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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

ESTUDO DA FORMAÇÃO DE MICELAS E MICROEMULSÕES CONTENDO

NIFEDIPINA: INFLUÊNCIA DAS FASES NA ESTRUTURA DOS SISTEMAS

DAYANE XAVIER DE OLIVEIRA

SÃO CRISTÓVÃO-SE

2014

Dayane Xavier de Oliveira



Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Química da

Universidade Federal de Sergipe como parte

dos requisitos para a obtenção do Título de

Mestre em Química.

Orientador: Prof. Dr. Victor Hugo Vitorino Sarmento

Coorientadora: Prof.a Dr.

a Rogéria de Souza Nunes

São Cristóvão-SE

2014

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

O48e

Oliveira, Dayane Xavier de

Estudo da formação de micelas e microemulsões contendo nifedipina :

influência das fases na estrutura dos sistemas / Dayane Xavier de Oliveira

; orientador Victor Hugo Vitorino Sarmento. – São Cristóvão, 2014.

92 f. : il.

Dissertação (mestrado em Química) – Universidade Federal de

Sergipe, 2014.

1. Físico-química. 2. Micelas. 3. Microemulsões. 4. Essências e óleos

essenciais. 5. Laranja. 6. Nifedipina. I. Sarmento, Victor Hugo Vitorino,

orient. II. Título.

CDU 544.77.051.62

Dayane Xavier de Oliveira



Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Química da

Universidade Federal de Sergipe como parte

dos requisitos para a obtenção do Título de

Mestre em Química.

Aprovada em ___/___/______

Comissão Examinadora:

_____________________________________________________________________

Prof. Dr. Victor Hugo Vitorino Sarmento (Orientador)

_____________________________________________________________________

Prof.a Dr.

a Iara de Fátima Gimenez (DQI – UFS)

___________________________________________________________________

Prof. Dr. Leandro Ramos Souza Barbosa (IF - USP)

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por ter me privilegiado com a dádiva da vida, pela

oportunidade de poder conquistar mais essa vitória, por ser sempre o meu amparo e refúgio,

por está sempre ao meu lado me dando forças para não fraquejar e por ser a luz do meu

caminho.

Aos meus pais, Josefa e Francisco, que são os meus maiores professores e exemplo na escola

da vida, agradeço pelo amor, pelo carinho, pela confiança e pelos conselhos. Enfim, por terem

sempre acreditado na minha capacidade e me dado força na conquista de mais uma etapa de

minha vida. Por isso, dedico especialmente a vocês a concretização deste trabalho. A vocês

meu eterno agradecimento e amor.

Ao meu namorado e amigo de todas as horas, David, agradeço por ter me aguentado e me

ajudado durante este tempo. Sem você não sei se teria aguentado passar por tudo isso. Você

sempre me incentivou nos momentos de angústia, sempre me ouvindo, me acolhendo, me

dando boas opiniões. Obrigada pelo amor verdadeiro e incondicional e por sempre ter

acreditado em mim!

A todos os familiares e amigos que sempre estiveram comigo nessa jornada de 2 anos e que

acompanharam direta ou indiretamente a minha caminhada em busca desta vitória, agradeço

pelos conselhos, pelo grande afeto e pela torcida.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Victor Hugo Vitorino Sarmento, por me orientar sempre com

dedicação, paciência, incentivo e contribuição na ampliação dos meus conhecimentos. Pelas

valiosas lições que foram passadas no decorrer destes 2 anos e que certamente me

acompanharão para toda a vida. Obrigada por confiar no meu potencial e no nosso trabalho!

A minha coorientadora, Prof. Dr. Rogéria de Souza Nunes, por ter cedido o seu laboratório de

pesquisa (Laboratório de Desenvolvimento Farmacotécnico - LADEF) para realização dos

experimentos e ter contribuído significativamente desde a ideia inicial do nosso projeto de

pesquisa até os resultados finais do nosso trabalho. Ao pessoal do LADEF não poderia deixar

de agradecer pelo acolhimento e ajuda dada durante o tempo que passei por lá, principalmente

Quênnia, Sarah, Joyce e Givalda que acompanharam mais de perto os encaminhamentos do

trabalho.

Aos professores componentes da banca de qualificação, Iara de Fátima Gimenez e Luiz

Carlos Lobato dos Santos, e aos professores componentes da banca de defesa da dissertação,

pelas contribuições dadas ao nosso trabalho.

Ao Prof. Dr. Leandro Ramos Souza Barbosa pelas contribuições dadas nos estudos de

espalhamento de raios-x a baixos ângulos (SAXS). Ao Prof. Dr. Marcelo Leite dos Santos

pelas contribuições dadas para a realização de alguns experimentos e pelas ideias

apresentadas para a conclusão de alguns resultados.

Ao Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) pelas análises de SAXS. Ao

Departamento de Física (DFI) pelas análises de microscopia de luz polarizada (MLP),

espalhamento dinâmico de luz (DLS) e espectrofotometria de absorção na região do

infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). Ao Departamento de Química do

Campus de Itabaiana (DQCI) pela realização de alguns experimentos e medidas

espectrofotométricas na região do ultravioleta e visível.

Ao Programa de Pós-Graduação em Química, à Universidade Federal de Sergipe e ao CNPq

pelo suporte financeiro.

Meus sinceros agradecimentos a todos que participaram dessa minha jornada e que de muitas

formas contribuíram para a realização e concretização desta dissertação.

RESUMO

As micelas (MIs) e as microemulsões (MEs) são classificadas como sistemas estabilizados

por tensoativos e se assemelham bastante com relação a sua estrutura e propriedades físico-

químicas. Quanto a sua aplicabilidade, elas têm sido destacadas por serem capazes de veicular

fármacos que possuem uma biodisponibilidade sistêmica limitada por via oral. A formação

destes sistemas é dependente principalmente dos tipos de componentes utilizados, tornando-se

relevante o estudo da sua influência na estrutura. O objetivo do presente trabalho foi a

obtenção e caracterização de sistemas micelares e microemulsionados (contendo óleo

essencial de Citrus sinensis (L.) Osbeck como fase oleosa), estabilizados por um tensoativo

não iônico (Tween 80) e um cotensoativo de cadeia curta (álcool etílico), que possam ser

utilizados como sistema de liberação para a nifedipina (NFD, um fármaco modelo), buscando

verificar a influência das fases e a interação do fármaco na estrutura desses sistemas.

Diagramas de fase ternário e pseudoternário para MIs e MEs, respectivamente, foram obtidos

e a partir das regiões de formação, formulações foram selecionadas para caracterização físico-

química e incorporação da NFD. Os aspectos macro e microscópicos foram avaliados

utilizando microscopia de luz polarizada (MLP), medidas de pH, condutividade elétrica e

tensão superficial. O tamanho médio de gotículas foi avaliado por espalhamento dinâmico de

luz (DLS) e espalhamento de raios-x a baixos ângulos (SAXS). Os resultados demonstraram

que esses sistemas são estáveis, isotrópicos e opticamente transparentes na ausência e

presença de fármaco. O tamanho das gotículas diminuiu com o aumento da quantidade de

tensoativo para as MIs e de mistura de tensoativo/cotensoativo para as MEs. A influência do

cotensoativo nas MIs foi praticamente desprezível. O aumento da quantidade de fase oleosa

nas MEs ocasionou um aumento do tamanho das gotículas. A presença da NFD não exerceu

influência na estrutura das MIs, entretanto para as MEs aumentou o tamanho de gotículas,

sugerindo que a NFD se encontra na fase interna das MEs. Os modelamentos das curvas de

SAXS para as MIs e MEs mais diluídas foram realizados e mostraram a interação existente

entre a NFD e os sistemas, corroborando com os resultados anteriores. Estudos por

espectrofotometria de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier

(FTIR) comprovaram a interação das MIs e das MEs com o estrato córneo (EC), o que

possibilita o uso destes sistemas como promotores de permeação da NFD.

Palavras-chave: Micelas, microemulsões, Tween 80, álcool etílico, óleo essencial de Citrus

sinensis, nifedipina, SAXS.

ABSTRACT

Micelles (MIs) and microemulsions (MEs) are classified as stabilized systems by surfactants

and are very similar with respect to their structure and physico-chemical properties. As for the

applicability, they have been deployed by being able to carry drugs which have a limited

systemic bioavailability by oral route. The formation of these systems is mainly dependent on

the types of components used, making it important to study its influence on the structure. The

goal of this study was to obtain and characterize micellar and microemulsion systems

(containing essential oil of Citrus sinensis (L.) Osbeck as oil phase) stabilized by a nonionic

surfactant (Tween 80) and short-chain cosurfactant (alcohol ethyl) which may be used as a

delivery system for nifedipine (NFD a model drug) seeking to verify the influence of the

phases and the interaction of the drug in the structure of these systems. Ternary and

pseudoternary phase diagrams for MIs and MEs, respectively, and were obtained from the

formation regions, formulations were selected for physico-chemical characterization and

incorporation of NFD. The macro and microscopic aspects were evaluated using polarized

light microscopy (MLP), measures pH, electrical conductivity and surface tension. The

average droplet size was measured by dynamic light scattering (DLS) and small angle x-ray

scattering (SAXS). The results demonstrated that such systems are stable, optically isotropic

and transparent in the absence and presence of drug. The droplet size decreases with

increasing amount of surfactant to MIs and the mixture surfactant/cosurfactant to the MEs.

The influence of the cosurfactant in MIs was negligible. The increase of the amount of oily

phase in MEs caused an increase in the droplet size. The presence of NFD no influence on the

structure of MIs, but for the MEs increased droplet size, suggesting that the NFD is the

internal phase of the MEs. The modeling by SAXS curves for MIs and MEs most diluted

were made and showed the interaction between the NFD and systems, confirming the

previous results. Studies by Fourier Transformed Infra Red (FTIR) confirmed the interaction

between MIs and MEs with the stratum corneum (EC) , which allows the use of these systems

as permeation enhancers of NFD.

Keywords: Micelles, microemulsions, Tween 80, ethyl alcohol, essential oil of Citrus

sinensis, nifedipine, SAXS.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Representação esquemática dos diferentes tipos de fases formadas dependendo do

PEC, teor de água, temperatura, entre outros. .......................................................................... 21

Figura 2 - Representação esquemática dos dois tipos de MI (a) direta e (b) inversa. ............. 23

Figura 3 - Representação esquemática dos três tipos de ME (1) O/A; (2) bicontínua e (3)

A/O. .......................................................................................................................................... 24

Figura 4 - Classificação de Winsor. ........................................................................................ 24

Figura 5 - Estrutura química dos Tweens. ............................................................................... 27

Figura 6 - Partes aéreas da planta Citrus sinensis (L.) Osbeck (laranja pêra). ........................ 29

Figura 7 - Estrutura química do D-limoneno. ......................................................................... 30

Figura 8 - Estrutura química da Nifedipina. ............................................................................ 33

Figura 9 - Representação esquemática de um triângulo equilátero em que cada lado é

representado por um dos componentes da mistura. O ponto D representa a concentração de

50% de A, 20% de O e 30% de T. ............................................................................................ 35

Figura 10 - Esquema do comportamento do tensoativo entre as fases fluida e superficial, em

função da tensão superficial, indicando a CMC. ...................................................................... 40

Figura 11 - Esquema de extração de OECS. ........................................................................... 44

Figura 12 - Esquematização da linha de SAXS (D11A) do LNLS de Campinas. .................. 51

Figura 13 - Esquematização da estrutura de um agregado micelar, o interior hidrofóbico e as

cabeças polares estão em cinza e vermelho, respectivamente. ................................................. 53

Figura 14 - Esquematização do modelo micelar ou microemulsionado tipo elipsoidal. Os

parâmetros de ajuste das curvas de SAXS para este elipsoide são: Rpar (raio parafínico), νRpar

(semi-eixo maior do elipsoide), assim como σpol e ρpol (espessura e densidade eletrônica da

camada polar, respectivamente), ρágua, e ρpar, são as densidades eletrônicas da água e da região

parafínica, respectivamente, mantidas constantes e iguais a 0.334 e 0.275 e/Å3. .................... 54

Figura 15 - Diagrama de fases ternário constituído por Tween 80 (T80), etanol (EtOH) e

tampão fosfato pH 5,0 (TF). Toda a área do diagrama representa Micela (MI). ..................... 58

Figura 16 - Diagrama de fases pseudoternário constituído por mistura de Tween 80 e etanol

(T80/EtOH), óleo essencial de Citrus Sinensis (OECS) e tampão fosfato pH 5,0 (TF). As

áreas delimitadas representam: Microemulsão (ME), Emulsão (EM) e Separação de Fase (SF).

.................................................................................................................................................. 59

Figura 17 - Aspecto visual dos seguintes sistemas: MI fluida, MI gelatinosa, ME, EM e SF

(da esquerda para direita). ........................................................................................................ 60

Figura 18 - Fotomicrografias das formulações MI3 (A) e ME3 (B) por MLP. A bolha é

deixada para obter uma maior visualização do campo escuro.................................................. 62

Figura 19 - Curvas de intensidade de espalhamento I(q) em função do vetor de espalhamento

q para (a) MIs mantendo cotensoativo ( etanol) constante e (b) MEs mantendo fase oleosa –

OECS – constante. .................................................................................................................... 66


q para (a) MIs mantendo tensoativo – Tween 80 – constante e (b) MEs mantendo a mistura de

tensoativo/cotensoativo – Tween 80/Etanol – constante. ......................................................... 67


q para os sistemas micelares na ausência e presença de nifedipina (NFD). ............................. 68


q para os sistemas microemulsionados na ausência e presença de nifedipina (NFD). ............. 69

Figura 23 - Representação da estrutura molecular da NFD com suas dimensões aproximadas,

destacadas em diferentes orientações. A figura do fármaco e suas dimensões foi preparada

usando o programa PyMOL (DeLano Scientific, San Carlos, CA, http://www.pymol.org). As

cores dos átomos representam: cinza (carbono), vermelho (oxigênio) e azul (nitrogênio). ..... 71

Figura 24 - Espetros de absorção na região do UV da NFD no tampão fosfato pH 5,0 (a), na

MI (b) e na ME (c). .................................................................................................................. 72

Figura 25 - Espectros de absorção na região do UV da NFD em cinco solventes de

polaridades diferentes. .............................................................................................................. 73

Figura 26 - Curvas de SAXS dos sistemas composto por MIs (A e C) e MEs (B e D) eu

ausência (A e B) e presença (C e D) de NFD. As linhas cheias indicam os melhores ajustes

obtidos com o modelo descrito anteriormente. ......................................................................... 75

Figura 27 - Representação esquemática em escala das MIs (A e C) e das MEs (B e D) em

ausência (A e B) e presença (C e D) de NFD. Os elipsoides internos representam as regiões

apolares, enquanto que os externos representam as regiões polares. ....................................... 77

Figura 28 - Espectros de FTIR da região de interesse do EC tratados com: (a) água destilada

(controle) e formulações de MIs em estudo; (b) água destilada (controle) e formulações de

MEs. .......................................................................................................................................... 79

Figura 29 - Espectros de segunda derivada do EC tratados com: (a) água destilada (controle)

e formulações de MIs em estudo; (b) água destilada (controle) e formulações de

MEs...........................................................................................................................................80

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação

das 9 formulações do Ensaio 1. ................................................................................................ 46

















Tabela 10 - Composição centesimal dos sistemas micelares e microemulsionados

selecionados a partir dos diagramas de fases............................................................................ 61

Tabela 11 - Valores de pH na ausência e presença de fármaco para as formulações de MIs e

MEs. .......................................................................................................................................... 63

Tabela 12 - Valores de condutividade elétrica na ausência e presença de fármaco para as

formulações de MIs e MEs. ...................................................................................................... 64

Tabela 13 - Valores de tamanho de gotícula e IPD na ausência e presença de fármaco para as


Tabela 14 - Valores de tensão superficial na ausência e presença de fármaco para as


Tabela 15 - Polaridade relativa e valores do comprimento de onda do pico de absorbância

máxima de cada um solventes. ................................................................................................. 73

Tabela 16 - Valores do coeficiente de partição da NFD em octanol/água realizados em

triplicata. ................................................................................................................................... 74

Tabela 17 - Parâmetros de ajuste das curvas de SAXS dos sistemas compostos por MIs e

MEs em ausência e presença de NFD. ..................................................................................... 76

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANOVA Análise de variância “one-way”

A/O Água em óleo

ATR Modo de Atenuação de Refletância

CEASA Centro de Abastecimento de Alimentos

CLAE Cromatógrafo líquido de alta eficiência

CMC Concentração micelar crítica

DFI Departamento de Física

DLS Espalhamento Dinâmico de Luz (do inglês, Dynamic Light Scattering)

DP Desvio padrão

DSC Calorimetria Exploratória Diferencial (do inglês, Differential Scanning

Calorimetry)

EC Estrato córneo

EHL Equilíbrio hidrófilo-lipófílo

EM Emulsão

EtOH Etanol (álcool etílico)

FTIR Espectrofotometria de absorção na região do infravermelho com

transformada de Fourier (do inglês, Fourier Transformed Infra Red)

IPD Índice de polidispersividade

LABAM Laboratório de Biotecnologia Ambiental

LADEF Laboratório de Desenvolvimento Farmacotécnico

LNLS Laboratório Nacional de Luz Síncroton

ME Microemulsão

MI Micela

MLP Microscopia de Luz Polarizada

MSA Aproximação de Esfera Média (do inglês, Mean Spherical Approximation)

