universidade federal de goiÁs programa de pÓs...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DAS
RELAÇÕES PARASITO-HOSPEDEIRO
MURIEL VILELA TEODORO SILVA
Avaliação do efeito da expressão do gene da interleucina 32 (IL-32)
humana em modelo murino de infecção por Leishmania
(Leishmania) amazonensis
Goiânia
2016
ii
iii
MURIEL VILELA TEODORO SILVA
Avaliação do efeito da expressão do gene da interleucina 32 (IL-32)
humana em modelo murino de infecção por Leishmania
(Leishmania) amazonensis
Dissertação de Mestrado apresentado ao
Programa de Pós-Graduação em Biologia
das Relações Parasito-Hospedeiro da
Universidade Federal de Goiás para
obtenção do Título de Mestre.
Orientadora: Dra. Fátima Ribeiro Dias
Co-orientador: Rodrigo Saar Gomes
Goiânia
2016
iv
v
Programa de Pós-Graduação em Biologia das Relações Parasito-Hospedeiro da Universidade
Federal de Goiás
vi
AGRADECIMENTOS
Em todos os momentos da nossa vida somos cercados por pessoas as quais nos acolhe, ensina,
aprende, cuida, cria laços, aconselham, compadece, respeita e divide experiências.
Dessa forma, neste momento tão especial que é a conclusão do mestrado gostaria de agradecer
primeiramente a Deus, meus pais e avós que me aconselharam, cuidaram e me guiaram em todos os
momentos que precisei. Gostaria de agradecer também ao Edson Filho, uma pessoa especial que acima
de tudo tornou um grande amigo e um verdadeiro companheiro.
Quero agradecer também a todos do Laboratório de Imunidade Inata do Instituto de Patologia Tropical
e Saúde Pública (Lab.321), em especial Prof Miriam, Arissa, Lucas, Jéssica, Larissa , Iara e Natália,
que com amizade, respeito e cuidado que me ajudaram a tornar esse trabalho possível.
De forma semelhante, esse trabalho não teria concretizado se não tivesse o apoio, a dedicação e os
ensinamentos, da minha orientadora Prof Dra. Fátima Ribeiro Dias que com dedicação me acolheu
desde o primeiro momento, apresentou as técnicas, orientou os paços, cuidou dos resultados, corrigiu
os trabalhos, e esteve disponível em todos os momentos de apelo. Agradeço imensamente ao meu co-
orientador Prof. Dr°. Rodrigo Saar Gomes, que esteve comigo praticamente em todos os experimentos,
conduziu estratégias melhores para alcançarmos os resultados, orientou, corrigiu, dividiu
ensinamentos e experiências. Agradeço também todo os professores do PPGBRHP do IPTSP pelos
ensinamentos à mim prestado, a equipe de profissionais do instituto e as agencias de fomento
CAPS/CNPQ e FAPEG.
Dessa forma, os resultados e aprendizados que construir até aqui só foram possíveis graças à
existência de todos vocês, meu muito obrigado!
vii
SUMÁRIO
FIGURAS .............................................................................................................................................. vii
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ...................................................................................... viii
RESUMO ................................................................................................................................................ x
ABSTRACT ........................................................................................................................................... xi
1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................... 12
1.1. Definições, epidemiologia e transmissão da Leishmaniose Tegumentar Americana .................... 12
1.2. Resposta imunológica em modelos murinos de Leishmaniose Tegumentar Americana ............... 15
1.3..Irterleucina - 32 Definição e propriedades gerais .......................................................................... 21
1.4. A IL-32 em doenças crônicas e infecciosas e na Leishmaniose Tegumentar Americana .............. 23
1.5 A IL-32 humana em camundongos ................................................................................................. 27
2. JUSTIFICATIVA .............................................................................................................................. 30
3 OBJETIVOS ...................................................................................................................................... 31
3.1. Objetivo Geral ................................................................................................................................ 31
3.2. Objetivos Específicos ..................................................................................................................... 31
4 MÉTODOS ........................................................................................................................................ 32
4.1. Animais e considerações éticas ................................................................................................. 32
4.2. Cultura de parasitos ................................................................................................................... 32
4.3. Infecção dos camundongos ............................................................................................................ 33
4.4. Acompanhamento da lesão ............................................................................................................. 33
4.5. Quantificação dos Parasitos por Diluição Limitante ...................................................................... 33
4.6. Preparo de antígeno de Leishmania........................................................................................... 35
4.7. Estimulação de células dos linfonodos drenantes ..................................................................... 35
4.8. Ensaio Imunoenzimático (ELISA) ............................................................................................ 36
4.9. Análises histopatológicas .......................................................................................................... 37
4.10. Imunoistoquímica para detecção de IL-32 ............................................................................ 38
4.11. Avaliação da atividade leishmanicida de macrófagos derivados da medula óssea ............... 39
4.12. Análises estatísticas ............................................................................................................... 40
5 RESULTADOS .................................................................................................................................. 41
5.1. Expressão da IL-32 em camundongos transgênicos para IL-32γ humana. .................................... 41
5.2. Curso da infecção por Leishmania (L.) amazonensis e carga parasitária nas lesões de
camundongos que expressam ou não IL-32 humana. .......................................................................... 42
5.3. Carga parasitária no linfonodo drenante e no baço de camundongos que expressam ou não IL-
32 humana infectados com Leishmania (L.) amazonensis. ................................................................. 44
5.4. Análise histopatológica das lesões causadas por Leishmania (L.) amazonensis em
camundongos que expressam ou não IL-32 humana. .......................................................................... 45
viii
5.5. Produção de citocinas nos linfonodos drenantes das lesões dos camundongos que expressam ou
não IL-32 humana após infecção com Leishmania (L.) amazonensis. ................................................ 50
5.6. Avaliação do papel da IL-32 na fagocitose de L. (L.) amazonensis e na atividade leishmanicida
de macrófagos murinos derivados da medula óssea. ............................................................................. 52
6. DISCUSSÃO ..................................................................................................................................... 54
7 CONCLUSÕES .................................................................................................................................. 65
8.REFERÊNCIAS..................... ...................................................................................................66
ix
FIGURAS
Figura 1 Produção de IL-32 em tecidos de camundongos transgênicos para a IL-32
humana.................................................................................................................................42
Figura 2 Curso temporal da lesão desencadeada por Leishmania (L.) amazonensis e
carga parasitária nas lesões da orelha de camundongos transgênico ou não para a IL-32
humana (IL-32γTg)..............................................................................................................43
Figura 3 Carga parasitária no linfonodo e baço de camundongos selvagens ou IL-32γTg
após infecção com Leishmania (L.)
amazonensis............................................................................................................................44
Figura 4 Análise histopatológica de orelhas de camundongos que expressão ou não a IL-
32γ humana infectadas com Leishmania (L.) amazonensis....................................................46
Figura 5 Análise histopatológica de orelhas de camundongos que expressão ou não a IL-
32γ humana, infectadas com Leishmania (L.) amazonensis....................................................47
Figura 6 Imunoistoquímica para IL-32γ em cortes histológicos das orelhas dos
camundongos IL-32γTg, após infecção com Leishmania (L.) amazonensis.............................49
Figura 7:Número de células nos linfonodos drenantes de camundongos que expressão ou não
a IL-32 γ humana, não infectados ou com 3,6 e 9, semanas de infecção por Leishmania (L.)
amazonensis..............................................................................................................................50
Figura 8 Produção de citocinas por células dos linfonodos drenantes das lesões de
camundongos, que expressão ou não a IL-32 γ humana, infectados com Leishmania (L.)
amazonensis..............................................................................................................................51
Figura 9:Avaliação dos efeitos da IL-32 na fagocitose e capacidade leishmanicida de
macrófagos derivados da medula óssea de camundongos selvagens e IL-32 γ Tg, infectados
com Leishmania (L.) amazonensis............................................................................................53
x
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
cDNA: DNA complementar
CO2: Dióxido de Carbono
ConA :Conavalina A
DMSO : Dimetilsulfóxido de sódio
DNA : Ácido desoxirribonucleico
EDTA : Ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA: Ensaioimunoenzimático
INFᵞ: Interferon Gama
HIV: Vírus da imunodeficiência humana
H1N1: Vírus causador da influenza A
HBV: Vírus da Hepative B
HCMV: Citomegalovírus humano
HDT: Hospital de Doenças Tropicais
HPV: Papiloma vírus humano
IL: Interleucina
IL-1,4,10:Interleucina 1,4,6,8 10
IHQ: Imunoistoquímica
iNos: Óxido Nítrico Sintase Induzida
IPTSP: Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
Tg IL-32γ: Camundongo transgênico para IL-32ᵞ humana
LN: Linfonodo
LPG: Lipofosfoglicano
LPS: Lipopolissacarideo
LTA: Leishmaniose tegumentar americana
mRNA: RNA mensageiro
NF- κB: Fator nuclear kappa B
ND: Não detectado
NO: Óxido Nítrico
PBS: Solução salina fosfato
PCR: Reação de cadeia em polimerase
xi
PMBC : Célula Mononuclear do Sangue Periférico
rIFN: Interferon gama recombinante
ROS: Espécies reativas de oxigênio
SFB: Soro Feral Bovino
t.a: Temperatura ambiente
TBS: Solução de salina tamponada com Tris
Th: Linfócito T auxiliar
TNF: Fator de Necrose Tumoral
WT: Camundongo Selvagem
xii
RESUMO
A IL-32 é uma citocina pró-inflamatória que apresenta diferentes isoformas. A isoforma IL-
32γ é a mais potente e foi detectada em lesões de pacientes com leishmaniose tegumentar
americana. Células murinas respondem à IL-32, no entanto, camundongos não têm o gene
para essa citocina. Para entender o papel da IL-32 na infecção por Leishmania (Leishmania)
amazonensis, foram utilizados camundongos transgênicos para a IL-32γ humana (IL-32γTg).
Camundongos C57BL/6 (WT) e C57BL/6 IL-32γTg foram infectados com formas
promastigotas de L. amazonensis na orelha. O desenvolvimento da lesão foi acompanhado
semanalmente com paquímetro digital (medida em mm de lesão). Após 3, 6 e 9 semanas, os
animais foram eutanasiados para análise de parasitismo tecidual, pela técnica de diluição
limitante, nas orelhas infectadas, no linfonodo drenante e no baço dos camundongos. As
células do linfonodo drenante foram incubadas (48 h), na presença ou ausência de antígeno de
L. amazonensis (Ag), para análise de citocinas pela técnica de ELISA. Camundongos IL-
32γTg apresentam produção de IL-32 no baço, fígado, linfonodo e orelha. Camundongos IL-
32γTg apresentam uma lesão menor do que a lesão dos camundongos WT, na terceira semana
de infecção. Da 5ª até a 9a semana de infecção, os dois grupos apresentaram perfis
semelhantes de desenvolvimento da lesão. Curiosamente, na 3ª semana de infecção, a carga
parasitária na lesão do camundongo IL-32γTg era 100 vezes maior do que a dos camundongos
WT. Após três semanas, os camundongos IL-32γTg mantiveram a mesma carga parasitária
até nove semanas. Em camundongos WT, no entanto, o número de parasitos aumentou
exponencialmente durante as semanas avaliadas. A carga parasitária do linfonodo e no baço
foi menor nos camundongos IL-32γTg, quando comparado com camundongos WT. Não foi
observada diferença nos perfis histológicos das lesões nos camundongos WT e IL-32γTg
infectados por L. amazonensis. Não foi observada nenhuma diferença entre os grupos WT e
IL-32γTg em relação à produção de citocinas (IFNγ, TNFα e IL-10), pelas células dos
linfonodos estimuladas com Ag, na 3a, 6
a e 9
a semana de infecção. Os nossos dados sugerem
que a IL-32γ favorece a infecção por L. amazonensis nas fases iniciais, permitindo o
crescimento do parasito; no entanto, essa citocina parece limitar o crescimento e a
disseminação dos parasitos nas fases mais tardias da infecção. As análises in vitro mostraram
porcentagem de células infectadas e número de parasitas por célula infectada semelhantes nos
macrófagos dos WT e IL-32γTg com 3 e 48h de infecção por L. amazonensis. Entretanto, a
produção de NO por macrófagos parece ser menor nas células de camundongos IL-32γTg
durante a infecção por L. amazonensis. Compreender os mecanismos pelos quais a IL-32γ
modula a infecção por L. amazonensis nos camundongos é fundamental para a definição dos
componentes que controlam a leishmaniose tegumentar causada por esta espécie em seres
humanos.
xiii
ABSTRACT
IL-32 is a proinflammatory cytokine which has different isoforms. IL-32γ isoform is the most
powerful and was detected in lesions of patients with cutaneous leishmaniasis. Murine cells
respond to IL-32, however mice lack the gene for this cytokine. To understand the role of IL-
32 in Leishmania (L.) amazonensis, we used transgenic mice for human IL-32γ (IL-32γTg).
