµµµM
ACµµµµM
Indometacina 1000µµµµM
C
Indometacina
Nú
mer
o d
e cé
lula
s m
igra
nd
o/m
m2
§
FIGURA 29: Ação do Ácido Centipédico e indometacina sozinhos ou
associados na migração das células IEC-6 após 24 horas de exposição. A
migração celular foi analisada pela leitura microscópica, em placas de 6 poços em
24 horas de exposição ao AC (12.5, 25, 50 e 100 µM), Indometacina (250, 500 e
1000 µM) ou a associação entre todas as doses de AC com indometacina (250 e
1000 µM) . Depois de 24 horas, a coluna com maior taxa de migração foi
selecionada e as células foram observadas em microscópio invertido (Nikon E400,
Japan) em um aumento de 100x. Os dados demonstram o aumento da migração
celular in vitro. *p<0.05; **p<0.01 e ***p<0.001 vs controle (meio) §p<0.001 vs
Indometacina 250 µM; #p<0.01 vs Indometacina 250 µM. Os valores foram
expressos pela média ± epm. (ANOVA e Student Newman Keuls, como teste post
hoc).
162
5.10. EFEITO DO ÁCIDO CENTIPÉDICO SOZINHO OU ASSOCIADO À INDOMETACINA SOBRE A PROLIFERAÇÃO CELULAR DE CÉLULAS INTESTINAIS (IEC-6).
AC (6.25, 12.5, 25, 50, 100 e 200µM) aumentou a proliferação celular
(0.85±0.07; 0.90±0.04; 0.97±0.09; 1.06±0.06; 1.07±0.06; 1.11±0.0, respectivamente)
nas 24 horas de exposição nas células IEC-6 quando comparado ao grupo M (-)
(0.89±0.04) (FIGURA 30-A). Não foi encontrada diferença estatisticamente
significativa entre as doses no período estudado.
O uso de indometacina (250, 500 e 1000 µM) como agente lesivo às células
diminuiu de maneira significativa a proliferação (0.59±0.0; 0.57±0.01; 0.56±0.0,
respectivamente) de IEC-6 no período de 24 horas de exposição (FIGURA 30-B).
AC (12.5, 25, 50 e 100µM) protegeu (0.72±0.0; 0.73±0.0; 0.77±0.0; 0.81±0.0,
respectivamente) as células IEC-6 contra a toxicidade causada pela indometacina
tanto na concentração de 250 (0.59±0.0), como protegeu (0.77±0.0; 0.76±0.02;
0.77±0.0; 0.78±0.0, respectivamente) na concentração de 1000 µM (0.56±0.0)
(FIGURA 30-C).
163
M- DMSO 6,25 12,5 25 50 100 2000.0
0.5
1.0
1.5
Ácido Centipédico
µµµµM
Ab
sorb
ânci
a 45
0nm
A
M- 250 500 10000.0
0.5
1.0
1.5
Indometacina
****** ***
µµµµM
Ab
sorb
ânci
a 45
0nm
B
M- DMSO 250 1000 12.5 25 50 100 12.5 25 50 1000.0
0.5
1.0
1.5
ACµµµµM
Indometacina 1000µµµµMIndometacina 250µµµµMIndometacina
a a aa b b b b
Ab
sorb
ânci
a 45
0nm
C
FIGURA 30: Ação do Ácido Centipédico e indometacina sozinhos ou
associados na proliferação das células IEC-6 após 24 horas de exposição. A
proliferação celular foi analisada pela leitura da absorbância, em placas de 96 poços,
usando o leitor de ELISA em 450 nm em 24 horas de exposição ao AC (6.25, 12.5,
25, 50, 100 e 200 µM). Após 24 horas os poços foram incubados por 2 horas com
sal tetrazólio e a absorbância foi medida. Os dados demonstram o aumento da
proliferação celular in vitro. ***p<0.001 vs meio ap<0.001 vs Indometacina 250 µM;
bp<0.001 vs Indometacina 1000 µM. Os valores foram expressos pela média ± epm.
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul, como teste post hoc).
164
5.11. ESTUDO DA TOXICIDADE AGUDA DO ÁCIDO CENTIPÉDICO.
Durante o período de observação de 180min, não se registrou nenhuma
alteração em parâmetros como motilidade, respiração, contorção, ataxia, tremor,
convulsão, postura, ereção da cauda, catalepsia, estereotopia, ptose palpebral,
piloereção, cianose, salivação, lacrimejamento, diarréia, analgesia, anestesia,
sudorese, sedação em nenhuma das doses administradas. Foi observado apenas a
diminuição da locomoção dos animais.
Ao final do período de 72h, observou-se que no grupo tratado com AC 100 e
300 mg/Kg, v.o. não houve mortes. No grupo que recebeu AC 1g/Kg, v.o. registrou-
se apenas uma morte, tendo sido observada uma diminuição da motilidade desses
animais. No grupo que recebeu AC 1,5g/Kg, v.o. registrou-se sete mortes e na dose
de 2g/kg, v.o., todos os animais morreram ao final da 72 horas. A DL50 foi verificada
na dose de 1,380 g/Kg, v.o., onde se observou a morte de cinco animais.
O gráfico mostra a DL50 (FIGURA 31) do AC em um período de 72 h após o
tratamento via oral.
165
0 500 1000 1500 2000 25000
5
10
15
Dose
Nú
mer
o d
e M
ort
os
FIGURA 31. Determinação da DL50 do Ácido Centipédico em camundongos,
após 72 h de observação.
166
6. DISCUSSÃO
As plantas medicinais estão entre as mais atrativas fontes de novas drogas, e
foi demonstrado que elas apresentam resultados promissores no tratamento males
gastrintestinais (BORRELLI & IZZO, 2000). No Brasil, um grande número de
preparações a partir de plantas é utilizado na medicina popular para o tratamento de
vários tipos de desordens gastrintestinais (GRACIOSO et al., 2002; TOMA et al.,
2002; ALMEIDA et al., 2003). Este fato, aliado a grande biodiversidade existente no
Brasil, impulsiona a pesquisa por novas drogas, a partir de produtos naturais, que
tenham ação sobre o trato gastrintestinal.
Constituintes químicos bioativos, incluindo flavonóides, terpenos, xantonas,
saponinas, alcalóides e taninos, já demonstraram ser capazes de oferecer
gastroproteção (RAO et al., 1997; SANTOS & RAO, 2001; GUEDES, 2002; BAGGIO
et al., 2005; MORIKAWA et al., 2006). Ácido Centipédico (AC) é um diterpeno de
cadeia aberta isolado de Egletes viscosa, erva popular do nordeste brasileiro para
qual já foram descritas diversas ações farmacológicas tais como hepatoprotetora
(RAO, 1994, SOUZA, 1998), antidiarreica (RAO, 1997), atividade anti-anafilática e
anti-inflamatória (SOUZA, 1992), antitrombótica (SOUZA, 1994), uroprotetora
(VIEIRA, 2004), antinociceptiva, anti-espasmódica e gastroprotetora (GUEDES,
2002, 2008). Foi verificado ainda a baixa toxicidade da planta quando verificada a
DL50 de seu extrato (GUEDES, 2002).
Estudos anteriores comprovaram atividades farmacológicas do AC (GUEDES
et al., 2002). A ansiedade da população por novas substâncias que ajudem na
resolução dos males que atingem o TGI, aliada à necessidade de drogas de baixo
custo financeiro e o nosso interesse de desvendar os possíveis mecanismos que
envolvem a ação do diterpeno, nos fez avaliar mais detalhadamente como AC age
167
sobre o estômago e o intestino. Para isso, alguns modelos experimentais foram
utilizados.
Os resultados desse trabalho confirmam nossa recente observação do efeito
gastroprotetor do AC. Nas doses orais de 12.5 - 100 mg/kg, AC impediu de maneira
dose-dependente as lesões hemorrágicas agudas da mucosa induzidas por etanol.
Essa gastroproteção mostrou ser mediada por ação antioxidante do diterpeno. Além
de proteger contra lesões induzidas por etanol, ácido centipédico também foi efetivo
na proteção das úlceras formadas por etanol acidificado. Além disso, o diterpeno
diminuiu a acidez e o volume gástrico, não alterando o esvaziamento gástrico
normal. Uma nova ação encontrada no ácido centipédico foi sua capacidade de
proteger o intestino contra lesões causadas por indometacina e sua capacidade de
proteger células intestinais da ação da indometacina na migração e proliferação
celular.