NFD Nifedipina

O/A Óleo em água

OECS Óleo essencial de Citrus sinensis

OZ Ornstein-Zernicke

PEC Parâmetro de empacotamento crítico

RMN Ressonância Magnética Nuclear

SANS Espalhamento de Nêutrons a Baixos Ângulos (do inglês, Small Angle

Neutron Scattering)

SF Separação de fase

SI Sistema Internacional de Unidades

SAXS Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (do inglês, Small Angle X-Ray

Scattering)

TF Tampão fosfato pH 5,0

T80 Tween 80

UV Ultravioleta

LISTA DE SÍMBOLOS

a Área ocupada pelo grupo polar

v Volume da cadeia hidrofóbica

l Comprimento da cadeia hidrofóbica

ΔG Variação da energia livre de Gibbs

ΔA Variação de área da interface

γ Tensão interfacial

KB Constante de Boltzmann

Ω Número de configurações possíveis

ni Número de mol em excesso na interface do componente i

µi Potencial químico do componente i

A Área da interface

R Constante universal dos gases

ai Atividade do componente i

f Fugacidade

xi Fração molar do componente i

Rh Raio hidrodinâmico médio

η Viscosidade do meio

D Coeficiente de difusão das partículas

I(q) Intensidade de espalhamento

k Constante relacionada ao arranjo experimental

np Densidade numérica das gotículas

P(q) Fator de forma

F(q) Amplitude de espalhamento

q Módulo do vetor de espalhamento

λ Comprimento de onda da radiação incidente

2θ Ângulo de espalhamento

S(q) Fator estrutura (fator de interferência)

g(r) Função de distribuição radial

r Centro de uma gotícula de referência

Rg Raio de giro

I(0) Intensidade de espalhamento extrapolada à q = 0

∆ρ Contraste de densidade eletrônica da partícula em relação ao meio

V Volume da gotícula espalhadora

p(r) Função de distribuição de distâncias

ρ1 Densidade eletrônica constante

ρágua Densidade eletrônica da água

Razão axial

Ref Raio efetivo

Ângulo formado entre o eixo longo do elipsoide

Rpar Raio parafínico

Rpol Raio da camada polar

νRpar Semi-eixo maior do elipsoide

σpol Espessura da camada polar

ρpol Densidade eletrônica da camada polar

ρpar Densidade eletrônica da região parafínica

tot Razão axial da partícula inteira

h(r) Função de correlação total

d Diâmetro médio da partícula espalhadora

h(rij) Função de correlação total da partícula i à partícula j

c(rij) Correlação direta da partícula i com a partícula j (correlação de pares)

rij Distância da partícula i à partícula j

Z Carga na superfície da MI ou ME

e Carga fundamental do elétron

Constante dielétrica do meio

NA Número de Avogadro

T Temperatura

kDB Intervalo de atuação do potencial repulsivo

Nag Número de agregação

Porcentagem de cargas na superfície da MI ou ME

log P Coeficiente de Partição

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 18

2 REFERENCIAL TEÓRICO .......................................................................................... 20

2.1 SISTEMAS ESTABILIZADOS POR TENSOATIVOS ........................................... 20

2.2 MICELAS (MIs) E MICROEMULSÕES (MEs) ...................................................... 22

2.2.1 Estrutura e Tipos de MIs e MEs ......................................................................... 23

2.2.2 Mecanismo de Formação de MIs e MEs ............................................................ 25

2.3 COMPOSIÇÃO DOS SISTEMAS ............................................................................ 26

2.3.1 Tensoativos ......................................................................................................... 27

2.3.2 Cotensoativos ..................................................................................................... 28

2.3.3 Fase Aquosa ....................................................................................................... 28

2.3.4 Fase Oleosa ........................................................................................................ 29

2.4 MICROEMULSÕES COMO SISTEMA DE LIBERAÇÃO TRANSDÉRMICA DE

FÁRMACOS ........................................................................................................................ 30

2.5 NIFEDIPINA (NFD) ................................................................................................. 32

2.6 DIAGRAMA DE FASES .......................................................................................... 34

2.1 MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS SISTEMAS ...... 35

2.1.1 Microscopia de Luz Polarizada (MLP) .............................................................. 36

2.1.2 Condutividade Elétrica ....................................................................................... 37

2.1.3 Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) .............................................................. 37

2.1.4 Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (SAXS) ......................................... 38

2.1.5 Tensão Superficial .............................................................................................. 39

3 OBJETIVOS .................................................................................................................... 42

3.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 42

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 42

4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 43

4.1 REAGENTES E SOLVENTES ................................................................................. 43

4.2 EQUIPAMENTOS E ACESSÓRIOS ....................................................................... 43

4.3 EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL ..................................................................... 44

4.4 OBTENÇÃO DAS REGIÕES DE FORMAÇÃO DE MICELAS E

MICROEMULSÕES ATRAVÉS DE DIAGRAMAS DE FASES ...................................... 45

4.5 SELEÇÃO DAS FORMULAÇÕES .......................................................................... 49

4.6 CARATERIZAÇÃO DAS MICELAS E MICROEMULSÕES SELECIONADAS 50

4.6.1 Microscopia de Luz Polarizada (MLP) .............................................................. 50

4.6.2 Determinação do pH .......................................................................................... 50

4.6.3 Condutividade elétrica ....................................................................................... 50

4.6.4 Tamanho e distribuição de tamanho das gotículas ............................................ 50

4.6.5 Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (SAXS) ......................................... 51

4.6.6 Determinação da Tensão Superficial ................................................................. 51

4.7 ESTUDOS DA INTERAÇÃO DA NIFEDIPINA COM AS MICELAS E AS

MICROEMULSÕES ............................................................................................................ 52

4.7.1 Estudos Computacionais .................................................................................... 52

4.7.2 Análises no Ultravioleta (UV) ............................................................................ 52

4.7.3 Determinação do coeficiente de partição ........................................................... 52

4.7.4 Modelamento das curvas de SAXS das MIs e MEs ............................................ 53

4.8 ESTUDO DE INTERAÇÃO ENTRE AS MICELAS E AS MICROEMULSÕES

EM MODELO DE ESTRATO CÓRNEO POR FTIR ......................................................... 57

4.8.1 Preparação das amostras ................................................................................... 57

4.8.2 Espectrofotometria de Absorção na região do Infravermelho com Transformada

de Fourier e modo de atenuação de refletância (FTIR-ATR) ........................................... 57

4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................ 57

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 58

5.1 OBTENÇÃO DO DIAGRAMA DE FASES ............................................................. 58

5.2 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS MICELAS E MICROEMULSÕES

SELECIONADAS ................................................................................................................ 62


MICROEMULSÕES ............................................................................................................ 70

5.4 ESTUDO DE INTERAÇÃO ENTRE AS MICELAS E AS MICROEMULSÕES

EM MODELO DE ESTRATO CÓRNEO POR FTIR ......................................................... 77

6 CONCLUSÕES ............................................................................................................... 81

7 PERSPECTIVAS FUTURAS......................................................................................... 83

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 84

18

1 INTRODUÇÃO

Tensoativos são moléculas de natureza anfifílica caracterizadas pela presença em suas

estruturas moleculares de duas regiões: uma polar (hidrofílica) e outra apolar (hidrofóbica) [1,

2]. Estas moléculas de tensoativos podem se autoagregar na presença de água ou até mesmo

se situar na interface óleo/água quando uma fase oleosa está presente formando uma grande

variedade de estruturas de escala microscópica ou macroscópica. Dentre todas as estruturas

existentes, os sistemas micelares e microemulsionados são os que mais se assemelham com

relação a sua estrutura e propriedades físico-químicas. Entretanto, existem distinções entre

estes sistemas que podem levar a diferenças expressivas quanto a sua funcionalidade.

As micelas (MIs) correspondem a um conjunto de moléculas de tensoativos que se

encontram espontaneamente agregadas em água, cujo tamanho está compreendido na faixa de

1 a 100 nm [3, 4, 5, 6], enquanto que as microemulsões (MEs) são dispersões homogêneas

caracterizadas pela mistura de óleo, água, tensoativo e/ou cotensoativo, cujo tamanho é um

pouco maior do que as MIs, na faixa de 5 a 140 nm [7, 8, 9, 10].

Sistemas micelares e microemulsionados apresentam uma série de propriedades físico-

químicas em comum, como transparência, isotropia óptica, baixa viscosidade, estabilidade

termodinâmica, capacidade de solubilização de componentes em meios de baixa afinidade e

grande área interfacial específica [11, 12, 13, 14, 15, 16]. Em contrapartida, existe uma

diferença básica entre estes dois sistemas, a qual está relacionada à presença da fase oleosa: as

MEs apresentam óleo como um dos seus componentes, enquanto que as MIs não o possuem

[17].

O ponto chave para a formação de MIs e MEs é a tensão interfacial, a qual deve ser

suficientemente baixa para que isso ocorra. A baixa tensão interfacial é normalmente atingida

com o uso de tensoativos. Para ampliar a região de formação desses sistemas, geralmente usa-

se um cotensoativo que se posiciona na monocamada do tensoativo, aumentando a

flexibilidade e diminuindo ainda mais a tensão interfacial [12, 18]. Logo, a escolha do

tensoativo e/ou cotensoativo é de extrema importância para a formação de MIs e MEs, pois

diferenças na estrutura e na geometria molecular podem causar diferenças importantes na

formação do sistema.

Além disso, a escolha da fase aquosa e oleosa é de fundamental importância, pois a

elas são adicionados o tensoativo e/ou cotensoativo. Como fase aquosa, a própria água é uma

ótima representação de um componente polar e a substância mais comumente utilizada [19].

19

Quanto à fase oleosa (presente nas MEs) são bastante utilizados os óleos essenciais, os quais

são classificados como monoterpenos de origem natural e agem como promotores de

permeação para fármacos hidrofílicos e lipofílicos minimizando assim, a função barreira

estabelecida pela pele [20, 21].

Ao adicionar um fármaco nestes sistemas é importante conhecer a sua origem, para

que seja compatível com a fase interna. O fármaco modelo utilizado neste trabalho foi a

nifedipina (NFD). De natureza lipofílica, a NFD é usada no tratamento de hipertensão e

angina e apresenta uma biodisponilidade sistêmica limitada por via oral, pois sua

farmacodinâmica é complexa [22, 23]. Desta forma, surge a ideia de veicular a NFD em

sistemas estabilizados por tensoativos, tais como MIs e MEs para administração transdérmica.

Neste contexto, o presente trabalho tem como finalidade estudar os sistemas micelares

e microemulsionados (contendo óleo essencial de Citrus sinensis (L.) Osbeck como fase

oleosa), buscando verificar a influência das fases e do fármaco na estrutura desses sistemas,

além de estudar a interação da NFD com as MIs e MEs para entender os mecanismos de

liberação transdérmica deste fármaco.

20

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 SISTEMAS ESTABILIZADOS POR TENSOATIVOS

As moléculas de tensoativos podem se autoagregar na presença de água formando uma

grande variedade de estruturas. Além disso, estas moléculas podem se situar na interface

óleo/água quando são introduzidas em misturas imiscíveis de óleo e água, resultando em

diferentes estruturas de escala macroscópica ou microscópica.

Para entender a formação destas estruturas, deve-se considerar as composições do

sistema, tais como a fase oleosa, cotensoativos, presença de sais, temperatura e estrutura do

tensoativo, sendo esta última a principal responsável pela formação do sistema. A estrutura do

tensoativo está relacionada à sua geometria molecular, que constitui um parâmetro

conveniente para predizer a geometria preferencialmente formada por uma substância

anfifílica, ao passo que associa o formato da molécula com propriedades que intervêm na

curvatura da interface polar-apolar e consequentemente no tipo de agregado formado [24]. O

parâmetro de empacotamento crítico (PEC), mostrado na Equação 1, relaciona a capacidade

dos tensoativos em formar agregados específicos à geometria da própria molécula e é

dependente da área ocupada pelo grupo polar (a), do volume (v) e do comprimento (l) da

cadeia hidrofóbica [15, 25].

A área ocupada pelo grupo polar do tensoativo é comandada pelas forças repulsivas

entre outros grupos polares, pelas forças atrativas entre as cadeias apolares e pelas forças entre

estas cadeias apolares e as moléculas de óleo. Logo, o valor desta área é uma propriedade não

exclusivamente intrínseca do tensoativo, mas também dependente de fatores tais como,

concentração de íons na fase aquosa, composição do óleo da fase apolar do sistema e da

própria concentração do tensoativo que define a estrutura formada [26].

A Figura 1 mostra as possíveis estruturas que os tensoativos podem formar na

presença de água, óleo ou na combinação de ambos de acordo com o valor do PEC das

cadeias de tensoativo. Para formação de estruturas lamelares, o tensoativo geralmente

apresenta a forma cilíndrica e na formação da fase hexagonal e micelar, ele apresenta a área

de um cone. É destacável que a mistura de componentes de diferentes polaridades, como óleo

21

e água, na presença do tensoativo, agregam-se de maneira que possibilitem diferentes regiões

adicionais de solubilização [27].

Figura 1 - Representação esquemática dos diferentes tipos de fases formadas dependendo do PEC, teor de água,

temperatura, entre outros.

Fonte: CARVALHO (2009) [8].

Dentre todas as estruturas existentes, os sistemas micelares se assemelham muito aos

microemulsionados tanto com relação a sua estrutura quanto as suas propriedades físico-

químicas e por isso há uma grande confusão quanto as suas distinções. No entanto, existem

diferenças básicas entre estes sistemas estabilizados por tensoativos, as quais podem levar a

diferenças significativas quanto a sua funcionalidade. Dessa forma, torna-se importante o

conhecimento de seus conceitos, estruturas, características e possíveis diferenças.

22

2.2 MICELAS (MIs) E MICROEMULSÕES (MEs)

O termo MI foi introduzido pelo pioneiro na área J. W. McBain em 1913 para

descrever a formação de partículas coloidais de detergentes e sabões. Além disso, a palavra

MI tem também sido amplamente utilizada em biologia e na química coloidal de outros

fenômenos [11].

As MIs são agregados tipicamente coloidais nanoestruturados, definidos como um

conjunto de moléculas de tensoativos anfifílicos que se encontram espontaneamente

agregados em água [3, 4]. Elas são constituídas pela associação das moléculas até um

conjunto cujo tamanho esteja compreendido na faixa de 1 a 100 nm [5, 6].

Já o conceito de ME foi introduzido na literatura em 1943 por Hoar e Schulman [9,

10]. Eles a descreveram como sistemas transparentes ou translúcidos, formados

espontaneamente por titulação de uma emulsão comum de aspecto leitoso com um álcool de

cadeia média, como o hexanol [15].

As MEs são dispersões macroscopicamente homogêneas caracterizadas pela mistura

de óleo, água, tensoativo e/ou cotensoativo. Em nível microscópico, elas representam

microdomínios individuais de dois líquidos imiscíveis (óleo e água) separados e estabilizados

por um filme interfacial de tensoativo, em que as partes polares e apolares estão voltadas para

os respectivos meios de afinidade [7, 9, 25, 27, 28, 29]. Elas são geralmente determinadas

como agregados esféricos com tamanho de partículas muito pequeno, na faixa de 5 a 140 nm

[8, 9, 10].

MIs e MEs apresentam uma série de propriedades físico-químicas em comum, como

transparência, isotropia óptica, baixa viscosidade, estabilidade termodinâmica, capacidade de

solubilização de componentes (hidrofílicos e lipofílicos) em meios de baixa afinidade e

grande área interfacial específica [11, 12, 13, 14, 15, 16]. Além disso, esses sistemas são

classificados como coloidais com tamanho de partícula menor que ¼ do comprimento de onda

da luz incidente, que é de 350 a 800 nm e portanto, não espalham luz visível. Isto explica

porque eles são opticamente transparentes [10, 30]. Eles normalmente são polidispersos,

sendo que a polidispersividade em geral, aumenta com o tamanho das gotículas [12].

No entanto, existe uma diferença básica entre estes dois sistemas, a qual está

relacionada à presença da fase oleosa [17]. Enquanto as MEs apresentam óleo como um dos

seus componentes, as MIs não o possuem.

23

2.2.1 Estrutura e Tipos de MIs e MEs

Diferentes formas de microestruturas tanto de MIs quanto de MEs são utilizadas para

diversas aplicações. Entretanto, o entendimento destas microestruturas e de como elas podem

ser influenciadas por diferentes aditivos se faz necessário para o uso eficiente deste tipo de

agregado [31].

Dependendo do equilíbrio hidrófilo-lipófilo (EHL) do tensoativo e da polaridade do

meio de dispersão (hidrofílico ou hidrofóbico), as MIs podem ser diretas ou inversas (Figura

2). As MIs são ditas diretas quando dissolvidas em meio polar, os tensoativos se unem pelas

cadeias orgânicas apolares (hidrofóbicas) ficando com as cabeças polares (hidrofílicas) na

parte externa da MI, protegendo o núcleo apolar do contato com o meio de dispersão polar.

Quando o meio for apolar, os tensoativos se unem pelas cabeças polares ficando com as

cadeias orgânicas apolares na parte externa das MIs, protegendo o núcleo polar do contato

com o meio de dispersão apolar formando assim MIs inversas [16, 32, 33].

