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UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICAS INSTITUTO DE INVESTIGACIONES FÁRMACO BIOQUÍMICAS

““OOPPTTIIMMIIZZAACCIIOONN DDEE MMEEDDIIOOSS DDEE CCUULLTTIIVVOO,, PPAARRAA LLAA PPRROODDUUCCCCIIOONN DDEE EENNZZIIMMAASS LLIIGGNNIINNOOLLIITTIICCAASS,, PPOORR CCEEPPAASS

FFUUNNGGIICCAASS AAIISSLLAADDAASS DDEELL AALLTTIIPPLLAANNOO BBOOLLIIVVIIAANNOO””

TTEESSIISS DDEE GGRRAADDOO PPAARRAA OOPPTTAARR EELL TTIITTUULLOO DDEE LLIICCEENNCCIIAATTUURRAA EENN BBIIOOQQUUIIMMIICCAA

POSTULANTE: PAMELA LAURA USNAYO GONZALES

LA PAZ – BOLIVIA

2007

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICAS INSTITUTO DE INVESTIGACIONES FÁRMACO BIOQUÍMICAS

““OOPPTTIIMMIIZZAACCIIOONN DDEE MMEEDDIIOOSS DDEE CCUULLTTIIVVOO,, PPAARRAA LLAA PPRROODDUUCCCCIIOONN DDEE EENNZZIIMMAASS LLIIGGNNIINNOOLLIITTIICCAASS,, PPOORR CCEEPPAASS

FFUUNNGGIICCAASS AAIISSLLAADDAASS DDEELL AALLTTIIPPLLAANNOO BBOOLLIIVVIIAANNOO””

TTEESSIISS DDEE GGRRAADDOO PPAARRAA OOPPTTAARR EELL TTIITTUULLOO DDEE LLIICCEENNCCIIAATTUURRAA EENN BBIIOOQQUUIIMMIICCAA

POSTULANTE: PAMELA LAURA USNAYO GONZALES

ASESORES: ENRIQUE TERRAZAS SILES Ph.D. MARIA TERESA ALVAREZ Ph.D. ALBERTO GIMENEZ TURBA Ph.D.

LA PAZ – BOLIVIA 2007

Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas Planta del Izozog Guirakillo IIFB

"De todo éxito, por pequeño

que sea, surgirá un día un

esfuerzo más grande

que lo completará."

“Whitman”

http://www.frases-celebres.info/index.php?seccion=autor&aut=Whitman


2

Dedicatoria

"A mis padres, Heriberto y Susana a quienes amo

y admiro por la fortaleza que tienen, y les agradezco todo,

porque a ellos debo lo que soy hoy en día y por estar

siempre a mi lado apoyándome y confiando en mi"


3

Agradecimientos

A Dios por haberme dado la vida y lo mejor de este mundo mi familia.

A la Universidad mayor de San Andrés, en especial a la facultad de Cs. farmacéuticas y Bioquímicas,

por darme la oportunidad de convertirme en profesional.

A la cooperación del proyecto “Biodiversidad microbiana” del programa UMSA, ASDI-SAREC de Suecia,

ya que sin su colaboración este trabajo no se habría realizado.

A la cooperación del IFS (Internacional Foundation for Science) por la colaboración brindada.

Al Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas (IIFB) por abrirme las puertas y darme la plena

libertad de trabajar en este proyecto, por incentivarme a salir adelante cada día.

Al Instituto de Investigaciones de Productos Químicos (IIDEPROQ) y todo su personal, por acogerme en

sus instalaciones y brindarme la ayuda necesaria para realizar el presente trabajo.

Muy especialmente al Dr. Enrique Terrazas por ser un gran maestro en mi formación, por transmitirme

sus conocimientos, por la paciencia, sobre todo por haberme dado la oportunidad de realizar este trabajo.

A la Dra. Teresa Alvarez por su paciencia, apoyo, toda la ayuda que me brindo para hacer realidad este

trabajo, a pesar de ser una gran docente es una gran amiga, la cual agradezco haber encontrado.

Al Dr.Alberto Gimenez por abrirme las puertas del Instituto, por su constante apoyo, y por sacarse tiempo

para brindarme su ayuda.

Al Ing. Cristhian Carrasco quien siempre me brindo su colaboración, por toda la confianza puesta en mi,

apoyo y su sincera amistad brindada.

A la Ing. Daysy Torrico por su constante apoyo y confianza, mas aun por su amistad.

A Karen Cabero por su amistad incondicional, su ayuda permanente, y por tus palabras de aliento.

A Laura Mendoza por su ayuda desinteresada, apoyo y consejos.

A todo el personal del IIFB Dra. Greis, Dr. Avila, Dra. Magui, Dra.Flores,Crispin, a mis compañeros

Kenny, Neida, Efraín, Romina, Silvia, Luis, Juan, Lencho, Hugo, Marina, Carla, Guido, Nelson, Rosita,

gracias por todos lo momentos vividos, por la paciencia que me tuvieron, y por la amistad que nos une.

Gracias a todos mis amigos y amigas de la facultad de Bioquímica y Farmacia, de Ingenieria, a mis

amigos del CBA, y otros, que si bien no escribo cada uno de sus nombres los llevo en mi corazon, gracias

por todo el apoyo brindado y su amistad que alegra mi vida.


4

Abreviaturas

ASDI/SAREC The Swedish International Development Agency / Swedish Agency for Research Cooperation

ABTS 2, 2’-Azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid).2NH4-salt

BFP Bifenilos policlorados

ºC Grados centigrados

CMC Carboxi – Metil – Celulosa

DMF Dimethoxyphenol

DNS Acido 3,5 Dinitrosalicilico

g Gramos

IB Ingeniería y Bioquímica

IIDEPROQ Instituto de Investigación y Desarrollo de Procesos Químicos

IIFB Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

IUB International Union of Biochemistry

KDa Kilo Daltons

L Litros

Lac Lacasa

LiP Lignina peroxidasa

M Concentración molar

MnP Manganeso peroxidasa

mM Milimolar

mg Miligramos

ml Mililitros

mm Milímetro

PB Podredumbre blanca

PCF Pentaclorofenol

PDA Papa dextrosa agar

PV Peroxidasa versátil

PHA Hidrocarburos policíclicos aromáticos

μl Microlitro

μmol Micromol

nm Nanómetro

UI Unidad Internacional


Índice de Contenido

1. INTRODUCCION .................................................................................................. 12

1.1 OBJETIVOS ............................................................................................................................................... 13 1.2.1 Objetivo General................................................................................................................................... 13 1.2.2 Objetivos Específicos............................................................................................................................ 13

1.3 JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION.- ...................................................................................... 14

2. MARCO TEORICO CONCEPTUAL.- ................................................................... 17

2.1 LA LIGNINA.-............................................................................................................................................ 17 2.1.1 Estructura y biodegradación de la molécula de lignina.- ..................................................................... 17

a. Propiedades físicas.................................................................................................................................. 19 b. Ligninas comercializadas ...................................................................................................................... 20

2.1.2 Funciones de la lignina.- ....................................................................................................................... 20

2.2 DEGRADACION DE LA LIGNINA POR HONGOS.- ............................................................................ 20 2.2.1 Hongos.- ............................................................................................................................................. 21

a. Características generales.-..................................................................................................................... 21 b. Estructura.- ............................................................................................................................................ 22 c. Hábitat.-.................................................................................................................................................. 24 d. Reproducción.-......................................................................................................................................... 24 e. Clasificación.- ........................................................................................................................................... 25 f. Fisiología de los Hongos.-........................................................................................................................ 25 g. Hongos ligninolíticos.-............................................................................................................................. 27

2.3 ENZIMAS.-.................................................................................................................................................. 27 2.3.1 Estructura y características generales.-................................................................................................ 28

a. Especificidad.-........................................................................................................................................... 28 b. Actividad Enzimática.-.............................................................................................................................. 28 c. Cinética de reacción (Michaelis-Menten).-.............................................................................................. 28 d. Temperatura.- ........................................................................................................................................... 29 e. pH.- ............................................................................................................................................................ 29 f. Clasificación Internacional de las enzimas.-............................................................................................ 29

2.3.2 Enzimas ligninolíticas.-........................................................................................................................... 30 a. Peroxidasas ligninolíticas.-....................................................................................................................... 30 b. Lacasas.-.................................................................................................................................................... 32

2.3.3 Aspectos biotecnológicos.-...................................................................................................................... 34

2.4 RECURSOS LIGNOCELULOSICOS.- ......................................................................................................... 36 2.4.1 Paja Brava.-.............................................................................................................................................. 37


6

2.4.2 Bagazo.- .................................................................................................................................................... 38 2.4.3 Aserrín.-.................................................................................................................................................... 38 2.4.4 Residuos de quinua real.-......................................................................................................................... 39 2.4.5 Cáscara de arroz.- .................................................................................................................................... 40

3. METODOS.- .......................................................................................................... 41

3.1 RECOLECCION DE MUESTRAS.- ............................................................................................................. 43

3.2 METODOS DE AISLAMIENTO DE CEPAS FUNGICAS.- .................................................................... 45 3.2.1. Codificación de cepas fúngicas aisladas.- .............................................................................................. 48

3.3 METODOS DE IDENTIFICACION DE CEPAS FUNGICAS.- .............................................................. 49 3.3.1 Identificación Macroscópica.- ................................................................................................................. 49 3.3.2 Identificación Microscópica.- .................................................................................................................. 50 3.3.3 Elaboración de Historial de cepas fúngicas.-....................................................................................... 52

3.4 METODOS DE DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.-.............................................. 52 3.4.1 Determinación Cualitativa.-..................................................................................................................... 52 3.4.2 Determinación Cuantitativa.- ................................................................................................................. 55

a. Manganeso Peroxidasa.- ........................................................................................................................ 60 b. Lignina Peroxidasa.- .............................................................................................................................. 61 c. Lacasa.- ................................................................................................................................................... 62

3.4.3 Cuantificación de las Enzimas.- .......................................................................................................... 63

3.5 OPTIMIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO PARA LA PRDUCCION DE ENZIMAS LIGNINOLITICAS.- ............................................................................................................................................. 63

3.5.1 Medios de cultivo con variación de concentración de Cobre.- .............................................................. 64 3.5.2 Medios de cultivo con diferentes sustratos lignocelulosicos.-............................................................... 65

3.6 Determinación de Actividad Celulolítica.- .................................................................................................. 66

3.7 Cuantificación de proteínas totales.-........................................................................................................... 67

3.8 Comparación de la Actividad Enzimática Ligninolítica de las enzimas producidas frente a enzimas comerciales.- .......................................................................................................................................................... 68

3.9 Análisis estadístico.- ..................................................................................................................................... 69

4. RESULTADOS Y DISCUSION ............................................................................. 70

4.1 DETERMINACION CUALITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA LIGNINOLITICA.-.............. 70

4.2. DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA LIGNINOLITICA.- .......... 71 4.2.1. Manganeso Peroxidasa.-........................................................................................................................ 71 4.2.2. Lignina Peroxidasa.- .............................................................................................................................. 76

4.2.3. Lacasa.- ........................................................................................................................................................81


4.3. OPTIMIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO PARA LA PRDUCCION DE ENZIMAS LIGNINOLITICAS.- ............................................................................................................................................. 87

4.3.1 Medios de cultivo con variación de concentración de Cobre.- ............................................................. 87 a. Manganeso Peroxidasa.- ........................................................................................................................ 88 b. Lignina Peroxidasa.- ................................................................................................................................ 92 c. Lacasa.- ..................................................................................................................................................... 95

4.3.2. Medios de cultivo con diferentes sustratos lignocelulosicos.-.............................................................. 100 I. Paja Brava.- ............................................................................................................................................ 101

a. Manganeso Peroxidasa.- .................................................................................................................... 101 b. Lignina Peroxidasa.- .......................................................................................................................... 102 c. Lacasa.- ............................................................................................................................................... 103

II. Bagazo.- ................................................................................................................................................. 105 a. Manganeso Peroxidasa.- .................................................................................................................... 105 b. Lignina Peroxidasa.- .......................................................................................................................... 107 c. Lacasa.- ............................................................................................................................................... 108

III. Aserrín.- ............................................................................................................................................... 110 a. Manganeso Peroxidasa.- .................................................................................................................... 110 b. Lignina Peroxidasa.- .......................................................................................................................... 111 c. Lacasa.- ............................................................................................................................................... 112

IV. Residuos de Quinua Real.-.................................................................................................................. 114 a. Manganeso Peroxidasa.- .................................................................................................................... 114 b. Lignina Peroxidasa.- .......................................................................................................................... 115 c. Lacasa.- ............................................................................................................................................... 116

V. Cáscara de Arroz.- ................................................................................................................................ 118 a. Manganeso Peroxidasa.- .................................................................................................................... 118 b. Lignina Peroxidasa.- .......................................................................................................................... 119 c. Lacasa.- ............................................................................................................................................... 121

4.4. Determinación de Actividad Celulolítica.- ................................................................................................... 122

4.5. Determinación de proteínas totales.-.......................................................................................................... 123

4.6. Comparación de la Actividad Enzimática Ligninolítica de las enzimas producidas frente a enzimas comerciales.- ........................................................................................................................................................ 124

5. CONCLUSIONES ............................................................................................... 127

6. RECOMENDACIONES ....................................................................................... 131

7. BIBLIOGRAFIA .................................................................................................. 132


8

Índice de figuras

Figura 1. Estructura parcial de la lignina............................................................................... 19

Figura 2. Corte esquemático de un hongo de la clase basidiomiceto y orden de los agaricales. ................................................................................................................................. 23

Figura 3. Procedimiento general “Producción de enzimas ligninolíticas, a partir de cepas fúngicas del Altiplano boliviano”. ............................................................................. 42

Figura 4. Orillas del Lago Titicaca en la localidad de Llamacachi. ................................ 43

Figura 5. Orillas del Río Desaguadero en el departamento de Oruro. ........................... 43

Figura 6. Paja Brava a orillas del río Desaguadero. ............................................................ 44

Figura 7. Suelo donde crece la planta Paja Brava a orillas del lago Titicaca. ............ 44

Figura 8. Métodos de aislamiento de las cepas fúngicas................................................. 46

Figura 9. Tronco de madera que contiene cepas fúngicas, recolectada de orillas del lago Titicaca. ............................................................................................................................. 47

Figura 10. Preparación de medio Papa Dextrosa Agar (PDA). ........................................ 47

Figura 11. Cepas fúngicas en crecimiento a temperatura ambiente............................ 48

Figura 12. Morfología macroscópica de la cepa fúngica ................................................ 50

Figura 13. Identificación microscópica ................................................................................ 51

Figura 14. Morfología microscópica...................................................................................... 52

Figura 15. Preparación de medio ABTS y Poli – R. .............................................................. 53

Figura 16. Decolorización del medio sólido Poly R............................................................ 54

Figura 17. Decolorización del medio sólido ABTS. .............................................................. 54

Figura 18. Estructura generaliza de ABTS (2,2'-Azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid).2NH4-salt)........................................................................................................... 55

Figura 19. Determinación cualitativa de la actividad enzimática ligninolítica............. 56

Figura 20. Fotografía del equipo Espectrofotómetro de absorción................................ 58


9

Figura 21. Medio de cultivo Mn (II) para determinación cuantitativa............................ 58

Figura 22. Determinación actividad enzimática ligninolítica por métodos espectrofotométricos. .............................................................................................................. 59

Figura 23. Reacción enzimática para MnP por oxidación de 2,6 dimetoxifenol.......... 60

Figura 24. Reacción enzimática para LiP por oxidación de ABTS. .................................. 61

Figura 25. Reacción enzimática para Lac por oxidación de ABTS.................................. 62

Figura 26. Diagrama determinación enzimática en medio de cultivo Cu (II)............... 64

Figura 27. Determinación enzimática en medios de cultivo con diferentes sustratos. 66

Figura 28. Determinación de la actividad Celulolítica. ..................................................... 67

Figura 29. Determinación de proteínas totales. .................................................................. 68

Figura 30. Determinación de la actividad enzimática de enzimas comerciales. ........ 69

Figura 31. Actividad enzimática Manganeso peroxidasa para la cepa fúngica IB-26C (Trinacrium) de los 8 medios evaluados en función de glucosa, extracto de levadura, Mn.............................................................................................................................. 73

Figura 32. Efecto de la glucosa y extracto de levadura sobre la actividad MnP para la cepa fúngica IB-26C (Trinacrium).......................................................................................... 74

Figura 33. Efecto de la glucosa y Mn sobre la actividad MnP para la cepa fúngica IB-26C (Trinacrium) ........................................................................................................................ 75

Figura 34. Actividad enzimática Lignina peroxidasa para la cepa fúngica IB-26C (Trinacrium) de los 8 medios evaluados en función de glucosa, extracto de levadura, Mn.............................................................................................................................. 77

Figura 35. Efecto de la glucosa y extracto de levadura sobre la actividad LiP para la cepa fúngica IB-26C (Trinacrium).......................................................................................... 79

Figura 36. Efecto de la glucosa y Mn sobre la actividad LiP para la cepa fúngica IB-26C (Trinacrium) ........................................................................................................................ 80

Figura 37. Actividad enzimática Lacasa para la cepa fúngica IB-29B (Blasthomyces) de los 8 medios evaluados en función de glucosa, extracto de levadura, Mn......... 83

Figura 38. Efecto de la glucosa y extracto de levadura sobre la actividad Lacasa


0

para la cepa fúngica IB-29B (Blasthomyces)...................................................................... 85

Figura 39. Efecto de la glucosa y Mn sobre la actividad Lacasa para la cepa fúngica IB-29B (Blasthomyces). ............................................................................................................ 85

Figura 40. Actividad enzimática Manganeso peroxidasa para la cepa fúngica IB-29B (Blasthomyces) de 8 medios evaluados en función de glucosa, extracto de levadura, Cu.............................................................................................................................. 89

Figura 41. Efecto de la glucosa y extracto de levadura sobre la actividad MnP para la cepa fúngica IB-29B (Blasthomyces). ................................................................................... 90

Figura 42. Efecto de la glucosa y Cu sobre la actividad MnP para la cepa fúngica IB-29B (Blasthomyces). ................................................................................................................. 91

Índice de tablas Tabla 1. Clasificación Internacional de las enzimas..............................................................................30

Tabla 2. Características principales de enzimas ligninolíticas ............................................................... 34

RESUMEN

Las enzimas ligninolíticas junto a las enzimas celulolíticas son importantes en los procesos de

fermentación in situ. En este trabajo se realizó la producción de enzimas ligninolíticas

Manganeso Peroxidasa (MnP), Lignino Peroxidasa (LiP) y Lacasa a partir de hongos aislados

de muestras recolectadas del Altiplano Boliviano. De un total de 31 hongos, 4 cepas fúngicas

presentaron actividad ligninolítica cualitativa determinada por Poly R-478 y ABTS. Las cepas

que presentaron mayor actividad fueron: IB-29B (Blasthomyces), IB-18Cb (Bdellospora), IB-

26C (Trinacrium), IB-15Da (Cephalosporium).

Para la optimización de la producción de estas enzimas se desarrollo un diseño factorial 23

con dos diferentes concentraciones glucosa o sustratos lignocelulósicos paja brava, bagazo,


aserrín, residuo de quinua, cascarilla de arroz, extracto de levadura, manganeso o cobre. La

cuantificación de enzimas ligninolíticas fue determinado espectrofotométricamente por

oxidación de ABTS y 2,6 DMF. La máxima actividad enzimática fue de 245,56 UI/L para

MnP, de 487,82 UI/L para LiP y de 287, 30 UI/L Lacasa.

Palabras Claves: Enzimas ligninolíticas, manganeso peroxidasa, lignino peroxidasa, lacasa.

ABSTRACT

The ligninolític and cellulolític enzymes are important in fermentation processes in situ. In this

thesis three kind of ligninolítics enzyme has been produced, Manganese peroxidase (MnP),

Lignin Peroxidase (LiP) and Laccase from fungi isolated using samples collected of the

Bolivian Andean High Plateau. Thirty one fungal strains were isolated, four fungal strains

showed a qualitative ligninolítica activity by Poly R-478 and ABTS. The strains that presented

greater activity were: IB-29B (Blasthomyces), IB-18Cb (Bdellospora), IB-26C (Trinacrium),

IB-15Da (Cephalosporium).

In order to optimize the production of these enzymes a factorial design 23 was developed with

two different concentrations of lignocellulósic material such as brave straw, bagasse, sawdust,

remainder of quinua, husk of rice or glucose, yeast extract, manganese or cupper.


2

The ligninolíticas enzyme quantification was determined spectrophotométrically by oxidation

of ABTS and 2.6 DMP. The greater enzymatic activity was of 245.56 UI/L for MnP, 487.82

UI/L for LiP and 287, 30 UI/L for Lacasa.

Key words: Ligninolíticas enzymes, manganese peroxidasa, lignino peroxidasa, laccasa.

1. INTRODUCCION

Las enzimas son catalizadores biológicos, es decir, proteínas que tienen la capacidad de

acelerar ciertas reacciones químicas. En los últimos años su uso en gran cantidad de industrias

ha adquirido gran relevancia. El desarrollo de técnicas y métodos para el desarrollo de estos

procesos han sido un importante requisito para el avance en la enzimología en las últimas tres

décadas y por muchos es considerada un arte [17, 11].

