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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA

LÍDIA INÁCIA DA SILVA RIBEIRO

COMPARAÇÃO DE METODOLOGIAS UTILIZANDO Daphnia sp. COMO

BIOINDICADOR DE TOXIDADE CRÔNICA E SUA APLICABILIDADE EM Daphnia

similis

Lorena

2017

LÍDIA INÁCIA DA SILVA RIBEIRO

COMPARAÇÃO DE METODOLOGIAS UTILIZANDO Daphnia sp. COMO

BIOINDICADOR DE TOXIDADE CRÔNICA E SUA APLICANILIDADE EM Daphnia

similis

Trabalho de conclusão de curso

apresentado à Escola de Engenharia de

Lorena – Universidade de São Paulo como

requisito parcial para conclusão da

Graduação do curso de Engenharia

Ambiental.

Orientadora: Profª. Dra. Teresa Cristina

Brazil de Paiva

Lorena

2017

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer ao meu pai, Vicente Ribeiro, que sempre deu grande

importância a minha educação, me ensinando a importância do saber, me motivando

a estudar e proporcionando todo o suporte necessário durante minha vida acadêmica.

Aos amigos Jaime Dias e Ana Lúcia Dias, que me acolheram nos primeiros

anos de formação. Obrigada por todo carinho e apoio em todos esses anos.

À minha mãe Maria Ceila da Silva Ribeiro, por sempre apoiar, incentivar e

acreditar em minha capacidade.

A meu irmão Eduardo Vinícius da Silva Ribeiro, pelos anos de convivência em

Lorena, pela paciência e apoio sempre oferecidos e pela nossa amizade.

À minha avó Maria das Graças Correia da Silva e ao meu avô Jairo Vicente da

Silva, pelos muitos anos de amor dedicados à mim e o apoio aos estudos.

Às minhas tias e amigas Elenice Ribeiro, Maria das Graças Goulart Pereira,

Maria Tereza Ribeiro Buschine, Maria Aparecida da Silva e ao meu tio e amigo José

Gilson da Silva, por todo apoio e amizade.

À Profa. Dra. Teresa Cristina Brazil de Paiva pela paciência e orientação

durante a elaboração deste trabalho, além da oportunidade da realização do estágio

e toda aprendizagem obtida.

À técnica responsável, Lucia Bernardes de Almeida e ao doutorando Lucas

Queiroz pela disposição em me auxiliar na execução do trabalho e pelo apoio durante

todos os momentos.

Aos professores Morun Bernardino Neto e Ana Paula Nola Deski, pela

participação na banca avaliadora e suas sugestões, contribuindo para a melhoria

desse trabalho.

A todos os professores que amam aquilo que fazem, servindo como exemplo e

ensinando o amor pelo saber. Especialmente ás professoras Regiane Florencio e

Renata Marques Luiz dos Santos, ás quais me acompanharam durante o ensino

médio e sem as quais eu não teria alcançado essa realização.

A todos os meus amigos de Lagoinha e Lorena, que me acompanharam e me

ajudaram a enfrentar muitas coisas ao longo desse caminho e estão sempre ao meu

lado.

“A felicidade só é real

quando compartilhada.”

Christopher McCandless

RESUMO

RIBEIRO, L. I. S. COMPARAÇÃO DE METODOLOGIAS UTILIZANDO Daphnia sp.

COMO BIOINDICADOR DE TOXIDADE CRÔNICA E SUA APLICABILIDADE EM

Daphnia similis. 2017. 47 p. Monografia (TCC) – Escola de Engenharia de Lorena,

Universidade de São Paulo, Lorena, 2017.

O gênero Daphnia, grupo mais antigo utilizado em ensaios de toxidade, tem

sua biologia amplamente estudada e grande participação na comunidade

zooplanctônica em todo o mundo. Dentre as mais utilizadas em ensaios

ecotoxicológicos podemos destacar D. pulex, D. pulicaria, D. magna e D. similis

(BEATRICI, 2004). Diversos motivos são responsáveis por tal posição. Dentre eles, a

importante posição ecológica que ocupa nas teias tróficas aquáticas e as importantes

consequências, em todos os níveis do sistema aquático, em caso de alterações que

ocorram nas populações. Constituem uma fonte de alimento relevante para a

comunidade de peixes e são organismos relativamente fáceis de cultivar em ambiente

não natural e de manusear ao longo de procedimentos experimentais (Castro et al.

2009). Embora não seja uma espécie nativa, D. similis é uma das espécies mais

estudadas e utilizadas no país, assim como D. magna (ZAGATTO, 1988). Seu uso

como bioindicador para avaliação da toxicidade aguda é usualmente o primeiro teste

a ser aplicado, pois se trata de um teste rápido e a espécie altamente sensível a uma

grande diversidade de poluentes (CETESB 1990). Toda via, poucos estudos utilizam

Daphnia similis em ensaios crônicos. Considerando sua relevância nos atuais

modelos em estudos ecotoxicológicos aquáticos e sua fácil manutenção em

laboratório, este trabalho visa comparar as diferentes metodologias de avaliação de

toxidade crônica em Daphnia sp. existentes, aplicando-as a Daphnia similis e

comparando-a a métodos já normatizados para testes crônicos. Averiguando as

melhores condições para viabilidade do teste e sua padronização.

Palavras-chave: Daphnia similis, toxidade crônica, toxicidade.

ABSTRACT

RIBEIRO, L. I. S. COMPARATION OF METHODOLOGIES USING Daphnia sp. AS

A CHRONIC TOXICITY BIOINDICATOR AND ITS APPLICABILITY IN Daphnia

similis. 2017. 47 p. Monografia (TCC) – Escola de Engenharia de Lorena,

Universidade de São Paulo, Lorena, 2017.

The genus Daphnia, the oldest group used in toxicity trials, has its biology widely

studied and large participation in the zooplankton community worldwide. Among the

most used in ecotoxicological trials we can highlight D. pulex, D. pulicaria, D. magna

and D. similis (BEATRICI, 2004). Several reasons are responsible for such a position.

These include the important ecological position it occupies in the aquatic webs and the

important consequences at all levels of the aquatic system in case of changes that

occur in their populations. They are a relevant food source for the fish community and

are relatively easy to grow in an unnatural environment and to be handled through

experimental procedures (Castro et al., 2009). Although not a native species, D. similis

is one of the most studied and used species in the country, as well as D. magna

(ZAGATTO, 1988). Its use as a bioindicator for the evaluation of acute toxicity is usually

the first test to be applied, since it is a rapid test and the species highly sensitive to a

great diversity of pollutants (CETESB 1990). However, few studies have used D. similis

in chronic trials. Considering its relevance in the current models in aquatic

ecotoxicological studies and its easy maintenance in the laboratory, this work aims to

compare the different methodologies of evaluation of chronic toxicity in Daphnia sp.

applied to Daphnia similis and comparing it to already standardized methods for

chronic tests. Finding the best conditions for the feasibility of the test and its

standardization.