Figura 2 - Representação esquemática dos dois tipos de MI (a) direta e (b) inversa.

Fonte: OLIVEIRA (2013)

Já para as MEs, do ponto de vista microestrutural, existem três tipos: MEs de água em

óleo (A/O), de óleo em água (O/A) e bicontínuas (Figura 3). As MEs A/O (quando o volume

de água é baixo) correspondem a nanogotículas de água dispersas em uma fase contínua de

óleo estabilizadas por um filme ou monocamada de tensoativo e na maioria dos casos um

cotensoativo também é utilizado. Já as MEs O/A (quando o volume de óleo é baixo) são o

contrário, ou seja, correspondem a nanogotículas de óleo que estão dispersas em uma fase

contínua de água e as moléculas de tensoativo e cotensoativo estão arranjadas de tal forma

que o grupo polar encontra-se posicionado na superfície das gotículas, direcionado para a

água [25]. Por último, as MEs bicontínuas são formadas quando as quantidades de água e óleo

são similares [15]. A representação mais geral para este tipo de ME é a de uma microestrutura

a b

24

águaóleo

água

óleo

1 2 3

com infinitos canais encurvados de óleo e água, podendo as moléculas dos dois componentes

transitarem livremente por toda a fase.

Figura 3 - Representação esquemática dos três tipos de ME (1) O/A; (2) bicontínua e (3) A/O.

Fonte: BRITO (2011) [34].

Nos casos em que as MEs se encontram com quantidades insuficientes de tensoativo, a

fase dispersa pode não ser completamente solubilizada na ME e, então, uma fase do

componente em excesso puro pode surgir em equilíbrio. Isso corresponde a uma sequência de

equilíbrio entre a ME e as fases aquosas e oleosas, comumente conhecida como fases de

Winsor. Winsor (1948) propôs a formação de quatro sistemas dispostos em função dos

equilíbrios: Winsor I, II, III e IV (Figura 4). Um sistema tipo Winsor I ocorre quando apenas

uma pequena parcela da fase oleosa está em equilíbrio com a ME, apresentando um excesso

de óleo na porção superior, formando um sistema bifásico. No tipo Winsor II, também

bifásico, uma pequena parcela da fase aquosa está em equilíbrio com a ME, exibindo um

excesso de água na parte inferior. No tipo Winsor III, a ME está em equilíbrio com excesso

tanto de óleo quanto de água, formando um sistema trifásico. E por fim, o tipo Winsor IV

ocorre quando não há excesso de fase aquosa ou oleosa, formando um sistema homogêneo e

monofásico [35]. Ou seja, o sistema tipo Winsor IV corresponde a uma ME sem excesso de

nenhuma das fases.

Figura 4 - Classificação de Winsor.

Fonte: WINSOR (1948) [35].

25

2.2.2 Mecanismo de Formação de MIs e MEs

Para que as variadas microestruturas dos sistemas micelares e microemulsionados

possam ser obtidas se faz necessário o conhecimento do processo físico-químico de formação

destes sistemas. Com base em um tratamento termodinâmico, este processo está associado a

uma mudança de energia livre de Gibbs (G) de acordo com a Segunda Lei da Termodinâmica,

a qual diz que G deve ser tornar negativa para a formação espontânea de uma ME

termodinamicamente estável [25]. Em condições de temperatura constante, isso pode ser

expresso pela Equação 2, em que ΔG é a variação da energia livre de Gibbs, γ é a tensão

interfacial e ΔA é variação da área interfacial do sistema [9, 25].

Para que uma MI ou uma ME se forme é imprescindível o aumento da área interfacial

(A1 → A2), a qual leva em princípio a um aumento brusco da energia livre de Gibbs (G1 →

G2). Com isso, para garantir a estabilização do sistema em estudo, a tensão interfacial deve

reduzir a um ponto que proporcione a diminuição da energia livre [9, 25]. Nesta situação, a

variação da energia livre de Gibbs (ΔG) se torna zero ou negativa, que é a condição de

estabilidade termodinâmica desses sistemas [7, 9, 15, 25]. Logo, uma tensão interfacial muito

baixa é um pré-requisito para a formação e estabilidade de tais sistemas [36], que é

geralmente atingida com o uso de um, dois ou mais tensoativos.

A adição de tensoativo na fase polar (água) ou na fase apolar (óleo) causa uma

redução gradual de γ alcançando um valor limite, o qual é conhecido como concentração

micelar crítica (CMC). Qualquer acréscimo de tensoativo acima da CMC causa pequena ou

nenhuma diminuição no valor de γ [7].

Quando ocorre a adição de duas moléculas anfifílicas, uma agindo como tensoativo e a

outra como cotensoativo, a redução da tensão interfacial é dada pela equação de adsorção de

Gibbs para um sistema de multicomponentes (Equação 3), onde ni é o número de mol em

excesso na interface do componente i e µi é o potencial químico do componente i [7].

∑

Quando o equilíbrio entre as concentrações nas fases interfacial e interior é atingido,

tem-se:

26

em que ai é a atividade do componente i e é dada pela Equação 5, onde f é a fugacidade e xi é

a fração molar do componente i [7].

Portanto, a Equação 4 torna-se:

[ ]

Substituindo esta equação na equação 3, obtém-se:

∑

[ ]

Logo, para um sistema com um tensoativo (S1) e um cotensoativo (S2) adsorvidos na

interface, tem-se a Equação 8 [7].

[ ]

[ ]

Por fim, aplicando integral na equação acima, obtém-se:

∫

[ ] ∫

[ ]

A Equação 9 indica que a tensão interfacial é reduzida a dois termos, um para o

tensoativo e outro para o cotensoativo, que têm concentração interfacial de excesso

respectivamente iguais a nS1/A e nS2/A. É importante ressaltar que as duas moléculas

adsorvem-se simultaneamente e não interagem entre si para que as respectivas concentrações

não sejam diminuídas. Isso explica por que as duas moléculas devem variar em natureza, isto

é, uma predominantemente solúvel em água e a outra solúvel em óleo [7].

Logo, a propensão do sistema para formar uma MI direta ou inversa e uma ME de

O/A, A/O ou bicontínua é dependente de vários fatores, como o tipo de tensoativo,

cotensoativo e fase oleosa (em ME), a razão de água/óleo, a presença de íons na fase aquosa e

a temperatura [9]. Por isso, torna-se relevante o estudo da composição do sistema.

2.3 COMPOSIÇÃO DOS SISTEMAS

Um critério fundamental associado ao desenvolvimento de sistemas estabilizados por

tensoativos é a seleção dos componentes da formulação. Esta seleção deve ser bastante

cautelosa e atender alguns requisitos, tais como toxicidade, irritabilidade, capacidade de

27

solubilização de ativos que podem ser incorporados, bem como capacidade de formar o

sistema desejado [15, 27]. Os componentes das MIs são fase aquosa, tensoativo e/ou

cotensoativo, já os das MEs são os mesmos com o acréscimo da fase oleosa. A seguir são

analisadas as características destes componentes.

2.3.1 Tensoativos

Tensoativos ou surfactantes são moléculas de natureza anfifílica, ou seja, são

compostos caracterizados pela presença em suas estruturas moleculares de duas regiões, uma

polar (hidrofílica) e outra apolar (hidrofóbica ou lipofílica). A estrutura de um tensoativo de

uma maneira geral pode ser dita como R-X, em que R é uma cadeia de hidrocarboneto

geralmente linear (variando de 8-18 átomos de carbono) e X é o grupo ‘cabeça’ (polar).

Dependendo da estrutura de X, os tensoativos podem ser classificados como iônicos

(catiônicos, aniônicos ou anfóteros, também chamados de zwitteriônicos) ou não iônicos [1, 2,

37].

Quando relacionados aos outros tipos de tensoativos, os tensoativos não iônicos são os

mais aceitos, uma vez que são menos afetados pela presença de aditivos (tampão, eletrólitos e

conservantes) e mudanças de pH, além de serem mais seguros e menos susceptíveis em causar

irritação [27, 38]. Eles não fornecem íons em solução e são derivados do polioxietileno e

polioxipropileno ou polialcoóis, ésteres de carboidratos, amidas de alcoóis graxos e óxidos de

amidas graxas. Como exemplo de tensoativo não iônico, têm-se os Tweens que são ésteres de

ácidos graxos de sorbitano (Figura 5). Dentre os Tweens existentes, o Tween 80 é o

tensoativo utilizado neste trabalho com massa molar de 1310 Da.

Figura 5 - Estrutura química dos Tweens.

Fonte: OLIVEIRA (2013).

O

HO-(CH2CH2O)Y-CH-CH2-(OCH2CH2)Z-O

HO-(CH2CH2O)x

HO-(CH2CH2O)w

Tween 20 R = C11H23 w + x + y + z = 20 Monolaurato de Polioxietileno Sorbitano

Tween 40 R = C15H31 w + x + y + z = 20 Monopalmitato de Polioxietileno Sorbitano

Tween 60 R = C17H35 w + x + y + z = 20 Monoesterato de Polioxietileno Sorbitano

Tween 80 R = C17H33 w + x + y + z = 20 Monooleato de Polioxietileno Sorbitano

O

R

28

Devido a sua estrutura e propriedades, os tensoativos têm a capacidade de reduzir a

tensão interfacial e superficial dos líquidos aonde estes se encontram. Quando eles são

adicionados a misturas imiscíveis de óleo e água, a molécula de tensoativo forma um filme na

interface óleo-água estabilizando a mistura e tornando o sistema mais estável

termodinamicamente.

As regiões hidrofílicas e lipofílicas dos tensoativos são definidas principalmente pelo

equilíbrio adquirido entre a parte polar e a apolar do tensoativo utilizado, denominado

equilíbrio hidrófilo-lipófilo (EHL). O EHL é numericamente apresentado em uma escala de

valores, que estão relacionados ao tamanho da cadeia polar do tensoativo. Valores de EHL

inferiores a dez revelam predominância da parte apolar nessas substâncias. Em contrapartida,

valores superiores a dez mostram a prevalência da região polar [2, 15].

2.3.2 Cotensoativos

O cotensoativo se posiciona na monocamada do tensoativo e apresenta a função de

aumentar a flexibilidade do sistema e diminuir a tensão interfacial e superficial entre a água e

o óleo proporcionando a redução máxima do tamanho das gotículas da fase interna e

ampliando as regiões de MIs e MEs [12, 18]. Entretanto, o uso de cotensoativos nem sempre é

necessário para a obtenção desses sistemas.

Os principais cotensoativos utilizados são alcoóis e glicóis, que apresentam massa

molecular pequena ou média e uma cadeia contendo entre dois e dez carbonos [19]. A

presença de um álcool como o etanol pode influenciar a solubilidade das fases aquosa e

oleosa, devido à sua partição entre ambas as fases [15].

2.3.3 Fase Aquosa

A água é a mais comumente utilizada para formação de sistemas estabilizados por

tensoativos, como as MIs e as MEs. Além de água, soluções salinas variadas também podem

ser adotadas como fase aquosa na preparação destes sistemas. De acordo com determinadas

aplicações, esta fase também pode conter aditivos, tais como tampões, antibactericidas e

agentes isotônicos [19].

29

2.3.4 Fase Oleosa

O tamanho das moléculas do óleo e a sua polaridade influenciam na formação de MEs.

Para elas serem formadas, as moléculas da fase oleosa têm que estar associadas e penetrar no

filme interfacial do tensoativo. Para facilitar a interação da fase oleosa com o filme interfacial

do tensoativo, o tamanho da molécula de óleo não deve ser muito grande ou pelo menos

conter ligações insaturadas [27]. Logo, óleos de tamanho menor são mais propícios para o

aparecimento deste tipo de estrutura microemulsionada.

Vários estudos têm sugerido o uso de óleos essenciais como a fase oleosa para a

formação de MEs, devido a estes agirem como promotores de permeação, por exemplo, para

fármacos hidrofílicos e lipofílicos, apresentando alta habilidade em promover a permeação de

maneira reversível e produzir baixo potencial de irritação cutânea [20, 21, 39, 40]. É

importante destacar que os promotores de permeação constituem um grupo de substâncias

capazes de minimizar a função barreira estabelecida pela pele através de vários mecanismos.

Dentre os óleos essenciais existentes, uma grande atenção tem sido dada ao óleo

essencial de Citrus sinensis (OECS - laranja pêra) (Figura 6) devido ser derivado de um

produto natural que vem sendo bastante exportado pelo Brasil, fazendo com que o nosso país

ocupe a quarta posição no ranking de exportação deste óleo para os EUA [41, 42, 43]. Ele é

obtido das cascas da laranja e apresenta um rendimento percentual em torno de 10%.

Figura 6 - Partes aéreas da planta Citrus sinensis (L.) Osbeck (laranja pêra).

Fonte: http://www.montedolaranjal.com/pt-pt/tag/laranja-pera/.

30

Além disso, o OECS constitui um sistema complexo que contém mais de 200

componentes, sendo o de maior predominância o D-limoneno (Figura 7), monoterpeno

utilizado em estudos de permeação de fármacos com o objetivo de aumentar a permeabilidade

destes através da pele [44, 45].

Figura 7 - Estrutura química do D-limoneno.


Em seus estudos, Williams e Barry (2004) destacam que os monoterpenos são muito

eficientes no sentido de aumento da permeação e que hidrocarbonetos ou terpenos apolares, a

exemplo do D-limoneno, ocasionam maior aumento para fármacos lipofílicos [46]. Logo,

pode-se concluir que os possíveis mecanismos de ação destes monoterpenos como promotores

de permeação estejam associados com a propriedade de solubilizar os lipídios do estrato

córneo, bem como aprimorar a divisão do fármaco nesta camada.

2.4 MICROEMULSÕES COMO SISTEMA DE LIBERAÇÃO TRANSDÉRMICA DE

FÁRMACOS

Nos últimos anos, MEs têm sido frequentemente empregadas na tentativa de aumentar

a liberação transdérmica de fármacos. As formulações de MEs mostram-se superiores para a

administração transdérmica devido ao seu alto potencial de solubilização de fármacos

particularmente lipofílicos, como também hidrofílicos, em comparação com os veículos

convencionais, tais como hidrogéis, emulsões e lipossomas [27, 47]. Além disso, permitem

liberação lenta do fármaco, a qual proporciona efeito prolongado evitando atingir

concentração plasmática acima do necessário [10] e oferecem benefícios que incluem o

aumento da solubilidade e absorção, o controle da biodisponibilidade de fármacos, a alteração

CH3

CH2CH3

31

dos parâmetros farmacocinéticos, a elevação do índice terapêutico e consequentemente, a

diminuição da toxicidade e o aumento da eficácia clínica de fármacos [10, 48].

Zhong et al. (2012) preparam MEs-géis de naproxeno compostas por uma mistura de

Tween 80 e Tween 20 como tensoativo, carbitol como cotensoativo, peponida como fase

oleosa e água, a fim de obter alto teor de fármaco e adesividade. Os estudos de permeação in

vitro mostram um aumento significativo na permeção do fármaco através da pele, além de

obter alto teor de fármaco, absorção percutânea e adesividade favorável [49]. Hathout et al.

(2010) mostraram que MEs à base de ácido oleico/Tween 20/Transcutol®/água são veículos

potencialmente úteis para a administração transdérmica de testosterona ao apresentar um

fluxo transdérmico aumentado nos estudos de permeação in vitro em peles suínas [50].

Zhu et al. (2008) mostraram que a permeação de penciclovir na pele, fármaco anti-

herpético, em uma formulação de ME de ácido oleico/Cremophor EL/etanol/água era 3,5

vezes mais elevada em comparação com um creme comercial [51]. Changez et al.

(2006) estudaram o fluxo transdérmico de hidrocloridrato de tetracaína a partir de MEs de

lecitina/n-propanol/miristato de isopropila/água e mostraram que estas MEs aumentam a

permeabilidade do hidrocloridrato de tetracaína na pele do rato por 20 a 25 vezes, dependendo

da composição da ME [52]. Gupta et al. (2005) demonstraram que o fluxo transdérmico de 5-

fluorouracil, um fármaco anti-neoplásico, aumentou de 2 a 6 vezes a partir de uma ME de bis

(2-etil-hexil) sulfosuccinato de sódio/água/miristato de isopropila, em comparação com uma

solução aquosa do mesmo fármaco [53].

Já Gallarate et al. (1999) estudaram a estabilidade do ácido ascórbico em várias MEs.

Palmitato de isopropila ou octanoato de cetearila foram utilizados como fases oleosas, dodecil

glicosídeo e propil betaína cocoamida foram utilizados como tensoativos, e 2-etil-1,3-

hexanodiol foi escolhido como um cotensoativo. A estabilidade do ácido ascórbico contra a

oxidação mostrou-se superior em sistemas microemulsionados em comparação com as

formulações aquosas [54]. Sintov e Shapiro (2004) escolheram a lidocaína como um fármaco

modelo lipofílico. Para reduzir a irritação, eles sugeriram MEs à base de oleato de glicerol e

polietilenoglicol 40 (PEG 40) derivados de ácidos graxos (tensoativos)/tetraglicol

(cotensoativo)/palmitato de isopropila/água, às quais o fármaco foi solubilizado. Estudos de

permeação in vitro em pele de ratos foram realizados e demostraram que o fluxo transdérmico

de lidocaína era significativamente melhorado pelas MEs compostas de oleato de glicerol -

estearato de PEG-40 comparada com as de oleato de glicerol - óleo de mamona hidroxilado

PEG-40 [55].

