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Universidade do AlgarveUnidade de Ciencias Exactas e Humanas

Universidade Nova de LisboaInstituto de Tecnologia Quımica e Biologica

Estudo Comparativo de propriedades dereducao e protonacao em citocromos c3 devarias especies de bacterias redutoras de

sulfato

Vitor Hugo Oliveira Teixeira

Relatorio de Estagio do Curso de Licenciatura em Bioquımica

Faro 2000

Relatorio de estagio do curso de Licenciatura em Bioquımica da Uni-versidade do Algarve, realizado no Instituto de Tecnologia Quımica eBiologica (ITQB), no laboratorio de Modelacao de Proteınas. Este re-latorio teve a orientacao interna do Professor Manuel Alves e a orientacaoexterna do Professor Claudio Soares.

Agradecimentos

Ao corpo docente da Licenciatura em Bioquımica da Unidade de CienciasExactas e Humanas da Universidade do Algarve pelos conhecimentos e moti-vacao transmitidos.

Ao Claudio Soares pela oportunidade de realizar este trabalho, pela orien-tacao, discussoes, sugestoes, conselhos, amizade, pelo grande apoio moral e pelarevisao deste relatorio.

Ao Antonio Baptista pelas discussoes, pela disponibilidade e pela amizade.A todas as pessoas do grupo de modelacao de proteınas do Instituto de

Tecnologia Quımica e Biologica, pelo bom ambiente de trabalho, pelo bomhumor, com quem e agradavel trabalhar.

A toda a minha famılia pelo apoio e pela enorme paciencia ao longo dosultimos cinco anos.

Ao Sergio Duarte, a Carla Junior, a Susana Sousa, a Stephanie de Sousa,ao Frederico Escada, ao Victor Pereira, ao Miguel Lourenco, a Andrea Sousa,a Ema Carla e a Ana Meirinho pela amizade, pelas conversas, pela paciencia epor todos os bons momentos.

A um pequeno grupo de amigos, a Teresa Tiago, ao Luıs Estronca, ao PedroBastos e a Vanessa Morais, pela amizade.

E ainda a todos aqueles que de algum modo, directa ou indirectamente,contribuıram para a realizacao deste trabalho.

Obrigado

iii

Parte dos resultados apresentados neste relatorio foram ja expostos em con-gressos:

1. Baptista, A.M., Teixeira, V.H., Soares, C.M. ”Simulation of electron-proton coupling in cytochrome c3 by simultaneous Monte Carlo sam-pling of protonation and redox states”, Poster apresentado no CongressoInternacional ”Understanding Protein Electrostatics”, que decorreu emEstocolmo, Suecia de 15 a 18 Setembro de 2000.

2. Teixeira, V.H., Soares, C.M., Baptista, A.M. ”Identification of the groupsresponsible for the redox-Bohr effect in cytochromes c3 from various spe-cies: molecular modeling studies”, Comunicacao oral apresentada no XIICongresso Nacional de Bioquımica, que decorreu na Povoa de Varzim,Portugal de 28 a 30 de Setembro de 2000.

Resumo

Os citocromos c3 tetra-hemicos sao pequenas proteınas redox que participam na respi-racao de bacterias redutoras de sulfato. Estas proteınas actuam como transportadoras deelectroes, desempenhando um papel muito importante no metabolismo destas bacterias.Varios estudos tem demonstrado a dependencia entre a reducao dos hemos e a proto-nacao de resıduos ionizaveis nestas proteınas, um fenomeno designado efeito redox-Bohr.O estudo do efeito redox-Bohr, e os grupos nele envolvidos sao o objectivo deste trabalho.

A termodinamica dos processos redox e de protonacao e aqui estudada atraves de doismetodos computacionais teoricos, que usam metodologias de electrostatica contınua. Nosdois metodos e considerado o equilıbrio simultaneo de ligacao de protoes e electroes nestetipo de sistemas. No metodo nao tautomerico os protoes tem uma posicao fixa durantetodo o calculo, considerando-se apenas o equilıbrio de ligacao, enquanto que no metodotautomerico a posicao dos protoes pode variar.

Em todos os citocromos c3 aqui estudados, os propionatos foram os grupos protonaveisque mostraram as maiores variacoes de pKhalf na zona de pH fisiologico, quando a proteınapassa de completamente oxidada para completamente reduzida. Verificou-se tambem quea protonacao dos propionatos apresenta as maiores correlacoes com a reducao dos hemosna zona de pH com interesse fisiologico. Embora os propionatos sejam os grupos maisenvolvidos no efeito redox-Bohr, outros grupos podem tambem ter um papel importante apH fisiologico.

v

Abstract

Tetraheme cytochrome c3 are small redox proteins that participate in the respiration ofsulphate reducing bacteria. These proteins act as electron carriers, having a very importantrole in the metabolism of these bacteria. Several studies have demonstrated the dependencebetween heme reduction and the protonation of protonatable residues, in a phenomenoncalled redox-Bohr effect. The study of the redox-Bohr effect, and of the groups involvedin it is the goal of this work.

The Thermodynamics of redox and protonation processes is here studied using twotheoretical computational methods, which use continuum electrostatic methodologies. Thetwo methods consider the simultaneous binding equilibrium of electrons and protons in thiskind of systems. In the non-tautomeric method, the protons have a fixed position, only thebinding equilibrium being considered, while in the tautomeric methodology their positionis able to change.

In all cytochromes c3 studied here, propionates were the groups that show the largestchanges of pKhalf in the physiological pH region, when the protein passes from fully oxidisedto fully reduced. The protonation of propionates presents the major correlations with hemereduction in the biologically interesting pH region. Although propionates are the majorgroups involved in the redox-Bohr effect, other groups may also have a role at physiologicalpH.

vi

Indice

Agradecimentos iii

Resumo v

Abstract vi

Indice viii

Abreviaturas e Sımbolos ix

1 Introducao 11.1 Aspectos biologicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.1.1 Importancia biologica dos citocromos c3 . . . . . . . . . . . . . . . 11.1.2 Caracterizacao estrutural . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.1.3 Mecanismos de accao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2 A modelacao molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2 Objectivos 6

3 Teoria e Metodos 73.1 Teoria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

3.1.1 Equilıbrio de ligacao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73.1.2 Significado dos diferentes tipos de pK ′s usados . . . . . . . . . . . . 83.1.3 Energia livre electrostatica de ligacao (∆G(n)) . . . . . . . . . . . . 83.1.4 Tipo de electrostatica a usar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103.1.5 Constante dielectrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113.1.6 Sistema tautomerico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123.1.7 Acoplamento entre centros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

3.2 Metodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143.2.1 Preparacao das estruturas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143.2.2 Calculos de electrostatica contınua . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163.2.3 Calculos de Monte Carlo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

vii

Indice

4 Resultados e Discussao 224.1 Comparacao entre os dois metodos: tautomerico versus nao tautomerico . . 224.2 Estudo individual dos diferentes citocromos c3 . . . . . . . . . . . . . . . . 28

4.2.1 Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH) . . . . . . . . . . . . . 284.2.2 Desulfovibrio vulgaris Miyazaki (DvM) . . . . . . . . . . . . . . . . 344.2.3 Desulfovibrio gigas (Dg) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374.2.4 Desulfomicrobium norvegicum (Dmn) . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

4.3 Comparacao entre os diversos citocromos c3 . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

5 Conclusoes 51

6 Perspectivas futuras 52

Bibliography 53

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Abreviaturas e Sımbolos

9Hcc Citocromo c com nove hemos (nine heme cytochrome c)

C-terminal Grupo C-terminal

d Distancia

E Potencial redox

FTIR Espectroscopia de infra vermelho por transformada de Fourier

h Espacamento entre os pontos de uma grelha tridimensional, no metodo dasdiferencas finitas

EPR Ressonancia Paramagnetica Electronica

Hmc Citocromo de elevado peso molecular (high molecular weight cytochrome)

I Forca ionica

m Vector de estados de centro (sistema tautomerico)

n Vector de estados de centro (sistema nao tautomerico)

N-terminal Grupo N-terminal

P Densidade de polarizacao

PA? Propionato A do hemo I, II, III ou IV, dependendo de ?

PD? Propionato D do hemo I, II, III ou IV, dependendo de ?

r Vector posicao

RMN Ressonancia Magnetica Nuclear

T Temperatura absoluta

TRPC Complexo de proteınas redox transmembranares

Wij Energia electrostatica de interaccao entre os centros i e j

ix

Abreviaturas e Sımbolos

ρ Densidade de carga

ε Constante dielectrica

χ Susceptibilidade electrica

φ Potencial electrostatico

µ Momento dipolar

κ Comprimento de Debye invertido

e Carga do protao

kB Constante de Boltzmann

∆G Variacao de energia livre

β 1/kBT

x

Capıtulo 1

Introducao

1.1 Aspectos biologicos

1.1.1 Importancia biologica dos citocromos c3

Os citocromos c3 tetra-hemicos (fig. 1.1) sao proteınas periplasmicas que estao envolvi-das na respiracao de bacterias redutoras de sulfato. A cadeia transportadora de electroesdestas bacterias anaerobias estritas e pouco usual, envolvendo varios citocromos c multi-hemicos [1]. Nestas bacterias, a oxidacao periplasmica de hidrogenio molecular (H2), rea-lizada pelas hidrogenases, esta ligada a reducao de sulfato no citoplasma. A hidrogenaseperiplasmica e um dos parceiros redox biologicos do citocromo c3 [2]. Estes citocromosforam extensivamente estudados, existindo ja um vasto conjunto de dados, nomeadamentecineticos [2–7], estruturais [1, 8–16], teoricos [17–20], termodinamicos [6, 21–30] e estudosde alteracoes conformacionais na oxi-reducao [14,16,31,32].

1.1.2 Caracterizacao estrutural

Os citocromos c3 foram inicialmente isolados na decada de 1950 a partir de duas su-bespecies de Desulfovibrio vulgaris, sendo depois encontradas em todos os organismos per-tencentes a famılia Desulfovibrionaceae, assim como em outras bacterias redutoras de sul-fato [33]. Sao pequenas proteınas soluveis (13.5 a 15 KDa) que contem uma unica cadeiapolipeptıdica (fig. 1.1) com cerca de 110 aminoacidos e quatro hemos do tipo c [1, 8–16].Como se pode ver na figura 1.2, cada hemo e coordenado axialmente por duas histi-dinas, e esta ligado covalentemente a cadeia polipeptıdica por ligacoes tioeter com duascisteınas. Estes citocromos apresentam em geral um grau de similaridade de aproxima-damente 40 % [34], sendo o arranjo espacial dos hemos altamente conservado em todas asproteınas estudadas. Nos resıduos conservados mais importantes encontram-se as histidi-nas axiais, as cisteınas que ligam o hemo a cadeia, algumas lisinas proximas do hemo IVe alguns resıduos aromaticos, fenilalaninas e tirosinas. A diversidade de resıduos em voltade cada hemo leva a que eles tenham potenciais redox diferentes [22,28–30]. O hemo qua-tro (IV) dos citocromos c3 esta rodeado por varios resıduos basicos, nomeadamente lisinas

1

1. Introducao

Figura 1.1: Citocromo c3 de Desulfovibrio vulgaris Miyazaki, evidenciando os hemos e aestrutura secundaria

Figura 1.2: Arquitectura do hemo, mostrando as histidinas axiais e as cisteınas que ligamcovalentemente o hemo a cadeia polipeptıdica

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1. Introducao

que, sendo carregadas positivamente, formam um conjunto caracterıstico na superfıcie damolecula [1,9–11,13,15,16]. Este arranjo e provavelmente responsavel pelo reconhecimentodos seus parceiros redox biologicos [35–38]. Uma caracterıstica interessante e a existencia,em todas as especies, de grupos aromaticos proximos dos hemos e em alguns casos, as his-tidinas axiais encontrarem-se paralelas e, em contacto de Van der Waals com estes gruposaromaticos. No entanto, nao existem dados que provem o envolvimento de tais resıduosna transferencia electronica intra-molecular.

1.1.3 Mecanismos de accao

A primeira evidencia experimental de que o citocromo c3 e o parceiro biologico dahidrogenase periplasmica surgiu ha ja algum tempo [2], tendo estas duas proteınas sido en-contradas no periplasma das bacterias redutoras de sulfato. Este citocromo e rapidamentereduzido na presenca de H2 e hidrogenase, e existem resultados experimentais comprovan-do que existe transferencia electronica entre estas duas moleculas [3, 39, 40]. O hidrogeniomolecular e oxidado pela hidrogenase periplasmica [2], resultando da reaccao dois electroese dois protoes segundo a reaccao reversıvel:

H2 2H+ + 2e−

E possıvel que estas hidrogenases estejam ligadas a um mecanismo conhecido como”ciclo do hidrogenio”, proposto por Odom e Peck [39]. Na figura 1.3 apresentamos umpossıvel mecanismo de accao do citocromo c3 no periplasma. Neste ciclo, os protoes eelectroes resultantes da reaccao de oxidacao de compostos de carbono seriam usados pelashidrogenases citoplasmicas para produzir hidrogenio. Este hidrogenio difunde-se atraves damembrana para o periplasma, onde seria oxidado pela hidrogenase periplasmica a protoes eelectroes. Os electroes seriam translocados para o citoplasma por um complexo de proteınastransmembranares (TRPC) para a reducao de sulfato e o gradiente protonico seria usadopor uma ATPsintetase membranar na sıntese de ATP [39]. Uma vez que o citocromo c3 eo parceiro biologico da hidrogenase periplasmica, existe a possibilidade de ele ser o veıculodos electroes, mas tambem dos protoes [6,27,28], para a reducao de sulfato e formacao deATP, respectivamente. Varios organismos da famılia Desulfovibrionaceae podem crescerusando H2 como unica fonte de energia [41], mostrando que o H2 pode estar ligado aproducao de ATP. Uma explicacao possıvel para o papel do citocromo c3 na transferenciaconjunta de protoes e electroes e a seguinte: a reducao do citocromo quando ele recebe osdois electroes da hidrogenase, pode aumentar os pKa

′s dos grupos da proteına, levando acaptura de protoes. Como resultado do aumento de cargas positivas, o potencial redox doshemos sobe e os electroes sao passados a proteınas transmembranares. Estes electroes saodepois usados na reducao de sulfato [6, 27]. A libertacao dos electroes reverte o processo,diminuindo o pKa dos grupos da proteına. Os dois protoes sao libertados, podendo serusados para formar um gradiente protonico que pode ser usado pela ATPsintetase naformacao de ATP [6, 27]. Este processo em que o pKa dos grupos protonaveis depende dopotencial de reducao, e os potenciais dos grupos redox variam com o pH, e um fenomeno

3

1. Introducao

Figura 1.3: Parte da cadeia de transferencia electronica em bacterias redutoras de sulfato

que foi designado de redox-Bohr [42, 43]. E possıvel que este fenomeno ajude a explicara forma pela qual os electroes e protoes sao transferidos de/e para o citocromo c3 [6].Recentemente foram realizados estudos por modelacao da interaccao do citocromo c3 deDesulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 com a [NiFe] - hidrogenase periplasmica do mesmoorganismo [38]. Neste estudo verificaram que as solucoes com menor energia correspondiama interaccao do hemo IV do citocromo c3 com o agregado [4Fe-4S] da [NiFe] - hidrogenase.A transferencia electronica devera ser eficiente nesta interaccao, mostrando que o hemo IVesta envolvido na transferencia de electroes entre estas duas moleculas [38]. Os citocromosc3 nao interagem unicamente com a hidrogenase periplasmica. Ha duas moleculas queparecem interagir com o citocromo c3 no periplasma, o Hmc e o 9Hcc [37, 40, 44]. Foiproposto que o 9Hcc fosse colocado na famılia do Hmc, devido a homologia existente entreo 9Hcc e a regiao C-terminal do Hmc [44], e pelo facto de o Hmc nao ser encontradona especie onde se isolou 9Hcc, Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774. Apesar de naose saber muito sobre estas duas proteınas, estudos cineticos de transferencia electronica[40] mostram que a reducao do Hmc pela hidrogenase e mediado pelo citocromo c3. Poroutro lado, a interaccao especıfica entre o citocromo c3 e o 9Hcc foi prevista por estudosde modelacao molecular [37], existindo a possibilidade deste, assim como o Hmc, estarenvolvido na transferencia electronica atraves da membrana.

4

1. Introducao

1.2 A modelacao molecular

A modelacao molecular e uma area relativamente recente que estuda o comportamentode moleculas ou sistemas moleculares, usando modelos matematicos combinados com leisfısicas. Esta area evoluiu rapidamente nos ultimos anos, devido nao so ao aumento do podercomputacional, nomeadamente a velocidade de processamento, mas tambem ao desenvol-vimento de algoritmos computacionais mais eficientes. Estes dois factores possibilitaramque as simulacoes se tornassem mais realistas, permitindo uma melhor parametrizacao,juntamente com uma diminuicao no tempo de calculo. No entanto, o tempo de calculoainda e uma limitacao em algumas aplicacoes. O desenvolvimento de modelos teoricoscapazes de estudar fenomenos de protonacao e reducao em proteınas nao e um interesserecente. Ao longo do tempo, os estudos em proteınas foram incluindo a previsao de valoresde pKa [45–48], o calculo de curvas de estabilidade dependentes do pH [48, 49] e estudosde acoplamento entre processos protonaveis e redox [17,19,20,50–52]. Para se estudar estetipo de sistemas sao precisos modelos que descrevam as propriedades quımico-fısicas dasmoleculas em solucao aquosa. E para se compreender as propriedades em solucoes aquosase preciso desenvolver modelos que caracterizem o soluto (proteına), o solvente (agua) e asinteraccoes entre eles [53], particularmente as de natureza electrostatica. Os fenomenos re-dox e de protonacao aqui estudados sao essencialmente de natureza electrostatica. Quandose estuda este tipo de processos por modelacao molecular, deparamo-nos com algumas di-ficuldades. Estes fenomenos deveriam ser estudados, estritamente, por mecanica quantica,mas tal ainda nao e possıvel para proteınas, que tem um grande numero de atomos. Pa-ra estes sistemas com muitos atomos, podemos no entanto, fazer calculos relativos. Estescalculos podem ser relativos a compostos modelo em solucao (por exemplo o uso do pKmodno calculo do pKa), e podem ser relativas entre si (por exemplo potenciais redox relativosaos diferentes hemos do citocromo c3). Para se fazer este tipo de calculos electrostaticos,normalmente utilizam-se metodos de electrostatica contınua, que assume que estes siste-mas podem ser modelados usando constantes dielectricas. Isto e uma aproximacao, e existeainda uma grande controversia relativamente ao valor a usar para a constante dielectricana proteına [54]. Diferentes investigadores usam diferentes valores para esta propriedade,mas o valor usado neste trabalho e as suas razoes irao ser discutidas no capıtulo da Teoriae Metodos. Uma outra dificuldade com que nos deparamos em electrostatica contınua, e ofacto de a proteına ser tratada de uma forma rıgida, o que pode causar alguns problemas,quando queremos seguir, por exemplo, alteracoes conformacionais.