C57BL/6 mice (WT) and C57BL/6 IL-32γTg were infected with L. amazonensis
promastigotes in the ear. The lesion development was followed weekly with a digital caliper
(measured in mm of injury). After 3, 6 and 9 weeks, the animals were euthanized for tissue
parasitism analysis by the limiting dilution technique, in infected ears, draining lymph node
and spleen of mice. The draining lymph node cells were incubated (48 h) in the presence or
absence of L. amazonensis antigen (Ag) for analysis of cytokines by ELISA. IL-32γTg mice
present IL-32 production in spleen, liver, lymph node and ear. IL-32γTg mice have a lower
injury than the WT mice during the third week of infection. From the 5th to the 9th week of
infection, the two groups had similar lesion development profiles. Interestingly, in the 3rd
week of infection, the parasitic load in the lesion of IL-32γTg mice was 100 times greater than
that of WT mice. After three weeks, IL-32γTg mice maintained the same parasitic load up to
nine weeks. In WT mice, however, the number of parasites increased exponentially during
weeks evaluated. The parasite load in the spleen and lymph node was lower in IL-32γTg mice
when compared with WT mice. There was no difference in histological sections of the lesions
in WT and IL-32γTg mice infected with L. amazonensis. We did not observe differences
between WT and IL-32γTg groups on the production of cytokines (IFN, TNF and IL-10) by
lymph node cells stimulated with Ag, in the 3rd, 6th and 9th week of infection. Our data
suggest that IL-32γ favors infection by L. amazonensis in the early stages, allowing the
growth of the parasites. However, this cytokine seems to limit the growth and spread of
parasites in the later stages of infection. In vitro analyzes show the similar percentage of
infected cells and the number of parasites per infected cell in WT macrophages and IL-32γTg
after 3 and 48h of infection with L. amazonensis. However, the production of NO by
macrophages seems to be lower in IL-32γTg mouse cells during infection with L.
amazonensis. Understanding the mechanisms by which IL-32γ modulates Leishmania
amazonensis infection in mice is essential to define the components that control cutaneous
leishmaniasis caused by this specie in humans.
14
1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA
1.1. Definições, epidemiologia e transmissão da Leishmaniose Tegumentar
Americana
As leishmanioses são um complexo de manifestações clínicas produzidas pela
infecção causada por diferentes espécies de protozoários digenéticos do gênero
Leishmania. A infecção pode levar ao desenvolvimento de lesões cutâneas crônicas que
acometem o sistema tegumentar, tanto a pele quanto as mucosas oral, nasal e faríngea,
dos portadores da doença chamada de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). Os
parasitos são transmitidos durante o repasto sanguíneo de fêmeas dos insetos vetores do
gênero Lutzomyia. As infecções ocorrem em animais silvestres, principalmente
roedores, sendo o homem um hospedeiro acidental. Nota-se que os ciclos de
transmissão da doença vêm se aproximando de áreas peridomiciliares e expandindo para
áreas não endêmicas (Desjeux et al. 2001; Gontijo & Carvalho 2003).
A LTA é um importante problema de saúde pública, sendo que cerca de 1,5
milhão de novos casos de leishmaniose cutânea ocorrem a cada ano (Tiuman et al.
2011). A Organização Mundial da Saúde (OMS, 2012) relata a ocorrência de
leishmanioses em 98 países, com notificação compulsória em apenas 32. Estima-se 12
milhões de pessoas acometidas pela doença ao longo do mundo, distribuídas nos
continentes Ásia, África, Europa e Américas. Aproximadamente 350 milhões de
indivíduos vivem em áreas de transmissão, estimando-se que ocorram dois milhões de
casos anuais, dos quais 1,3 milhão são de formas cutânea ou cutaneomucosa. Estima-se,
ainda, por volta de 20.000 mortes anuais ocasionadas pela LTA (Paladi et al. 2012;
Alvar et al, 2012; WHO, 2015). O Brasil e mais nove países são responsáveis por 70 a
75% dos casos de leishmaniose cutânea no mundo (Alvar et al. 2012).
15
A LTA sofreu uma expansão geográfica nos últimos 20 anos no Brasil, havendo
notificação de casos autóctones em todos os estados brasileiros a partir de 2003. As
regiões Norte e Centro-Oeste respondem, cada uma, por 36% dos casos de LTA, sendo
notificados cerca de 400 novos casos, por ano, no estado de Goiás (MS, 2012). O
hospital de referência de leishmanioses, Anuar Auad (Hospital de Doenças Tropicais,
HDT), localizado em Goiânia, capital do estado de Goiás, tem confirmado anualmente
cerca de 70 casos de LTA, sendo a maioria dos pacientes das regiões Norte e Centro-
Oeste. Entre os casos autóctones do Estado de Goiás atendidos no HDT, entre os anos
2000 e 2010, 60,8% são classificados como leishmaniose cutânea localizada (LCL),
33,7% como leishmaniose mucosa (LM), 4,2% como leishmaniose cutêaneomucosa
(LCM) e somente 1,3%, como leishmaniose cutânea disseminada (LD). Durante cerca
de 10 anos de pesquisa, nosso grupo detectou apenas dois casos de leishmaniose
cutânea difusa (LCD), causados por Leishmania (Leishmania) amazonensis. Em 80
amostras de lesões de pacientes com LTA, de diferentes municípios do Estado de Goiás,
identificamos que 92,5% foram positivas para a presença de Leishmania (Viannia) sp e
7,5% para Leishmania (L.) amazonensis (manuscrito em preparação).
No Brasil, existem sete espécies que causam a LTA, que, por sua vez, pertencem
a dois subgêneros: Viannia, representado pelas espécies L. (V.) braziliensis, L. (V.)
guyanensis, L. (V.) naiffi, L. (V) lainsoni, L. (V.) lindenberg, L. (V.) shawii; e
Leishmania, representado por L. (L.) amazonensis (Ashford 2000; Gontijo & Carvalho
2003; Antinori et al., 2011; Guerra et al. 2011).
As formas clínicas observadas nos pacientes com LTA são consequências da
relação parasito-hospedeiro, dependendo, portanto, de fatores intrínsecos dos parasitos e
da resposta imune do hospedeiro. A forma cutânea localizada (LCL) é a forma mais
prevalente da doença, apresentando lesão única, ou até 10 lesões, geralmente, com
16
aspecto ulcerativo, arredondado e bordas elevadas, que acometem a pele do hospedeiro.
Esta forma de LTA pode apresentar cura clínica espontaneamente. A LCL é causada por
todas as espécies de Leishmania presentes no Brasil. A forma cutaneomucosa (LCM) é
caracterizada por lesões mucosas agressivas que afetam a região nasofaríngea e a
mucosa oral. A LCM é causada, principalmente, por L. (V.) braziliensis e L. (V.)
guyanensis no Brasil. A forma cutânea disseminada (LD) é caracterizada pela
presença de múltiplas lesões, principalmente lesões pleomórficas acneiformes e
papulares, em várias áreas do corpo do hospedeiro. No Brasil, essa forma clínica é
associada principalmente a L. (V.) braziliensis. Já a forma cutânea difusa (LCD) é
caracterizada pela presença de várias lesões nodulares que, normalmente, não ulceram,
sendo associada às espécies L. (L.) mexicana e L. (L.) amazonensis nas Américas
(Silveira et al. 2009; Pereira et al. 2009a; Goto & Lindoso 2010; Scarisbrick et al.,
2006).
Durante o ciclo de vida de Leishmania, há variações morfológicas do parasito,
de acordo com o hospedeiro vertebrado ou invertebrado em que este se encontra. As
formas promastigotas, alongadas e com flagelo, são encontradas nos órgãos digestivos
dos insetos vetores e as formas amastigotas, arredondas e sem flagelo aparente,
parasitam o sistema fagócitico mononuclear do hospedeiro. A infecção do hospedeiro
vertebrado acontece após a picada da fêmea do inseto vetor infectada pelo parasito,
quando as formas promastigotas metacíclicas infectantes são inoculadas, juntamente
com a saliva dos insetos, durante o repasto sanguíneo. As formas promastigotas são,
então, capturadas por fagócitos, nos quais se diferenciam em formas amastigotas que se
multiplicam nos vacúolos parasitóforos (fagolisossomos) dos macrófagos, por divisão
binária. Os hospedeiros vertebrados de Leishmania sp incluem uma grande variedade de
mamíferos. Embora as infecções por esses parasitos sejam mais comuns nos roedores e
17
canídeos, elas ocorrem também em edentados, marsupiais, procionídeos, ungulados
primitivos, primatas e, entre estes, o homem (Gontijo & de Carvalho, 2013; McGwire &
Satoskar, 2014; Silva et al. 2012; Tiuman et al. 2011).
Há relatos de vários flebotomíneos relacionados com a transmissão das
leishmanioses tegumentares no Brasil. Os principais transmissores são L. (N.)
intermedia (Lutz & Neiva 1912), L. (Migonei) migonei; L. (N.) whitmani; L.
(Pintomyia) fischeri; L. (Psychodopygus) pessoai; L. (N.) umbratilis; L. (P.) wellcomei;
L. (Trichophoromyia); L. (P.) complexa; L. (P.) ayrozai; L. (P.) paraensis e L. (N.)
flaviscutellata Mangabeira, 1942, sendo esse último transmissor da Leishmania (L.)
amazonensis (Lutz e Neiva, 1912; Azevedo, 1990; Pinto 1926; Rangel e Lainson,
2003).
1.2. Resposta imunológica em modelos murinos de Leishmaniose Tegumentar
Americana.
Para elucidar a resposta imunológica associada à infecção por parasitos do
gênero Leishmania tem-se utilizado modelos experimentais murinos. A partir destes
estudos, foi possível demonstrar os fatores envolvidos na resposta imunológica do
hospedeiro, tanto os relacionados à resistência quanto àqueles envolvidos na
suscetibilidade à infecção. Dentre os modelos murinos clássicos de infecção, destacam-
se os que utilizam Leishmania major. Em camundongos da linhagem C57BL/6 foi
observada uma resposta imunológica Th1 (linfócitos T auxiliares do tipo 1),
caracterizada pela elevada produção de interferon gama (IFN), relacionada à
resistência a L. major. Os mecanismos microbicidas induzidos por IFN incluem
ativação de macrófagos, células dendríticas e células NK (natural killers). Por outro
18
lado, em camundongos BALB/c, foi observada uma resposta do tipo Th2 (linfócitos T
auxiliares do tipo 2), caracterizada, principalmente, pelo aumento da produção das
interleucinas IL-4, IL-13 e IL-10, as quais são relacionadas à suscetibilidade à infecção
por L. major (Heinzel et al. 1998; Jones, Buxbaum, Scott 2000; Bruxbaum & Scott
2005; Tripathi et al. 2007). As citocinas Th2 favorecem o crescimento do parasito e
também a suscetibilidade à doença, pela produção de enzimas como arginase, que
sintetiza L-ornitina, que pode ser usando pelo parasito para a proliferação. O
crescimento de amastigotas de Leishmania spp. é controlado pela inibição da arginase,
mostrando que essa enzima produzida durante uma resposta Th2 pode auxiliar no
sucesso da infecção por Leishmanias spp. (Iniesta, et al. 2001).
Nas infecções causadas por L. (L.) amazonensis, entretanto, as respostas
imunológicas do hospedeiro não são semelhantes às encontradas nos modelos clássicos
Th1/Th2 de camundongos infectados com L. major (Maioli et al. 2004; Felizardo et al.
2007). L. (L.) amazonensis induz uma lesão crônica, que não se cura espontaneamente,
em modelos experimentais murinos. Nos camundongos BALB/c infectados com L. (L.)
amazonensis, observou-se elevada produção de IL-4, que medeia a suscetibilidade à
doença nestes animais (Afonso & Scott 1993). Já em camundongos C57BL/6
infectados, observou-se um aumento na produção de IFN e de fator de necrose tumoral
alfa (TNF-α) no início da infecção (1 a 3 semanas), relacionado a um intenso
recrutamento de monócitos e ativação dos macrófagos. O parasito, no entanto, resiste à
morte mediada pelos macrófagos. Nota-se, ainda, uma diminuição na produção de
citocinas inflamatórias/imunoestimuladoras nos períodos mais tardios de infecção, por
volta de 11 a 12 semanas, o que justifica a cronicidade das lesões nos animais
infectados com L. (L.) amazonensis (Afonso & Scott 1993; Jones et al., 2002;
McMahon-Pratt & Alexander 2004; Pereira et al., 2009a; Parreia & Alves 2008;
19
Silveira et al., 2009; Ramer et al. 2006). Apesar de camundongos C57BL/6 serem
suscetíveis à infecção por L. (L.) amazonensis, não se observa uma resposta do tipo
Th2, demonstrado pelos níveis baixos de produção de IL-4 durante a infecção (Afonso
& Scott, 1993). Observa-se, portanto, que não há uma polarização Th1 ou Th2 eficiente
em infecções experimentais causadas por L. (L.) amazonensis (Afonso & Scott, 1993;
Jones, Buxbaum & Scott, 2000; Lemos, et al. 2000). A não polarização ou ausência de
uma resposta Th2, em camundongos C57BL/6, também não favorece o
desenvolvimento de uma resposta do tipo Th1 predominante. Isso resulta em uma
produção deficiente de IFN e, consequentemente, a não contenção do parasito
(Colmenares et al. 2003; Pinheiro et al. 2007).
A infecção de camundongos C57BL/6 geneticamente deficientes em IFNpor L.
(L.) amazonensis causa uma lesão nos primeiros dois meses de infecção similar à de
animais selvagens. Contudo, a ausência do IFN gera uma lesão maior do que a dos
animais selvagens (wild type, WT), com frequente ulceração, nos momentos mais
tardios da infecção. A ausência de IFN está relacionada com menor produção de
citocinas pro-inflamatórias, como IL-12 e TNF-α, e produção elevada de IL-4. Estes
resultados sugerem que o IFN seja crucial na tentativa de desenvolvimento de resposta
do tipo Th1 protetora nas fases finais da infecção (Oliveira et al, 2000; Santiago et al.
2006; Pinheiro & Rossi-Bergmann, 2007 Lombana-Gonzales, et al. 2008;).