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S000527360900296X#bib212

32

Em estudos de caracterização físico-química dos sistemas microemulsionados com

fármacos, é possível observar que algumas propriedades do sistema podem se alterar um

pouco dependendo do fármaco, mas a estabilidade do sistema permanece a mesma. Por

exemplo, Djordjevic et al. (2004) investigaram MEs compostas de água, miristato de

isopropila, glicerídeo cáprico/PEG-8 caprílico (Labrasol®) e poligliceril-6 dioleato (Plurol

Oleique®

), como potenciais veículos de liberação de dietilamina diclofenaco. Entretanto,

verificou-se que a condutividade e as propriedades reológicas foram influenciadas

significativamente pela incorporação do fármaco nas condições experimentais. Pelo contrário,

o fármaco não influencou significativamente tanto no valor do pH, quanto na estabilidade e

textura óptica dos sistemas examinados [56].

Quanto à NFD, fármaco modelo utilizado neste trabalho, também existem estudos que

revelam o potencial dos sistemas microemulsionados ao veicular este fármaco. Boltri et al.

(1994) estudaram a absorção transdérmica in vitro da NFD a partir de MEs compostas de

Tween 20, taurodesoxicolato, álcool benzílico e duas fases aquosas (ora água-transcutol, ora

água-propilenoglicol) [57]; enquanto Thacharodi e Rao (1994) prepararam MEs óleo/água de

seis promotores de permeação diferentes (óleo de ylang ylang, óleo de lavanda, óleo de

canela, eucalipto, mentona e mentol) contendo etanol como agente emulsificante, buscando

verificar também a absorção transdérmica da NFD [58]. Tais estudos mostraram uma ótima

eficiência na permeação cutânea da NFD. No entanto, nos últimos anos, não existem estudos

recentes que abordem o efeito promotor de permeação dos sistemas microemulsionados

contendo esse fármaco.

2.5 NIFEDIPINA (NFD)

A NFD, dimetil-1,4-di-hidro-2,6-dimetil-4 (2-nitro-fenil) piridina-3,5-dicarboxilato

(Figura 8) é um fármaco utilizado no tratamento de hipertensão arterial e angina e é

quimicamente classificada como uma diidropiridina [59, 60]. Ela é uma antagonista do cálcio,

sendo assim considerada bloqueadora de canais de cálcio [61]. Os canais de cálcio são seu

sítio de ação, em que eles se localizam na superfície de todas as células e principalmente, das

células musculares lisas e células do músculo cardíaco.

33

Figura 8 - Estrutura química da Nifedipina.


Este fármaco constitui um ácido fraco (pKa = 3,93) com massa molar de 346,33 Da e é

conhecido por sua fotosensibilidade e baixa solubilidade em água (≈ 10 µg mL-1

em água a

37°C) [62]. A maioria dos fármacos da classe das diidropiridinas apresenta propriedades

físicas e químicas semelhantes à NFD, tais como hidrofobicidade.

A NFD apresenta uma biodisponibilidade sistêmica limitada por via oral, pois sua

farmacodinâmica é complexa em decorrência de uma combinação dos efeitos enzimáticos ao

longo do trato gastrointestinal [22, 23]. Apesar de ser eficaz no alívio dos sintomas da

hipertensão grave, a concentração de NFD suficiente para atingir um efeito benéfico para o

coração pode causar efeitos colaterais indesejáveis, os quais incluem hipotensão pronunciada,

diarréia, hepatoxicidade, confusão mental e aumento na mortalidade em pacientes com

doenças coronárias [63]. Consequentemente, os efeitos colaterais são principalmente,

resultado de doses altas e excessivas ou de como o fármaco é solicitado para formulações

atuais.

Em decorrência disso, surge a ideia de veicular a NFD e outros fármacos que

apresentem o mesmo problema em sistemas estabilizados por tensoativos, tais como MIs e

MEs, para administração transdérmica. Alguns trabalhos têm mostrado resultados

satisfatórios, em virtude de uma maior permeação desse fármaco com relação ao aumento de

fluxo, uma maior solubilidade do mesmo e diminuição dos efeitos colaterais [22, 44, 58, 64,

65, 66].

Por isso, torna-se de extrema importância o conhecimento da interação existente entre

o fármaco e os sistemas aqui estudados (MIs e MEs) visando os possíveis estudos de

liberação. Todavia, para que o fármaco possa ser incorporado a tais sistemas, é necessário o

NH

CH3 CH3

O

OCH3 O CH3

O

NO2

34

conhecimento de sua região de formação, a qual pode ser obtida a partir da construção de

diagramas de fases.

2.6 DIAGRAMA DE FASES

A construção do diagrama de fases é de fundamental importância para obtenção das

regiões de formação de sistemas micelares e microemulsionados. Sua interpretação retrata as

estruturas presentes, podendo-se escolher a região que considerar mais apropriada para o

fármaco ser incorporado. Os diagramas de fases ternários e pseudoternários são normalmente

produzidos em duas dimensões a partir de dados obtidos por titulação ou pela preparação de

um grande número de amostras de diferentes composições [67].

Estes diagramas são formados por um triângulo equilátero, em que os lados são

utilizados como eixos e estes representam os componentes do sistema. Na maioria das vezes,

a proporção de cada componente é exibida como porcentagem de peso total da formulação,

sendo que cada vértice corresponde a 100% do componente indicado [15]. A Figura 9

apresenta um triângulo equilátero em que cada lado (dividido em dez partes correspondentes à

composição centesimal de cada ponto) é composto por um dos componentes da mistura. Os

vértices do diagrama de fases (A, T, O) representam os componentes puros [25]. Para

determinar as concentrações de cada componente no ponto D, deve-se traçar sucessivamente

por este ponto as paralelas aos lados opostos aos vértices que representam 100% de cada

componente. Geralmente, o diagrama de fases que utiliza um triângulo equilátero com uma

mistura de três componentes é chamado de diagrama ternário. No entanto, no caso de MEs,

estes diagramas são chamados de pseudoternários, pois um dos vértices (normalmente T), que

representa apenas o tensoativo, passa a representar a mistura binária de

tensoativo/cotensoativo. Por isso, o diagrama é a representação da mistura de quatro

constituintes no triângulo equilátero [9, 25].

No interior do triângulo, regiões de MEs, MIs, cristais líquidos, emulsões ou separação

de fases (regiões de Winsor) são formadas, permitindo a visualização simultânea das

quantidades relativas de cada componente. Assim, os diagramas são como ferramentas

capazes de apontar as regiões em que ocorrem a formação de MIs e MEs e, através delas, os

pesquisadores podem selecionar as formulações de interesse apropriadas aos seus propósitos

[9]. Todavia, os diagramas de fases não determinam as propriedades físico-químicas desses

sistemas que são necessárias para o conhecimento de suas estruturas e da influência dos

35

O0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

T

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

A

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

D

componentes. Para isso, as formulações selecionadas são levadas a uma série de

caracterizações físico-químicas através de vários métodos.

Figura 9 - Representação esquemática de um triângulo equilátero em que cada lado é representado por um dos

componentes da mistura. O ponto D representa a concentração de 50% de A, 20% de O e 30% de T.


2.1 MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS SISTEMAS

O conhecimento da dinâmica e estrutura de um sistema micelar e microemulsionado é

de fundamental importância e, em decorrência disso, diversas técnicas podem ser utilizadas

para este fim. Métodos como microscopia de luz polarizada (MLP) para averiguar a isotropia

do sistema [56], espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) [68] e espalhamento de

nêutrons a baixos ângulos (SANS) [69] para determinar o tamanho e a estrutura do sistema, e

ressonância magnética nuclear (RMN) para determinar a estrutura interna [70], têm sido

frequentemente usados. Além disso, métodos tais como comportamento reológico e

viscosidade [71], índice de refração, condutividade elétrica e potencial zeta, são

36

extremamente fundamentais para complementar o estudo estrutural, determinando o tipo de

MI e ME formada e sua caracterização físico-química [15].

2.1.1 Microscopia de Luz Polarizada (MLP)

Quando uma fonte de luz incide em um meio opticamente isotrópico, as propriedades

ópticas são as mesmas em todas as direções, ou seja, há apenas um único índice de refração.

Todavia, quando a luz se propaga em um meio anisotrópico independente do estado inicial de

polarização, a direção de oscilação do seu campo elétrico pode ser decomposta em duas

componentes denominadas como raio extraordinário (paralelo à direção do eixo óptico do

meio) e raio ordinário (perpendicular à direção do eixo óptico do meio). Estes por sua vez,

viajam com velocidades de propagação diferentes [72].

A MLP é uma técnica que permite averiguar a isotropia de um sistema e baseia-se em

um campo elétrico de raio luminoso polarizado que uma substância birrefringente pode

ocasionar. Este método permite classificar um sistema em isotrópico ou anisotrópico,

diferenciando microscopicamente os tipos de estruturas formadas. Os sistemas isotrópicos são

aqueles que não desviam luz sob o plano de luz polarizada e os anisotrópicos desviam luz sob

o plano de luz polarizada [73].

O microscópio de luz polarizada é um microscópio óptico comum, no qual o

polarizador, localizado junto ao condensador, orienta as ondas luminosas decorrentes da fonte

de luz em uma só direção, em um só plano. As modificações que um sistema birrefringente

provoca na direção da propagação da luz, em um equipamento desse tipo são realizadas

graças ao analisador, um segundo sistema de polarização que se encontra junto à ocular. O

máximo de luz é obtido quando o polarizador e analisador estão com eixos em paralelo e, ao

contrário, a luz extingue quando são perpendiculares [72, 73].

Para os sistemas que exibem estruturas anisotrópicas, imagens características do tipo

de fase formada são obtidas, por exemplo, estrias para fase hexagonal e cruzes de malta para

fases lamelares. No entanto, para sistemas com estruturas isotrópicas, como os micelares e

microemulsionados, por não desviarem a propagação da luz polarizada, são visualizados

como campo escuro [10].

37

2.1.2 Condutividade Elétrica

A condutividade elétrica é uma indicativa da facilidade com a qual o sistema é capaz

de conduzir corrente elétrica e é medida em Siemens por metro (S/m) no Sistema

Internacional de Unidades (SI). Ela é uma ferramenta sensível e frequentemente utilizada para

determinar, por exemplo, se um sistema microemulsionado possui domínio contínuo aquoso

ou oleoso [15, 55, 56, 74].

A condutividade de um sistema microemulsionado pode variar drasticamente

dependendo do tipo da ME (O/A, A/O ou bicontínua). MEs de O/A têm condutividade

próxima à do meio aquoso, ao contrário de MEs de A/O que apresentam valores de

condutividade muito baixos. Nas MEs bicontínuas, a condutividade também é

significativamente alta [12]. Logo, a condutividade das MEs pode ser muito importante na

determinação do tipo de microestrutura formada nestes sistemas.

2.1.3 Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)

O DLS consiste em uma técnica importante para a medição do tamanho das partículas,

com tamanho menor que 1 μm. O feixe de luz laser que incide nas partículas, passa por um

processo de espalhamento que varia em uma taxa dependente da velocidade de difusão da

partícula, sendo detectado em um determinado ângulo. Por sua vez, esta velocidade é

governada pelo seu tamanho, oferecendo informações diretas sobre o movimento translacional

das partículas e possibilitando o cálculo do tamanho destas através de relações empíricas

adequadas [75].

O método consiste em medir a função de auto-correlação da intensidade da luz

espalhada. Como para uma partícula essa função decai exponencialmente com o tempo, fica

visível que, para um conjunto de partículas, a função é uma soma de exponenciais. O valor

máximo desta função representa o coeficiente de difusão médio da partícula, o qual

corresponde à soma do espalhamento de luz dos elementos de volume. Comumente esses

valores são obtidos da diluição infinita da amostra, ou seja, mede-se o coeficiente de difusão

em função da concentração de partículas e extrapolam-se esses valores para a concentração

zero [7]. A partir do coeficiente de difusão médio, o raio hidrodinâmico médio (Rh) das

partículas micelares ou microemulsionadas é calculado pela equação de Stokes-Einstein

38

(Equação 10), em que KB é a constante de Boltzmann, T é a temperatura absoluta, η é a

viscosidade do meio dispersante e D é o coeficiente de difusão das partículas [25].

Caso o sistema a ser analisado esteja em elevadas concentrações, a interpolação torna-

se dificultada em razão das interações interpartículas. Desta forma, se faz necessário realizar

uma diluição para facilitar a sua identificação [28] .

2.1.4 Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (SAXS)

A técnica de SAXS é uma ferramenta muito útil no estudo de partículas coloidais,

como MIs e MEs, já que possibilita a medida do tamanho, da forma e de possíveis interações

entre as partículas espalhadoras [76].

Para um sistema de partículas idênticas com baixa polidispersividade, anisometria e

esfericamente simétrico, tais como sistemas micelares e microemulsionados, a intensidade de

espalhamento I(q) pode ser escrita da seguinte forma:

⟨ ⟩ { ∫

}

sendo k uma constante relacionada ao arranjo experimental e np a densidade numérica das

gotículas. O fator de forma da gotícula espalhadora é dado pela seguinte equação:

⟨ ⟩

em que F(q) é a amplitude do espalhamento e q é o módulo do vetor de espalhamento

(

, λ é o comprimento de onda da radiação incidente e 2θ é o ângulo de

espalhamento). Enquanto que o fator estrutura é dado por:

∫

que é a função de interferência entre as gotículas espalhadoras, sendo g(r) a função de

distribuição radial, relacionada à probabilidade de se encontrar uma gotícula distante de r do

centro de uma gotícula de referência [77, 78, 79].

Para sistemas não interagentes (ou seja, S(q) ≈ 1), em uma curva de SAXS pode ser

obtido o valor do raio de giro (Rg) da gotícula em estudo. Segundo a lei de Guinier, a curva

39

de espalhamento para q → 0 pode ser aproximada por uma função exponencial, de tal forma

que:

onde I(0) é a intensidade extrapolada à q = 0. Esta relação torna-se válida na região em que

qRg ≤ 1 e logo, I(0) pode ser escrita como:

sendo que ∆ρ e V representam o contraste de densidade eletrônica da partícula em relação ao

meio e o volume da gotícula espalhadora, respectivamente [77].

A intensidade de espalhamento também pode ser escrita através da função de

distribuição de distâncias, p(r). Esta função está relacionada com a probabilidade de se

encontrar dois centros espalhadores distantes de r dentro da gotícula em estudo. Esta função

pode ser dita como [77, 78, 79]:

∫ ∫

Através de p(r) é possível também obter o valor do raio de giro (Rg) da gotícula de

acordo com a relação:

∫

∫

Com isso, a partir dessas equações e de modelos que se adequem aos sistemas em

estudo é possível determinar parâmetros estruturais como o raio de giro (Rg) e a distância

entre as gotículas.

2.1.5 Tensão Superficial

O termo superfície indica uma interface onde uma fase é liquida e a outra é gasosa,

geralmente o ar. As moléculas na superfície de um líquido estão sujeitas a fortes forças de

atração das moléculas interiores. A resultante dessas forças atua de tal maneira que a

superfície líquida seja a menor possível. A grandeza desta força, atuando perpendicularmente

(por unidade de comprimento) ao plano na superfície é dita tensão superficial. Sua unidade no

SI é de mN.m-1

[80, 81].

40

A tensão superficial da maioria dos líquidos é afetada pela presença de moléculas de

tensoativos provocando a sua diminuição significativa mesmo em baixas concentrações. Até

que a CMC seja alcançada, à medida que a concentração do tensoativo aumenta, a tensão

superficial do líquido tende a diminuir [81]. Isso pode ser verificado pela Figura 10 que

mostra um esquema do comportamento do tensoativo na superfície do líquido e no meio da

solução, em função da tensão superficial [80].

Figura 10 - Esquema do comportamento do tensoativo entre as fases fluida e superficial, em função da tensão

superficial, indicando a CMC.

Fonte: SANTOS et al. (2007) [80].

Com isso, a partir da tensiometria busca-se verificar, por exemplo, o quanto o

tensoativo conseguiu baixar a tensão superficial de um líquido. Existem vários métodos para

a determinação de tensão superficial que podem ser estáticos ou dinâmicos. O método

utilizado neste trabalho é o da placa de Wilhelmy, que se caracteriza por ser dinâmico.

Tendo em vista todos estes pontos, o presente trabalho propõe um estudo da formação

de sistemas micelares e microemulsionados (contendo óleo essencial de Critus sinensis (L.)

Osbeck) que possam ser utilizados como veículo para um fármaco modelo (NFD) buscando

verificar a influência das fases e do fármaco na estrutura desses sistemas através de seu

41

desenvolvimento e caracterização físico-química. Além disso, busca estudar a interação da

NFD com as MIs e MEs para entender os mecanismos de liberação transdérmica deste

fármaco.

42

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Obter e caracterizar sistemas micelares e microemulsionados (contendo óleo essencial

de Citrus sinensis (L.) Osbeck) para incorporação da NFD, avaliar a influência das fases e do

fármaco na estrutura dos sistemas e estudar a interação da NFD com as MIs e MEs para

entender os mecanismos de liberação transdérmica deste fármaco.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obter sistemas micelares e microemulsionados (contendo óleo essencial de Citrus

sinensis (L.) Osbeck como fase oleosa);

Caracterizar a estrutura das MIs e MEs obtidas;

Avaliar a incorporação da NFD nos sistemas obtidos;

Avaliar a influência das fases e do fármaco na estrutura dos sistemas obtidos;

Avaliar a interação dos sistemas com o estrato córneo (EC) por espectrofotometria de

absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR);

Estudar a interação da NFD com as MIs e MEs por meio de ajustes de modelos

estruturais das curvas de SAXS e estudos complementares.