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Capıtulo 2

Objectivos

Com este trabalho pretende-se, principalmente, fazer dois estudos distintos. O primeiropretende entender fenomenos fısico-quımicos que ocorrem na proteına e que podem estarna base da sua funcao biologica. O segundo e um estudo comparativo de dois metodosteoricos que sao usados para os calculos do primeiro objectivo. O fenomeno redox-Bohrvai ser estudado em quatro citocromos c3 diferentes, tentando-se identificar os grupos queestao envolvidos directa e/ou indirectamente com ele. Este fenomeno ira ser estudadoatraves de metodologias computacionais teoricas que servirao para determinar os pKa

′s deresıduos protonaveis, os potenciais de reducao de cada hemo, assim como a sua ordem dereducao em cada molecula, comparando-se posteriormente com resultados experimentais[22,28–30]. As estruturas dos citocromos c3 estudados pertencem aos seguintes organismos:Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH) [10], Desulfovibrio vulgaris Miyazaki (DvM)[9], Desulfovibrio gigas (Dg) [13], Desulfomicrobium norvegicum1 (Dmn) [11].

O outro objectivo do trabalho e comparar duas metodologias. Uma vez que o estudoengloba titulacao protonica, e tendo em conta que as estruturas de cristalografia de raio-Xnao tem protoes, estes tem de ser adicionados. No metodo que nao usa tautomeros (verTeoria e Metodos), os hidrogenios adicionados podem ter uma unica posicao, ou podemter uma posicao deslocalizada. Este posicionamento depende nao so das condicoes em quea molecula foi cristalizada, como tambem da pessoa que esta a fazer o posicionamento. Nasegunda metodologia os melhoramentos consistem na inclusao, nos calculos electrostaticos,de moleculas de agua cristalograficas de uma forma nao rıgida, e o tratamento dos resıduostitulaveis, bem como alcoois, sob a forma de tautomeros [52]. Este tratamento de resıduossob a forma de tautomeros permite simular uma situacao mais realista em que os protoesnao estao fixos e podem mudar de posicao a medida que o estado de protonacao da moleculavaria (ex. quando um acido desprotona).

1Este pode ainda ser encontradocom os nomes: Desulfovibrio desulfuricans Norway 4, Desulfomicrobiumbaculatos ou Desulfovibrio baculatum.

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Capıtulo 3

Teoria e Metodos

3.1 Teoria

3.1.1 Equilıbrio de ligacao

Se considerarmos uma proteına como tendo N centros titulaveis (protonaveis e/ou re-dox), o estado de ligacao e descrito como um vector (n) com N componentes (n1, n2, . . . , nN),onde ni = 0 ou 1 indicam se o centro i esta desprotonado/reduzido ou protonado/oxidado,respectivamente [19,49]. Um estado e uma combinacao do conjunto de centros titulaveis deuma proteına, cada um na sua forma carregada ou neutra. A probabilidade de ocorrenciade (ou a fraccao de moleculas com) um estado de ligacao n, em condicoes de equilıbriotermodinamico, e dada por

p(n) =exp [−2.3nppH + βenoE− β∆G(n)]∑n′ exp

[−2.3n′ppH + βen′oE− β∆G(n′)

] (3.1)

onde np e o numero total de centros protonados no estado n, pH = − log aH+ (onde a e aactividade do protao), β = 1/(kBT ), e e a carga protonica, no e o numero total de centrosoxidados no estado n, E e o potencial electrostatico e ∆G(n) e a energia livre padrao dareaccao de ligacao 0 → n. Assim, os centros redox sao implementados considerando umformalismo baseado na oxidacao, em vez de na reducao, em que ni = 1 corresponde aoestado oxidado [19]. Esta conveniencia de tratar o estado oxidado como o estado ocupado,leva a que a ocupacao do centro redox seja feita por uma carga positiva (oxidao e+), quenao afecta em nada a validade da eq. (3.1). Um oxidao e como um electrao, mas com umacarga positiva. Quando so existem centros redox, o primeiro termo das exponenciais (nonumerador e no denominador) da eq. (3.1) desaparece; se so existem centros protonaveisdesaparece o segundo termo. Se tivermos um metodo que calcule os valores da energialivre de ligacao para cada estado n, a equacao anterior pode ser usada directamente numaamostragem dos varios estados usando, por exemplo, um metodo de Monte Carlo [55]. Comisto podemos fazer uma amostragem dos estados de protonacao e oxidacao do sistema avarios valores de pH e potencial [19,52]. A partir deste calculo, podemos calcular todas as

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3. Teoria e Metodos

propriedades termodinamicas do sistema. Quando o numero de centros e pequeno, pode-sefazer um calculo exacto da probabilidade de todos os estados n do sistema.

3.1.2 Significado dos diferentes tipos de pK ′s usados

Esta seccao tem como objectivo esclarecer o significado de alguns pK ′s usados, nomea-damente a diferenca entre um tipo de pK usado em cada um dos metodos e o pKhalf . Umavez que os dois metodos tem estados de referencia diferentes, definiram-se duas constan-tes distintas. Para o metodo nao tautomerico, o estado de referencia e o neutro [45], e aconstante e pK int (definida a seguir). No metodo tautomerico, o estado de referencia e ocarregado [52] e a constante e pKcrg (ver definicao a seguir). O pKhalf corresponde ao valorde pH quando a titulacao do centro em questao esta metade ocupada [45], e poder-se-iaperguntar porque e que nao se usa pKa em vez de pKhalf . O pKa nao pode ser usado emproteınas, pois os valores tabelados referem-se aos resıduos em solucao ou ao seu compostomodelo, e nao a um resıduo particular de uma proteına particular. Se um centro protonavelestiver numa zona apolar da proteına, a forma carregada nao ira ser favoravel comparadacom a mesma situacao em solucao, onde pode ser estabilizada pelas moleculas de agua domeio. Assim, um grupo cationico/anionico inserido numa regiao apolar, da proteına, vaiter um pKa, geralmente, mais baixo/elevado do que o mesmo composto modelo em solucao.Por outro lado, na proteına existe acoplamento entre grupos titulaveis devido a interaccoeselectrostaticas. Desta forma, o pK de cada centro protonavel depende do estado de todosos outros na proteına, que tambem sao afectados pelo pH. O pKhalf nao vai depender deum unico equilıbrio quımico, como o pKa, mas de varios. Vamos primeiro falar dos centrosprotonaveis, e depois generalizar para os centros redox. O pKmod e a constante da reaccaode protonacao/desprotonacao do composto modelo (fig. 3.2) em solucao [56]. Seguidamen-te ha o pK int que consiste no pK do centro dentro da proteına, quando todos os outrosestao fixos no seu estado neutro [19]. Temos depois uma constante tambem intrınseca, masusada no metodo tautomerico, e corresponde ao pK do centro dentro da proteına, quandotodos os outros estao fixos no seu estado carregado e denomina-se pKcrg [52]. Relativa-mente aos centros redox, a situacao e em tudo analoga, mas no entanto o programa usadopara calcular os termos de energia individuais (que dependem apenas de um centro) e ostermos que dependem de pares de centros, (ver subsec. 3.1.3 deste capıtulo), foi concebidoapenas para centros protonaveis. Assim, para que o programa (MEAD versao 1.1.8 [45])tenha em conta os centros redox, precisamos converter os potenciais redox em unidadesde pK, e isso e conseguido atraves da expressao de equivalencia pK= −eEβ/2.3. Para osresıduos redox, o estado neutro e o estado reduzido, uma vez que eles sao tratados comocationicos [52].

3.1.3 Energia livre electrostatica de ligacao (∆G(n))

Por uma questao de simplicidade, vamos tratar apenas os centros protonaveis. Umcentro protonavel e um grupo anionico ou cationico que pode desprotonar ou protonar numcerto intervalo de pH. Neste estudo, um centro protonavel pode ser qualquer aminoacido

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3. Teoria e Metodos

Asol + H+∆G◦sol(AH,A)−−−−−−−→ AsolH

∆G◦(sol,prot)

(AH)

y y∆G◦(sol,prot)

(A)

Aprot + H+ −−−−−−−−→∆G◦prot(AH,A)

AprotH

Figura 3.1: Ciclo termodinamico usado para calcular a energia livre de solvatacao.

com uma cadeia lateral protonavel e os grupos C- e N-terminal. Devido ao uso de equacoeslineares, e possıvel decompor as diferentes contribuicoes energeticas numa soma de termosque dependem apenas de um centro, e aqueles que dependem de pares de centros [53]. Paraos termos que so dependem de um centro, onde i = j, a energia de solvatacao correspondea diferenca de energia devido a transferencia de um grupo de um meio dielectrico paraoutro (ex. da agua para a proteına). As contribuicoes energeticas relativas aos termosque dependem de pares de centros, onde i 6= j, correspondem as interaccoes directas entreos grupos carregados i e j da proteına. Agrupando todas as contribuicoes, temos entaoque a diferenca de energia livre entre o estado de protonacao n e o estado completamentedesprotonado pode ser escrita como

∆G(n) = −2.3β∑i

nipKint

i +1

2

∑i

∑j

(ninj + niz◦j + njz

◦i )Wij (3.2)

onde o pK int e o pK intrınseco do centro i, e z◦i e a carga do centro i na forma despro-tonada [49]. O primeiro termo da eq. (3.2) refere-se a energia de solvatacao e pode sercalculado com a ajuda de um ciclo termodinamico, como o da figura 3.1 [45], que envolveo carregamento e descarregamento do centro em diferentes meios. Neste ciclo, AsolH e Asol

representam o centro na forma protonada e desprotonada em solucao, e de forma analogaAprotH e Aprot representam, na proteına, o centro na forma protonada e desprotonada.A energia livre de solvatacao inclui a interaccao da carga com a polarizacao que a cargainduz na sua vizinhanca, e a interaccao da carga com a densidade de carga ionica queela induz no solvente [53]. Quando o resıduo isolado da proteına e usado como modelo(fig. 3.2) , a constante de ligacao do protao em solucao - pKmod, e assumida como sendo opK da reaccao horizontal superior da figura 3.1 (∆Gsol(AH,A)), obtido experimentalmente.A constante de ligacao do protao no interior da proteına, reaccao horizontal inferior dafigura 3.1 (∆Gprot(AH,A)), pode ser determinada tendo em conta as restantes tres reaccoesdo ciclo termodinamico

pK int = pKmod +β

2.3(∆Gsol,prot(A)−∆Gsol,prot(AH)) (3.3)

Atraves do ciclo termodinamico (fig. 3.1) obtemos entao o termo para a diferenca de energiaapos transferencia de um grupo do solvente para a proteına [49,53].

O segundo termo da eq. (3.2) descreve-nos as interaccoes directas entre diferentes gruposcarregados da proteına

Wij = wpij(1, 1)− wp

ij(1, 0)− wpij(0, 1) + wp

ij(0, 0) (3.4)

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3. Teoria e Metodos

Figura 3.2: Modelo usado no calculo das energias livres electrostaticas (Adaptado de [45]

onde wij(ni, nj) e a energia de interaccao electrostatica entre os centros i e j no estadode ligacao ni e nj, respectivamente (a deducao do Wij pode ser encontrada na literatura[49]). Os quatro termos da eq. (3.4) representam as combinacoes dos possıveis estados deprotonacao do par de centros (p.e. wij(1,1) da-nos a energia de interaccao electrostaticaquando os dois centros estao protonados). Para os grupos redox, o raciocınio e o mesmo.

3.1.4 Tipo de electrostatica a usar

Para o calculo de interaccoes electrostaticas, poderıamos usar a expressao fundamentalda electrostatica - a lei de Coulomb (eq. 3.5 superior) [57]1, ou a equacao de Poisson (eq. 3.5inferior)

φ =q

εdou

∇2φ(r) =−4πρ(r)

ε(3.5)

Estas equacoes relacionam a variacao espacial do potencial φ com a posicao d/r para a cargaq/distribuicao da densidade de carga ρ, onde a constante dielectrica relativa, ε, e uniforme[58]. A densidade de carga (ρ), e a carga media num ponto particular como resultadoda distribuicao das cargas microscopicas causado por movimentos atomicos [53]. No caso

1O sistema de unidades electrostaticas aqui usado e o Gaussiano. Neste sistema o factor de conversaoSI 1/(4πε0), nao aparece na equacao de Coulomb, e o factor 1/ε0 da equacao de Poisson e substituıdo por4π

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3. Teoria e Metodos

particular do vacuo, a constante dielectrica relativa e 1. A partir do momento em que omeio deixa de ser uniforme, comecando a surgir polarizacoes entre o soluto e o solvente, aeq. (3.5) deixa de ser valida [59]. Desta forma, o campo electrico produzido pela moleculadepende nao so da distribuicao de cargas, como tambem da forma da superfıcie [57, 59].Assim a constante dielectrica deixa de ser uniforme, tornando-se tambem uma funcao der, e a equacao de Poisson, para meios nao homogenios, passa a ser a usada [53,58,60,61]

∇·(ε(r)∇φ(r)) = −4πρ(r) (3.6)

Esta equacao nao permite tratar a presenca de contra-ioes e, para se tratar o efeito ionico,e necessario considerar a equacao de Poisson-Boltzmann [53, 61], apresentada na eq. (3.7)sob a sua forma linear

∇·(ε(r)∇φ(r))− κ2(r)φ(r) + 4πρ(r) = 0 (3.7)

onde

κ2 =8πe2I

kBT(3.8)

em que κ e o comprimento de Debye invertido modificado, e e a carga elementar, I e aforca ionica, kBT e a constante de Boltzmann e T e a temperatura absoluta. Nos casos emque κ e zero, ou seja na ausencia de ioes (I = 0), a eq. (3.7) reduz-se a equacao de Poisson.ε e κ sao funcao de r, tendo portanto em conta a forma da superfıcie molecular (dentroε=εin, fora ε=εout) e a zona de exclusao ionica (dentro κ = 0, fora κ = eq. (3.8)).

3.1.5 Constante dielectrica

Esta quantidade tem originado grande controversia entre diversos investigadores , re-lativamente ao valor a usar para simular o interior da proteına. Isto deve-se ao facto dea constante dielectrica depender das propriedades que usamos para a definir [54]. A cons-tante dielectrica macroscopica (ε), e uma medida da resposta (compensacao) duma dadaregiao quando exposta a um campo electrico externo [53]. As propriedades dielectricas dosmateriais resultam da orientacao de dipolos a nıvel molecular, podendo estes ser de doistipos: permanente e induzido. O primeiro e devido a distribuicao assimetrica de cargas nasmoleculas (ex.: a molecula de agua). Devido a liberdade da agua em solucao, quando seaplica um campo electrico a molecula ira reorientar-se, e a sua resposta ao campo aplicadosera tanto maior quanto maior for a constante dielectrica [53]. Os dipolos induzidos sao de-vidos a polarizacao electronica (distorcao de nuvens electronicas pelo campo electrico) [53],neste caso campos electricos causados por diferentes partes do sistema molecular. Para si-mular o solvente, que no presente caso e a agua, o valor da constante dielectrica e 80.Que valor se deve usar entao para modular as proteınas? Poder-se-ia usar um valor de 2,uma vez que o interior das proteınas e maioritariamente constituıdo por grupos apolares.Contudo, as proteınas nao tem apenas resıduos interiores (maioritariamente apolares), asuperfıcie das proteınas e populada por varios grupos polares e carregados que se podemorganizar na presenca de um campo electrico, pelo que uma constante dielectrica de 2 nao

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3. Teoria e Metodos

consegue modular convenientemente a proteına. Assim, mesmo que o uso de um valor deconstante dielectrica mais elevada (15-20) [19,20,48,49,51,52] para o interior da proteına serquestionavel em termos fısicos, verificou-se uma melhoria nos resultados quando se modelapK ′s experimentais. Tal deve-se possivelmente a natureza exposta de resıduos ionizadosem proteınas, podendo existir no entanto outras explicacoes. Constantes dielectricas destaordem podem compensar o tratamento incompleto da energia de reorganizacao de dipolosda proteına [54]. Estudos de dinamica molecular (MD) [62, 63] apontam para dielectricoselevados para as proteınas, facto que pode ser devido aos dipolos de grupos ionizaveis asuperfıcie da proteına.