Actualmente en Bolivia, la producción de enzimas viene desarrollándose por los

métodos de la biotecnología clásica que incluye dos etapas principales: fermentación, en la

que se multiplica el microorganismo productor de la enzima, y la de recuperación y

purificación, en la que se aísla la enzima y se lleva al grado de pureza adecuado para su uso,


3

éste último en plena proyección, cuyo pionero es el Instituto de Investigaciones Fármaco-

Bioquímicas desde el año 1999.

Diversas investigaciónes sobre producción de enzimas ligninolíticas; Lignina

peroxidasa, Manganeso peroxidasa y Lacasa, obtenidos a partir de cultivos fúngicos, han

ayudado a lograr un mayor entendimiento sobre las cualidades que éstas brindan, cuyas

aplicaciones industriales son variadas, basta mencionar algunas: relacionadas con procesos de

deslignificación, detoxificación de suelos y efluentes industriales, versátil y atractivo para

fines ambientales porque puede servir para eliminar diversos contaminantes difíciles de

degradar, como los hidrocarburos del petróleo, plaguicidas, explosivos, colorantes sintéticos

que se utilizan en la industria textil y otros compuestos que son tóxicos para la flora, fauna y el

hombre.

La finalidad del presente estudio fue investigar la capacidad de producción de enzimas

ligninolíticas por los hongos del Altiplano boliviano y encontrar mayores rendimientos de

actividad enzimática ligninolítica, mediante la optimización de condiciones de cultivo a través

del establecimiento de diseños factoriales de los diferentes componentes del medio

1.1 OBJETIVOS

1.2.1 Objetivo General

- Optimizar medios de cultivo para la producción de enzimas ligninolíticas, por

cepas fúngicas aisladas del Altiplano boliviano.

1.2.2 Objetivos Específicos

- Aislar cepas fúngicas a partir de muestras recolectadas de las regiones cercanas al

lago Titicaca y río Desaguadero a través de técnicas de aislamiento axenico.

- Identificar y caracterizar taxonómicamente las cepas fúngicas aisladas.


4

- Seleccionar cepas fúngicas capaces de producir enzimas con actividad

ligninolítica (Manganeso peroxidasa, Lignina peroxidasa, Lacasa) a través de un

método cualitativo (Poly- R y ABTS).

- Optimizar la producción de enzimas ligninolíticas a través de un diseño factorial

23, considerando la variación de glucosa, manganeso, extracto de levadura como

nutrientes que influyen en la síntesis de enzimas ligninolíticas.

- Optimizar la producción de enzimas ligninolíticas a través de un diseño factorial

23, considerando la variación de glucosa, cobre, extracto de levadura como

nutrientes que influyen en la síntesis de enzimas ligninolíticas.

- Evaluar medios de cultivo complejos con diferentes sustratos lignocelulósicos

como paja, bagazo, aserrín, residuos de quinua, cáscara de arroz en base las

condiciones optimizadas de extracto de levadura y manganeso, para la

determinación de enzimas ligninolíticas.

-

1.3 JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION

La lignina en la madera confiere una protección física a la celulosa y hemicelulosa

contra el ataque enzimático. Existe una gran cantidad de organismos (bacterias y hongos) con

enzimas hidrolíticas necesarias para degradar celulosa y hemicelulosa, pero en lo referente al

ataque y mineralización de la lignina el número de organismos es mucho mas limitado. Los

únicos organismos descritos con la capacidad de degradar y mineralizar la lignina son un

grupo de basidiomicetes causantes de pudrición blanca [4]. Estos hongos, poseen un complejo

de enzimas oxidasas y peroxidasas que catalizan las primeras reacciones que rompen uniones

dentro de la compleja molécula de la lignina, generando moléculas más pequeñas [5], y luego

hay una incorporación de estos productos de degradación a los ciclos metabólicos del


organismo que como producto final dan CO2 [3].

Después de los polisacáridos, la lignina es el polímero orgánico más abundante en el

mundo vegetal. Es importante destacar que la lignina es la única fibra no polisacárido que se

conoce [16]. El conocimiento del proceso de biodegradación de la lignina es importante para

comprender aspectos claves del ciclo bioquímico del carbono en la Tierra, dado que la mayor

parte del carbono y la energía fijados por fotosíntesis se acumulan en la molécula de celulosa,

un polímero de glucosa que es el constituyente mayoritario de la biomasa vegetal y que está

íntimamente ligado a la lignina en las plantas [9].

Sin duda, uno de los grandes retos de la humanidad en este inicio del siglo XXI es el

convertir los procesos productivos en procesos limpios y eficientes energéticamente. Por otro

lado, se quiere tener la capacidad tecnológica para restaurar los sitios dañados

ambientalmente, La biotecnología tiene un papel importante que desempeñar en esta

transformación tecnológica. La investigación deberá estar enfocada en al utilización de nuevas

herramientas biotecnológicas para la prevención, control y remediación de las

contaminaciones ambientales [12].

Este sistema ligninolítico, ha demostrado ser muy versátil y atractivo para fines

ambientales, porque puede servir para eliminar diversos contaminantes difíciles de degradar,

como los hidrocarburos del petróleo, plaguicidas, explosivos, colorantes sintéticos que se

utilizan en la industria textil y otros compuestos que son tóxicos para la flora, fauna y el

hombre [8].

Todos los mencionados anteriormente son compuestos muy contaminantes y los

sistemas actualmente implantados para su depuración se basan en la aplicación de tratamientos

físicos o químicos, la mayoría de los cuales son caros [12]. El tratamiento biológico

representa una alternativa atractiva. En este sentido, los hongos ligninolíticos se han estudiado

como posibles agentes para tales procesos debido a que sus sistemas enzimáticos

extracelulares inespecíficos les permite degradar diversos tipos de sustancias recalcitrantes. La

capacidad de estos microorganismos para degradar distintos tipos de compuestos


6

contaminantes ha sido demostrada [10].

Adicionalmente, las enzimas ligninolíticas pueden ser aplicadas como indicadores del

deterioro de jugos y vinos y para la síntesis químico-enzimática de nuevos antibióticos y

alcaloides [8]. Además tienen amplias aplicaciones industriales; actualmente, las enzimas son

empleadas principalmente para la obtención de lácteos, edulcolorantes, fármacos, alimentos,

licores, detergentes, etc. [11].

Por otro lado, uno de los problemas que encara el mundo es el agotamiento progresivo

de sus recursos energéticos basados mayoritariamente en combustibles no renovables. Al

mismo tiempo, el consumo de energía aumenta a ritmos cada vez más crecientes. De otro lado,

el consumo global de combustibles genera enormes cantidades de gases contaminantes que

son liberados a la atmósfera. Este tipo de contaminación ha causado cambios en el clima del

planeta, por lo que se ha convertido en una de las problemáticas que mas preocupan a los

gobiernos. La única forma de encarar esta problemática es mediante de recursos energéticos

renovables. Para ello la biotecnología ofrece múltiples alternativas tecnológicas. Una solución

renovable es el uso de energía solar en forma de biomasa, la cual esta representada en los

materiales lignocelulósicos y en cultivos de plantas ricas en energía [13].

Los hongos causantes de la pudrición blanca están adaptados a una amplia variedad

desechos lignocelulósicos, tales como paja brava, bagazo de caña de azúcar, aserrín, residuos

de quinua, cáscara de arroz, entre otros. La producción de estas enzimas es importante en el

proceso de biodegradación de los mencionados sustratos lignocelulósicos, ya que son muy

poco aprovechados, pero no seria posible la utilización de estos como materia prima para la

producción de alcohol, sin la intervención de enzimas como las ligninolíticas y de enzimas

celulolíticas [15].

En este sentido en el Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas (IIFB), con el

apoyo de la cooperación Sueca ASDI/SAREC, en el proyecto “Biodiversidad Microbiana”


conjuntamente con el Instituto de Investigaciones y Desarrollo de Procesos Químicos

(IIDEPROQ), con la colaboración del IFS (Internacional Foundation for Science) debido al

alto costo de este tipo de enzimas comerciales se toma la iniciativa de producir enzimas

ligninolíticas, requiriendo identificar al hongo capaz de producir dichas enzimas.

El presente estudio de investigación se enfoca íntegramente en la producción de

enzimas ligninolíticas, a partir de hongos aislados de muestras recolectadas del Altiplano

boliviano, en el cual se verifica cualititavamente a la cepa fúngica capaz de producir este tipo

de enzimas redox, utilizando medios sólidos que tiene como indicadores Poly-R y ABTS,

posteriormente se desarrollara diseño factorial 23 con dos diferentes concentraciones de los

nutrientes: glucosa o sustratos lignocelulósicos (paja brava, bagazo, aserrín, residuo quinua,

cáscara arroz), extracto de levadura, manganeso o cobre, se tomen en cuenta las unidades de

color y el consumo de sustrato sintéticos como ABTS y 2,6 DMF por oxidación, los cuales

fueron determinados por métodos espectrofotométricos, la posterior purificación y aplicación

de dicha enzima en diferentes procesos ya descritos, se realizara en trabajos posteriores.

2. MARCO TEORICO CONCEPTUAL

2.1 LA LIGNINA

La palabra lignina proviene del término latino lignum, que significa madera; así, a las

plantas que contienen gran cantidad de lignina se las denomina “leñosas” [16]. La lignina está

en las plantas, íntimamente ligada a la celulosa, constituyente mayoritario a su vez de la

biomasa vegetal. Actúa como pegamento entre las fibras vegetales, recubre y protege a las

moléculas de celulosa en la pared de las fibras [9].

2.1.1 Estructura y biodegradación de la molécula de lignina


8

La lignina, después de la celulosa, es el mayor componente de la materia vegetal y

forma más abundante de material aromático en la biosfera. La composición química de la

madera y otros tejidos vasculares es muy variable. Se compone principalmente de celulosa,

lignina, hemicelulosa, y de un 5% a un 10% de otros materiales. La lignina representa entre un

16 % hasta un 33% del peso según el tipo de madera u otro tejido lignocelulósico [19]. La

mayor parte de esta se encuentra dentro de las paredes celulares, entremezclada con las

hemicelulosas y formando una matriz que rodea las ordenadas microfibrillas de celulosa. Este

compuesto provee de rigidez a las plantas superiores ya que actúa como pegamento entre las

fibras de celulosa formando la lámina media [5]. Además, protege a los carbohidratos

fácilmente degradables (celulosa, hemicelulosa) de la hidrólisis enzimática microbiana [12].

Una estructura química representativa de la lignina se muestra en la figura 1. Este

biopolímero contiene alrededor de 10-20% de grupos hidroxilo fenolitos que le confieren

rigidez a la pared celular de las plantas y además las protege del ataque de organismos

patógenos [12, 19].

Biosintéticamente, la lignina proviene de tres alcoholes precursores: el alcohol

p-hidroxicinamilico (cumarilico), el alcohol 4-hidroxi-3-metoxicinamilico (coniferilico) y el

alcohol 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinamilico. La copolimerización por radicales libres de estos

alcoholes, iniciada por peroxidasa vegetales, da lugar al polímero de lignina [5].

Químicamente este polímero es heterogéneo, amorfo, ópticamente inactivo, y altamente

ramificado [12].

La lignina es un caso especial en el que la biodegradabilidad depende de la

disponibilidad de oxigeno. A menudo no existe una degradación sustancial por que la mayoría

de los hongos filamentoso que degradan lignina, pueden actuar solo en presencia de oxigeno

[22].


9

Figura 1. Estructura parcial de la lignina

Fuente: Rev Temuco Universidad de la Frontera [20].

Las características estructurales de este heteropolímero vegetal imponen ciertas

restricciones para su biodegradación. Definiendo a una molécula de lignina con un peso

molecular de entre 600-1000 kDa, es evidente que su tamaño le impide poder ser degradada

intracelularmente [7, 9]. Además por el tipo de enlaces covalentes que presenta (aril-eter, aril-

aril y carbono-carbono) y su hetereogeneidad, no puede ser degradado por mecanismos típicos

de hidrólisis [21]. Por lo tanto, cualquier enzima o grupo de enzimas capaces de atacar

inicialmente la lignina, deben ser además de extracelulares, no hidrolíticas y bastante

inespecíficas.

a. Propiedades físicas


20

Las ligninas son polímeros insolubles en ácidos y en álcalis fuertes, que no se digieren

ni se absorben y tampoco son atacados por la microflora del colon. Pueden ligarse a los ácidos

biliares y otros compuestos orgánicos (por ejemplo, colesterol), retrasando o disminuyendo la

absorción en el intestino delgado de dichos componentes. El grado de lignificación afecta

notablemente a la digestibilidad de la fibra [19]. La lignina, que aumenta de manera ostensible

en la pared celular de la planta con el curso de la maduración, es resistente a la degradación

bacteriana, y su contenido en fibra reduce la digestibilidad de los polisacáridos fibrosos.

b. Ligninas comercializadas Sólo existen dos tipos de lignina comercialmente disponibles: las ligninas sulfonadas y

las kraft ligninas. La capacidad de elaboración de productos de lignina en el mundo oriental es

aproximadamente de 1,4106 toneladas/año. Sólo una compañía produce kraft ligninas; las

restantes producen ligninas sulfonadas. Los productos de lignina han empezado a tener una

importancia creciente en distintas aplicaciones industriales [19].

2.1.2 Funciones de la lignina.- La lignina realiza múltiples funciones que son esenciales para la vida de las plantas.

Por ejemplo, posee un importante papel en el transporte interno de agua, nutrientes y

metabolitos. Proporciona rigidez a la pared celular y actúa como puente de unión entre las

células de la madera, creando un material que es notablemente resistente a los impactos,

compresiones y flexiones. Realmente, los tejidos lignificados resisten el ataque de los

microorganismos, impidiendo la penetración de las enzimas destructivas en la pared celular.

2.2 DEGRADACION DE LA LIGNINA POR HONGOS

Los biocatalizadores o enzimas pueden ser obtenidos de animales, plantas, sin embargo

la fuente mas importante constituyen los microorganismos como las bacterias, hongos y

levaduras. El 90% de las enzimas empleadas industrialmente son de origen microbiano. Los

microorganismos son fácilmente cultivables industrialmente bajo condiciones controladas y

por lo tanto las enzimas son obtenidas con un buen rendimiento y de manera


2

constante. Además los microorganismos son productores inducibles y en algunos casos

constitutivos de enzimas [29].

Existe un limitado número de microorganismos que producen esta clase de enzimas,

principalmente hongos y bacterias, las enzimas ligninolíticas que se encuentran en el mercado

principalmente provienen de cepas fúngicas, de esta forma las cepas fúngicas son un grupo de

interés en la producción de enzimas. Hasta hoy día se conoce una sola clase de seres vivos

capaces de degradar eficientemente lignina. Se trata de los hongos Basidiomicetes,

denominados "pudrición blanca", ya que producen un blanqueamiento de la madera al

degradar la lignina [20].

En este sentido debido a sus propiedades ya descritas, nos interesa estudiar las

diferentes propiedades de los hongos.

2.2.1 Hongos

a. Características generales

Los hongos constituyen un grupo muy numeroso de organismos (se han descrito

aproximadamente 500.000, pero se estima que pueden existir entre 1 y 1,5 millones de

especies) que presentan una amplia distribución en la naturaleza, contribuyendo ala

descomposición de la materia orgánica y participando en ciclos biológicos. Un pequeño

número son patógenos de animales y plantas [24].

Son un grupo diverso de organismos unicelulares o pluricelulares que se alimentan

mediante la absorción directa de nutrientes. Los alimentos se disuelven mediante enzimas que

secretan los hongos; después se absorben a través de la fina pared de la célula y se distribuyen

por difusión simple en el protoplasma. Junto con las bacterias, los hongos son los causantes de

la putrefacción y descomposición de toda la materia orgánica. Hay hongos en cualquier parte

en que existan otras formas de vida. Algunos son parásitos de organismos vivos y producen

graves enfermedades en plantas y animales. La disciplina científica que estudia los hongos se


22

llama micología.

Los hongos figuraban en las antiguas clasificaciones como una división del reino

Plantas (Plantae). Se pensaba que eran plantas carentes de tallos y de hojas que, en el

trascurso de su transformación en organismos capaces de absorber su alimento, habían perdido

la clorofila, y con ello, su capacidad para realizar la fotosíntesis. Sin embargo, en la actualidad

los científicos los consideran un grupo completamente separado, que evolucionó a partir de

flagelados sin pigmentos. Ambos grupos se incluyen dentro del reino Protistas, o bien se

coloca a los hongos como un reino aparte, debido a la complejidad de su organización (ver

clasificación más adelante). Hay unas cien mil especies conocidas de hongos. Se cree que los

grupos más complejos derivan de los tipos más primitivos, los cuales tienen células flageladas

en alguna etapa de su ciclo vital [25].

b. Estructura.-

Los hongos se diferencian en inferiores y superiores. Los inferiores son los que no se

pueden ver a simple vista, teniendo que utilizar un microscopio para su observación, de aquí

que se llamen también hongos microscópicos. Los superiores o macroscópicos, son las

populares setas que se recolectan al bosques, y que en realidad se trata de la parte fructífera del

hongo, figura 2-3 [24].

La pared celular de los hongos posee diferentes constituyentes químicos como ser

polisacáridos, proteínas, lípidos y otras sustancias. La constitución varía entre las diferentes

especies. También varia con la edad del hongo, ya que sustancias que pueden estar presentes

en las hifas jóvenes, desaparecen en las más viejas o depositar otros materiales y enmascarar la

presencia de constituyentes iniciales, también la composición del medio, el pH y la

temperatura, influyen en la composición de las paredes de los hongos [25].

La mayoría de los hongos están constituidos por finas fibras que contienen

protoplasma, llamadas hifas. Éstas a menudo están divididas por tabiques llamados septos. En

cada hifa hay uno o dos núcleos y el protoplasma se mueve a través de un diminuto poro que


23

ostenta el centro de cada septo.

Figura 2. Corte esquemático de un hongo de la clase basidiomiceto y orden de los agaricales.

Fuente: El reino de los hongos [24].

No obstante, hay un filo de hongos, que se asemejan a algas, cuyas hifas generalmente

no tienen septos y los numerosos núcleos están esparcidos por todo el protoplasma. Las hifas

crecen por alargamiento de las puntas y también por ramificación. La proliferación de hifas,

resultante de este crecimiento, se llama micelio. Cuando el micelio se desarrolla puede llegar a

formar grandes cuerpos fructíferos ya anteriormente mencionados, tales como las setas y los

pedos o cuescos de lobo. Otros tipos de enormes estructuras de hifas permiten a algunos

hongos sobrevivir en condiciones difíciles o ampliar sus fuentes nutricionales. Las fibras, a

modo de cuerdas, del micelio de la armilaria color de miel (Armillaria mellea), facilitan la

propagación de esta especie de un árbol a otro [27].


24

c. Hábitat.-

Los hongos están muy distribuidos en todos los ecosistemas, desde 0 a 25ºC, aunque

pocos a 0ºC y con un máximo de 50ºC. para los hongos del suelo el óptimo se ubica entre 20-

30ºC, en pH muy variados: el óptimo estaría de Ph 6 y dominan en ambientes ácidos [25]. La

luz esencial para la esporulación de muchas especies [25].

d. Reproducción.-

La mayoría de los hongos se reproducen por esporas, diminutas partículas de

protoplasma rodeado de pared celular. El champiñón silvestre puede formar doce mil millones

de esporas en su cuerpo fructífero; así mismo, el pedo o cuesco de lobo gigante puede producir

varios billones.

Las esporas se forman de dos maneras. En el primer proceso, las esporas se originan

después de la unión de dos o más núcleos, lo que ocurre dentro de una o de varias células

especializadas. Estas esporas, que tienen características diferentes, heredadas de las distintas

combinaciones de genes de sus progenitores, suelen germinar en el interior de las hifas. Los

cuatro tipos de esporas que se producen de esta manera (oosporas, zigosporas, ascosporas y

basidiosporas) definen los cuatro grupos principales de hongos. Las oosporas se forman por la

unión de una célula macho y otra hembra; las zigosporas se forman al combinarse dos células

sexuales similares entre sí. Las ascosporas, que suelen disponerse en grupos de ocho unidades,

están contenidas en unas bolsas llamadas ascas. Las basidiosporas, por su parte, se reúnen en

conjuntos de cuatro unidades, dentro de unas estructuras con forma de maza llamadas basidios

[27].

El otro proceso más común de producción de esporas implica la transformación de las

hifas en numerosos segmentos cortos o en estructuras más complicadas de varios tipos. Este

proceso sucede sin la unión previa de dos núcleos. Los principales tipos de esporas


2

reproductivas formadas así son: oídios, conidios y esporangiosporas. Estas últimas se originan

en el interior de unos receptáculos, parecidos a vesículas, llamados esporangios. La mayoría

de los hongos producen esporas sexuales y asexuales.

e. Clasificación.-

Existen dos tipos de clasificaciones:

Según la forma de los órganos productores de esporas

Ascomicetos: Son aquellos hongos que producen sus esporas en el interior de unas

pequeñas vainas a modo de saco microscópico llamadas ascas. Las esporas maduran en el

interior de este pequeño saco, que se abrirá para expulsarlas al exterior. Cada asca contiene

generalmente 8 esporas.