Em infecções experimentais causadas por L. (L.) amazonensis observa-se, ainda,
uma produção significante de IL-10, possivelmente, estimulada pelo próprio parasito. A
IL-10 inibe a expressão de iNOS (óxido nítrico sintase induzida), resultando em um
microambiente favorável à proliferação do parasito (Gazzinelli et al. 1992; Balestieri et
al, 2002). De fato, Jones et al (2002) inocularam L. (L.) amazonensis na pata de
camundongos geneticamente deficientes em IL-10 e observaram um aumento na
20
produção de IL-12 e IFN bem como na expressão de iNOS nesses animais. Sabe-se
que o aumento de IL-10 nas infecções por L. (L.) amazonensis está associado à uma
elevada frequência de células T reguladoras (CD4+CD25+) (Treg). Camundongos
infectados com L. (L.) amazonensis apresentam porcentagem elevada de células Treg
produtoras de IL-10, suprimindo a proliferação de células T efetoras produtoras de IFN
e IL-2 (Ji et al. 2005). Acredita-se, portanto, que o desequilíbrio Treg/Th1 seja
determinante no curso da infecção por L. (L.) amazonensis.
Embora a imunidade adquirida tenha sido o principal alvo da resposta imune
durante as infecções murinas causadas por Leishmania sp, a imunidade inata é essencial
para o controle inicial da infecção e para a modulação da resposta imune adquirida; A
imunidade inata é responsável pela resposta imediata contra os parasitos. Um grande
número de promastigotas inoculadas são eliminadas pela imunidade inata do
hospedeiro, mas os parasitos que resistem conseguem propagar a infecção (DeKrey et
al. 1998; Dominguez et al. 2003; van Zandbergen et al. 2004). As formas promastigotas
do parasito Leishmania, ao atingirem o sangue do hospedeiro, podem se ligar a
anticorpos naturais, com isso, podendo ativar a via clássica do sistema complemento e
consequentemente a cascata lítica. A opsonofagocitose pode facilitar a invasão da
Leishmania no macrófago de uma forma mais rápida, podendo ser útil ao parasito como
mecanismo de escape (Dominguez et al. 2003).
Os macrófagos e as células dendríticas imaturas, exemplos de células residentes
da imunidade inata, são ativadas mediante a existência do parasito ou, também, por
moléculas destes. Após ativadas, essas células irão recrutar, inicialmente,
polimorfonucleares do sangue periférico, como neutrófilos, seguidos de células
mononucleares, incluindo monócitos, além de células natural killers (NK) e linfócitos,
21
com objetivo de controlar e eliminar a infecção (Bajenoff et al. 2006; Beil et al. 1992;
de Baey et al. 2001).
A partir do momento que macrófagos são ativados por IFNγ, eles expressam
uma quantidade elevada da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) e da NADPH
oxidase (Phox) (Bogdan et al. 2000; Colotti& Ilari 2010; Gordon 2003; Mukbel et al.
2007). A iNOS usa o aminoácido L-arginina para a produção de óxido nítrico, uma das
principais moléculas leishmanicidas conhecidas. Em macrófagos ativados, o superóxido
e NO são produzidos em quantidades semelhantes (Colotti& Ilari 2010; Gordon 2003;
Liese et al. 2008; Horta et al. 2012; Radi et al. 2001).
O parasito possui diversos mecanismos de escape à resposta imune, a fim de
estabelecer a infecção. A imunopatologia das infecções por L. (L.) amazonensis são alvo
de inúmeros estudos, em especial, aqueles focados na grande capacidade dessa espécie
de evadir à resposta imune do hospedeiro. Formas amastigotas de L. (L.) amazonensis
promovem o bloqueio da ativação de células Natural Killer (NK), resultando na redução
da produção de IFN por estas células e, consequentemente, na menor ativação de
macrófagos e células dendríticas (Aranha et al. 2005). A infecção por este parasito leva
à deficiência na produção de inúmeras citocinas e quimiocinas, principalmente nos
momentos iniciais da infecção. Ji & Soong (2003) detectaram, durante a infecção por L.
(L.) amazonensis, uma baixa expressão e produção de IL-12, IFN, IL-1β, MIP-
1CCL3, CCL5 e CCL4 em linfonodos e patas de camundongos C57BL/6. Observa-se,
ainda, falhas na apresentação de antígenos aos linfócitos T virgens, uma vez que o
parasito prejudica a total maturação de células dendríticas (Courret et al. 2003; Mukbel
et al. 2007; Figueiredo et al. 2012).
Evidências mostram, ainda, que L. (L.) amazonensis é capaz de inibir,
diretamente, a produção de NO pelos macrófagos, o que favorece a sobrevivência do
22
parasito no interior da célula hospedeira (Calegari-Silva et al. 2009; Balestieri et al.
2002; Almeida et al. 2012, Gomes et al. 2015). Essa inibição parece estar associada a
uma redução na atividade da iNOS e a uma expressão deficiente dessa enzima, de forma
dependente de NFem macrófagos infectados (Calegari-Silva e cols., 2009).
Além disso, tem sido demonstrado que L. (L.) amazonensis é capaz de resistir à
morte mediada tanto por NO quanto por superóxido induzidos por IFN/LPS, porque
esta via de ativação leva à fosforilação de ERK que inibe a produção de ânion
superóxido e NO (Mukbel et al. 2007). A redução na expressão de iNOS, e consequente
redução na produção de NO, é resultado de uma série de alterações nas funções dos
macrófagos causadas por L. (L.) amazonensis, tais como o aumento de IL-10 e TGF-β,
redução na produção de IL-12, inativação de JAK/STAT e ativação de fosfotirosina
fosfatases (Mukabel et al. 2007; Olivier et al. 2005).
A modulação da resposta inata pelo parasito, com baixa produção de IL-12 e
IFN culmina em uma resposta imune adquirida ineficaz no combate à infecção por L.
(L.) amazonensis. Além disto, a interferência do parasito nos mecanismos microbicidas,
tanto durante a resposta imune inata quanto adquirida, dificulta a eliminação deste. O
desfecho da LTA, com a eliminação ou permanência do parasito, danos teciduais e
prejuízo tegumentar no hospedeiro, é diretamente dependente da relação parasito-
hospedeiro, no qual o status da resposta imune do hospedeiro determina as formas
clínicas da doença. Os mecanismos que podem resultar tanto no controle como no
favorecimento da permanência do parasito no hospedeiro ainda não estão totalmente
esclarecidos, principalmente considerando as infecções por L. (L.) amazonensis. Além
disto, os fatores que desencadeiam e mantém os mecanismos imunopatogênicos também
não estão totalmente compreendidos na LTA. Faz-se necessário, assim, avaliar o papel
de componentes do sistema imune, ainda não avaliados, no processo de infecção por L.
23
(L.) amazonensis. Nesse contexto, nosso grupo propõe, de maneira inédita, investigar se
a citocina interleucina 32 (IL-32) influencia no curso da infecção murina.
1.3. Interleucina – 32: Definições e Propriedades Gerais
A IL-32 foi identificada, inicialmente, como um transcrito de células NK,
descrito como NK4, cuja função não era conhecida. Somente em 2005 foi renomeada
como IL-32 e associada a propriedades pró-inflamatórias (Kim et al. 2005).
Inicialmente foi demonstrado que a IL-32 era produzida por células NK, células
epiteliais, e linfócitos T, em especial quando recebiam estimulação pelas citocinas IL-12
e IL-18, IFN e mitógeno, respectivamente (Kim et al. 2005). A produção da IL-32, no
entanto, ocorre em vários tipos de células humanas, imunes ou não imunes, e ela
permanece predominantemente intracelular ou associada à membrana, atuando como
outras citocinas intracelulares, como IL-1β, IL-33 e IL-37 (Heinhuis et al. 2012; Kim et
al. 2005; Dinarello & Kim 2008). Inicialmente, foram descritas seis isoformas da IL-32
(α, β, γ, δ, ε e ζ) (Goda et al. 2006), contudo, posteriormente, foram identificadas mais
outras três isoformas (, totalizando, assim, nove isoformas de IL-32 relatadas até
o momento, sendo a IL-32 a isoforma mais ativa biologicamente (Kang, et al. 2013).
A IL-32 é capaz de induzir várias citocinas, em especial as citocinas pró-
inflamatórias. Foi demonstrado que a IL-32α e a IL-32β induzem produção de TNF-α,
IL-8, IL-6 e IL-1β em monócitos e macrófagos humanos, bem como em macrófagos
murinos. Embora não tenha sido encontrado um gene homólogo para IL-32 em
roedores, os resultados mostram que células murinas respondem à IL-32 humana
(Nakayama, 2013; Hong et al. 2010; Choi et al, 2009; Kim et al. 2005; Netea 2006). Foi
demonstrado que o silenciamento de IL-32 endógena em células humanas
24
mielomonocíticas THP-1 leva a uma queda na produção de TNF-α, IL-8 e IL-1β (Hong
et al. 2010). A IL-32 pode, ainda, induzir apoptose (Goda et al. 2006); a diferenciação
de monócitos humanos em macrófagos (Netea et al. 2006) ou em células dendrícias
(Shenck et al. 2012); e a maturação e ativação de células dendríticas imaturas,
promovendo a diferenciação de linfócitos Th0 em linfócitos Th1 ou Th17 (Jung et al.
2011), via produção de IL-12 e IL-6, respectivamente, controlando, assim, não apenas a
resposta imune inata, mas também a imunidade adquirida.
A via de sinalização da IL-32 inclui a ativação de p38 proteína quinase ativada
por mitógeno (MAPK) e os fatores de transcrição NFκB e ativador de proteína 1 (AP-1)
(Kim et al. 2005). Ainda não há relatos de um receptor para IL-32 (Novick et al. 2006).
Porém, pesquisadores conseguiram localizar uma serina protease em grânulos de
neutrófilos ou secretada, denominada de PR3 (proteinase 3), como um possível ligante
da IL-32. A PR3 é produzida por vários tipos de células e atua clivando a forma
associada à membrana da IL-32, gerando formas ativas dessa citocina. A ação
exarcebada da PR3, contudo, pode resultar na destruição da própria IL-32 (Novick et al.
2006; Dinarello & Kim 2008). A ligação de IL-32 em PR3 aciona um receptor ativado
por protease, o PAR2, que está ligado a duas vias de sinalização, a via Ras-Raf e a via
do TRIF, importantes para a indução de TNF- e IFN tipo I, respectivamente, em
macrófagos humanos (Nakayama et al. 2014).
O mRNA da IL-32 pode sofrer processamento alternativo, dando origem a
outras isoformas da citocina, que podem atuar de maneira diversa da IL-32 e
interagirem entre si, controlando suas funções. A IL-32β, por exemplo, tem uma
atividade inflamatória diminuída em relação à IL-32 e induz a produção da citocina
supressora IL-10, levando à diminuição da inflamação crônica, em alguns casos. A
interação da IL-32 com a IL-32no entanto, bloqueia a indução de IL-10 (Kang et al.
25
2013; Choi et al. 2009; Heinhuis et al. 2012; Kang et al. 2009). Além disto, em células
THP-1 expressando a isoforma IL-32ocorre inibição da produção de IL-1 (Kim et al.
2014) e em linhagens de células leucêmicas, o TNF é inibido pela IL-32im et al.
2015). Assim, a IL-32 pode atuar como um regulador intracelular do processo
inflamatório.
1.4. A IL-32 em doenças crônicas e infecciosas e na Leishmaniose Tegumentar
Americana.
A IL-32 foi primeiramente estudada em doenças inflamatórias crônicas. Essa
citocina é importante na imunopatogênese da artrite reumatóide (AR), uma doença
crônica onde observa-se uma correlação positiva entre a atividade da doença e o
aumento de citocinas como IL-1β, TNF-α, IL-18 e IL-32 na sinóvia de pacientes
(Joosten et al. 2006). A IL-32foi detectada em fibroblastos sinoviais de pacientes com
AR (Cagnard et al. 2005), especialmente quando ativados por TNF-α (Shoda et al.
2006). A IL-32 foi associada à elevada produção de TNF-α, o que contribui para a
exacerbação das lesões teciduais em pacientes e em modelo murino de artrite (Joosten et
al. 2006; Shoda et al. 2006; Dinarello & Kim 2006; Heinhuis et al. 2011). Portanto,
parece haver uma retroalimentação positiva entre TNF-α e IL-32 na AR. A IL-32
também participa de outras doenças inflamatórias, como na Colite e na doença de
Crohn, que atingem o intestino (Shoda et al. 2006; Shioya et al. 2007, Choi et al. 2010).
Por apresentar características pró-inflamatórias, a IL-32 poderia também
apresentar um importante papel na imunidade inata do hospedeiro frente a doenças
infecciosas, por modular a produção de TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 e quimiocinas pró-
inflamatórias C-X-C (Dinarello Kim et al. 2006; Kang et al., 2009). Netea et al. (2006)
26
demonstraram que Mycobacterium tuberculosis (MTB) e Mycobacterium bovis
induzem elevada produção de IL-32 (α e ) em monócitos humanos, dependente da
presença de IFN. A produção de IL-32 foi similar por monócitos e células dendríticas e
macrófagos derivados de monócitos. Em infecções in vitro causadas por M. tuberculosis
e M. avium, a IL-32 pode contribuir para o controle da infecção, reduzindo o
crescimento micobacteriano em macrófagos (Bai et al. 2010; Bai et al. 2011). Bai et al.
(2010) avaliaram os mecanismos de ação da IL-32 em macrófagos infectados com M.
tuberculosis, utilizando células da linhagem THP-1 com o gene da IL-32 silenciado. A
inibição de IL-32 resultou em diminuição da produção de TNF-α, IL-1β e IL-8 e
aumentou o número de M. tuberculosis, em comparação com células THP-1 controle.
Também observaram o menor número de células THP-1 infectadas com M. tuberculosis
em apoptose, após o silenciamento da expressão da IL-32, sugerindo, assim, que a IL-32
pode desempenhar um papel importante na defesa do hospedeiro frente à infecção por
M. tuberculosis, através da indução de apoptose nos macrófagos infectados. Montoya et
al. (2014) demostraram que a IL-32 exercia um possível papel como marcador de
proteção contra a turberculose, observado pelo mRNA de IL-32 aumentado em
pacientes com tuberculose latente e não com tuberculose ativa. A IL-32 tem capacidade
de indução de componentes da via microbicida da vitamina D, que resultou ao aumento
da produção de peptídeos antimicrobianos contribuindo para a atividade anti-MTB dos
macrófagos.