Key words: Daphnia similis, chronic toxicity, toxicity.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Morfologia Daphnia similis........................................................................17

Figura 2 - Representação esquemática da reprodução partenogenética de D.

magna.........................................................................................................................18

Figura 3 – Ovos de resistência (efípio).......................................................................18

Figura 4 – Ceriodaphnia dubia....................................................................................20

Figura 5 - Raphidocelis subcapitata............................................................................21

Figura 6 – Cristalizadores utilizados no cultivo de D. similis........................................24

Figura 7 – Cubas utilizadas no cultivo de Ceriodaphnia dubia....................................27

Figura 8 - Visualização Microscópica da Câmara de Neubauer..................................32

Figura 9 – Neonatos produzidos por D. similis em cada troca nos diferentes

ensaios.......................................................................................................................35

Figura 10 – Média de neonatos produzidos por D. similis em diferentes

ensaios.......................................................................................................................36

Figura 11 – Mortalidade em diferentes cultivos de D. similis.....................................37

Figura 12 – Neonatos produzidos por D. similis em diferentes concentrações de cloreto

de sódio......................................................................................................................38

Figura 13 – Neonatos produzidos por Ceriodaphnia dubia em diferentes

concentrações de cloreto de sódio.............................................................................40

Figura 14 – Biomassa algal produzidas nos testes de toxidade crônica em diferentes

concentrações da solução de NaCl – Teste Crônico Raphidocelis

subcapitata.................................................................................................................41

Figura 15 – Inibição do crescimento algal em diferentes concentrações da solução de

NaCl comparadas ao controle – Teste Crônico Raphidocelis subcapitata.................42

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Testes de toxidade padronizados pela ABNT e CETESB.......................14

Quadro 2 - Soluções para o preparo da água de cultivo e diluição – Meio MS.........25

Quadro 3 - Soluções para o preparo da água de cultivo e diluição...........................27

Quadro 4 - Meio de cultivo L. C. Oligo......................................................................29

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Normas referentes aos organismos utilizados..........................................16

Tabela 2 – Testes crônicos utilizando Daphnia sp......................................................19

Tabela 3 – Média de neonatos produzidos por D. similis em diferentes ensaios.......36

Tabela 4 – Neonatos produzidos por D.similis em diferentes concentrações de cloreto

de sódio......................................................................................................................38

Tabela 5 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio na produção de

neonatos por D.similis.................................................................................................39

Tabela 6 – Neonatos produzidos por Ceriodaphnia dubia em diferentes concentrações

de cloreto de sódio......................................................................................................39


neonatos por Ceriodaphnia dubia..............................................................................40

Tabela 8 – Biomassa algal produzidas nos testes de toxidade crônica em diferentes

concentrações da solução de NaCl – Teste Crônico Raphidocelis

subcapitata.................................................................................................................41


biomassa algal por Raphidocelis subcapitata............................................................42

Tabela 10 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio em diferentes

testes de toxidade crônica..........................................................................................43

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 11

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 13

2.1 Teste de Toxidade ............................................................................................... 13

2.2 Organismos Teste ............................................................................................... 15

2.2.1 Daphnia similis ................................................................................................. 16

2.2.2 Ceriodaphnia .................................................................................................... 20

2.2.3 Raphidocelis subcapitata .................................................................................. 21

3 OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 23

3.1 Objetivos específicos .......................................................................................... 23

4 METODOLOGIA .................................................................................................... 24

4.1 Manutenção e cultivo .......................................................................................... 24

4.1.1 Daphnia similis ................................................................................................. 24

4.1.2 Ceriodaphnia dubia .......................................................................................... 26

4.1.3 Raphidocelis subcapitata .................................................................................. 28

4.2 Solução Teste ..................................................................................................... 30

4.3 Daphnia similis – Ensaio de fertilidade e teste Crônico ....................................... 30

4.4 Ceriodaphnia dubia -Teste Crônico ..................................................................... 31

4.5 Raphidocelis subcapitata - Teste Crônico ........................................................... 32

4.6 Avaliação estatística dos resultados ................................................................... 33

5 RESULTADOS E DISCUSSSÃO ........................................................................... 35

6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 44

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 45

11

1 INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, em especial no pós-Revolução Industrial, uma imensa gama

de substâncias químicas foram produzidas de forma intencional ou como subproduto

de atividades produtivas. Algumas dessas substâncias são essencialmente sintéticas

como pesticidas e fármacos. Já outras, apesar de terem ocorrência natural, tiveram

sua concentração aumentada no meio ambiente, como ocorre com os hormônios.

Nesse aspecto surge uma nova e vasta gama de micropoluentes, fonte de potenciais

impactos desconhecidos (BILA; DEZOTTI, 2007).

A ecotoxicologia foi formada dada a necessidade de se conhecer os efeitos que

tais poluentes, emergentes ou não, exercem quando lançados no meio ambiente,

sobre populações e comunidades de organismos e como o homem pode ser afetado

(FONSECA, 1991).

Para identificar os efeitos destas substâncias sobre a biota aquática, a

ecotoxicologia utiliza testes de toxicidade com organismos presentes em águas

continentais, estuarinas e marinhas, seja em condições laboratoriais ou de campo.

Tais testes possibilitam estabelecer limites permissíveis para várias substâncias

químicas, avaliando o impacto da mistura de diversos poluentes sobre os organismos

aquáticos dos corpos hídricos receptores (BERTOLETTI, 1990).

Tal determinação é realizada através das concentrações em que determinado

agente químico ou, em que concentrações, determinado efluente é potencialmente

prejudicial ao corpo receptor. Onde, determinado poluente pode não produzir um

efeito adverso se a concentração do produto for baixa, ou o tempo de contato for

insuficiente. Entretanto, concentração e o tempo de exposição do microrganismo

estão diretamente relacionados, de maneira que altas concentrações poderão ter

efeitos prejudiciais em curtos tempos de exposição. Pequenas concentrações

geralmente produzem efeitos crônicos sub-letais e, até mesmo, letais durante longos

períodos de exposição. (FONSECA, 1991).

Enquanto a análise química identifica e quantifica substâncias em um efluente

ou corpo hídrico, o ensaio ecotoxicológico detecta informações sobre o efeito conjunto

de várias substâncias, que interagindo podem afetar a biota presente no ambiente

aquático. Toda via, a grande diversidade e complexidade das substâncias existentes

num mesmo efluente ou corpo hídrico torna inviável a sua completa caracterização,

não só do ponto de vista analítico, como do econômico. (CETESB, 1986).

12

Desta maneira, os testes de toxicidade com organismos têm sido utilizados e

apresentam grande importância na complementação das análises físico-químicas.

Através do qual, podem ser estabelecidos padrões de emissão que permitam

identificar problemas de lançamento em efluentes e contaminantes complexos,

envolvendo a misturas de diferentes substâncias.

O gênero Daphnia, grupo mais antigo utilizado em ensaios de toxidade, tem

sua biologia amplamente estudada e grande participação na comunidade

zooplanctônica em todo o mundo. Dentre as mais utilizadas em ensaios

ecotoxicológicos podemos destacar D. pulex, D. pulicaria, D. magna e D. similis

(BEATRICI et al., 2006)

Diversos motivos são responsáveis por tal posição. Dentre eles, a importante

posição ecológica que ocupa nas teias tróficas aquáticas e as importantes

consequências em todos os níveis do sistema aquático em caso de alterações que

ocorram nas suas populações. Constituem uma fonte de alimento relevante para a

comunidade de peixes e são organismos relativamente fáceis de cultivar em ambiente

não natural e de manusear ao longo de procedimentos experimentais (CASTRO et al.,

2009).