3.1.6 Sistema tautomerico

Um centro tautomerico e um centro em que um protao pode ter posicoes alternativas.Quando se fazem simulacoes de equilıbrio protonico, os protoes podem ser tratados dediferentes formas. Para um dado grupo protonavel, podemos atribuir uma carga media aforma protonada [20, 45, 48, 64] ou colocar o protao numa dada posicao, apropriada paraum determinado estado de protonacao [20, 47]. Em qualquer um dos casos anteriores, oprotao e colocado numa posicao fixa ao longo de todo o calculo, nao variando com o es-tado dos grupos vizinhos. Assim sendo, um modelo em que fosse permitido aos protoesmudarem a sua posicao ao longo das variacoes do estado de protonacao da proteına se-ria uma forma mais correcta de tratar o sistema. Se tomarmos o exemplo de um acidocarboxılico, o protao pode ter diferentes posicoes (oxigenio O1 ou O2), dependendo estasdo estado de todos os outros centros da proteına. Num sistema tautomerico, o estadode ocupacao n ja nao da uma descricao completa do estado de protonacao, uma vez queos estados protonado e desprotonado de cada ni podem ter mais do que uma forma [52].O estado de protonacao passa entao a ser completamente representado como um vectors = (s1, s2, . . . , sN), onde si pode ter tantos valores quanto o total de estados protonadose desprotonados. Se tomarmos como exemplo um acido, existem no total tres estadospossıveis, dois estados protonados, em que o protao pode estar em O1 ou em O2 da ca-deia lateral, e um desprotonado. Uma forma de abordar este problema consiste em definirum sistema equivalente nao tautomerico de pseudo-centros que mantenha as propriedadesdo sistema tautomerico original. Este sistema equivalente pode entao ser estudado comos metodos descritos acima. Designando o estado de ocupacao deste sistema equivalentenao tautomerico como m (semelhante a n), e necessario definir a transformacao s → me ∆G(m) de forma que p(s) = p(m) [52]. Se decompusermos cada centro tautomericonum conjunto de pseudo-centros nao tautomericos, um por tautomero, a expressao paraas probabilidades sera igual a equacao 3.1, com a diferenca de que teremos m em vez den. Esta igualdade deve ser feita de forma que a energetica original do sistema seja preser-vada, satisfazendo tres condicoes [52]. Em primeiro lugar, e preciso definir um estado dereferencia que, ao contrario do estado completamente neutro para o caso nao tautomerico,vai ser aqui o carregado. Isto porque o estado com todos os pseudo-centros neutros naoesta unicamente definido para os centros protonaveis usualmente encontrados em proteınas(grupos amino, carboxılicos, fenil e tiol tem todos um unico estado carregado, mas varios

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3. Teoria e Metodos

estados neutros), enquanto que o estado carregado esta. Um acido tem uma unica for-ma carregada (desprotonada), mas tem duas formas neutras (uma com o protao em O1e outra com o protao em O2). Segundo, um pseudo-centro nao pode interagir com maisdo que um pseudo-centro no estado carregado de outro centro, e nao pode interagir comnenhum pseudo-centro do seu centro. E ultimo, os centros nao podem ter mais do que umpseudo-centro no estado neutro. A primeira condicao e satisfeita para cada pseudo-centroy usando-se como referencia o pK quando todos os outros centros estao carregados (quandomx 6=y = z◦x + 1, onde z◦y e a carga do centro y no estado desprotonado), que representamospor pKcrg

y . A energia de protonacao correspondente e −2.3kBTpKcrgy , podendo o processo

ser descrito em dois passos

{my = 0,mx 6=y = z◦x + 1} → {mx = 0} → {my = 1,mx 6=y = z◦x + 1} (3.9)

em que o primeiro passo corresponde a uma desprotonacao e o segundo a uma protonacao[52]. Se usarmos a eq. (3.2) para calcular a energia livre de cada um desses passos, obtemos

−2.3kBTpKcrgy = −2.3kBTpK int

y +∑y

(2z◦x + 1)Wij (3.10)

2z◦x + 1 = ±1, depende do pseudo-centro ser cationico ou anionico. Inserindo a eq. (3.10)na eq. (3.2), substituindo n por m e rearranjando os termos obtemos

∆G(m) = −2.3KBT∑x

mxpKcrgx +

1

2

∑x

∑y

(mxmy +mxz∗y +myz

∗x )Wxy (3.11)

onde z∗x = −z◦x − 1. A expressao entre parentesis dentro do somatorio duplo pode serescrita como (my + z∗y )(mx + z∗x ) − z∗y z

∗x , onde o ultimo termo constante nao tem efeito

nenhum sobre as probabilidades. Concentrando-nos entao no primeiro produto, quando umpseudo-centro y esta carregado temos que (my + z∗y ) = 0 e o produto desaparece, podendoassim dois pseudo-centros estarem carregados simultaneamente e nao interagirem [52].Entao, uma vez que a eq. (3.2) e a eq. (3.11) sao formalmente identicas, as metodologiasusadas para o calculo no sistema nao tautomerico podem ser aplicadas aqui [52]. E precisoter em conta as condicoes ja referidas: a) decomposicao de cada centro tautomerico empseudo-centros nao tautomericos, b) redefinicao de tipos de pseudo-centro (z◦x → z∗x ) evalores de pK int (pK int → pKcrg), e c) imposicao de valores elevados para as interaccoesentre pseudo-centros pertencentes ao mesmo centro [52]. Os centros que irao ser tratadoscomo tautomericos incluem todos os resıduos titulaveis (exceptuando os centros redox),os alcoois e a molecula de agua. Para os grupos carboxılicos temos dois tautomeros,um para cada oxigenio da cadeia lateral. Para as aminas, e de forma analoga para osalcoois, consideraram-se tres tautomeros, um para cada mınimo de energia de torcao. Paraa tirosina, apenas se considerou dois tautomeros, colocados nos mınimos de energia dosangulos de torcao. E finalmente para a molecula de agua, poder-se-ia considerar inumerostautomeros, mas por uma questao de simplicidade nos calculos, apenas se consideraramseis. Para nao permitir que os alcoois e a agua desprotonassem, foi-lhes atribuıdo uma

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3. Teoria e Metodos

constante de dissociacao elevada - pKmod, de forma que os protoes da cadeia lateral dosalcoois e os protoes da molecula de agua pudessem variar a sua posicao, mas impedindoque os grupos desprotonassem.

3.1.7 Acoplamento entre centros

Uma forma de medir o acoplamento entre centros da proteına e analisar a magnitude dasenergias livres de interaccao (Wij da eq. (3.4)). Isto indica-nos uma medida de quanto umaalteracao num estado de ligacao de um centro afecta o estado de ligacao de outro centro deuma forma directa. A interaccao directa e obviamente uma contribuicao importante parao acoplamento entre dois centros, mas esta medida ignora a existencia de efeitos indirectosatraves de outros centros cujo estado de ligacao pode alterar-se de uma forma concertadae complexa [19]. A tendencia de dois centros terem estados de ligacao iguais ou opostose determinado por efeitos directos e indirectos entre eles [19]. Uma forma de incluir osefeitos indirectos e calcular o equilıbrio resultante e as correlacoes entre diferentes estadosde ligacao [19]. Esta correlacao e dada para um par de centros (i, j) como funcao dasvariancias e covariancias para os seus estados de ligacao

cij =cov(ni, nj)√

[var(ni)var(nj)](3.12)

A correlacao entre dois centros nao e uma constante do sistema, como as interaccoesdirectas, mas uma funcao do pH e do potencial [19]. A analise de acoplamentos entreestados baseados nas correlacoes estatısticas nao estao limitadas a pares de centros, po-dendo tambem ser aplicadas para estudar o acoplamento entre grupos de centros, comopor exemplo, o total de protoes e total de electroes.

3.2 Metodos

3.2.1 Preparacao das estruturas

As estruturas usadas para os calculos foram obtidas por cristalografia de raio-X, eretiradas de uma base de dados (Protein Data Bank) [65]. Estas estruturas nao contemprotoes, pois a resolucao da cristalografia de raio-X de proteınas nao e suficiente paraos identificar. Sendo assim, e uma vez que este estudo trata de titulacao protonica, elesprecisam de ser adicionados. A forma como os protoes sao adicionados e colocados paracada metodo e descrita a seguir.

Posicionamento de protoes no metodo nao tautomerico

A colocacao de protoes nas estruturas de cristalografia e de extrema importancia, poisexistem casos em que a colocacao do protao nao e unica. Se virmos o exemplo de umresıduo acıdico (que e titulavel), o protao pode estar num dos dois oxigenios da cadeia

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3. Teoria e Metodos

lateral, e a colocacao num ou no outro pode dar origem a constantes de dissociacao (pK)bastante diferentes. O mau posicionamento dos hidrogenios pode levar a redes de pontes dehidrogenio incorrectas [66], influenciando os estados dos resıduos vizinhos. Os protoes quetem apenas uma configuracao possıvel foram adicionados usando o programa GROMOS87 [67], considerando os centros na sua forma carregada. Seguidamente, posicionaram-seos protoes que tem liberdade conformacional (pertencentes a resıduos polares e aminas)com o programa WHATIF [68] que implementa um potencial empırico para as ligacoes dehidrogenio e metodologias de optimizacao para a rede de pontes de hidrogenio [69]. Final-mente foram posicionados os protoes dos acidos, seguindo a mesma metodologia usada paraos protoes com alguma liberdade conformacional. Em todos os casos, o posicionamento foiverificado visualmente, e corrigido sempre que necessario.Em alguns casos, existem dife-rentes possibilidades para colocar o protao. Nos acidos, o protao pode estar num oxigenio(O1), ou no outro (O2) ou, pode estar dividido entre os oxigenios da cadeia lateral (verexemplo a seguir). No primeiro caso isto acontece quando existe por exemplo, um grupohidroxido de uma serina proximo do O1 da cadeia lateral do acido, sendo mais favoravelo hidrogenio estar no O2. No segundo caso, podemos ter um grupo que esta de tal formaposicionado (em frente do acido, equidistante dos oxigenios), que e indiferente o protaoestar no O1 ou no O2. Se nao existirem outras interaccoes com esse acido, o protao vaiestar em media dividido pelos oxigenios carboxılicos desse acido, sendo a carga do protaodividida pelos oxigenios O1 e O2. Este diferente tratamento da protonacao e distinguidoexplicitamente no calculo dos pK int e dos Wij. Assim, temos protonacao tratada expli-citamente (no caso um) e protonacoes tratadas em media (caso dois). O tratamento decentros protonaveis desta forma, gera algumas dificuldades, pois em alguns casos sabemoscom certeza onde o protao esta, e noutros casos nao sabemos, pois o protao pode estar emqualquer um dos oxigenios (considerando um acido). O programa MEAD usa as cargas eraios atomicos provenientes do programa GROMOS 87. As cargas atomicas de cada atomopodem ser encontradas nas tabelas 2, 3 e 4 de [19].

Posicionamento de protoes no metodo tautomerico

Quando se usam tautomeros, o problema de nao saber onde posicionar o protao ja naose coloca, assim como nao precisamos assumir nenhuma posicao para o protao, pois estemetodo permite que a posicao dos hidrogenios varie ao longo do pH. Assim, o sistema esimulado com maior realismo, uma vez que a posicao do protao dos grupos protonaveispode variar com as alteracoes do estado dos grupos vizinhos. A adicao dos atomos dehidrogenio as estruturas cristalograficas foi feita de forma a que os protoes pudessem serusados posteriormente nos calculos tautomericos. Da mesma forma que na seccao ante-rior, os atomos de hidrogenio sem liberdade conformacional foram adicionados usando oGROMOS 87 [67], assumindo que todos os centros estao na forma protonada. Quandoos protoes tem liberdade conformacional (todos os centros, exceptuando His e Arg), a suacolocacao e feita tendo em conta as conformacoes em que os diedros estao no seu mınimode energia [52]. Para ter em conta geometrias de tautomeros alternativos, os hidrogeniosforam adicionados da seguinte forma. No caso dos carboxılicos (Asp, Glu e C-terminal) o

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3. Teoria e Metodos

Figura 3.3: Elemento de volume cubico associado a um ponto da grelha (subscrito 0). Noponto medio de cada linha, esta um valor de constante dielectrica, ε. O potencial φ, e oparametro de Debye-Huckel κ, estao associados com o centro do cubo [59]

protao adicional foi colocado no carboxılico livre. Nas Tyr, o protao adicional foi colocadono oxigenio fenılico, fazendo um angulo de 180◦ com aquele que e colocado automaticamen-te pelo GROMOS, sendo posicionado no mesmo plano que o anel aromatico. Os alcoois,Ser e Thr, tem dois protoes adicionais que sao colocados no oxigenio hidroxılico, fazendoum angulo de 120◦ com aquele que e introduzido pelo GROMOS. Apesar da agua poderter inumeros tautomeros, este metodo considera apenas seis (para simplicidade de calculo),que se obtem distribuindo um protao por cada vertice de um tetraedro centrado no atomode oxigenio.

3.2.2 Calculos de electrostatica contınua

O metodo das diferencas finitas

O metodo utilizado pela grande parte dos programas para resolver a equacao de Poisson-Boltzmann na sua forma linear, e o metodo das diferencas finitas. Neste metodo usa-seuma grelha cubica regular de espacamento h [59], e a precisao do calculo e tanto melhorquanto menor e o h [57]. A cada ponto e atribuıdo um valor para a densidade de carga,constante dielectrica e forca ionica segundo a eq. (3.7) [58, 59]. Integrando a equacao dePoisson-Boltzmann ao longo do volume de um cubo de lado h (fig. 3.3), obtemos

h∑

εi(φi − φ0)− h3κ20φ0 + 4πq0 = 0 (3.13)

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3. Teoria e Metodos

Tabela 3.1: Valores de pKmod e Emod usados para calcular a energia livre de um estado deligacao. Excepto o Emod (ultima linha da tabela) que tem unidades de potencial (mV), ospK ′s estao em unidades de pK. A coluna da esquerda para o metodo nao tautomerico e ada direita para o metodo tautomerico.

centro pKmod pKmod

Arginina 12.00 12.00Lisina 10.40 10.88Tirosina 9.60 9.30N-terminal 7.50 7.98Histidina 6.30 7.00,6.60Propionato 4.75 4.45Glutamato 4.40 4.10Aspartato 4.00 3.70C-terminal 3.80 3.50Hemo -203.82 -203.82

onde q e a carga total fixa dentro do elemento volume. Se resolvermos a eq. (3.13) emordem a φ0 obtem-se

φ0 =

∑εiφi + 4πq0∑εi + κ2

0h2

(3.14)

E feita uma estimativa inicial para o potencial em todos os pontos da grelha e seguida-mente fazem-se iteracoes ate que a variacao do potencial seja mınima [59], e portanto oprocedimento numerico tenha convergido.

Calculo dos pK int e das interaccoes entre resıduos

Os valores para os pK ints e interaccoes sao calculados pelo programa MEAD [45, 70],que usa o metodo das diferencas finitas descrito anteriormente para resolver a eq. (3.7).Este programa requer os valores de pKmod (tab. I) para cada centro.

Exceptuando os acidos propionicos (propionatos), cujo valor utilizado foi o pKa ex-perimental do acido acetico [71], os valores para o pKmod foram retirados de Nozaki eTanford [56]. O Emod foi calculado atraves do metodo nao tautomerico usando um hemoligado a um octapeptido [72], obtido a partir do citocromo c de cavalo. A partir de umpotencial obtido experimentalmente [73], e usando o mesmo sistema retirado do citocromoc de cavalo, modelamos o valor do Emod que melhor reproduzia o valor experimental. Nometodo tautomerico foram usados os pK ′s de Bashford et al . [45] para as histidinas, e ascorreccoes entropicas necessarias para os centros podem ser encontradas em Baptista eSoares [52].

Relativamente as moleculas de agua, estas foram escolhidas de acordo com a sua aces-sibilidade individual ao solvente e consideradas apenas aquelas com acessibilidade relativa

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3. Teoria e Metodos

inferior a 0.5 [52]. As acessibilidades sao calculadas usando o programa ASC [74, 75]. Asuperfıcie molecular da proteına e calculada pelo MEAD, rolando uma esfera de raio 1.4Aao longo de toda a proteına [76]. A espessura da zona de exclusao ionica (ver fig. 3.2)para alem da superfıcie molecular da proteına e de 2.0 A. A constante dielectrica usadapara a regiao do solvente foi 80. Para simular o interior da proteına, usou-se uma constantedielectrica de 15 [19] para o metodo em que nao se consideram tautomeros, e 20 [52] parao metodo tautomerico. A forca ionica usada foi 100 mM e a temperatura foi 300 K. Parafazer os calculos, foi usado um sistema de focagem em dois passos [77]: no primeiro usamosuma grelha cubica de 80 Ade lado com espacamento entre pontos de 1.0 A, centrada naproteına. No segundo passo foi usada uma grelha cubica com 20 Ade lado e espacamentode 0.25 Aentre pontos, centrada no centro titulavel. O composto modelo tem o mesmotratamento, mas com grelhas de 60 Ae 15 Ade lado, respectivamente. Na metodologia emque foram usados tautomeros, a excepcao da primeira grelha usada para a proteına, quefoi de 90 Ade lado (o sistema e um pouco maior, devido a inclusao explicita de moleculasde agua), as restantes grelhas tem as mesmas caracterısticas. O tempo de calculo para umcaso tıpico no sistema nao tautomerico e cerca de uma hora, e para o sistema tautomericoe de aproximadamente vinte e seis horas, num pentium III 500 MHz e 256 Mb de memoriaRAM.

3.2.3 Calculos de Monte Carlo

Depois de termos os pK int (ou pKcrg) e as energias de interaccao entre pares de centroscarregados, podemos calcular a probabilidade de cada estado de ligacao ao longo de umintervalo de pH e potencial electrostatico. Esta amostragem vai permitir-nos obter todosos dados termodinamicos para caracterizar o sistema, como por exemplo, a variacao dopotencial de reducao de um centro redox ao longo do pH ou a curva de titulacao de umcentro protonavel. Se o numero de centros titulaveis e inferior a 25, e possıvel tratar-seo sistema com um calculo exacto. No entanto, quando se tratam proteınas com muitoscentros titulaveis, os calculos tornam-se muito demorados, dada a dependencia exponencialdo tempo relativamente ao numero de centros. Para ultrapassar esta limitacao, foi propostoum metodo de Monte-Carlo [55], capaz de tratar um elevado numero de centros e, noentanto, com erros de amostragem muito baixos. Neste metodo, os estados sao amostradoscom probabilidade dada pelo factor de Boltzmann normalizado pa = exp [−βG(a)] /Z, comZ =

∑a exp [−βG(a)]. Desta forma, apenas os estados mais provaveis sao amostrados,

diminuindo consideravelmente o seu numero relativamente a quantidade total de estados.

Sistema nao tautomerico

Os centros redox podem ser facilmente incluıdos no formalismo protonico. Por conve-niencia, adoptou-se um formalismo baseado na oxidacao, em vez de baseado na reducao,onde ni = 1 correspondera ao estado oxidado [19]. Os valores de pK int e Wij calculadospelo MEAD sao usados pelo programa de Monte-Carlo (MC) para calcular a energia deestados [19]. Este metodo de MC segue o criterio de Metropolis [78] para aceitar ou re-

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3. Teoria e Metodos

jeitar alteracoes de estado. Neste criterio, em vez de se fazer uma seleccao aleatoria doscentros individuais e pares como em [55], as seleccoes dos centros para troca foram feitassequencialmente para aumentar a velocidade dos calculos [19]. Partimos de um estado deprotonacao escolhido ao acaso, gerando-se depois estados sucessivos. Para cada um dosnovos estados gerados, e calculada a diferenca de energia (∆U), relativamente ao estado deprotonacao anterior. Se a variacao de energia e negativa, ∆U ≤ 0, o novo estado e aceite;caso a variacao de energia seja positiva, ∆U > 0, entao o novo estado e aceite com umaprobabilidade exp{−∆Uβ}. No nosso caso, a energia U e o termo dentro da exponencialda equacao 3.1. As alteracoes sao simples trocas do estado de protonacao ou reducao0 1 de grupos individuais. O algoritmo de MC pode nao ser eficiente quando se tratamgrupos fortemente acoplados, pois so permite a troca, para um estado de protonacao, entreestados amostrados sucessivos. Isto pode levar a barreiras energeticas entre estados debaixa energia, semelhantes ao exemplo dado a seguir. Considerando uma proteına comdois centros fortemente acoplados com valores de pK int iguais, os estados [1,1] e [0,0] saoenergeticamente desfavoraveis, comparados com os estados [1,0] e [0,1] [55]. Uma vez queos estados de baixa energia sao os mais provaveis, se tivermos um algoritmo que apenastroque um centro de cada vez, para passarmos de [1,0] para [0,1], terıamos necessariamentede passar por um estado de elevada energia [1,1] ou [0,0], cuja probabilidade de ocorrere baixa. Assim, para se verificar a troca entre os estados [1,0] e [0,1], sao precisas duastransicoes, onde uma delas passaria por um estado intermediario de elevada energia ([1,1]ou [0,0]). Para que alguns centros nao tenham uma amostragem ineficiente, sao permi-tidas transicoes duplas [55], apenas para pares que tenham acoplamentos superiores a 2unidades de pH [19]. Assim nao ha necessidade de passar por estados de alta energiaOscalculos foram realizados num intervalo de pH e potencial electrostatico que variaram entre-5 e 25 com intervalos de 0.2, e -700 e 300 com intervalos de 10 mV, respectivamente. Assimulacoes foram feitas a temperatura de 300 K, e cada corrida de MC consistiu em 40000passos (para as medias), onde cada passo e definido como um ciclo completo de trocas sobretodos os centros individuais e pares acoplados. Cada simulacao para calculo de correlacoesfoi feito com 106 passos de MC, uma vez que para esta propriedade os erros sao maiores doque para os valores medios. Cada calculo completo de medias e correlacoes tem a duracaode dois dias, num pentium III 500 MHz e 256 Mb de memoria RAM.