M. leprae também é capaz de induzir IL-32, que, por sua vez, parece estar
associada ao desenvolvimento de formas mais brandas da doença. Foi demonstrado que
a expressão mais elevada de IL-32 está associada à hanseníase na forma clínica limitada
ou tuberculóide (predominância do perfil Th1), e não à forma clínica progressiva ou
lepromatosa, de perfil Th2. Além disso, monócitos ativados pela via do NOD2, pelo
27
MDP bacteriano, induziram a produção da IL-32 que intervia na diferenciação de
monócitos para células dendríticas que apresentaram uma aumentada capacidade de
ativação de linfócitos T citotóxicos, resultando na defesa contra micobactéria (Schenk et
al. 2012; Schenk et al. 2016).
A participação da IL-32 no controle de infecções virais, tais como Influenza A e
o vírus da imunodeficiência humana (HIV), também tem sido investigada. Foi
observado que baixas concentrações (5-10 ng/mL) de IL-32 recombinante (rIL-32)
foram capazes de proteger a linhagem celular epitelial WISH da morte induzida por
vírus cDNAs e RNAs. O tratamento adicional de rIL-32 resultou em uma diminuição
drástica da carga viral em cerca de três a quatro vezes em comparação com as células
controle que não receberam rIL-32, além de proteção contra a morte de células
infectadas. Quando silenciaram a expressão da IL-32 em células WISH, observaram que
a eficácia das respostas antivirais desencadeadas pelos análogos sintéticos do vírus
ssRNA (poly U) e vírus dsRNA (poly-IC) foi reduzida. Os dados sugeriram, então, que
a IL-32 participa da resposta imune anti-vírus RNA ou DNA (Zepp et al. 2011). Em
infecções pelo vírus H1N1 foi demonstrado que a IL-32 tem a capacidade de induzir a
produção de transferrina nos macrófagos o que leva a uma inibição da replicação viral
(Bae et al. 2012). Além disso, foi relatado que células epiteliais infectadas pelo vírus
H1N1 produzem PGE e IL-32, sendo que a produção aumenta de PGE parece ser via
ativação da expressão de cicloxigenase tipo 2 (COX-2), o que estimula a produção de
IL-32 pelas células infectadas (Li et al. 2008).
Em infecções pelo vírus da hepatite B (HBV) foi demonstrado que este
microrganismo é capaz de induzir a expressão de IL-32 em PBMCs. Além disso foi
demonstrado que a produção de IFNque está correlacionada com a inibição da
replicação viral, é controlada pelos níveis de IL-32 (Yongkui et al., 2013). Tanto o
28
mRNA da IL-32 quanto a proteína são mais expressas em células de pacientes
infectados pelo citomegalovírus humano (HCMV) comparando com células de
indivíduos sadios. A IL-32 também é induzida em células do colo do útero pelo
papiloma vírus humano (HPV) e o aumento da expressão de IL-32 induz citocinas pró-
inflamatórias e o aumento da apoptose de células cancerígenas induzidas por HPV,
inibindo o desenvolvimento do câncer. O oncogene E7 presente no HPV desencadeia a
produção de COX-2/PGE2 e de IL-32. A IL-32, por sua vez, controla a expressão de E7
e COX2 em células do colo do útero, sugerindo que a IL-32 inibe o desenvolvimento do
câncer via regulação das expressões de E7 e COX-2 (Sojung et al., 2010).
Com base nos estudos acima descritos, observa-se, então, que a IL-32 pode ser
importante em infecções, especialmente onde o sítio de infecção pode ter influência do
epitélio, que produz IL-32 e outras citocinas, gerando uma alça de amplificação da
produção de citocinas/quimiocinas pelas células mononucleares inflamatórias que
infiltram o local da infecção e que também produzem IL-32. Recentemente, nosso grupo
demonstrou que lesões cutâneas e mucosas de pacientes com LTA causada por L.
Viannia sp. expressam IL-32, tanto em células epiteliais, quanto em células
mononucleares do infiltrado inflamatório. Além disto, formas amastigotas de L. (V.)
braziliensis induzem IL-32em células mononucleares do sangue periférico obtidas de
doadores sadios (Galdino Jr et al. 2014), sugerindo que a IL-32 pode ser produzida
rapidamente após a infecção e contribuir para a defesa do hospedeiro contra os
parasitos. Dados ainda não publicados também demonstram que em lesões cutâneas
causadas por L. (L.) amazonensis há uma elevada expressão de IL-32, em comparação
com tecidos de doadores sadios. Além disso, L. (L.) amazonensis é capaz de induzir IL-
32 em macrófagos humanos (dos Santos et al., manuscrito em preparação). Como a
IL-32 é pró-inflamatória, estando associada a perfil Th1 (Joosten, et al. 2005; Kim, et al.
29
2005; Netea, et al. 2005), e produção de TNF-α na LCM causada por L. (Viannia) sp
(Galdino Jr et al. 2014), essa citocina pode contribuir para a imunopatogênese da LTA.
Por outro lado, em infecções onde haja dificuldade na geração de um perfil Th1, a IL-32
poderia auxiliar neste desenvolvimento e levar ao controle da infecção, como é o caso
de lesões causadas por L. (L.) amazonensis.
1.5. A IL-32 humana em camundongos
Apesar da IL-32 não ter sido encontrada em camundongos, o mesmo pode
responder a rIL-32 humana, tornando, assim, possível avaliar o papel da IL-32 frente a
diversas doenças em modelos murinos. Shoda et al (2006) desenvolveram um modelo
experimental de artrite e de colite em camundongos quiméricos, transplantados com
células da medula óssea transfectadas com o gene da IL-32 humana. Seis a nove
semanas após o transplante, linfócitos T e B, macrófagos e DCs expressavam IL-32.
Estes camundongos apresentaram um aumento da concentração de TNF-α no soro e em
culturas de esplenócitos ativados com lipopolissacarídeo (LPS). Tanto a artrite quanto a
colite foram exacerbadas pela presença de IL-32 e a aumentada produção de TNF
(Shoda et al. 2006)
Camundongo transgênico para IL-32 foi gerado pelo grupo de Bai, et al.
(2015), no qual o gene da IL-32 é expresso em células epiteliais alveolares tipo II, sob
o controle do promotor da proteína surfactante C (SPC-IL-32Tg). Após infecção com
M. tuberculosis foi observado que os mesmos possuíam 85% menos carga bacteriana
nos pulmões (60 dias após a infecção), bem como apresentaram sobrevida aumentada,
comparado aos camundongos WT. Foi observado um aumento na população de
linfócitos T CD4+ e T CD8
+, macrófagos ativados e células dendríticas nos animais
30
SPC-IL-32Tg infectados, bem como um aumento na expressão de citocinas pró-
inflamatórias, como TNF-α e IFN. Os macrófagos dos camundongos SPC-IL-32Tg
infectados com M. tuberculosis também apresentaram uma diminuição da carga
bacteriana, sugerindo que a IL-32 proporciona um aumento da imunidade protetora do
hospedeiro frente a esta bactéria.
O grupo de Choi et al. (2010) desenvolveu um camundongo transgênico para IL-
32 humana com o promotor de -actina de galinha, para expressão ubíqua da IL-32.
Estes IL-32Tg foram utilizados na investigação do papel da IL-32 na inflamação
intestinal, em um modelo experimental de colite. Os animais IL-32Tg apresentaram
uma maior taxa de sobrevivência comparada aos animais WT. Camundongos IL-32Tg
apresentaram um aumento na inflamação aguda, porém, em fases mais tardias, esses
animais apresentaram uma menor inflamação no cólon, bem como uma diminuição da
perda tecidual ocasionada pela colite, relacionada a níveis reduzidos de TNF- e IL-6,
e níveis elevados de IL-10, possivelmente pelo aumento de splicing para a isoforma ,
indutora de IL-10. Os dados indicaram que a IL-32 pode ter um papel paradoxal em
inflamações intestinais, parecendo, também ser importante na proteção do tecido
intestinal (Choi, et al. 2010).
Bang et al (2014) utilizaram o mesmo camundongo IL-32Tg desenvolvido por
Choi et al. (2010) para avaliar o papel da IL-32 em um modelo de asma, que possui
perfil Th2. Foi observado que esses animais, na asma aguda, apresentam uma menor
inflamação eosinofílica das vias aéreas quando comparados com os camundongos WT.
Este efeito foi associado a um aumento de IL-10 nos pulmões, devido a um
recrutamento de monócitos produtores desta citocina. Os dados mostram efeitos anti-
inflamatórios da IL-32 em inflamação alérgica das vias aéreas.
31
Diante do exposto, fica claro que a IL-32 está associada à resposta imune do
hospedeiro frente à várias infecções ou doenças inflamatórias. O uso de camundongos
IL-32Tg pode auxiliar na elucidação de aspectos da imunopatogenicidade, bem como
do controle, de diversas doenças, dentre elas, a LTA.
32
2. JUSTIFICATIVA
A LTA é uma doença infecto-parasitária, com lesões cutâneas e mucosas
pleomórficas que dependem da relação parasito-hospedeiro, ou seja, de fatores inerentes
ao parasito, bem como do status imune do hospedeiro. Os mecanismos que controlam as
infecções ou levam à persistência do parasito ainda não foram totalmente revelados,
especialmente no que se refere ao parasito L. (L.) amazonensis, marcadamente
reconhecido por sua capacidade de evasão da resposta imune.
Nosso grupo demonstrou que a IL-32 pode ser induzida por formas amastigotas
de L. (Viannia) braziliensis e esta citocina está presente em lesões de pacientes com
LTA. É necessário elucidar o papel da IL-32 nas leishmanioses, uma vez que essa
citocina pode, como em outras infecções, participar do controle da doença. Porém,
devido às suas propriedades pró-inflamatórias, a IL-32 também pode atuar na
imunopatogênese da LTA. Neste contexto, é importante explorar o papel da IL-32 na
LTA causada por diferentes espécies de Leishmania, que levam à diferentes respostas
imunes e desfechos clínicos. Além disso, para avaliar se a IL-32 controla ou exacerba a
infecção, é necessário desenvolver um modelo experimental. A utilização de
camundongos transgênicos para IL-32 humana, portanto, é de grande potencial para o
melhor entendimento da infecção por L. (L.) amazonensis, uma vez que roedores não
possuem essa citocina, mas suas células respondem a ela. Geralmente, as infecções
murinas não apresentam o grau elevado de inflamação que existe na doença humana,
havendo a possibilidade de que a falta de IL-32 possa ser uma das explicações para isto.
Assim, este modelo experimental pode contribuir para a melhor compreensão da
infecção por L. (L.) amazonensis ao mimetizar mais fielmente a infecção humana.
33
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Avaliar o papel da IL-32 na leishmaniose cutânea em camundongos C57BL/6
transgênicos para IL-32 humana infectados com L. (L.) amazonensis.
3. 2. Objetivos Específicos
3.2.1. Avaliar o curso da infecção (tamanho da lesão) por L. (L.) amazonensis
em camundongos C57BL/6 IL-32Tg e animais selvagens;
3.2.2. Avaliar a carga parasitária nas lesões e no baço de camundongos C57BL/6
IL-32Tg e selvagens infectados com L. (L.) amazonensis, em diferentes etapas do curso
da infecção;
3.2.3. Avaliar os aspectos inflamatório das lesões dos camundongos C57BL/6
IL-32Tg e selvagens infectados com L. (L.) amazonensis;
3.2.4. Analisar a produção de citocinas nos linfonodos drenantes de
camundongos C57BL/6 IL-32Tg e selvagens infectados com L. (L.) amazonensis;
3.2.5. Avaliar a atividade leishmanicida in vitro de macrófagos derivados da
medula óssea de camundongos C57BL/6 IL-32Tg e selvagens infectados com L. (L.)
amazonensis.
34
4. MÉTODOS
4.1. Animais e considerações éticas
Os camundongos transgênicos para IL-32humana foram desenvolvidos por
Choi et al. (2010) e doados ao nosso grupo pelo Dr. Charles Dinarello (Universidade do
Colorado, Denver, EUA). Os camundongos C57BL/6 WT (wild-type) (n = 40) e os IL-
32Tg (n = 40) foram criados e mantidos no biotério do IPTSP/UFG. Para os
experimentos, foram utilizados camundongos entre 6 e 8 semanas de idade, de ambos os
sexos, mantidos em estantes ventiladas e microisoladores (quatro animais por gaiola),
tratados com ração e água autoclavadas, à vontade, com ciclo de luz de 12 h. Foram
seguidos todos os procedimentos de acordo com as diretrizes e legislação sobre ética da
Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL) e Conselho
Nacional de Controle da Experimentação Animal (CONCEA). Projeto aprovado pelo
Comite de Ética protocolo 1.123.480.
4.2. Cultura de parasitos
A cepa MHOM/BR/1973/M2269 L. (L.) amazonensis foi gentilmente cedido
pelo Dr. Renato Mortara, UNIFESP, São Paulo - SP. Os parasitos estão armazenados no
Leishbank (Banco Imunobiológico de Leishmanioses do Centro-Oeste, IPTSP/UFG),
em solução contendo soro fetal bovino (SFB) e dimetilsulfóxido (10%), em nitrogênio
líquido. Após descongelamento, os parasitos foram cultivados (placas de 24 poços,
Corning-Costar, EUA) em Meio de Grace (Sigma Chem. Co, EUA), suplementado com
20% de Soro Fetal Bovino/SFB (Gibco Life Technologies, Brasil), 2 mM de L-
glutamina (Sigma), 100 U/mL de penicilina (Sigma) e 100 µg/mL de estreptomicina
(Sigma), denominado meio Grace completo, a 26 °C. As passagens em cultura foram
35
efetuadas a cada dois ou três dias, mantendo os parasitos em fase logarítmica do
crescimento, sempre iniciando as culturas com 1 x 106 parasitos/mL. A quantificação
dos parasitos foi realizada em hematocitômetro, após diluição de uma alíquota da
cultura em solução salina tamponada com fosfatos (PBS)-formaldeído a 1%. As
infecções foram realizadas com formas promastigotas obtidas das culturas no 5o ou no
6o dia de crescimento (fase estacionária do crescimento).