Considerando sua relevância nos atuais modelos em estudos ecotoxicológicos

aquáticos e fácil manutenção em laboratório, este trabalho visa comparar as diferentes

metodologias de avaliação de toxidade crônica em Daphnia sp. existentes, aplicando

a Daphnia similis e comparando a métodos já normatizados para testes crônicos.

Averiguando as melhores condições para viabilidade do teste e sua padronização.

13

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Teste de Toxidade

A ecotoxicologia permite o desenvolvimento de protocolos de testes de

toxicidade a partir dos quais, é possível definir limiares de toxicidade. Gerando

parâmetros fundamentais para criação de leis, fiscalização e controle da qualidade de

rios. Diversos órgãos de proteção ambiental vêm se concentrando na elaboração e

validação de sistemas e testes diagnósticos na busca por estratégias que visam

proteger os ecossistemas (RONCO et al., 2004).

A utilização de testes padronizados tem como vantagem proporcionar sua

uniformidade, facilitando a comparação dos dados de diferentes laboratórios e sua

reprodutibilidade, contribuindo assim para o aumento da utilização dos dados

publicados (RONCO et al., 2004).

No Brasil, os principais órgãos responsáveis pelo desenvolvimento de

protocolos de testes de toxicidade são a Associação Brasileira de Normas Técnicas

(ABNT) e a Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental do Estado de São

Paulo (CETESB).

Já no mundo, American Society for Testing and Materials (ASTM), Organisation

for Economic Cooperationand Development (OECD), Association of Analytical

Communities (AOAC) e International Organization for Standardization (ISO), são

alguns dos principais órgãos de proteção ambiental.

A Quadro 1 representa as principais normas brasileiras referentes aos testes

de toxicidade aquática.

14

Quadro 1 - Testes de toxidade padronizados pela ABNT e CETESB.

Organismo Efeito Espécie Normas brasileiras

Bactéria Agudo Vibrio fischeri CETESB, L5.227

Bactéria Agudo Spirillum volutans CETESB, L5.228

Alga Crônico Chlorella vulgaris, Scenedesmus

subspicatus,

Pseudokirchneriella subcapitata

CETESB, L5.020 e

ABNT, NBR12648

Microcrustáceo Agudo Daphnia similis, Daphnia magna CETESB, L5.018 e

ABNT, NBR12713

Microcrustáceo Agudo Artemia salina CETESB, L5.021

Microcrustáceo Crônico Ceriodaphnia dubia, Ceriodaphnia

silvestrii

CETESB, L5.022 e

ABNT, NBR13373

Peixe Agudo Danio rerio, Pimephales promelas CETESB, L5.019 e

ABNT, NBR15088

Fonte: OLIVI; COSTA, 2008

Os testes de toxicidade podem ser classificados em agudos e crônicos. E

diferem-se na duração e nas respostas finais a serem medidas. Os testes de

toxicidade aguda medem os efeitos de agentes tóxicos sobre espécies aquáticas

durante um curto período de tempo em relação ao seu período de vida. E têm como

objetivo estimar a concentração de um agente tóxico que será capaz de produzir uma

resposta específica mensurável em um organismo-teste, em um período de tempo

relativamente curto, geralmente de 24 a 96 h (OLIVI; COSTA, 2008).

Normalmente, o efeito medido em estudos de toxicidade aguda com

organismos aquáticos é a letalidade ou alguma outra manifestação do organismo que

a anteceda, por exemplo, o estado de imobilidade. Em testes crônicos, as variáveis

estudadas são utilizadas, por exemplo, o crescimento e a reprodução dos animais, de

modo que uma boa alimentação será crucial na garantia de um resultado confiável.

Em ensaios de toxicidade aguda, os animais podem ou não ser alimentados. Cada

procedimento possui suas vantagens e desvantagens (OLIVI; COSTA, 2008).

Para avaliação de testes de toxicidade crônica, utilizam-se normalmente os

parâmetros CENO (Concentração do Efeito Não Observado), no qual é determinada

a concentração do agente tóxico que não causa o efeito observado, ou CEO

(Concentração do Efeito Observado), no qual a resposta representará a concentração

que causa o efeito observado (CETESB, 1990).

15

2.2 Organismos Teste

Cesar et al. (1997), destaca que dentre diversas espécies de organismos

empregadas internacionalmente em testes de toxicidade, os seguintes grupos de

organismos são vastamente utilizados em ensaios laboratoriais: bactérias, peixes,

oligoquetas, microalgas, microcrustáceos, equinoides e poliquetas.

Para Olivi e Costa (2008), tais grupos, que representam diversos ecossistemas

e níveis tróficos, geram subsídios importantíssimos para a avaliação e caracterização

dos efeitos agudos e crônicos em diversos agentes tóxicos e corpos receptores. E a

sua escolha deve respeitar critérios como:

- Significativa representação ecológica dentro das biocenoses;

- Conhecimento da biologia, fisiologia e hábitos alimentares;

- Estabilidade genética e uniformidade das populações;

- Baixo índice de sazonalidade;

- Sensibilidade constante e apurada.

Desta forma o conhecimento da biologia, cultivo e manutenção de organismos

em laboratório, constituem aspectos fundamentais para a execução, interpretação e

confiabilidade dos resultados de um teste de toxicidade. No entanto, é sabido que não

existe uma única espécie de organismo-teste capaz de representar integralmente

todos os efeitos causados em um determinado ecossistema. Sendo necessário

empregar espécies de diferentes níveis da cadeia alimentar, a fim de se obter

resultados mais precisos (PEREIRA, 2008).

Na tabela 1, são apresentadas as normas referentes aos organismos utilizados

neste trabalho, assim como parâmetros avaliados e seus requisitos.

16

Tabela 1 – Normas referentes aos organismos utilizados.

Organismo Daphnia similis Ceriodaphnia dubia Raphidocelis subcapitata

Tipo Agudo Crônico Crônico

Norma NBR 12.713/04 NBR13.373/10 NBR 12648/05

Duração 48 horas 8 dias 96 horas

Tipo Estático Semi-estático Estático

Alimentação NÃO

SIM

*Diariamente NÃO

Nº de organismos por

réplica 5 1 105 cel/mL

Vol. de sol. Teste por

réplica 20 ml 15 ml 50 ml

Nº de replicas 4 10 3

Parâmetro avaliado Mortalidade Nº de neonatos Crescimento

Fonte: próprio autor.

2.2.1 Daphnia similis

Também conhecidas como “pulgas d’água” e pertencentes ao grupo Cladocera,

as Daphnias (Figura 1) são comumente encontradas em lagos e represas de águas

continentais. Possuem cerca de 0,1 a 5,0 mm de comprimento e são dotadas de uma

carapaça transparente bivalve. Quando em condições naturais, alimentam-se

basicamente de algas, bactérias e protozoários, além de uma grande variedade de

detritos orgânicos, os quais são capturados através de seu sistema de filtragem. No

qual, mecanismos complexos fazem com que as partículas alimentares coletadas

sejam transferidas para um sulco alimentar meio-ventral, onde são envolvidas em

muco e depois movidas para frente até as maxilas, que empurram o alimento para o

interior da boca (CESAR et al.,1997).

17

Figura 1 – Morfologia Daphnia similis.

Fonte: RUPPERT e BARNES, 1996; PPHOTOEX, 2015

Sua estratégia reprodutiva (Figura 2) pode alternar entre assexuada

(partenogênese) e sexuada, o que dependerá das condições ambientais presentes.