43

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 REAGENTES E SOLVENTES

Cascas de Citrus sinensis (L.) Osbeck (laranja pera);

Nifedipina (HENRIFARMA®);

Água ultra pura Milli-Q;

Óleo essencial de Citrus sinensis (L.) Osbeck;

Tween® 80 [Monooleato de Polioxietileno (20) Sorbitano, SYNTH

®];

Álcool etílico (Etanol, 99,5%, NEON®);

Fosfato de potássio monobásico anidro (KH2PO4, NEON®

);

Hidróxido de sódio micropérola (NaOH, SYNTH®);

Álcool isopropílico (Isopropanol, NEON®);

Clorofórmio (CHCl3, SYNTH®

);

Acetato de etila (NEON®

);

Álcool octílico (Octanol, NEON®

);

Álcool metílico (Metanol, NEON®

).

4.2 EQUIPAMENTOS E ACESSÓRIOS

Estufa;

Moinho de facas;

Aparelho extrator do tipo Clevenger modificado;

Agitadores magnéticos (GOSTIRRER®, MARTE

® e FISATOM

®);

Barras magnéticas ou peixinhos;

Pipetas graduadas de 1,0 a 10,0 mL;

Micropipetas;

Pipetas de Pasteur;

Pipetadores;

Béqueres;

Balões volumétricos;

44

Bastões de vidro;

Provetas;

Espátulas;

Balança analítica (BIOPRECISA® FA-2104N);

Condutivímetro (ION®

CON500);

Zetasizer Nano ZS (MALVERN®);

pHmetro (PHTEK®);

Microscópio de luz polarizada (OLYMPUS® BX51);

Tensiômetro Attension (SIGMA 700);

Espectrofotômetro Perkin-Elmer FTIR (System Spectrum BX);

Espectrofotômetro UV-vis (UV-1800 da SHIMADZU®);

Cromatógrafo líquido de alta eficiência com detecção no ultravioleta (Perkin Elmer).

4.3 EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL

O óleo essencial foi obtido das cascas de Citrus sinensis (laranja pêra) em único lote,

as quais foram secas em uma estufa de ar circulante, à temperatura de 40°C por um período de

72 horas. Após este período, as cascas foram trituradas em um moinho de facas e levadas a

um aparelho extrator do tipo Clevenger modificado por ± 3 h para obtenção do OECS (Figura

11). Resíduos de água foram removidos com a adição de sulfato de sódio [82].

Figura 11 - Esquema de extração de OECS.


45

O óleo foi acondicionado em frasco âmbar e armazenado sob refrigeração. As laranjas

foram adquiridas no Centro de Abastecimento de Alimentos (CEASA) em Aracaju-SE, sendo

procedentes do Município de Lagarto.

4.4 OBTENÇÃO DAS REGIÕES DE FORMAÇÃO DE MICELAS E

MICROEMULSÕES ATRAVÉS DE DIAGRAMAS DE FASES

As regiões de MIs e MEs foram determinadas através da construção de diagramas de

fase ternários e pseudoternários, respectivamente. Para isso, utilizou-se o método de

preparação de um grande número de amostras de diferentes composições.

Para os sistemas micelares, o diagrama de fases ternário foi composto pelos seguintes

componentes: Tween 80 como tensoativo não iônico, álcool etílico absoluto como

cotensoativo (álcool de cadeia curta) e tampão fosfato pH 5,0 como fase aquosa, buscando-se

o ajuste dos sistemas aqui estudados ao pH da pele para uma possível administração

transdérmica.

Para iniciar a construção do diagrama, uma proporção específica de Tween 80 e etanol

foi misturada por agitação magnética à temperatura ambiente nas seguintes proporções de

cotensoativo e tensoativo: 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1 e deixada sob agitação

durante 20 minutos. Estas proporções foram denominadas de ‘ensaios’ que variaram de 1 a 9.

Para cada um destes ensaios, foram criadas 9 formulações diferentes a fim de adicionar a fase

aquosa em proporções variadas de Tween 80/etanol e tampão fosfato pH 5,0. Após a adição

da fase aquosa, as misturas foram homogeneizadas em agitador magnético por 5 minutos a

temperatura ambiente. As tabelas 1 a 9 mostram as 81 formulações que foram preparadas e a

quantidade em volume utilizada de cada um dos componentes de acordo com o que foi

descrito anteriormente.

46

Tabela 1 - Quantidade em volume de cada um dos componentes utilizados para a preparação das 9 formulações

do Ensaio 1.

Ensaio 1

[1:9]

Etanol

(mL)

Tween 80

(mL)

Tampão Fosfato pH 5,0

(mL)

1:9 0,9 8,1 1,0

2:8 0,8 7,2 2,0

3:7 0,7 6,3 3,0

4:6 0,6 5,4 4,0

5:5 0,5 4,5 5,0

6:4 0,4 3,6 6,0

7:3 0,3 2,7 7,0

8:2 0,2 1,8 8,0

9:1 0,1 0,9 9,0


do Ensaio 2.

Ensaio 2

[2:8]

Etanol

(mL)

Tween 80

(mL)


(mL)

1:9 1,8 7,2 1,0

2:8 1,6 6,4 2,0

3:7 1,4 5,6 3,0

4:6 1,2 4,8 4,0

5:5 1,0 4,0 5,0

6:4 0,8 3,2 6,0

7:3 0,6 2,4 7,0

8:2 0,4 1,6 8,0

9:1 0,2 0,8 9,0


do Ensaio 3.

Ensaio 3

[3:7]

Etanol

(mL)

Tween 80

(mL)


(mL)

1:9 2,7 6,3 1,0

2:8 2,4 5,6 2,0

3:7 2,1 4,9 3,0

4:6 1,8 4,2 4,0

5:5 1,5 3,5 5,0

6:4 1,2 2,8 6,0

7:3 0,9 2,1 7,0

8:2 0,6 1,4 8,0

9:1 0,3 0,7 9,0

47


do Ensaio 4.

Ensaio 4

[4:6]

Etanol

(mL)

Tween 80

(mL)


(mL)

1:9 3,6 5,4 1,0

2:8 3,2 4,8 2,0

3:7 2,8 4,2 3,0

4:6 2,4 3,6 4,0

5:5 2,0 3,0 5,0

6:4 1,6 2,4 6,0

7:3 1,2 1,8 7,0

8:2 0,8 1,2 8,0

9:1 0,4 0,6 9,0


do Ensaio 5.

Ensaio 5

[5:5]

Etanol

(mL)

Tween 80

(mL)


(mL)

1:9 4,5 4,5 1,0

2:8 4,0 4,0 2,0

3:7 3,5 3,5 3,0

4:6 3,0 3,0 4,0

5:5 2,5 2,5 5,0

6:4 2,0 2,0 6,0

7:3 1,5 1,5 7,0

8:2 1,0 1,0 8,0

9:1 0,5 0,5 9,0


do Ensaio 6.

Ensaio 6

[6:4]

Etanol

(mL)

Tween 80

(mL)


(mL)

1:9 5,4 3,6 1,0

2:8 4,8 3,2 2,0

3:7 4,2 2,8 3,0

4:6 3,6 2,4 4,0

5:5 3,0 2,0 5,0

6:4 2,4 1,6 6,0

7:3 1,8 1,2 7,0

8:2 1,2 0,8 8,0

9:1 0,6 0,4 9,0

48


do Ensaio 7.

Ensaio 7

[7:3]

Etanol

(mL)

Tween 80

(mL)


(mL)

1:9 6,3 2,7 1,0

2:8 5,6 2,4 2,0

3:7 4,9 2,1 3,0

4:6 4,2 1,8 4,0

5:5 3,5 1,5 5,0

6:4 2,8 1,2 6,0

7:3 2,1 0,9 7,0

8:2 1,4 0,6 8,0

9:1 0,7 0,3 9,0


do Ensaio 8.

Ensaio 8

[8:2]

Etanol

(mL)

Tween 80

(mL)


(mL)

1:9 7,2 1,8 1,0

2:8 6,4 1,6 2,0

3:7 5,6 1,4 3,0

4:6 4,8 1,2 4,0

5:5 4,0 1,0 5,0

6:4 3,2 0,8 6,0

7:3 2,4 0,6 7,0

8:2 1,6 0,4 8,0

9:1 0,8 0,2 9,0


do Ensaio 9.

Ensaio 9

[9:1]

Etanol

(mL)

Tween 80

(mL)


(mL)

1:9 8,1 0,9 1,0

2:8 7,2 0,8 2,0

3:7 6,3 0,7 3,0

4:6 5,4 0,6 4,0

5:5 4,5 0,5 5,0

6:4 3,6 0,4 6,0

7:3 2,7 0,3 7,0

8:2 1,8 0,2 8,0

9:1 0,9 0,1 9,0

Para os sistemas microemulsionados, o diagrama de fases pseudoternário foi composto

pelos mesmos componentes dos sistemas micelares, só que agora com a adição de uma fase

oleosa, o OECS. Inicialmente, Tween 80 e etanol foram combinados na razão fixa de 1:1,

49

misturados e deixados em agitador magnético durante o período de 12 horas. Na construção

do diagrama, uma proporção específica de Tween 80/etanol e OECS foi misturada por

agitação magnética à temperatura ambiente nas seguintes proporções de fase oleosa e

tensoativo/cotensoativo: 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1 e deixada sob agitação

durante 20 minutos. Como falado anteriormente para os sistemas micelares, estas proporções

foram denominadas de ‘ensaios’ que variaram de 1 a 9. Para cada um destes ensaios, foram

criadas 9 formulações diferentes a fim de adicionar a fase aquosa em proporções variadas de

Tween 80/etanol/OECS e tampão fosfato pH 5,0. Após a adição da fase aquosa, as misturas

foram homogeneizadas em agitador magnético por 5 minutos a temperatura ambiente.

Todas as formulações preparadas foram deixadas em repouso e as mudanças do

aspecto visual puderam ser observadas depois de 5 dias. Considerando as proporções dos

componentes, os pontos obtidos foram plotados no diagrama de fases, utilizando o software

SigmaPlot 11,0. Com isso, foi possível observar as possíveis transições dos sistemas

opticamente transparentes ou translúcidos líquidos (MIs e MEs) para sistemas opacos líquidos

ou semissólidos (emulsões), dispersões opacas ou ainda separação de fases.

4.5 SELEÇÃO DAS FORMULAÇÕES

Após a construção dos diagramas de fases, as MIs e MEs de escolha para a

caracterização físico-química e incorporação da NFD foram obtidas a partir de uma

determinada região do diagrama ternário e pseudoternário, respectivamente. A concentração

limite (0,15 mg/mL) foi selecionada e incorporada de forma ativa nas formulações escolhidas

durante a preparação, logo, foi necessário preparar novamente as MIs e MEs de escolha. É

importante ressaltar que estes sistemas micelares e microemulsionados foram preparados 5

dias antes dos testes para garantir a estabilização termodinâmica das gotículas em temperatura

ambiente.

50

4.6 CARATERIZAÇÃO DAS MICELAS E MICROEMULSÕES SELECIONADAS

4.6.1 Microscopia de Luz Polarizada (MLP)

A identificação de isotropia nos sistemas selecionados foi realizada por um

microscópio de luz polarizada (Olympus BX51), câmera digital (Evolution LC Color) e

software analisador de imagem (Pixel link) do Departamento de Física (DFI) da Universidade

Federal de Sergipe (UFS) em São Cristóvão-SE, depois de percorrido o tempo mínimo de 5

dias para o equilíbrio dos sistemas.

4.6.2 Determinação do pH

O pH das formulações selecionadas na presença e ausência do fármaco foi avaliado

utilizando um potenciômetro digital com eletrodo de vidro e sensor de temperatura da marca

PHTEK PHS-3B do Laboratório de Desenvolvimento Farmacotécnico (LADEF) da UFS em

São Cristóvão-SE, previamente calibrado com soluções tampão pH 4,0 e 7,0 a uma

temperatura de 25 ± 0,5ºC.

4.6.3 Condutividade elétrica

Buscando comprovar o tipo de MI e ME formada, a condutividade elétrica dos

sistemas em estudo foi medida em um condutivímetro (ION CON500 Portable Conductivity

Meter), em temperatura de 25ºC. Foi medida a condutividade elétrica das amostras sem e com

fármaco. Estas medidas foram realizadas no LADEF da UFS em São Cristóvão-SE.

4.6.4 Tamanho e distribuição de tamanho das gotículas

Os sistemas isotrópicos selecionados foram submetidos sem diluições a medidas de

DLS utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano system ZS (Malvern-UK). Estas medidas

foram realizadas no DFI da UFS em São Cristóvão-SE. As amostras na presença e ausência

de fármaco foram colocadas em cela de vidro de 1 cm de caminho óptico e as medições feitas

à temperatura ambiente (25ºC). O equipamento realiza em média 10 determinações para cada

51

análise em triplicata. O diâmetro foi calculado por função de autocorrelação da intensidade

espalhada pelas gotículas.

O índice de polidispersividade (IPD) é uma medida da homogeneidade da dispersão

em relação ao diâmetro e varia de 0 a 1. Valores próximos de 0 indicam homogeneidade da

dispersão, enquanto valores que se aproximam de 1 indicam alta heterogeneidade.

4.6.5 Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos (SAXS)

As medidas foram realizadas na estação de medidas D11-A do Laboratório Nacional

de Luz Síncroton (LNLS) em Campinas-SP, cuja óptica pode ser apreciada na Figura 12. Ele

é equipado com um monocromador de silício (111), comprimento de onda de 1,499 Ǻ, uma

câmara de ionização, um detector vertical e um analisador multicanal para registrar a

intensidade do espalhamento. O espalhamento parasita (espalhamento de partículas existentes no

sistema sem amostra) do ar e das fendas foi subtraído da intensidade total da amostra. A

intensidade de espalhamento I(q) em função do módulo do vetor de espalhamento q de todas as

formulações na ausência e presença do fármaco foi expressa em unidades arbitrárias.

Figura 12 - Esquematização da linha de SAXS (D11A) do LNLS de Campinas.

Fonte: BARBOSA (2008) [76].

4.6.6 Determinação da Tensão Superficial

As medidas de tensão superficial das amostras na ausência e presença de fármaco

foram determinadas através do Tensiômetro Attension (SIGMA 700) do Laboratório de

52

Biotecnologia Ambiental (LABAM) da UFS em São Cristóvão-SE, à temperatura ambiente.

Durante a medição, a placa de Wilhelmy é submersa nas MIs e MEs e o tensiômetro mede a

força de empuxo sobre a placa, calculando assim, a tensão superficial através do tamanho da

placa conhecida [83].


MICROEMULSÕES

4.7.1 Estudos Computacionais

Para a avaliação das dimensões moleculares da NFD foi realizado um estudo de

modelagem deste fármaco empregando o programa computacional CAChe WorkSytem Pro

Versão 6.01. (CAChe) [84], sendo realizado ainda uma análise conformacional acompanhada

de otimização da geometria molecular pelo uso do método quântico semi-empírico AM1

(Austin Model 1) [85].

4.7.2 Análises no Ultravioleta (UV)

Análises de espectrofotometria de absorção na região do UV e visível foram realizadas

com o intuito de avaliar o ambiente químico da NFD nas MIs e MEs de modo a vislumbrar a

provável incorporação desta molécula por estas estruturas. Foram analisadas amostras de

NFD em tampão fosfato pH 5,0, MI, ME e alguns solventes, de diferentes polaridades, na

região do UV, utilizando um espectrofotômetro UV-vis (UV-1800 da SHIMADZU®

) para

aquisição dos dados, localizado no laboratório de pesquisa do Campus Prof. Alberto Carvalho

da UFS em Itabaiana-SE.

4.7.3 Determinação do coeficiente de partição

O coeficiente de partição da NFD em octanol/água foi determinado a partir da

utilização de cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) com detecção no ultravioleta

composto por uma bomba Perkin Elmer e detector UV/VIS Perkin Elmer configurado para o

comprimento de onda de 350 nm.

53

A separação cromatográfica isocrática foi realizada com uma coluna em fase reversa

RP-18 (Agilent, USA) com pré-coluna RP-18 4 mm e tamanho de partícula de 5 µm, a

temperatura ambiente. A padronização analítica utilizada para determinação da NFD por

CLAE foi baseada no método proposto por Kamiya et al. (2008) [86]. A fase móvel foi

composta por metanol e água (80:20) sendo filtrada, sonicada e bombeada a um fluxo de 0,8

mL min-1

. O volume de injeção foi de 20 L. As determinações foram realizadas em

triplicatas. As medidas foram realizadas no LADEF da UFS em São Cristóvão-SE.

