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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
ESCUELA DE BIOLOGÍA
TESIS DE GRADO PREVIA A LA OBTENCIÓN
DEL TÍTULO DE BIÓLOGO.
POTENCIALIDADES DEL USO DE QUITOSANO Y AGUA
DE COCO COMO PROMOTORES DEL CRECIMIENTO IN
VITRO DE LA ORQUÍDEA Cattleya sp.
JULIA ESTHER VALENCIA PACHO
GUAYAQUIL-ECUADOR
2016
ii
© Derecho de autor
Julia Esther Valencia Pacho
iii
DIRECTOR DE TESIS
----------------------------------------------
MSc. Xavier Cornejo
iv
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
ESCUELA DE BIOLOGÍA
CALIFICACIÓN QUE OTORGA EL TRIBUNAL QUE RECIBE LA
SUSTENTACIÓN Y DEFENSA DEL TRABAJO INDIVIDUAL DE TITULACIÓN:
TESIS
POTENCIALIDADES DEL USO DE QUITOSANO Y AGUA DE COCO COMO
PROMOTORES DEL CRECIMIENTO IN VITRO DE LA ORQUÍDEA CATTLEYA
SP.
Autora: Julia Esther Valencia Pacho
PREVIO A OBTENER EL TÍTULO DE BIOLÓGA
Miembros del tribunal CALIFICACIÓN (Números y Letras) Blga. Mónica Armas Soto MSc. PRESIDENTE DEL TRIBUNAL ---------------------------
Blga. Shirley Moncayo Baño MIEMBRO DEL TRIBUNAL ---------------------------
Lcdo. José Suarez, MSc.
MIEMBRO DEL TRIBUNAL ---------------------------
SUSTENTACIÓN Y DEFENSA DEL TRABAJO INDIVIDUAL DE
TITULACIÓN REALIZADA EN LA SALA DE MAESTRÍA DE LA FACULTAD.
FECHA: -------------------------------------------------------------------------------- CERTIFICO
Abg. José Solórzano Cabezas
SECRETARIO DE LA FACULTAD
v
DEDICATORIA
Con humildad y sencillez dedico esta tesis a mi adorada hija Scarlet Lara,
quien me prestó el tiempo que le pertenecía para terminar y me motivó siempre
para nunca rendirme y poder ser un ejemplo para ella, a mi padre Sr. Galo
Valencia y mi madre Domitila Pacho, quienes me enseñaron desde pequeña a
luchar para alcanzar mis metas. A mi familia, por brindarme su confianza y por el
tiempo dedicado, a mis amigos y compañeros que de una u otra manera
aportaron con sus conocimientos.
vi
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a mi Dios, quien me dio la fe, fortaleza, la salud y la esperanza
para realizar esta tesis.
Ayer, hoy y siempre agradezco eternamente a mis padres, que me han
dado su apoyo incondicional para realizar mis estudios.
A la empresa AGROVITROPARIS, Ing. Agr. Laura Paris Moreno Rivas, por
permitir realizar esta investigación en sus laboratorios.
A los docentes, los cuales nos han ido capacitando arduamente
profesionalmente para la elaboración de este trabajo.
A mis amigas Diana Rojas y Shirley Moncayo, que de una u otra manera
aportaron con sus conocimientos.
Al MSc. Xavier Cornejo que con su paciencia tiempo y dedicación
contribuyó a culminar con éxito este proyecto.
vii
RESUMEN
El presente estudio se realizó en los meses de junio a diciembre del 2015,
en el cantón Daule, Provincia del Guayas, en el laboratorio de cultivos de tejidos
in vitro de la empresa AGROVITROPARIS. Donde se determinó la dosis
apropiada de quitosano y agua de coco para el desarrollo de la orquídea Cattleya
sp.
Como material vegetal de inicio se utilizó explantes protocormos de la
orquídea Cattleya sp. se evaluaron 5 variables: número de brotes, tallas de las
vitroplantas, ancho central de la hoja, longitud de raíces e índice de mortalidad.
Para el cultivo se utilizó el medio Murashige y Skoog, suplementado con
quitosano y agua de coco. Se realizó un diseño completamente al azar en forma
grupal usando cinco tratamientos con distintas dosis de quitosano ** y agua de
coco * (T1: 50 mg**50 mL*; T2: 80 mg**100 mL*; T3: 100 mg**150 mL*; T4: 125
mg**200 mL*; T5: 150 mg**250 mL*).
Los mejores resultados en las variables evaluadas se obtuvieron con el
empleo de 150 mg de quitosano y 250 mL de agua de coco.