Basidiomicetos: Producen sus esporas sobre unos pequeños órganos a modo de mazas,

formando una especie de racimo microscópico de, generalmente, 4 esporas [26].

Según sus características microscópicas y morfológicas

Existen en realidad más categorías, como el subgénero, sección, tribu, variedad, forma,

etc; pero las mencionadas antes son las principales, y la mayoría de las veces simplemente

utilizaremos las dos últimas para referirnos a un hongo: el Género y la Especie [26].

Por ejemplo si observamos al microscopio una muestra podremos observar que, las

esporas se producen en basidios, con lo cual pertenecerán a la subdivisión Basidiomicotina,

clase Basidiomicetes, etc.

f. Fisiología de los Hongos.-

En la mayoría de los hongos las paredes de las hifas están compuestas principalmente


26

por quitina y algunas hemicelulosas. La celulosa, que está presente sólo en unos pocos grupos

de hongos, es característica de los oomicetes. La proporción de agua de los hongos

mucilaginosos generalmente es mayor del 90%. Las esporas pueden tener menos del 50% de

agua; otras estructuras de resistencia, tales como los esclerocios, contienen aún menos. Los

hongos requieren oxígeno para su crecimiento, así como grandes cantidades de agua y de

hidratos de carbono u otras fuentes de carbono.

La mayoría de los hongos utilizan azúcares como la glucosa y la levulosa (D-

fructosa), pero algunos usan otros compuestos orgánicos como alimento, según su capacidad

para sintetizar las enzimas adecuadas. Ciertas micorrizas toman directamente el nitrógeno de

la atmósfera; sin embargo, todos los demás hongos lo obtienen de nitratos, sales de amonio u

otros compuestos orgánicos o inorgánicos de nitrógeno. Los hongos, además, precisan otros

elementos como potasio, fósforo, magnesio y azufre. También son necesarios, aunque en muy

pequeñas cantidades, hierro, manganeso, cobre, molibdeno, zinc y galio; así como factores de

crecimiento [24]. Determinados hongos son deficitarios, al menos en parte, en uno o más

factores de crecimiento.

Las enzimas de los hongos pueden actuar sobre una gran variedad de sustancias. Un

grupo de enzimas, llamado el complejo zimasa, permite a las levaduras llevar a cabo la

fermentación alcohólica [27].Otras enzimas, como la protopectinasa, la pectasa y la pectinasa,

hidrolizan los compuestos pectídicos que hay en las capas medias de las paredes celulares de

las plantas. La amilasa, celobiasa, citasa, dextrinasa, invertasa, lactasa, maltasa, proteasa y la

tanasa son también enzimas producidas por los hongos.

El glucógeno, sustancia relacionada con el almidón y con la dextrina, es la reserva de

hidratos de carbono más común en los hongos. Además, algunos hongos forman polisacáridos

y alcoholes polihidroxílicos, como el manitol y la glicerina. Otros producen proteínas y grasas

en abundancia. Muchos hongos sintetizan ácido oxálico y otros ácidos orgánicos, como

cítrico, fórmico, pirúvico, succínico, málico y acético; la producción de ácido láctico sólo la

realiza una familia de hongos [26]. Otros productos del metabolismo fúngico son compuestos

de azufre, sustancias que contienen cloro y numerosos pigmentos. Unos cuantos hongos tienen


2

la facultad de formar compuestos volátiles de arsénico cuando crecen sobre sustratos que lo

contienen.

g. Hongos ligninolíticos.-

Estos hongos ligninolíticos denominados hongos de la pudrición blanca de la madera,

comprenden un grupo de organismos cuya característica es su capacidad para mineralizar

eficientemente la lignina. Presumiblemente esta degradación selectiva les permite tener acceso

a la celulosa y/o hemicelulosa, las cuales finalmente representan su fuente de energía y

carbono [12].

La mayoría de los hongos ligninolíticos pertenecen al grupo Basidiomycetes y son los

microorganismos más eficientes en degradar totalmente la lignina. Estos organismos secretan

varias enzimas extracelulares que son esenciales para la transformación inicial de la lignina y

que en conjunto logran su mineralización [28].

Los hongos ligninolíticos has desarrollado un sistema enzimático único y no especifico

que funciona en el ambiente extracelular. El mecanismo del sistema degradador de lignina esta

basado en la producción de radicales libres. Este mecanismo permite que estas enzimas sean

cataliticamente activas sobre una gran diversidad e sustratos orgánicos. La enorme diversidad

estructural de los contaminantes que son degradados por estos hongos, les confiere un uso

potencial en biorremediación.

Las enzimas ligninolíticas son expresadas por los hongos como un proceso idiofasico,

el cual esta a la limitación de carbono y/o nitrógeno o sulfato en el medio y su síntesis es

particularmente activa con altas tensiones de oxigeno [23].

2.3 ENZIMAS.-

Las enzimas o biocatalizadores son proteínas cuya función es catalizar las reacciones

que realizan los seres vivos. Las enzimas son altamente selectivas para la reacción que


28

catalizan. Estas se unen a un sustrato y lo biotransforman.

2.3.1 Estructura y características generales.-

Las enzimas, como proteínas globulares de diversos tamaños, tiene su estructura

definida por la estructura primaria, segundaria, terciaria y cuaternaria.

Existe también una serie de características que diferencian alas enzimas de otras

sustancias. Algunas de ellas son: especificidad, actividad enzimática, cinética de reacción,

temperatura, pH, activación enzimática e inactivación [31].

a. Especificidad.-

Las enzimas son específicas, es decir, hidrolizan y sintetizan un compuesto en

particular. En algunos casos, su acción esta limitada a ligaciones especificas dentro de los

compuestos con los cuales ejercen reacción.

b. Actividad Enzimática.-

La actividad de una enzima o preparación enzimáticas se expresa por peso, en bases de

volumen y/o también en unidades, que es lo más común. Las condiciones propicias para una

óptima actividad enzimática, tales como pH óptimo, concentración de sustrato, cofactores e

inhibidores, temperatura, tiempo de duración del análisis y actividad de agua, son utilizadas

para determinar la unidad de actividad de la enzima.

c. Cinética de reacción (Michaelis-Menten).-

La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que representa el

estado de transición.


29

El sustrato se une al enzima a través de numerosas interacciones débiles como son:

puentes de hidrógeno, electrostáticos, hidrófobos, etc, en un lugar específico, el centro activo.

Este centro es una pequeña porción del enzima, constituido por una serie de aminoácidos que

interaccionan con el sustrato.

Algunas enzimas actúan con la ayuda de estructuras no proteícas. En función de su

naturaleza se denominan:

Cofactor es cuando se trata de iones o moléculas inorgánicas.

Coenzima es cuando es una molécula orgánica. Aquí se puede señalar, que muchas

vitaminas funcionan como coenzimas; y realmente las deficiencias producidas por la falta de

vitaminas responden más bien a que no se puede sintetizar un determinado enzima en el que la

vitamina es la coenzima [30,31].

d. Temperatura.-

La velocidad de reacciones enzimáticas aumenta con el incremento de la temperatura,

de modo semejante a las reacciones químicas.

e. pH.-

La acción catalítica de una reacción enzimática es alcanzada dentro de límites muy

estrechos de pH. Cada reacción tiene un pH óptimo, que para la mayoría de las enzimas se

encuentra entre 4,5 y 8,0, y allí la enzima presenta su actividad máxima.

f. Clasificación Internacional de las enzimas.-

Según la Internacional Comision on Enzyme, han formado con el consentimiento de la


30

IUPAC (Internacional Union of Pure and Applied Chemistry) y IUB (internacional Union of

Biochemistry) un sistema para la nomenclatura de las enzimas [30,41] (ver tabla 2-1).

Tabla 1. Clasificación Internacional de las enzimas.

2.3.2 Enzimas ligninolíticas.-

Se han identificado dos familias de enzimas extracelulares, las peroxidasas y las

lacasas. Estas enzimas son capaces de oxidar una gran variedad de compuestos aromáticos y

se diferencian en sus requerimientos catalíticos, potencial de oxido-reducción, y en su modo

de acción que puede ser directo o indirecto [46].

a. Peroxidasas ligninolíticas.-

Lignina peroxidasa (LiP) diaril propano O2 H2O2 oxidoreductasa EC 1.11.1.14

Esta enzima fue descrita por primera vez en P. chrysosporium [5, 47, 48]. Es una

glucoproteína monomerica que contiene un grupo hemo.

El ciclo catalítico de esta peroxidasa comienza con la oxidación de la enzima por

peróxidos, dando lugar al compuesto I, que contiene un complejo oxo-Fe+4 radical

Nº Clase Tipo de reacción catalizada

1 Oxidoreductasas Transferencia de electrones (iones hidruro o átomos de H)

2 Transferasas Reacciones de transferencia de grupos

3 Hidrolasas Reacciones de hidrólisis ( Transferencia de grupos funcionales al agua)

4 Liasas Adición de grupos a dobles enlaces o formación de dobles enlaces por eliminación de grupos

5 Isomerasas Transferencia de grupos dentro de moléculas dando formas isomericas

6 Ligasas Formación de enlaces C-C, C-S, C-O, C-H mediante reacciones de condensación acopladas a la rotura de ATP


3

cationico de la porfirina [49] (1). El compuesto I es reducido en dos pasos consecutivos por

compuestos aromáticos, para formar el Compuesto II y la enzima nativa (2) (3). El exceso de

peroxido da lugar a una reacción irreversible en la que se forma en Compuesto III que es

inactivo (4).

LiP Fe 3+ + H2O2 -------- LiP C-I Fe 4+ = O (P)+ + H2O (1)

LiP C-I Fe 4+ = O (P) + + RH ------- LiP C-II Fe 4+ = O (P) + R * + H + (2)

LiP C-II Fe 4+ = O (P) + RH + H ------- LiP Fe 3+ + R * + H2O (3)

LiP C-II Fe 4+ = O + H2O ------- LiP C-III Fe 3 + O2 + (4)

La LiP se diferencia de otras peroxidasas por su alto potencial de oxido-reducción, lo

que permite oxidar directamente compuestos aromáticos no fenólicos, y por tanto, la mayor

parte de las unidades de la lignina [48].

Peroxidasas que oxidan el manganeso (MnP) Mn (II): H2O2 oxidoreductasa EC

1.11.1.13

Mas frecuente que la producción de peroxidasas que oxidan el Mn 2+ a Mn 3+ en

presencia de peróxidos. Estas peroxidasas manganeso dependientes se han descrito en al

mayoría de los hongos ligninolíticos de la podredumbre blanca de la madera [50].

El Mn 3+ formado en la reacción es un fuerte oxidante, que estabilizado con ácidos

dicarboxilicos secretados por el hongo, actúa como intermediario de la oxidación de

compuestos fenólicos y no fenólicos [51].

El ciclo catalítico de la MnP es semejante al de otras peroxidasas incluidas la LiP y

transcurre a través de la formación de intermediarios de la enzima MnP C-I y MnP C-II.

Mn Fe 3+ + H2O2 -------- MnP C-I Fe 4+ = O (P)+ + H2O (1)


32

MnP C-I Fe 4+ = O (P) + + Mn +2 ------- MnP C-II Fe 4+ = O (P) + Mn 3+ (2a)

MnP C-I Fe 4+ = O (P) + RH ------- MnP C-II Fe 4+ + O (P) + R * (2b)

MnP C-II Fe 4+ = O (P) + Mn +2 ------- MnP Fe 3 + + Mn 3+ + H2O (3)

MnP C-II Fe 4+ = O + H2O2 ------- MnP C-III Fe 3 + O2 + (4)

El primer producto de la reacción de la MnP nativa con el peroxido de hidrogeno es el

compuesto I (1). La reducción monoelectrónica del compuesto I por Mn 2+ conduce al

compuesto II que de nuevo se reduce por Mn 2+ para generar el enzima nativo. Mientras que el

compuesto I puede ser reducido además de por el Mn 2+ (2a), por otros donadores como los

fenoles (2b), el compuesto II de la MnP solo puede ser reducido por Mn 2+ por lo que depende

de este catión para cerrar su ciclo (3).

Al igual que la LiP la MnP es sensible a latas concentraciones de H2O2 que provocan la

inactivación reversible del enzima al compuesto III que es un estado de oxidación inactivo

cataliticamente (4).

La mayoría de estas peroxidasas se caracterizan por depender del Mn 2+ para cerrar su

ciclo catalítico [49]. Son enzimas que solo actúan de manera indirecta sobre la lignina.

b. Lacasas.-

Lacasas EC.1.10.3.2. Benzodiol oxigeno: oxigeno reductasa

Las lacasas son fenoloxidasas ampliamente distribuidas en plantas, hongos de

diferentes clases [52] y algunas bacterias [53].

Las lacasas se descubrieron en el látex de la planta Rhus vernicifera [54], como la

sustancia termolábil responsable del endurecimiento de la resina. En plantas la lacasa tiene una

función protectora frente a lesiones sufridas por el vegetal, pues la oxidación de fenoles del

látex por la lacasa provoca radicales libres que tienden a polimerizar lo que origina una


33

cubierta protectora en la lesión.

La función de la lacasa en los hongos no esta clara, se ha relacionado con la

morfogénesis, con la pigmentación de los conidios, con la formación de rizoformos, con el

desarrollo de cuerpos fructificantes [54], con la patogénesis [55] y en la protección frente a

compuestos fenólicos tóxicos liberados durante la degradación de la lignina [56].

La lacasa mejor estudiada es la de Trametes versicolor [56]. Es una O2 p-difenol

oxidoreductasa que se diferencia de la mayoría de fenoloxidasas en que se produce agua en

lugar de peroxido en la reducción del oxigeno. Son glucoproteínas con 4 átomos de cobre y de

peso molecular variable [57]. Los átomos de cobre están clasificados en tres tipos (1, 2, 3) con

diferentes propiedades [58].

Cobre tipo 1 (T1): es responsable del color azul de la proteína. Tiene una alta

absorbancia en la región del visible (605nm) provocada por la union covalente cobre-cisteina.

Debido al alto potencial redox de este cobre es el sitio donde ocurre la oxidación del sustrato.

Cobre tipo 2 (T2): se caracteriza por no presentar absorbancia detectable en al región

visible y por tener una alta afinidad por aniones (F, CN...) que actúan como inhibidores de la

actividad del enzima.

Cobre tipo3 (T3): es un complejo binario formado por un par de iones Cu2+-Cu 2+

unidos por puente hidróxido con un máximo de absorbancia a 330 nm y un espectro de

fluorescencia característico. La reacción que cataliza la lacasa es la siguiente:

4 AH + O2+ ---------- 4A + H2O [AH: Dador de electrones]

Los cobres T2 y T3 forman un cluster trinuclear que es el lugar donde se reduce el

oxigeno. El cobre del centro T1 es el primer aceptor de electrones del sustrato. Después los

electrones se trasfieren secuencialmente al centro T2-T3 que tras recibir cuatro electrones

reducen una molécula de oxigeno a agua. Así la oxidación monoelectrónica del sustrato va

acoplada a la reducción por cuatro electrones del oxigeno molecular.


34

Tabla 2. Características principales de enzimas ligninolíticas

2.3.3 Aspectos biotecnológicos.-

Los organismos productores de enzimas ligninolíticas han evolucionado para adaptarse

a diferentes condiciones ambientales. En tales condiciones cuando estas enzimas son

secretadas, funcionan de manera inusual. Esta habilidad adaptativa es importante en términos

de aplicaciones industriales, como por ejemplo en la degradación de diferentes compuestos

descritos a continuación.

Colorantes: en la industria textil se estima que del 10-14% de los colorantes, después

del teñido de telas, se vierten en efluentes de agua dulce, los más comunes son: azo,

trifenilmetano o polimérico/heterocíclico, estables a la acción degradadora por la microbiota

EC MnP (1.11.1.13) Mn (II):H2O2oxidoreductasa

LiP(1.11.1.14)diarilpropano O2 H2O2 oxidoreductasa

Lac(1.10.3.2)pbenzodiol O2 oxidoreductasa

Grupo proteico Hemo Hemo Cobre I, II=1Cobre III=2

PM (kDa) 32,62,5(122) 38-47 59-110

Glucosilacion N- N- N-

Isoformas monomeros; acima de 11 monomeros; acima de 15 mono-,di-,tetrameros

Punto Isoelectrico

2,8-7,2 3,2-4,7 2,6-4,5

Punto de pH 2,6-4,5 2,0-5,0 2,0-8,5

H2O2 si si No

Estabilidad +++ + +++

Med. naturales Mn2+, Mn3+ AV, 2CL-1, 4DMB 3-HAA

Especificidad Mn2+ Amplia,aromáticos, incluidos no fenólicos

Amplia, fenólico

Med. sintéticos Ácidos grasos insaturados no ABTS, HBT


3

natural, dada la similitud química de estos con los compuestos de los procesos vitales

celulares. Para disminuir ese impacto negativo, existe la alternativa de usar hongos de la

podredumbre blanca y/o sus enzimas extracelulares inespecíficas que oxidan la lignina [59].

Aromáticos: en la biorremediación de ambientes contaminados con xenobioticos

aromáticos, se recomienda aplicar hongos de la PB. [60]

Hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP): los HAP son compuestos homólogos

de benceno formados por 2 o más anillos fusionados, que se liberan en emisiones industriales,

durante la combustión incompleta de la gasolina en automotores, en plantas de generación de

energía, naturalmente en depósitos de carbón, en el proceso de transformación de derivados

aromáticos de terpenos, esteroles, quinonas etc., sin embargo estos compuestos son

recalcitrantes y potenciales carcinogénicos. La literatura reporta que los hongos de la PB, así

como sus extractos extracelulares, tienen la capacidad potencial para la degradación de HAP,

por ello son una alternativa en la biorremediación de ambientes contaminados con estos

poliaromáticos [61,62].

Bifenilos policlorados (BFP): los BFP se utilizan en la industria como fluidos

dieléctricos e hidráulicos, como diluyentes orgánicos, plastificantes, etc., por su estabilidad

química, son recalcitrantes a la biodegradación, por ello, causan serios problemas de

contaminación, por esa razón existen estrategias de biorremediación para su eliminación.

Diversos reportes en la literatura muestran la capacidad degradativa de los hongos de la PB

sobre los BFP [63, 64].

Pesticidas: son los compuestos que contaminan aguas superficiales y subterráneas,

causan un grave problema ambiental, pues algunos de estos químicos son carcinogénicos, más

por su bioaumentación a través de la cadena alimenticia, son de alto riesgo para la vida, por

eso es necesario su tratamiento mediante biorremediación para minimizar o reducir su

negativo impacto ambiental. Los hongos de la PB y sus enzimas ligninolíticas son un recurso

viable en la eliminación de los pesticidas o de algunos de sus componentes [65, 66].


36

Nitroaromáticos: estos son compuestos como: el nitrobenceno, el nitrotolueno, los

nitrofenoles y los nitrobenzoatos, se utilizan en síntesis de pesticidas, explosivos, colorantes, y

farmacéuticos, pero son un problema ambiental por su recalcitrancia. Ciertos nitroaromáticos

son tóxicos para humanos y animales. Investigación reporta que los hongos de la PB oxidan

nitroaromáticos, como el trinitrotolueno (TNT) son una alternativa en la recuperación de

ambientes contaminados con estos compuestos.

Otros aromáticos: existen otros compuestos sintéticos que por su estructura y su

composición química compleja no se investigan, pero evidencia sugiere que pueden ser

degradados y/o mineralizados por el sistema enzimático de los hongos de la PB como: C.

versicolor, Funalia trogii, P. chrysosporium y P. pulmonaris en la decoloración de vinasas en

cultivo estático. Los reportes al respecto muestran que no solo decoloran las vinasas sino

también reducen su demanda química de oxígeno [67]. Otro estudio demostró la capacidad

oxidativa de P. crhysosporium, P. ostreatus, Lentinus edodes, T. versicolor en un licor

residual del molido de pulpa y papel en un medio plástico poroso, donde los hongos de la PB

oxidaron en un 71% la lignina para disminuir en un 48% la demanda química de oxígeno, lo

que baja el costo de producción del proceso [68].

Además de estar implicadas en la degradación de otros compuestos aromáticos que

producen problemas de contaminación ambiental, anteriormente ya descritos tiene amplias

aplicaciones industriales; actualmente, las enzimas son empleadas principalmente para la

obtención de lácteos, edulcolorantes, fármacos, alimentos, licores, detergentes, el blanqueo de

textiles y de pulpa de papel, síntesis orgánica, biorremediación ,detergentes de lavado, etc.

2.4 RECURSOS LIGNOCELULOSICOS.-

Bolivia es uno de los países mas ricos del mundo en diversidad biológica, ya que en el

país se encuentran entre el 35 a 45% de toda la diversidad biológica, aun que el territorio

boliviano representa apenas el 0,2% de la superficie mundial, y sus bosques alcanzan el 3,5%

de los bosques del mundo [27].