Sistema tautomerico

Apesar do formalismo anterior poder ser utilizado no metodo que inclui o tratamento detautomeros, o seu uso pode trazer alguns problemas praticos. Em primeiro lugar, as variasalteracoes de estado so podem ocorrer atraves de trocas de varios pseudo-centros [52]. Is-to porque a alteracao entre tautomeros neutros de um dado centro requer que o correntepseudo-centro ocupado se torne vazio, e que o correspondente ao novo tautomero se torneocupado. Se um algoritmo de MC com trocas duplas para centros fortemente acopladosfor usado, os pseudo-centros do mesmo centro tautomerico irao ser seleccionados para mo-vimentos duplos de MC [52]. Apesar do uso de movimentos duplos para pseudo-centros,tornando possıvel a tautomerizacao, a ocorrencia de todas as variantes de movimentos

19

3. Teoria e Metodos

duplos envolvendo dois centros so sera possıvel com movimentos de ordem superior. Porexemplo, se tivermos dois centros com tres tautomeros neutros cada um, iremos precisar demovimentos multiplos que envolvam todos os seis pseudo-centros. Desta forma e possıvela tautomerizacao, com o inconveniente dos calculos se tornarem muito demorados, devi-do a natureza tautomerica dos pseudo-centros que leva a muitos movimentos multiplosinuteis [52]. Estes movimentos apesar de serem eliminados devido ao uso de elevadosWij consomem muito tempo de processador, especialmente se as moleculas de agua saoincluıdas nos calculos como centros tautomericos. Uma forma de resolver este inconveni-ente e transformando a amostragem de estados de centros. Inicialmente esta era feita emtermos de centros vazios ou ocupados (0 ou 1), existindo apenas um estado neutro e umcarregado. Agora e feita tendo em conta o numero total de estados neutros e carregadospara cada centro. Para o caso de um acido, por exemplo, temos tres estados, dois neutros(com o protao em cada um dos oxigenios da cadeia lateral) e um carregado (sem protao).Dividindo entao a eq. (3.11) em termos de centros tautomericos

∆G(m) =∑i

[−2.3KBT

∑x∈i

mxpKcrgx

]+

1

2

∑i

∑j

[∑x∈i

∑y∈j

(mxmy +mxz∗y +myz

∗x )Wxy

](3.15)

A equacao foi entao rearranjada de forma a que um estado s correspondesse um estado mparticular, e trocando para estados s, rescreveu-se a equacao anterior como ∆G(s)

∆G(s) =∑i

gi(si) +1

2

∑i

∑j 6=i

gij(si, sj) (3.16)

onde gi e gij foram definidos como

gi(si) = −2.3KBT∑x∈i

mxpKcrgx +

1

2gii(si, si) (3.17)

gij =∑x∈i

∑y∈j

(mxmy +mxz∗y +myz

∗x )Wxy (3.18)

Se usarmos a eq. (3.16) nos calculos de MC, em vez da eq. (3.11), conseguimos uma amos-tragem em termos de estados s mais eficiente, diminuindo tambem o tempo de calculo cercade 10 vezes [52]. Esta simplificacao pode seleccionar apenas estados s validos, tornandodesnecessario o uso de valores elevados para Wxy entre os pseudo-centros x, y ∈ i [52] . Osegundo termo de gi(si) e excluıdo na eq. (3.17), porque nao contribui para a energia livrede protonacao ∆G(s) [52]. Para todos os centros foram realizados movimentos simples, epara aqueles pares que estavam fortemente acoplados (pelo menos um Wxy > 2 unidades depK) realizaram-se movimentos duplos [52]. Para estes calculos , a temperatura absoluta foide 300 K, e o numero de passos de MC usados para calcular as medias foi de 105, enquantoque para as correlacoes foi de 106 . Para cada especie foram percorridas gamas de pH epotencial distintas (calculadas em blocos). Isto nao interfere com os calculos, e diminui otempo destes. Os intervalos de pH passam a ser de 0.5, e os de potencial de 30 mV, por

20

3. Teoria e Metodos

necessidades computacionais. Para o calculo do potencial de reducao de cada hemo, foirealizada uma corrida adicional em que o pH era de 6.6, valor a que os potenciais de re-ducao foram calculados em todas as especies (com excepcao do citocromo c3 do organismoDmn), e o potencial electrostatico cobria um intervalo de -400 a -50 mV com passos de 10mV. Cada calculo completo de medias e correlacoes tem um perıodo de duracao entre umaa duas semanas, num pentium III 500 MHz e 256 Mb de memoria RAM, dependendo donumero de centros, e principalmente do numero de moleculas de agua.

21

Capıtulo 4

Resultados e Discussao

4.1 Comparacao entre os dois metodos: tautomerico

versus nao tautomerico

Uma vez que a analise dos citocromos c3 dos quatro organismos seria dificultada pelaanalise em simultaneo dos dois metodos usados, iremos fazer uma breve comparacao entreas metodologias, e prosseguir apenas com o estudo dos citocromos utilizando o metodoque trata a molecula como um sistema tautomerico [52]. Uma diferenca que o metodotautomerico tem relativamente ao nao tautomerico, e a posicao alternativa dos protoes,que pode variar a medida que a proteına muda o seu estado de ligacao. Embora estemelhoramento esteja relacionado directamente com os centros protonaveis, alcoois e aguas,os hemos sao tambem influenciados, embora indirectamente. Como exemplo, temos nafigura 4.1 a comparacao entre os dois metodos relativamente as curvas de titulacao redoxdos hemos no citocromo c3 de Dg. Como se pode verificar pelos graficos da figura 4.1, eatraves da tabela 4.1, as ordens de reducao de cada hemo foram correctamente previstasem cada um dos dois metodos [19, 52], quando comparadas com as obtidas atraves deum modelo termodinamico experimental [30]. As diferencas nos potenciais de reducao doshemos sao devidas fundamentalmente a vizinhanca de cada hemo. Proximo dos hemos estaoos propionatos e outros grupos titulaveis que podem, no metodo tautomerico, ter o protaoem posicoes diferentes (no oxigenio O1 ou O2) para estabilizar ou compensar interaccoes oucargas que possam aparecer quando um outro grupo titula. Isto vai influenciar o potencialredox dos hemos de uma forma diferente daquela que se verifica no metodo nao tautomerico,sendo esta uma das razoes para as diferencas observadas. Na figura 4.2 podemos observaras variacoes nas populacoes de formas tautomericas de alguns propionatos ao longo dopH. No PRAIV do citocromo c3 da especie Dg podemos observar uma grande diferenca,relativamente ao local onde o protao esta ao longo do pH. A elevada populacao de moleculascom o protao no O2 e muito proxima de 100 %, e deve-se a presenca de um iao de calciona vizinhanca [13]. Portanto a protonacao deste grupo poderia ser facilmente descritapelo metodo nao tautomerico. Em contraste com esta situacao temos o PRDIV do mesmocitocromo que apresenta duas populacoes distintas de tautomeros, e que variam ao longo

22

4. Resultados e Discussao

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−400 −300 −200 −100

Fra

cção

red

uzid

a

E (mV)

Sem tautómeros

"I""II"

"III""IV""tot"

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−400 −300 −200 −100F

racç

ão r

eduz

ida

E (mV)

Com tautómeros sem H2O

"I""II"

"III""IV""tot"

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−400 −300 −200 −100

Fra

cção

red

uzid

a

E (mV)

Com tautómeros com H2O

"I""II"

"III""IV""tot"

Figura 4.1: Curvas de titulacao pertencentes ao citocromo c3 da especie Dg, nos doismetodos (curvas calculadas a pH 6.6)2. O grafico da esquerda foi calculado com o metodosem tautomeros. O grafico do meio foi calculado com o metodo com tautomeros nos centrosprotonaveis e alcoois, mas nao estao incluıdas aguas. O grafico da direita foi calculado como metodo tautomerico considerando tautomeros nos centros protonaveis, alcoois e aguas.As designacoes “I”, “II”, “III” e “IV”, referem-se aos hemos, e “tot” refere-se a curva detitulacao total da molecula.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−5 −3 −1 1 3 5 7 9

Fra

cção

de

taut

ómer

os

pH

Dg PRAIV

"tit""O1""O2"

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−5 −3 −1 1 3 5 7 9

Fra

cção

de

taut

ómer

os

pH

Dg PRDIV

"tit""O1""O2"

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−5 −3 −1 1 3 5 7 9

Fra

cção

de

taut

ómer

os

pH

Dmn PRDIV

"tit""O1""O2"

Figura 4.2: Exemplo de comportamentos que podemos encontrar nas populacoes tau-tomericas dos propionatos. Cada grafico foi feito a um potencial electrostatico em que ohemo correspondente esta reduzido (no grafico da esquerda e no central, os graficos foramfeitos a um potencial em que o hemo IV do citocromo c3 de Dg esta reduzido, no grafico dolado direito foi tambem feito a um potencial em que o hemo IV do citocromo c3 de Dmnesta reduzido). Nos graficos, a legenda “tit” corresponde a titulacao do resıduo, “O1” apercentagem de populacoes com o protao em O1 e “O2” corresponde a percentagem depopulacoes com o protao em O2.

23


Tabela 4.1: Valores dos potenciais de reducao para os citocromos c3 dos diferentes orga-nismos, no modelo experimental, no metodo nao tautomerico (metodo 1 [19]) e no metodotautomerico (metodo 2 [52]) sem e com moleculas de agua. Os potenciais no modelo expe-rimental sao obtidos a partir de dados experimentais termodinamicos, aplicando-se depoisum modelo de centros em interaccao. As ordens de reducao representadas sao para omodelo experimental, e para o metodo 2 em que as moleculas de agua sao consideradas.

Modelo experimental Metodo 2Organismo Hemos Potenciais ordem Metodo 1 sem agua com agua ordem

DvH HI -302.03 2 -221.39 -219.00 -228.80 2HII -306.71 3 -238.65 -238.80 -239.96 3HIII -335.74 4 -250.21 -242.95 -249.89 4HIV -255.92 1 -190.82 -196.73 -202.59 1

DvM HI -290.62 2 -221.99 -221.70 -228.62 2HII -317.80 3 -224.52 -236.31 -236.61 3HIII -340.00 4 -251.03 -245.76 -249.37 4HIV -262.94 1 -198.95 -203.64 -209.72 1

Dg HI -280.88 4 -243.46 -247.10 -256.80 4HII -275.27 3 -245.82 -242.47 -246.58 3HIII -257.12 2 -220.17 -217.43 -221.77 2HIV -181.60 1 -180.50 -184.72 -186.29 1

Dmn HI -317.93 3 -258.40 -255.72 -263.76 2HII -349.96 4 -275.83 -273.01 -276.95 3HIII -150.01 1 -199.29 -198.52 -204.54 1HIV -279.67 2 -265.65 -272.75 -280.10 4

do pH. As populacoes de tautomeros em O1 e O2 apresentam uma diferenca de cerca de25 % de probabilidade de ocorrencia, antes de se verificar a troca da posicao do protao deO1 para O2 (resultados nao mostrados), enquanto que nos outros citocromos a diferencade probabilidades e aproximadamente 0 %, pois a probabilidade de ter o protao em O1 ouO2 e quase igual. Esta troca nao seria possıvel no metodo nao tautomerico, pois o protaotem uma posicao fixa ao longo do pH.

A troca de populacoes no PRDIV ocorre numa zona de pH (entre -1.5 e 0) em queo PRAIV e o ASP-11 (que juntamente com o PRDIV coordenam um iao de calcio [13])estao a titular (Tabela 4.4 mais a frente). Estas titulacoes vao fazer com que acontecauma troca da posicao do protao (alteracao que podera estabilizar o PRDIV) que naoseria possıvel observar no metodo nao tautomerico [19]. Assim sendo, quando o PRAIVdesprotona, o protao do propionato D do hemo IV muda do O1 para o O2. No PRDIVde Dmn, as populacoes do protao em O1 e O2 mantem-se afastadas ate um ponto (pH 3)onde, pouco antes da titulacao, a populacao O1 (a mais baixa) sofre uma ligeira subida.

24


0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−5 0 5 10 15 20

Fra

cção

de

taut

ómer

os

pH

THR 14

"taut1""taut2""taut3"

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−5 0 5 10 15 20

Fra

cção

de

taut

ómer

os

pH

SER 23

"taut1""taut2""taut3"

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−5 0 5 10 15 20

Fra

cção

de

taut

ómer

os

pH

TYR 65

"taut1""taut2"

"tit"

Figura 4.3: Exemplo de comportamentos que podemos encontrar em alcoois e tirosinas amedida que o estado de protonacao do citocromo c3 varia. Os tres resıduos apresentadospertencem a especie DvH, e a simulacao foi realizada a um potencial em que a moleculaesta completamente reduzida. Na Ser e Thr “taut1”, “taut2” e “taut3” correspondem astres diferentes posicoes que o protao pode adquirir. Relativamente a Tyr, “taut1” e “taut2”correspondem as duas posicoes alternativas que o protao tem, e “tit” corresponde a curvade titulacao deste resıduo.

Isto deve-se a fortes interaccoes, directas e indirectas, entre os propionatos do hemo IV(dados nao apresentados), que fazem com que a titulacao de um dos propionatos influencieo comportamento do outro de forma que as populacoes dos diferentes tautomeros O1 eO2 sejam alteradas. Embora os grupos que contem um hidroxilo na cadeia lateral (Sere Thr), exceptuando o caso da tirosina que e um grupo ionizavel, nao titulem na zonade pH fisiologico (ver Teoria e Metodos), eles tambem sao tratados como tautomeros. Aposicao do protao pode variar ao longo do pH, e com o estado de protonacao da molecula.Adicionalmente, no caso da tirosina este resıduo chega mesmo a desprotonar a partir dedeterminado pH. A figura 4.3 mostra alguns comportamentos exemplo para este tipo degrupos. Com estes graficos podemos ver como e que as probabilidades de cada tautomerovariam ao longo do pH. Qualquer uma das alteracoes verificadas na figura 4.3 ocorremem zonas de pH nas quais resıduos proximos titulam ou alteram as suas interaccoes. Porexemplo, a percentagem de populacoes da Thr-14 no tautomero 2 e superior a 60 % ate pH1, e depois sobe para valores superiores a 80 % na zona de pH 1–5. Analisando a estruturade raio-X [10] e os valores de pKhalf da tabela 4.2 (mais a frente) , atribuiu-se esta alteracaoao PRDIV que esta proximo deste alcool e desprotona nesta zona. Na Ser-23, temos a trocados tautomeros 1 e 3 pelo 2, numa zona de pH acido entre 2 e 4, que neste caso se deve atitulacao do ASP-7 (tab. 4.2).

E interessante ver que quando o ASP-7 titula, existe a troca de 2 tautomeros por 1.

25


taut1

Ser-23

taut2

taut1

Asp-7

taut3

taut2

Figura 4.4: Representacao dos varios tautomeros da SER-23 cuja variacao ao longo dopH esta representada na figura 4.3. Nesta imagem, os nomes “taut1”, “taut2” e “taut3”correspondem aos mesmos nomes no grafico da figura 4.3. O ASP-7 e aqui apresentadopara mostrar que quando este acido esta protonado, o seu protao esta em O2, e que oprotao da serina e mais favoravel em qualquer uma das posicoes “taut1” ou “taut3”.

Isto acontece, porque ate ao acido desprotonar, o protao do ASP-7 esta colocado no O2,dado que a posicao O1 e desfavorecida pela proximidade do N-H da cadeia principal (fig.4.4), e o protao da SER-23 pode estar em “taut1” ou em “taut3”. Apos a desprotonacaodo aspartato, o protao da serina ira preferir a posicao “taut2”, como se pode confirmar nografico da figura 4.3 e figura 4.4. Para finalizar apresentamos o caso de uma tirosina, naqual se observam alteracoes das populacoes tautomericas num intervalo de pH em que ha atitulacao do PRDIV. Quando este acido titula, verifica-se que uma das populacoes e maisprovavel que a outra, subindo ate alcancar uma probabilidade de 80 % que se mantem ateao ponto em que perde o protao.

As moleculas de agua podem ajudar a estabilizar cargas e interaccoes da mesma formaque os outros tautomeros. As moleculas podem alterar a sua configuracao em diversosintervalos de pH, e de acordo com o pH onde ocorre a modificacao das probabilidades decada tautomero da molecula de agua, podemos sugerir que tipo de grupo (acido, histidinas,

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0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−5 0 5 10 15 20

Fra

cção

de

taut

ómer

os

pH

HOH 127

"taut1""taut2""taut3""taut4""taut5""taut6"

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−5 0 5 10 15 20

Fra

cção

de

taut

ómer

os

pH

HOH 170


0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−5 0 5 10 15 20

Fra

cção

de

taut

ómer

os

pH

HOH 121 (molécula oxidada)


0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−5 0 5 10 15 20

Fra

cção

de

taut

ómer

os

pH

HOH 121 (molécula reduzida)


Figura 4.5: Tipos de resposta que as moleculas de agua podem ter com as variacoes depH e potencial. As moleculas de agua aqui apresentadas pertencem ao citocromo c3 deDvH. Os graficos das aguas 127 e 170 foram feitos aos potenciais -220 e -190mV (tab. 4.1),respectivamente, e os graficos da agua 121 foram feitos a potenciais em que a moleculaesta completamente oxidada e completamente reduzida.