Na assexuada o crescimento e desenvolvimento de um embrião se dá sem a

fertilização, levando ao aumento rápido da população, formada apenas por clones

fêmeas e expandindo substancialmente o número de indivíduos. Em condições

ambientais desvantajosas ocorre a fase sexuada, onde originam-se ovos de

resistência, conhecidos como efípio (Figura 3), que são capazes de sobreviver em

estado latente. Eclodindo apenas quando as circunstâncias voltarem a ser favoráveis

e desta forma, possibilitando a conservação da população (PEREIRA, 2008).

18

FIGURA 2 - Representação esquemática da reprodução partenogenética de D. magna.

Fonte: PEREIRA, 2008.

Figura 3 – Ovos de resistência (efípio).

Fonte: PPHOTOEX, 2015

19

Em condições naturais, Jaconetti (2005) observou que os picos reprodutivos

ocorrem entre o 7° e o 18° dia do ciclo de vida, mostrando que as fêmeas apresentam

tendência a diminuir o número de filhotes produzidos a partir o 20° dia.

Tais organismos são importantes em muitas cadeias alimentares, servindo

como uma importante fonte de alimento para peixes. Além disso, características como

ciclo de vida relativamente curto, facilidade de seu cultivo em laboratório, sensibilidade

a vários contaminantes do ambiente aquático e necessidade de menores volumes de

água de diluição devido ao seu pequeno tamanho e, consequentemente, menores

volumes de amostras-teste, são responsáveis pelo grande emprego do

microcrustáceo como bioindicador em testes de toxidade (SHAW; CHADWICK, 1998,

p. 1927, apud OLIVI; COSTA, 2008)

Embora não seja uma espécie nativa, D. similis é uma das espécies mais

estudadas e utilizadas no país, assim como D. magna (ZAGATTO, 1988). Sua

utilização é relatada em inúmeros trabalhos recentes, abrangendo ensaios de diversos

contaminantes emergentes, como nanopartículas, cosméticos e fármacos (ZHANG,

2017; RATH et al., 2016).

Seu uso como bioindicador para avaliação da toxicidade aguda é usualmente

o primeiro teste a ser aplicado, pois se trata de um teste rápido e a espécie altamente

sensível a uma grande diversidade de poluentes (CETESB, 1990). Toda via, poucos

estudos a utilizam D. similis em ensaios crônicos.

A Tabela 2 apresenta os principais estudos utilizados nesse trabalho para a

realização dos testes crônicos utilizando D. similis.

Tabela 2 – Testes crônicos utilizando Daphnia sp.

Referência

OECD Guidelines for the

Testing of Chemicals. Test

211, ano 2012.

SOTERO-

SANTOS et

al, 2005.

PRESTES

et al, 2013.

Organismo D. magna D. similis D. similis

Volume de

amostra 50 - 100 mL 20 mL 40 mL

Nº de réplica 10 10 4

Org. por réplica 1 1 6

Fonte: próprio autor.

20

2.2.2 Ceriodaphnia

Pertencentes à família Daphnidae, as Ceriodaphnias possuem cultivo e biologia

semelhantes aos das Daphnias. Porém são menores e possuem ciclo reprodutivos

mais curto, produzindo de três a quatro crias por semana em condições ótimas.

Apresentam ampla distribuição, e são consideradas uma das famílias mais

diversificadas nas regiões temperadas (RAND, 1995).

O gênero é o mais representativo de águas do território brasileiro (ROCHA et

al, 1995). Tendo sua ocorrência relatada na maioria dos reservatórios brasileiro, em

muitos trabalhos sobre a diversidade de cladóceros (SAMPAIO, 2002; GÜNTZEL,

2000; ROCHA, 2000).

Figura 4 – Ceriodaphnia dubia.

Fonte: UNH Center for Fleshwater Biology

Em espécies nativas como C. silvestrii, o tamanho varia entre 0,39 mm ao

nascer, 0,73 mm na primeira reprodução e 1,06 mm do adulto. A reprodução de C.

silvestrii inicia-se no 5°dia, alcançando as três primeiras posturas entre 8 e 10 dias,

portanto, para ensaios crônicos a duração dos testes será entre 8 e 10 dias, sendo

que o teste deverá ser finalizado quando a espécie alcançar três posturas

(JACONETTI, 2005).

21

2.2.3 Raphidocelis subcapitata

Anteriormente conhecida como Selenastrum capricornutum e

Pseudokirchneriella subcapitata, Raphidocelis subcapitata (Figura 5) é uma microalga

de aparência curvada e torcida. São unicelulares e possuem comprimento entre 8 e

14 μm, e uma largura entre 2 e 3 μm. É comumente usada como bioindicadora para

avaliação dos níveis de nutrientes ou substâncias tóxicas em ambientes de água doce.

Esta espécie é bastante sensível à presença de substâncias tóxicas, incluindo metais

e tem uma vasta distribuição (KRIENITZ et al., 2011).

FIGURA 5 - Raphidocelis subcapitata.

Fonte: Algae Resourse Database, 2006.

São componentes importantes na cadeia alimentar do ambiente aquático,

sendo responsável não somente pela produção primária, mas também pelo

estabelecimento de importantes relações bióticas. Sua utilização em testes de

toxicidade apresenta grande importância já que qualquer alteração da composição

específica da comunidade fitoplanctônica pode afetar a base e a função de todo o

ecossistema (SILVA, 2012). Além disso, seu ciclo de vida curto, altas taxas de

crescimento, facilidade para manter as culturas e sua capacidade de crescer em

22

meios sintéticos bem definidos, faz deste o organismo um dos mais importantes para

avaliação da toxicidade aquática (VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004)

Nos testes ecotoxicológico utilizando Raphidocelis subcapitata, o parâmetro

avaliado é a inibição ou estimulo do crescimento algáceo, devido ao fator de estresse

ocasionado em função da exposição às amostras, ambientais ou não, em relação ao

controle laboratorial. Em testes algáceos a produção de clorofila e possíveis

alterações morfológicas, entre outras respostas, também podem ser avaliadas

(SILVA, 2012).

23

3 OBJETIVO GERAL

Utilizar Daphnia similis como bioindicador de toxidade crônica e comparar a

viabilidade de diferentes métodos de avaliação.

3.1 Objetivos específicos

Adotar o organismo Daphnia similis como bioindicador de toxidade

crônica;

Comparar metodologias existentes de avaliação de toxidade crônica que

utilizam Daphnia sp. e aplicá-las a Daphnia similis.

Comparar a sensibilidade dos resultados dos testes de toxicidade

crônica com Daphnia similis com a dos resultados obtidos a partir dos

organismos Ceriodaphnia dubia e Raphidocelis subcapitata.

24

4 METODOLOGIA

4.1 Manutenção e cultivo

4.1.1 Daphnia similis

Os organismos foram mantidos em cristalizadores (Figura 6), com capacidade

de 1,8 litros, onde foram alocados aproximadamente 50 organismos em 1,6 litros de

água reconstituída. A água reconstituída teve sua dureza, pH e condutividade

previamente testados e aprovados. Os parâmetros de pH devem estar entre 7,0 e 7,6

e a dureza total deve ser em torno de 40 a 48 mg/L de CaCO3.

Figura 6 – Cristalizadores utilizados no cultivo de D. similis.

Fonte: Próprio autor.