As doses utilizadas neste estudo podem ser consideradas não tóxicas com
base na DL50 de 1380mg/kg v.o. para AC, como visto neste trabalho.
Os modelos experimentais utilizados neste trabalho para a avaliação dos
mecanismos protetores gastrintestinais do AC foram selecionados por envolverem
diferentes agentes e mecanismos, conhecidos na indução de lesões do TGI.
A mucosa gastrintestinal é revestida por uma camada de muco, cujas
principais funções são a proteção e lubrificação, mas atua também como barreira de
difusão entre o lúmen e o epitélio (PEPPAS & SALLIN, 1996; EDWARDS, 1997).
Esta camada de muco desempenha ainda funções em nível do sistema imunitário,
atuando como "scavenger" de radicais livres e mantendo elevadas concentrações de
IgA e lisozima à superfície epitelial (ATUMA et al., 2001; EDSMAN &
HÄGERSTRÖM, 2005).
168
Estudos experimentais têm demonstrado que a geração de radicais livres está
associada à patogênese de lesões gástricas agudas induzidas por etanol
(RODRIGUES et al., 2008).
A patogenicidade do etanol é considerada multifatorial e pesquisas implicam o
envolvimento de mediadores pró-inflamatórios (prostaglandinas, leucotrienos, óxido
nítrico e neuropeptídeos), tióis intracelulares e cálcio, fatores hormonais
(colecistocinina, gastrina, leptina e grelina), e fatores de crescimento (EGF e TGF),
além da estimulação simpática (LIRA, 2009).
O estresse oxidativo é um processo mediado pela formação de radicais livres
diversos que resultam da degradação oxidativa dos lipídeos (lipoperoxidação) e de
proteínas presentes nos diversos sistemas de membrana da célula. Esse processo
pode ser iniciado por radicais derivados dos xenobióticos gerados em reações
catalisadas pelas isoenzimas do cit- P450 ou ainda pela produção de radicais livres
oriundos do oxigênio (O2-, H2O2 e OH+). A primeira conseqüência desse processo é
a profunda alteração das propriedades físicas e químicas das membranas, causando
perda das suas funções especializadas (ROSS, 1988).
As Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) são continuamente produzidas
durante os eventos fisiológicos normais, sendo removidas por mecanismo de defesa
antioxidante. Em condições patológicas como as provocadas pelo etanol, as EROs
resultam em peroxidação lipídica e dano oxidativo. Alterando ainda a permeabilidade
e fluidez da membrana, prejudicando as funções dos receptores, canais iônicos e
outras proteínas que fazem parte da membrana (FREEMAN & CRAPO, 1982). O
desequilíbrio entre EROs e defesa antioxidante leva à modificação oxidativa na
membrana celular, ou nas moléculas intracelulares (EL-HABIT et al., 2000).
169
Evidências clínicas e experimentais sugerem que o estresse oxidativo está
estreitamente relacionado à etiopatologia da doença ulcerosa péptica, e que
substâncias com ação antioxidante, como os diterpenos, podem desempenhar ação
gastroprotetora (REPETTO et al., 2002; THOMPSON et al., 2006; FARIA, 2009).
A mais importante defesa contra as lesões oxidativas induzidas pelas
espécies reativas de oxigênio é a manutenção da homeostase da glutationa (GSH).
A glutationa reduzida serve como substrato para a ação da glutationa peroxidase, na
remoção do radical superóxido, e da glutationa transferase, na formação do ácido
mercaptúrico, além de atuar como seqüestrador de radicais livres. Atua também
como reguladora intracelular de grupos sulfidrila de enzimas glicolíticas e de
ATPase-Ca+2 (BENZI & MORETTI, 1995). As reações dependentes da glutationa
reduzida são de fundamental importância para a proteção da célula contra o
estresse oxidativo, por manter a célula em um ambiente reduzido sob condições
fisiológicas normais.
A principal enzima antioxidante é a superóxido dismutase (SOD)
(BRZOZOWSKI et al., 2001), a qual pode ser distinguida entre: citoplasmática,
mitocondrial e extracelular. A SOD catalisa a dismutação do radical superóxido (02•-)
em um peróxido (H2O2) menos lesivo, que posteriormente é degradado pela catalase
(CAT) ou glutationa peroxidase (GPx) (KWIECIEN, et al., 2002 a). Vários tipos de
SODs têm sido relatados: a Cu,ZnSOD, a FeSOD, a MnSOD e a NiSOD (MATÉS,
2000; NOOR et al., 2002; FATTMAN et al., 2003). Esses metais agem como co-
fatores onde ocorre a dismutação do radical superóxido em peróxido de hidrogênio e
oxigênio (MEISTER, 1983).
Como etanol é agente que age comprovadamente causando estresse
oxidavo, avaliamos algumas ações do ácido centipédico sobre o estresse oxidativo
170
provocado por etanol em camundongos, a fim de verificarmos sua possível ação
antioxidante. Dessa forma, AC restabeleceu de maneira significativa a depleção dos
grupamentos sulfidrílicos, assim como protegeu a diminuição dos níveis da
superóxido dismutase, e, diminuiu significativamente a peroxidação lipídica como
evidenciado pela grande diminuição dos níveis de malonildialdeído, sugerindo sua
capacidade de prevenir o estresse oxidativo. Foi relatado que em humanos a
redução da glutationa gástrica pode ocorrer seguida do consumo de álcool e o pré-
tratamento com glutationa poderia diminuir o dano gástrico (LOGUERCIO et al.
1993).
Neste estudo, semelhantemente à N-acetilcisteína, um doador de
grupamentos sulfidrílicos, AC restabeleceu significativamente a diminuição de NP-
SH por etanol. Portanto, é concebível que AC seja dotado de propriedade
antioxidante.
Uma vez confirmada a ação antioxidante na gastroproteção do ácido
centipédico no modelo de etanol, verificamos então quais seriam outros possíveis
mecanismos envolvidos nessa atividade do diterpeno. Dentre os vários fatores
envolvidos na manutenção da integridade na mucosa gástrica e proteção contra
injúria provocada pelo etanol, direcionamos nossa atenção à contribuição das fibras
aferentes sensíveis à capsaicina, óxido nítrico endógeno, prostaglandinas (PGs) e
canais de potássio sensíveis a ATP (KATP).
Altas concentrações de etanol levam a um aumento da permeabilidade
epitelial, como conseqüência de mudanças da diferença de potencial celular que é
causado pela re-difusão de íons H+ através da mucosa lesada, e danos da mucosa
principalmente devido aos distúrbios vasculares e diminuição do fluxo sangüíneo
local (SIEGMUND et al., 2003)
171
A inervação da mucosa apresenta importante papel na proteção gástrica, em
particular, as fibras aferentes sensíveis a capsaicina têm sido implicadas
diretamente na resposta aguda à agressão da mucosa, promovendo a dilatação das
arteríolas da submucosa e aumentando rapidamente a circulação sangüínea local.
Seu efeito estaria envolvido com a ativação dos receptores TRPV1 e com a
liberação de taquicininas e de peptídio relacionado ao gene da calcitonina (CGRP),
visto que a eliminação deste efeito foi observada com vagotomia, administração de
capsazepina, um antagonista TRPV1 (SCHUBERT, 2004), antagonistas NK2 de
taquicininas e antagonistas dos receptores CGRP (MINOWA et al., 2004). A ativação
dos neurônios sensoriais por compostos como a capsaicina promove também um
aumento na produção de NO através da ativação da cNOS, com conseqüente
aumento no fluxo sanguíneo da mucosa o que reduz a susceptibilidade do estômago
a danos (EVANGELISTA, 2006). Assim, a ativação das terminações destes
neurônios aferentes protegeria a mucosa gástrica da formação das lesões
(HOLZER, 1998; HOLZER, 1991).
Foi demonstrado que algumas substâncias derivadas de plantas podem
atenuar lesões gástricas induzidas por álcool e estresse através da ativação da via
das prostaglandinas, do óxido nítrico e de nervo sensorial e, assim, melhorar a
microcirculação (ZAYACHKIVSKA, 2004 & BRZOZOWSKI, 2005).