3

Dada la disminución de las reservas de materias orgánicas fósiles, en los últimos años

en todo el mundo se dedica mucha atención al tratamiento químico y biotecnológico de la

biomasa vegetal de madera y plantas agrícolas. La biomasa vegetal (fitomasa) se forma como

resultado de la actividad fotosintética de las plantas. A diferencia de las fuentes fósiles, las

reservas de fitomasa se renuevan como resultado de la actividad de las plantas superiores.

Cada año en el planeta se forman cerca de 200 millones de toneladas de biomasa vegetal

celulósica. La biosíntesis de la celulosa es la mayor de las síntesis en el pasado, presente y

futuro.

En este siglo los principales tipos de materiales orgánicos serán la madera, las plantas

agrícolas y el carbón de piedra que a su vez es de origen vegetal. Por una valoración

aproximada, las reservas conocidas de petróleo son prácticamente iguales a las de la madera

en nuestro planeta, sin embargo, los recursos petroleros se agotan, al tiempo que los de

maderas y otros desechos agrícolas, como resultado del crecimiento natural, se elevan [72].

La generación de Biomasa a partir de materiales lignocelulósicos tiene gran

importancia para todos los países. Los residuos agrícolas y forestales constituyen una fuente

importante de sustratos orgánicos para organismos que son capaces de degradar en la

naturaleza la lignina y la celulosa.

2.4.1 Paja Brava.-

En Bolivia se encuentran especies de plantas y animales de casi todas las zonas climáticas

debido a la variada elevación de su territorio. La paja brava es una planta que crece en la zona

más elevada del extenso Altiplano, se utiliza para confeccionar techos, denominados techos de

quincha, es empleada como cama para animales, dígase en caballerizas, también se utiliza para

mantener la humedad después de haber sembrado pasto, puede utilizarse como material de

construcción

Tabla 3: Composición química de la paja brava. Parámetro Unidad Valor Humedad % 8,17


38

Cenizas % 6,12 Fibra cruda % 90,06

Lignina % 22,89 Celulosa % 54,13

Hemicelulosa % 13,04

2.4.2 Bagazo.-

El material sólido y pulposo que queda después de la extracción del jugo de la caña de

azúcar se llama bagazo, es el residuo leñoso. En estado fresco estos bagazos contienen un 40%

de agua. Suelen utilizarse como combustible de las propias azucareras. También se utilizan en

la industria del papel y fibras, por la celulosa que contienen, se aprovecha el bagazo de la caña

en la elaboración de forrajes para ganado y fabricación de madera sintética.

Tabla 4: Composición química del bagazo.

La

pro

duc

ción de energía eléctrica, a partir de bagazo de caña, permite que los ingenios sean capaces de

suplir su demanda de energía para la producción de azúcar.

2.4.3 Aserrín.-

Los materiales lignocelulósicos constituyen una fuente de materia prima importante

para la obtención de productos de amplia utilización en la agricultura. Dentro de estos

materiales se encuentran el aserrín y la corteza que resultan desechos de la industria de la

elaboración primaria de la madera. En el mundo se desarrollan cada día nuevas tecnologías

para dar un uso racional a estos residuos, que además contribuyen con su acumulación a la

contaminación del entorno. En el presente trabajo se exponen los aspectos sociales de este

problema y se ofrecen sugerencias para dar un aprovechamiento óptimo de los residuos con

Parámetro Unidad Valor Humedad % 6,7 Cenizas % 8,62

Fibra cruda % 85,06 Lignina % 20,36 Celulosa % 49,58



39

enfoque ambientalista [71].

Tabla 5 Composición química del aserrín.

El

aser

rín

solo, como fertilizante, es poco efectivo, ya que contiene bajo contenido de elementos

nutritivos: aproximadamente 0,1 % de N, 0,02 % de P2O5 y 0,12 % de K2O. Si se suministra

fresco, sin compostar, puede provocar carencia de Nitrógeno en la planta en el primer y a

veces en el segundo años de haberlo suministrado al suelo. Por otra parte, el complejo

lignocelulósico del aserrín puede ser utilizado para aumentar el nivel de humus del suelo.

Efecto positivo y continuado del aserrín se observó con su introducción en forma de capas

para la reforestación en suelos pobres, arenosos. Ejemplo de esto se observó que durante un

experimento en el cual al cabo de 14 años de plantado un bosque, se conservó sólo el 7 % sin

enmienda, y para el suelo que tuvo aserrín, 43 - 50 %, con un diámetro y altura de los árboles

2 - 3 veces superior [73].

2.4.4 Residuos de quinua real.-

La Quinua Real, es uno de los granos más importantes de los Andes, cuyo origen se

remonta a más de 5000 años, fue el principal alimento que corresponde a las necesidades y

requerimientos del mundo moderno. El ciclo vegetativo de la planta tiene una duración de 8

meses. La siembra generalmente se la realiza en el mes de septiembre, y la planta llega a su

fase de maduración en el mes de abril, para efectuar la cosecha y trilla en los meses de Mayo y

Junio.

Tabla 6: Composición química de residuos de quinua.





40

Dentro de las variedades más importantes de Quinua Real y cultivadas con fines

comerciales y de exportación. Sin embargo existe una gran variedad de semillas que son

cultivadas con fines específicos de consumo, está considerado como uno de los granos más

ricos en proteínas, dado por los aminoácidos que la constituyen como: la leucina, isoleucina,

metionina, fenilamina, treonina, triptofano y valina. La concentración de licina en la proteína

de la QUINUA es casi el doble en relación a otros cereales y gramíneas [74].

En este sentido es muy importante darle una función al residuo de quinua, ya que es

bastante rico en celulosa ya que no se lo utiliza y existe en bastante cantidad en especial en el

Altiplano boliviano.

2.4.5 Cáscara de arroz.-

La cáscara del arroz, además de los componentes fibrosos, contiene también fitosteroles,

con evidente capacidad de reducir los niveles de colesterol sanguíneo. Por tanto, personas con

colesterol elevado, para obtener los beneficios mencionados será preciso que elijan el arroz

integral que conserva la cáscara.

Una característica particular de la cáscara del arroz es su contenido en silicio. Este

microelemento, ha llamado la atención a causa de su capacidad para estimular las células

necesarias para la síntesis y formación de material óseo y por su rol en la formación de la

sustancia fundamental de los tejidos cartilaginosos, necesaria para la formación del cartílago y

de la elastina.





4

Tabla 7: Composición química de la cáscara de arroz.

El aprovechamiento y la aplicación que se le puede dar a las cenizas de las cáscaras de

arroz, desecho agrícola de bajo rendimiento económico cuyo volumen asciende a las 60 mil

toneladas anuales. Al someter a la cáscara de arroz a una temperatura cercana a los

500-600 °C, se obtiene una sustancia similar a la arena de cuarzo con un porcentaje de sílice

cercano.

3. METODOS.-

El siguiente diagrama resume en forma general el procedimiento del presente trabajo.

Parámetro Unidad Valor Humedad % Cenizas %


Hemicelulosa % 0,52


42

Figura 3. Procedimiento general “Producción de enzimas ligninolíticas, a partir de cepas fúngicas del

Altiplano boliviano”.


43

3.1 RECOLECCION DE MUESTRAS.-

Se realizo un viaje a lugares cercanos al lago Titicaca mas específicamente a la

localidad de Llamacachi, cantón Compi (L.S. 17º 51, 966´ NO 67º 20,603´ 3737 m.s.n.m.) y

el rió Desaguadero (L.S. 17º 38,061´ NO 67º 30,500´ 3750 m.s.n.m.) ubicados en los

departamentos de La Paz y Oruro respectivamente.

Figura 4. Orillas del Lago Titicaca en la localidad de Llamacachi.

Figura 5. Orillas del Río Desaguadero en el departamento de Oruro.


44

En los lugares mencionados se procedió a recolectar muestras de cepas fúngicas

presentes en la parte baja de la paja brava y quinua real, las muestras se tomaron de la raíz, del

tallo, del nudo vital, e incluso del suelo que rodeaba las mencionadas plantas, las muestras

fueron tomadas utilizando pinzas estériles, preparadas a los métodos tradicionales. El

muestreo se realizo utilizando frascos de vidrio estériles, frascos de plástico irradiados por luz

U.V., y bolsas de polietileno.

Figura 6. Paja Brava a orillas del río Desaguadero.

Figura 7. Suelo donde crece la planta Paja Brava a orillas del lago Titicaca.


4

Se tomaron los datos de muestreo de cada espécimen recolectado con los siguientes

parámetros: ubicación geográfica, la altura, descripción del lugar y apariencia general de la

planta (ANEXO B-2).

En este viaje realizado se aprovecho para la recolección de algunos sustratos utilizados

más adelante, tales como la paja brava, residuos de quinua real.

De la toma de muestra realizada se recolectaron 30 muestras diferentes, entre ellas 19

pertenecían a la paja brava, 5 a quinua real, 4 a tierra que rodeaba mencionadas plantas, y 2 a

las setas.

3.2 METODOS DE AISLAMIENTO DE CEPAS FUNGICAS.-

La inoculación se realizo de dos formas, una indirecta y otra directa.

INDIRECTO: Se preparo diluciones de hipoclorito de sodio al 10% (v/v), alcohol al

70% (v/v). La muestra fue sumergida por 5 segundos en cada dilución y finalmente en agua

destilada y fue trasladada a medio Papa Dextrosa Agar (PDA).

DIRECTO: Se traslado la muestra directamente en medio Papa Dextrosa Agar (PDA).

En ambos casos se incubo a temperatura de 20ºC durante 5 días. Se comprobaron la

pureza de las cepas aisladas mediante resiembras en medio Papa Dextrosa Agar (PDA).

De las 30 muestras recolectadas, se logro aislar 102 cepas fúngicas, de las cuales

muchas eran repetidas, obteniéndose 31 cepas fúngicas diferentes (anexo B-1).


46

Figura 8. Métodos de aislamiento de las cepas fúngicas.

Una vez aisladas dichas cepas fúngicas, fueron conservadas en medio Papa Dextrosa

Agar (PDA), en tubos pico de flauta, para posteriormente liofilizarlas.


4

Figura 9. Tronco de madera que contiene cepas fúngicas, recolectada de orillas del lago Titicaca.

Las muestras recolectadas fueron manipuladas con los debidos cuidados, y a las 24 hrs.

de ser recolectadas.

Figura 10. Preparación de medio Papa Dextrosa Agar (PDA).

La preparación de los medios de cultivo se realizó a condiciones estériles, usando los

materiales adecuados y las normas de Bioseguridad.


48

Figura 11. Cepas fúngicas en crecimiento a temperatura ambiente.

El crecimiento de las cepas fúngicas aisladas fue a unos 20ºC, teniendo cuidado de no

cruzar las cepas, esto por la esporulación de los hongos.

3.2.1. Codificación de cepas fúngicas aisladas.-

El presente trabajo se realizo en el Instituto de Investigaciones fármaco Bioquímicas

(IIFB) de la Facultad de ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, en conjunto con el Instituto de

Investigación y Desarrollo de Procesos Químicos (IIDEPROQ) de la Facultad de Ingeniería,

motivo el cual se codifico a las cepas fúngicas aisladas como IB.

I = Ingeniería B = Bioquímica

Para la codificación de las cepas fúngicas aisladas se les asigno un numero según el

orden de muestras recolectadas, seguidas de una letra mayúscula el cual representa el primer

aislamiento de la muestra , seguido de una letra minúscula el cual significa el segundo

aislamiento de la misma muestra.


49

3.3 METODOS DE IDENTIFICACION DE CEPAS FUNGICAS.-

Una vez aisladas las cepas fúngicas se procedió a identificarlas mediante la

identificación de los hongos filamentosos se basa en el examen macroscópico de la colonia y

en sus características microscópicas.

3.3.1 Identificación Macroscópica.-

Se observo cuidadosamente todas las características que pudieran presentar dichas

cepas, tales como: tiempo de crecimiento, forma de crecimiento, color característico de la cepa

fúngica, para así poder compararla con la bibliografía e identificarla según mencionadas

características.

Semejanzas macroscópicas como la forma de la colonia, el color de la superficie, la

textura y la producción de pigmentos son muy útiles para la identificación.

En general, la morfología macroscópica de los hongos es estable y presenta pocas

variaciones. La identificación definitiva se basa en la forma característica, método de

producción y ordenamiento de las esporas, siendo también importante conocer el tamaño y la

disposición de las hifas [18].


0

A: Vista anterior de la cepa fúngica B: Vista posterior (observamos el (se observa micelios algodonados) (pigmento que produce el hongo)

Figura 12. Morfología macroscópica de la cepa fúngica

Los estudios macroscópicos consistieron en evaluar el tipo de micelio aéreo, tipo de micelio

vegetativo, color del micelio vegetativo y del micelio aéreo, producción de pigmentos

difusibles en el medio de cultivo y consistencia de las colonias. Todas estas observaciones se

realizaron en medio Papa Dextrosa Agar (PDA).

3.3.2 Identificación Microscópica.-

Se basa en la observación al microscopio con la lente (40x) de la muestra de la cepa

fúngica en un portaobjetos, evaluar el tipo y disposición de hifas, micelios y esporas de cada

una de las cepas, guiándonos en la bibliografía, y así poder identificarlas.


A: Selección de colonia fúngica. B: Preparación de muestra

Figura 13. Identificación microscópica

La observación al microscopio permite distinguir la forma y disposición de las esporas. Este

método permite la observación microscópica del hongo mientras se desarrolla directamente

debajo del cubreobjetos, de forma que las características microscópicas se distinguen con

facilidad, las estructuras se mantienen intactas y puede observarse un gran número de áreas

representativas [18]. Se comparo información morfológica y taxonómica con bibliografía.

Muchas especies de hongos se pueden diferenciar, identificar y clasificar según su

morfología, estructura, mecanismo de formación y elementos formadores de las esporas. El

conocimiento de estas características puede ser suficiente para identificar especies que

pertenecen al grupo de los hongos filamentosos; sin embargo, cuando se trata de identificar

otras especies es imprescindible la aplicación de pruebas de biología molecular.

Se identificaron microorganismos de los géneros Circinutrichum, Stephanoma,

Cephalosporium, Bdellospora, Blatomyces, Trinacrium, Verticium, Dendrodochium,

Choanephora, Botritys, Paecielomyces, Mycotypha.

De las 31 cepas fúngicas asiladas (100%), solo 25 cepas fúngicas (80,64%) fueron

identificadas, el resto 6 (19, 35%) no pudieron ser identificadas, ya muchas de ellas no

coincidían con la taxonómica de ninguna bibliografía utilizada.


2

A: Morfología microscópica Botrytis B: Morfología microscópica Cephalosporium

Figura 14. Morfología microscópica

3.3.3 Elaboración de Historial de cepas fúngicas.-

Una vez identificadas las cepas fúngicas, se procedió a elaborar un historial de las cepas

fúngicas recolectadas (ver anexo B).

Este contiene información sobre: numero de muestra, lugar de origen, coordenadas de

la ubicación geográfica, la altura, nombre común, la descripción general del hábitat, apariencia

general, nombre científico de las cepas fúngicas identificadas.(ver anexo A-2). La

identificación microscópica se realizo de acuerdo al procedimiento descrito (3.3.1). Se

comparo información morfológica y taxonómica con bibliografía.

3.4 METODOS DE DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD

ENZIMATICA.-

3.4.1 Determinación Cualitativa.-

En este estudio, se determino la actividad enzimática ligninolítica que sean capaces de

producir cepas fúngicas.


3

Figura 15. Preparación de medio ABTS y Poli – R.

Ver composición en ANEXO A-1

Las cepas identificadas por sus características morfológicas en medio PDA de esos

cultivos se tomo una pieza de micelio aproximadamente de 10mm de diámetro, esos fueron

transferidos a un medio sólido Poly R-478, y otra pieza de micelio del mismo diámetro se

traslado a un medio sólido ABTS, el diámetro de decolorización fue examinado después de 2

días, hasta los 5 días, a 20ºC, se tuvo cuidado de incubarlas a oscuridad, ya que luz puede

afectar al respuesta, y podríamos obtener resultados verdaderos positivos, por ultimo, fue

comparado con las zonas formadas del medio de referencia de Trametes versicolor, esto por

bibliografía [56].

Las figuras 4-5 muestra claramente el resultado de esta prueba, ya que se puede notar

la decolorización del medio alrededor de la cepa fúngica en crecimiento, este resultado se vio

entre el tercer y quinto día. La decolorización se debe a la oxidación del colorante Poly R-478

por acción de las enzimas ligninoliticas, lo que significa que el microorganismo es capaz de

degradarlo y por ende producir dichas enzimas [34].


4

Figura 16. Decolorización del medio sólido Poly R

Fuente: Elaboración propia

La figura 4-6 muestra el resultado de decoloración del medio solidó ABTS, este

resultado se presento a los 3 días y nos da a entender que el cambio de color es causada por la

oxidación del colorante ABTS, lo cual indica que la cepa fúngica en el medio tiene la

capacidad de producir enzimas ligninolíticas con actividad ligninolitica.

Figura 17. Decolorización del medio sólido ABTS.


El ABTS (2,2'-Azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid).2NH4-salt)

(figura 4-6) es un compuesto el cual tiene una estructura compleja, en este sentido podemos

decir que cuando hay una degradación de ABTS lo cual esta representado por la

decolorización, hay presencia de enzimas ligninolíticas [41].


Figura 18. Estructura generaliza de ABTS (2,2'-Azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid).2NH4-salt)

3.4.2 Determinación Cuantitativa.-

De la cepa fúngicas que presentaron elevadas actividades según los criterios

establecidos anteriormente, se seleccionaron las que como resultado dieron positiva,

para determinar esta actividad enzimática se realizo un diseño factorial 23, siendo los factores:

glucosa, manganeso, extracto de levadura.

Obteniendo un diseño factorial 23 con 8 combinaciones posibles, se utilizaron frascos

de vidrio de 100 ml de capacidad, cada uno con 10 ml de medio de cultivo Mn (II). A partir

del cultivo agarizado, se tomo discos de agar de 10mm de diámetro que fueron transferidos a

los frascos con medio de cultivo, y se incubo en oscuridad, a 20ºC, durante 4 semanas, se tomo

una muestra de cada medio de cultivo cada 7 días para determinaciones de las actividades

enzimáticas, proteínas totales y celulasas, cabe recalcar que las pruebas fueron realizadas por

triplicado, esto para confirmar resultados.


6

Figura 19. Determinación cualitativa de la actividad enzimática ligninolítica.

Tabla 8: Composición de medios de cultivo Mn (II), resultado del diseño factorial 23

Por otro lado se determinó la influencia de glucosa, extracto de levadura, manganeso,

sobre la producción de las enzimas ligninolíticas por parte de los hongos seleccionados.

Glucosa: Fuente de carbono

Medio Glucosa (g/L) Manganeso(mg/L) Ext. de lev. (g/L) 1 1 40 0.5 2 1 40 2 3 1 80 0.5 4 5 40 0.5 5 1 80 2 6 5 40 2 7 5 80 0.5 8 5 80 2


El medio de cultivo utilizado tiene como única fuente carbono a la glucosa, por tanto

podremos verificar que tan importante es el carbono para la producción de este tipo de

enzimas. Considerando a al glucosa como fuente de carbono e inductor de la actividad

enzimática, en estudios en los cuales se utilizo fuente de carbono para producción de este tipo

de enzimas fue observado que las fuentes utilizadas fueron eficientes y rápidamente utilizadas,

resultando al altos niveles de actividades [34].

Extracto de levadura: Fuente de nitrógeno y vitaminas

El extracto de levadura contiene aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en agua y

carbohidratos. La producción de enzimas ligninolíticas esta en dependencia tanto de fuente de

carbono como de nitrógeno, en este trabajo fue utilizado como fuente de nitrógeno y fuente de

vitaminas el extracto de levadura, lo cual pueda explicar varias concentraciones encontradas, a

pesar de la importancia de la fuente de nitrógeno para la producción de estas enzimas ha sido

recientemente apuntada por algunos autores que su actividad es mayor en condiciones

limitantes de nitrógeno [38].

Manganeso: Inductor de enzimas

La producción de enzimas por hongos, por el medio modificado por el diseño factorial,

requieren glucosa y manganeso según bibliografía. Las actividades de MnP, LiP aumentan

simultáneamente por la adición del mencionado en el medio el cual puede estimular la

producción de mas MnP que LiP [1].


8

Figura 20. Fotografía del equipo Espectrofotómetro de absorción.

Figura 21. Medio de cultivo Mn (II) para determinación cuantitativa.


9

Figura 22. Determinación actividad enzimática ligninolítica por métodos espectrofotométricos.

De los medios de cultivo preparados se tomo muestra del sobrenadante de cada frasco,

se tomo 0,5 mL de muestra, cuidando de no extraer micelio, se procedió a determinar tres

tipos de enzimas ligninolíticas: Manganeso peroxidasa, Lignina peroxidasa y Lacasa.

A continuación detallamos el procedimiento de cada enzima.