4.7.4 Modelamento das curvas de SAXS das MIs e MEs

Os agregados micelares e microemulsionados são caracterizados por possuírem uma

densidade eletrônica não homogênea (Figura 13). A grande diferença entre MIs e MEs é que o

segundo é composto também pela adição da fase oleosa, junto aos demais componentes. Estes

agregados são compostos por um interior hidrofóbico, cuja densidade eletrônica (ρpar = 0.275

e/Å3) é menor que a da água (ρágua = 0.334 e/Å

3) e que pode ser apenas composta de

tensoativos (no caso das MIs) ou de uma mistura de tensoativo e óleo (no caso das MEs) além

de uma camada polar (hidrofílica), cuja densidade eletrônica é maior que a densidade

eletrônica da água. A figura abaixo mostra uma esquematização geral da estrutura micelar.

Figura 13 - Esquematização da estrutura de um agregado micelar, o interior hidrofóbico e as cabeças polares

estão em cinza e vermelho, respectivamente.

Fonte: BARBOSA (2008) [76].

Neste trabalho foi utilizado o modelo de elipsoide prolato de revolução para o fator de

forma de MIs e MEs em solução. Abaixo segue uma breve descrição deste modelo.

A princípio, vamos considerar um elipsoide prolato, com densidade eletrônica

constante (ρ1) e contraste de densidade eletrônica em relação ao meio (que em nosso caso será

a água) (= ρ1 - ρágua); os três semi-eixos do elipsoide são definidos por R, R e .R ( =

razão axial, também chamado de anisometria). Este elipsoide pode ser transformado em uma

esfera, de volume equivalente, cujo raio efetivo Ref é dado por [87]:

54

2

1222cos senRRef

Solução aquosa

pol Rpar

Rpar

Apolar/hidrofóbica

Polar/hidrofílica

pol Rpar

Rpar

Apolar/hidrofóbica

Polar/hidrofílica

água

par

pol

(18)

sendo o ângulo formado entre o eixo longo do elipsoide e a direção do vetor de

espalhamento q.

Se o elipsoide não tem orientação preferencial, obtém-se o fator de forma através da

média de todos os possíveis valores de , tal que [77]:

(19)

onde 1() = (cos2 +

2sen

2)

1/2 e:

(20)

Entretanto, como dito anteriormente, MIs e MEs são partículas heterogêneas com

respeito à densidade eletrônica, portanto, usaremos o modelo de dois níveis de densidade

eletrônica (Figura 14) para modelarmos o fator de forma de uma MI ou ME elipsoidal em

solução [87].

Figura 14 - Esquematização do modelo micelar ou microemulsionado tipo elipsoidal. Os parâmetros de ajuste

das curvas de SAXS para este elipsoide são: Rpar (raio parafínico), νRpar (semi-eixo maior do elipsoide), assim

como σpol e ρpol (espessura e densidade eletrônica da camada polar, respectivamente), ρágua, e ρpar, são as

densidades eletrônicas da água e da região parafínica, respectivamente, mantidas constantes e iguais a 0.334 e

0.275 e/Å3.

Fonte: BARBOSA (2008) [ 76].

Assim, este fator de forma pode ser escrito como:

55

323131212 )()()()( drrhrcnrcrh p

(21)

onde

2

1

222

2

2

1

222

1

)(cos)(

)(cos)(

sen

sen

tot

e tot = (Rpar +pol)/Rpol é a razão axial da partícula inteira, onde Rpol = Rpar + pol; pol é a

espessura da segunda camada de densidade eletrônica pol.

Durante a execução deste trabalho, ficou evidenciado que alguns sistemas

apresentaram interações entre as partículas espalhadoras. A função de interferência S(q)

depende do potencial de interação entre as partículas e de suas posições relativas, via função

de distribuição radial g(r) (Equação 11). É bem conhecido que uma transformada de Fourier

conecta as funções de interferência S(q) e a função de correlação total h(r) (= g(r) - 1) [88]. Se

duas partículas não podem se interpenetrar, nenhuma partícula pode ser encontrada mais perto

que a distância máxima de aproximação D (= diâmetro médio da partícula), tal que g(r < D) =

0. No outro extremo, para distâncias muito maiores que o diâmetro médio da partícula, não

deve existir interação entre as mesmas, já que os potenciais de interação de longo alcance são

proporcionais a r-1

. Assim, a densidade de partículas longe da partícula de referência é

indistinguível da densidade média das partículas e g(r ) = 1.

O cálculo utilizado para a função de correlação total, h(r), é o mesmo da teoria

fundamental de líquidos [88]: resolve-se a equação de Ornstein-Zernicke (OZ) [89] (Equação

22), impondo algumas relações de fechamento (Percus-Yevick (PY), Aproximação de Esfera

Média (MSA), “Hipperneted Chain” (HNC), “Random Phase Approximation” (RPA), dentre

outras) [90]. A equação de OZ pode ser escrita como [88, 89]:

(22)

onde h(rij) é função de correlação total da partícula i à partícula j, c(rij) é a correlação direta da

partícula i com a partícula j (também chamado de correlação de pares) e rij é a distância da

partícula i à partícula j.

As relações de fechamento nada mais são do que funções matemáticas que

correlacionam a função de correlação de pares, c(r), com a função de distribuição radial, g(r)

a fim de que a equação de OZ tenha uma solução. Dentre todos as metodologias citadas para

56

resolver (analiticamente ou não) a equação de OZ, destaca-se a relação de fechamento MSA,

desenvolvida por Hayter e Penfold [91] e Hansen e Hayter [92]. A relação de fechamento

MSA vem sendo amplamente utilizada por outros grupos de pesquisa ao redor do mundo [93,

94, 95].

Esta relação de fechamento supõe que as MIs ou MEs podem ser representadas como

esferas ”duras” efetivas (com volume equivalente e diâmetro ef = 2Ref) em solução, sendo

que o potencial mais comumente adotado para a interação de MIs ou MEs em solução é o

termo repulsivo do potencial DLVO (Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek) [96], uma vez

que não existem evidências de um termo atrativo em sistemas micelares ou

microemulsionados a baixas concentrações. O termo repulsivo deste potencial pode ser escrito

como:

(23)

onde

2

2

3

8

10

A

DB

B

e N Ik

K T

, sendo Z a carga na superfície da MI ou ME, e a carga fundamental do

elétron, a constante dielétrica do meio, NA o número de Avogadro, I a força iônica, KB a

constante de Boltzmann e T a temperatura. Neste modelo, kDB é o inverso do comprimento de

Debye, que descreve o intervalo de atuação do potencial repulsivo. No caso de MIs e MEs em

solução, é interessante substituir Z por αNag (Nag = Número de agregação). Deste modo, está

relacionado com a porcentagem de cargas na superfície da MI ou ME. É importante salientar

que α, por ser um parâmetro de ajuste, pode suprir algumas deficiências do potencial adotado.

Assim, ele não pode ser interpretado diretamente como o coeficiente de ionização das MIs ou

MEs, mas sim como um valor efetivo. É interessante mencionar aqui que a força iônica foi

calculada utilizando-se as constantes de dissociação dos sais que compõem o tampão, por

isso, o valor da força iônica pode ser ligeiramente diferente do valor nominal.

Desta forma o ajuste de modelos por SAXS permite a obtenção de informações

quantitativas sobre a nanoestrutura dos sistemas micelares e microemulsionadas e quando

fármacos são incorporados permite ainda conhecer as suas interações com o sistema. Neste

trabalho foram estudadas as amostras mais diluídas de MI e ME preparadas e mantidas em

repouso por cerca de 6 meses para garantir a presença dos agregados coloidais mais estáveis e

minimizar os efeitos de interferência entre eles, diminuindo a contribuição de picos de

57

correlação à baixos valores de q. Estudos qualitativos por SAXS apenas para confirmar a

formação das MIs e MEs também foram realizados.

4.8 ESTUDO DE INTERAÇÃO ENTRE AS MICELAS E AS MICROEMULSÕES EM

MODELO DE ESTRATO CÓRNEO POR FTIR

4.8.1 Preparação das amostras

A pele de cobra foi cortada em pequenos discos circulares com um diâmetro

aproximado de 3 cm e submersa em água destilada durante 12 h. Após esse período foi

retirado o excesso de água destilada com o auxílio de papel filtro e inserida as peles em

soluções contendo as MIs e as MEs selecionadas por um período de 12h. Logo depois, o

excesso de amostra contido na pele foi retirado com água destilada e com papel filtro [97]. As

peles hidratadas com água destilada foram utilizadas como controle.

4.8.2 Espectrofotometria de Absorção na região do Infravermelho com Transformada de

Fourier e modo de atenuação de refletância (FTIR-ATR)

Os espectros de FTIR-ATR de transmissão foram obtidos utilizando um

espectrofotômetro Perkin-Elmer FTIR System Spectrum BX do DFI da UFS em São

Cristóvão-SE. As amostras foram caracterizadas no FTIR-ATR com resolução 4 cm-1

, 16

varreduras, faixa de frequência de 4000-700 cm-1

, em temperatura ambiente [97].

4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os valores foram expressos como a média ± desvio padrão (DP) e, quando necessário,

foi utilizada a análise de variância “one-way” (ANOVA) seguida do pós-teste de Tukey para

avaliar a significância das diferenças entre as médias.

58

EtOH0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

T80

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TF

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

MI

MI1

MI2

MI3 MI4MI5

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 OBTENÇÃO DO DIAGRAMA DE FASES

A relação entre o comportamento de fase de uma mistura e da sua composição pode

ser obtida com o auxílio de um diagrama de fases. O comportamento de fase dos sistemas

micelares que compreendem Tween 80, álcool etílico e tampão fosfato pH 5,0, pode ser

estudado com a ajuda de um diagrama de fases ternário. Já o comportamento de fase dos

sistemas microemulsionados que compreendem uma mistura de Tween 80 e álcool etílico na

razão fixa de 1:1, OECS e tampão fosfato pH 5,0, pode ser estudado com a ajuda de um

diagrama de fases pseudoternário [15]. Com isso, para determinar a faixa de formação de MIs

e MEs, dois diagramas de fases foram elaborados sendo um ternário (Figura 15) e outro

pseudoternário (Figura 16), respectivamente.

Figura 15 - Diagrama de fases ternário constituído por Tween 80 (T80), etanol (EtOH) e tampão fosfato pH 5,0

(TF). Toda a área do diagrama representa Micela (MI).

59

OECS0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

T80/EtOH

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TF

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

SF

EM

ME

ME1

ME2

ME3 ME4

ME5

Figura 16 - Diagrama de fases pseudoternário constituído por mistura de Tween 80 e etanol (T80/EtOH), óleo

essencial de Citrus Sinensis (OECS) e tampão fosfato pH 5,0 (TF). As áreas delimitadas representam:

Microemulsão (ME), Emulsão (EM) e Separação de Fase (SF).

Os dois diagramas construídos mostram as regiões comuns identificadas a partir de seu

aspecto visual, tais como: Micela (MI), Microemulsão (ME), Emulsão (EM) e Separação de

Fase (SF). A Figura 17 mostra o aspecto visual de cada um destes sistemas compostos por

Tween 80, álcool etílico, tampão fosfato pH 5,0 e OECS (nos sistemas que apresentam fase

oleosa). A região com predominância de sistemas líquidos homogêneos, translúcidos e de

baixa viscosidade é característica de MI e ME. A região EM corresponde aos sistemas com

aspecto leitoso que apresentam viscosidades baixas e altas dependendo da formulação. A

região SF compreende os sistemas que apresentam duas ou três fases separadas.

60

Figura 17 - Aspecto visual dos seguintes sistemas: MI fluida, MI gelatinosa, ME, EM e SF (da esquerda para

direita).

Na Figura 15, foi possível observar a formação de sistemas micelares em toda

extensão do diagrama de fases. É importante destacar que a região micelar vai desde MIs bem

fluidas até MIs muito viscosas que apresentam um perfil gelatinoso (Figura 17). Isso é

decorrente da grande quantidade de Tween 80 presente que acarreta um intumescimento da

MI [98].

Na Figura 16, foi observada a formação de três diferentes sistemas que correspondem

a ME, EM e SF. A região de ME foi obtida em baixas concentrações de fase oleosa (0-40%),

atingindo uma ampla gama de fase aquosa e da mistura de tensoativo/cotensoativo (0-100%).

No entanto, fica perceptível que a formação dos sistemas microemulsionados depende

diretamente da concentração da mistura de tensoativo/cotensoativo, pois nas regiões em que

há concentrações baixas e intermediárias não foi possível estabilizar a mistura dos

componentes e ocorreu a formação de EM ou SF. Com o aumento da concentração dessa

mistura, sistemas microemulsionados vão sendo formados em maior quantidade. Por isso, na

região de ME, em que as concentrações da mistura variam de 0-60%, sua formação tende a

diminuir. Assim, com a construção deste diagrama foram observadas transições de sistemas

microemulsionados ricos em fase oleosa para sistemas microemulsionados ricos em fase

aquosa.

Para avaliar a influência dos componentes na estrutura do sistema, foram selecionadas

5 formulações de MIs e 5 formulações de MEs para caracterização físico-química e

incorporação do fármaco modelo. Para as MEs, 3 destas formulações foram mantidas

constante a concentração da mistura de tensoativo/cotensoativo (Tween 80/Etanol) a 24% e as

61

outras 3 foram mantidas constante a concentração da fase oleosa (OECS) a 2%. Estas

composições foram escolhidas devido ao fato de se ter interesse nas regiões em que MEs do

tipo O/A pudessem ser obtidas (0-10% de fase oleosa e 20-50% de mistura) com a fase

interna hidrofóbica para solubilizar o fármaco.

Para efeito de comparação, 3 formulações com quantidade constante de tensoativo

(Tween 80) a 24% e outras 3 com quantidade constante de cotensoativo (etanol) a 2% foram

selecionadas. Destas formulações, espera-se obter MIs diretas, em que a fase interna também

é hidrofóbica. Todas essas formulações são representadas pelos pontos nos diagramas da

Figura 15 e 16 e suas respectivas composições estão apresentadas na Tabela 10.

Tabela 10 - Composição centesimal dos sistemas micelares e microemulsionados selecionados a partir dos

diagramas de fases.

MICELAS

Formulação Fase Aquosa

(% v/v)

Cotensoativo

(% v/v)

Tensoativo

(% v/v)

MI1 90 2 8

MI2 80 2 18

MI3 74 2 24

MI4 72 4 24

MI5 70 6 24

MICROEMULSÕES

Formulação Fase Aquosa

(% v/v)

Fase Oleosa

(% v/v)

Tensoativo/Cotensoativo

(% v/v)

ME1 90 2 8

ME2 80 2 18

ME3 74 2 24

ME4 72 4 24

ME5 70 6 24

Em relação ao aspecto macroscópico foi possível observar que tanto as MIs quanto as

MEs se mantiveram homogêneas, límpidas e translúcidas com o decorrer do tempo,

confirmando assim a estabilidade termodinâmica desses sistemas. Após a incorporação de

forma ativa de uma concentração fixa de NFD nestas formulações, os sistemas se mantiveram

com a mesma limpidez e transparência mostrando que a NFD não perturbou a estabilidade

termodinâmica dos sistemas micelares e microemulsionados.

62

5.2 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS MICELAS E MICROEMULSÕES

SELECIONADAS

A Figura 18 mostra as fotomicrografias das formulações de MIs e MEs por MLP.

Estes sistemas foram visualizados como campo escuro, não desviando a propagação da luz e

sendo assim classificados como sistemas com estrutura isotrópica, os quais se apresentam

com as mesmas propriedades ópticas em todas as direções.

Figura 18 - Fotomicrografias das formulações MI3 (A) e ME3 (B) por MLP. A bolha é deixada para obter uma

maior visualização do campo escuro.

A Tabela 11 apresenta todos os valores de pH das formulações selecionadas. Na

ausência de NFD, os sistemas micelares apresentaram valores de pH que variam de 5,54 a

5,90, já os sistemas microemulsionados variam de 5,48 a 5,80. Na presença de NFD, os

valores de pH não mudaram muito, variando de 5,46 a 5,72 para as MIs e de 5,36 a 5,60 para

as MEs. Com isso, é possível perceber que o fármaco não influencia significativamente no pH

da formulação. Isso pode ser explicado pelo fato de a NFD não ser um ácido forte (pKa =

3,93) e se solubilizar facilmente em um meio pouco ácido, característico do sistema em

estudo. Além disso, estes resultados mostram que tanto as MIs quanto as MEs são apropriadas

para aplicação na pele, uma vez que a superfície da pele tem um pH de aproximadamente 4 a

5 e formulações aplicadas sobre ela devem possuir um pH entre 4 e 7 [99].

A B

10 x 10 x

63

Tabela 11 - Valores de pH na ausência e presença de fármaco para as formulações de MIs e MEs.

MICELAS

Formulação pH

Sem fármaco Com fármaco

MI1 5,54 ± 0,01 5,46 ± 0,03

MI2 5,74 ± 0,01 5,66 ± 0,03

MI3 5,90 ± 0,03 5,72 ± 0,03

MI4 5,78 ± 0,01 5,55 ± 0,02

MI5 5,83 ± 0,03 5,60 ± 0,02

MICROEMULSÕES

Formulação pH


ME1 5,48 ± 0,01 5,36 ± 0,01

ME2 5,71 ± 0,02 5,60 ± 0,01

ME3 5,80 ± 0,01 5,52 ± 0,01

ME4 5,80 ± 0,01 5,55 ± 0,01

ME5 5,80 ± 0,01 5,58 ± 0,03

média ± desvio padrão, n = 3

A Tabela 12 apresenta os valores de condutividade elétrica na ausência e presença de

fármaco para as formulações de MIs e MEs. A medida de condutividade é usada para

determinar o tipo de ME ou MI formada e estimar a fase predominante, resultante das

mudanças na composição ou na temperatura. Com isso, ela revela principalmente se uma fase

é aquosa ou oleosa ou ambas as fases são contínuas [74, 100].