Em nosso estudo os resultados mostraram que a capsazepina, um
antagonista do receptor TRPV1 não produziu bloqueio da gastroproteção do AC,
sugerindo que mecanismos adicionais possam estar envolvidos em sua ação
gastroprotetora. Diferentemente de sua ação sobre AC, capsazepina produziu
bloqueio da gastroproteção da capsaicina. Capsaicina é o componente ativo de
172
pimentas vermelhas, que modifica especificamente os nervos aferentes sensoriais
sensíveis à capsaicina.
O NO reduz efetivamente a injúria na mucosa gástrica provocada por agentes
químicos, além de facilitar a cicatrização do tecido lesado e a inibição da sua síntese
aumenta a susceptibilidade do estômago à injúria provocada por agentes como o
etanol (MASUDA et al., 1995; KAWANO & TSUJI, 2000). A presença de NO em
baixas concentrações está associada aos efeitos benéficos no TGI, enquanto o NO
em altas concentrações pode induzir a formação de radicais derivados do nitrogênio,
que são altamente citotóxicos (WALLACE & MILLER et al., 2000).
O efeito gastroprotetor do AC contra a lesão gástrica induzida por etanol em
camundongos foi revertido pelo tratamento com L-NAME (um inibidor não específico
das enzimas NO sintases). Dessa maneira, nossos resultados sugerem que o efeito
do ácido centipédico depende de NO, pois a inibição da produção de NO endógeno
reverteu seu efeito gastroprotetor.
As PGs mantêm a integridade da mucosa gástrica pela inibição da secreção
ácida, estimulação da secreção de muco e bicarbonato, inibição da ativação de
mastócitos, diminuição da aderência leucocitária ao endotélio vascular, inibição da
apoptose, aumento e manutenção do fluxo sangüíneo da mucosa (BATISTA et al.,
2004). As prostaglandinas apresentam particular importância na integridade da
mucosa gástrica quando mecanismos de defesa neuronal estão danificados
(PESKAR, 2001).
A inibição da síntese de prostaglandinas endógenas mediada pela
administração de indometacina aos camundongos foi capaz de reverter o efeito
gastroprotetor do ácido centipédico frente às lesões gástricas induzidas por etanol,
levando-nos a inferir que a produção de prostaglandinas está envolvida no
173
mecanismo protetor deste diterpeno. Além do mais, estudos anteriores mostraram
que ações que estimulem glutationa podem modular a produção de prostaglandina
(SAKAMOTO et al., 2000). Assim, AC por sua ação poupadora de glutationa,
poderia também por essa via, estar estimulando a produção de prostaglandina.
Peskar e colaboradores (2002) demonstraram que a gastroproteção por
vários agentes é inibida não somente pela indometacina, mas também pelo
bloqueador dos canais de KATP, glibenclamida. Estes dados sugerem que o
mecanismo de ação das prostaglandinas endógenas e exógenas envolve a ativação
dos canais de KATP (PESKAR et al., 2002). Assim, trabalhos sugerem que a
regulação da abertura e fechamento dos canais de KATP no estômago pode ser um
mecanismo de defesa da mucosa gástrica a agressões externas.
Como a proteção oferecida por AC é adicionalmente sensível à indometacina
e L-NAME, sugerimos que sob essas condições prostaglandinas endógenas e óxido
nítrico ajam como ativadores dos canais de K+ATP (EVANGELISTA, 2006 &
FRANCO, 1998) e esse mecanismo, pelo menos em parte, medeia a
gastroproteção. O bloqueio mais eficaz da gastroproteção pelo AC é confirmado pela
glibenclamida, bloqueador do canal de K+ATP. Assim, confirmamos a participação dos
canais de potássio como sendo também, um de seus mecanismos de ação.
Os resultados observados neste estudo mostraram claramente que AC simula
a gastroproteção como visto nos camundongos tratados com, misoprostol (análogo
de prostaglandina), L-arginina (agonista NOS) ou diazóxido (abre canais K+ATP).
Dessa maneira, o mecanismo de ação indica papel citoprotetor do diterpeno
oferecendo gastroproteção aos danos à mucosa gástrica induzidos por etanol. Seu
mecanismo gastroprotetor é multifatorial que possivelmente envolve um efeito
antioxidante através da ação poupadora de NP-SH (glutationa reduzida) e
174
superóxido dismutase gástricas e de diminuição de malonildealdeído, estimulação
de prostaglandinas endógenas e liberação de óxido nítrico e canais de K+-ATP,
acompanhado do aumento da microcirculação.
O muco gel aderido à superfície da mucosa gástrica protege o epitélio
subjacente contra o ácido gástrico (BELL et al, 1985; SLOMIANY et al., 1985),
pepsina (ALLEN et al., 1987) e também contra agentes necrozantes como etanol e
indometacina (ALQASOUMI et al., 2008). O muco da parede gástrica desempenha
um papel mais importante na defesa do meio gástrico contra a agressão química ou
mecânica da mucosa que o muco solúvel no lúmen do estômago (ALLEN et al.,
1986). O revestimento do muco gástrico é considerado importante por facilitar a
reparação do epitélio gástrico danificado (WALLACE, 1986).
NO está envolvido com a regulação da circulação sangüínea gástrica
(promove a diferenciação das células endoteliais nos tubos vasculares) e
estimulação direta da secreção gástrica de muco pela estimulação da guanilato
ciclase nas células epiteliais (CHO, 2001). Alguns autores demonstraram que além
do óxido nítrico, as prostaglandinas são capazes de aumentar a secreção de muco
no estômago (BROWN et al., 1992).
No modelo de úlcera por etanol, nossos resultados revelaram que AC
protegeu significativamente a mucosa contra o esgotamento de muco da parede
gástrica. Esse resultado corrobora com o achado de que tanto NO como
prostaglandinas participam do mecanismo gastroprotetor do diterpeno. Assim, é
provável que a atividade citoprotetora do AC possa ser, pelo menos em parte, pela
interação com a camada aderente de muco gástrico. E que o aumento nos níveis de
muco gástrico e a síntese de prostaglandinas também pode contribuir para o efeito
gastroprotetor do AC.
175
Dando continuidade aos estudos gastroprotetores do ácido centipédico,
decidimos analisar esse diterpeno em modelo de etanol acidificado.
A administração oral da solução de etanol acidificado para o grupo controle
produziu claramente as características lesões necrozantes na mucosa. ETOH/HCl
induziu longas úlceras e petéquias em relativo curto espaço de tempo. Segundo
Mizui e Doteuchi (1983), a administração de uma solução irritante de etanol
acidificado em camundongos, produz lesões necrozantes na mucosa gástrica,
principalmente devido à debilidade da mucosa protetora e da exacerbação da
secreção ácida gástrica e de pepsina (pepsinogênio é convertido a pepsina em meio
ácido).
O pré-tratamento com AC (50mg/kg v.o.), de maneira semelhante ao
lansoprazol (30mg/kg v.o.), protegeu contra as lesões causadas pelo ETOH/HCl. A
associação entre essas duas drogas mostrou uma potenciação de seus efeitos.
Inibidores da bomba de prótons são largamente usados para tratar
hiperacidez e úlceras estomacais (BASTAKI, 2008). Essas drogas quando
comparadas com outros inibidores de secreção ácida, têm se mostrado como uma
das categorias de mais sucesso descobertas recentemente (CHANDRANATH et al.
2002). Substâncias que têm a habilidade de suprimir a secreção ácida gástrica, tais
como os inibidores da bomba de prótons e antagonistas dos receptores H2 de
histamina são acreditados para acelerar o processo de cicatrização das lesões
gástricas ou inibir a formação de lesões na mucosa (BRZOZOWSKI et al, 2000).
Além do mais, essas drogas mostraram possuir comprovada atividade antioxidante
(SCHULZ-GESKE et al., 2003; BISWAS et al., 2009)
No presente estudo, etanol acidificado foi administrado em camundongos no
intuito de excluir a possibilidade de apenas a atividade anti-secretória possa ser
176
responsável pelo efeito protetor do ácido centipédico. AC inibiu as lesões gástricas
por ETOH/HCl similarmente ao lansoprazol, droga que tem mostrado possuir
atividade citoprotetora (YUJI NAITO, 2007) e antioxidante (PARAMESWARI et al.,
2010; HIGUCHI et al., 2009). Dessa forma, é possível que a prevenção das úlceras
por AC e lansoprazol possa ser parcialmente atribuída por sua habilidade em
suprimir a secreção ácida e proteger contra estresse oxidativo, como descrito
anteriormente.
As investigações sobre os mecanismos de defesa da mucosa gástrica
concentram-se principalmente sobre os processos locais da mucosa. Pouco se sabe
sobre como o sistema nervoso central pode influenciar a defesa da mucosa gástrica.