60

a. Manganeso Peroxidasa.-

Para determinar la actividad de esta enzima se leyó la variación de absorbancia del

cultivo (entre 120 segundos) en espectrofotómetro (470nm), en cubetas de plástico con: 2,6

DMF 1mM (100μ), MnSO4 3mM (100μl), buffer succinato pH 5 100mM (400μl),

sobrenadante de medio de cultivo (100μl) y peroxido de hidrogeno 0,5mM (100μl).

La actividad para MnP fue estimada por oxidación de 2,6 dimetoxifenol, a coerulignona

(ε470 = 24500 M-1cm-1) monitoreada a 470nm a pH 5.

Figura 23. Reacción enzimática para MnP por oxidación de 2,6 dimetoxifenol

La figura 4-8 muestra el cambio de coloración cuando se lleva acabo la reacción

producida por MnP, la diferencia es clara, para la cepa IB-26C (Trinacrium) que fue la que

presento mayor actividad enzimática que las demás.

La MnP, esta enzima es una peroxidasa que oxida componentes fenólicos de la lignina,

mediante la reacción de oxidación del Mn2+ a Mn3+, la cual es dependiente del H2O2, ya que la

reacción es iniciada por este compuesto[80]. Una unidad de actividad enzimática de MnP es

definida como la formación de coerulignona por minuto.


6

b. Lignina Peroxidasa.-

La actividad de esta enzima se determino mediante la variación de absorbancia del

cultivo (entre 120 segundos) en espectrofotómetro (420nm) en cubetas de plástico con: ABTS

10mM (100μl), buffer acetato pH 3 100mM (400μl), sobrenadante de medio de cultivo (100μl)

y peroxido de hidrogeno 0,5mM (100μl).

LiP fue medida a pH 3 por oxidación de ABTS en presencia de agua oxigenada a un

catión radical (ε420 = 36000 m-1 cm-1) por el monitoreo en el cambio de absorbancia a 420 nm

[34] (figura 4-12).

La LiP que su actividad depende del peroxido de hidrogeno, además posee algunas

características con las hemoproteínas transportadoras de oxigeno.

La degradación que causa sobre de lignina se da por la ruptura de anillos aromáticos,

por síntesis endógena oxida compuestos aromáticos no fenólicos, en la reacción se generan

radicales arilo y alquilo que se anabolizan intracelularmente.

Figura 24. Reacción enzimática para LiP por oxidación de ABTS.


62

c. Lacasa.-

La actividad de la lacasa se determino mediante la variación de absorbancia del cultivo

(entre 120 segundos) en espectrofotómetro (420nm) en cubetas de plástico con: ABTS 10mM

(100μl), buffer acetato pH 3 100mM (400μl), sobrenadante de medio de cultivo (100μl).

La actividad de la lacasa se determino mediante la oxidación del sustrato ABTS la

oxidación se midió mediante el incremento de absorbancia (ε420 = 36000 m-1 cm-1) a 420nm (ver

figura 4-16). Lacasa una fenol oxidasa con cobre, enzima que reduce el oxigeno molecular a

agua y a través la utilización de ciertos compuestos redox puedes ser capaz de ampliar su

espectro de sustratos, logrando así la oxidación de porciones no fenólicas de la lignina [12].

Figura 25. Reacción enzimática para Lac por oxidación de ABTS.

Esta enzima con cuatro átomos de cobre como cofactor y cuyo aceptor de electrones es

el O2 dando agua como producto [86]. La enzima oxidada ataca principalmente sustratos

fenólicos, pero en este caso en presencia de ABTS [87,88]. Estos actúan como cooxidantes y

capacitan ala enzima para atacar sustratos más difícilmente oxidables como los de tipo no

fenólico.


63

Para todas las medidas de actividad enzimática, una unidad de actividad enzimática fue

definida como la cantidad de enzima, que catalizó la formación de 1 mol de producto por

minuto bajo condiciones del análisis.

3.4.3 Cuantificación de las Enzimas.-

Determinado por la ecuación (1) según bibliografía.

[ ] ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ ×== −1

m

t min L

U Y V x ε

xCV x 1000 x AbsiónConcentrac

Abs: variación de la absorbancia en los dos minutos (min.-1)

Vt: volumen total de la solución (mL)

Vm: volumen de la muestra

ε: coeficiente de extinción molar, donde:

ε470 = 24500 M-1cm-1 (Manganeso Peroxidasa)

ε420 = 36000 m-1 cm-1 (Lignina Peroxidasa – Lacasa).

1000: factor de conversión de moles a moles.

C: distancia de la cubeta por donde pasa el haz luminoso (1cm)

3.5 OPTIMIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO PARA LA PRDUCCION

DE ENZIMAS LIGNINOLITICAS.-

Una vez cuantificada la actividad enzimática ligninolítica, se procedió a realizar una


64

variación en el medio de cultivo con las cepas fúngicas que dieron mejor resultado en la

anterior prueba.

3.5.1 Medios de cultivo con variación de concentración de Cobre.-

Tabla 9: Composición de medios de cultivo Cu (II), resultado del diseño factorial 23

Figura 26. Diagrama determinación enzimática en medio de cultivo Cu (II).

Medio Glucosa (g/L) Cobre (mg/L) Ext. de lev. (g/L) 1 1 40 0.5 2 1 40 2 3 1 80 0.5 4 5 40 0.5 5 1 80 2 6 5 40 2 7 5 80 0.5 8 5 80 2


6

Se preparo un medio de cultivo Cu (II), en el cual se hizo un diseño factorial 23 con 8

combinaciones posibles, siendo los factores: glucosa, manganeso, extracto de levadura. Se

inoculo las cepas fúngicas, se incubo a temperatura ambiente en oscuridad, a 20 ºC, durante 4

semanas, se tomo una muestra de cada medio de cultivo cada 7 días, las pruebas fueron

realizadas por triplicado, de igual forma que la anterior se procedió a determinar la actividad

enzimática de MnP, LiP y Lacasa.

3.5.2 Medios de cultivo con diferentes sustratos lignocelulosicos.-


66

Figura 27. Determinación enzimática en medios de cultivo con diferentes sustratos.

Se preparo un medio de cultivo igual al anterior, con la diferencia de que en este medio

de cultivo se suprimió la glucosa, y en su lugar se trabajo con diferentes sustratos

lignocelulosicos, como ser: paja brava, bagazo, aserrín, residuos de quinua real, y cáscara de

arroz., se inocularon las cepas fúngicas en este medio, se incubo a temperatura ambiente en

oscuridad, a 20 ºC, durante 4 semanas, se tomo una muestra de cada medio de cultivo cada 7

días, las pruebas fueron realizadas por triplicado, de igual forma que la anterior, se procedió a

determinar la actividad enzimática de MnP, LiP y Lacasa.

3.6 Determinación de Actividad Celulolítica.-


6

Figura 28. Determinación de la actividad Celulolítica.

Se realizo la determinación cuantitativa de la actividad enzimática celulolítica

combinada, se utilizo el método del “Acido 3,5 Dinitrosalicilico” (DNS), donde se agrego a la

muestra (500μl) buffer citrato (1000μl) y se adiciono 100g de papel filtro, se dejo incubar por

60min., posteriormente se adiciono reactivo DNS (3000μl), ebullir la mezcla por 5min. y se

procede a leer la absorbancia de la muestra en espectrofotómetro (550nm).

3.7 Cuantificación de proteínas totales.-

La concentración de proteínas de los sobrenadantes de los cultivos se midió por el


68

método de Lowry, utilizando el reactivo y el procedimiento de Bio-Rad reactivo folin

Ciocalteo en un espectrofotómetro, teniendo en cuenta la capacidad de union del colorante del

reactivo a dichas moléculas, posteriormente se leyó de absorbancia de esta muestra en

espectrofotómetro (660nm) en cubetas de plástico.

Muestra (sobrenadante de medio de cultivo) 0,1 ml

Añadir agua (0,1ml) + reactivo A (1ml)

Incubar a 35ºC por 35 min.

Adicionar reactivo B ( 0,1ml)

Incubar por 20 min. a 37 ºC

Leer abs. (660nm)

Figura 29. Determinación de proteínas totales.

3.8 Comparación de la Actividad Enzimática Ligninolítica de las enzimas

producidas frente a enzimas comerciales.-

Para poder verificar la efectividad de las enzimas ligninolíticas producidas en el

presente trabajo, se las comparo frente a enzimas comerciales, esto como una prueba no

especifica, ya que las enzimas producidas no están previamente purificadas.


69

Enzima comercial purificada

Dilución de la enzima

Lignina peroxidasa LacasaManganeso peroxidasa

Variación abs. (470 nm) 2,6 DMF, H2O2

Variación abs. (420 nm) ABTS,

H2O2

Variacion abs. (420 nm) ABTS

Cuantificación de enzimas

Comparacion de la actividad enzimatica frente a las enzimas

producidas

Figura 30. Determinación de la actividad enzimática de enzimas comerciales.

Las enzimas comerciales utilizadas para esta prueba fueron Lacase de “Rhus

vernificera” y Peroxidase de “Horseradish”.

3.9 Análisis estadístico.-

El análisis de varianza (ANOVA), fue realizado en el software estadístico Statistica

Release 6.0 Stat Soft con un nivel de confianza de 95%. Las superficies de respuesta fueron

realizadas en el programa Microsoft Office Excel 2003.


0

4. RESULTADOS Y DISCUSION

4.1 DETERMINACION CUALITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

LIGNINOLITICA.-

A continuación se presenta la tabla 4-1 en la que se resume los resultados positivos,

obtenidos en la determinación cualitativa de actividad ligninolítica.

Tabla 10: Determinación de la actividad ligninolítica en medio solidó.


(-) No hubo decoloración (+) decoloración poco visible

(++) decoloración media (+++) buena decoloración

Cuatro cepas dieron positivo en los dos medios de cultivo, fueron: IB-15B (Stephanoma),

IB-26C (Trinacrium), IB-15A (Dactylella), IB-29B (Blasthomyces).

Cinco cepas fúngicas mostraron un resultado positivo para el medio sólido ABTS,

fueron: IB-15Da (Cephalosporium), IB-18Cb (Bdellospora), IB-18Cb (Bdellospora), IB-20Ca

(Mycotypha), IB-14A (Triposporium), IB-6 (Circinutrychum).

Cepas fúngicas ABTS Poli-R

IB-15B (Stephanoma) +++ +

IB-15Da (Cephalosporium) ++ -

IB-26C (Trinacrium) +++ +

IB-18Cb (Bdellospora) ++ -

IB-15A (Dactylella) + ++

IB-30B (Sepedonium) - ++

IB-29B (Blasthomyces) + +++

IB-5 (Spiromyces) - +

IB-20Ca (Mycotypha) ++ -

IB-14A (Triposporium) + -

IB-18B (Fusoma) - ++

IB-6 (Circinutrychum) + -


Las tres cepas restantes presentaron un resultado positivo respecto al medio sólido Poly

R-478, fueron: IB-30B (Sepedonium), IB-5 (Spiromyces), IB-18B (Fusoma).

De las 31 (100%) cepas fúngicas aisladas que fueron inoculadas en medios ABTS y

Poly-R, 12 (38,7%) cepas fúngicas presentaron cambio de coloración en el medio, es decir

presentaron actividad ligninolítica, el restos de los hongos 19 (61,3%) no presentaron

actividad ligninolítica, por que no se los tomo en cuenta para otras pruebas en adelante.

4.2. DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

LIGNINOLITICA.-

4.2.1. Manganeso Peroxidasa.-

De las doce cepas fúngicas con actividad enzimática, los resultados fueron los

siguientes, para MnP.

Como se puede observar en la tabla 11 los resultados son muy variados para cada cepa

fúngica, ya que varían en el medio de cultivo, ya que cada una tiene diferentes requerimientos,

pero el tiempo necesario para alcanzar el máximo de producción (o actividad) de manganeso

peroxidasa es el mismo. La concentración de enzima detectada es influida por el medio de

cultivo que se utilice (ver anexo C-1).

Las doce cepas fúngicas alcanzo su actividad máxima a un tiempo de 28 días.

Tabla 11: Actividad enzimática máxima para MnP de diferentes cepas fúngicas con variación

Mn

Cepa fúngica Medio Glucosa (g/L)

Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

MnP (UI/L)

IB-26C (Trinacrium) 6 5 40 2 28 76,65

IB-15B (Stephanoma) 3 1 80 0.5 28 57,89

IB-29B (Blasthomyces) 5 1 80 2 28 40,24


2

IB-18Cb (Bdellospora) 8 5 80 2 28 17,68

IB-15Da (Cephalosporiu) 2 1 40 2 28 13,60

IB-6 (Circinutrychum) 3 1 80 0,5 28 6,80

IB-20Ca (Mycotypha) 5 1 80 20 28 3,26

IB-5 (Spiromyces) 4 5 40 0,5 28 2,72

IB-18B (Fusoma) 4 5 40 0,5 28 2,31

IB-14A (Triposporium) 4 5 40 0,5 28 2,31

IB-30B (Sepedonium) 7 5 80 0,5 28 2,17

IB-15A (Dactylella) 6 5 40 2 28 1,90

La cepa fúngica IB-26C (Trinacrium) (figura 31) fue la que presento mayor actividad

enzimática para Manganeso peroxidasa (MnP) a los 28 días, en el medio 6, llegando a 76,65

(UI/L), en este medio existe mayor fuente de carbono, de vitaminas, de nitrógeno, pero la

concentración de manganeso es la mínima, por lo podemos afirmar que esta cepa no necesita

mayor concentración de manganeso para producir enzima.

La actividad de MnP es sensible a la presencia de algunos metales (manganeso, cobre,

hierro, molibdeno, zinc, níquel) son esenciales para el crecimiento fúngico y también actúan

como co-factores enzimáticos induciendo la actividad ligninolítica. Entretanto, estos metales

son tóxicos para el hongo cuando existen en exceso, ya que pueden inhibir el crecimiento de la

cepa fúngica y la actividad enzimática [83].


3

IB-26C MnP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L)

Medio 1Medio 2Medio 3


Medio 7Medio 8

Figura 31. Actividad enzimática Manganeso peroxidasa para la cepa fúngica IB-26C (Trinacrium) de los 8

medios evaluados en función de glucosa, extracto de levadura, Mn.

Los resultados del análisis de varianza de la cepa IB-26C (Trinacrium) que muestra

(tabla 12) la interacción de los tres componentes como ser: glucosa, extracto de levadura y Mn

tiene un valor de F igual a 4,599763 lo que implica que la interacción de estos tres es

significativa. Pro otro lado Prob > F menores a 0,23480 indican que los términos

significantes del modelo.

Tabla 12: Análisis de efectos principales ANOVA para la cepa IB-26C. (Trinacrium) para MnP, de los 8 medios evaluados en función de glucosa, extracto de levadura, Mn

Fuente: Elaboración propia con datos procesados en Statistica 6.0

Factores SS

Suma de cuadrados

DF Grados de

libertad

MS Media de cuadrados

F Valor critico

Prob > F

Interacción 2259,566 1 2259,566 4,599763 0,098566 significativo Glucosa [g/L] 1692,274 1 1692,274 3,444935 0,137025 significativo

Mn [mg/L] 137,306 1 137,306 0,279512 0,624997 Extracto de

levadura[g/L] 1361,213 1 1361,213 2,770999 0,171318 significativo

Error 1964,941 4 491,235


4

3D Surface Plot (IB-26C Mn peroxidasa Mn 4v*8c)Mn peroxidasa UI/L = -26,7506+7,2721*x+17,3923*y

40 20 0

Figura 32. Efecto de la glucosa y extracto de levadura sobre la actividad MnP para la cepa fúngica IB-26C (Trinacrium)


En esta grafica (Figura 32) podemos comprender que a mayor concentración de glucosa

y menor concentración de extracto de levadura en el medio de cultivo, se llega a obtener una

mayor actividad enzimática para Manganeso peroxidasa.


3D Surface Plot (IB-26C Mn peroxidasa Mn 4v*8c)Mn peroxidasa UI/L = 7,4184+7,2721*x-0,2071*y

40 30 20 10 0

Figura 33. Efecto de la glucosa y Mn sobre la actividad MnP para la cepa fúngica IB-26C (Trinacrium)



y menor concentración de Mn en el medio de cultivo, se llega a obtener una mayor actividad

enzimática para Manganeso peroxidasa.

A mayor producción de enzimas ligninolíticas por IB-26C (Trinacrium) ocurre durante

el metabolismo segundario, por la influencia de algunos nutrientes como carbono, y nitrógeno

[81]. Durante el crecimiento de IB-26C (Trinacrium) la actividad MnP aumentara durante el

metabolismo primario entre los 14 a 21 días, en paralelo con el crecimiento del hongo,

evidenciando que esas enzimas no son metabolitos segundarios, mas parecen ser dependientes

de crecimiento fúngico [82]. La producción de estas enzimas no fue inhibida por altas

concentraciones de extracto de levadura.

IB-15B (Stephanoma) (ver anexo C-1) a mayor concentración de extracto de levadura y

mayor concentración de manganeso, produciría una mayor actividad enzimática, esto según

los resultados obtenidos según los análisis de estadística realizada, por otro lado se


6

puede notar que la concentración de glucosa no influye en la actividad enzimática de esta cepa

fúngica (ver anexo D-1).

Otra cepa que alcanzó actividad enzimática significativa, fue la IB-29B

(Blasthomyces) (ver anexo D-1).

4.2.2. Lignina Peroxidasa.-

Tabla 13: Actividad enzimática máxima LiP de diferentes cepas fúngicas con variación Mn.


Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

LiP (UI/L)

IB26C (Trinacrium) 8 5 80 2 28 76,50

IB18Cb (Bdellospora) 8 5 80 2 28 69,69

IB29B(Blasthomyces) 3 1 80 2 28 61,76

IB15B (Stephanoma) 8 5 80 2 28 50,69

IB15Da(Cephalospori) 3 1 40 2 28 38,56

IB6 (Circinutrychum) 5 1 80 0,5 28 12,25

IB-5 (Spiromyces) 4 5 40 0,5 28 10,58

IB-30B (Sepedonium) 1 1 40 0,5 28 4,66

IB-18B (Bdellospora) 8 5 80 2 28 3,76

IB-20Ca (Mycotypha) 7 5 80 0,5 28 1,86

IB-14A (Triposporium) 5 1 80 2 28 1,58

IB-15A (Dactylella) 8 5 80 2 28 1,02

En la tabla 13 se puede notar que el medio de preferencia para la producción de esta

enzima es el medio 8, pero esto depende de la cepa fúngica, el tiempo óptimo para el alcance

de la mayor actividad enzimática es a los 28 días (ver anexo C-2).

La cepa fúngica IB-26C (Trinacrium) (figura 34) fue la que presento mayor actividad


(UI/L), este medio contiene mayor concentración de la composición del medio, por lo que se

denota que esta fúngica es muy exigente en sus requerimientos nutricionales.


La producción de LiP aparentemente es limitada por ciertos hongos basidiomicetos,

pero no se descarta la hipótesis de que otros hongos sean capaces de producir dicha enzima, su

excepcional potencial degradativo no esta limitado a la lignina, ya que la ultima década fueron

descritos como posibles sustratos para esta enzima derivados geo-bioquímicos de lignina, y

contaminantes orgánicos entre los cuales están los xenobioticos [76].

IB-26C LiP

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo ( dias)

Act

ivid

ad (U

I/L)



Medio 7Medio 8

Figura 34. Actividad enzimática Lignina peroxidasa para la cepa fúngica IB-26C (Trinacrium) de los 8

medios evaluados en función de glucosa, extracto de levadura, Mn.


La secreción de esta enzima probablemente resulta de modificaciones fisiológicas

características del metabolismo primario a metabolismo segundario, son diferentes

condiciones y tipo de sustrato [76].

La actividad enzimática alcanzada se puede deber a la interacción de los componentes

del medio y la concentración, lo cual favorezca al metabolismo del microorganismo y se

pueda hacer posible la producción de enzima tipo LiP.


8

Tabla 14: Análisis de efectos principales ANOVA para la cepa IB-26C. (Trinacrium) para LiP de

los 8 medios evaluados en función de glucosa, extracto de levadura, Mn





significativa. Pro otro lado Prob > F menores a 0,37073 indican que los términos significantes

del modelo.

Factores SS

Suma de cuadrados

DF Grados de

libertad


F Valor critico

Prob > F


Mn [mg/L] 870,372 1 870,372 1,408383 0,300991 significativo Extracto de


Error 2471,975 4 617,994


9

3D Surface Plot (IB-26C Li peroxidasa Mn 4v*8c)Li peroxidasa UI/L = -11,2731+4,0694*x+16*y

40 30 20 10 0

Figura 35. Efecto de la glucosa y extracto de levadura sobre la actividad LiP para la cepa fúngica IB-26C (Trinacrium)




mayor actividad enzimática para Lignina peroxidasa, es posible que este hongo requiera

mayor fuente de carbono para aumentar su actividad enzimática, ya que la glucosa, como bien

sabemos puede ser un co-factor para la producción de estas enzimas, de todas maneras el

extracto de levadura no influye en la actividad de la enzima.