N-terminal, lisinas, tirosinas) sofreu variacoes no seu estado. Na figura 4.5, apresentam-se alguns graficos que pretendem mostrar os diferentes tipos de comportamento que umamolecula de agua pode ter no interior da proteına. Comecando pela agua 127, verifica-seque, apos uma aparente estabilidade de populacoes de tautomeros antes da zona acida,as primeiras alteracoes surgem a pH 5, voltando a aparecer novas alteracoes a pH 14. Osgrupos que provocam estas diferencas sao o PRDI e a Tyr-65, cujos pKhalf (tab. 4.2) estaonas zonas de pH em que se verificam as alteracoes nas populacoes, e estao proximos dessaagua [10]. A agua 170 esta proxima do propionato A do hemo IV, existindo neste caso

27


uma troca de tautomeros quando o acido titula. Esta troca de tautomeros vai estabilizaro acido que desta forma pode estabelecer uma ponte de hidrogenio com a agua 170. Amolecula de agua 121 e aqui apresentada a dois potenciais distintos, para mostrar queo comportamento das moleculas de agua tambem e afectado pelo estado de reducao daproteına. Esta molecula de agua esta sobre o plano de um hemo bastante proximo, sendotalvez essa a razao pela qual o seu comportamento seja tao influenciado pelo estado redox.

Como se pode ver pelos resultados apresentados nesta seccao, o metodo tautomerico[52] mostrou que o tratamento dos varios grupos titulaveis, alcoois e de moleculas deagua, e mais correcto atraves de tautomeros. Este metodo trata o sistema de uma formamais detalhada, sendo este detalhe muitas vezes necessario. Desta forma, quando algunsgrupos perdem o protao, o sistema pode ser estabilizado mudando a configuracao de gruposvizinhos aquele em que se verificou a alteracao. Por exemplo, consideremos o caso em quetemos um acido e um alcool a superfıcie, e que o acido interage com um grupo interno.Enquanto o acido estiver protonado, o protao do acido vai estar do lado oposto a interaccao,com o grupo interno, tornando difıcil a interaccao com o alcool. Quando o acido perdero protao, o alcool vai poder interagir livremente com ele, facto que se perderia assumindoum estado de protonacao inicial para colocacao dos protoes, como e o caso do metodo semtautomeros [19].

4.2 Estudo individual dos diferentes citocromos c3

4.2.1 Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH)

Titulacoes redox

Observando o grafico de titulacao redox total da figura 4.6, podemos ver que o potencialmostra uma forte dependencia do pH. A media que o pH diminui, podemos observar que ascurvas de titulacao vao sofrendo variacoes para valores de potencial redox mais elevados.Isto advem do facto de a pH baixos, os grupos protonaveis terem maior probabilidade deestarem ocupados, aumentando a carga positiva da molecula e facilitando assim a capturaelectronica, que ocorre a potenciais mais elevados (menor concentracao de electroes emsolucao). Este citocromo c3 apresenta grandes variacoes na superfıcie de titulacao redoxcaracterısticos do efeito redox-Bohr. Estas variacoes aparecem sempre que existem grandesalteracoes no estado de protonacao da proteına. Para esta molecula, podemos ver tresvariacoes, duas significativos entre pH 1–8 e pH 10–15, e uma mais pequena entre pH 16–17, o que esta de acordo com calculos teoricos anteriores [19]. A primeira destas variacoesencontra-se numa zona em que os resıduos que estao a titular sao os acidos, o N-terminale a histidina; no segundo temos as lisinas, a arginina e algumas tirosinas, e no ultimoesta a tirosina 65. Se analisarmos o grafico relativo aos Ehalf (fig. 4.6), as variacoes dopotencial de reducao ocorrem nas mesmas zonas em que se verificam as variacoes no graficocorrespondente a titulacao redox total (fig. 4.6), que e onde se verificam as alteracoesno estado de protonacao da proteına mais significativas. Esta interdependencia entre acaptura electronica e protonica aparece sempre que grupos redox e protonaveis coexistam

28


Titulação redox total

05

1015

20pH−600 −400 −200 0 200E (mV)

0

1

2

3

4

Nº electrões

−450

−400

−350

−300

−250

−200

−150

−100

−50

0

0 5 10 15 20

E (

mV

)

pH

Ehalf

"I""II"

"III""IV"

Figura 4.6: O grafico da esquerda representa a titulacao redox total da molecula a medidaque se varia o potencial electrostatico e o pH. O grafico da direita e relativo a variacao dopotencial de reducao de cada hemo ao longo do pH. Este potencial que varia ao longo dopH e o potencial a que o hemo tem em media meio electrao.

na mesma molecula [19, 20, 64]. Apesar de o fenomeno redox-Bohr surgir em diferenteszonas, apenas nos interessam aquelas que tem interesse biologico. Assim sendo, o efeitoredox-Bohr vai ser estudado em volta de pH 7 (proximo do fisiologico destas bacterias), eassim concentramo-nos no estudo da primeira variacao.

Ordens de reducao

Se analisarmos a titulacao redox a um unico pH (o escolhido foi 6.6), obtemos curvasde titulacao que podem ser comparadas com resultados experimentais de RMN [28]. Osdados obtidos por RMN sao usados num modelo constituıdo por quatro grupos redox e umgrupo protonavel [21,25] (vou referir-me a este modelo como “modelo experimental”). Nafigura 4.7 temos as curvas de titulacao de cada hemo e da molecula, para o nosso modeloteorico (grafico da esquerda) e para o modelo termodinamico experimental (grafico da di-reita). Pode-se ver que existem algumas diferencas entre as curvas de titulacao calculadaspelo modelo termodinamico experimental e pelo nosso metodo. A partir do modelo expe-rimental, verificou-se que os segundo e terceiro hemos a reduzirem (ver ordem de reducaona Tabela 4.1) mostram curvas de declive acentuado indicativas de cooperatividade positi-va [28]. A cooperatividade positiva pode ser explicada por uma alteracao conformacional(que nao pode ser facilmente incluıda na corrente metodologia teorica [19,52]) induzida poruma mudanca no estado redox dos hemos I e/ou II [28]. Alteracoes conformacionais indu-zidas por reducao foram ja observadas, nestes citocromos, em estudos de RMN [14,16] e emestudos de dinamica molecular [18]. Quando dois hemos reduzem a potenciais de reducaomuito proximos um do outro (ex. no modelo experimental deste organismo (Tab. 4.1)),

29


Tabela 4.2: Valores de pKhalf para diferentes grupos protonaveis do citocromo c3 de DvHquando a molecula esta completamente oxidada e reduzida. Grupos de interesse estao emnegrito.

Residuo Reduzido Oxidado variacao Residuo Reduzido Oxidado variacaoNTALA-1 7.670 7.333 0.337 HIS-67 8.687 7.964 0.723LYS-3 10.758 10.551 0.207 ASP-71 -0.262 -0.630 0.368ASP-7 3.079 2.724 0.355 LYS-72 10.755 10.229 0.526LYS-10 12.088 11.855 0.233 LYS-75 11.635 11.359 0.276GLU-12 4.202 4.144 0.058 LYS-77 12.480 12.080 0.400LYS-15 10.742 10.612 0.130 GLU-85 2.900 2.616 0.284LYS-26 10.972 10.778 0.194 ASP-90 2.160 2.067 0.093LYS-29 11.606 11.395 0.211 LYS-93 12.046 11.897 0.149ASP-32 3.519 2.969 0.550 LYS-94 10.572 10.474 0.098LYS-40 10.897 10.762 0.135 LYS-95 11.574 11.420 0.154GLU-41 4.045 3.689 0.356 ASP-96 1.718 1.483 0.235ASP-42 1.543 0.981 0.562 LYS-101 11.266 11.093 0.173TYR-43 12.453 11.618 0.835 LYS-102 10.924 10.849 0.075ARG-44 13.963 13.668 0.295 LYS-104 12.413 12.032 0.381LYS-45 12.685 12.284 0.401 GLU-107 3.976 3.863 0.113ASP-53 2.505 2.285 0.220 CTGLU-107 1.953 1.747 0.206ASP-56 1.778 1.702 0.076 PRA-112 3.733 3.117 0.616LYS-57 11.173 10.882 0.291 PRD-113 6.180 4.776 1.404LYS-58 11.310 11.275 0.035 PRA-114 3.114 2.348 0.766ASP-59 3.218 3.064 0.154 PRD-115 4.684 4.211 0.473LYS-60 13.464 13.183 0.281 PRA-116 4.762 3.503 1.259LYS-63 12.222 11.870 0.352 PRD-117 4.927 4.507 0.420TYR-65 16.051 15.218 0.833 PRA-118 3.811 3.307 0.504TYR-66 11.129 9.713 1.416 PRD-119 3.351 1.885 1.466

isto indica que eles reduzem quase em simultaneo, e que a molecula passa do estado dereducao um para o estado de reducao tres, nao havendo populacao significativa no esta-do de reducao com dois electroes [19, 28]. As curvas obtidas atraves dos nossos metodosnao tem um declive tao acentuado como as observadas no modelo experimental. Assim,nao foi possıvel detectar fenomenos de cooperatividade positiva, que sao raros de observarcom este tipo de metodologias que tratam as proteınas como moleculas semi-rıgidas. Aordem de reducao de todos os hemos foi correctamente prevista, de acordo com resultadosteoricos anteriores [19], como pode ser visto na tabela 4.1. Mesmo nao conseguindo preverfenomenos de cooperatividade positiva, os metodos aqui usados provaram ser eficazes naprevisao das ordens de reducao, sendo esta IV, I, II e III, do primeiro hemo a reduzir para

30


0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−500 −400 −300 −200 −100 0

Fra

cção

red

uzid

a

E (mV)

Tautómeros

"I""II"

"III""IV""tot"

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−500 −400 −300 −200 −100 0

Fra

cção

red

uzid

a

E (mV)

Modelo termodinâmico experimental

"I""II"

"III""IV""tot"

Figura 4.7: Comparacao das curvas de titulacao teoricas e experimentais pertencentes aocitocromo c3 de DvH. Cada um dos graficos foi realizado a pH 6.6. As designacoes “I”,“II”, “III” e “IV”, referem-se aos hemos, e “tot” refere-se a curva de titulacao total damolecula.

o ultimo.

Acoplamento entre grupos

As correlacoes entre o numero total de protoes e o numero total de electroes (de hemosreduzidos) formam superfıcies onde podemos estudar o acoplamento global entre os gruposprotonaveis e os grupos redox. Olhando para a figura 4.8, conseguimos detectar zonas deelevadas correlacoes, que correspondem a intervalos de pH e potencial em que os centrosprotonaveis e redox estao a protonar e reduzir, respectivamente [19]. Estas zonas surgemem intervalos de pH e potencial electrostatico em que os grupos protonaveis e redox estao atitular, de forma analoga ao que ja foi visto para a titulacao redox total. Estas superfıciessao outra forma de caracterizar o efeito redox-Bohr, que surge sempre que grupos pro-tonaveis e grupos redox coexistem na mesma molecula [18–20]. Observando a superfıcieda figura 4.8, vemos que as correlacoes so sao elevadas em determinadas zonas de pH epotencial; correspondendo a primeira zona a titulacao dos acidos, a seguinte a titulacaode lisinas e a ultima a titulacao das tirosinas. Entre as zonas de titulacao dos acidos edas lisinas, podemos encontrar as titulacoes do N-terminal e da histidina livre. Para faci-litar a analise do acoplamento entre centros individuais, diminuindo tambem o numero degraficos a serem apresentados, iremos restringir-nos apenas as correlacoes com diferentesgrupos que os diferentes hemos tem ao longo do pH no seu Ehalf (fig. 4.6). Este estudo

31


Correlação total

−600−400

−2000

200E (mV)

05

1015

20pH

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Correlação

Figura 4.8: Correlacao entre o numero total de protoes e o numero total de electroes nocitocromo c3 de DvH para diferentes valores de potencial e pH. Na base estao representadascurvas de isocorrelacao, que correspondem a linhas onde a correlacao e a mesma, e de forapara dentro tem os valores 0.1, 0.2 e 0.3.

vai permitir saber quais os grupos que mais interagem com cada hemo, directa e indirec-tamente, indicando-nos tambem os possıveis grupos envolvidos no efeito redox-Bohr. Nafigura 4.9 temos as correlacoes de cada hemo ao longo do seu Ehalf (fig. 4.6). Nos graficosapresentados para as correlacoes entre pares de centros, consideram-se apenas pares comvalores absolutos superiores a 0.1, uma vez que abaixo deste valor existem demasiadas cor-relacoes que dificultariam a analise e que nao sao muito importantes. Podemos observar,na figura 4.9, que em alguns propionatos a correlacao nao e unicamente um pico estreito,mas sim um pico alargado. Isto pode ser uma consequencia do efeito redox-Bohr, comoproposto em [19]. Quando existem grandes variacoes de pKhalf e/ou Ehalf (tabela 4.2 egrafico dos Ehalf da figura 4.6), as correlacoes entre grupos podem alargar-se por zonas depH mais amplas. Tal verificou-se no PRDIV em que a correlacao se prolonga cerca de umaunidade de pH abaixo e duas unidades de pH acima do intervalo de valores de pKhalf entre osquais este propionato varia. Para este citocromo c3, os resıduos que se encontram na zonade interesse (em redor de pH 7) sao o N-terminal, a histidina livre e todos os propionatoscom excepcao do PRAI e PRAII (ver tambem a tabela 4.2), o que esta de acordo com osresultados obtidos por [19]. De acordo com os graficos da figura 4.9, e tendo em conta azona de pH fisiologico, os grupos de maior relevancia sao o PRDI, PRDII, N-terminal eHis-67. Isto esta de acordo com estudos teoricos realizados anteriormente [18–20], que pro-puseram os mesmos grupos como os possıveis resıduos envolvidos no fenomeno redox-Bohr,com excepcao de Baptista et al . [19] que foi o unico a propor o PRDII. Embora todos estescentros possam estar relacionados com o fenomeno, aquele que tem uma maior variacao(tab. 4.2) no intervalo de interesse biologico e o PRDI, podendo ser por esta razao umdos mais importantes. Alem dos resıduos ja mencionados, poderao existir outros gruposenvolvidos no fenomeno. Como sugerido em [18], estudos de mutagenese dirigida [79] mos-traram que grupos carregados na vizinhanca dos propionatos podem afectar fenomenos decooperatividade e o efeito redox-Bohr. Relativamente ao acoplamento entre centros redox,

32


0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Cor

rela

ção

�

pH

Hemo I

II

IIIPrAI

PrDI

Nt

Y43

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Cor

rela

ção

�

pH

Hemo II

D42PrAII

PrDII

PrDI H67 I

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Cor

rela

ção

�

pH

Hemo III

PrAIII

PrDIII I

IV0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Cor

rela

ção

�

pH

Hemo IV

PrDIV

PrAIV III

Y66

Figura 4.9: Correlacoes que cada hemo tem com os grupos que o envolvem no citocromoc3 de DvH. As linhas finas referem-se a correlacoes negativas (entre dois sites redox) e aslinhas grossas e tracejadas correspondem a correlacoes positivas (entre grupos protonaveise redox). Estas correlacoes sao feitas a valores de potencial em que os hemos tem emmedia meio electrao, ou seja, ao longo de cada linha do grafico dos Ehalf da figura 4.6.Os intervalos em que se verificam correlacoes equivalem a pontos em que os centros redoxestao a reduzir e os protonaveis estao a protonar.

observam-se correlacoes entre os pares I-II, I-III e III-IV, os quais correspondem a hemosadjacentes (dos pares adjacentes da molecula, falta apenas o par II-IV). A correlacao entreos pares I e II nao e elevada, mas no entanto, segundo [19], a correlacao poderia tornar-sepositiva se estes metodos fossem capazes de seguir alteracoes conformacionais.

33



05

1015

20pH−600 −400 −200 0 200E (mV)

0

1

2

3

4

Nº electrões

−450

−400

−350

−300

−250

−200

−150

−100

−50

0

0 5 10 15 20

E (

mV

)

pH

Ehalf

"I""II"

"III""IV"


4.2.2 Desulfovibrio vulgaris Miyazaki (DvM)

Titulacao redox

Esta molecula e muito semelhante a anterior (DvH), possivelmente porque pertencem amesma especie (Desulfovibrio vulgaris). O grafico da titulacao redox total de DvM, mostravariacoes em zonas de pH e potencial redox identicas aquelas encontradas na subespecietratada em 4.2.1. Como se pode ver na figura 4.10, existem duas variacoes significativasentre pH 1–8 e pH 11–15, e uma mais pequena a volta de 16. O aspecto geral do graficoda figura 4.10 parece manter-se relativamente ao da figura 4.6, podendo verificar-se queas variacoes caracterısticas do efeito redox-Bohr surgem nos mesmos pontos. A primeiravariacao pode ser atribuıda a titulacao dos grupos acıdicos e do N-terminal; a segunda quevai entre pH 11 e 15 corresponde a titulacao das lisinas e tirosinas, com excepcao da Tyr-65que e a responsavel pela terceira variacao a pH 16 (ver pKhalf na tabela 4.3). Pelo graficodos Ehalf da figura 4.10, pode-se verificar que o potencial de reducao dos varios hemos sofregrandes variacoes em zonas de pH onde ha grandes alteracoes do estado de protonacao e dereducao da proteına. O efeito redox-Bohr pode, mais uma vez, ser identificado em variaszonas de pH, mas apenas iremos analisar o intervalo com interesse biologico.

Ordens de reducao

As curvas de titulacao redox de cada hemo e da molecula, juntamente com o modelo ter-modinamico experimental estao representadas na figura 4.11. Os dois graficos apresentamdiferencas, nomeadamente no declive de algumas curvas. As curvas de titulacao dos hemos

34


Tabela 4.3: Valores de pKhalf para diferentes grupos protonaveis do citocromo c3 de DvMquando a molecula esta completamente oxidada e reduzida. Grupos de interesse estao emnegrito.

Residuo Reduzido Oxidado variacao Residuo Reduzido Oxidado variacaoNTALA-1 7.475 7.312 0.163 HIS-67 9.122 8.432 0.690LYS-3 10.670 10.490 0.180 ASP-71 0.543 -0.022 0.565ASP-7 2.808 2.444 0.364 LYS-72 10.748 10.551 0.197LYS-10 11.184 10.870 0.314 LYS-75 11.819 11.544 0.275ASP-12 3.270 3.229 0.041 LYS-77 12.485 12.070 0.415LYS-13 11.951 11.571 0.380 GLU-85 2.189 1.826 0.363LYS-15 10.804 10.709 0.095 ASP-90 3.444 3.367 0.077LYS-26 10.856 10.648 0.208 LYS-93 13.642 13.301 0.341LYS-29 11.898 11.533 0.365 LYS-94 10.819 10.708 0.111ASP-32 2.906 2.305 0.601 LYS-95 10.740 10.557 0.183LYS-40 10.645 10.535 0.110 GLU-96 2.041 1.760 0.281GLU-41 4.182 3.769 0.413 LYS-101 10.654 10.550 0.104TYR-43 12.822 11.908 0.914 LYS-104 11.831 11.380 0.451LYS-45 12.584 12.176 0.408 CTSER-107 2.994 2.777 0.217ASP-53 1.507 1.242 0.265 PRA-112 4.184 3.657 0.527ASP-56 3.031 2.959 0.072 PRD-113 6.063 4.455 1.608LYS-57 11.627 11.289 0.338 PRA-114 3.791 3.039 0.752LYS-58 10.713 10.689 0.024 PRD-115 3.392 2.939 0.453ASP-59 2.938 2.733 0.205 PRA-116 4.254 2.904 1.350LYS-60 13.517 13.140 0.377 PRD-117 4.309 3.804 0.505LYS-63 12.085 11.679 0.406 PRA-118 4.366 3.821 0.545TYR-65 16.879 15.428 1.451 PRD-119 2.482 0.981 1.501TYR-66 11.158 9.802 1.356

I e II, do modelo termodinamico experimental, apresentam declives acentuados indicativosde cooperatividade positiva [29], mas com os nossos metodos as curvas tem um declivemenos acentuado. Mais uma vez, as metodologias aqui usadas foram capazes de prevercorrectamente todas as ordens de reducao da molecula quando comparadas com as obtidasexperimentalmente [29]. As ordens de reducao dos hemos obtidas para este citocromo, nosnossos metodos, foram do primeiro a capturar um electrao ao ultimo: IV, I, II e finalmenteIII.