O meio MS, proposto por Keating (1985), foi preparado a partir das soluções

descridas no Quadro 2. Das quais, foram utilizadas cerca de 5 mL das soluções 1 e

2; 1,0 mL de cada umas das soluções 3, 4, 5, 6, e 7; e 4,0 mL da solução estoque

para cada litro de água reconstituída preparada.

25

Quadro 2: Soluções para o preparo da água de cultivo e diluição – Meio MS.

Solução Reagente Qnt (g) Preparo

1

NaNO2 10

Dissolver e diluir com água destilada em

balão volumétrico de 1000 mL

Na2SiO3 1,718

KH2PO4 1,8125

K2HPO4 2

2

KCl 2 Dissolver e diluir com água destilada em

balão volumétrico de 1000 mL MgSO4.7H2O 5,1455

3 CaCl Dissolver e diluir com água destilada em


4

EDTA 1,25

Dissolver e diluir com água destilada em


H3BO3 1,4

FeCl3.6H2O 0,483

MnCl2.4H2O 0,18

LiCl 0,1517

RbCl 0,0355

SrCl2.6H2O 0,0758

NaBr 0,016

Na2MoO4.2H2O 0,0315

CuCl2.2H2O 0,0168

ZnCl2 0,013

CoCl2.6H2O 0,005

KI 0,00165

5 SeO2 0,0014 Dissolver e diluir com água destilada em


6 NH4VO3 0,0011 Dissolver e diluir com água destilada em


7 Vitamina B12 0,0010 Dissolver e diluir com água destilada em


Fonte: KEATING, 1985.

26

Em casos onde a dureza da água apresentou valores inferiores a 40 mg

CaCO3/L, o volume de solução a ser acrescentada para cada miligrama de dureza a

ser aumentado foi de 0,5 mL da solução 1 e 0,25 mL da solução 2 por litro de água

reconstituída.

As culturas foram mantidas em câmaras de germinação (SOLAB - Mod. DAKO

340), com a temperatura controlada em 20 +/- 2°C e fotoperíodo de 16 horas de luz e

8 horas de escuro, a uma intensidade luminosa de, aproximadamente, 1000 lux.

A sala de manutenção das culturas foi mantida limpa, isenta de poeira e

vapores tóxicos. Apesar da importância da manutenção da temperatura para

sobrevivência destes organismos, não foi possível controlar a temperatura do

ambiente durante as trocas do cultivo.

Os organismos foram alimentados diariamente com 1,5 mL de alimento

composto e 2,5 mL da alga Raphidocelis subcapitata e sua água de cultivo trocada

duas vezes por semana. A cada troca foi realizado o controle do tempo de vida dos

organismos em semanas. E os neonatos provenientes dos organismos com faixa

etária entre uma a duas semanas foram utilizados para realização de testes e abertura

de novas culturas. Neonatos remanescentes e organismos com mais de três semanas

de vida foram descartados.

Mensalmente, foram feitos testes para a avaliação da sensibilidade do

organismo teste. No qual os organismos foram expostos a substância referência,

cloreto de sódio, conforme as condições do ensaio definitivo para toxidade aguda

descritas na NBR 12713/04.

4.1.2 Ceriodaphnia dubia

O cultivo foi realizado em cubas com capacidade de 4 litros (Figura 7), onde se

adicionam aproximadamente de 50 organismos em 3 litros de água natural de boa

qualidade, corrigida e isenta de contaminação. A água utilizada era proveniente de

fonte natural, coletada na divisa do estado de São Paulo com Minas Gerais, no

município de Delfim Moreira – MG, no Km 0 da BR459 e a 1700 m de altitude. Antes

de sua utilização, a água coletada foi filtrada em rede de plâncton com malha de 30 a

45 mm e sua teve sua dureza testada e corrigida para valores em torno de 40 a 48

mg/L de CaCO3.

27

Figura 7 – Cubas utilizadas no cultivo de Ceriodaphnia dubia.


Sua correção foi realizada a partir das soluções descridas no Quadro 3. Onde,

foram utilizadas cerca de 20 mL da solução 1 e 10 mL da solução 2 para cada litro de

água reconstituída preparada.

Quadro 3 - Soluções para o preparo da água de cultivo e diluição.

Solução Reagente Qnt (mg) Preparo

1 CaSO4.2H2O 1500 Dissolver e diluir com água destilada em

balão volumétrico de 1000 Ml

2

KCl 200 Dissolver e diluir com água destilada em

balão volumétrico de 1000 mL NaHCO3 4800

MgSO4.7H2O 6100

Fonte: ABNT NBR 13373, 2010.

Em casos onde a dureza da água apresentou valores inferiores a 40 mg

CaCO3/L, o volume de solução a ser acrescentada para cada miligrama de dureza a

ser aumentado foi de 0,5 mL da solução 1 e 0,25 mL da solução 2 por litro de água

reconstituída.

Após a correção, os parâmetros de pH foram novamente medidos. Devendo

estar entre 7,0 e 7,6.

28

Os organismos foram alimentados diariamente com 1,5 mL de alimento

composto e 1,5 mL da alga Raphidocelis subcapitata e sua água de cultivo trocada

duas vezes por semana. A cada troca foi realizado o controle do tempo de vida dos

organismos em semanas.

A sala de manutenção das culturas foi mantida limpa, isenta de poeira e

vapores tóxicos. As culturas foram mantidas em câmaras de germinação (SOLAB -

Mod. DAKO 340), com a temperatura controlada em 20 +/- 2°C e fotoperíodo de 16

horas de luz e 8 horas de escuro, a uma intensidade luminosa de, aproximadamente,

1000 lux.

Mensalmente, foram feitos testes para a avaliação da sensibilidade do

organismo teste. No qual os organismos foram expostos à substância referência,

cloreto de sódio, conforme as condições do ensaio definitivo descritos na seção

Ceriodaphnia dubia – Teste Crônico.

4.1.3 Raphidocelis subcapitata

Para o preparo do meio de cultura L. C. Oligo (Quadro 4), foram dispostos em

um erlenmeyer de 2 L, 2 mL das soluções 1,2,3,4 e 7 e 1 mL das soluções 5 e 6 e o

volume completado para 2 L com água destilada.

29

Quadro 4 - Meio de cultivo L. C. Oligo

Meio L. C. Oligo Qnt (mg) Preparo

Solução

1 (Ca(NO3)2.4H2O 4000

Dissolver e completar para 100 mL de

água destilada.

Solução

2 (KNO3) 10000


água destilada.

Solução

3 (MgSO4.7H2O) 3000


água destilada.

Solução

4 (K2HPO4) 4000


água destilada.

Solução

5

CuSO4.5H2O 30


água destilada.

(NH4)6Mo7O2.4H2O 60

ZnSO4.7H2O 60

CoCl2.6H2O 60

Mn(NO3)2.4H2O 60

C6H8O2.H2O 60

H3BO3 60

Solução

6

C6H5FeO7.5H2O 1625 Dissolver e completar para 1000 mL de

água destilada. FeCl3.6H2O 625

FeSO4.7H2O 625

Solução

7 NaHCO3 15000


água destilada.

FONTE: ABNT NBR 12648, 2005

O meio permaneceu sob agitação por uma hora e após sua homogeneização,

100 mL da solução meio foram distribuídos em três erlenmeyers de 125 mL, o restante

da solução foi mantido em erlenmeyers de um ou dois litros. Cada erlenmeyer foi

tampado com rolha de algodão e coberto com papel alumínio, a fim de evitar a

umidade da autoclave entre em contato com o interior da vidraria.