80

3D Surface Plot (IB-26C Li peroxidasa Mn 4v*8c)Li peroxidasa UI/L = -22,5648+4,0694*x+0,5215*y

40 30 20 10 0

Figura 36. Efecto de la glucosa y Mn sobre la actividad LiP para la cepa fúngica IB-26C (Trinacrium)



y mayor concentración de Mn en el medio de cultivo, se llega a obtener una mayor actividad

enzimática para Manganeso peroxidasa, es muy importante el papel que juega el Mn ya que es

un inductor de estas enzimas.

En IB-26C (Trinacrium) al parecer según los análisis estadísticos parece tener una gran

influencia la fuente de carbono adicionada en el medio, ya que para esta misma cepa fúngica

en el medio 6, el cual tiene la misma concentración de glucosa, pero no así de manganeso,

tiene la segunda actividad enzimática mas alta, no olvidemos que la glucosa también puede

actuar como inductor enzimático.

IB15B (Stephanoma) ( ver anexo C-2), requiere para una mejor actividad enzimática,

una concentración mayor de extracto de levadura y una menor concentración de glucosa y


8

extracto de levadura, la influencia de la fuente de nitrógeno es muy importante en la

producción de estas enzimas, por otro lado, el extracto de levadura contiene algunas vitaminas

que pueden favorecer a la permeabilidad de la membrana plasmática, esto también puede

influir en el proceso de expresión de enzimas (ver anexo C-2).

Los requerimientos nutricionales son muy distintos para cada una de las cepas fúngicas,

es por eso que el medio de cultivo no se repite.

Algunos hongos productores de LiP no producen enzima en compuestos fenólicos, ya

que acusan inactivación de la actividad de LiP e interfieren en la oxidación de ABTS,

causando inhibición competitiva por el sustrato enzimático, En estas condiciones de cultivo se

torna la necesidad la utilización de otros sustratos para la determinación de actividad LiP,

como por ejemplo veratryl alcohol [83].Talvez la baja actividad enzimática de algunas cepas se

deba a que no se utilizo un sustrato adecuado.

4.2.3. Lacasa.-

Notamos claramente en la tabla 16 que solo cinco cepas fúngicas alcanzaron una

actividad enzimática significativamente buena, ya que las restantes lograron producir enzimas

de actividad lacasa, pero no con éxito, esto puede deber se a diferentes factores los cuales

discutiremos mas adelante.

IB-18Cb (Bdellospora) (ver anexo C-3) a mayor concentración de extracto de levadura

y manganeso, llegaría a una mejor actividad enzimática, podemos notar que la concentración

de glucosa no afecta en la producción de enzima (ver anexo D-3).

La cepa IB-26C (Trinacrium) tuvo una actividad enzimática que fue significativa (ver

anexo C-3), es por esta razón que se la considero entre las cepas fúngicas seleccionadas, para

las pruebas que se realizaran mas adelante.


82

Tabla 15: Actividad enzimática máxima Lac de diferentes cepas fúngicas con variación Mn. Cepa fúngica Medio Glucosa

(g/L) Mn

(mg/L) Ext. Lev.

(g/L) Tiempo (días)

Lac (UI/L)



IB26C (Trinacrium) 8 5 80 2 28 51,86

IB15B (Stephanoma) 5 1 80 2 28 45,05

IB6 (Circinutrychum) 2 1 40 2 28 29,41

IB15Da(Cephalosporium) 3 1 80 0,5 28 3,06

IB-20Ca (Mycotypha) 4 5 40 0,5 21 2,90

IB-5 (Spiromyces) 8 5 80 2 28 2,00

IB-18B (Fusoma) 1 1 40 0,5 28 1,82

IB-14A (Triposporium) 2 1 40 2 28 1,79

IB-30B (Sepedonium) 2 1 40 2 28 1,74

IB-15A (Dactylella) 5 1 80 2 28 1,55

En la tabla 16 observamos los resultados mas significativos ( ver anexo B-3)para la

actividad enzimática lacasa, de igual forma notamos que el medio 2 y 5 son los preferidos por

esta enzima, se puede afirmar que es por la concentración de extracto de levadura que

contienen es tos medios, ya que al parecer se requiere una buena concentración de fuente de

nitrógeno para producir esta enzima, las seis cepas fúngicas restantes no se las tomo en cuenta,

ya que tuvieron actividades enzimáticas no significativas.

La cepa fúngica IB-29B (Blasthomyces) (figura 4-17) fue la que presento mayor

actividad enzimática para Lacasa (Lac) a los 28 días, en el medio 2, llegando a 74,12 (UI/L). IB-29B (Blasthomyces) produce el sistema enzimático ligninolítico durante el metabolismo

secundario, en respuesta a la limitación de fuente de carbono [57, 58]. Sin embargo, para otros

hongos la degradación de la lignina se produce bajo condiciones de exceso en carbono y


83

nitrógeno [59, 60].

De forma general en los laboratorios, la producción de enzimas ligninolíticas y la

propia ligninolisis se produce bajo elevadas tensiones de O2 [61] aunque los cultivos de IB-

29B (Blasthomyces) en la degradación selectiva de la lignina es estimulada por el aumento de

fuente de nitrógeno y vitaminas (extracto de levadura) [62, 63].

IB-29B Lacasa

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L) Medio 1



Medio 8

Figura 37. Actividad enzimática Lacasa para la cepa fúngica IB-29B (Blasthomyces) de los 8 medios

evaluados en función de glucosa, extracto de levadura, Mn.

La actividad producida también tiene que ver con el crecimiento del hongo, ya que su

actividad enzimática va incrementándose según el crecimiento de la cepa fúngica, podemos

ver que el medio 2 lleva delantera en la producción de enzimas son respecto de los otros siete

medios, lo esencial para esta cepa es la fuente de nitrógeno.

Tabla 16: Análisis de efectos principales ANOVA para la cepa IB-29B (Blasthomyces) para Lacasa de los 8 medios evaluados en función de glucosa, extracto de levadura, Mn

Factores SS

Suma de cuadrados

DF Grados de

libertad


F Valor critico

Prob > F


Mn [mg/L] 912,792 1 912,792 2,170854 0,214647 significativo Extracto de 1009,377 1 1009,377 2,400559 0,196219 significativo


84

Los resultados del análisis de varianza de la cepa IB-29B (Blasthomyces) que muestra



significativa. Pro otro lado Prob > F menores a 0,26245 indican que los términos significantes

del modelo.

En esta grafica (Figura 38) podemos comprender que a menor concentración de glucosa

y mayor concentración de extracto de levadura en el medio de cultivo, se llega a obtener una

mayor actividad enzimática para Lacasa.

3D Surface Plot (IB-29B Lacasa Mn 4v*8c)lacasa UI/L = 10,3084-4,1337*x+14,9769*y

40 30 20 10 0

levadura[g/L] Error 1681,904 4 420,476


8

Figura 38. Efecto de la glucosa y extracto de levadura sobre la actividad Lacasa para la cepa fúngica IB-

29B (Blasthomyces).


En esta grafica (Figura 39) podemos comprender que a menor concentración de glucosa

y mayor concentración de Mn en el medio de cultivo, se llega a obtener una mayor actividad

enzimática para Manganeso peroxidasa.

3D Surface Plot (IB-29B Lacasa Mn 4v*8c)Lacasa UI/L = 61,0747-4,1337*x-0,5341*y

40 30 20 10 0

Figura 39. Efecto de la glucosa y Mn sobre la actividad Lacasa para la cepa fúngica IB-29B

(Blasthomyces).


También se dice que este tipo de enzimas pueden ser reguladas por metales como el

manganeso [35]. La influencia del pH para oxidar el ABTS tanto como el DMF es importante,

este fue conducido en el caso del ABTS por tampón acetato a pH 3 100mM y para DMF por


86

tampón succinato pH 5 100 mM, ya que según la bibliografía revisada [81], estos niveles de pH

son óptimos para cada tipo de actividad enzimática que se requiere determinar.

Como las enzimas son proteínas, la variación de pH afecta profundamente al carácter

iónico dos grupos carboxilo y amino de la superficie de la molécula, influenciando bastante en

la naturaleza catalítica. Estas enzimas como ya lo mencionamos tiene un pH optimo

característico exactamente igual al medio en el que se encuentran [84].

Son muchos los factores que afectan la producción de enzimas ligninolíticas en hongos.

Además, las diferentes cepas corresponden de un modo particular a cada un de estos factores.

Debido a esto, el estudio combinado de dos o más factores es acertado para estudiar no solo la

producción de enzimas sino la posible interacción entre estos compuestos.

La entrada de aire u oxigeno tiene gran relevancia debido a que la enzimas

ligninolíticas son activadas a diferentes tensiones de oxigeno en el medio.

Se ha demostrado que la lignina no es una fuente aprovechable para el crecimiento de

los hongos sino que es necesaria la presencia de un co-sustrato [85]. Por lo tanto la adquisición

de la habilidad para mineralizar lignina seria ventajoso par el aprovechamiento de otras

moléculas más fácilmente metabolizables, teniendo en cuenta las relaciones intermoleculares

presentes en la estructura de las paredes celulares.

El patrón de actividad de estas enzimas es específico del género y especie de hongo de

la PB involucrado, algunos excretan la LiP, la MnP y no la Lac ó la MnP, la Lac y no la LiP;

La síntesis fúngica de la LiP y la MnP se realiza bajo una alta tensión de oxígeno, se reprime

en agitación o cuando los hongos de la PB, se cultivan en medio líquido, sin embargo la Lac se

sintetiza sólo en agitación, estas tres enzimas son inespecíficas y se inducen en condición

limitante de nutrientes, como la fuente de nitrógeno [39].

Según los resultados obtenidos, podemos comprobar las referencias de que una misma

cepa fúngica es capaz de producir las tres enzimas ligninolíticas, ya que en este caso, cuatro

cepas son capaces de producir al mismo tiempo MnP, LiP, Lac, unas con mas actividad


8

enzimática en LiP y otras con mayor actividad enzimática en Lac.

Las cepas que fueron capaces de producir los tres tipos de enzimas fueron: IB-29B, IB-

26C, IB-15B, IB-18Cb, (ver anexos C-1, C-2, C-3) según la caracterización realizada se cree

que son hongos basidiomicetos, pero esto aun esta por confirmarse, en posteriores pruebas

moleculares.

Es interesante notar que las condiciones óptimas para la producción de estas enzimas

son las mismas, este hecho es una ventaja para procesos de biorremediación dado que en un

mismo medio se produce la máxima cantidad de enzima y fue demostrado que en estas actúan

sinergicamente en procesos de degradación [78].

De las doce cepas que se seleccionaron cualitativamente, solo seis mostraron una buena

actividad enzimática, esto se debe a que muy pocas son las cepas fúngicas con actividad

ligninolítica que están distribuidas ampliamente en el ecosistema.

4.3. OPTIMIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO PARA LA PRDUCCION

DE ENZIMAS LIGNINOLITICAS.-

Con el objetivo de llegar a obtener una mayor actividad enzimática fue que se realizo

una segunda modificación de medio de cultivo para producción de enzimas ligninolíticas. Esta

prueba se llevo a cabo con seis cepas seleccionadas: IB-29B (Blasthomyces), IB-18Cb

(Bdellospora), IB-26C (Trinacrium), IB-15B (Stephanoma), IB-15Da (Cephalosporium), IB-6

(Circinutrychum). Esto por los resultados obtenidos en la anterior prueba

4.3.1 Medios de cultivo con variación de concentración de Cobre.-

Se realizo nuevamente un diseño factorial diseño factorial 23, siendo los factores esta

vez: glucosa, cobre, extracto de levadura. Esta prueba se debe a que según bibliografía

revisada, el cobre es un buen inductor de este tipo de enzimas, especialmente lacasas, ya que

estas llevan en su estructura cobre.


88


Se observa que la máxima producción de enzima, se da donde la concentración de

cobre es más baja, Si bien es un hecho común que la MnP se induzca con otro metal que no

sea Mn ya se ha mostrado que en S. hirsutum el Cd induce la síntesis de esta enzima. [77].

También se puede afirmar que la producción de MnP son incrementadas con el agregado de

Cu al medio, tal no es el caso para IB-29B (Blasthomyces) [76].

En la tabla 18 observamos que en las tres cepas con mayor actividad enzimática

(ver anexo C-4), la concentración de cobre es mínima, lo cual confirma, que para la

producción de esta enzima, es limitada la adición de cobre en el medio de cultivo. No

podemos afirmar que esto sea cierto para todas las cepas fúngicas, ya que cada una tiene sus

propios requerimientos.

Tabla 17: Actividad enzimática MnP de diferentes cepas fúngicas con variación Cu. Cepa fúngica Medio Glucosa

(g/L) Cu

(mg/L) Ext. Lev.

(g/L) Tiempo (días)

MnP (UI/L)



IB15B (Stephanoma) 1 1 40 0,5 28 121,64


IB-26C (Trinacrium) 7 5 80 0,5 28 82,68

IB-6 (Circinutrychum) 5 1 80 2 21 61,03

En IB-29B (Blasthomyces) la fuente de carbono y nitrógeno es muy importante ya que

en el medio el cual se presento la mayor actividad enzimática, se tiene la concentración de

estos alta, de esta forma podemos decir que es muy importante la participación de nitrógeno y

glucosa en el metabolismo de lis hongos para la producción de esta enzima.


89

IB-29B MnP

0

50

100

150

200

250

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L)

Medio 1Medio 2Medio 3Medio 4Medio 5Medio 6Medio 7Medio 8

Figura 40. Actividad enzimática Manganeso peroxidasa para la cepa fúngica IB-29B (Blasthomyces) de 8

medios evaluados en función de glucosa, extracto de levadura, Cu.

Tabla 18: Análisis de efectos principales ANOVA para la cepa IB-29B (Blasthomyces) para MnP, de 8 medios evaluados en función de glucosa, extracto de levadura, Cu.

Fuente: Elaboración propia con dato

s procesados en Statistica 6.0


(tabla 17) la interacción de los tres componentes como ser: glucosa, extracto de

Factores SS

Suma de cuadrados

DF Grados de

libertad


F Valor critico

Prob > F


Cu [mg/L] 95,82 1 95,82 0,010163 0,924550 no significativo

Extracto de levadura[g/L] 12859,93 1 12859,93 1,363968 0,307715 significativo

Error 37713,30 4 9428,32


90

levadura y Cu tiene un valor de F igual a 5,832676 lo que implica que la interacción de estos

tres es significativa. Pro otro lado Prob > F menores a 0,71014 indican que los términos


3D Surface Plot (IB29b Mn peroxidasa Cu 4v*8c)Mn peroxidasa UI/L = 1,1664+4,9736*x+53,458*y

140 120 100 80 60 40

Figura 41. Efecto de la glucosa y extracto de levadura sobre la actividad MnP para la cepa fúngica IB-29B (Blasthomyces).



y mayor concentración de extracto de levadura en el medio de cultivo, se llega a obtener una

mayor actividad enzimática para Manganeso peroxidasa, aunque se hace notar mas la

influencia de la fuente de nitrógeno que la fuente de carbono.

Lo interesante de este resultado, es conocer que la interacción de los tres componentes

es esencial, ya que si bien tien mas influencia el extracto de levadura, también la tien el cobre

y la glucosa, ya que sin uno de estos elementos no se obtendría la misma actividad enzimática.


9

3D Surface Plot (IB29b Mn peroxidasa Cu 4v*8c)Mn peroxidasa UI/L = 78,3716+4,9736*x-0,173*y

80

Figura 42. Efecto de la glucosa y Cu sobre la actividad MnP para la cepa fúngica IB-29B (Blasthomyces).


En esta grafica (Figura 42) podemos comprender que la concentración de Cu en el

medio de cultivo, no influye en la actividad enzimática para Manganeso peroxidasa. Sin

embargo si comparamos los resultados obtenidos para MnP con la influencia de manganeso,

notaremos claramente que los resultados mejoraron notablemente con la intervención del

cobre, pro lo cual no podemos afirmar que este metal no influya en los resultados obtenidos.

En la cepa fúngica IB-15Da (Cephalosporium) (ver anexo C-4) no influye la

concentración de glucosa, pero en cambio la concentración de manganeso y extracto de


92

levadura incrementarían la actividad enzimática, según se adicione sus concentraciones el

medio de cultivo (ver anexo D-4).


Tabla 19: Actividad enzimática LiP de diferentes cepas fúngicas con variación Cu.


Cu (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

LiP (UI/L)

IB29B(Blasthomyces) 1 1 40 0,5 21 250,62

IB6 (Circinutrychum) 1 1 40 0,5 14 243,18

IB15Da(Cephalosporium) 2 1 40 2 21 242,61

IB26C (Trinacrium) 5 1 80 2 28 229,87

IB18Cb (Bdellospora) 1 1 40 0,5 28 108,63

IB15B (Stephanoma) 2 1 40 2 21 94,81

La tabla 20 muestra los resultados alcanzados de las seis cepas sometidas a esta prueba,

donde resalta que las mayores actividades enzimáticas alcanzadas se dieron en el medio 1, lo

cual da a entender que los nutrientes necesarios para la producción de esta enzima son

mínimos, ya que este medio es que contiene nutrientes en baja concentración.

La cepa fúngica IB-6 (Circinutrychum) (figura 43) fue una de las que presento mayor

actividad enzimática para Lignina peroxidasa (LiP) a los 14 días, en el medio 1, llegando a

243,18 (UI/L).

Por otro lado se hace indispensable el estudio de las necesidades nutricionales de estos

hongos debido a que se ha reportado que las enzimas ligninolíticas, son generadas como un

proceso idiofasico y estimulado por la limitación de nutrientes como carbono y nitrógeno o

sulfato, también se ha reportado que altas concentraciones de una fuente de carbono o de

nitrógeno, pueden limitar la producción de las enzimas ligninolíticas. [36].


93

Figura 43: Actividad enzimática Lignina peroxidasa para la cepa fúngica IB-26C (Trinacrium) de

los 8 medios evaluados en función de glucosa, extracto de levadura, Cu.

IB-6 LiP

0

50

100

150

200

250

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L)

Medio 1Medio 2Medio 3Medio 4Medio 5Medio 6Medio 7Medio 8

Para la degradación de la lignina se necesita de una fuente adicional de carbono que

funciona como un co-sustrato. Este mecanismo de degradación es regulado por los hongos

[81].

Tabla 20: Análisis de efectos principales ANOVA para la cepa IB-6 (Circinutrychum) para LiP de los 8 medios evaluados en función de glucosa, extracto de levadura, Cu.



Factores SS

Suma de cuadrados

DF Grados de

libertad


F Valor critico

Prob > F

Interacción 55762,54 1 55762,54 7,847136 0,048748 Glucosa [g/L] 21583,88 1 21583,88 3,037373 0,156325 significativo

Cu [mg/L] 5722,52 1 5722,52 0,805297 0,420245 significativoExtracto de


Error 28424,40 4 7106,10


94

Los resultados del análisis de varianza de la IB-6 (Circinutrychum) que muestra (tabla

19) la interacción de los tres componentes como ser: glucosa, extracto de levadura y Cu tiene

un valor de F igual a 7,847136 lo que implica que la interacción de estos tres es significativa.

Pro otro lado Prob > F menores a 0,38678 indican que los términos significantes del modelo.

Figura 44: Efecto de la glucosa y extracto de levadura sobre la actividad LiP para la cepa fúngica IB-6 (Circinutrychum)

3D Surface Plot (IB-6Li peroxidasa Cu 4v*8c)Li peroxidasa UI/L = 146,3669-25,9711*x+12,0278*y

140 120 100 80 60 40 20




mayor actividad enzimática para Lignina peroxidasa, sin embargo en el medio 5 el cual tien la

misma concentración de extracto de levadura y cobre, y la concentración de glucosa aumenta,

no se obtuvo una actividad enzimática buena, esto puede deberse a que el microorganismo

requiere concentraciones nutricionales mínimas para llegar a su actividad máxima.


9

Figura 45: Efecto de la glucosa y Cu sobre la actividad LiP para la cepa fúngica IB-6

(Circinutrychum).

3D Surface Plot (IB-6 Li peroxidasa Cu 4v*8c)Li peroxidasa UI/L = 241,6377-25,9711*x-1,3373*y

180 140 100 60 20


En esta grafica (Figura 45) podemos comprender que a mayor concentración de

glucosa y menor concentración de Cu en el medio de cultivo, se llega a obtener una mayor

actividad enzimática para Lignina peroxidasa.

IB6 (Circinutrychum) (ver anexo C-5) a mayor concentración de glucosa, y menor

concentración de extracto de levadura obtendría un actividad enzimática máxima, también se

puede denotar que la concentración de cobre no afecta en la producción de enzima (ver anexo

D-5).

c. Lacasa.-


96

De acuerdo a los resultados obtenidos en la tabla 22 la producción de esta enzima con

la variabilidad de cobre requiere una concentración mínima de glucosa, y la concentración de

extracto de levadura es muy importante, ya que es muy necesaria la fuente de nitrógeno para

estas enzimas, si comparamos los resultados alcanzados en esta prueba respecto a la

determinación de lacasa con variación de manganeso, notaremos claramente que los resultados

tiene mucha diferencia (ver anexo C-6).

Tabla 21: Actividad enzimática Lac de diferentes cepas fúngicas con variación Cu.