4.3. Infecção dos camundongos
Para a infecção dos camundongos, os parasitos foram retirados das culturas,
centrifugados e lavados com solução fisiológica (NaCl 0,8%) por três vezes (1.400 g, 15
min, 4 oC). Após a quantificação dos parasitos, os animais foram inoculados (1 x 105
promastigotas/10 L de salina) na orelha esquerda, intradermicamente. Cada grupo
experimental foi composto de quatro animais.
4.4. Acompanhamento da lesão
Após a infecção dos camundongos WT ou IL-32Tg, o tamanho da lesão foi
medido semanalmente, ao longo de nove semanas. A medida foi realizada com auxílio
de paquímetro digital. O tamanho da lesão é descrito como a diferença entre a espessura
da orelha infectada e a espessura da orelha não infectada, contralateral. O resultado foi
expresso em mm (Lima Jr et al. 2013).
4.5. Quantificação dos Parasitos por Diluição Limitante
Ao final de cada período de infecção, os animais foram eutanasiados e a orelha
infectada, o linfonodo drenante (submandibular/região cervical esquerda) e o baço de
cada animal foram removidos para análise da carga parasitária, por ensaio de diluição
36
limitante (Souza-Neto et al. 2004). Para isso, a orelha infectada foi retirada e depositada
em álcool 70% por dois minutos. Em seguida, cada orelha foi macerada por 5 minutos
em 2 mL de PBS, com auxílio de homogeneizador do tipo Potter (Kimble-Chase, EUA).
O macerado foi centrifugado inicialmente a 500 g, por 1 minuto a 4 °C, afim de se
remover o debri celular. O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
centrifugados novamente a 1.400 g, 15 minutos, a 4 ºC e o sedimento foi ressuspendido
em meio de Grace completo (descrito no Item 4.2), volume final de 0,5 mL. A
suspensão das orelhas foi diluída seriadamente, em fator 10, em meio de Grace
completo, em placas de 96 poços de fundo chato (Corning-Costar). Após a diluição
seriada, as placas foram fechadas, hermeticamente, e incubadas a 26 ºC
Para a realização da diluição limitante do linfonodo e do baço, os órgãos foram
macerados, utilizando-se êmbolos de seringas autoclavados, em placa de petri de vidro
esterilizada. O macerado foi centrifugado a 500 g, por 1 minuto, para retirada de
fragmentos de tecido. O sobrenadante foi transferido para novos tubos e centrifugados à
1.400 g, por 15 minutos, a 4 °C. Ao final, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento
foi ressuspedido em 0,5 mL de meio Grace. A suspensão foi diluída, seriadamente, em
fator 10, em meio de Grace completo, em placas de 96 poços de fundo chato (Corning-
Costar). Após a diluição seriada, as placas foram fechadas, hermeticamente, e incubadas
a 26 ºC.
A detecção de formas promastigotas foi realizada por avaliações diárias das
placas, utilizando um microscópio de luz invertido. A leitura final foi realizada no 14º
dia após o início das culturas. A quantidade estimada de parasitos foi obtida pela
determinação da última diluição em que os parasitos foram detectados, sendo os
resultados expressos como o logarítmico negativo do título de parasitos (Souza-Neto et
al. 2004).
37
4.6. Preparo de antígeno de Leishmania
A cepa PH8 de Leishmania (L.) amazonensis foi cultivada em meio Grace
completo. Os parasitos foram diluídos em PBS 1x de forma que a concentração de
parasito fosse igual 5x108 parasito/mL. O volume correspondente foi então transferido
para tubos de congelamento com 10uL do inibidor de protease (Protease Inhibitor
CocktailI- Sigma). Realizou-se 10 ciclos de congelamento no Nitrogênio líquido e
descongelamento em banho-maria a 36°C, intercalando no agitador de tubos (Tecnal-
Br). Ao final, foi coletado cerca de 10uL de solução e observado ao microscópio de luz,
para certificar a existência apenas de fragmentos dos parasitos. Todas as alíquotas foram
unidas em um só tudo e realizado a quantificação de proteína utilizando o Kit- BCAtm
(Thermo Scientific-USA), conforme instruções do fabricante. Por fim, as alíquotas
foram identificadas e armazenadas no freezer -20°C.
4.7. Estimulação de células dos linfonodos drenantes
Para avaliar a produção de citocinas nos linfonodos drenantes
(submandibular/região cervical esquerda), os linfonodos foram colhidos em condições
assépticas. Cada linfonodo foi depositado em um poço de placa de 24 poços (Corning-
Costar), com 2 mL de PBS e foi realizada a maceração, com auxílio de êmbolo de
seringa, para desagregação celular. A suspensão celular foi, então, centrifugada (600 g,
10 minutos, a 10 ºC) e o sedimento celular foi ressuspendido em meio RMPI 1640
(Sigma), contendo 10% de SFB (Cripion, Brasil), 50 µM de 2-mercaptoetanol (Sigma),
1 M de HEPES, 2 mM de glutamina (Sigma), 100 U/mL de penicilina (Sigma) e 100
mg/mL de estreptomicina (Sigma), denominado meio RPMI completo. As células foram
quantificadas em hematocitômetro, após diluição de uma alíquota em solução de azul de
38
tripano 0,1% em PBS, para exclusão de células mortas. Foram utilizadas somente
suspensões celulares com viabilidade acima de 90%.
A concentração das células viáveis foi ajustada para 5 x 106 células/mL, sendo
distribuídos 200 µL por poço de placas de cultura de 96 poços (Corning-Costar). As
células foram estimuladas, ou não, com concanavalina A (ConA; Sigma) a 5 µg/mL ou
antígeno total de L. (L.) amazonensis, a 50 µg/mL. A cultura de células foi incubada em
estufa com atmosfera úmida, contendo 5% de CO2, a 37º C. O procedimento foi
realizado em triplicata para cada suspensão celular/tratamento. Após 48 h de incubação,
o sobrenadante foi colhido e a quantidade de citocinas (IFN, TNF-α e IL-10) foi
determinada pelo ensaio imunoenzimático (ELISA).
4.8. Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
Para dosagem de IL-10, utilizamos kit comercial anti-IL-10 murino (Peprotech-
USA), de acordo com as instruções do fabricante.
Para a dosagem de IFNforam utilizadas microplacas para ELISA (Jet Biofil –
EUA) sensibilizadas com o anticorpo monoclonal de captura anti-IFN (hibridoma
XMG1.2, 1 µg/mL, 18 h, 4 ºC). Para a dosagem de TNF-α, as placas foram
sensibilizadas com o anticorpo monoclonal de captura anti-TNF (hibridoma XT22.11, 1
µg/mL, 18 h, 4 ºC). Em seguida, as placas foram bloqueadas, por 1 hora, com PBS
contendo 3% de SFB (Gibco Life Technologies, Brasil). Os sobrenadantes das culturas
foram adicionados aos poços (80 µL/poço), em duplicata. Após incubação (2 h,
temperatura ambiente, T.a.), a placa foi lavada três vezes com PBS-Tween-20 a 0,04 %,
e, então, foi adicionado o segundo anticorpo (hibridoma MPG-XT3 conjugado com
biotina, 0,5 µg/mL, para IFN e hibridoma XT22 para TNF-α - 80 µL/poço). Após
incubação por 1 h, à temperatura ambiente, a placa foi lavada mais três vezes com PBS-
39
Tween-20 a 0,04% e o conjugado estreptoavidina-peroxidase (Sigma; 1:2.000) foi
adicionado (80 µL/poço). Após 30 minutos, T.a., a placa foi lavada seis vezes com PBS-
Tween 20 a 0,04%. O substrato cromógeno TMB (3,3’,5,5,-tetrametilbenzidina, Life
Technologies, Brasil) foi adicionado (50 µL/poço) e, após o desenvolvimento de cor, a
reação foi finalizada com H2SO4 2 N (20 L/poço). A densidade óptica (D.O.) foi
obtida em leitor de microplacas (Multskam, ThermoLabsystems, EUA), com filtros de
492/620nm. As concentrações de IFN, TNF-α e IL-10 foram determinadas de acordo
com as curvas padrões preparadas com as citocinas recombinantes (R&D System,
Mineápolis, MN, EUA). O limite mínimo de detecção foi de 0,015 ng/mL para IFN,
0,3125 ng/mL para TNF-α e 0,07 ng/mL para IL-10. A quantidade de IL-32 no lisado
foi determinada por kit de ELISA, seguindo as instruções do fabricante (R&D Systems).
O limite mínimo de detecção para o INF foi de 0,078 ng/ ml, para TNF foi de 0,39
ng/mL, para IL-10, de 0,39 ng/g/mL.O limite de detecção de IL-32 foi de 15 pg/mL.
4.9. Análises histopatológicas
Os fragmentos das orelhas foram processados de acordo com os procedimentos
padrões para histologia, embebidos em parafina e os cortes de 5 m foram corados com
Hematoxilina-Eosina (HE). Os cortes histológicos foram analisados em microscópio de
luz, aumento de 400 vezes (Nikon-Eclipse, E200, EUA). Os seguintes aspectos
microscópios evidenciados no processo inflamatório foram considerados: edema,
acantose, hiperceratose, espessura da orelha, infiltrado inflamatório e presença de
parasito. As análises foram realizadas de forma semi-quantitativa, observando a área
total da lesão, sendo descritas como ausente, discreta (menos de 10% de acometimento),
moderado (de 25 a 50% de acometimento) e intenso (mais que 50% de acometimento)
em toda área analisada.
40
4.10. Imunoistoquímica para detecção de IL-32
As orelhas dos camundongos WT e IL-32Tg não infectados foram processadas
para histologia e incluídas em parafina, sendo os cortes (3 µm) colhidos em lâminas
silanizadas. As lâminas foram depositadas em três soluções de Xilol por 10 minutos
cada, para desparafinizar os cortes. Em seguida, foram imersas em concentrações
decrescentes de álcoois (absoluto, 95% e 70%), por 2 minutos cada. As lâminas foram,
então, lavadas em tampão TBS (11,7 g de TRIS, 17 g de NaCl e uma gota de Triton
X100 para dois litros de água destilada; pH: 7,2). Todos os cortes foram imersos em
tampão EDTA (pH 6,0), a 95ºC e lavados com tampão TBS, para a exposição
antigênica. Posteriormente, foi realizada uma incubação por 30 minutos com peróxido
de hidrogênio a 3%, para o bloqueio da peroxidase endógena. Ao final, todas as lâminas
foram novamente lavadas com tampão TBS e secadas cuidadosamente. O bloqueio foi
realizado por incubação com solução Beckground Sniper (Starr Trek Sistema Universal
de HRP Detecção, Biocare Medical Inc., EUA), por 15 minutos, T.a.. Os cortes foram,
em seguida, incubados com anticorpo policlonal de coelho anti-IL-32 (diluição 1:20, 5
mg/mL; Abcam Inc., EUA), em câmara escura umidificada, por no mínimo 8 h. Ao
final, após lavagem em tampão TBS, todos os cortes foram tratados com a solução Link
Universal Trekie (Starr Trek Universal HRP Detection System, Biocare Medical Inc.,
Concord, CA, EUA), por 20 minutos, seguido de lavagem e o tratamento com Trek
Avidina-HRP (Starr Trek Universal HRP Detection System, Biocare Medical, Concord,
CA, EUA), estreptavidina-biotina-peroxidase, por 20 minutos. As secções foram
incubadas em solução de cromógeno DAB betazóide (Biocare Medical Inc.) e contra-
coradas com hematoxilina de Meyer, por 20 segundos. As lâminas foram adicionadas
em álcoois (absoluto, 95% e 70%) e montadas em lamínulas com resina Entellan
41
(Merck, Brasil). Os dados mostram a existência da IL-32 em coloração em marrom sob
microscopia de luz.
4.11. Avaliação da atividade leishmanicida de macrófagos derivados da medula
óssea.
As células da medula óssea de camundongos WT e IL-32Tg foram adquiridas a
partir dos ossos fêmur e tíbia de camundongos não infectados, mediante lavagem do
canal medular com meio RPMI completo. Após o desprendimento das células, foi
realizada uma centrifugação a 600 g, por 10 minutos, a 10 ºC. A concentração de células
foi ajustada para 2 x 105/mL de meio RPMI completo, sendo adicionados 10 mL em
cada placa de 100 mm (Sarstedt-Alemanha). As células foram cultivadas por 10 dias, na
presença de 20% de sobrenadante de cultura de células L929, contendo fator
estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). O meio foi substituído por meio
fresco, a cada 48 h. Ao final do 10º dia, os macrófagos foram desgrudados das placas,
com auxílio de incubação com solução de PBS-EDTA (50 mM), em estufa a 37 °C/5%
de CO2, por 30 minutos e uso de um raspador celular (Corning-Costar, EUA). As
células foram, então, transferidas para tubos de fundo cônico de 50 mL e centrifugadas a
600 g, por 10 minutos, a 10 ºC. Após a centrifugação, as células foram ressuspendidas
em 1 mL de meio RPMI completo e quantificadas em hematocitômetro, excluindo
células mortas com solução azul de tripano 0,1% em PBS. A viabilidade celular foi
sempre acima de 90%
Para infecção dos macrófagos, as células foram ajustadas para a concentração de
1 x 106 células/mL, em placas de 24 poços (Corning-Costar), sobre lamínulas de vidro
(13 mm, Knitell, Alemanha). As placas foram incubadas por 24 h, a 37 oC, 5% CO2.