35


0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−500 −400 −300 −200 −100 0

Fra

cção

red

uzid

a

E (mV)

Tautómeros

"I""II"

"III""IV""tot"

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−500 −400 −300 −200 −100 0

Fra

cção

red

uzid

a

E (mV)


"I""II"

"III""IV""tot"

Figura 4.11: Comparacao das curvas de titulacao teoricas e experimentais pertencentes aocitocromo c3 de DvM. Cada um dos graficos foi realizado a pH 6.6. As designacoes “I”,“II”, “III” e “IV”, referem-se aos hemos, e “tot” refere-se a curva de titulacao total damolecula.


Comecando pelo acoplamento entre o numero total de protoes e de electroes (fig. 4.12),podemos observar que ha tres zonas onde existe forte acoplamento entre estes dois grupos.As elevadas correlacoes, indicativas do efeito redox-Bohr, verificam-se nas mesmas areasde pH e potencial electrostatico que no citocromo c3 de DvH, como se pode comprovaranalisando as figuras 4.8 e 4.12. A primeira zona com elevadas correlacoes corresponde atitulacao dos acidos, a segunda as lisinas e algumas tirosinas e a ultima a uma tirosina, aTyr-65. A titulacao do N-terminal e da histidina livre encontram-se entre as duas primeiraszonas de elevadas correlacoes. As correlacoes entre pares de centros (fig. 4.13) foram feitasao longo do Ehalf (fig. 4.10 do lado direito) dos diferentes hemos. De forma analoga aoque foi observado no ponto 4.2.1, os hemos mostram elevadas correlacoes com pelo menosum dos seus propionatos. A titulacao do propionato D do hemo I apresenta uma extensacorrelacao com o proprio hemo. Podemos ver que o grupo N-terminal nao surge nascorrelacoes com o hemo I, sugerindo que ele nao esta envolvido no efeito redox-Bohr. Talpode dever-se ao N-terminal estar mais afastado desse hemo do que no citocromo c3 deDvH [9], existindo menor interaccao. Os grupos com maiores correlacoes na gama de pHcom importancia biologica (em volta do pH fisiologico, proximo de 7) e o PRDI e a His-67.Assim sendo, o grupo que esta mais implicado no fenomeno redox-Bohr e o PRDI, pois eo grupo que maiores correlacoes apresenta, de acordo com resultados experimentais [26] e

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Correlação total

−600−400

−2000

200E (mV)

05

1015

20pH

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Correlação

Figura 4.12: Correlacao entre o numero total de protoes e o numero total de electroes nocitocromo c3 de DvM para diferentes valores de potencial e pH. Na base estao representadascurvas de isocorrelacao, que correspondem a linhas onde a correlacao e a mesma , e de forapara dentro tem os valores 0.1, 0.2 e 0.3.

com calculos teoricos [20], embora a His-67 tambem possa ter alguma participacao. Quantoas correlacoes entre pares de sites redox, observa-se o mesmo tipo de comportamento queem DvH, nomeadamente as correlacoes entre os pares de hemos adjacentes I-II, I-III eIII-IV.

4.2.3 Desulfovibrio gigas (Dg)

Titulacao redox

Analogamente ao que aconteceu nos citocromos anteriores, verificou-se que as curvasde titulacao (paralelas ao E) mostram fortes variacoes ao longo do pH (fig. 4.14). A mediaque o pH diminui, podemos observar que as curvas de titulacao vao sofrendo variacoespara valores de potencial redox mais elevados. Isto advem do facto de a pH baixos, osgrupos protonaveis terem maior probabilidade de estarem ocupados, aumentando a cargapositiva da molecula e facilitando assim a captura electronica, que ocorre a potenciais maiselevados (menor concentracao de electroes em solucao). Este citocromo mostra, em geral,apenas duas variacoes em comparacao com as anteriores que apresentavam tres. Estasvariacoes ocorrem em intervalos de pH entre 2–7 e 11–14. A primeira variacao correspondea titulacao dos acidos, e a segunda a titulacao das lisinas e das tirosinas, como se podever na tabela 4.4. No grafico da figura 4.14 que mostra a variacao do Ehalf ao longo dopH, podemos ver que as alteracoes do potencial de reducao dos hemos coincidem com asvariacoes verificadas para o grafico da titulacao redox total da mesma figura, e que estessurgem em zonas de pH onde ha grandes alteracoes do estado de protonacao do citocromoc3. Da mesma forma que nos pontos 4.2.1 e 4.2.2, o fenomeno redox-Bohr manifesta-se emregioes de pH semelhantes. Aqui iremos apenas investigar aquela que mais interesse possuido ponto de vista biologico (em volta de pH 7).

37


0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Cor

rela

ção

�

pH

Hemo I

E41PrAI

PrDI

IIIII

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Cor

rela

ção

�

pH

Hemo II

H67PrDI

PrAII

PrDIII

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Cor

rela

ção

�

pH

Hemo III

PrAIII

PrDIII I

IV0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Cor

rela

ção

�

pH

Hemo IV

Y66

PrAIV

PrDIV

III

Figura 4.13: Correlacoes que cada hemo tem com os grupos que o envolvem no citocromo c3

de DvM. As linhas ponteadas referem-se a correlacoes negativas (entre dois sites redox) e aslinhas a cheio e tracejadas correspondem a correlacoes positivas (entre grupos protonaveise redox). Estas correlacoes sao feitas a valores de potencial em que os hemos tem emmedia meio electrao, ou seja, ao longo de cada linha do grafico dos Ehalf da figura 4.10.Os intervalos em que se verificam correlacoes equivalem a pontos em que os centros redoxestao a reduzir e os protonaveis estao a protonar.

Ordens de reducao

As curvas de titulacao redox para este citocromo estao representadas na figura 4.15 on-de, de forma semelhante aos citocromos anteriores, se verificam diferencas entre as curvasde titulacao realizadas pelo nosso metodo e pelo modelo termodinamico experimental [30].A primeira reducao neste citocromo, do hemo IV, ocorre a potenciais elevados, relativa-mente ao que se verifica para os outros hemos. O elevado potencial deste hemo e devido

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05

1015

20pH−600 −400 −200 0 200E (mV)

0

1

2

3

4

Nº electrões

−400

−350

−300

−250

−200

−150

−100

−50

0

50

0 5 10 15 20

E (

mV

)pH

Ehalf

"I""II"

"III""IV"


0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−500 −400 −300 −200 −100 0

Fra

cção

red

uzid

a

E (mV)

Tautómeros

"I""II"

"III""IV""tot"

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−500 −400 −300 −200 −100 0

Fra

cção

red

uzid

a

E (mV)


"I""II"

"III""IV""tot"

Figura 4.15: Comparacao das curvas de titulacao teoricas e experimentais pertencentes aocitocromo c3 de Dg. Cada um dos graficos foi realizado a pH 6.6. As designacoes “I”, “II”,“III” e “IV”, referem-se aos hemos, e “tot” refere-se a curva de titulacao total da molecula.

39


Tabela 4.4: Valores de pKhalf para diferentes grupos protonaveis do citocromo c3 de Dgquando a molecula esta completamente oxidada e reduzida. Grupos de interesse estao emnegrito.

Residuo Reduzido Oxidado variacao Residuo Reduzido Oxidado variacaoNTVAL-1 8.318 8.013 0.305 LYS-76 11.046 10.961 0.085ASP-2 3.589 3.424 0.165 LYS-80 12.868 12.206 0.662ASP-6 3.484 3.095 0.389 LYS-88 11.244 10.756 0.488LYS-9 11.086 10.921 0.165 ASP-89 3.936 3.639 0.297ASP-11 0.039 -0.236 0.275 LYS-90 11.892 10.634 1.258GLU-17 4.095 4.032 0.063 ASP-93 2.977 2.915 0.062LYS-18 10.715 10.589 0.126 ASP-94 2.690 2.575 0.115LYS-30 11.810 11.647 0.163 LYS-95 10.589 10.570 0.019ASP-31 3.275 3.003 0.272 GLU-96 4.256 4.221 0.035LYS-33 12.732 12.559 0.173 LYS-98 11.830 11.749 0.081ASP-35 2.502 2.186 0.316 LYS-99 10.602 10.523 0.079ASP-36 2.978 2.328 0.650 LYS-100 12.021 11.713 0.308ASP-43 3.754 3.646 0.108 LYS-105 10.996 10.824 0.172LYS-44 11.068 10.748 0.320 CTPRO-111 2.931 2.729 0.202TYR-46 11.693 10.846 0.847 PRA-116 5.419 5.033 0.386ASP-52 3.718 3.599 0.119 PRD-117 5.989 4.598 1.391ASP-59 2.997 2.881 0.116 PRA-118 3.712 2.829 0.883LYS-60 11.443 11.163 0.280 PRD-119 5.169 4.735 0.434ASP-62 3.704 3.536 0.168 PRA-120 4.998 3.646 1.352LYS-63 11.143 11.054 0.089 PRD-121 5.195 4.680 0.515TYR-69 10.936 9.379 1.557 PRA-122 -1.393 -2.073 0.680LYS-70 12.813 12.289 0.524 PRD-123 3.148 1.791 1.357ASP-74 2.020 1.651 0.369

ao baixo pKhalf que os seus propionatos e o ASP-7 tem por estarem a coordenar um iaocalcio [13]. Devido a esta coordenacao, estes acidos vao desprotonar a pH muito baixos(tab. 4.4). A diferenca de potencial do hemo IV, relativamente aos outros hemos, pode serexplicada pelos baixos pKhalf ′s que estes tres acidos proximos deste hemo tem, comparadoscom os valores encontrados para os outros propionatos (tab. 4.4). De tal forma que o po-tencial do hemo IV e maior do que nos outros hemos, de acordo com a variacao das curvasde titulacao, em que estas tomam valores de potencial mais elevados, a medida que o pHbaixa (fig. 4.14). O modelo experimental mostra novamente declives mais acentuados doque o nosso metodo para as curvas de titulacao dos segundo e terceiro hemos da ordem dereducao. O declive acentuado destas curvas no modelo experimental sao indicativos de co-operatividade positiva nos hemos III e II [30]. Este fenomeno nao foi captado pelos nossos

40


Correlação total

−600−400

−2000

200E (mV)

05

1015

20pH

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Correlação

Figura 4.16: Correlacao entre o numero total de protoes e o numero total de electroes nocitocromo c3 de Dg para diferentes valores de potencial e pH. Na base estao representadascurvas de isocorrelacao, que correspondem a linhas onde a correlacao e a mesma , e de forapara dentro tem os valores 0.1, 0.2 e 0.3.

metodos [19, 52]. A ordem de reducao dos hemos foi novamente prevista correctamente,como se pode comprovar atraves da tabela 4.1. A ordem de reducao obtida para o nossometodo foi, do primeiro hemo a reduzir para o ultimo, IV, III, II e I, o que esta de acordocom o modelo termodinamico experimental [30].


Uma analise da correlacao do total de protoes e do total de electroes (fig. 4.16) mostraque existe um deslocamento da superfıcie para pHs mais baixos e potenciais mais elevadosem relacao aos citocromos ja analisados. A presenca de um iao calcio [13], proximo dospropionatos do hemo IV e do ASP-11, faz com que estes grupos acıdicos percam o protao apH baixos. Este facto gera pKhalf baixos (tab. 4.4), e consequentemente surgem correlacoesa valores de pH relativamente baixos, quando comparados com outros citocromos, comose pode ver na figura 4.16. A zona de elevada correlacao encontrada na gama de pHmais baixo corresponde, provavelmente, a titulacao de um conjunto de acidos que estaoa coordenar um iao calcio [13] proximo do hemo IV. Entre pH 0 e 9 temos as restantestitulacoes dos resıduos acıdicos e do N-terminal, e por ultimo, de pH 10 a 16, estao astitulacoes das lisinas e das tirosinas. Examinando agora as correlacoes que cada hemo temao longo do seu Ehalf (fig. 4.17), verifica-se que o PRDI nao tem correlacoes com o hemoII, ao contrario do que se observou para os citocromos anteriores. No intervalo de interessebiologico desta especie, que se situa proximo de 7, os grupos com correlacoes mais elevadassao os propionatos do hemo I, o N-terminal, o PRDII e possivelmente os propionatos dohemo III e a Tyr-69. A ordem de reducao para este citocromo nao e a mesma que paraos citocromos analisados previamente (ver pontos 4.2.1 e 4.2.2, e ordens de reducao natabela 4.1). O facto de a ordem de reducao ser diferente, e o passo importante envolveros hemos II e III poderia levar a pensar que o PRAIII ou o PRDII seriam os principais

41


0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Cor

rela

ção

�

pH

Hemo I

II

IIINt

PrDI

PrAI Y460.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Cor

rela

ção

�

pH

Hemo II

I

PrAII

PrDII

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Cor

rela

ção

�

pH

Hemo III

IIV

PrAIII

PrDIII

K90

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Cor

rela

ção

�

pH

Hemo IV

III

PrDIV

Y69


de Dg. As linhas ponteadas referem-se a correlacoes negativas (entre dois sites redox) e aslinhas a cheio e tracejadas correspondem a correlacoes positivas (entre grupos protonaveise redox). Estas correlacoes sao feitas a valores de potencial em que os hemos tem emmedia meio electrao, ou seja, ao longo de cada linha do grafico dos Ehalf da figura 4.14.Os intervalos em que se verificam correlacoes equivalem a pontos em que os centros redoxestao a reduzir e os protonaveis estao a protonar.

responsaveis pelo fenomeno redox-Bohr. No entanto, pela figura 4.17 podemos verificarque o grupo com maiores correlacoes na zona de pH 7 e o propionato D do hemo I. Emestudos termodinamicos de RMN [30] verificou-se que o efeito redox-Bohr era mais forteno hemo I, indicando que sao grupos protonaveis proximos desse hemo, nomeadamentepropionatos que estao mais envolvidos no efeito redox-Bohr. Isto pode estar relacionadocom a reducao dos hemos II e I se dar a potenciais muito proximos, como se pode ver na

42



05

1015

20pH−600 −400 −200 0 200E (mV)

0

1

2

3

4

Nº electrões

−450

−400

−350

−300

−250

−200

−150

−100

−50

0

0 5 10 15 20

E (

mV

)

pH

Ehalf

"I""II"

"III""IV"


figura 4.15 e tabela 4.1. E possıvel que o N-terminal e mesmo a Tyr-69 contribuam paraque se observe o efeito redox-Bohr, de acordo com estudos teoricos [20].

Analisando as correlacoes entre os grupos redox, verifica-se que elas coincidem com osmesmos pares que nos citocromos c3 de Desulfovibrio vulgaris. Contudo, ao contrario doDvH e DvM em que o hemo I se correlaciona mais com o hemo III, em Dg a correlacaodo hemo I e mais elevada com o hemo II. Isto podera ser devido a alteracao das ordens dereducao de cada hemo.

4.2.4 Desulfomicrobium norvegicum (Dmn)

Titulacao redox

Como se pode ver no grafico da titulacao redox total da figura 4.18, o citocromo c3 desteorganismo tem um comportamento bastante diferente daqueles encontrados para os outroscitocromos c3 aqui analisados. No entanto, tal como nos outros organismos, podemos ob-servar uma forte dependencia das curvas de titulacao relativamente ao pH. Neste organismonao se individualizam variacoes, pois temos uma variacao contınua que abrange uma vastagama de pHs. A variacao ocorre entre pH 2 e 17, sendo um pouco mais pronunciada a pHmais baixos. Estas variacoes devem-se a titulacao dos resıduos protonaveis, sendo a maispronunciada atribuıda aos resıduos acıdicos (tab. 4.5). Esta variacao contınua num vastointervalo de pH deve-se ao facto de existirem grupos protonaveis com pKhalf ′s que abrangemtoda essa gama de pH. Se observarmos a figura 4.18, referente ao Ehalf , podemos analisaras alteracoes dos centros redox ao longo do pH. Ao contrario dos citocromos anteriores, em

43


Tabela 4.5: Valores de pKhalf para diferentes grupos protonaveis do citocromo c3 de Dnquando a molecula esta completamente oxidada e reduzida. Grupos de interesse estao emnegrito.

Residuo Reduzido Oxidado variacao Residuo Reduzido Oxidado variacaoNTALA-1 8.265 7.863 0.402 LYS-75 10.799 10.755 0.044ASP-2 3.715 3.534 0.181 LYS-79 10.834 10.706 0.128ASP-6 3.301 2.828 0.473 ASP-80 1.587 1.346 0.241ASP-7 4.003 3.826 0.177 LYS-82 12.672 12.432 0.240TYR-8 14.387 13.118 1.269 GLU-85 3.792 2.720 1.072GLU-14 4.525 4.460 0.065 ASP-94 3.566 3.042 0.524LYS-17 11.393 11.315 0.078 LYS-97 10.781 10.523 0.258LYS-19 10.483 10.139 0.344 LYS-100 9.703 9.264 0.439LYS-21 9.654 9.529 0.125 LYS-101 10.855 10.726 0.129ASP-23 3.565 3.558 0.007 ASP-102 3.508 3.413 0.095LYS-24 10.744 10.722 0.022 LYS-103 10.623 10.582 0.041LYS-30 11.449 11.195 0.254 LYS-104 11.355 11.012 0.343LYS-38 12.111 11.725 0.386 LYS-113 8.794 8.312 0.482GLU-43 4.593 4.333 0.260 CTASN-118 3.688 3.627 0.061GLU-52 4.427 4.319 0.108 PRA-123 5.386 4.656 0.730ASP-54 3.448 2.771 0.677 PRD-124 2.484 1.106 1.378LYS-59 12.174 11.859 0.315 PRA-125 5.157 4.632 0.525LYS-60 13.898 13.560 0.338 PRD-126 4.825 4.328 0.497ASP-68 4.371 4.079 0.292 PRA-127 4.668 4.123 0.545GLU-71 3.796 3.779 0.017 PRD-128 4.231 3.736 0.495ARG-73 13.776 13.456 0.320 PRA-129 4.566 3.370 1.196ASP-74 2.712 2.706 0.006 PRD-130 7.850 6.393 1.457

que se verificam patamares na variacao do Ehalf de cada hemo ao longo do pH, o Ehalf dohemo IV deste citocromo nao apresenta patamares, observando-se uma variacao contınuado potencial redox ao longo do pH. Esta variacao no potencial de reducao do hemo IV edevida a existencia de grupos protonaveis na vizinhanca deste hemo cujos pKhalf abrangemesta gama de pHs, enquanto que nos outros citocromos nao se verificam grupos que estejama titular em toda esta gama de pHs.