Cu (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

Lac (UI/L)


IB29B(Blasthomyces) 1 1 40 0,5 21 265,25

IB26C (Trinacrium) 5 1 80 2 21 220

IB6 (Circinutrychum) 2 1 40 2 28 227.11

IB15B (Stephanoma) 2 1 40 2 21 208,92

IB-18Cb (Bdellospora) 1 1 40 0,5 28 138,49

La cepa fúngica IB-15Da (Cephalosporium) (figura 46) alcanzo la mayor actividad

enzimática para Lacasa (Lac) a los 28 días, en el medio 1, llegando a 287,30 (UI/L).

Figura 46: Actividad enzimática Lacasa para la cepa fúngica IB-15Da (Cephalosporium) de los 8

medios evaluados en función de glucosa, extracto de levadura, Cu.


9

IB-15Da Lacasa

0

50

100

150

200

250

300

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L) Medio 1


Medio 5Medio 6Medio 7Medio 8

Experimentos con purificación de lacasa mostraron que Cu no solo induce la actividad

enzimática lacasa por la expresión de genes de lacasa, ya que esto probablemente también sea

efecto de la estabilidad y actividad de la enzima [90].

Una de las posibilidades es que las células posean mecanismos de regulación

controlada de cobre, en los que el metal sea transportado y este disponible de acuerdo a las

necesidades del hongo.

Tabla 22: Análisis de efectos principales ANOVA para la cepa IB-15Da (Cephalosporium) para Lacasa de los 8 medios evaluados en función de glucosa, extracto de levadura, Cu.



Los resultados del análisis de varianza de la cepa IB-15Da (Cephalosporium) que

muestra (tabla 21) la interacción de los tres componentes como ser: glucosa, extracto de

levadura y Mn tiene un valor de F igual a 11,57524 lo que implica que la interacción de estos

tres es significativa. Pro otro lado Prob > F menores a 0,10940 indican que los términos

Factores SS

Suma de cuadrados

DF Grados de

libertad


F Valor critico

Prob > F

Interacción 67183,18 1 67183,18 11,57524 0,027221 Glucosa [g/L] 60318,61 1 60318,61 10,39252 0,032166

Cu [mg/L] 7545,72 1 7545,72 1,30008 0,317836 significativo Extracto de


Error 23216,16 4 5804,04


98


Figura 47: Efecto de la glucosa y extracto de levadura sobre la actividad Lacasa para la cepa

fúngica IB-15Da (Cephalosporium).

3D Surface Plot (IB-15Da LACASA Cu 4v*8c)Lacasa UI/L = 206,7051-43,4161*x+12,1466*y

200 150 100 50 0



mayor actividad enzimática para Lacasa.


99

Figura 48: Efecto de la glucosa y Cu sobre la actividad Lacasa para la cepa fúngica IB-15Da

(Cephalosporium).

3D Surface Plot (IB-15Da LACASA Cu 4v*8c)Lacasa UI/L = 314,0237-43,4161*x-1,5356*y

200 150 100 50 0 -50



y mayor concentración de Cu en el medio de cultivo, se llega a obtener una mayor


00

actividad enzimática para Lacasa. Sin embargo cuando la concentración de glucosa puede

aumentarse esto puede resultar inhibidor de la producción de enzimas que inductor.

Talvez esto pueda deberse a que la lacasa no parece estar transcripcionalmente por el

cobre, puesto que la suplementacion de cobre disminuye la cantidad de transcrito, en

condiciones de exceso de cobre, el aumento observado en cultivos se debe a ala sobre-

expresión de los genes acumulando mRNA [32]. El aumento de la actividad lacasa que se

produce al añadir cobre puede deberse a la incorporación de este a la apoproteína acumulada:

por lo tanto, la actividad lacasa dependería de la disponibilidad de cobre y de la presencia de

apoproteína inactiva.

La IB-29B (Blasthomyces) no tuvo mucha diferencia en su actividad enzimática

respecto a IB-15Da (Cephalosporium) (ver anexo C-6) sin embargo sus requerimientos

nutricionales son muy diferentes ya que esta cepa requiere mayor concentración de fuente de

nitrógeno y vitaminas (ver anexo D-6).

Los resultados obtenidos en la presente prueba son mucho más significativos que los

resultados donde utilizo manganeso, esto nos conduce a afirmar, que el cobre es un mejor

inductor para las cepas fúngicas con las cuales estamos trabajando.

En especial para la actividad enzimática lacasa, se obtuvo resultados óptimos,

probablemente se deba a que esta enzima en su estructura lleve cobre, y este metal sea un

excelente inductor para esta enzima, por esa razón.

Los resultados mas bajos de las tres actividades enzimáticas fueron para manganeso

peroxidas, aun que esto no fue con mucha diferencia significativa, sin embargo con medio de

cultivo Cu, las enzimas llegaron a producir mas de tres veces mas que con el medio de cultivo

Mn.

4.3.2. Medios de cultivo con diferentes sustratos lignocelulosicos.-

Estas enzimas son en términos biotecnológicos, uno de los grupos de enzimas que mas


0

importancia adquirieron en los últimos años debido a que podrían ser aplicadas en procesos de

biorremediación. Por lo tanto se busca la producción de ligninasas mediante sistemas que sean

baratos y justifiquen el proceso. Si bien la utilización de compuestos como el cobre,

manganeso o sustancias aromáticas es ampliamente adoptada para la producción de estas

enzimas, por que no pensar en medios de cultivo basados en sustratos naturales como bagazo,

aserrín, cas. Arroz, etc [35].

Al variar las condiciones de cultivo se puede mejorar el rendimiento, optimizar la

calidad y reducir costos del proceso de fermentación [89]. Se seleccionaron cuatro diferentes

cepas con medios distintos, apoyados en los resultados anteriores.

I. Paja Brava.-


Tabla 23: Actividad enzimática MnP de diferentes cepas fúngicas con variación de paja brava. Cepa fúngica Medio Paja

brava (g/L)

Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

MnP (UI/L)



IB26C (Trinacrium) 6 5 40 2 28 13,78

IB15B (Stephanoma) 3 1 80 0.5 28 31,15

La cepa fúngica IB-15B (Stephanoma) (figura 49) fue la que presento mayor actividad


(UI/L).

Figura 49: Actividad enzimática Manganeso peroxidasa de 4 cepas fúngicas en función de la paja

brava.


02

MnP (paja brava)

0

10

20

30

40

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad U

I/L

IB-29B IB-18Cb IB-26C IB-15B

Con respecto a los anteriores resultados alcanzados en la pruebas que se adiciono en el

medio glucosa, se alcanzaron valores más altos de actividad enzimática, si bien explicamos

anteriormente que la fuente de carbono es muy importante para la producción de estas

enzimas.

La paja brava en su composición química contiene un 54% de celulosa lo cual es fuente

de carbono, en este caso esa fuente de carbono no esta libre, esta protegida por lignina, lo que

se quizo comprobar es la efectividad de este tipo de enzimas, con este sustrato lignocelulósico.


Tabla 24: Actividad enzimática LiP de diferentes cepas fúngicas con variación de paja brava.

La

cepa

fúngi

ca

IB-

18Cb (Bdellospora) fue una de las que presento mayor actividad enzimática para Lignina

Cepa fúngica Medio Paja brava (g/L)

Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

LiP (UI/L)

IB29B(Blasthomyces) 3 1 80 0.5 21 16,19


IB-26C (Trinacrium) 8 5 80 2 21 13,84

IB15B (Stephanoma) 8 5 80 2 21 28,54

IB15Da(Cephalosporium) 3 1 80 0.5 21 21,03


03

peroxidasa (LiP) a los 21 días, en el medio 8, llegando a 133,97 (UI/L).

Figura 50: Actividad enzimática Lignina peroxidasa de 5 cepas fúngicas en función de la paja

brava.

LiP (paja brava)

0

35

70

105

140

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad U

I/L

IB-29B IB-18Cb IB-26C IB-15B IB-15Da

El resultado alcanzado por la cepa IB-18Cb fue el mas significativo de las 5 cepas,

incluso fue mayor que el alcanzado en la prueba con variación de manganeso. El medio en que

se desarrollo esta actividad enzimática para LiP es aquel en el cual lleva en mayor

concentración sus componentes.

Es posible que esta cepa requiera mayores cantidades de nutrientes para alcanzar una

actividad máxima, también no se deja de lado la hipótesis de que esta actividad se deba a un

producto del metabolismo del microorganismo.

c. Lacasa.-

Tabla 24: Actividad enzimática Lac de diferentes cepas fúngicas con variación de paja

brava.

La

cepa

Cepa fúngica Medio Paja brava (g/L)

Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

Lac (UI/L)


IB18Cb (Bdellospora) 3 1 80 0.5 28 37,61

IB-26C (Trinacrium) 8 5 80 2 28 9,52

IB15B (Stephanoma) 5 1 80 2 21 5,20



04

fúngica IB-18Cb (Bdellospora) fue una de las que presento mayor actividad enzimática para

Lacasa (Lac) a los 28 días, en el medio 3, llegando a 37,61 (UI/L).

El medio 3 contiene en menor concentración de extracto de levadura, se ha explicado

que el extracto de levadura es importante en la producción de enzimas ya que participa como

fuente de nitrógeno y fuentes de vitaminas, pero en algunos hongos, esto tiene que ser

limitado, ya que no todos las cepas fúngicas tienen los mismos requerimientos nutricionales.

Es posible que la paja brava no sea un buen sustrato para esta enzima, razón por la cual

no se haya producido una actividad enzimática buena.

Figura 51: Actividad enzimática Lacasa de 5 cepas fúngicas en función de la paja brava.

Lacasa (paja brava)

0

10

20

30

40

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L)

IB-29B IB-18Cb IB-26C IB-15B IB-6

Esta cepa fúngica IB-18Cb (Bdellospora) es muy peculiar, ya que si observamos la

figura 4-31 notaremos que respecto a las demás cuatro cepas fúngicas que elevo su actividad

enzimática en los últimos 14 días, por locuaz es posible que necesite mas tiempo para producir

este tipo de enzimas.

Figura 52: Actividad enzimática de la cepa fúngica IB-15B frente a diferentes sustratos

lignocelulosicos


0

IB-15B

01020304050607080

Paja Brava Bagazo Aserrin ResiduosQuinua

Cascara dearroz

Sustratos

Act

ivid

ad (U

I/L)

MnP UI/L LiP UI/L Lac UI/L

De las seis cepas fúngicas escogidas la que mejor resultado presento para la paja brava

fue la IB-18Cb como se observa en la figura 52, con respecto a otras cepas, fue la cepa que

mejor resultado alcanzo para actividad MnP, sin embargo podemos notar que el bagazo y la

cáscara de arroz presentan una mayor actividad enzimática para LiP, esto depende de los

requerimientos nutricionales de cada hongo , para la expresión de una determinada enzima.

II. Bagazo.-


Tabla 25: Actividad enzimática MnP de diferentes cepas fúngicas con variación de bagazo

La

cepa

fúngi

ca

IB-29B (Blasthomyces) fue la que presento mayor actividad enzimática para Manganeso

peroxidasa (MnP) a los 28 días, en el medio 5, llegando a 91,40 (UI/L).

Cepa fúngica Medio Bagazo (g/L)

Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

MnP (UI/L)



IB26C (Trinacrium) 6 5 40 2 21 16,28

IB15B (Stephanoma) 3 1 80 0.5 21 16,28


06

Figura 53: Actividad enzimática Manganeso peroxidasa de 4 cepas fúngicas en función de

bagazo.

Manganeso Peroxidasa (bagazo)

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L)


IB-29B (Blasthomyces) en comparación de las otras tres cepas alcanzo un actividad enzimática

de cinco veces mas, es posible que el hongo haya asimilado en forma positiva el sustrato, y que la

glucosa no influya en la producción de enzima, lo interesante para este microorganismo es que

depende de una fuente de nitrógeno, y un inductor en este caso el manganeso.

Las otras cepas en especial IB-18Cb (Bdellospora), IB-26C (Trinacrium) son

dependientes de fuentes de carbono par la producción de MnP, es por esta razón que no

tuvieron un buen resultado con este sustrato lignocelulósico.


0


Tabla 26: Actividad enzimática LiP de diferentes cepas fúngicas con variación de bagazo

La cepa fúngica IB-18Cb (Bdellospora) fue la que presento mayor actividad enzimática

para Lignina peroxidasa (LiP) a los 21 días, en el medio 8, llegando a 487,82 (UI/L).

Según los análisis para esta cepa fúngica, tendría mayor actividad enzimática con la

adición de glucosa, sin embargo el resultado que se obtuvo en esta prueba fue inesperado ya

que alcanzo cinco veces mas actividad enzimática que los resultados obtenidos con glucosa,

esto nos da a entender que la cepa asimilo la fuente de carbono que contiene el bagazo que es

49,58% en celulosa y este estimulo la actividad enzimática de este microorganismo.

Figura 54: Actividad enzimática Lignina peroxidasa de 5 cepas fúngicas en función de la bagazo.

Lignina Peroxidasa (bagazo)

0

100

200

300

400

500

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L)



Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

LiP (UI/L)



IB-26C (Trinacrium) 8 5 80 2 28 44,59

IB15B (Stephanoma) 8 5 80 2 28 69,99



08

De manera peculiar la cepa IB-18Cb (Bdellospora) fue la única de las cinco cepas

testeadas que presento una buena actividad enzimática (figura 54) ya que las demás cuatro no

llegaron ni a la sexta parte de lo que alcanzó esta enzima. Cabe recalcar que la LiP es la más

escasa del sistema ligninolítico.

c. Lacasa.-

Tabla 27: Actividad enzimática Lac de diferentes cepas fúngicas con variación Bagazo

En la tabla 27 veremos el resumen de resultados para el sustito bagazo, comparándolo

con los resultados de variación manganeso, la actividad fue mas baja.

La cepa fúngica IB-18Cb (Bdellospora) fue una de las que presento mayor actividad

enzimática para Lacasa (Lac) a los 21días, en el medio 3, llegando a 56,24 (UI/L).

IB-18Cb (Bdellospora) según análisis realizados para esta cepa fúngica se dice que a

mayor concentración de manganeso, se obtendría mayor actividad enzimática, también es

importante la concentración de extracto de levadura en el medio, pero la concentración de


Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

Lac (UI/L)



IB-26C (Trinacrium) 8 5 80 2 21 48,56

IB15B (Stephanoma) 5 1 80 2 28 8,18



09

glucosa no influye en la actividad enzimática.

Figura 55: Actividad enzimática Lacasa de 5 cepas fúngicas en función del bagazo.

Lacasa (bagazo)

0

10

20

30

40

50

60

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (UI/L)

Act

ivid

ad (U

I/L)


Si vemos la figura 4-34 notaremos que la cepa IB-26C (Trinacrium) no tiene mucha

diferencia con IB-18Cb (Bdellospora), pero al contrario esta cepa es dependiente de glucosa, y

por supuesto de manganeso.

La aceptación del sustrato bagazo, por la cepa IB-18Cb, para la producción de LiP

como se observa en la figura 56 fue la que mejor resultado obtuvo, sin embargo el medio que

contiene paja brava resulta ser un medio mucho mas confiable, que el medio del bagazo, esto

por su rango de error que presenta.


0

Figura 56: Actividad enzimática de la cepa fúngica IB-18Cb frente a diferentes sustratos

lignocelulosicos

IB-18Cb

-100

0

100

200

300

400

500


Cascara dearroz

Sustratos

Activ

idad

(UI/L

)


III. Aserrín.-


Tabla 28: Actividad enzimática MnP de diferentes cepas fúngicas con variación de aserrín

La cepa fúngica IB-18Cb (Bdellospora) fue la que presento mayor actividad enzimática

para Manganeso peroxidasa (MnP) a los 28 días, en el medio 8, llegando a 84,70 (UI/L) de

actividad enzimática.

Figura 57: Actividad enzimática MnP de 4 cepas fúngicas en función de aserrín.

Cepa fúngica Medio Aserrín (g/L)

Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

MnP (UI/L)



IB26C (Trinacrium) 6 5 40 2 28 41,76

IB15B (Stephanoma) 3 1 80 0.5 28 22,35


Manganeso Peroxidasa (aserrin)

0

15

30

45

60

75

90

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L)


En la figura 57 observaremos que hasta los 21 días las cepas IB-18Cb (Bdellospora) y

IB-26C (Trinacrium) se asimilaban en su actividad pero ya a los 28 días IB-26C (Trinacrium)

bajo su actividad enzimática, mientras IB-18Cb (Bdellospora) incrementó notablemente su


No podemos negar que el manganeso juega un papel muy importante en esta actividad

enzimática, si observamos la composición de los medios escogidos, la mayoría tiene

requerimientos nutricionales donde el manganeso tiene una alta concentración.


Tabla 29: Actividad enzimática LiP de diferentes cepas fúngicas con variación de aserrín

La

cepa

fúngi

ca

IB-15B (Stephanoma) fue una de las que presento mayor actividad enzimática para Lignina

peroxidasa (LiP) a los 28 días, en el medio 8, llegando a 42,25 (UI/L).


Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

LiP (UI/L)



IB-26C (Trinacrium) 8 5 80 2 21 29,56

IB15B (Stephanoma) 8 5 80 2 28 42,25



2

La cepa que alcanzo la actividad máxima requería una fuente de manganeso alta, pero

esto se presento a los 28 días, ya que de los 15 a 21 días, no tenia buen alcance enzimático

como se puede ver en la figura 4-36.

Las actividades enzimáticas obtenidas en los medios con aserrín, probablemente se

deba a que en las maderas existe una gran variedad de compuestos aromáticos que habrían

pasado a la solución [3]. El manganeso que comúnmente esta presente en las maderas también

pudo haber sido el inductor [88].

Figura 58: Actividad enzimática Lignina peroxidasa de 5 cepas fúngicas en función de la aserrín.

Lignina Peroxidasa (aserrin)

0

10

20

30

40

50

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L)


En la figura 58 observaremos que las cinéticas enzimáticas que presentaron las cinco

cepas fúngicas no tuvieron diferencia como en anteriores casos, al parecer este sustrato fue

asimilado por las cinco cepas, aunque esto no estimule una buena actividad enzimática.

c. Lacasa.-


3

Tabla 30: Actividad enzimática MnP de diferentes cepas fúngicas con variación de aserrín

La cepa fúngica IB-29B (Blasthomyces) fue la que presento mayor actividad enzimática

para Lacasa (Lac) a los 28 días, en el medio 2, llegando a 30,09 (UI/L).

Las respuestas enzimáticas para cada cepa son diferentes, ya que cuando una variación

se realiza en el medio de cultivo, todas las condiciones cambian, como es le caso de IB-29B

(Blasthomyces) que en su caso, la concentración de manganeso y glucosa no influyen en la


Figura 59: Actividad enzimática Lacasa de 5 cepas fúngicas en función del aserrín.

Lacasa (aserrin)

0

10

20

30

40

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L)


En la tabla 29 se puede notar claramente que los valores de las cinco cepas fúngicas


Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

LiP (UI/L)



IB-26C (Trinacrium) 8 5 80 2 21 24,25

IB15B (Stephanoma) 5 1 80 2 28 12,72



4

testeadas no tienen diferencia significativa, con excepción de IB-15B (Stephanoma) que no

alcanzo buena actividad para LiP.

Figura 60: Actividad enzimática de la cepa fúngica IB-26C frente a diferentes sustratos

lignocelulosicos

IB-26C

0

20

40

60

80

100


Cascara dearroz

Sustratos

Act

ivid

ad (U

I/L)


Por la composición química que presenta el aserrín se esperaba que fuera el sustrato

mejor asimilado, en la cepa IB-26C tuvo una mayor actividad enzimática para Mn P , en

cambio para LiP y Lacasa fue superado por el sustrato residuos de quinua.

IV. Residuos de Quinua Real.-


Tabla 31: Actividad enzimática MnP de diferentes cepas fúngicas con variación de

residuos de quinua.

Cepa fúngica Medio Residuos quinua (g/L)

Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

MnP (UI/L)



IB26C (Trinacrium) 6 5 40 2 28 13,07

IB15B (Stephanoma) 3 1 80 0.5 21 26,72


La cepa fúngica IB-29B (Blasthomyces) en el medio 5 fue la que presento mayor

actividad enzimática para Manganeso peroxidasa (MnP) a los 21 días, llegando a 80,74 (UI/L).


residuos de quinua.

Manganeso Peroxidasa (res. quinua)

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L)


En este caso la cepa IB-29B (Blasthomyces) tuvo una gran diferencia respecto a las

demás tres cepas restantes, ya que ninguna alcanzo ni la mitad de la actividad enzimática

producida por esta.

Al parecer este sustrato no tuvo gran aceptación por los hongos testeados, ya que con

este en medio de cultivo, las actividades enzimáticas bajaron, con excepción de IB-29B

(Blasthomyces), es posible que este residuo lignocelulósico contenga otro tipo de enzimas el

cual pueden llegar a inhibir la actividad enzimática que queremos encontrar, tal es el caso de

la saponina, que esta presente en la planta de quinua.


La cepa fúngica cepa IB-26C (Trinacrium) en el medio 8 fue la que presento mayor

actividad enzimática para Lignina peroxidasa (LiP) a los 28 días, llegando a 50,99 (UI/L).