Após 24 h, as células foram incubadas, por 3 h, com L. (L.) amazonensis, na proporção
42
de 5 parasitos por célula (5:1). As células foram, então, lavadas duas vezes com PBS
aquecido a 37 oC, para retirada de parasitos não internalizados, e incubadas em meio
RPMI completo por 48 h, a 37 ºC, 5% CO2. O sobrenadante foi colhido para a dosagem
de citocinas, por ELISA, e NO, pelo método de Griess (Migliorini, et al. 1991). As
lamínulas foram fixadas com Metanol (Sigma) e corados por Giemsa (Merck KgaA,
Alemanha), diluído a 1:20 com água destilada, por 4 minutos. Após secagem, as
lamínulas foram montadas sobre lâminas para microscopia, usando resina de montagem
(Entellan; Merck KgaA). A quantidade de células infectadas (%) e o número de
parasitos por célula infectada foram avaliados em microscópio de luz (Nikon- Eclipse,
E200, EUA), em aumento de 1.000x. Foram avaliadas 300 células em cada lamínula
(em duplicata).
4.12. Análises estatísticas
Os dados representam média ± desvio padrão (DP). Os testes t de Student, One-
way ou Two-way ANOVA seguidas de teste de Bonferroni foram utilizados. Os
gráficos e as análises estatítsticas foram realizados com auxílio do GraphPad Prism 5.0
Software Inc. (San Diego, CA, EUA). Diferenças foram consideradas significantes
quando p < 0,05.
43
5. RESULTADOS
5.1. Expressão da IL-32 em camundongos transgênicos para IL-32γ humana.
Apesar de camundongos não possuírem o gene para IL-32 ou um gene homólogo
conhecido, células murinas são capazes de responder a esta citocina. Dessa forma,
animais transgênicos para o gene humano da IL-32 são importantes para a análise do
papel desta citocina na imunopatogênese de doenças infecciosas, tais como a
leishmaniose.
Com o objetivo de demonstrar a existência da IL-32 em camundongos C57BL/6
IL-32Tg e a ausência desta nos animais WT, foi realizada a pesquisa da citocina em
lisados dos tecidos do baço, fígado, linfonodo e orelha de animas, 24 h após injeção de
LPS, conhecido indutor de IL-32 (Netea et al. 2005). Foi observado que baço, fígado e
linfonodo de camundongos C57BL/6 IL-32Tg expressam elevados níveis de IL-32. Por
outro lado, observamos que a expressão desta citocina na orelha é bastante limitada
(Figura 1A). Dado que o ELISA para IL-32 é uma técnica com falhas em sensibilidade,
realizamos imunoistoquímica, usando anticorpos policlonais anti-IL-32 humana, em
cortes histológicos das orelhas dos camundongos IL-32Tg e WT não-infectados. A
expressão de IL-32 no tecido das orelhas dos camundongos IL-32Tg, bem como a
ausência de IL-32 em camundongos WT é demonstrada na Figura 1B. Esses dados
confirmam, assim, que os animais estão expressando IL-32 e podem ser usados para o
estudo do papel da IL-32 nas infecções experimentais com Leishmania spp.
44
Figura 1. Produção de IL-32 em tecidos de camundongos transgênicos para a IL-32 humana. Em A,
os animais foram inoculados, intraperitonealmente, com 100 µg de LPS.. Após 24 h, foram preparados
homogenatos de baço, fígado, linfonodo e orelha, utilizados para a detecção de IL-32 por ELISA. Os
dados representam Média ± Desvio Padrão (DP) de 3 animais por grupo. Em B, fotomicroscopias
ilustram cortes histológicos de orelhas de camundongos selvagens (WT) e transgênicos para IL-32γ (IL-
32γTg), submetidos à imunoistoquímica com anticorpo policlonal para IL-32 humana. A presença da IL-
32 é demonstrada pela coloração em marrom (revelação com DAB).
5.2. Curso da infecção por Leishmania (L.) amazonensis e carga parasitária nas
lesões de camundongos que expressam ou não IL-32 humana.
Para investigar a progressão das lesões causadas por L. (L.) amazonensis,
camundongos C67BL/6 WT ou IL-32γTg foram inoculados com formas promastigotas
de L. (L.) amazonensis na orelha, intradermicamente. As lesões foram acompanhadas
semanalmente, com auxílio de paquímetro digital, por nove semanas. Todos os animais
desenvolveram lesões que progrediram até a nona semana após o inóculo e não foi
observada uma regressão das lesões. Os animais IL-32γTg, contudo, apresentaram um
atraso no início do desenvolvimento da lesão, o que se tornou mais evidente na 3º
semana, quando a lesão nos animais IL-32γTg foi cinco vezes menor do que a dos
45
animais WT. Contudo, a partir da 4º semana, até o período final analisado, o tamanho
das lesões nos dois grupos de animais foi semelhante. Não houve ulceração em
nenhuma das orelhas dos animais infectados (Figura 2A).
Para quantificar os parasitos existentes nas lesões dos grupos de camundongos
WT e IL-32γTg, foi realizado o ensaio de diluição limitante, nas semanas 3, 6 e 9 após a
infecção. Surpreendentemente, apesar de a lesão ser cerca de cinco vezes maior nos
animais WT na terceira semana de infecção, estas lesões continham cerca de 100 vezes
menos parasitos do que aquelas dos camundongos IL-32γTg. Interessante observar que,
apesar desse crescimento nos momentos iniciais de infecção (3 semanas), o parasitismo
nos animais IL-32γTg se manteve estável durante os períodos posteriores. No grupo
WT, entretanto, houve um crescimento exponencial de parasitos ao longo das semanas
de infecção (Figura 2B).
Figura 2. Curso temporal da lesão desencadeada por Leishmania (L.) amazonensis e carga
parasitária nas lesões da orelha de camundongos transgênicos ou não para a IL-32 humana (IL-
32γTg). Os camundongos selvagens (WT) e transgênicos para IL-32 (IL-32γTg) foram infectados com 1
x 105 formas promastigotas de L. (L.) amazonensis, intradermicamente, nas orelhas. A: O tamanho da
lesão foi mensurado semanalmente, sendo representado pela diferença na espessura da orelha infectada e
a espessura da orelha não-infectada, contralateral. B: A carga parasitária foi determinada pela técnica de
diluição limitante em camundongos infectados com L. (L.) amazonensis por 3, 6 e 9 semanas. Os
resultados representam a média ± DP, de 8-12 animais por grupo, em 2 ou 3 experimentos independentes.
*p < 0,05 (IL-32γTg vs WT).
46
5.3. Carga parasitária no linfonodo drenante e no baço de camundongos que
expressam ou não IL-32 humana infectados com Leishmania (L.) amazonensis.
Para avaliar a capacidade de disseminação dos parasitos para outros órgãos, foi
realizada a avaliação da carga parasitária pela técnica de diluição limitante nos
linfonodos drenantes e nos baços dos animais infectados com L. (L.) amazonensis. Não
foram detectados parasitos em 3 e 6 semanas de infecção. Após nove semanas de
infecção, entretanto, foi possível detectar parasitos nos linfonodos e nos baços dos
animais infectados. Camundongos IL-32γTg apresentaram menor número de parasitos
tanto no linfonodo (Figura 3A) quanto no baço (Figura 3B), comparados aos animais
WT.
Figura 3. Carga parasitária no linfonodo e baço de camundongos selvagens ou IL-32γTg após
infecção com Leishmania (L.) amazonensis após nove semanas de infecção Camundongos selvagens
(WT) e IL-32γ Tg foram infectados com 1 x 105 formas promastigotas de L. (L.) amazonensis na orelha
esquerda, intradermicamente. A carga parasitária no linfonodo (A) e no baço (B) foi avaliada pela técnica
de diluição limitante. Os dados representam as médias ± DP de 8 animais por grupo (2 experimentos
independentes), para o baço; e 4 animais por grupo, em único experimento, para o linfonodo. *p < 0,05.
Até aqui, os dados sugerem que a IL-32 favorece a infecção por L. (L.)
amazonensis nos momentos iniciais da infecção, mas, por outro lado, essa citocina
47
parece controlar o crescimento do parasito em momentos mais tardios, bem como evitar
a disseminação destes para outros órgãos.
5.4. Análise histopatológica das lesões causadas por Leishmania (L.) amazonensis
em camundongos que expressam ou não IL-32 humana.
Objetivando analisar as diferenças nos perfis histológicos das lesões nos
camundongos WT e IL-32γTg, cortes histológicos de orelhas de camundongos não
infectados e infectados por 3, 6 ou 9 semanas foram corados com hematoxilina e eosina
e analisados sob microscopia de luz. A histologia das orelhas de camundongos WT e
IL-32γTg não infectados foi similar (Figura 4A e 4B). Além disso, os resultados
demonstram que, após três semanas de infecção com L. (L.) amazonensis, há um
infiltrado inflamatório e edema semelhantes entre os grupos WT e IL-32γTg. Nesse
tempo de infecção, não foram observados processos de acantose (hiperplasia epidérmica
difusa) e hiperqueratose (espessamento da camada córnea) nas orelhas dos animais
infectados (Figura 4C e 4D e Figura 5A). Após seis semanas de infecção, houve
infiltrado celular inflamatório e edema aumentados em camundongos WT, embora sem
diferenças estatisticamente significantes. Além disso, nesse tempo de infecção, foi
observada a presença de acantose apenas nos animais WT (Figura 4E e 4F e Figura 5B).
Após nove semanas de infecção, os perfis histopatológicos foram similares entre os dois
grupos analisados. Salienta-se, ainda, que, apenas nessa fase tardia da infecção, foi
observado um processo de hiperqueratose e presença de muitos parasitos em ambos os
grupos (Figura 4G e 4H e Figura 5C).
48
Figura 4. Análise histopatológica de orelhas de camundongos que expressam ou não a IL-32γ
humana, infectadas com Leishmania (L.) amazonensis. Os camundongos selvagens (WT) e IL-32γTg
foram infectados com 1 x 105 formas promastigotas de L. (L.) amazonensis na orelha, intradermicamente.
Ao atingirem 3, 6 ou 9 semanas de infecção, as orelhas foram retiradas e fixadas, embebidas em parafina
e processadas para coloração com hematoxilina e eosina. As fotomicrografias (400X) representam (A)
WT não infectado, (B) IL-32γTg não infectado, (C) WT infectado por 3 semanas (setas em vermelho
mostram o infiltrado inflamatório e o edema) , (D) IL-32γTg infectado por 3 semanas (setas em vermelho
mostram o infiltrado inflamatório e o edema), (E) WT infectado por 6 semanas(setas em vermelho
mostram o infiltrado inflamatório o edema e a acantose), (F) IL-32γTg infectado por 6 semanas, (G) WT
infectado por 9 semanas (a seta em vermelho mostram o processo de hiperqueratose e a presença do
parasito), (H) IL-32γTg infectado por 9 semanas (aa setaa em vermelho mostram o processo de
hiperqueratose e a presença do parasito).
49
Figura 5. Análise histopatológica de orelhas de camundongos que expressam ou não a IL-32γ
humana, infectadas com Leishmania (L.) amazonensis. Os camundongos selvagens (WT) e IL-32γTg
foram infectados com 1x105 formas promastigotas de L. (L.) amazonensis na orelha, intradermicamente.
Ao atingirem 3, 6 ou 9 semanas de infecção, as orelhas foram fixadas, embebidas em parafina e
processadas para coloração com hematoxilina e eosina. Infiltrado inflamatório, edema, acantose e
hiperqueratose foram avaliados de maneira semi-quantitativa, sendo definidos por escore 0, quando
ausentes, 1, quando discretos, 2, quando moderados e 3, quando intensos. Os dados representam mediana
(linha horizontal vermelha) e resultados individuais de 5 camundongos por grupo, em 3 semanas; 4
camundongos por grupo, em 6 semanas; e 7 camundongos por grupo, em 9 semanas de infecção.
50
Para avaliar se L. (L.) amazonensis modula a expressão de IL-32, cortes
histológicos das orelhas infectadas dos animais IL-32Tg submetidos a
imunoistoquímica nos períodos analisados de 3, 6 e 9 semanas após infecção. Como é
possível notar na Figura 6, em todos os períodos após infecção analisados os animais
IL-32Tg foram capazes de produzir IL-32 humana (Figura 6A, 6B, 6C e 6D), sendo
que parece haver um aumento na expressão dessa citocina, quando os cortes de orelhas
dos animais infectados são comparados com os cortes dos animais não-infectados,
especialmente após nove semanas de infecção (Figura 6A vs 6D). A expressão da IL-32
é identificada em vários tipos celulares, como as células epiteliais, mononucleares no
infiltrado inflamatório, glandulares e endoteliais (Figura 6).
51
Figura 6. Imunoistoquímica para IL-32 em cortes histológicos das orelhas dos camundongos IL-
32γTg, após infecção com Leishmania (L.) amazonensis. A reação de imunoistoquímica foi realizada
com anticorpo policlonal de coelho anti-IL-32 humana em cortes histológicos de orelhas de camundongos
não infectados (A) ou infectados (B, C, D). As fotomicroscopias mostram a presença de IL-32 em
coloração marrom, em diferentes células (indicadas pelas setas vermelhas: células epiteliais,
mononucleares); a coloração marrom em fibras musculares é reação inespecífica (setas amarelas). Em B,
3 semanas após infecção; C, 6 semanas após infecção; e D, 9 semanas após infecção
52
5.5. Produção de citocinas nos linfonodos drenantes das lesões dos camundongos
que expressam ou não IL-32 humana após infecção com Leishmania (L.)
amazonensis.