No entanto a proteção da mucosa gástrica induzida por mecanismo central já foi
descrita (TACHE ET AL., 1994; GYIRES, 1997; GUIDOBONO ET AL., 1998;
KANEKO ET AL., 1998; YANG ET AL., 1999).
Estudos anteriores mostraram que receptores opioides e α2-adrenérgicos
estão envolvidos no mecanismo de gastroproteção no modelo de úlcera induzida por
etanol acidificado (GYIRES, 2000; 2001). Segundo Gyres (2000) há uma interação
entre receptores pré-sinápticos α2-adrenérgicos e sistema opiode e que clonidina
pode induzir gastroproteção por mecanismos centrais.
O nosso estudo demonstrou que o efeito gastroprotetor do AC contra a lesão
gástrica induzida por etanol acidificado em camundongos é revertido pelo tratamento
com naloxona (um antagonista não-seletivo de receptores opioides) ou com ioimbina
(antagonista α2-adrenérgico). Dessa forma, podemos afirmar que o mecanismo pelo
qual AC faz proteção gástrica nesse modelo, envolve pelo menos, receptores α2-
adrenérgicos e opioides.
177
O ácido pode ser visto como a primeira linha de defesa da mucosa, por causa
de sua importância na redução da possibilidade de colonização bacteriana no
estômago. Da mesma forma, o muco secretado na superfície luminal tem um
importante papel na prevenção da colonização bacteriana e translocação
(WALLACE, 2001).
Acredita-se que o aumento da secreção de ácido gástrico seja pela a ativação
do refluxo vago-vagal por estimulação dos receptores de pressão na mucosa
gástrica antral no modelo de hipersecreção de ligadura do piloro (BAGGIO et al.,
2003).
A secreção gástrica é regulada principalmente pelos estimulantes diretos da
célula parietal, acetilcolina, gastrina e histamina (HERSEY & SACHS, 1995). A
acidez da mucosa não representa um fator importante no modelo de úlcera gástrica
induzida por etanol (TARNAWSKI, et al., 1985), porém tem enorme relevância no
efeito ulcerogênico do etanol acidificado e da indometacina (FUNATSU et al., 2007).
Assim, a redução do volume secretório gástrico basal assim como a acidez titulável
promovido pelo AC no modelo de animais com piloro ligado por 4 horas, estimulando
possivelmente a ação da prostaglandina (TAKEUCHI, 2006), nos leva a sugerir que
este efeito possa estar envolvido no seu mecanismo gastroprotetor.
As prostaglandinas são de particular importância para a manutenção da
integridade da mucosa gástrica quando os mecanismos de defesa neuronal são
danificados (PESKAR, 2002). A habilidade de AC proteger contra as úlceras
gástricas induzidas por indometacina (GUEDES, 2002) pode ser devido ao aumento
da síntese de prostaglandinas e ou da reduzida secreção ácida observada no
modelo piloro-ligado em ratos.
178
Dispepsia funcional é um complexo de sintomas caracterizados por
desconforto pós-prandial superior ou dor abdominal, saciedade precoce, náusea,
vômito, distensão abdominal, flatulência e anorexia, na ausência de doença orgânica
(LEE et al., 2006).
Sabe-se que a modulação farmacológica do esvaziamento gástrico e da
mistura ácido-base representa um mecanismo de defesa gástrica importante na
dispepsia funcional. Os mecanismos que participam da origem dos sintomas na
dispepsia funcional não são perfeitamente conhecidos e as anormalidades da
motilidade antro-piloro-duodenal constituem, provavelmente, o grupo de fatores
etiopatogênicos que tem sido demonstrado há mais tempo e com maior freqüência
(TRONCON, 2001).
O tratamento farmacológico para pacientes com dispepsia funcional continua
a ser insatisfatório. Assim, é provável que agentes supressores da acidez e agentes
procinéticos sejam, na melhor das hipóteses, eficazes em alguns subgrupos de
pacientes dispépticos (LEE et al., 2006).
Uma vez verificada a ação anti-ácida do AC, verificarmos a possibilidade de
uma ação pró-cinética do diterpeno. Analisamos então o diterpeno sobre o
esvaziamento gástrico normal. No entanto, no presente trabalho observamos que o
ácido centipédico não altera a o esvaziamento gástrico normal. Como AC diminuiu o
volume gástrico no modelo de piloro ligado, é possível que a pressão no esfíncter
pilórico esteja menor e por isso, não altere o esvaziamento gástrico. Entretanto
maiores estudos merecem ser realizados para analisar a ação desse diterpeno na
existência de alguma alteração no esvaziamento.
Helicobacter pylori é uma bactéria gram-negativa espiral que coloniza o
estômago e o duodeno humano e está associada com várias doenças
179
gastroduodenais, incluindo gastrite, úlcera péptica, e linfoma de mucosa gástrica de
baixo grau associado a tecido linfóide (MALT). A erradicação de H. pylori é o
tratamento recomendado para esses casos (MALFERTHEINER et al., 2007)
A terapia mais amplamente difundida para erradicação da bactéria é tripla
com amoxicilina, claritromicina e um inibidor de bomba de próton duas vezes ao dia
por 7 dias, sendo a eficácia deste protocolo de 74% -76% (VERGARA et al., 2003).
As razões para a sua ocasional falha não são claras, embora a resistência
bacteriana e a baixa adesão do paciente sejam considerados os principais fatores
(HUNT, 1996).
Vários estudos avaliaram novos antibióticos (por exemplo, levofloxacina,
moxifloxacina, furazolidona e rifabutina) e diferentes esquemas terapêuticos para
aumentar a eficácia do tratamento para Helicobacter pylori (MIEHLKE et al., 2006;
DAGHAGHZADEH et al., 2007; RISPO et al., 2007 e SEZGIN et al., 2007) e, a
necessidade de descoberta de novas drogas com atividade anti-h.pylori é iminente,
tendo em vista os danos gastroduodenais causados por essa bactéria.
Os produtos naturais, por sua grande diversidade, surgem como boa
alternativa para tratamento desses males gastroduodenais. Kim et al. (2008)
mostrou a atividade anti- h. pylori promissora de ecabet sódico, um derivado do
ácido dihidroabietico que foi inicialmente purificado a partir da resina de um pinheiro.
AC foi testado em sua possível atividade contra Helicobacter pylori. Apesar de
há mais de uma década, diterpenos já terem mostrado atividade anti- Helicobacter
pylori (KADOTA et al., 1997, YIN et al., 2008) , nosso diterpeno não demonstrou
possuir tal característica, porém, poderia ser indicado por exemplo, como terapia
adjuvante.
180
A reepitelização é um fator crucial tanto na injúria à mucosa gastrintestinal
como na cicatrização das úlceras. Tem-se visto que a cicatrização de úlceras
gástricas é um processo complexo e bem regulado de preenchimento da mucosa
defeituosa com proliferação e migração de células epiteliais do tecido conectivo
(TARNAWSKI et al., 2001).
Verificamos também a ação cicatrizante do AC sobre úlceras crônicas
induzidas por ácido acético após 7 ou 14 dias de tratamento com o diterpeno.
O processo de cicatrização de úlceras gástricas é afetado pelo ácido
intraluminal (HALTER, et al., 1980). Agentes anti-secretores como o omeprazol,
promoveram a cicatrização das úlceras gástricas induzidas por ácido acético em
ratos (YAMAMOTO, et al., 1984).
Os resultados do presente estudo mostraram pela primeira vez que o
tratamento com AC acelerou a cicatrização das úlceras crônicas comparando-se a
uma droga já estabelecida no mercado (ranitidina) após 7 ou 14 dias de tratamento
com as mesmas.
Bloqueadores H2 não exibiram efeito definido na cicatrização de úlceras por
ácido acético, mesmo sob administração de doses extremamente altas e freqüentes
(quatro vezes ao dia). Uma possível explicação para esse resultado é a falta de
inibição consistente da secreção ácida, por a droga apresentar apenas um período
limitado de eficácia que dura por 3 ou 4 horas seguidas de sua ingestão
(RAJENDRA et al, 2004).