Sistemas microemulsionados do tipo O/A e bicontínuos possuem valores de condutividade

elétrica relativamente elevados quando comparados aos sistemas microemulsionados do tipo

A/O [101].

Isso é confirmado para os valores de condutividade elétrica das formulações de MEs,

para as quais é verificado valores a partir de 3840 µS.cm-1

(Tabela 12) que diminuem com a

diminuição da quantidade de fase aquosa. Estes resultados sugerem que a fase oleosa é a fase

interna e a fase aquosa é a fase dispersante, característica de MEs do tipo O/A. O mesmo pode

ser verificado para os sistemas micelares que apresentam valores de condutividade elétrica

elevados e em faixas similares às formulações de MEs. Entretanto, por não terem um fase

oleosa característica, os resultados sugerem a formação de MIs diretas.

64

Tabela 12 - Valores de condutividade elétrica na ausência e presença de fármaco para as formulações de MIs e

MEs.

MICELAS

Formulação Condutividade (µS.cm

-1)


MI1 3690 3250

MI2 2700 2510

MI3 2300 2040

MI4 2080 1882

MI5 1863 1778

MICROEMULSÕES

Formulação Condutividade (µS.cm

-1)


ME1 3840 3250

ME2 2640 1867

ME3 2160 2000

ME4 2100 1916

ME5 2080 2020

A Tabela 13 apresenta os valores de tamanho médio das gotículas das MIs e MEs

obtidos por DLS. Os valores mostram que, na ausência de fármaco, o tamanho das gotículas

diminui com o aumento da quantidade de tensoativo (MI1, MI2 e MI3) e da mistura de

tensoativo/cotensoativo (ME1, ME2 e ME3). Este resultado é esperado uma vez que as

cadeias de Tween 80 e etanol promovem um rearranjo do filme interfacial do sistema. À

medida que o número de moléculas desse tensoativo e cotensoativo aumenta por unidade de

área, elas começam a se comprimir, umas ao lado das outras, diminuindo a tensão superficial

na interface, levando a uma redução do tamanho das gotículas com o aumento espontâneo da

área interfacial do sistema [9].

A mesma diminuição do tamanho de gotícula foi observada conforme a quantidade de

cotensoativo aumentou para as MIs (MI3, MI4 e MI5). No entanto, esta diminuição não é

significativa, podendo ser devido a pequena variação na quantidade de etanol em relação à

quantidade de Tween 80.

Para as MEs, o aumento da quantidade de fase oleosa influenciou no tamanho das

gotículas promovendo o seu aumento, conforme observado para ME3, ME4 e ME5. Estes

resultados confirmam os obtidos pelo estudo de condutividade, sugerindo que a fase oleosa é

a fase interna, pois aumentando a quantidade de OECS aumenta o tamanho das gotículas.

Para os sistemas com o fármaco, apenas as MEs apresentaram um aumento no

tamanho das gotículas enquanto, para as MIs, a variação é pouco significativa. Para confirmar

estes resultados, os dados da Tabela 13 foram tratados estaticamente utilizando a ANOVA

65

seguida do pós-teste de Tukey (não mostrado). A partir deste tratamento foi possível concluir

que há uma diferença significativa (p < 0,05) para o tamanho de gotículas das MEs sem e com

fármaco, mas o mesmo não pode ser observado para MIs, sugerindo que a adição de NFD não

influenciou no seu tamanho das gotículas.

Outra importante informação que pode ser obtida a partir dos resultados da Tabela 13

é que os tamanhos das gotículas para os sistemas micelares em estudo (entre 2 e 7 nm) foram

menores do que para os sistemas microemulsionados (entre 6 e 10 nm) tanto na ausência

quanto na presença de NFD. Os valores de IPD demonstraram que todas as formulações de

MI e ME apresentam distribuição de tamanho menor do que 0,5 garantindo assim, a

homogeneidade dos sistemas.

Tabela 13 - Valores de tamanho de gotícula e IPD na ausência e presença de fármaco para as formulações de

MIs e MEs.

MICELAS

Formulação Tamanho (nm) IPD

Sem fármaco Com fármaco Sem fármaco Com fármaco

MI1 6,31 ± 0,17 6,53 ± 0,21 0,07 ± 0,01 0,10 ± 0,01

MI2 4,30 ± 0,35 4,85 ± 0,45 0,26 ± 0,01 0,18 ± 0,07

MI3 3,16 ± 0,26 3,28 ± 0,33 0,23 ± 0,02 0,37 ± 0,01

MI4 2,94 ± 0,42 2,96 ± 0,23 0,31 ± 0,09 0,34 ± 0,01

MI5 2,80 ± 0,37 3,36 ± 0,50 0,20 ± 0,03 0,32 ± 0,01

MICROEMULSÕES

Formulação Tamanho (nm) IPD

Sem fármaco Com fármaco Sem fármaco Com fármaco

ME1 7,41 ± 0,05 9,01 ± 0,46 0,26 ± 0,01 0,09 ± 0,05

ME2 7,02 ± 0,24 7,93 ± 0,40 0,26 ± 0,01 0,29 ± 0,03

ME3 6,19 ± 0,34 8,15 ± 0,58 0,27 ± 0,02 0,19 ± 0,02

ME4 6,72 ± 0,34 8,11 ± 0,42 0,25 ± 0,07 0,24 ± 0,11

ME5 7,73 ± 0,16 9,42 ± 0,40 0,26 ± 0,04 0,17 ± 0,03 média ± desvio padrão, n = 3

Informações qualitativas a respeito da influência dos componentes e da incorporação

do fármaco sobre a nanoestrutura das MIs e MEs foram obtidos pela técnica de SAXS. Nesta

técnica, o perfil de dispersão registrado em ângulos baixos e a aplicação de modelos

adequados permitem a obtenção de informações acerca do tamanho, forma e nanoestrutura de

sistemas tais como MIs e MEs [74].

A Figura 19 mostra as curvas de intensidade de espalhamento (I(q)) em função do

vetor de espalhamento (q) para as MIs mantendo a quantidade de cotensoativo constante (a) e

para as MEs mantendo a fase oleosa constante (b) na ausência de fármaco.

66

As curvas exibem um pico largo centrado em q, característico de sistemas micelares e

microemulsionados [14, 76]. Como se pode observar, o aumento da quantidade do tensoativo

promove um pequeno deslocamento dos picos para valores maiores de q tanto para as MIs

quanto para as MEs. Isso indica que, segundo a equação d = 2π/q (sendo d o diâmetro das

partículas espalhadoras), o tamanho de gotículas dos sistemas está diminuindo (Figura 19).

Estes resultados são confirmados com os de tamanho obtidos por DLS (Tabela 13). Para

valores menores de q (q 0) pode se observar a presença de um pico largo que pode ser

atribuído a contribuição de interferência ou interação entre as partículas espalhadoras (neste

caso as MIs).

Figura 19 - Curvas de intensidade de espalhamento I(q) em função do vetor de espalhamento q para (a) MIs

mantendo cotensoativo ( etanol) constante e (b) MEs mantendo fase oleosa – OECS – constante.

A Figura 20 mostra as curvas de I(q) em função de q para as MIs mantendo a

quantidade de tensoativo constante (a) e para as MEs mantendo a mistura

tensoativo/cotensoativo constante (b) na ausência de fármaco.

Para os sistemas micelares, pode-se observar que os picos das curvas de SAXS não se

deslocam com o aumento da quantidade do cotensoativo (Figura 20(a)). Estes resultados

sugerem que o etanol não influenciou na nanoestrutura das MIs, confirmando os resultados de

tamanho de gotícula obtidos por DLS, aonde praticamente não foi observada a variação do

tamanho com o aumento da quantidade de etanol.

Perfil de curvas semelhantes das MIs foram obtidas para os sistemas

microemulsionados. Ao manter o conteúdo da mistura de tensoativo/cotensoativo constante, o

aumento do conteúdo da fase oleosa contribui para o deslocamento dos picos para valores de

(a)

a

(b)

0,1 1

1E-3

0,01

In

ten

sidad

e (u

. a)

q (nm-1)

ME1

ME2

ME3

0,1 1

1E-3

0,01

MI1

MI2

MI3

Inte

nsi

dad

e (u

. a)

q (nm-1

)

67

q menores, o que indica que o tamanho das gotículas está aumentando (Figura 20(b)),

confirmando a influência do OECS no tamanho das gotículas de MEs também observados nos

resultados de tamanho da Tabela 13.

Figura 20 - Curvas de intensidade de espalhamento I(q) em função do vetor de espalhamento q para (a) MIs

mantendo tensoativo – Tween 80 – constante e (b) MEs mantendo a mistura de tensoativo/cotensoativo – Tween

80/Etanol – constante.

A influência da NFD na nanoestrutura dos sistemas micelares e microemulsionados

também foi estudada por SAXS. As Figuras 21 e 22 apresentam as curvas de I(q) em função

de q para as MIs e MEs, respectivamente.

Para os sistemas micelares (Figura 21) pode-se verificar que a presença do fármaco

não altera os perfis das curvas de espalhamento, pois elas apresentam a mesma forma e

intensidade. Este resultado sugere que a NFD não influencia na nanoestrutura das MIs. Para

os sistemas microemulsionados (Figura 22), os picos são deslocados para menores valores de

q indicando que a presença do fármaco aumenta o tamanho das gotículas. No entanto,

surpreendentemente, na ME5 ocorre o contrário, novos estudos serão realizados para

confirmar estes resultados.

Os resultados de SAXS confirmam as medidas de tamanho por DLS e sugerem que a

NFD, no caso das MEs, esteja incorporada na sua fase interna (oleosa), enquanto para as MIs,

devido a ausência de uma fase oleosa, não há interação do fármaco, uma vez que ele é

lipofílico. Este resultado também indica que os sistemas micelares, apesar de potenciais

sistemas permeadores, podem não ser um bom sistema de liberação de fármacos lipofílicos.

(a)

a

(b)

0,1 1

1E-3

0,01

Inte

nsi

dad

e (u

. a)

q (nm-1)

MI3

MI4

MI5

0,1 1

1E-3

0,01

Inte

nsi

dad

e (u

. a)

q (nm-1)

ME3

ME4

ME5

68

É interessante salientar novamente que, nas curvas de SAXS das Figuras 19 a 22, fica

visível um significante ‘ombro’ a baixos valores de q atribuído às interações entre as MIs (ou

entre as MEs), que gera uma função de interferência S(q). Este perfil de curva se apresenta

mais perceptível em sistemas recentes que não se encontram totalmente estabilizados.

Figura 21 - Curvas de intensidade de espalhamento I(q) em função do vetor de espalhamento q para os sistemas

micelares na ausência e presença de nifedipina (NFD).

0,1 1

1E-3

0,01

Inte

nsi

dad

e (u

. a)

q (nm-1

)

MI3

MI3 (NFD)

0,1 1

1E-3

0,01

Inte

nsi

dad

e (u

. a)

q (nm-1

)

MI1

MI1 (NFD)

0,1 1

1E-3

0,01

Inte

nsi

dad

e (u

. a)

q (nm-1

)

MI2

MI2 (NFD)

0,1 1

1E-3

0,01

Inte

nsi

dad

e (u

. a)

q (nm-1

)

MI5

MI5 (NFD)

0,1 1

1E-3

0,01

Inte

nsi

dad

e (u

. a)

q (nm-1

)

MI4

MI4 (NFD)

69

Figura 22 - Curvas de intensidade de espalhamento I(q) em função do vetor de espalhamento q para os sistemas

microemulsionados na ausência e presença de nifedipina (NFD).

A Tabela 14 apresenta os valores de tensão superficial das formulações de MIs e MEs.

No geral, é possível perceber, tanto para os sistemas micelares quanto os microemulsionados,

uma diminuição significativa da tensão superficial à medida que aumenta a quantidade de

0,1 1

1E-3

0,01

Inte

nsi

dad

e (u

. a)

q (nm-1

)

ME1

ME1 (NFD)

0,1 1

1E-3

0,01

Inte

nsi

dad

e (u

. a)

q (nm-1

)

ME2

ME2 (NFD)

0,1 1

1E-3

0,01

Inte

nsi

dad

e (u

.a)

q (nm-1

)

ME5

ME5 (NFD)

0,1 1

1E-3

0,01

Inte

nsi

dad

e (u

. a)

q (nm-1)

ME3

ME3 (NFD)

0,1 1

1E-3

0,01

Inte

nsi

dad

e (u

. a)

q (nm-1

)

ME4

ME4 (NFD)

70

tensoativo ou da mistura de tensoativo/cotensoativo no sistema. Ao manter a concentração de

cotensoativo constante (MI1, MI2 e MI3), quando a concentração de tensoativo aumenta, a

tensão superficial diminui significativamente, corroborando com os resultados de tamanho das

gotículas (Tabela 13). O mesmo perfil é observado para as MEs ao manter a concentração de

fase oleosa constante e variar a concentração da mistura de tensoativo/cotensoativo (ME1,

ME2 e ME3).

Logo, pode-se sugerir que tanto os sistemas micelares quanto os microemulsionados

apresentaram tensões superficiais suficientemente baixas em relação ao seu controle (água

destilada), o qual apresentou uma tensão superficial de 71,14 ± 0,18. Isso é decorrente das

cadeias do Tween 80 (tensoativo) e do etanol (cotensoativo) que promovem um rearranjo do

filme interfacial como já explicado anteriormente.

Tabela 14 - Valores de tensão superficial na ausência e presença de fármaco para as formulações de MIs e MEs.

MICELAS

Formulação Tensão Superficial (mN/m)


MI1 35,08 ± 0,38 35,65 ± 0,39

MI2 34,04 ± 0,18 34,20 ± 0,12

MI3 33,16 ± 0,06 33,32 ± 0,10

MI4 33,09 ± 0,03 33,42 ± 0,10

MI5 32,41 ± 0,02 33,03 ± 0,05

MICROEMULSÕES

Formulação Tensão Superficial (mN/m)


ME1 33,68 ± 0,54 32,06 ± 0,35

ME2 32,72 ± 0,19 31,53 ± 0,28

ME3 31,75 ± 0,21 30,89 ± 0,30

ME4 30, 78 ± 0,04 30,21 ± 0,18

ME5 29,32 ± 0,08 29,56 ± 0,23

média ± desvio padrão, n = 3


MICROEMULSÕES

Na tentativa de comprovar e entender melhor a localização da NFD nos sistemas

micelares e microemulsionados, estudos complementares tais como, estudos computacionais,

análises no UV e determinação do coeficiente de partição do fármaco em octanol/água foram

realizados.

71

Nos estudos computacionais, a estrutura da NFD foi construída no programa

computacional CAChe. Esta molécula teve sua geometria ajustada, incluindo um estudo

conformacional, empregando o método quântico semi-empírico AM1, com intuito de avaliar

as dimensões aproximadas desse fármaco. As dimensões finais avaliadas variam entre 5 a 12

Å de dimensões mínimas e máximas, respectivamente, mesmo após a realização de estudo

conformacional (Figura 23).

Figura 23 - Representação da estrutura molecular da NFD com suas dimensões aproximadas, destacadas em

diferentes orientações. A figura do fármaco e suas dimensões foi preparada usando o programa PyMOL (DeLano

Scientific, San Carlos, CA, http://www.pymol.org). As cores dos átomos representam: cinza (carbono), vermelho

(oxigênio) e azul (nitrogênio).

Nas análises no UV, foram realizadas medidas da NFD em tampão fosfato pH 5,0, MI

e ME, para a visualização dos espectros de absorção do fármaco e acompanhamento dos

deslocamentos dos comprimentos de onda máximos como parâmetro de avaliação do

ambiente químico ao seu redor. Foi possível observar que no tampão fosfato pH 5,0 (Figura

24(a)), o fármaco mostra uma significativa absorção, apresentando uma banda característica

em torno de 340 nm, o que viabiliza o uso desta técnica para este fim. No entanto, o perfil

característico da NFD não pode ser observado no sistema micelar e microemulsionado (Figura

24(b) e (c)), pois tanto a MI quanto a ME espalham fortemente a radiação nessa região.

http://www.pymol.org/

72

200 250 300 350 400 450 500

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

Abso

rbân

cia

(u. a)

Comprimento de Onda (nm)

Tampão Fosfato pH 5,0 + NFD

200 250 300 350 400 450 500

-4

-2

0

2

4

Abso

rbân

cia

(u. a)


MI + NFD

200 250 300 350 400 450 500

-4

-2

0

2

Abso

rbân

cia

(u. a)


ME + NFD

Figura 24 - Espetros de absorção na região do UV da NFD no tampão fosfato pH 5,0 (a), na MI (b) e na ME (c).

Com isso, surgiu a ideia de avaliar os espectros de absorção da NFD em solventes de

diferentes polaridades para verificar o que acontece em cada um deles e tomá-los, se possível,

como parâmetros de polaridade para os sistemas. Inicialmente, foi construída uma escala de

oito solventes de polaridades relativas à água e capazes de solubilizar o fármaco. Destes oito

solventes, três foram descartados por espalharem na região do UV. A Figura 25 mostra os

espectros de absorção da NFD na região do UV em cinco solventes de diferentes polaridades.