Após sua preparação, os erlenmeyers foram esterilizados em autoclave,

permanecendo na mesma durante 15 minutos a partir do momento em que a pressão

alcança o valor de 1kgf/cm2.

Após a esterilização do meio, a “semente” da alga, previamente reservada em

incubadora, foi levada, juntamente com os materiais esterilizados, para a câmara de

fluxo laminar (visando evitar contaminação do material manipulado) onde foi realizada

a semeadura da alga nos erlenmeyers esterilizados.

30

Após a semeadura, foi acoplado uma das pontas do cabo de aeração no

erlenmeyer de dois litros e outra em uma bomba de aquário, garantindo a aeração do

meio. Os três erlenmeyers pequenos foram acomodados no shaker sob agitação de

cerca de 150 rpm e temperatura máxima de 28ºC durante de 5 a 7 dias e expostas a

luz artificial.

Após seu cultivo, os erlenmeyers de 125 mL serviram como novas “sementes” e a

alga produzida no erlenmeyer de dois litros, levada para centrifugação e lavagem e

posteriormente utilizada como alimento de outros organismos.

Mensamente, foram feitos testes para a avaliação da sensibilidade do

organismo teste. No qual os organismos foram expostos a substância referência,

dicromato de potássio, conforme as condições do ensaio definitivo descrito na seção

Raphidocelis subcapitata – Teste crônico.

4.2 Solução Teste

Para cada um dos testes propostos foram preparadas soluções de cloreto de

sódio nas seguintes concentrações 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 g/L.

Em cada teste, a solubilização do cloreto de sódio foi realizada com a água de

cultivo utilizada para manutenção de cada um dos organismos teste. Visando assim,

oferecer todos os nutrientes necessários para o desenvolvimento do organismo e

garantir que o composto padrão utilizado nos testes seja o único agente inibidor

possível.

Os parâmetros para a preparação de cada meio de cultivo estão apresentados

na seção manutenção e cultivo.

4.3 Daphnia similis – Ensaio de fertilidade e teste Crônico

Neonatos, entre 6 e 24 horas de vida, foram alocados em béquers de 100 mL

contendo diferentes volumes de solução teste e alimentados com 70 µg de Alimento

Composto e 100 µg da alga Raphidocelis subcapitata.

A troca da solução teste, assim como a contagem dos organismos vivos e

neonatos e sua alimentação, foi realizada a cada três dias sempre que possível. Aos

finais de semana a troca da solução não era realizada e para tanto a alimentação do

meio na sexta-feira correspondeu ao dobro da originalmente proposta.

31

Para o Ensaio A, cinco neonatos foram dispostos em 50 mL de solução teste

quatro réplicas foram utilizadas. Nos ensaios B e C, foram utilizadas dez réplicas,

contendo um neonato cada. O volume de solução teste utilizado foi respectivamente

de 20 mL e 40 mL.

Os resultados foram considerados validos quando, ao final do ensaio, a

mortalidade dos organismos adultos no controle não excedeu 20% e o número médio

de organismos jovens produzidos por fêmea no controle foi igual ou maior que 40

(USEPA, 2002).

Em todos os diferentes ensaios de toxicidade crônica propostos para Daphnia

similis, os béqueres foram dispostos em bandejas e levados à incubadora durante 21

dias e fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro, a uma intensidade luminosa

de, aproximadamente, 1000 lux.

4.4 Ceriodaphnia dubia -Teste Crônico

No teste foram utilizadas Ceriodaphnias jovens, de no máximo 24 horas de

idade, tendo todas nascidas dentro de um período de 8 horas e obtidas a partir de

culturas mantidas em condições laboratoriais padronizadas.

Cada organismo jovem foi adicionado em béquer contendo 20 mL das

respectivas soluções teste e alimento. Os organismos foram mantidos à temperatura

de 20 ± 2 ºC, com fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 de escuridão. E alimentados

diariamente com o mesmo tipo de alimento e com a mesma quantidade empregada

na manutenção das culturas.

No final do período de exposição, determinou-se o número médio de jovens

produzidos e o número de fêmeas adultas sobreviventes.

Os resultados foram considerados validos, quando ao final do ensaio, a

mortalidade dos organismos adultos no controle não excedeu 20% e o número médio

de organismos jovens produzidos por fêmea no controle foi igual ou maior que 15

(ABNT NBR 12648, 2005).

32

4.5 Raphidocelis subcapitata - Teste Crônico

O teste com a alga foi realizado ao longo de 96 horas, em triplicata, analisando-

se cinco concentrações distintas mais o controle.

As soluções-teste foram constituídas do meio de cultura, do inoculo, dos

volumes definidos de solução estoque e de água destilada para se obter as

concentrações necessárias.

A preparação do teste é semelhante à da produção e cultivo da alga. Sendo

cultivada no meio L.C.Oligo, e preparada conforme descrito na seção Manutenção e

Cultivo. Ao final das 96 horas foi realizada a contagem dos organismos e amostras

resultantes, levadas para análise em microscópio em Câmara de Contagem de

Neubauer.

Após o ajuste do microscópio, a contagem das células foi feita de acordo com

a sequência A, B, C, D e E ilustradas na Figura 6. O número de células contadas em

A, B, C, D e E para cada uma das malhas (a Câmara de Neubauer apresenta duas

malhas) foi somado e feito uma média desses valores.

Figura 8 - Visualização Microscópica da Câmara de Neubauer.

Fonte: ALGAE RESOURSE DATABASE, 2017.

Os resultados foram considerados validos, quando ao final do ensaio, o

crescimento da biomassa algácea média do controle for superior a 100 vezes a

biomassa inicial em 96 h de exposição e o coeficiente de variação da biomassa

algácea das replicatas do controle menor ou igual a 20% (NBR 12648, 2005).

33

4.6 Avaliação estatística dos resultados

Diferentes níveis de efeito tóxico podem ser obtidos em função das diferentes

diluições do agente químico ou condição, empregada nos experimentos de toxicidade.

Desta forma, é necessário dispor de métodos estatísticos para determinar um único

valor, que represente o conjunto dos dados gerados. Para os testes de toxicidade

crônica e crônica de curta duração, determinam-se a Concentração de Efeito Não

Observado (CENO), a qual representa a maior concentração onde não se observa

efeito e a Concentração de Efeito Observado (CEO), responsável por apresentar a

menor concentração onde observou-se efeito. Pode-se determinar também o valor

crônico (VC), que é a média geométrica da CENO e da CEO e mais recentemente a

ICp, que é a concentração percentual de inibição (CESAR, 1997).

Para cada experimento, deve-se adotar um método estatístico apropriado. Hoje

no mercado tecnológico, é possível encontrar disponíveis, gratuitamente, diversos

softwares estatísticos. Porém, é necessário verificar a qualidade destes programas no

seguimento educacional (DA SILVA et al., 2014).

O software BioEstat foi desenvolvido especialmente para estudantes de

graduação e pós-graduação das áreas médicas e biológicas. Possui métodos

paramétrico e não-paramétricos disponíveis, que devem ser empregados de acordo

com os dados obtidos no experimento. Possui como objetivo propiciar aos acadêmicos

de diversas áreas do conhecimento um instrumento de grande praticidade e de fácil

manuseio na avaliação de informações originadas através de pesquisa (AYRES et al.,

2007, apud DA SILVA et al. 2014).