O controle negativo, celecoxibe, retardou o processo de cura tanto em 7 como
em 14 dias de tratamento. Berenguer et al (2002) relatou que o celecoxibe, um
inibidor seletivo da COX-2, retardou significativamente a cicatrização de úlceras por
ácido acético em ratos. Berenguer sugeriu que o mecanismo de down-regulation da
181
COX-2 está envolvido no mecanismo de retardo da cura. Baatar et al. (2002)
examinou os efeitos do celecoxibe na cicatrização de úlceras esofágicas induzidas
por ácido acético em ratos, em nível celular e molecular. O autor constatou que o
celecoxibe causou um retardo significativo na cicatrização de úlceras esofágicas,
reduzindo a proliferação das células epiteliais do esôfago, provavelmente por down-
regulation da via de sinalização GF/c-Met-Erk2. Shen (2005) mostrou que NS-398
(inibidor seletivo cox-2) causou um retardo significativo na cicatrização de úlceras de
ácido acético em ratos, possivelmente pelo aumento da supressão dos níveis de PG
na mucosa gástrica ulcerada.
Não se pode esquecer de que vários fatores de crescimento, como o fator de
crescimento fibroblástico básico (bFGF), por exemplo, também são importantes na
cura de úlceras gástricas. Vários estudos têm mostrado que bFGF exerce um efeito
de promoção na cicatrização de úlceras gástricas e duodenais induzidas
experimentalmente em ratos (SATOH et al., 1987; FOLKMAN et al., 1991). Este fator
de crescimento é um potente mitógeno de células endoteliais que afetam a
proliferação de outros tipos de células, incluindo fibroblastos, células musculares
lisas e células epiteliais que são necessárias para a substituição de tecidos no local
da úlcera (FOLKMAN & KLAGSBRUN, 1987). Já foi descrito que o extrato aquoso
de folhas Buddleja globosa, uma planta utilizada tradicionalmente no Chile para
cicatrização de feridas, aumenta o crescimento de fibroblastos (MENSAH et al.,
2001).
Nossos estudos verificaram que o tratamento com AC e ranitidina, mas não
com celecoxibe, demonstrou melhor desempenho no processo de cicatrização.
Como verificado nos achados histológicos, houve maior atividade fibroblástica nos
grupos AC e ranitidina; evento que não foi bem visualizado no grupo tratado com o
182
inibidor da cox-2 nem aos 7, nem aos 14 dias de tratamento. Corroborando com
esses resultados, a análise dos parâmetros: hemorragia, edema, congestão,
esfoliação, infiltrado inflamatório, necrose e angiogênese também mostrou melhor
desempenho do AC e ranitidina.
Prostaglandinas aceleram a cicatrização de úlceras em modelos
experimentais e em humanos (SONTAG et al., 1994; HAWKEY et al., 1998). Os
mecanismos responsáveis por este efeito não são totalmente compreendidos, mas a
capacidade das prostaglandinas reduzirem a secreção de ácido gástrico contribui
para a aceleração da cicatrização de úlceras (como é observada com outros
fármacos anti-secretores) (WALLACE, 2008). A capacidade das prostaglandinas de
estimular a secreção de muco e bicarbonato também pode contribuir
significativamente para a promoção da cura da úlcera (MA et al., 2000).
Todas essas ações acima atribuídas às PGs são encontradas no AC
estudadas no presente trabalho. Assim, além das comprovações encontradas
histologicamente, encontramos mais esses indícios que mostram a ação cicatrizante
de AC.
Células inflamatórias ativadas e acumuladas nas lesões foram encontradas
para serem destruídas por apoptose, para promover a resolução da inflamação
aguda e durante o processo de cicatrização (SAVILL, 1997). A apoptose também
possui um papel importante na remodelação do local inflamado pela destruição de
miofibroblastos (AKIBA et al.,1998).
Ainda nos achados histológicos foi encontrado grande foco inflamatório no
grupo celecoxibe no dia 14 de tratamento e, o tratamento com AC, diminuiu esse
foco inflamatório. Podemos então sugerir que a diminuição do foco inflamatório seja
183
também uma das formas pelas quais AC pode estar melhorando o processo de
cicatrização.
O resultados do AC no modelo de úlcera por ácido acético revelam a elevada
capacidade de cicatrização deste diterpeno. Essa capacidade pode se dever, pelo
menos em parte, pela diminuição da acidez gástrica, pela produção de muco
gástrico e pela diminuição dos escores dos parâmetros histológicos analisados, além
da estimulação da síntese de prostaglandinas.
No presente trabalho, examinamos também a atividade do AC na ulceração
intestinal induzida por indometacina (agente lesivo plurimecanístico) em ratos e
investigamos alguns mecanismos envolvidos nessa ação, especialmente em relação
a sua ação antioxidante e protetora da formação de úlceras intestinais. O tratamento
com indometacina restingiu-se a três dias para ser evitada a morte dos animais em
consequência do aumento da permeabilidade vascular.
Indometacina (1 - (4-clorobenzoil)-5-metoxi-2-metil-1H-indole-3-ácido acético)
é um inibidor não-seletivo da ciclooxigenase, que inibe a formação de prostanoides.
A utilidade clínica dos antiinflamatórios não-esteróides (AINE) é limitada por sua
toxicidade gastrintestinal e renal. Indometacina (um AINE comumente usado em
estudos de toxicidade) tem mostrado induzir significante estresse oxidativo e
disfunção mitocondrial no rim de ratos (VARGUESE et al., 2009).
Indometacina causa toxicidade renal, inibindo a enzima ciclooxigenase no
glomérulo, produzindo vasoconstrição. Esse AINE pode levar à insuficiência renal
através de vários mecanismos: o mais importante desses é a diminuição dos níveis
de prostaglandinas, que regulam vasodilatação arterial e glomerular, embora
também possa produzir necrose tubular aguda, devido à toxicidade direta ou a
184
nefrite intersticial aguda (PARAZELLA, 2003; TABER & MUELLER, 2006; KRAUSEL
et al., 2005; ULINSKI et al., 2004).
Seu efeito renal também importante, pode resultar em oligúria, aumento das
concentrações séricas de uréia e creatinina, além da redução na taxa de filtração
glomerular e excreção urinária de sódio. Em geral, há um aumento leve e transitório
dos níveis de creatinina sérica, mas às vezes aumentos são intensos (JOHN et al.,
1984).
Como a toxicidade renal é comum durante o uso de indometacina e também
fator limitante, decidimos verificar essa ação, embora nosso trabalho esteja
direcionado à ação gastrintestinal.
A administração de indometacina (10mg/kg, v.o.) em alta dose, por três dias
consecutivos, não alterou os níveis séricos de uréia, mas elevou os níveis de
creatinina, mostrando possível toxicidade, que não foi revertida nem por AC, nem
pela dexametasona (3mg/kg).
Um dos métodos de estudo da função renal mais amplamente utilizados, é a
estimativa dos níveis de nitrogênio não protéico no sangue, ou seja, determinação
dos níveis séricos de uréia e creatinina. (COLES, 1984).
Os fatores que influenciam os níveis de creatinina e de uréia são os mesmos,
com algumas exceções. A creatinina sérica não sofre interferência da dieta, e nem é
tão facilmente influenciada pelos fatores catabólicos que afetam a formação de
uréia. (COLES, 1984)
Como ocorre com a uréia, a creatinina é um índice grosseiro da filtração
glomerular. Uma severa perda muscular poderá reduzir a quantidade de creatinina
formada, por exemplo. De forma semelhante à uréia, uma redução na taxa de
filtração glomerular aumenta a concentração sérica de creatinina. Os mesmos
185
fatores pré-renal, renal e pós-renal que influenciam a uréia também afetam a
creatinina sérica. (MEYER et al., 1995).
Segundo Knottenbelt et al. (1998), as concentrações séricas de creatinina e
cálcio são indicadores bioquímicos úteis da insuficiência renal, pois sofrem
elevações significativas dentro de um período relativamente curto. A concentração
sérica de uréia é indicador menos confiável da insuficiência renal.
Observou-se que os níveis de uréia não foram alterados, e, embora AC não
tenha revertido os níveis séricos de creatinina, é precoce afirmar sua falta de
proteção contra a nefrotoxicidade da indometacina. Estudos mais acurados seriam
necessários para avaliação do papel de AC sobre a função renal.
Dano hepático por AINEs é raro, mas estes medicamentos não devem ser
usados em pessoas com cirrose hepática, pois problemas de sangramento e
insuficiência renal são mais susceptíveis (RISSER ET AL., 2009).