(a) (b)

(c)

73

250 300 350 400 450 500

0,0

0,2

0,4

A

bso

rbân

cia

(u. a)


Água + NFD

Etanol + NFD

Isopropanol + NFD

Clorofórmio + NFD

Acetato de Etila + NFD

Figura 25 - Espectros de absorção na região do UV da NFD em cinco solventes de polaridades diferentes.

Na Tabela 15 estão as polaridades relativas e os valores aproximados do comprimento

de onda do pico de absorbância máxima para cada um dos solventes. É possível observar que,

à medida que a polaridade relativa diminui, ocorre um deslocamento do pico de absorbância

máxima para menores comprimentos de onda e que estes valores se mantêm os mesmos para

aqueles solventes que apresentam polaridades muito próximas. Este deslocamento

hipsocrômico ou deslocamento para o azul ocorre devido às diferenças do solvente. Se os

espectros de MI e ME não tivessem espalhado, esperava-se um deslocamento hipsocrômico

também para a NFD nas MIs e MEs e logo, poderíamos ter uma ideia em que escala de

polaridade dentre os solventes estudados estes sistemas se encontravam.

Tabela 15 - Polaridade relativa e valores do comprimento de onda do pico de absorbância máxima de cada um

solventes.

Solventes Polaridade Relativa* λ (nm)

Água 1,000 340

Etanol 0,654 329

Isopropanol 0,546 329

Clorofórmio 0,259 321

Acetato de Etila 0,228 321 * Extraída de Reichardt (2003) [102].

74

Na determinação do coeficiente de partição, a Tabela 16 mostra os valores do

coeficiente de partição (log P) da NFD em triplicata, que em média corresponde a 4,263 ±

0,024. Este valor indica que a concentração do fármaco em octanol é cerca de 18000 vezes

maior que em água, o que garante que a NFD é muito mais solúvel em solvente orgânico que

mimetiza a fase oleosa e reforça mais ainda a ideia de "preferência" desse fármaco pela fase

hidrofóbica.

Tabela 16 - Valores do coeficiente de partição da NFD em octanol/água realizados em triplicata.

Amostras log P

1 4,235

2 4,274

3 4,280

MÉDIA ± DP 4,263 ± 0,024

Todos estes resultados reforçam a ideia de que o fármaco provavelmente se encontra

na fase interna das MEs (fase oleosa) e o mesmo não ocorre com as MIs como já previsto

anteriormente, mas não a comprovam como esperado, e portanto novos estudos deverão ser

realizados.

Visando obter informações estruturais quantitativas e avaliar o grau de interação do

fármaco nas MIs e MEs, novas medidas de SAXS foram realizadas para os sistemas

compostos por MI e ME com e sem NFD incorporada e as curvas analisadas mediante o

ajuste por modelos adequados. Para isto, foram selecionadas duas amostras com maior

quantidade de água na sua composição (MI1 e ME1 ambas com 90% de fase aquosa) e

mantidas sob repouso durante 6 meses para garantir a presença dos agregados mais estáveis

no meio. Estes procedimentos foram efetuados para minimizar os efeitos de interferência

causados pela interação entre as partículas espalhadoras e com isto diminuir a contribuição a

baixos valores de q, como visualizado anteriormente (Figura 19 a 22).

A Figura 26 mostra as curvas de SAXS com os melhores ajustes obtidos utilizando a

metodologia descrita anteriormente. Podemos observar que o ajuste do modelo está de acordo

com os dados experimentais principalmente para valores de q < 0,20 Å. Nesse estudo, foi

possível obter que a MI em ausência de NFD, tem as dimensões internas de: 16,39 Å, 16,39 Å

e 40,37 Å indicando uma forma de elipsoide prolato além da presença de uma camada polar

cujo comprimento é de 19,75 Å. É interessante mencionar que, em presença de NFD, esses

valores são levemente alterados para 17,43 Å, 17,43 Å e 41,67 Å, para as dimensões internas

e a cabeça polar diminui levemente para cerca de 18,37 Å. Essas informações indicam que o

75

fármaco altera de forma apenas marginal a estrutura da MI. Esse fato corrobora com dados

anteriores de que o fármaco interage pouco com a MI.

Figura 26 - Curvas de SAXS dos sistemas composto por MIs (A e C) e MEs (B e D) eu ausência (A e B) e

presença (C e D) de NFD. As linhas cheias indicam os melhores ajustes obtidos com o modelo descrito

anteriormente.

Considerando as MEs, foi obtido um resultado ligeiramente diverso. Nesse caso, em

ausência de fármaco, a estrutura pode ser analisada também como uma elipsoide prolato de

dimensões 14,79 Å, 14,79 Å e 33,97 Å, enquanto que a parte polar obtida dentro deste

modelo foi de 22,34 Å. Em presença de fármaco, ocorre uma maior alteração da estrutura das

MEs, passando para cerca de 19,79 Å, 19,79 Å e 43,93 Å e além disso, a espessura da cabeça

polar diminui para 19,54 Å. Todos os parâmetros de ajuste estão descritos na Tabela 17.

É importante perceber a diferença significante obtida em cada um dos sistemas

estudados. Obteve-se que as MEs são menores que as MIs em ausência do fármaco, ou seja,

para uma mesma concentração de tensoativo existe um maior número de MEs formados do

que de MIs. Este fato é muito importante pois está diretamente relacionado a concentração de

cada uma das espécies em solução. A concentração de MIs e MEs em solução é 4.9x10-4

e

6.5x10-4

mol/L, respectivamente (Tabela 17).

76

Tabela 17 - Parâmetros de ajuste das curvas de SAXS dos sistemas compostos por MIs e MEs em ausência e

presença de NFD.

Parâmetros Micelas Microemulsões

Sem NFD Com NFD Sem NFD Com NFD

Tween 80 (mM) 65.40 65.40 65.40 65.40

Óleo - D-Limoneno (mM) 0.00 123.00 0.00 123.00

Semi-eixo A (Å) 16.39 17.43 14.79 19.37

Semi-eixo B (Å) 16.39 17.43 14.79 19.37

Semi-eixo C (Å) 40.37 41.67 33.98 43.92

Espessura da Cabeça Polar (Å) 19.75 18.37 22.34 19.54

Dens. eletrônica apolar (e/Å3) 0.28 0.28 0.28 0.28

Dens. eletrônica polar (e/Å3) 0.37 0.37 0.36 0.37

Raio Esfera-dura (Å) 44.44 46.32 39.32 41.84

Número de agregação

tensoativo/MI 132.62 145.41 100.90 170.07

Concentração (mol/L) 4.9E-04 4.5E-04 6.5E-04 3.9E-04

Considerando a presença da NFD, podemos perceber um efeito interessante nos

sistemas estudados. A NFD pouco altera a MI, mantendo seus parâmetros estruturais

praticamente inalterados. Já para as MEs, a presença do fármaco induz um aumento

significativo do raio parafínico (parte interna da estrutura) de cerca de 30%, passando de

14,79 para 19,37 Å.

Em ambas as estruturas estudadas, ficou evidenciado que a NFD não altera de forma

significativa a espessura da cabeça polar. Este fato sugere fortemente que o fármaco deve se

localizar dentro (integralmente ou parcialmente) da interface apolar, de modo que a região

polar não sofre alterações muito significativas.

De posse dessas informações, é possível propor um modelo para a interação do

fármaco em cada uma das estruturas estudadas. A figura abaixo mostra uma esquematização,

em escala, de todos os sistemas estudados em ausência (Figura 27 (A) e (B)) e presença de

NFD (Figura 27 (C) e (D)). É perceptível pelas Figuras 27 (B) e (D) que existe um grande

aumento da região apolar nessa esquematização representados pelo inchaço no elipsoide

menor (região apolar) e pouca alteração na região externa (polar).

77

Figura 27 - Representação esquemática em escala das MIs (A e C) e das MEs (B e D) em ausência (A e B) e

presença (C e D) de NFD. Os elipsoides internos representam as regiões apolares, enquanto que os externos

representam as regiões polares.

5.4 ESTUDO DE INTERAÇÃO ENTRE AS MICELAS E AS MICROEMULSÕES EM

MODELO DE ESTRATO CÓRNEO POR FTIR

O FTIR é considerado uma poderosa ferramenta para a determinação das vibrações

moleculares de materiais em modelo de EC no nível do grupo funcional. Devido à

composição complexa do EC, incluindo lipídios, proteínas, minerais e aminoácidos, muitas

bandas de absorção do FTIR aparecem no espectro obtido do EC. Todavia, numerosas bases

de dados já têm sido estabelecidas para se determinar a origem de cada vibração. Além disso,

a utilização desta técnica assegura que as vibrações obtidas experimentalmente reflitam

diretamente as características do EC. Usando FTIR com ATR pode ser possível observar a

organização dos lipídios na superfície e em regiões mais profundas do EC [103].

Em um espectro de FTIR, as cadeias de hidrocarbonetos dos lipídios apresentam

vibrações assimétricas e simétricas de CH2 em aproximadamente 2920 e 2850 cm-1

,

respectivamente [97, 103, 104, 105]. A intensidade de um pico (altura e área) é proporcional à

quantidade de lipídios presentes no EC. Com isso, qualquer extração dos lipídios por uma MI

ou ME, por exemplo, resulta na diminuição da altura e/ou da área do pico. No entanto, pode

ocorrer também a fluidificação dos lipídios do EC por algumas MIs ou MEs, a qual pode ser

78

decorrente da mudança dos picos do estiramento CH2 a um menor ou maior número de onda

[97, 105, 106].

Os espectros de FTIR do EC tratados com água destilada (controle) e com as

formulações dos sistemas micelares e microemulsionados em estudo são apresentados na

Figura 28. Na região em que vibrações assimétricas de CH2 ocorrem (≈ 2920 cm-1

), os

espectros de FTIR tratados tanto com as MIs quanto com as MEs apresentaram um nítido

deslocamento do pico do lipídio para um menor número de onda em relação ao espectro sem

tratamento (controle). Este resultado sugere que possivelmente ocorreu uma fluidificação dos

lipídios do EC pelas MIs e MEs. Entretanto, na região em que ocorrem vibrações simétricas

de CH2 (≈ 2850 cm-1

), não foi possível observar deslocamento dos picos para números de

onda menores ou maiores, mas os espectros de FTIR do EC tratados com as MIs e as MEs

apresentaram uma ligeira diminuição da área do pico do lipídio em relação ao espectro sem

tratamento (controle). Logo, nesta região, sugere-se que as MIs e as MEs extraíram os lipídios

do EC, mas não as fluidizaram.

Tanto a fluidificação quanto a extração dos lipídios do EC pelas MIs e MEs mostram o

potencial destes sistemas como promotores de permeação à medida que minimizam a função

barreira estabelecida pela pele quando ocorre a entrada de qualquer substância. Neste caso,

estes sistemas mostram ser capazes de promover a entrada de fármacos na pele ao interagir

bem com o modelo de EC.

79

Figura 28 - Espectros de FTIR da região de interesse do EC tratados com: (a) água destilada (controle) e

formulações de MIs em estudo; (b) água destilada (controle) e formulações de MEs.

Apesar do espectro de FTIR ser uma poderosa ferramenta para estudar a interação

destes sistemas com o EC, as variações estruturais são muitas vezes sutis entre uma amostra e

outra o que dificulta a análise. A segunda derivada do espectro ou espectrofotometria de

segunda derivada é um tratamento matemático que aumenta a separação de picos sobrepostos,

apresentando certas vantagens que levam a visualização e identificação mais específica dos

picos não tão bem resolvidos ou com diferenças muito pequenas [107]. A Figura 29 mostra os

espectros de segunda derivada do EC tratados com água destilada (controle) e com os

sistemas micelares e microemulsionados estudados. É possível visualizar com maior clareza

(a)

a

(b)

3000 2980 2960 2940 2920 2900 2880 2860 2840 2820 2800

10

15

20

25

30

35

40

45

50

MI5MI4MI3MI1

MI2T

ransm

itân

cia

(%)

Número de Onda (cm-1

)

Controle

3000 2980 2960 2940 2920 2900 2880 2860 2840 2820 2800

15

20

25

30

35

40

45

50

Tra

nsm

itân

cia

(%)

Número de Onda (cm-1)

Controle

ME2

ME1

ME3

ME4

ME5

80

as diferenças dos espectros de FTIR do EC tratados com as MIs e as MEs em relação ao

espectro de FTIR do EC sem tratamento (controle). Com isso, pode-se sugerir que realmente

houve uma interação, tanto das MIs quanto das MEs com o modelo de EC, confirmando o que

foi dito anteriormente.

Figura 29 - Espectros de segunda derivada do EC tratados com: (a) água destilada (controle) e formulações de

MIs em estudo; (b) água destilada (controle) e formulações de MEs.

(a)

a

(b)

3000 2980 2960 2940 2920 2900 2880 2860 2840 2820 2800

MI3

MI1

Controle

MI2

MI4


)

MI5

2ª

Der

ivad

a da

Tra

nsm

itân

cia

3000 2980 2960 2940 2920 2900 2880 2860 2840 2820 2800

ME3

ME1

ME2

Controle

ME4

2ª

Der

ivad

a da

Tra

nsm

itân

cia


)

ME5

81

6 CONCLUSÕES

O emprego dos diagramas de fases ternário e pseudoternário se mostrou um simples e

bem sucedido método que possibilitou a obtenção e escolha das formulações de MIs e MEs

para caracterização físico-química e incorporação do fármaco. Por meio dos diagramas, foi

também possível determinar e identificar as várias regiões obtidas, tais como MIs, MEs,

emulsões e separação de fase em função das quantidades dos componentes.

A caracterização físico-química das MIs e MEs selecionadas por medidas de MLP,

pH, condutividade e tamanho das gotículas por DLS mostraram que estes sistemas são

estáveis, isotrópicos e translúcidos com IPD menor que 0,5. Quanto à microestrutura, ficou

comprovada que as MIs são do tipo direta e as MEs do tipo O/A, estando de acordo com o

esperado. Quanto ao tamanho médio de gotículas, as MIs (2 a 7 nm) se mostraram menores do

que as MEs (6 a 10 nm), corroborando assim com os dados da literatura. Além disso, a

presença do fármaco modelo nos sistemas micelares e microemulsionados selecionados não

alterou as suas características, mantendo a estabilidade termodinâmica dos sistemas.

As medidas de tamanho obtidas por DLS e por SAXS demonstraram a influência das

fases nas MIs e MEs, em que o tamanho das gotículas diminui com o aumento da quantidade

de tensoativo e mistura de tensoativo/cotensoativo. A influência do cotensoativo nas MIs foi

praticamente desprezível provavelmente devido a sua quantidade ser muito pequena em

relação a do tensoativo. Nas MEs, o aumento da quantidade de fase oleosa ocasionou um

aumento do tamanho das gotículas, confirmando que a fase interna é oleosa.

A presença da NFD não alterou o tamanho de gotículas das MIs, mas aumentou o

tamanho das MEs, o que sugere que a NFD esteja na fase interna da ME favorecendo um

aumento no tamanho de gotículas ao interagir com a fase oleosa. Já para as MIs, a ausência de

uma fase oleosa consequentemente não permite a interação com fármacos lipofílicos tais

como a NFD.

Os resultados de tensão superficial das MIs e MEs complementaram o estudo de

caracterização físico-química desses sistemas, mostrando que eles apresentaram tensões

superficiais suficientemente baixas e que diminuem com o aumento da quantidade de

tensoativo no sistema.

O modelamento das curvas de SAXS para as MIs e MEs mais diluídas mostra que as

MIs apresentaram poucas alterações com a presença do fármaco, sugerindo que a NFD não

interage nestes sistemas. Para as MEs, a interação com a NFD é alta e houve um considerável

aumento de tamanho da ME, principalmente do raio parafínico (parte interna da estrutura). Além

82

disso, em ambos os sistemas estudados, ficou evidenciado que a NFD não altera de forma

significativa a espessura da cabeça polar, o que sugere fortemente que o fármaco deve se

localizar dentro (integralmente ou parcialmente) da interface apolar.

Os estudos complementares buscaram comprovar e entender melhor a localização da

NFD nas MIs e nas MEs. Todavia, os seus resultados reforçam a ideia de que o fármaco

provavelmente se encontra na fase interna das MEs e o mesmo não ocorre com as MIs como

já previsto anteriormente, mas não a comprovam como esperado.

As medidas de FTIR do estrato córneo (EC) tratados com MIs e MEs demostraram

que é possível a utilização desses sistemas como promotores de permeação, a partir das

interações observadas com o modelo de EC.

Dessa forma, tanto os sistemas micelares quanto os microemulsionados apresentaram

estabilidade e capacidade de agirem como promotores de permeação. Entretanto, apenas as

MEs são potenciais sistemas de liberação e administração transdérmica da NFD in vitro, em

decorrência de sua capacidade de solubilização e incorporação deste fármaco na fase interna.

83

7 PERSPECTIVAS FUTURAS

- Estudo do efeito das influências das fases sobre as propriedades reológicas das MIs e

MEs;

- Estudo quantitativo por SAXS de MIs e MEs com fase aquosa acima de 90%;

- Medidas de DSC para o estudo das interações existentes entre as MIs e entre as MEs

em modelo de EC;

- Ensaios in vitro de permeação cutânea.

84

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