A produção de citocinas por células dos linfonodos drenantes de camundongos
WT e IL-32γTg não infectados ou após 3, 6 e 9 semanas de infecção com L. (L.)
amazonensis foi avaliada. Inicialmente, foi quantificado o número de células existentes
nos linfonodos drenantes dos camundongos WT e IL-32γTg. Quantidades semelhantes
de células foram obtidas de camundongos WT e IL-32γTg não infectados ou infectados
com L. (L.) amazonensis por 3 semanas. Após 6 e 9 semanas de infecção, entretanto, o
número de células foi maior nos linfonodos de camundongos IL-32γTg do que nos
animais WT (Figura 7).
Figura 7. Número de células nos linfonodos drenantes de camundongos que expressam ou não a IL-
32 humana, não infectados ou com 3, 6 e 9 semanas de infecção por Leishmania (L.) amazonensis.
Os camundongos selvagens (WT) e IL-32γTg foram infectados com 1 x 105 formas promastigotas de L.
(L.) amazonensis na orelha, intradermicamente. Ao atingirem 3, 6 ou 9 semanas de infecção, os
linfonodos drenantes foram removidos e as células, quantificadas em hematocitômetro. Os dados
mostram o número de células por x 106. Os dados representam as médias ± DP, de 8 animais por grupo (2
experimentos independentes). *p < 0,05 (WT vs IL-32γ Tg).
Células dos linfonodos drenantes dos camundongos WT e IL-32γTg foram
estimuladas, ou não, com antígeno de L. (L.) amazonensis por 48 horas. A produção de
53
citocinas foi avaliada por ELISA. Não foi observada diferença significante entre a
produção de IFN-, de TNF- ou de IL-10 entre os grupos WT e IL-32γTg nos três
períodos de infecção analisados (Figura 8). Apesar do número de células ser maior nos
animais IL-32γTg, houve uma tendência à redução na produção de IFN-(Figura 7).
Figura 8. Produção de citocinas por células dos linfonodos drenantes das lesões de camundongos,
que expressam ou não a IL-32 humana, infectados com Leishmania (L.) amazonensis. Os
camundongos selvagens (WT) e IL-32γTg foram infectados com 1 x 105 formas promastigotas de L. (L.)
amazonensis na orelha, intradermicamente. Ao atingirem 3, 6 ou 9 semanas de infecção, as células dos
linfonodos drenantes foram cultivadas na ausência (Controle) ou presença de antígeno de L. (L.)
amazonensis (Antígeno), por 48 horas, a 37 ºC/5% CO2. Os sobrenadantes foram utilizados para dosagem
de (A) IFN-γ, (B) TNF-α e (C) IL-10, por ELISA. Os dados representam as médias ± DP de 8 animais por
grupo, de 2 experimentos independentes.
54
5.6. Avaliação do papel da IL-32 na fagocitose de L. (L.) amazonensis e na
atividade leishmanicida de macrófagos murinos derivados da medula óssea.
Células da medula óssea obtidas de camundongos WT e IL-32, foram
cultivados por 10 dias com meio de cultura contendo sobrenadante de células L929,
para derivação em macrófagos. Os macrófagos foram infectados com formas
promastigotas de L. (L.) amazonensispor 3 h e 48 h, para avaliação da fagocitose e da
atividade microbicida, respectivamente, na presença ou ausência de IFN A presença
da IL-32 nos macrófagos de camundongos não alterou a porcentagem de células
infectadas, nem o número de parasitos por célula infectada, comparando com os
macrófagos derivados da medula óssea de camundongos WT, após 3 horas de infecção
(Figura 9A e 9B).
As porcentagens de células infectadas e número de amastigotas por célula
infectada, após 48h, foram similares entre os grupos WT e IL-32Tg, tanto na ausência
quanto na presença de IFN(Figura 9A e 9B). Esses dados indicam que a IL-32 não
afeta significantemente a fagocitose e atividade microbicida de macrófagos derivados da
medula óssea. Apesar disso, foi observada uma redução na produção de NO por
macrófagos de camundongos IL-32Tg infectados, estimulados com IFN, comparados
com os níveis de NO produzidos por macrófagos WT (Figura 9C). Apesar dos
macrófagos dos camundongos IL-32Tg produzirem menos NO, isso não interferiu na
capacidade leishmanicida dessas células, comparando-as com macrófagos WT.
55
Figura 9: Avaliação dos efeitos da IL-32 na fagocitose e capacidade leishmanicida de macrófagos
derivados da medula óssea de camundongos selvagens e IL-32Tg infectados com L. (L.)
amazonensis. Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos WT e IL-32 foram infectados
com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis (5:1, parasitos:célula), por 3 h. As células foram
lavadas, para retirada de parasitos não aderidos ou internalizados, e incubadas por 48 h na ausência ou
presença de rIFN(10 ng/mL). As células foram coradas (Giemsa) e analisadas sob microscopia de luz,
para determinação da carga parasitária. A) Porcentagem de células infectadas. B) Número médio de
amastigotas por célula infectada. C) Produção de óxido nítrico no sobrenadante de 48 h, por método de
Griess. Os dados representam as médias ± DP de 4 experimentos independentes, realizados em duplicata.
*p < 0,05 (WT vs IL-32Tg).
56
6. DISCUSSÃO
No presente estudo avaliou-se, pela primeira vez, o papel da IL-32 na infecção
com Leishmania (L.) amazonensis. Para isso, foram utilizados camundongos
transgênicos para IL-32 humana. Inicialmente, foi realizada a detecção da produção da
IL-32 em órgãos específicos dos camundongos IL-32γTg, importantes nas infecções por
Leishmania, como o baço, fígado, lindonodo e orelha (local da infecção). Nossos dados
demonstraram que os animais transgênicos não possuem uma expressão homogênea da
IL-32 nos diferentes órgãos (Figura 1). Em conformidade com nossos achados, Choi et
al. (2010) demonstraram que a expressão de IL-32 era irregular nos camundongos IL-
32γTg, podendo ser mais ou menos expressa, dependendo do órgão do animal.
Contrário aos resultados de Choi et al. (2010) que detectaram IL-32 por RT-PCR e
western blotting em animais IL-32Tg sem nenhuma estimulação, o ELISA usado no
presente estudo não foi capaz de detectar uma produção de IL-32 nos animais não
estimulados, mas somente após estimulação in vivo com LPS, conhecido indutor de IL-
32 (Neteia, 2006). Estes dados podem ser explicados por diferentes sensibilidades das
técnicas utilizadas. De fato, quando foi utilizada a imunoistoquímica para IL-32 nas
orelhas dos camundongos IL-32Tg, esta foi fortemente detectada, no presente estudo.
Neste estudo, em camundongos IL-32γTg, houve um atraso no aparecimento da
lesão desenvolvida na orelha dos animais infectados. Contudo, a lesão, a partir da quarta
semana, progrediu de maneira crescente, se igualando às lesões de camundongos WT
(Fig. 2A) e sem regressão ou cura até a 9a semana de infecção. Interessante observar, no
entanto, que a IL-32 favoreceu o parasito nos momentos iniciais da infecção (até 3ª
semana), quando foram observadas lesões menores, mas com maior quantidade de
parasitos, o que sugere que a inflamação local estava reduzida nessas lesões. Sabe-se
57
que camundongos da linhagem C57BL/6 são altamente suscetíveis a L. (L.)
amazonensis, desenvolvendo lesões crônicas persistentes, que não se curam
espontaneamente e são marcadas pela presença de parasitos em quantidades elevadas
(Afonso & Scott, 1993; Ramer et al. 2006; Cortes et al. 2010; Sousa et al. 2010). Nossos
dados corroboram com os achados descritos na literatura, e, especialmente, mostram
que a presença de IL-32 nos camundongos IL-32γTg infectados com L. (L.)
amazonensis não foi capaz de reduzir a carga parasitária no local da infecção. Uma vez
que IL-32 é uma citocina pró-inflamatória, podendo induzir a produção de outras
citocinas, como TNF, e quimiocinas (Kim et al. 2005; Li et al. 2008; Choi et al. 2009;
Nakayama et al. 2013), era esperado um maior controle da infecção nos animais IL-
32γTg, pela indução de moléculas microbidicas, ou, ao menos, um maior processo
inflamatório. O maior parasitismo inicial nos animais IL-32γTg sugerem, portanto, que
IL-32 não foi capaz de reverter o quadro imunossupressor induzido por L. (L.)
amazonensis, não aumentando o controle da infecção local e que, por algum mecanismo
ainda desconhecido, favoreceu o crescimento inicial dos parasitos.
A IL-32 pode sofrer processamento para outras isoformas menos inflamatórias
ou até menos anti-inflamatórias. A IL-32, por exemplo, é indutora de IL-10 (Kang et
al. 2009; Kang et al. 2013), que, por sua vez, favorece a infecção por Leishmania
(Gazzinelli et al. 1992; Balestieri et al. 2002). Podemos hipotetizar, portanto, que a
infecção por L. (L.) amazonensis pode induzir processamento da IL-32 para IL-32,
favorecendo, assim, a infecção por L. (L.) amazonensis. Infelizmente não obtivemos
sucesso, ainda, com as reações de PCR em tempo para quantificação de citocinas nas
lesões; tais resultados devem contribuir para esclarecer se está havendo o
processamento alternativo do mRNA da IL-32 e se há aumento de IL-10 no local.
Contudo, é importante ressaltar que não encontramos produção elevada de IL-10 em
58
células do linfonodo drenante de IL-32Tg estimuladas com antígeno de L. (L.)
amazonensis, em nenhum dos períodos de infecção analisados (Figura 8). Já foi
demonstrado que L. (L.) amazonensis é capaz de controlar a resposta inflamatória do
tipo Th1, mesmo em animais geneticamente deficientes em IL-10 (Jones et al. 2002),
sugerindo outras vias de modulação da resposta Th1 independentes de IL-10. De fato, a
IL-10 parece estar mais associada à inibição de lesões inflamatórias teciduais do que
como um fator de suscetibilidade (Ji et al. 2005).
No presente estudo, foi avaliada, também, a capacidade da IL-32γ em impedir a
disseminação do parasito para outros órgãos. Houve disseminação de parasitos para o
linfonodo e baço nos animais WT, na 9a semana de infecção. A presença da IL-32, por
outro lado, parece impedir a disseminação desses parasitos (Fig. 3B). Esses dados
sugerem que a IL-32 pode ser importante para o controle da disseminação dos parasitos
em fases mais tardias da infecção. O controle da disseminação do parasito é importante
para que não haja uma visceralização da infecção, o que agrava a doença (Sypek et al.
1993; Turetz et al. 2002). Alternativamente, a IL-32 pode não ter controlado a
disseminação dos parasitos para o linfonodo e o baço, mas sim induzido a morte dos
parasitos nesses órgãos. O fato de esses órgãos apresentarem maior expressão de IL-32
do que o tecido cutâneo da orelha (Figura 1) pode explicar os melhores resultados
obtidos nas análises do parasitismo no linfonodo e no baço. Corrobora essa hipótese o
fato que, em modelo experimental de leishmaniose visceral com esses mesmos
camundongos transgênicos, a IL-32 aumenta a resposta inflamatória no baço e no
fígado e induz maior controle dos parasitos nesses órgãos (dados não publicados).
As análises histopatológicas das orelhas infectadas por três semanas
demonstraram, microscopicamente, que, em animais WT, há um maior aumento na
espessura da orelha (Figura 4A), contribuindo para o maior tamanho da lesão observado
59
nesse grupo (Figura 2A), comparado com a lesão nos camundongos IL-32γTg. Os
aspectos inflamatórios, como o infiltrado celular e o edema, observados nas lesões,
foram, no entanto, semelhantes nos camundongos WT e IL-32γTg. Os aspectos
histopatológicos das infecções por L (L.) amazonensis tem sido amplamente estudados
(Lemos de Souza et al, 2000; Abreu-Silva et al., 2004; Cardoso et al., 2010). Em
análises histológicas de animais C57BL/10 WT infectados com L. (L.) amazonensis na
pata, notou-se um processo inflamatório intenso, com formas amastigotas no interior
dos macrófagos vacuolizados, presença de mastócitos e eosinófilos no início da infeção.
Oito semanas após a infecção, foi possível notar um infiltrado celular composto
principalmente por eosinófílos, macrófagos e amastigotas dentro dos macrófagos
(Maüel et al. 1987; Grimaldi et al. 1984; Pompeu et al. 1991; Terabe et al. 2004). Tais
aspectos não foram detectados no presente estudo, onde o infiltrado inflamatório foi
composto especialmente por células mononucleares, linfócitos e macrófagos.
Charret et al. (2013) infectaram a pata esquerda de camundongos C57BL/6 com
L. (L.) amazonensis, e observaram uma quantidade aumentada de infiltrado celular e
edema no local da lesão em animais WT. Além disso, os autores notaram alterações na
derme, como acantose. A população celular presente no local da infecção incluía
macrófagos, linfócitos, neutrófilos e eosinófilos. De maneira geral, os dados da
literatura corroboram os nossos achados e, aqui, foi observado que a IL-32 não altera o
perfil histopatológico das lesões experimentais causadas por L. (L.) amazonensis. A
indução de TNFα pela IL-32γ (Netea et al. 2005; Kim et al. 2005; Joosten et al. 2006;
Dinarello et al. 2006) poderia aumentar, indiretamente, a vasodilatação e favorecer a
quimiotaxia das células para o local da inflamação (Bradley, 2008), mas L. (L.)
amazonensis parece inibir a inflamação local, mesmo na presença dessa citocina.
Galdino Jr et al. (2014) mostraram uma associação entre os níveis de expressão
60
de TNFα e IL-32 nas lesões de pacientes com LTA na forma mucosa causada por L.