Quanto ao relacionamento entre o fígado e derivados do ácido araquidônico,
muito se aprendeu entre as interações de fígado/prostaglandinas (PGs), sob
condições normais e patológicas. No entanto, ainda restam dúvidas a se esclarecer
(NEEDLEMAN et al., 1986). Fisiologicamente, o fígado sintetiza todos os principais
metabólitos da cascata do ácido araquidônico, incluindo PGs. Foi constatado que
PGs estão envolvidas em vários processos fisiológicos no fígado, incluindo
vasoregulação, agregação plaquetária e mediação da inflamação (NEEDLEMAN et
al., 1986).
As transaminases ou aminotransferases são provas de função hepática. TGP
é mais específica para as doenças hepáticas, já que a TGO pode ser encontrada
em outros órgãos que não o fígado, porém em menor quantidade (como o músculo
cardíaco, músculo esquelético, rins e cérebro).
186
Como era de se esperar, não foram observadas diferenças entre os grupos
tratados com indometacina e o grupo controle, uma vez que o tratamento precoce (3
dias) com indometacina não teve tempo suficiente para uma possível alteração
hepática.
Elevações de transaminases são comumente associadas com o uso de
AINEs; entretanto, insuficiência hepática é muito rara. Recomenda-se a dosagem
das enzimas e testes de função hepáticas, apenas oito semanas após o início da
terapia crônica com AINE (MONTEIRO et al., 2008).
Estudos anteriores mostram que a administração de indometacina por via
subcutânea de 20 mg/kg (uma vez por dia durante 2 dias) provocou graves lesões
hemorrágicas e diminuição dos níveis de PGE2 no intestino delgado, e 80% dos
ratos morreram dentro de 9 dias (MIURA et al., 2007). Sabe-se que a extensão das
úlceras provocadas por indometacina é dose-dependente (NYGARD et al., 1994;
ANTHONY et al., 1996; ETTARD & CARR, 1993).
Em ratos, a administração de indometacina produz inflamação crônica distal
do jejuno e íleo caracterizada pelo aumento da permeabilidade da mucosa e
translocação bacteriana (BANERJEE & PETERS, 1990; YAMADA et al., 1993;
COLPAERT et al., 2001)
Vários agentes mostraram ter efeito protetor no modelo de enteropatia
induzida por indometacina que resulta em injúrias relativamente leves e baixa
letalidade, como por exemplo, análogos de prostaglandinas (KUNIKATA et al.,
2002), thiaton um antiespasmódico (KUNIKATA et al., 2002), fator de crescimento de
fibroblasto (JEFFERS et al., 2002) e antagontista H2 (KATO et al., 2000).
Em nosso estudo foi analisada a quantificação das úlceras dos ratos que
receberam indometacina. A administração de indometacina produziu inflamação
187
crônica com extensa ulceração confluente pontual e longitudinal localizadas
principalmente ao longo da borda mesentérica do jejuno e íleo proximal. AC (50
mg/kg) e dexametasona (3 mg/kg) apresentaram menor número de úlceras
longitudinais formadas quando comparados ao grupo tratado apenas com
indometacina; embora AC tenha formado ainda um número considerável de úlceras
pontuais. O fato do diterpeno ter apresentado poucas úlceras longitudinais e ter
formado mais úlceras pontuais nos faz levantar a hipótese de sua capacidade
protetora intestinal, uma vez que úlceras longitudinais por deixarem mais delgada a
espessura do tecido, teriam mais probabilidade de perfuração do mesmo.
Há possibilidade de AC ter ação sobre a permeabilidade vascular que se
encontra alterada nos animais que recebem indometacina. A formação apenas de
pequenas úlceras é uma informação que nos faz acreditar nessa teoria. Estudos
futuros sobre a resistência elétrica transepitelial nos confirmarão essa possível ação
do diterpeno.
A administração de indometacina pode resultar em inflamação do intestino
delgado em animais experimentais como cães e ratos (STEWAT et al., 1980; KENT
et al., 1969). Além de um aumento da síntese dos leucotrienos, outros possíveis
mecanismos têm sido propostos como sendo tão ou mais importantes, para a
indução da doença intestinal. Entre estes, a capacidade de desacoplamento da
fosforilação oxidativa (levando à diminuição de reservas celulares de adenosina
trifosfato) (SOMASUNDARAM et al., 1995), a inibição da atividade desaturase
(levando a um desequilíbrio na relação ácidos graxos saturados versus
poliinsaturados da membrana da célula epitelial) (COOPER, 1977), a ação
detergente na borda de escova (alterando o propriedades da camada de muco)
(GULLIKSON et al., 1982) e deposição de fibrina intravascular (ANTHONY et al.,
188
1996), juntamente com vasoconstrição esplâncnica levando à isquemia local, têm
sido sugeridos como patogênicos (FEIGEN et al., 1981).
Enquanto os mecanismos de doenças do intestino delgado induzidas por
indometacina é um assunto de debate, as circunstâncias em que a indometacina
pode ou não causar doença nesse órgão são mais claras. As influências da bílis
(REUTER et al., 1997; BRODIE et al., 1970; YAMADA et al., 1993, 1996) , dieta
(BJARNASON et al., 1992; HOND et al., 1999; TUREK & SCHOENLEIN, 1993;
MATSUMOTO et al., 1994) e bactérias luminais (KENT et al., 1969; YAMADA et al.,
1993; ROBERT & ASANO, 1977; SATOH et al., 1983; KONAKA et al., 1999) têm
sido há algum tempo, extensivamente estudadas. A ausência da doença em
condições de livre de patógenos versus convencional é um pilar em todos os
modelos de doença inflamatória intestinal, incluindo o modelo de indometacina
(ROBERT & ASANO, 1977).
Antiinflamatórios como a indometacina induzem a lesão intestinal em
proporção direta à sua capacidade de serem excretados na bile, e são conhecidos
por se associar quimicamente com fosfatidilcolina. Assim, fosfatidilcolina biliar
desempenha um papel importante na proteção fisiológica do epitélio gastrintestinal
das ações citotóxicas dos sais biliares. A capacidade de AINEs excretados na bile se
associar com micelas mistas de sais biliares e reduzir a ação protetora da
fosfatidilcolina pode ser um componente crítico no mecanismo patogênico dessas
drogas (DIAL et al., 2008).
Foi proposto por Naito et al. (1998) que as espécies reativas de oxigênio
mediadas pela peroxidação lipídica são uma das principais causas de lesões
gastrintestinais induzidas por indometacina. O comprometimento estrutural e
funcional das mitocôndrias (patologia mitocondrial) induzido por indometacina leva
189
ao estresse oxidativo mitocondrial associado com a geração de espécies reativas de
oxigênio intramitocondrial. A perda estrutural e funcional das mitocôndrias é comum
em danos celulares por estresse oxidativo (TAKEUCHI et al., 1991).
A fim de verificarmos uma possível ação antioxidante do AC no modelo de
úlcera intestimal induzida por indometacina, estudamos parâmetros de estresse
oxidativo tais como MDA que é produto da peroxidação, MPO usada como indicador
de enzima pró-oxidante, NP-SH e Catalase como enzimas de defesa antioxidante.
Verificou-se que houve aumento nos níveis de MDA formado nos animais
tratados com indometacina em comparação ao controle. Estas observações foram
reforçadas pelos resultados da atividade de mieloperoxidase que foi aumentada e a
atividade de catalase e NP-SH que foi diminuída.
A atividade de Mieloperoxidase, que é considerada um marcador enzimático
de neutrófilos, é fonte de radicais livres. Aumento na atividade dessa enzima indica
aumento na geração de radicais livres. Diminuição das atividades das enzimas de
limpeza de radicais livres como catalase e glutationa redutase, sugerem a presença
de estresse oxidativo, produzido em resposta à administração de indometacina.
(SIVALINGAM et al., 2007).
Um aumento na geração de radicais livres pode conduzir à oxidação de
lipídios e proteínas, que são importantes componentes das biomembranas. Tais
alterações podem levar a alterações nas biomembranas, resultando em
funcionamento prejudicado destas estruturas (BRASITUS & SCHACHTER, 1984;
BRASITUS et al., 1984).
No estudo realizado por Sivalingam et al. (2007) a diminuição da viabilidade
de enterócitos em resposta a indometacina, foi explicada com base no aumento dos
níveis de produtos da peroxidação que foram detectados e que são prejudiciais ao
190
funcionamento dessas células. Assim, extrapolando os resultados obtidos com
animais tratados com ácido centipédico, é provável que sua ação antioxidante
viabilize enterócitos não permitindo que a injúria provocada por indometacina seja
tão evidente nos animais.