Ordens de reducao

Para esta especie nao temos dados termodinamicos obtidos por RMN. No entanto, te-mos dados termodinamicos obtidos por EPR [22,23]. Os dados de EPR foram usados nummodelo termodinamico um pouco diferente daquele usado para os dados de RMN. Este

44


0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−500 −400 −300 −200 −100 0

Fra

cção

red

uzid

a

E (mV)

Tautómeros

"I""II"

"III""IV""tot"

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

−500 −400 −300 −200 −100 0

Fra

cção

red

uzid

a

E (mV)


"I""II"

"III""IV""tot"

Figura 4.19: Comparacao das curvas de titulacao teoricas e experimentais pertencentes aocitocromo c3 de Dn. Cada um dos graficos foi realizado a pH 8.1. As designacoes “I”, “II”,“III” e “IV”, referem-se aos hemos, e “tot” refere-se a curva de titulacao total da molecula.

modelo considera apenas quatro centros redox em interaccao, e um unico pH (de 8.1). Nafigura 4.19 estao representadas as curvas de titulacao calculadas pelo nosso modelo teoricoe pelo modelo aplicado aos dados experimentais. Neste citocromo e a este pH, os resultadosdo modelo termodinamico [22], nao parecem indicar fenomenos de cooperatividade positivasignificativos como nos outros organismos. As curvas que foram calculadas pelo modeloaplicado aos dados experimentais apresentam declives semelhantes em todos os hemos, emuito comparaveis aos obtidos pelos nossos metodos teoricos. Neste citocromo, os hemostem uma interaccao muito baixa [22], nao sendo possıvel sugerir a existencia de cooperati-vidade. Um facto interessante, e a curva de titulacao total da molecula determinada pelomodelo termodinamico experimental. Esta curva sofre um alongamento que podera serdevido ao alto potencial do primeiro hemo a reduzir (ver tabela 4.1), que apresenta umadiferenca significativa relativamente ao segundo hemo a capturar electrao. Infelizmente, onosso metodo nao permitiu a correcta determinacao da ordem de reducao para todos oshemos, como se pode ver na tabela 4.1 e figura 4.19. Nesta molecula, o potencial de reducaodo hemo IV apresenta um potencial de reducao que o coloca como sendo o quarto hemo areduzir e nao o segundo, como foi evidenciado pelo modelo termodinamico experimental.Nos graficos da figura 4.19 estao as curvas de titulacao calculadas pelo metodo teorico epelo modelo experimental, ambas a pH 8.1. Muito embora, Gayda et. al [22] afirmaramnao existirem diferencas significativas entre os valores obtidos a pH 7.6 e 8.1, no entanto,esses valores de pH podem ser determinantes na analise dos resultados pelo nosso metodo,

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Correlação total

−600−400

−2000

200E (mV)

05

1015

20pH

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Correlação

Figura 4.20: Correlacao entre o numero total de protoes e o numero total de electroes nocitocromo c3 de Dmn para diferentes valores de potencial e pH. Na base estao representadascurvas de isocorrelacao, que correspondem a linhas onde a correlacao e a mesma , e de forapara dentro tem os valores 0.1, 0.2 e 0.3.

como pode ser verificado pelo grafico da variacao do Ehalf da figura 4.18.E possıvel que o potencial do hemo IV se tenha deslocado devido a um erro no calculo

do pKhalf de um resıduo proximo deste hemo. Como se pode observar na figura 4.18, ohemo IV sofre uma descida do potencial proximo de pH 7 devido a titulacao de um grupoproximo do hemo, que pode ser a causa para o valor de potencial obtido para o hemo IV.Se este grupo desprotona-se mais tarde, a ordem de reducao poderia ser corrigida.


A correlacao entre o numero total de electroes e o numero total de protoes esta repre-sentada no grafico da figura 4.20. De forma semelhante ao que foi observado para os outrosorganismos, temos tres regioes com elevadas correlacoes, embora as duas primeiras quasese fundam. Na primeira regiao encontram-se as titulacoes dos acidos, na segunda, comoque uma continuacao da primeira, a titulacao da Lys-113 e do N-terminal e na ultima atitulacao de um conjunto de lisinas e tirosinas. Uma vez que o intervalo de pH com interessebiologico e proximo de 7, e em volta deste valor que nos iremos concentrar.

Os resıduos com correlacoes nas proximidades de pH 7 sao o N-terminal, o PRAI e oPRDIV, como se pode ver na figura 4.21. Para este citocromo, o PRDI nao parece ser oprincipal resıduo responsavel pelo efeito redox-Bohr. Como principal candidato aparece oPRDIV, que mostra ter uma correlacao muito elevada com o hemo IV num intervalo depH consideravel. Tendo em conta a zona em volta de pH 7, o PRDIV parece ser o principalresıduo responsavel pelo efeito redox-Bohr. Para alem deste resıduo, ha o N-terminal, queembora tenha uma pequena variacao (tab. 4.5), esta ocorre dentro da zona interessantedo ponto de vista biologico. Um outro resıduo que poderia estar envolvido no fenomenoredox-Bohr, pelo baixo pKhalf apresentado, poderia ser a lisina 113 (tab. 4.5). Contudoos resultados nao confirmam esta suposicao, e nao se verificam correlacoes deste grupo

46


0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Cor

rela

ção

�

pH

Heme I

IIIIINt

PrAI

PrDI

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Cor

rela

ção

�

pH

Heme II

I

D45

PrDIPrDII

PrAII

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Cor

rela

ção

�

pH

Heme III

IIV

PrAIIIPrDIII

K1040.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Cor

rela

ção

�

pH

Heme IV

III

E85 PrAIV

PrDIV


de Dmn. As linhas ponteadas referem-se a correlacoes negativas (entre dois sites redox) e aslinhas a cheio e tracejadas correspondem a correlacoes positivas (entre grupos protonaveise redox). Estas correlacoes sao feitas a valores de potencial em que os hemos tem emmedia meio electrao, ou seja, ao longo de cada linha do grafico dos Ehalf da figura 4.18.Os intervalos em que se verificam correlacoes equivalem a pontos em que os centros redoxestao a reduzir e os protonaveis estao a protonar.

com nenhum dos hemos, o que indica que nao existem interaccoes significativas entre aLys-113 e os grupos redox. As correlacoes entre pares redox mantem-se, relativamenteaos organismos anteriores, ou seja; entre os pares adjacentes I-II, I-III e III-IV [9–11, 13].A correlacao do hemo I e maior com o hemo III do que com o hemo II, semelhante aoobservado para as subespecies DvH e DvM. Um aspecto interessante e que a correlacao dohemo III com o hemo IV desaparece (adquire valores inferiores a 0.1) proximo de pH 7, o

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que nao acontece nos outros hemos, nem em outros citocromos.

4.3 Comparacao entre os diversos citocromos c3

Como se pode constatar pelos resultados para os varios citocromos c3, as metodologiasutilizadas conseguiram prever as ordens de reducao de quinze de um total de dezasseis he-mos. Esta excelente previsao demonstra que as metodologias sao adequadas para descrevereste tipo de sistemas. Os quatro citocromos c3 apresentam variacoes nas superfıcies de titu-lacao caracterısticas do efeito redox-Bohr. O facto de existirem variacoes a varias gamas depH, indica que o efeito redox-Bohr nao e muito especıfico, surgindo sempre que ha grandesalteracoes no estado de protonacao da proteına, de acordo com o que foi encontrado paraDvH em Baptista et al . [19]. E curioso ver que os citocromos c3 das subespecies DvH e DvMe da especie Dg, apresentam patamares entre as variacoes do Ehalf com o pH (fig. 4.6, 4.10e 4.14), e que a especie Dmn (fig. 4.18) existe um hemo com uma unica variacao alongada.Neste ultimo organismo, o efeito redox-Bohr parece estar presente numa vasta gama depHs, mostrando mais uma vez o seu caracter pouco especıfico. Todos os citocromos aquiestudados apresentaram varias regioes onde o fenomeno redox-Bohr aparece. Contudo, emais importante do que o fenomeno aparecer em varias regioes, e a presenca deste efeito apH fisiologico em todos os organismos. Nos quatro casos aqui apresentados verificaram-sesempre diferencas nas curvas de titulacao, entre os nossos calculos e os modelos termo-dinamicos experimentais de RMN e EPR. As principais diferencas observadas sao a nıveldo declive de algumas curvas, como se pode ver nas figuras 4.7, 4.11, 4.15 e 4.19. Quando odeclive das curvas de titulacao e acentuado, isso e, geralmente, um sinal de cooperativida-de positiva. A cooperatividade positiva pode ser vista como uma maior facilidade que umligando tem de se ligar, apos a ligacao de outro. Aqui podemos ter homo-cooperatividade,onde a ligacao de um segundo electrao e favorecida pela ligacao de um primeiro electrao,e/ou hetero-cooperatividade, onde a ligacao de um protao favorece a entrada posterior deum electrao. Embora os citocromos de DvH e DvM pertencam a mesma especie - Desul-fovibrio vulgaris, e portanto tenham poucas diferencas estruturais, verificam-se pequenasdiferencas, nomeadamente o N-terminal que esta mais deslocado para o solvente em DvMdo que em DvH, o que diminui as interaccoes com os outros grupos da proteına. Estefacto fez com que o N-terminal do citocromo c3 de DvM deixasse de estar envolvido noefeito redox-Bohr, pois este afastamento para o solvente provocou uma diminuicao dassuas interaccoes com os restantes grupos da proteına. No caso do citocromo c3 de DvH jaforam detectadas algumas diferencas entre a estrutura completamente oxidada por raio-X [13] e reduzida por RMN [14] e observaram-se alteracoes conformacionais por dinamicamolecular [18], indicando a possibilidade de existirem alteracoes conformacionais neste ci-tocromo durante a reducao. Alguns estudos de espectroelectroquımica em conjunto comespectroscopia de infravermelho [32], indicam tambem a existencia de pequenas alteracoesconformacionais na molecula de DvH quando ela passa de completamente reduzida a com-pletamente oxidada. Estudos estruturais de RMN do citocromo c3 de Dg na forma oxidadae reduzida em solucao, mostraram que existem pequenas diferencas localizadas [16]. Em-

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bora a estrutura tridimensional seja muito semelhante, verificaram-se algumas diferencasdurante a mudanca do estado redox. Schlered et al . [31] fez estudos de FTIR combinadoscom espectroelectroquımica, fazendo espectros de infravermelho com os citocromos c3 deDg e Dmn completamente oxidado e reduzido. Com este estudo, verificou-se que ocorriampequenas alteracoes conformacionais em acidos carboxılicos, nomeadamente propionatos,de acordo com o numero de onda em que ocorriam as diferencas entre os espectros. Asalteracoes conformacionais detectadas por FTIR ocorrem segundo um processo com doispassos [31], estando dois hemos envolvidos em cada passo. Neste processo, existe primeiroa reducao de dois hemos, segue-se a alteracao na conformacao de alguns resıduos e porultimo, observa-se a reducao dos outros dois hemos. Assim sendo, parece que a alteracaoconformacional de alguns grupos, ainda que pequena, acontece no decorrer do processo dereducao da molecula, mais propriamente quando a proteına esta metade reduzida. Estesestudos com as proteınas reduzidas e oxidadas parecem mostrar a existencia de pequenasalteracoes conformacionais no processo de reducao dos citocromos [14, 16, 18, 31, 32], queas correntes metodologias teoricas [19, 52] ainda nao conseguiram tratar. Mesmo assim,as nossas metodologias conseguiram excelentes resultados falhando apenas na previsao daordem de reducao de um hemo entre dezasseis, relativamente ao que foi obtido experimen-talmente [22, 28–30]. Um factor que varia nos diferentes citocromos e metodos (teoricos eexperimentais), e o espacamento que as curvas de titulacao tem entre si, ou seja, a diferencade potencial de reducao entre os hemos. Sao varios os factores que podem modelar o poten-cial redox de cada hemo. Entre eles temos a acessibilidade ao solvente, o efeito redox-Bohre o envolvimento electrostatico. A acessibilidade dos hemos pode influenciar na capturaelectronica, na medida em que um hemo com maior acessibilidade pode capturar maisfacilmente um electrao. Em relacao ao efeito redox-Bohr, este tambem pode influenciar acaptura electronica por hetero-cooperatividade, na qual a tomada de um protao favorece acaptura de um electrao. Um outro factor que tambem pode modelar o potencial redox e oenvolvimento electrostatico que cada hemo apresenta, podendo este facilitar ou dificultara reducao de um grupo redox. Analisando as superfıcies de correlacao do numero total deprotoes e numero total de electroes (fig. 4.8, 4.12, 4.16 e 4.20), observamos tres regioes deelevadas correlacoes em cada uma das especies. Embora a localizacao destas zonas possavariar de especie para especie, estas aparecem sempre que grupos redox e protonaveis estaoa titular (ver Metodos). Os picos emergem sempre em zonas onde o estado de protonacaoda molecula varia consideravelmente, mostrando que o efeito redox-Bohr e pouco especıficoe caracterıstico de proteınas redox. Tal como se esperava, os graficos relativos aos citocro-mos c3 de DvH e DvM sao praticamente iguais, uma vez que pertencem a mesma especie.Se observar-mos o grafico do citocromo c3 de Dg, podemos verificar que a primeira regiaode elevadas correlacoes surge a valores de pH mais baixos, e que a regiao a pH mais alto,desapareceu. Neste citocromo, os pKhalf de alguns acidos e tirosinas baixaram um poucorelativamente as outras especies, o que provocou o aparecimento das correlacoes em zonasde pH mais baixo. A especie Dmn tem uma interessante correlacao alargada numa vastagama de pHs que se deve a existencia de grupos a titular a varios pHs diferentes. O propi-onato D do hemo IV, com o seu pKhalf elevado relativamente aos outros propionatos, fazcom que a regiao de elevadas correlacoes da titulacao dos acidos (primeiro), se prolongue

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ate quase se fundir com o seguinte (onde estao as lisinas e N-terminal). Um aspecto comumem todas as especies, e a elevada correlacao que os hemos tem com pelo menos um dos seuspropionatos, como observado em estudos teoricos anteriores [19]. Os citocromos c3 de DvHe DvM, assim como de Dmn, tem propionatos cuja correlacao nao e unicamente um picoestreito, mas sim um pico alargado com um ombro. Estes ombros so aparecem nos PRDI enos PRDIV, podendo ser uma consequencia do efeito redox-Bohr, como sugerido em [19].Quando existem grandes variacoes de pKhalf e/ou Ehalf (tabelas de pKhalf e figuras da va-riacao do Ehalf ao longo do pH), as correlacoes entre grupos podem alargar-se por zonasde pH mais amplas. Por exemplo, temos o PRDIV do DvH ou o PRDIV de Dmn em quea correlacao se prolonga consideravelmente acima e abaixo dos valores de pKhalf obtidospara estes resıduos quando o citocromo c3 correspondente esta completamente oxidado ereduzido. Nos citocromos c3 de DvH, DvM e de Dg, o grupo com a maior correlacao nazona de interesse biologico [28–30] e o propionato D do hemo I. Park e colaboradores [26]fizeram estudos de RMN em que conseguiram titular os propionatos de cada hemo, bemcomo a titulacao dos metilos dos hemos do citocromo c3 de DvM. Observaram que o hemoI era o grupo redox que mais dependia do pH, e apesar de serem varios os grupos queafectam o potencial redox dos varios hemos, o propionato D do hemo I e o grupo que maisinfluencia o potencial redox do hemo I. Assim, este propionato parece ser o grupo que estamais envolvido no fenomeno redox-Bohr, o que esta de acordo com os nossos resultados.No citocromo c3 de DvH, mutacoes na Lys-45, um resıduo que interage fortemente comos propionatos do hemo I, altera o padrao do efeito redox-Bohr, como tinha sido propostopor Soares et al . [18], evidenciando, de uma forma indirecta a importancia dos propionatosdo hemo I como responsaveis por este efeito.No organismo Dmn o grupo com maior va-riacao na zona de interesse biologico e o propionato D do hemo IV, e isso faz deste resıduoo melhor candidato como principal responsavel pelo efeito redox-Bohr, neste citocromo.Os propionatos sao os grupos mais importantes no controlo do efeito redox-Bohr a pHfisiologico, no entanto podem existir outros grupos como o N-terminal, que apresenta va-riacoes na gama de pH proximos de 7, que podem estar tambem envolvidos no fenomeno.Alguns citocromos tem histidinas livres, como o caso dos citocromos c3 de DvH e DvM,que embora tenham pequenas variacoes do seu pKhalf (tab. 4.2 e 4.3), tambem podem teruma contribuicao relevante para o efeito redox-Bohr na zona de interesse biologico.

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Capıtulo 5

Conclusoes

As metodologias usadas para tratar os citocromos c3 demonstraram ser mui-to adequadas para estudar este tipo de sistemas.

A ordem de reducao dos hemos nos diferentes citocromos foi prevista comsucesso em quinze, num total de dezasseis hemos.

Os grupos mais importantes envolvidos no fenomeno redox-Bohr sao o pro-pionato D do hemo I nos citocromos c3 dos organismos Desulfovibrio vulgarisHildenborough, Desulfovibrio vulgaris Miyazaki e Desulfovibrio gigas, e o pro-pionato D do hemo IV em Desulfomicrobium norvegicum.

O N-terminal, assim como as histidinas livres (quando existem), tambempodem desempenhar um papel importante no efeito redox-Bohr nestes citocro-mos c3.

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Capıtulo 6

Perspectivas futuras

O trabalho descrito neste relatorio abre perspectivas para trabalhos futuros, quer sejamexperimentais ou teoricos. Em termos experimentais, a cristalizacao dos citocromos emcondicoes de oxidacao/reducao parcial e a resolucao das suas estruturas por cristalografiade raio-X, poderia permitir um melhor seguimento das alteracoes que ocorrem ao longo dareducao da molecula, podendo tambem, tornar possıvel a identificacao do estado em queelas ocorrem. O mesmo se poderia dizer em relacao a estudos de RMN. A mutacao deresıduos, analogamente ao estudo realizado por Saraiva et. al [79], permitiria o teste dehipoteses, relativamente aos grupos que poderao estar envolvidos no fenomeno redox-Bohr.