Figura 62: Actividad enzimática Lignina peroxidasa de 5 cepas fúngicas en función de residuos


6

de quinua.

Lignina Peroxidasa (res. quinua)

0

10

20

30

40

50

60

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L)


Como se puede observar la cinética enzimática que produce este hongo se incremento en

los últimos siete días, puede ser que la producción de esta enzima lleve un tiempo mas esto

respecto al metabolismo que tiene el microorganismo, no olvidemos que el crecimiento del

hongo va correlacionado con la actividad enzimática.

Tabla 32: Actividad enzimática LiP de diferentes cepas fúngicas con variación de residuos de

quinua

c. Lacasa.-

La cepa fúngica IB-26C (Trinacrium) en el medio 8 presento mayor actividad


Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

LiP (UI/L)



IB-26C (Trinacrium) 8 5 80 2 28 50,99

IB15B (Stephanoma) 8 5 80 2 28 17,57



enzimática para Lacasa (Lac) a los 28 días llegando a 62,62 (UI/L).

Tabla 33: Actividad enzimática Lac de diferentes cepas fúngicas con variación de residuos de

quinua

IB-26C (Trinacrium) influenciada por la fuente de nitrógeno y vitaminas que contiene

en su medio de cultivo alcanzo una actividad enzimática ala cual supera como cinco veces más

a las de más cuatro cepas fúngicas, no olvidemos que en análisis anteriores de este hongo

estaba inducida por la glucosa, esto puede afecta a que la actividad haya bajado según pruebas

realizadas anteriormente.

Figura 64: Actividad enzimática Lacasa de 5 cepas fúngicas en función de residuos de quinua.

Lacasa (res. quinua)

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L)


El sustrato bagazo fue el sustrato que asimilaron mejor la mayoría de las cepas fúngicas


Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

Lac (UI/L)



IB-26C (Trinacrium) 8 5 80 2 28 62,62

IB15B (Stephanoma) 5 1 80 2 28 1,42



8

para actividad MnP sin embargo, no existe diferencia estadísticamente significativa con

respecto a los residuos de quinua, en especial en la cepa IB-29B (figura 65) se observa una

optima producción de esta enzima comparándola con las otras cinco cepas.

Figura 65: Actividad enzimática de la cepa fúngica IB-15B frente a diferentes sustratos

lignocelulosicos

IB-29B

0

2040

6080

100


Cascara dearroz

Sustratos

Act

ivid

ad (U

I/L)


V. Cáscara de Arroz.-


Tabla 34: Actividad enzimática MnP de diferentes cepas fúngicas con variación de cáscara

de arroz

Cepa fúngica Medio Cáscara de arroz

(g/L)

Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

MnP (UI/L)



IB26C (Trinacrium) 6 5 40 2 21 23,93

IB15B (Stephanoma) 3 1 80 0.5 28 2,19


9

La cepa fúngica IB-18Cb (Bdellospora) fue la que presento mayor actividad


(UI/L).


cáscara de arroz.

MnP (cas. arroz)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L)


La cinética enzimática de estas cepas fúngicas se puede observar en la figura 4-41,

podemos notar que entre las cuatro cepas su cinética es muy diferente, para IB-18Cb

(Bdellospora) que alcanzó una actividad tres veces mas que en la prueba donde se utilizo

glucosa, esto quiere decir que este medio es mas optimo para este hongo, se puede decir que la

glucosa, extracto de levadura no influyen en la producción de enzimas.

La cepa IB-29B (Blasthomyces) que depende exclusivamente del extracto de levadura,

y siendo indispensable este en el medio de cultivo para que este microorganismo sea capaz de

producir enzimas.


Tabla 35: Act enz LiP de diferentes cepas fúngicas con variación de cáscara de arroz


(g/L)

Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

LiP (UI/L)



IB-26C (Trinacrium) 8 5 80 2 21 20,55


20

La cepa fúngica IB-15B (Stephanoma) presento mayor actividad enzimática para

Lignina peroxidasa (LiP) a los 21 días, en el medio 8, llegando a 59,87 (UI/L). en esta cepa la

glucos influye pero no del todo, ya que su valor no es significativo, en cambio la interacción

de tres componentes de este medio como ser. Glucosa, extracto de levadura, manganeso,

influyen bastante para que el hongo sea capaz de producir estas enzimas, en el medio se

suprimió la glucosa, pero se adiciono cáscaras de arroz, la cual en su composición química

contienen celulosa en un 62.49%, es posible que el microorganismo haya aprovechado esta

fuente de carbono, la cual requiere para su metabolismo y por ende producir enzimas.

Figura 67: Actividad enzimática Lignina peroxidasa de 5 cepas fúngicas en función de cáscara de arroz.

LiP (cas. arroz)

0

10

20

30

40

50

60

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L)


IB15B (Stephanoma) 8 5 80 2 21 59,87



2

Comparando con el medio que se utilizo glucosa, esta cepa alcanzo un similar

resultado. En las cepas fúngicas restantes como la IB-15Da (Cephalosporium) el componente

que realmente influye en la expresión de enzimas es el manganeso, por lo cual el resultado fue

mas optimo en esta prueba que en la prueba donde se utiliza glucosa.

En cambio en la cepa IB-18Cb (Bdellospora) se obtuvo un resultado mas bajo que el

anterior, esto, por que, para el metabolismo de este hongo, es indispensable una fuente de

carbono, y en concentración alta.

c. Lacasa.-

Tabla 36: Actividad enzimática MnP de diferentes cepas fúngicas con variación de

cáscara de arroz

La cepa fúngica IB-29B (Blasthomyces) en el medio 2 fue una de las que presento

mayor actividad enzimática para Lacasa (Lac) a los 21 días llegando a 28,70 (UI/L). Por lo

visto anteriormente esta cepa no es dependiente de glucosa en concentraciones altas, pero si de

extracto de levadura, el medio en el cual se realizo la prueba contenía a una alta concentración

de fuente de nitrógeno, es por eso que se esperaba un mejor resultado.

Figura 68: Actividad enzimática Lacasa de 5 cepas fúngicas en función de cáscara de arroz.


(g/L)

Mn (mg/L)

Ext. Lev. (g/L)

Tiempo (días)

LiP (UI/L)



IB-26C (Trinacrium) 8 5 80 2 28 11,22

IB15B (Stephanoma) 5 1 80 2 21 4,67



22

Lacasa (cas. arroz)

0

5

10

15

20

25

30

0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (dias)

Act

ivid

ad (U

I/L)


Algunos metabolitos que están presentes en el sustrato lignocelulósico pueden

influenciar en la producción de enzimas [81].

Los resultados obtenidos con sustratos lignocelulosicos, reemplazando la glucosa, como

componente del medio de cultivo, en algunos casos como es el de IB-18Cb (Bdellospora) en la

actividad enzimática LiP utilizando como sustrato bagazo, alcanzo una actividad impresiónate,

en otros casos no se obtuvo buenos resultados, pero esto depende de cada cepa fúngicas, ya

que cada una tiene requerimientos nutricionales diferentes, realizando una comparación de la

mejor cepa fúngica para cada sustrato y capacidad de producir enzima podemos ver el anexo

C-7, C-8, C-9, donde se enguanta los hongos que presentaron mejor actividad para cada

enzima.

Podemos resaltar que estos sustratos asimilaron mejor en la actividad lignina

peroxidasa, que las otras dos enzimas

4.4. Determinación de Actividad Celulolítica.-

De los resultados obtenidos para enzimas celulolíticas de actividad combinada, en esta

prueba solo una cepa dio resultados significativos, fue la cepa IB-29B (Blasthomyces) los

cuales se resumen a continuación.

Tabla 37: Actividad celulítica para -29B (Blasthomyces).


23

Los resultados obtenidos para las demás cepas fúngicas no fueron significativos, es por

eso que no se los tomo en cuenta.

Para realiza esta prueba se realizo una curva de calibración la cual se puede observar en

anexo E-1.

Esta prueba se realizo queriendo verificar si existen enzimas tipo hidrolasas, ya que esta

enzimas trabajan en conjunto con las enzimas ligninolíticas, teniendo como fin degradar la

celulosa, las primeras, y las otras degradar la lignina.

4.5. Determinación de proteínas totales.-

La absorción a 660 nm se transformo en ug/mL estandarizada con albúmina de suero

bovino (Sigma).

Esta prueba se realizo con el objetivo de evaluar si existía alguna limitación en algunos

nutrientes que estuviera afectando la producción de las actividades obtenidas en ambos medios

[3]. Otro objetivo de era prueba era el de comprobar la existencia de enzimas en el medio , las

cuales son proteínas especializadas.

Los resultados más importantes, fueron siguientes:

Tabla 38: Concentración de proteínas totales para IB-26C (Trinacrium)

IB-26C (Trinacrium) Ci (g/L) Cf (g/L)

Medio 1 0,28 0,4 Medio 2 0,18 0,3 Medio 3 0,19 0,2

IB-29B(Blasthomyces) C (g/L) Medio 6 0,6 Medio 7 0,6


24

Medio 4 0,05 0,2 Medio 5 0,21 0,3 Medio 6 0,11 0,3 Medio 7 0,1 0,2 Medio 8 0,22 0,4

Se obtuvieron resultados óptimos para la mayoría de las cepas. También se puede

observar la curva de estandarización para esta prueba, en la cual se pueden relacionar los

resultados obtenidos (ver anexo E-2).

4.6. Comparación de la Actividad Enzimática Ligninolítica de las enzimas

producidas frente a enzimas comerciales.-

Las enzimas producidas por los hongos aislados, se compararon frente a enzimas

comerciales por métodos colorimétricos, los resultados obtenidos para enzima se detallan a

continuación.

Tabla 39: Comparación de enzimas comérciales para actividad MnP.

Podemos ver en la tabla 4-31, la diferencia entre la enzima comercial, para actividad

MnP, en este caso la enzima comercial prácticamente supera la cantidad de actividad

enzimática respecto ala cepa IB-26C (Trinacrium) en medio manganeso.

Figura 69: Reacción enzimática para MnP de la cepa IB-26C (Trinacrium) Frente a una enzima

comercial (peroxidasa).

Manganeso

peroxidasa

IB-26C

(Trinacrium)

medio Mn

IB-29B

(Blasthomyces)

medio Cu

IB-29B

(Blasthomyces)

medio bagazo

Enz. comercial

Peroxidase de

“Horseradish”.

77 (UI/L) 246 (UI/L) 91(UI/L) 4289 (U/L)


2

En la figura 4-44 podemos ver el cambio de coloración que sufrió la reacción gracias a

la enzima MnP, en la cual la que mas oxidación produjo fue la enzima comercial.

Tabla 40: Comparación de enzimas comérciales para actividad LiP.

Para la enzima LiP los resultados de IB-18Cb (Bdellospora) en un medio con variación

de residuos de bagazo alcanza un 10% de la actividad enzimática de la enzima comercial (ver

tabla 4-31).

Figura 70: Reacción enzimática para LIP de la cepa IB-29B(Blasthomyces) frente a una enzima

comercial (peroxidasa).

IB-26C(Trinacrium) medio manganeso

IB-6(Trinacrium) medio cobre

IB18Cb(Bdellospora) medio bagazo

Enzima comercial

76,50926 (UI/L) 251 (UI/L) 488 (UI/L) 4633 (UI/L)


26

En la figura 4-45 observamos la oxidación que produce LiP sobre el sustrato ABTS,

como resultado se torna una coloración verde oscura.

Tabla 41: Comparación de enzimas comérciales para actividad Lac.

Para la comparación de actividad enzimática de lacasa, las enzimas comerciales alcanzaron

mayor actividad enzimática que las enzimas producidas.

Para la determinación de la actividad enzimática de las enzimas comerciales, se tuvo

que realizar diluciones 1/10 para que así entren en el rango de linealidad y pueda ser

comparadas con las enzimas producidas en el presente trabajo.

Cabe la pena aclarar que las enzimas producidas, están en bruto, ya que no han sido

purificadas, esto puede influir bastante por que pueden haber elementos que estén inhibiendo

su reacción enzimática, como puede haber elementos que incrementen su actividad

enzimática, son bastantes los factores que pueden estar influyendo.

Figura 71: Reacción enzimática para Lac de la cepa IB-15Da(Cephalosporium) frente a una

IB29B(Blasthomyces) medio manganeso

IB15Da(Cephalosporium) medio cobre

IB26C(Trinacrium) medio res quinua

Enzima comercial

74 (UI/L) 287 (UI/L) 63 (UI/L) 4204 (UI/L)


2

enzima comercial (lacasa).

Esta prueba fue realizada, par tener una ida de la actividad enzimática de las enzimas

producidas.

5. CONCLUSIONES

Dentro de todos los objetivos planteados inicialmente se legaron a las siguientes

conclusiones.

Se realizo un viaje de recolección de muestras, en el cual pudimos recolectar 30

muestras diferentes de diferentes fuentes, el viaje se realizo en una parte del Altiplano

boliviano, en los departamentos de La Paz y Oruro, es importante mencionar que un

porcentaje de hongos han sido aislados de diferentes zonas geográficas de Bolivia.

De las muestras recolectadas logramos aislar 31 cepas fúngicas diferentes, las cuales

aun no han sido totalmente estudiadas, de igual forma, no hubiera sido posible realizar el

presente trabajo sin la presencia de hongos. De los dos métodos que se utilizaron, el más

efectivo fue el método indirecto, ya que se logro aislar más variedad de hongos que en el

método indirecto, lo cual nos permite nuevos microorganismos con características

interesantes, que despiertan ideas de investigación.


28

De las 31 cepas aisladas se identifico y caracterizó a un 80,64%, debido a la diversidad

que presentan los hongos en el ecosistema, la identificación que se realizo solo fue apoyada en

bibliografía, y se estima que sean correctos, por esta razón es necesario confirmarlos por

métodos de biología molecular. Respecto al 19, 35% que no fueron identificadas constituyen

posiblemente a nuevas especies aun no estudiadas.

Debido ala capacidad de producir enzimas con actividad enzimática ligninolítica se

realizo dos selecciones de cepas fúngicas, la primera selección realizada en medios sólidos

específicos, prueba de la cual el 38,7% de los hongos aislados presentaron actividad

ligninolítica, el restos de los hongos 61,3% no presentaron actividad ligninolítica, razón por la

cual no se los tomo en cuenta para otras pruebas en adelante.

Este método cualitativo es muy práctico, par la determinación de actividad enzimática,

ya que permita ahorrar materiales y tiempo en comparación con otras determinaciones

cuantitativas, de todas maneras es indispensable confirmar los resultados con pruebas

espectrofotométricas.

En cuanto a la segunda selección de las doce cepas seleccionadas, solo seis mostraron

una buena actividad enzimática, esto se debe a que muy pocas son las cepas fúngicas con

actividad ligninolítica que están distribuidas ampliamente en el ecosistema. Las seis cepas

seleccionadas fueron: IB-29B (Blasthomyces), IB-18Cb (Bdellospora), IB-26C (Trinacrium),

IB-15B (Stephanoma), IB-15Da (Cephalosporium), IB-6 (Circinutrychum).

Se realizo un diseño factorial 23, siendo los factores: glucosa, manganeso, extracto de

levadura, con esto se obtuvo 8 diferentes medios con diferente composición, lo cual permitió

obtener una mejor actividad enzimática, buscando además el medio especifico para cada cepa

fúngica y para cada enzima.

De acuerdo alas pruebas realizadas por métodos espectrofotométricos logramos

cuantificar la actividad enzimática de las cepas fúngicas seleccionadas. Con estos resultados

obtenidos llegamos a varias conclusiones.


29

Para actividad MnP y LiP la cepa que presento la mejor actividad enzimática en medio

manganeso fue la IB-26C (Trinacrium) debido ala cinética que presento, podemos afirmar que

esta cepa es capaz de producir enzimas peroxidasas óptimamente.

El hongo capaz de expresar enzimas de actividad lacasa óptimamente es IB-29B

(Blasthomyces).

Los medios de elección en la mayoría de las cepas fúngicas son el 5 y 8, para actividad

MnP, esto se debe a que es importante la fuente de nitrógeno y necesitan un inductor en este

caso es el manganeso para la producción de estas enzimas.

Para una mejor actividad enzimática LiP, los microorganismos requieren una mayor

fuente de nitrógeno, pero la actividad enzimática no se produciría si no existiría la interacción

de los tres compuestos.

La concentración de glucosa no influye en el medio de cultivo para la producción de

enzimas de actividad enzimática lacasa, lo que es indispensable en este medio de cultivo es un

inductor en este caso manganeso.

La mayor actividad enzimática para las enzimas ligninolíticas se da entre los 21 y 28

días, esto para el medio manganeso.

Cada microorganismo tiene diferentes requerimientos nutricionales.

Las tres enzimas ligninolíticas determinas tienen diferentes exigencias para potenciar su


Las cepas que fueron capaces de producir los tres tipos de enzimas fueron: IB-29B

(Blasthomyces), IB-18Cb (Bdellospora), IB-26C (Trinacrium), IB-15B (Stephanoma).

De acuerdo ala segunda selección realizada de los hongos aislados se realizo con un

segundo diseño factorial 23, siendo los factores esta vez: glucosa, cobre, extracto de levadura,

y se observo la actividad enzimática que puedan producir en estos medios.


30

En la prueba de variación cobre para actividades enzimática de enzimas peroxidasas se

determinó que la concentración de cobre influye en la actividad enzimática, sin embargo no se

necesita altas concentraciones de este metal para optimizar la actividad enzimática, según los

resultados obtenidos, las concentraciones tienen que ser bajas, de lo contrarió puede llegar a

intoxicar al microorganismo e inhibir la síntesis de enzimas.

Con respecto a lacasas se requiere una concentración mínima de glucosa, y la

concentración de extracto de levadura es muy importante, ya que es muy necesaria la fuente de

nitrógeno para estas enzimas

Realizando una comparación de resultados alcanzados con la variación cobre con

respecto a los resultados con variación de manganeso, notamos claramente que los resultados

tiene mucha diferencia, en este sentido podemos afirmar, que el medio de cultivo de cobre es

mas efectivo que el medio de cultivo manganeso.

Se evaluó cinco sustratos lignocelulosicos diferentes para determinar la producción de

enzimas ligninolíticas, en medios donde se suprimió la glucosa por: paja brava, bagazo,

aserrín, residuos de quinua, cáscara de arroz.

Variando las condiciones de cultivo se consiguió mejorar el rendimiento, optimizando

en algunos casos la producción de enzimas, como es el caso de LiP.

Con esta variación de aprovechamiento de sustratos lignocelulosicos se logro reducir

costos del proceso de fermentación.

En los fermentos de cultivo fungicos se encontraron dos tipos de actividda enzimática

celulolítica y redox. Esta observación fue evidente con la cepa fungica Blatomyces.

Se determinó la cuantificación de proteínas, resultados con los cuales afirmamos que

existe una biomasa proteica, equivalente ala actividad enzimática determinada.

Como referencia, se determinó la comparación de la capacidad de la actividad


3

enzimática de las enzimas producidas frente a enzimas comerciales.

Las cepas fúngicas aisladas producieron un 52 a 54% de la actividad enzimática

producida por enzimas comerciales.

Las enzimas producidas de actividad enzimática LiP posen mayor actividad enzimática

que las comerciales, sin embargo tomamos en cuanta que estas enzimas producidas en el

presente trabajo no están purificadas.

6. RECOMENDACIONES

- Realizar recolección de muestras explorando más regiones, en especial del altiplano

boliviano, debido ala amplia diversidad del país.

- Hacer pruebas de biología molecular, para la identificación de las cepas fúngicas aisladas,

para verificar, los resultados estimados de esta prueba.

- Realizar estudios profundos sobre las cepas fúngicas aisladas, con respecto a potenciales

biotecnológicos.

- Determinar la actividad enzimática ligninolítica probando un medio de cultivo con otro tipo

de metales que induzcan la actividad enzimática, por ejemplo cadmio.

- Realizar pruebas que confirmen el pH característico para cada enzima, ya que este punto es

muy influyente en la actividad enzimática.

- Buscar la temperatura optima para la fermentación de los medios de cultivo de producción de

enzimas, y para la reacción enzimática.

- Determinar la biomasa de los medios de cultivo de producción de enzimas, por métodos

específicos.

- Profundizar estudios en los medios de cultivo e producción de enzimas, talvez con un diseño


32

factorial 33, esto con el fin de mejorar la producción de enzimas.

- Incrementar el tiempo de cultivo para determinar si existen diferencias en la cinética de estas

enzimas, ya que la actividad máxima en algunos casos se dio en los 28 días.

- Probar otro tipo de sustratos sintéticos, para la evaluación de enzimas ligninolíticas, por

ejemplo veratryl alcohol para LiP.

- Se requieren experimentos más precisos para definir la producción de enzimas.

- Por los resultados alcanzados se recomienda realizar la purificaron de dichas enzimas.

- Probar otros sustratos lignocelulosicos, para la producción de estas enzimas, estudiando su

composición química.

- Realizar pruebas de este tipo de enzimas para la producción de alcohol, la aplicación de

industrial como la fabricación de papel, en la industria farmacéutica para la modificación

químico enzimático de fármacos y finalmente para procesos de biorremediación por su

capacidad de oxidantes.

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