Em modelos animais, a lesão gastrintestinal induzida por indometacina está
associada a alterações agudas na morfologia, ou seja, contração do vilo da
musculatura lisa, lesão microvascular e as alterações na permeabilidade
(BATTARBEE et al., 1996)
A administração de indometacina resulta em aderência e emigração
leucocitária, como avaliada por microscopia intravital (ARNDT et al., 1995, 1996).
Progressiva infiltração neutrofílica acontece entre 6 e 48 horas pós-indometacina
(NYGARD et al., 1994). Isso não quer dizer, porém, que os granulócitos são
exclusivamente responsáveis pela patologia. Além disso, o soro anti-neutrófilo nem
sempre tem sido mostrado ter um papel preventivo neste modelo (YAMADA et al.,
1993; MELARANGE et al., 1995). Outras células se infiltram no intestino, embora
seja mais tarde do que os neutrófilos. Entre elas estão os macrófagos, situados em
torno das úlceras em 48 h após a indução, (NYGARD et al., 1994) e linfócitos
(BARBACCI et al., 1992).
Nos achados histológicos do nosso estudo, em concordância com estudos
anteriores, indometacina promoveu lesão intestinal resultando em necrose, focos de
hemociderose e presença de linfócitos na região ulcerada. AC de maneira
interessante, pareceu retardar o processo de formação da úlcera, por ter sido
visualizado um princípio de necrose com o início do desenvolvimento da úlcera
somente após 3 dias de tratamento, e, no grupo tratado com indometacina já ser
191
possível visualizar a úlcera no mesmo período. Essa informação pode justificar a
maior visualização macroscópica de úlceras pontuais e não longitudinais.
A barreira funcional epitelial consiste em uma monocamada contínua de
células especializadas, polarizadas em constante e rápida renovação celular
(CEREIJIDO et al., 2000). O turnover das células epiteliais intestinais e da barreira
funcional intestinal, que envolve proliferação, migração, diferenciação, apoptose e
necrose celular, é um processo dinâmico, marcadamente afetado pelo estado
nutricional e pelo adequamento de nutrientes específicos na dieta (ZIEGLER et al.,
2003).
A superfície das células epiteliais intestinais é continuamente exposta a
agentes nocivos e ingesta de abrasivos que podem causar lesões na mucosa
(DIGNASS, 2001). Esse epitélio desempenha um importante papel na prevenção da
translocação de substâncias ou organismos nocivos presentes no lúmen do intestino
e na manutenção da homeostase (DIGNASS & PODOLSKY, 1995). O tecido
intestinal é altamente dinâmico no qual o ciclo celular pode ser concluído em
questão de poucos dias (POTTEN et al., 1992).
O processo pelo qual a integridade do epitélio intestinal é restabelecida após
lesão foi denominado de restituição epitelial (MORRIS & WALLACE, 1981). Foi
demonstrado que o processo de restituição envolve migração celular e proliferação.
O processo inicial de migração ocorre muito rapidamente e, portanto, acredita-se
ocorrer independente da divisão celular (SILEN & ITO, 1985). Células ao redor da
área danificada migram para restabelecer a integridade da mucosa. A proliferação
dessas células, então, conclui o processo de reparação. A proliferação começa de
12-16 h após um insulto a mucosa e se completa em 1-2 dias (YEOMANS et al.
1973).
192
A migração de células do epitélio intestinal é modulada por uma grande
variedade de efetores citoplasmáticos associada com um número de vias de
sinalização (DIGNASS, 2001; Pai et al., 2001). Infelizmente há falta de
conhecimento sobre os efeitos globais dos AINEs sobre os componentes destas
complexas redes de transdução de sinal (RAVEEDRAN et al., 2008). Apesar da
exaustiva investigação, os mecanismos responsáveis por danos gastrintestinais
associados aos AINEs não estão completamente esclarecidos. As evidências
mostradas até agora sugerem que os AINEs podem promover a formação de úlcera,
não só por inibição da ciclooxigenase (COX) da mucosa e diminuindo
prostaglandinas (PGs) citoprotetoras, mas também por influenciar negativamente a
microflora intestinal, o recrutamento de neutrófilos, hidrofobicidade de superfície e
restituição epitelial (LICHTENBERGER, 2001;
LITTLE et al., 2007). Raveedran et al. (2008) sugere que as calpainas também
tenham papel na toxicidade gastrintestinal dos AINEs.
AINEs como indometacina, contribuem para a formação de úlceras
gastrintestinais por inibir a migração de células epiteliais e restituição da mucosa.
Sabe-se que a inibição da migração dessas células é independente da depleção
poliamina e está associada com despolarização do potencial de membrana e
diminuição da expressão de superfície de canais heteroméricos K(v)1 (FREEMAN et
al., 2007).
Em nosso trabalho verificamos, in vitro, a ação do AC sobre células intestinais
normais e que receberam injúria por indometacina. Para tal, utilizamos linhagem de
células IEC-6 que é comumente utilizada em modelos in vitro de monocamadas de
células. Uma das razões escolhidas para utilização de IEC-6, é que essas células
não transformadas têm sido amplamente utilizadas para estudar a migração de
193
células do epitélio intestinal (e outros parâmetros), e há conhecimento abundante
sobre as vias de transdução de sinais envolvidas na sua migração (MCCORMACK E
JOHNSON, 2001; GUO et al., 2002; RAO et al. 2002 ; FREEMAN et al., 2007).
Em nosso estudo foi feita uma ranhura com uma lâmina na monocamada
confluente de células IEC-6, e, permitiu-se que as células migrassem para a área
desnudada após 24h. Os resultados indicaram que AC sozinho aumenta a migração
das células IEC-6; sendo que as doses mais efetivas foram de 25, 50 e 100 µM. A
associação de AC (100µM) com indometacina (250 µM) um reconhecido agente
lesivo de IEC-6 mostrou ter potente eficácia na prevenção da toxicidade causada
pelo AINE, quando verificamos que o número de células que migram retornam ao do
AC sozinho. 24h após a migração foi previsto como tempo suficiente para um
número adequado de células migrarem para a área ferida (RUTHING, 1999).
A proliferação e migração celular são fenômenos cinéticos agindo em
conjunto para alternar a função celular através de renovação e reparação
(DIGNASS, 2001). A proliferação das células epiteliais é necessária para reconstituir
um pool de células diminuído. Isto exige um equilíbrio entre a proliferação de células
progenitoras e a perda de células maduras (HALL et al., 1994). Processos
inflamatórios, como nas injúrias por indometacina, podem interferir com a migração e
proliferação das células epiteliais e, assim, modular a cicatrização do epitélio
intestinal (DIGNASS, 2001).
Nossos resultados evidenciaram a importância da presença do ácido
centipédico para melhorar a barreira intestinal exposta a uma condição de estresse.
Além de influir sobre a migração das células IEC-6, o diterpeno também mostrou
habilidade sobre a proliferação celular. Nossos achados mostram que AC (12.5-100
µM) foi capaz de proteger a diminuição na proliferação celular provocada pela
194
administração de indometacina, e, mesmo sozinho AC tem tendência ao aumento da
proliferação.
Fatores de crescimento fibroblástico estão envolvidos na proliferação,
migração e diferenciação celular (ORNITZ & ITOH, 2001). Fator de crescimento
fibroblástico 10, fator transformador de crescimento-β, fator de crescimento derivado
de plaquetas e fator de crescimento endotelial vascular estão entre os que modulam
a proliferação e migração de IEC-6 (WALSH et al., 2008). Eles também são
importantes reguladores da morfogênese epitelial, reparação e citoproteção
(ORNITZ & ITOH, 2001).
A migração celular é modulada por uma variedade de fatores incluindo
peptídeos regulatórios, substratos metabólicos, citocinas, integrinas, matriz
extracelular e poliaminas (MCCOMACK & JOHNSON, 2001). Vários estudos têm
enfocado a importância de vários nutrientes na migração celular em células
intestinais (KAUR & POTTEN, 1986; MCCORMACK et al., 1999; MCCOMACK &
JOHNSON, 2001), entretanto pouco se sabe sobre a base molecular dessas ações.