O software também apresenta grande potencial de uso devido à facilidade de

aquisição, por meio gratuito e virtual, além de apresentar fácil instalação e possuir um

manual autoexplicativo.

Para o uso de dados paramétricos, é importante utilizar métodos para verificar

se a distribuição dos dados utilizados se ajusta a uma distribuição normal.

Metodologias como Shapiro-Wilks, Qui-quadrado e a análise visual de alguns gráficos

são alguns dos testes existentes para verificação da hipótese de normalidade

(TORMAN et al., 2012).

Todavia, Torman et al. (2012) salienta que o desempenho dos testes é, em

geral, muito ruim em pequenos tamanhos amostrais. Os autores, recomendam não

34

proceder ao teste de normalidade e partir diretamente para uma estratégia não-

paramétrica de análise para amostras de tamanho menor ou igual a 10.

Neste trabalho, utilizou-se o programa estatístico BioEstat 5.3. Os resultados

foram submetidos ao teste Kruskal-Wallis, e posteriormente submetido ao método

Student Newman Keuls, responsável por realizar a comparação de médias dos postos

duas a duas. Avaliou-se se houve diferença significativa (p<0,05) entre o controle

laboratorial e as demais amostras. As amostras que apresentaram diferença

estatística significativa, em relação ao controle, foram consideradas tóxicas (ABNT,

2005).

O teste de Kruskal-Wallis ou teste H consiste na versão, não paramétrica,

análoga do teste F (análise paramétrica), o qual tem por objetivo comparar somente

as variações entre os tratamentos, cujo resultado é traduzido no valor do F-teste.

No teste não paramétrico, quando o teste H for significativo, o BioEstat disponibiliza

dois métodos de comparações de médias dos postos: Dunn e Student-Newman Keuls.

A fertilidade de Daphnia similis em cada um dos diferentes ensaios foi avaliada

através da comparação do número médio de neonatas produzida por fêmea viva por

réplica em cada um dos ensaios. Os dados foram analisados estatisticamente pelo

programa BioEstat 5.3, no qual utilizou-se do teste Kruskal-Wallis, comparando as

diferenças médias dos postos pelo método Student-Newman Keuls.

Nos demais testes crônicos foi avaliada a existência de diferença significativa

(p<0,05) entre o controle laboratorial e as demais amostras, utilizando-se dos métodos

acima citados. Os dados utilizados para D. similis e C. dubia correspondem ao número

médio de neonatas produzidas por fêmea viva em cada réplica.

Para o teste crônico em Raphidocelis subcapitata, os dados utilizados

correspondem a biomassa algal produzida por réplica. Considerou-se tóxicas as

concentrações que apresentaram diferença estatística significativa, correspondendo

à Concentração de Efeito Observado (CEO) (ABNT, 2005).

35

5 RESULTADOS E DISCUSSSÃO

Os resultados obtidos nos diferentes ensaios de fertilidade para D. similis estão

apresentados na Tabela 3 e Figuras 9 e 10. Para verificar os dados observados, foi

utilizado o programa BioEstat, através do qual não foram constatadas diferenças

estatisticamente significativas entre os diferentes ensaios. Entretanto, os resultados

apresentados no Ensaio C, foram utilizados apenas como indicativos da natalidade de

D. similis, pois, a sua alta mortalidade (Figura 11) no início do teste (superior a 20%)

inviabiliza a validação deste resultado.

Para avaliação do número de neonatos produzidos, descartaram-se as réplicas

onde houve mortalidade maternal antes do 19º dia de seu ciclo de vida. Medida

tomada tendo em vista que os picos reprodutivos ocorreram entre o 7° e o 18° dia do

ciclo de vida, assim como previsto em Jaconetti (2005).

Figura 9 – Neonatos produzidos por D. similis em cada troca nos diferentes ensaios.


0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

3 º 5 º 8 º 1 0 º 1 2 º 1 5 º 1 7 º 1 9 º 2 1 º

Nº

NEO

NA

TOS

PO

R A

DU

TOS

DIA

Ensaio A: 5 neonatos; 4réplicas; 50 mL sol. teste

Ensaio B: 1 neonatos; 10réplicas; 40 mL sol. teste

36

Figura 10 – Média de neonatos produzidos por D.similis em diferentes ensaios.


Tabela 3 – Média de neonatos produzidos por D. similis em diferentes ensaios.

Réplicas Ensaio

A Ensaio

B Ensaio

C

1 74,8 70,0 76,0

2 92,2 69,0 85,0

3 89,5 78,0 53,0

4 94,7 75,0 78,0

5 - 70,0 65,0

6 - 80,0 *

7 - 98 *

8 - 81 *

9 - 81 *

10 - * *

Média 87,8 78,0 71,4

Mediana 90,9 78,0 76,0

* Descartado (morte maternal anterior ao 17º dia)

- Não existente


87,8

78,071,4

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0



Ensaio C: 1 neonatos; 10réplicas; 20 mL sol. teste

Nº

DE

NEO

NA

TOS

PR

OD

UZI

DO

S

37

Figura 11 – Mortalidade em diferentes cultivos de D. similis.


Ademais, todos os ensaios apresentaram valores semelhantes e condizentes a

USEPA (2002). O qual estipulou para validação do teste, o mínimo de 40 neonatos

produzidos por fêmea no período de 21 dias nos controles dos ensaios de toxicidade

crônica com D. magna. Indicando, portanto, a viabilidade do uso de metodologias

feitas para Daphnia magna em testes utilizando Daphnia similis (Ensaio A) e o uso de

pequenos volumes de solução teste (Ensaio C).

Além dos ensaios de fertilidade em diferentes cultivos, testes de toxidade

crônica utilizando D. similis, nas condições do ensaio A (Tabela 4 e 10 e Figura 12),

foram realizados cg e comparados aos testes de toxidade crônica realizados utilizando

R. subcapitata e C. dubia. Soluções de cloreto de sódio foram utilizadas nos testes

crônicos visando proporcionar uma comparação entre a sensibilidade dos testes já

normatizados e do teste proposto.

A escolha deste ensaio como referência para comparação com os demais

testes citados, foi feita com base em seu melhor rendimento, mesmo que não

significativamente estatístico, frente aos ensaios de fertilidade B e C e sua menor

necessidade de réplicas. Implicando assim em menores volumes de solução-teste

necessários para a realização do teste e facilitando sua realização.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

1 º 3 º 5 º 8 º 1 0 º 1 2 º 1 5 º 1 7 º 1 9 º 2 1 º

% M

OR

TALI

DA

DE

DIA



Ensaio C: 1 neonatos; 10réplicas; 20 mL sol. teste

38

Tabela 4 – Neonatos produzidos por D. similis em diferentes concentrações de cloreto de sódio.

Réplicas Controle 0,5 g/L 1,0 g/L 1,5 g/L 2,0 g/L 2,5 g/L

1 74,8 70,4 86,1 88,0 16,5 -

2 92,2 74,2 70,2 41,3 0,0 -

3 89,5 73,4 87,6 29,8 2,0 -

4 94,7 77,1 65,4 39,7 0,0 -

Média 87,8 73,8 77,3 49,7 9,3 -

Mediana 90,9 73,8 78,1 40,5 9,3 - - Não avaliado (mortalidade maternal)


No ensaio crônico utilizando Daphnia similis, podemos observar o decaimento

do desempenho reprodutivo (Figura 12) em concentrações de cloreto de sódio

superiores a 1,5 g/L. Tal diferença pode ser afirmada ao avaliarmos a existência de

diferença estatisticamente significativa entre as médias dos tratamentos (Tabela 5).