(Viannia) sp, uma forma clínica onde há poucos parasitos, muita inflamação e TNFα
(Bacellar et al. 2002; Gaze et al. 2006; Alves-Ferreira et al. 2015). Era esperado,
portanto, um aumento no processo inflamatório e um melhor controle dos parasitos da
espécie L. (L.) amazonensis, no presente estudo. O TNFα é importante para a ativação
de macrófagos, principal célula hospedeira para parasitos do gênero Leishmania, e é
fundamental para a expressão de iNOS e, consequentemente, para a produção de NO
por células infectadas (Bogdan, 2001; Fonseca et al. 2003). O TNFα é uma molécula
importante, também, para a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), que
juntamente com o NO, são importantes para a eliminação de L. (L.) amazonensis
(Mukbel et al. 2008; Lowenstein et al. 1993). Era esperado, portanto, que a IL-32
desempenhasse um papel imunoprotetor na leishmaniose, uma vez que essa citocina já
foi descrita na proteção contra inúmeros agentes infeciosos, como HIV, Influenza e
Mycobacterium spp. (Li et. al. 2009; Nold et. al. 2009; Bai et. al. 2010; Bai et. al. 2011;
Bai et. al. 2015). Além disso, a IL-32é capaz de induzir maior quimiotaxia de células
T efetoras, via aumento da produção de CCL2, CCL4 e CCL5 por células dendríticas.
As vias envolvidas nesse processo envolvem a ativação de JNK e NF-κB (Son et al.
2014). Mais ainda, a IL-32induz um perfil inflamatório Th1 e Th17, por induzir IL-12
e IL-6, respectivamente, em células dendríticas (Jung et al. 2011). Apesar de infecções
por L. (L.) amazonensis serem capazes de reduzir a produção de IL-12 por macrófagos,
via aumento na fosforilação de ERK1/2 (Cameron et al. 2004; Belkaid et al. 1998; Feng
et al. 1999), e, consequentemente, alterar o perfil de células T durante a infecção, uma
maior polarização para um perfil Th1 em animais IL-32g era esperado no presente
estudo. L. (L.) amazonensis, contudo, parece ser capaz de subverter a resposta imune
gerada por IL-32. A produção de citocinas inflamatórias, induzidas por antígenos de
61
Leishmania, como TNFα e IFNγ foram semelhantes entre os animais WT e IL-32γTg na
terceira, sexta ou nona semana de infecção (Fig. 8). Apesar de sabermos que L. (L.)
amazonensis é capaz de modular a resposta imune, favorecendo a infecção, em especial
nos momentos iniciais da infecção (Ji et al. 2003; Oliveira et al. 2005; Wanderley et al.
2012), todos os trabalhos, até o momento, foram realizados em animais desprovidos de
IL-32. Aqui, demonstramos que L. (L.) amazonensis também deve ser capaz de modular
a inflamação induzida por IL-32, nas semanas iniciais da infecção, de tal forma que,
após a 3a semana de infecção, o animal IL-32γTg apresente um perfil de lesão e
produção de citocinas similar àquele do WT (Figura 7 e 8).
É importante ressaltar, ainda, que dados do nosso grupo, ainda não publicados,
demonstram que os camundongos transgênicos para IL-32são mais eficientes em
controlar a lesão e o parasitismo tecidual em infecção por L. (V). braziliensis. Esse
efeito protetor está associado com uma maior produção de IFNγ e TNF nos
camundongos IL-32γTg infectados com L. (V.) braziliensis. Convém destacar, no
entanto, que L. (V.) braziliensis parece ter uma capacidade diminuída de modular a
produção de citocinas inflamatórias, em comparação com a L. (L.) amazonensis (Afonso
& Scott 1993; Pereira & Alves 2008; Ji et al. 2003). Além disso, a resposta de
camundongos C57BL/6 a L. (V.) braziliensis é protetora, com participação de linfócitos
Th1 e mecanismos microbicidas dos macrófagos. Portanto, a IL-32 amplifica uma já
forte resposta anti-L. (V.) braziliensis desenvolvida nesta linhagem de camundongos.
Neste estudo, os experimentos in vivo apresentam diferentes mecanismos imunes
funcionando simultaneamente, sendo possível, portanto, que a atividade leishmanicida
dos macrófagos pudesse estar sendo alterada pela resposta imune no local da infecção.
Assim, para avaliar o papel da IL-32 na atividade leishmanicida dos macrófagos, estas
células foram derivadas de medula óssea dos camundongos transgênicos. Os
62
macrófagos derivados de camundongos IL-32γTg não apresentaram uma maior
capacidade fagocítica, nem maior atividade microbicida que os macrófagos de animais
WT (Figura 9). Pelo contrário, durante a infecção com L. (L.) amazonensis, os
macrófagos com o gene da IL-32γ produziram menores quantidades de NO do que os
macrófagos WT, quando estimulados com rIFNγ. Tem sido demonstrado que a adição
da rIL-32γ em linhagens de macrófagos humanos THP-1 promoveu a redução
intracelular de M. tuberculosis e M. avium fagocitados pelos macrófagos (Bai et al.
2010; Bai et al. 2015). Além disso, IL-32 recombinante (rIL-32) reduziu o número de
micobactérias em células epiteliais e macrófagos. A redução do crescimento
micobacteriano foi associada com apoptose de macrófagos (Bai et al., 2011).
Macrófagos alveolares de camundongos IL-32γTg infectados com M. tuberculosis
também foram mais capazes de controlar a infecção (Bai et al. 2015). Na infecção com
L. (L.) amazonensis, no entanto, foi observado que a presença do gene da IL-32γ não
altera significantemente a capacidade dos macrófagos em conter os parasitos. A carga
parasitária não foi alterada de 3 h para 48 h nem nos macrófagos WT, nem nos IL-
32Tg.
Os resultados acima foram obtidos imediatamente antes de finalizar a presente
dissertação, não havendo tempo hábil para execução de experimentos para checar se a
IL-32 estava sendo expressa ou não nos macrófagos dos animais transgênicos. É
possível que o parasito iniba a expressão de IL-32 nestes macrófagos. Experimentos
para a obtenção de lisados celulares para a dosagem de IL-32 estão sendo realizados. A
expressão da IL-32 pode ser modulada in vivo nos animais transgênicos, conforme
demonstrado por Choi et al. (2010) em um modelo de colite experimental. Os
mecanismos que explicam a diminuição de IL-32, constitutivamente expressa sob
controle do promotor de -actina de galinha, não é conhecido. No presente estudo, para
63
detectar a IL-32 nos tecidos, foi necessário estimular as células in vivo com LPS,
portanto, os resultados sugerem que o promotor da -actina pode ser ativado ou inibido
durante reações inflamatórias. É crucial, assim, avaliar a produção in vivo e in vitro da
IL-32 nos animais transgênicos durante a infecção por L. (L.) amazonensis, comparando
com as células IL-32Tg na ausência de infecção ou na presença de um indutor de sua
expressão, como o LPS utilizado in vivo.
Tem sido largamente demonstrado que L. (L.) amazonensis modula várias
funções dos macrófagos, incluindo a produção de NO (Balestieri et al. 2002; Gregory &
Olivier 2005; Camacho et al. 2008), um dos principais mecanismos leishmanicidas da
célula infectada (Green et al. 1991; Mauel et al. 1991). Os mecanismos que levam à
inibição da produção de NO não são totalmente esclarecidos, mas moléculas como
Lipofosfoglicano (LPG) e Glicoinositolfosfolipideos (GIPLs) parecem ser importantes
nesse processo, uma vez que essas moléculas causam redução na capacidade do
macrófago em expressar iNOS e gerar NO, mesmo na presença de estímulos
inflamatórios, como IFN- e LPS (Proudfout et al. 1996). Alguns autores demonstraram
que a inibição da produção de NO por L. (L.) amazonensis não é dependente da
expressão de iNOS, mas sim da redução na atividade da enzima (Balestieri et al. 2002).
Por outro lado, foi relatado que a redução de NO, durante infecções por L. (L.)
amazonensis, envolve uma redução da expressão do iNOS. Nam et al (2014) mostraram
que macrófagos THP-1 derivados na presença de IL-32 recombinante humana
produzem NO, indicando que a presença da IL-32 por longos períodos de incubação é
capaz de induzir mecanismos microbicidas em macrófagos. No entanto, no presente
estudo, além de não haver aumento na produção de NO nos macrófagos IL-32Tg,
nestes macrófagos, o tratamento com IFN causou uma diminuição da produção de NO
após infecção com L. (L.) amazonensis. Os resultados sugerem que a combinação IFN
64
e IL-32 não aumenta a produção de NO, quando na presença do parasito. Uma razão
para isto pode ser a capacidade do IFN em alterar o processamento alternativo do
mRNA da IL-32, pois foi observado, pelo nosso grupo, que dependendo da dose de
IFN, macrófagos THP-1 expressam diferentes isoformas de IL-32 (dados não
publicados). E é sabido que a IL-32 é indutora de IL-10 (que não foi dosada nos
experimentos deste estudo, nas culturas de macrófagos), que pode inibir a produção de
NO (Kang, 2009). A concentração de IFNnos experimentos com os macrófagos
murinos, no presente estudo, foi baseada em vários artigos previamente publicados,
assim, serão necessários experimentos para avaliar o efeito de diferentes concentrações
desta citocina na produção de NO por macrófagos durante a infecção com L. (L.)
amazonensis.
Outro ponto a ser considerado no presente modelo é que, em seres humanos, os
mecanismos microbicidas anti-micobactérias, induzidos pela IL-32, envolvem a via da
vitamina D, seu receptor (VDR) e os peptídeos antimicrobianos, como catelicidina e -
defensina-2 (Montoya et al. 2015). Murinos, no entanto, não produzem IL-32, ou -
defensina-2 e não há elementos de resposta a vitamina D no gene do precursor da
catelicidina (Bloom & Modlin, 2016), sugerindo que os mecanismos microbicidas
dependentes de IL-32 possam ser diferentes em seres humanos e murinos e tais
diferenças possam ser importantes na resposta anti-Leishmania. Os mecanismos
microbicidas em macrófagos murinos expressando IL-32 e em macrófagos humanos
devem ser estudados, para comparação e melhor entendimento do que ocorre em ambas
as células.
Os estudos com este modelo de camundongo IL-32Tg estão apenas no início,
tendo sido avaliados em modelos de colite (Choi et al. 2010), diabetes (Jhun et al. 214),
sepse (Kim et al. 2014), asma (Park et al. 2015) e, agora, em leishmaniose, pelo nosso
65
grupo. Algumas falhas no modelo do presente estudo podem ser apontadas, à medida
que estamos entendendo como funciona a expressão de IL-32 humana nos
camundongos transgênicos. Primeiro, o modelo usa a orelha para infecção com
Leishmania, no entanto, observamos que este tecido parece expressar pouca IL-32.
Além disto, o promotor da -actina, que controla a expressão da IL-32 humana pode
ser modulado durante reações inflamatórias, o que pode alterar os resultados em
diferentes tecidos. Realizaremos experimentos de infecção em outro local, para reavaliar
os efeitos da IL-32 in vivo, assim como pretendemos comparar diferentes espécies de
Leishmania.
O estudo das interações iniciais de Leishmania com macrófagos são
importantes, uma vez que a interação entre os parasitos e as células hospedeiras são
importantes para determinar o resultado da infecção (Ji et al. 2003; Soong 2012). Dessa
forma, as interações iniciais de L. (L.) amazonensis com macrófagos, bem como com
neutrófilos e células dendríticas, podem explicar a deficiência de montagem da reposta
Th1 nas infecções por essa espécie. Até o momento, podemos dizer que a IL-32 parece
desempenhar algum papel na infecção in vivo por L. (L.) amazonensis, pelo menos em
relação ao controle da carga parasitária nas lesões e da disseminação do parasito.
Infelizmente, não pudemos continuar com a infecção por mais de nove semanas, porque
nesta semana já havia indicações de ulceração das lesões, tanto nos animais WT quanto
nos IL-32Tg, o que não permitiria continuar a avaliação. Nós ainda hipotetizamos que
a IL-32 possa ser um alvo adicional para a evasão do parasito L. (L.) amazonensis, pelo
menos no início da infecção. De fato, um paciente com a grave LCD, causada por L.
(L.) amazonensis, caracterizada por ausência de resposta específica contra o parasito
(Pereira et al. 2009), apresenta expressão muito elevada de IL-32 nas lesões,
aparentemente maior que em infecção por L. (Viannia) sp que causam leishmaniose
66
cutânea menos grave (comunicação pessoal). O estudo dos mecanismos celulares e
moleculares pelos quais a IL-32 interage com componentes da resposta imune inata e
adquirida são necessários para entendermos como a IL-32 participa da imunopatogenia
das infecções por L. (L.) amazonensis.
67
7. CONCLUSÕES
A IL-32γ pode favorecer a infecção por L. (L.) amazonensis, nos momentos
iniciais, e, por outro lado, participar do controle do crescimento dos parasitos e
da disseminação para outros órgãos, nos momentos mais tardios.
A análise histológica das lesões dos camundongos IL-32γTg infectados por L.
amazonensis demonstraram que o processo inflamatório parecer ser semelhante
na presença ou ausência da IL-32.
A presença da IL-32 parece não interferir no produção de citocinas durante a
infecção por L. (L.) amazonensis.
A IL-32 parece não influenciar na capacidade de macrófagos em fagocitar e
controlar infecções in vitro por L. (L.) amazonensis. Além disso, a IL-32 parece
favorecer a redução na produção de NO durante as infecções por essa espécie.
68
8. REFERÊNCIAS
Abreu-Silva AL, Calabrese KS, Cupolilo SMN, Cardoso FO, Souza CSF, Gonçalves da
Costa S.C. Histopathological studies of visceralized Leishmania (Leishmania)
amazonensis in mice experimentally infected, Veterinary Parasitology, 121(3–4): 179-
187, 2004.
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