Em termos teoricos, o desenvolvimento de metodologias que tenham em conta alteracoesconformacionais ao longo das variacoes do estado geral da proteına, ajudariam na previsaode fenomenos de cooperatividade positiva. Por outro lado, o desenvolvimento de algoritmosmais eficientes permitiria diminuir o tempo de calculo.

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Bibliography

[1] Czjzek, M., Guerlesquin, F., Bruschi, M., and Haser, R. (1996). Crystal structure of adimeric octaheme cytochrome c3 (Mr 26000) from Desulfovibrio desulfuricans Norway.Structure 4, 395–404.

[2] Yagi, T., Honya, M., and Tamiya, N. (1968). Purification and properties of hydroge-nases of different origins. Biochem. Biophys. Acta 153, 699–705.

[3] Haladjian, J., Bianco, P., Guerlesquin, F., and Bruschi, M. (1987). Electrochemicalstudy of the electron exchange between cytochrome c3 and hydrogenase from Desul-fovibrio desulfuricans Norway. Biochem. Biophys. Res. Commun. 147, 1289–1294.

[4] Catarino, T., Coletta, M., LeGall, J., and Xavier, A. (1991). Kinetic study of thereduction mechanism for desulfovibrio gigas cytochrome c3. Eur. J. Biochem. 202,1107–1113.

[5] Aubert, C., Leroy, G., Bruschi, M., Wall, J., and Dolla, A. (1997). A single mutationin the heme 4 environment of Desulfovibrio desulfuricans Norway cytochrome c3 (Mr

26000) greatly affects the molecule reactivity. J. Biol. Chem. 272, 15128–15134.

[6] Louro, R., Catarino, T., LeGall, J., and Xavier, A. (1997). Redox-Bohr effect inelectron/proton energy transduction: Cytochrome c3 coupled to hydrogenase worksas a ’proton thruster’ in Desulfovibrio vulgaris. J. Biol. Inorg. Chem. 2, 488–491.

[7] Aubert, C., Giudici-Orticoni, M., Czjzek, M., Haser, R., Bruschi, M., and Dolla, A.(1998). Structural and kinetic studies of the Y73E nutant of octaheme cytochrome c3

(Mr = 26000) from Desulfovibrio desulfuricans Norway. Biochemistry 37, 2120–2130.

[8] Haser, R., Frey, P., Payan, F., and Astier, J. (1979). Structure and sequence of themultihaem cytochrome c3. Nature 282, 806–810.

[9] Higuchi, Y., Kusunoki, M., Matsuura, Y., Yasuoka, N., and Kakudo, M. (1984).Refined structure of cytochrome c3 at 1.8 angstrons resolution. J. Mol. Biol. 172,109–139.

[10] Matias, P., Frazao, C., Morais, J., Coll, M., and Carrondo, M. (1993). Structure analy-sis of cytochrome c3 from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough at 1.9 A resolution.J. Mol. Biol. 234, 680–699.

53

Bibliography

[11] Czjzek, M., Payan, F., Guerlesquin, F., Bruschi, M., and Haser, R. (1994). Crystalstructure of cytochrome c3 from Desulfovibrio desulfuricans Norway at 1.7 A resolu-tion. J. Mol. Biol. 243, 653–667.

[12] Morais, J., Palma, P., Frazao, C., Caldeira, J., LeGall, J., Moura, I., Moura, J.,and Carrondo, M. (1995). Structure of the tetraheme cytochrome from Desulfovibriodesulfuricans ATCC 27774: X-ray diffraction and electron paramagnetic ressonancestudies. Biochemistry 34, 12830–12841.

[13] Matias, P., Morais, J., Coelho, R., Carrondo, M., Wilson, K., Dauter, Z., and Sieker, L.(1996). Cytochrome c3 from Desulfovibrio gigas : Crystal structure at 1.8 A resolutionand evidence for a specific calcium-binding site. Protein Sci. 5, 1342–1354.

[14] Messias, A., Kastrau, D., Costa, H., LeGall, J., Turner, D., Santos, H., and Xavier, A.(1998). Solution structure of Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough) ferrocytochromec3: Structural basis for functional cooperativity. J. Mol. Biol. 281, 719–739.

[15] Norager, S., Legrand, P., Pieulle, L., Hatchikian, C., and Roth, M. (1999). Crystalstructure of the oxidized and reduced acidic cytochrome c3 from Desulfovibrio africa-nus. J. Mol. Biol. 298, 881–902.

[16] Brennan, L., Turner, D., Messias, A., Teodoro, M., LeGall, J., Santos, H., and Xavier,A. (2000). Structural basis for the network of functional cooperativities in cytochromec3 from Desulfovibrio gigas : Solution structure of the oxidized and reduced states.J. Mol. Biol. 298, 61–82.

[17] Soares, C. (1997). Simulacao de proteınas usando metodos de mecanica/dinamicamolecular. Quimica 64, 33–44.

[18] Soares, C., Martel, P., Mendes, J., and Carrondo, M. (1998). Molecular dynamicssimulation of cytochrome c3: Studying the reduction processes using free energy cal-culations. Biophys. J. 74, 1708–1721.

[19] Baptista, A., Martel, P., and Soares, C. (1999). Simulation of electron-proton cou-pling with a Monte Carlo method: Application to cytochrome c3 using continuumelectrostatics. Biophys. J. 76, 1–21.

[20] Martel, P., Soares, C., Baptista, A., Fuxreiter, M., Naray-Szabo, G., Louro, R., andCarrondo, M. (1999). Comparative redox and pKa calculations on cytochrome c3 fromseveral Desulfovibrio species using continuos electrostatic methods. J. Biol. Inorg.Chem. 4, 73–86.

[21] Santos, H., Moura, J., Moura, I., LeGall, J., and Xavier, A. (1984). NMR studies ofelectron transfer mechanism in a protein with interacting redox centers: Desulfovibriogigas cytochrome c3. Eur. J. Biochem. 141, 283–296.

54

Bibliography

[22] Gayda, J., Benosman, H., Bertrand, P., More, C., and Asso, M. (1988). EPR deter-mination of interaction redox potencials in a multiheme cytochrome: cytochrome c3

from Desulfovibrio desulfuricans Norway. Eur. J. Biochem. 177, 199–206.

[23] Guigliarelli, B. (1990). Single-crystal electron paramagnetic resonance study of cyto-chrome c3 from Desulfovibrio desulfuricans Norway strain: Assignment of the hememidpoint redox potencials. J. Mol. Biol. 216, 161–166.

[24] Coletta, M., Catarino, T., LeGall, J., and Xavier, A. (1991). A thermodynamicmodel for the cooperative functional properties of the tetraheme cytochrome c3 fromDesulfovibrio gigas. Eur. J. Biochem. 202, 1101–1106.

[25] Turner, D., Salgueiro, C., Catarino, T., LeGall, J., and Xavier, A. (1994). Homotropicand heterotropic cooperativity in the tetrahaem cytochrome c3 from Desulfovibriovulgaris. Biochem. Biophys. Acta 1187, 232–235.

[26] Park, J., Ohmura, T., Kano, K., Sagara, T., Niki, K., Kyogoku, Y., and Akutsu, H.(1996). Regulation of the redox order of four hemes by pH in cytochrome c3 from D.vulgaris Miyazaki F. Biochem. Biophys. Acta 1293, 45–54.

[27] Louro, R., Catarino, T., Salgueiro, C., LeGall, J., and Xavier, A. (1996). Redox-Bohreffect in the tetrahaem cytochrome c3 from Desulfovibrio vulgaris : A model for energytransduction mechanisms. J. Biol. Inorg. Chem. 1, 34–38.

[28] Turner, D., Salgueiro, C., Catarino, T., LeGall, J., and Xavier, A. (1996). NMRstudies of cooperativity in the tetrahaem cytochrome c3 from Desulfovibrio vulgaris.Eur. J. Biochem. 241, 723–731.

[29] Salgueiro, C., Turner, D., LeGall, J., and Xavier, A. (1997). Reevaluation of theredox and redox-Bohr cooperativity in tetrahaem desulfovibrio vulgaris (Miyazaki F)cytochrome c3. J. Biol. Inorg. Chem. 2, 343–349.

[30] Louro, R., Catarino, T., Turner, D., Picarra-Pereira, M., Pacheco, I., LeGall, J.,and Xavier, A. (1998). Functional and mechanistic studies of cytochrome c3 fromDesulfovibrio gigas - thermodynamics of a ’proton-thruster’. Biochemistry 37, 15808–15815.

[31] Schlereth, D., Fernandez, V., and Mantele, W. (1993). Protein conformational changesin tetrahaem cytochrome detected by FTIR spectroelectrochemistry: Desulfovibriodesulfuricans Norway 4 and Desulfovibrio gigas cytochrome c3. Biochemistry 32,9199–9208.

[32] Kazanskaya, I., Lexa, D., Bruschi, M., and Chottard, G. (1996). Electron transferin tetrahaem cytochrome c3: Spectroelectrochemical evidence for a conformationalchange triggered by heme IV reduction. Biochemistry 35, 13411–13418.

55

Bibliography

[33] Coutinho, I. and Xavier, A. (1994). Tetraheme cytochromes. Methods Enzymol. 243,119–140.

[34] Mizuguchi, K., Deane, C., Blundell, T., and Overington, J. (1998). HOMSTRAD:a database of protein structure alignments for homologous families. Protein Sci. 7,2469–2471.

[35] Guerlesquin, F., Bruschi, M., and Bovier-Lapierre, G. (1984). Electron transfer me-canism and interaction studies between cytochrome c3 and ferredoxin. Biochimie 66,93–99.

[36] Stewart, D., LeGall, J., Moura, J., Peck Jr., H., Xavier, A., Weiner, P., and Wampler,J. (1988). A hypothetical model of the flavodoxin-tetraheme cytochrome c3 complexof sulfate-reducing bacteria. Biochemistry 27, 2444–2450.

[37] Matias, P., Saraiva, L., Soares, C., Coelho, A., LeGall, J., and Carrondo, M. (1999).Nine-haem cytochrome c from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774: Primary se-quence determination, crystallographic refinement at 1.8 A and modeling studies ofits interaction with the tetrahaem cytochrome c3. J. Biol. Inorg. Chem. 4, 478–494.

[38] Matias, P., Soares, C., Saraiva, L., Coelho, R., Morais, J., LeGall, J., and Carrondo,M. (2001). NiFe hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774: Primarysequence determination, crystallographic refinement at 1.8 A and modeling studies ofits interaction with the tetra-haem cytochrome c3. J. Biol. Inorg. Chem. 6, 63–81.

[39] Odom, J. and Peck, H. (1981). Hydrogen cycling as a general mechanism for energycoupling in the sulfate-reducing bacteria, Desulfovibrio sp. FEMS Microbiology Letters12, 47–50.

[40] Pereira, I., Romao, C., Xavier, A., LeGall, J., and Teixeira, M. (1998). Electrontransfer between hydrogenases and mono and multiheme cytochromes in Desulfovibriosp. J. Biol. Inorg. Chem. 3, 494–498.

[41] Badziong, W., Thauer, R., and Zeikus, J. (1978). Isolation and characterizationof Desulfovibrio growing on hydrogen plus sulfate as the sole energy source. Arch.Microbiol. 116, 41–49.

[42] Papa, S., Guerrieri, F., and Izzo, G. (1979). Redox-Bohr effects in the cytochromesystem of mitochondria. FEBS Letters 105, 213–216.

[43] Xavier, A. (ed.) (1985). In Frontiers in Bioinorganic Chemistry. VCH Publishers,Weinheim.

[44] Matias, P., Coelho, R., Pereira, I., Coelho, A., Thompson, A., Sieker, L., LeGall,J., and Carrondo, M. (1999). The primary and three-dimensional structures of anine-haem cytochrome c from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 reveal a newmember of the Hmc family. Structure 7, 119–130.

56

Bibliography

[45] Bashford, D. and Karplus, M. (1990). pKa’s of ionizable groups in proteins: Atomicdetail from a continuum electrostatic model. Biochemistry 29, 10219–10225.

[46] Bashford, D. and Karplus, M. (1991). Multiple-site titration curves of proteins: Ananalysis of exact and approximate methods for their calculation. J. Phys. Chem. 95,9556–9561.

[47] Oberoi, H. and Allewell, N. (1993). Multigrid solution of the nonlinear poisson-boltzmann equation and calculation of titration curves. Biophys. J. 65, 48–55.

[48] Antosiewicz, J., McCammon, J., and Gilson, M. (1994). Prediction of pH-dependentproperties of proteins. J. Mol. Biol. 238, 415–436.

[49] Schaefer, M., Sommer, M., and Karplus, M. (1997). pH-dependence of protein sta-bility: Absolute electrostatic free energy differences between conformations. J. Phys.Chem. B 101, 1663–1683.

[50] Lancaster, C., Michel, H., Honig, B., and Gunner, M. (1996). Calculated coupling ofelectron and proton transfer in the photosynthetic reaction center of Rhodopseudomo-nas viridis. Biophys. J. 70, 2469–2492.

[51] Gunner, M. and Alexov, E. (2000). A pragmatic approach to structure based calcu-lation of coupled proton and electron transfer in proteins. Biochem. Biophys. Acta1458, 63–87.

[52] Baptista, A. and Soares, C. (2001). Some theoretical and computational aspects ofthe inclusion of proton isomerism in the protonation equilibrium of proteins. J. Phys.Chem. B 105, 293–309.

[53] Martel, P., Baptista, A., and Petersen, S. (1996). Protein electrostatics. Bioth. Annu.Rev. 2, 315–372.

[54] Warshel, A. (1991). Electrostatic energy and macromolecular function. Annu. Rev.Biophys. Biophys. Chem. 20, 267–298.

[55] Beroza, P., Fredkin, D., Okamura, M., and Feher, G. (1991). Protonation of interactingresidues in a protein by a Monte Carlo method: Application to lysozyme and thephotosynthetic reaction center of rhodobacter sphaeroides. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 88, 5804–5808.

[56] Nozaki, Y. and Tanford, C. (1967). Examination of titration behavior. MethodsEnzymol. 11, 715–734.

[57] Shadowitz, A. (1988). The Electromagnetic Field. Dover Publications, Inc., New York.

[58] Sharp, K. and Honig, B. (1990). Electrostatic interaction in macromolecules: theoryand applications. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 301–332.

57

Bibliography

[59] Klapper, I. (1986). Focusing of electric fields in the active site of Cu-Zn superoxidedismutase: Effects of ionic strength and amino-acid modification. Proteins: Struct.Funct. Genet. 1, 47–59.

[60] Bockris, J. and Reddy, A. (1970). Modern Electrochemistry: an introduction to aninterdisciplinary area. MacDonald, London.

[61] Hill, T. (1986). An Introduction to Statistical Thermodynamics. Dover Publications,Inc., New York.

[62] King, G., Lee, F., and Warshel, A. (1991). Microscopic simulations of macroscopicdielectric constants of solvated proteins. J. Chem. Phys. 95, 4366–4377.

[63] Smith, P., Brunne, R., Mark, A., and Van Gunsteren, W. (1993). Dielectric propertiesof trypsin inhibitor and lysozyme calculated from molecular dynamics simulations.J. Phys. Chem. 97, 2009–2014.

[64] Soares, C., Martel, P., and Carrondo, M. (1997). Theoretical studies on the redox-Bohr effect in cytochrome c3 from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. J. Biol.Inorg. Chem. 2, 714–727.

[65] Bernstein, F., Koetzle, T., Williams, G., Jr., E., Brice, M., Rodgers, J., Kennard, O.,and Shimanouchi, T. (1977). The protein data bank. a computer-based archival filefor macromolecular structures. J. Mol. Biol. 112, 535.

[66] Alexov, E. and Gunner, M. (1997). Incorporating protein conformational flexibilityinto the calculation of pH-dependent protein properties. Biophys. J. 72, 2075–2093.

[67] Van Gunsteren, W. and Berendsen, H. (1987). Groningen Molecular Simulation(GROMOS) Library Manual. Biomos B.V., Nijenborgh 16, 9747. AG Groningen,the Netherlands.

[68] Vriend, G. (1990). WHAT IF: a molecular modeling and drug design program. J.Mol. Graph. 8, 52–56.

[69] Hooft, R., Sander, C., and Vriend, G. (1996). Positioning hydrogen atoms by optimi-zing hydrogen-bond networks in protein structures. Proteins: Struct. Funct. Genet.26, 363–376.

[70] Bashford, D. and Gerwert, K. (1992). Electrostatic calculations of the pKa values ofionizable groups in bacteriorhodopsin. J. Mol. Biol. 224, 473–486.

[71] Weast, R. (ed.) (1984). Handbook of Chemistry and Physics. Boca, Raton.

[72] Harbury, H., Cronin, J., Fanger, M., Hettinger, T., Murphy, A., Myer, Y., and Vino-gradov, S. (1965). Complex formation between methionine and a heme peptide fromcytochrome c. Biochemistry 54, 1658–1664.

58

Bibliography

[73] Churg, A. and Warshel, A. (1986). Control of the redox potential of cytochrome cand microscopic dielectric effects in proteins. Biochemistry 25, 1675–1681.

[74] Eisenhaber, F. and Argos, P. (1993). Improved strategy in analytic surface calcu-lation for molecular systems: Handling of singularities and computational efficiency.J. Comput. Chem. 14, 1272–1280.

[75] Eisenhaber, F., Lijnzaad, P., Argos, P., Sander, C., and Scharf, M. (1995). The doublecubic lattice method: Efficient approaches to numerical integration of surface area andvolume and to dot surface contouring of molecular assemblies. J. Comput. Chem. 16,273–284.

[76] Connolly, M. (1983). Solvent-accessible surfaces of proteins and nucleic acids. Science221, 709–713.

[77] Gilson, M., Sharp, K., and Honig, B. (1987). Calculating the eletrostatic potential ofproteins in solution: Method and error assessment. J. Comput. Chem. 9, 327–335.

[78] Metropolis, N., Rosenbluth, A., Rosenbluth, M., Teller, A., and Teller, E. (1953).Equation of state calculations by fast computing machines. J. Chem. Phys. 21, 1087–1092.

[79] Saraiva, L., Salgueiro, C., Costa, P., Messias, A., LeGall, J., van Dongen, W., andXavier, A. (1998). Replacement of lysine 45 by uncharged residues modulates theredox-Bohr effect in tetraheme cytochrome c3 of Desulfovibrio vulgaris (Hildenbo-rough). Biochemistry 37, 12160–12165.

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