Sabe-se que moléculas bioativas endógenas e exógenas, incluindo as
adquiridas de uma dieta diária típica, podem ser mediadores potentes e/ou
reguladores de muitos processos celulares. Diferentes tipos de gordura alimentar e,
mais especificamente, os ácidos graxos, caracterizam-se como tais moléculas
bioativas. Foi demonstrado que a alteração de fosfolipídios da membrana celular
pode ser alcançada, in vitro e in vivo, por meio suplementado de lipídios ou alteração
de gordura na dieta (BLACKMORE & MECKLING-GILL 1995, PHILBRICK et al.,
1987, SPECTOR et al., 1979, VOSSEN et al., 1993). Portanto, é razoável supor que
a alteração das propriedades da membrana, devido à composição fosfolipídica
195
alterada é capaz de mediar os processos envolvidos na restituição epitelial
(RUTHING, 1999).
Já foi bem demonstrada a capacidade da suplementação de ácidos graxos de
modificar a proliferação celular (ROSE et al., 1994, SPECTOR et al., 1979), a
atividade do fator de crescimento (JIANG et al., 1995, KAMINSKI et al. 1993),
diferenciação (AWAD et al., 1991, DAS 1991), a sinalização celular
(BANDYOPADHYAY et al., 1995, HANNIGAN & WILLIAMS 1991) e produção de
eicosanóides (VON SCHACKY et al., 1985, WEBER 1990). Além de ter uma
variedade de efeitos fisiológicos e fisiopatológicos no intestino (TAZOE et al., 2008).
Nesse trabalho AC demonstrou sua capacidade de regeneração do trato
gastrintestinal quando este entrou em contato alguns agentes nocivos causadores
principalmente de estresse oxidativo. Esse diterpeno age sobre a migração e
proliferação de células intestinais, assim como melhora a taxa de cura de úlceras
gástricas crônicas, quando observamos que AC melhora atividade fibroblástica.
Verificamos ainda que há semelhança molecular entre ácido graxos de cadeia curta
e o ácido centipédico. Além do mais, ácido graxos são por assim dizer, precursores
das prostaglandinas que estão envolvidas no mecanismo gastroenteroprotetor do
ácido centipédico. Dessa forma, lançamos o seguinte questionamento: AC poderia
modular as funções de migração e proliferação de forma semelhante a dos ácidos
graxos de cadeia curta e dessa forma melhorar a cicatrização de úlceras
gastrintestinais?
Em suma, demonstramos pela primeira vez que AC possui papel citoprotetor
oferecendo proteção aos danos à mucosa gastrintestinal induzidos por agentes
nocivos como etanol, ácido acético ou indometacina. Seu mecanismo gastroprotetor
envolve, pelo menos, estimulação de prostaglandinas endógenas, liberação de óxido
196
nítrico e abertura de canais de potássio sensíveis a ATP, acompanhado do aumento
da microcirculação. Além de ação antioxidante através do efeito poupador de NP-SH
e SOD gástrica, e diminuição dos níveis de malonildealdeido, diminuindo ainda a
acidez gástrica.
AC é capaz de atenuar as lesões intestinais induzidas por indometacina
através de ação antioxidante que envolve, efeito poupador de NP-SH e catalase e
diminuição dos níveis de malonildealdeido e mieloperoxidase. Agindo ainda como
agente protetor de células intestinais, pela sua ação na migração e proliferação
celular.
Logo, podemos afirmar que AC tem valor terapêutico e é uma substância
promissora para o desenvolvimento de novo agente terapêutico para o combate de
gastroenteropatias associadas à AINES e doença ulcerosa péptica (apresenta baixa
toxicidade), não só para a redução de efeitos colaterais aos AINEs, mas também
para o tratamento de distúrbios intestinais humanos, como doença inflamatória
intestinal, podendo também ser usado como biomarcador da sua planta de origem.
197
7. CONCLUSÕES
� Ácido Centipédico apresentou atividade gastroprotetora em modelo
experimental de lesão gástrica aguda induzida por etanol de forma dose
dependente, demonstrando eficácia por via oral. O estudo do mecanismo
citoprotetor do diterpeno indica envolvimento, em parte, das prostaglandinas
endógenas, óxido nítrico e abertura de canais de potássio sensíveis a ATP,
mas não de envolvimento do receptor TRPV1. Aumentando ainda produção
de muco da mucosa gástrica.
� Ácido Centipédico atenuou a depleção dos grupos sulfridrilas não-proteicos e
dos níveis de SOD, e reduziu a formação de MDA no modelo de lesão
gástrica induzida por etanol, indicando uma ação antioxidante como parte do
seu mecanismo de ação gastroprotetor.
� Ácido Centipédico mostrou ainda atividade gastroprotetora em modelo de
lesão gástrica aguda induzida por etanol acidificado, com envolvimento de
receptores opioides e α2-adrenérgicos.
� O mecanismo gastroprotetor do Ácido Centipédico também envolve a
diminuição da secreção ácida e do volume gástrico, demonstrada no teste em
animais com piloro ligado por 4 horas, porém não possui ação sobre o
esvaziamento gástrico normal.
� Ácido centipédico não mostrou possuir atividade contra a bactéria
Helicobacter pylori.
198
� No modelo de úlcera gástrica crônica induzida pó ácido acético, ácido
centipédico apresentou atividade cicatrizante, demonstrando eficácia por via
oral.
� O diterpeno mostrou ação enteroprotetora em modelo de lesões intestinais
induzidas por indometacina em ratos, como visto pelo diminuído número de
úlceras formadas, e, atenuou a depleção dos grupos sulfridrilas não-proteicos
e da enzima catalase, e reduziu a formação de malonildealdeído e os níveis
de mieloperoxidase, indicando uma ação antioxidante como parte do seu
mecanismo de ação.
� Verificou-se ainda que AC age de forma positiva na migração e proliferação
celular, mesmo quando células intestinais receberam indometacina como
agente tóxico.
� Portanto, esse estudo demonstra a ação protetora gastrintestinal do Ácido
Centipédico e fornece evidências de que este diterpeno é uma substância
segura e promissora para o desenvolvimento de novo agente terapêutico no
combate a patologias gastrintestinais associadas à AINES e doença ulcerosa
péptica. Suas ações aqui estudadas nos levam a sugerir a indicação da
macela para a relação de plantas medicinais de interesse do SUS
(RENISUS), podendo ainda ser usado como biomarcador de E. viscosa no
possível desenvolvimento de um fitoterápico.
199
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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228
9. ANEXO - ARTIGOS PUBLICADOS
GUEDES, M.M; CARVALHO, A.C.S; LIMA, A.F.L; LIRA, S.R.S; QUEIROZ, S.S;
SILVEIRA, E.R; SANTOS, F.A; RAO, V.S. Gastroprotective Mechanisms of
Centipedic Acid, a Natural Diterpene from Egletes viscosa LESS. Biol. Pharm. Bull;
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PUBLICAÇÃO NA MESMA LINHA DE PESQUISA:
CARVALHO A.C, GUEDES M.M, DE SOUZA A.L, TREVISAN M.T, LIMA A.F,
SANTOS F.A, RAO, V.S. Gastroprotective effect of mangiferin, a xanthonoid from
Mangifera indica, against gastric injury induced by ethanol and indomethacin in
rodents. Planta Med.;73(14):1522, 2007.
LIRA, SRS; Rao, VS; CARVALHO, AC; GUEDES, MM; MORAIS, TC; SOUZA, AS;
TREVISAN, MTS; LIMA, AF; CHAVES, MH; SANTOS, FA. Gastroprotective effect of
lupeol on ethanol-induced gastric damage and the underlying mechanism.
Inflammopharmacology, 2009.
PUBLICAÇÃO EM LINHA DE PESQUISA AFIM (PRODUTOS NATURAIS):
RABELO, AFL; GUEDES, MM; TOMÉ, AR; LIMA, PR; MACIEL, MA; LIRA SRS;
CARVALHO, ACS; SANTOS, FA; RAO, VS. Vitamin E Ameliorates High Dose trans-
Dehydrocrotonin-Associated Hepatic Damage in Mice. Natural Product
Communications (TRABALHO ACEITO PARA PUBLICAÇÃO-2010)
HOLANDA PINTO S.A, PINTO L.M, GUEDES M.A, CUNHA G.M, CHAVES M.H,
SANTOS F.A, RAO V.S. Antinoceptive effect of triterpenoid alpha,beta-amyrin in rats
on orofacial pain induced by formalin and capsaicin. Phytomedicine. Aug;15(8):630-
4, 2007.