Confirmando a existência de toxidade a 1,5 g/L de NaCl.

Figura 12 – Neonatos produzidos por D. similis em diferentes concentrações de cloreto de

sódio.


87,8

73,877,3

49,7

9,3 0,00,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

Controle 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Nº

DE

NEO

NA

TOS

PR

OD

UZI

DO

S

Concentração de NaCl (g/L)

39

Tabela 5 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio na produção de neonatos

por D.similis.

Tratamento Posto Médio

Dif. Postos

p-valor Dif. Sig. Efeito

Controle 15,5

0,5 g/L 9,75 5,75 0,1277

1,0 g/L 10 5,5 0,1451 CENO

1,5 g/L 6,75 8,75 0,0205 * CEO

2,0 g/L 1,5 14 0,0025 *

2,5 g/L - - - -

- Não avaliado

* Diferença estatisticamente significativa (p<0,05)

CENO Concentração de Efeito Não Observado

CEO Concentração de Efeito Observado


Quanto aos ensaios utilizando Ceriodaphnia dubia (Tabelas 6 e 7 e Figuras 13),

foi observada uma maior sensibilidade ao cloreto de sódio. Apresentando CEO em 1,0

g/L de NaCl.

Tabela 6 – Neonatos produzidos por Ceriodaphnia dubia em diferentes concentrações de

cloreto de sódio.


1 9 17 9 1 - -

2 19 15 13 3 - -

3 15 11 10 7 - -

4 15 13 4 5 - -

5 16 10 15 5 - -

6 17 17 7 3 - -

7 13 15 14 - - -

8 19 9 14 - - -

9 - 11 13 - - -

10 - - 6 - - -

Média 15,4 13,1 10,5 4

Mediana 15,5 13 11,5 4

- Descartado (morte maternal)


40

Figura 13 – Neonatos produzidos por Ceriodaphnia dubia em diferentes concentrações de

cloreto de sódio.


Tabela 7 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio na produção de neonatos

por Ceriodaphnia dubia.


Dif. Postos

p-valor Dif. Sig.

Efeito

Controle 25,3125

0,5 g/L 20,4444 4,8681 0,3002 CENO

1,0 g/L 14,9 10,4125 0,0232 * CEO

1,5 g/L 4,25 21,0625 < 0,0001 *

2,0 g/L - - - -

2,5 g/L - - - -

- Não avaliado


CENO Concentração de Efeito Observado

CEO Concentração de Efeito Não Observado


Nos ensaios utilizando Raphidocelis subcapitata (Tabela 8 e Figuras 14 e 15),

as concentrações onde ocorreram diferenças estatisticamente significativas foram

maiores que as anteriormente apresentadas nos testes crônicos utilizando D. similis e

C. dubia.

15,4

13,1

10,5

4,0

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

Controle 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Nº

DE

NEO

NA

TOS

PR

OD

UZI

DO

S


41

Tabela 8 – Biomassa algal produzidas nos testes de toxidade crônica em diferentes

concentrações da solução de NaCl – Teste Crônico Raphidocelis subcapitata.


1 7,33E+06 5,81E+06 4,66E+06 4,73E+06 3,76E+06 3,26E+06 2 7,11E+06 4,13E+06 4,26E+06 4,51E+06 3,96E+06 3,76E+06 3 6,16E+06 5,08E+06 5,63E+06 5,73E+06 4,38E+06 2,91E+06

Média 6,87E+06 5,01E+06 4,85E+06 4,99E+06 4,03E+06 3,31E+06

Mediana 7,11E+06 5,08E+06 4,66E+06 4,73E+06 3,96E+06 3,26E+06 Fonte: Próprio autor.

Figura 14 – Biomassa algal produzidas nos testes de toxidade crônica em diferentes

concentrações da solução de NaCl – Teste Crônico Raphidocelis subcapitata.


6,87E+06

5,01E+06 4,85E+06 4,99E+06

4,03E+06

3,31E+06

0,00E+00

1,00E+06

2,00E+06

3,00E+06

4,00E+06

5,00E+06

6,00E+06

7,00E+06

8,00E+06

Controle 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

BIO

MA

SSA

PR

OD

UZI

DA

(C

ÉL/m

L)


42

Figura 15 – Inibição do crescimento algal em diferentes concentrações da solução de NaCl

comparadas ao controle – Teste Crônico Raphidocelis subcapitata.


A tabela 9 apresenta os resultados do teste Kruskall-Wallis nos dados de

biomassa algal produzida (figura 14).

Tabela 9 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio na produção de biomassa

algal por Raphidocelis subcapitata.


Dif. Postos

p-valor Dif. Sig. Efeito

Controle 17

0,5 g/L 11 6 0,1687

1,0 g/L 10 7 0,1083

1,5 g/L 11,3333 5,6667 0,1936 CENO

2,0 g/L 5,5 11,5 0,0083 * CEO

2,5 g/L 2,1667 14,8333 0,0007 *





Desta maneira, pode-se observar uma maior sensibilidade do organismo

Ceriodaphnia dubia à solução de cloreto de sódio (Tabela 10). Enquanto Raphidocelis

subcapitata apresentou toxidade apenas em concentração maiores, mostrando-se

menos sensível ao teste em questão. Toda via, apesar da necessidade de maior

27%29%

27%

41%

52%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

INIB

IÇÃ

O D

O C

RES

CIM

ENTO


43

aprofundamento sobre o tema, D. similis mostrou-se adequada para a avaliação de

toxidade crônica, apresentando sensibilidade à solução-teste utilizada, condizente

com a encontrada em ensaios crônicos normatizados e vastamente empregados no

pais.

Tabela 10 – Efeito das diferentes concentrações de cloreto de sódio em diferentes testes de

toxidade crônica.

Tratamento D.

similis C. dubia

R. subcapitata

Controle

0,5 g/L

1,0 g/L *

1,5 g/L * *

2,0 g/L * - *

2,5 g/L - - *

- Não avaliado

* Efeito observado (p<0,05)




44

6 CONCLUSÃO

A partir dos resultados obtidos neste trabalho, pode-se concluir que os

diferentes volumes de solução teste utilizados e o número de organismos por réplica,

aparentemente, não influiu na reprodução de D. similis. Assim, a viabilidade da

aplicação de metodologias existentes para ensaio com Daphnia magna em ensaio

com Daphnia similis e o uso de pequenos volumes de solução-teste (20 mL), não

possui quaisquer empecilhos para seu uso como metodologias para ensaios crônicos.

Entretanto, o ensaio A utiliza de metodologia mais simplificada, facilitando sua

montagem e replicação.

Quanto a sensibilidade do organismo Daphnia similis no ensaio crônico, o

mesmo apresentou sensibilidade na faixa intermediaria às encontradas nos

organismos Ceriodaphnia dubia e Raphidocelis subcapitata. Indicando assim, mais

uma vez, sua aplicabilidade na avaliação de toxicidade, com grande potencial para

ensaios crônicos.

Entretanto, ainda é necessário estudos futuros com diferentes organismos

pertencentes a diversos níveis tróficos, os quais podem apresentar diferentes

respostas aos poluentes.

45

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