Las vitroplántulas obtenidas tuvieron 3 brotes, con una altura de 3.30 cm,
diámetro de la hoja 1.40 cm y raíces vigorosas de 4.50 cm aproximadamente.
viii
ABSTRACT
The present study was conducted between June to December 2015, in the
laboratory of AGROVITROPARIS Company, located in Parish Daule, Province of
Guayas, Ecuador. The proper dose of quitosan and coconut water for the
optimum development of Cattleya sp. orchid was determined.
As starting plant material explant protocorms of Cattleya sp. were used, and
five parameters were measured number of sprouts, size of vitro plantlets, central
width of blades, length of roots, and mortality rate.
For the culture, Murashige and Skoog media supplemented with quitosan
and coconut water were used. It was conducted completely randomized design in
groups using five treatments with different doses of quitosan and coconut water
(T1: 50 mg**50 mL*; T2: 80 mg**100 mL*; T3: 100 mg**150 mL*; T4: 125 mg**200
mL*; T5: 150 mg**250 mL*).
The best results among the evaluated variables were obtained with the use
of 150 mg of quitosan and 250 mL of coconut water.
The vitro plantlets were three outbreaks, the highest sprout measures 3.30
cm; the leaf measures 1.40 cm and the strong roots 4.50 cm approximately.
ix
ÍNDICE GENERAL
Contenido
RESUMEN .......................................................................................................... vii
ABSTRACT ........................................................................................................ viii
LISTA DE TABLAS ............................................................................................. xi
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................... xii
1.INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1
1.1 GENERO CATTLEYA SP. ........................................................................................ 2
1.2 QUITOSANO ............................................................................................................ 5
1.3 AGUA DE COCO ...................................................................................................... 7
1.3.1. COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS EN EL AGUA DE COCO: ........................... 7
1.4. PRINCIPALES COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO .................................. 8
2. ANTECEDENTES .............................................................................................9
3. HIPÓTESIS ..................................................................................................... 11
4. OBJETIVOS .................................................................................................... 12
4.1. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................... 12
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................. 12
5. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 13
5.1. ÁREA DE ESTUDIO .............................................................................................. 13
5.1.1. Datos geográficos: ........................................................................................... 14
5.1.2. Datos climáticos: .............................................................................................. 14
5.1.3. Duración del experimento ................................................................................ 14
5.2. DISEÑO EXPERIMENTAL ..................................................................................... 14
5.3. ETAPA DE CULTIVO ............................................................................................. 15
5.4. MEDIO DE CULTIVO ............................................................................................. 15
5.5. MATERIAL VEGETAL............................................................................................ 15
5.6. CONDICIONES AMBIENTALES ............................................................................ 16
5.7. METODOLOGÍA DE LA SIEMBRA ........................................................................ 16
5.8. VARIABLES A MEDIRSE. ..................................................................................... 17
5.8.1. Número de brotes de las vitroplantas ............................................................. 17
5.8.2. Tallas de las Vitroplantas ................................................................................. 17
5.8.3. Ancho en la parte central de la hoja y longitud de raíces .............................. 18
5.8.4. Aclimatación...................................................................................................... 18
x
5.9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE LA PRUEBA DE TUKEY 5% .................... 18
6. RESULTADOS ................................................................................................ 19
6.1. ENSAYOS PREVIOS ................................................................................... 19
6.1.1 Medio de cultivo estándar sin agua de coco ni quitosano. .................. 19
6.1.2 Medio de cultivo estándar con agua de coco. ....................................... 19
6.1.3 Medio de cultivo estándar con quitosano. ............................................. 19
6.2. ÍNDICES DE MORTALIDAD ........................................................................ 20
6.3. NÚMEROS DE BROTES ....................................................................................... 21
6.4. TALLAS DE LAS VITROPLANTAS ........................................................................ 22
6.5. ANCHO DE LAS HOJAS ....................................................................................... 24
6.6. LONGITUD DE RAÍCES ........................................................................................ 25
7. DISCUSIÓN .................................................................................................... 26
8. CONCLUSIONES ........................................................................................... 28
9. RECOMENDACIONES ................................................................................... 29
9. BIBLIOGRAFÍA. ............................................................................................. 30
10. GLOSARIO ................................................................................................... 36
11. ANEXOS ....................................................................................................... 38
ANEXO 1. MEDIO DE CULTIVO MURASHIGE Y SKOOG................................. 38
ANEXO 2. RESULTADOS DE LAS DIFERENTES VARIABLES EVALUADAS . 40
ANEXO 3. ANÁLISIS DE VARIANZAS .............................................................. 44
ANEXO 4. REGISTRO FOTOGRÁFICO ............................................................ 48
xi
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Composición de aminoácidos en el agua de coco…………………...........7
Tabla 2. Dosis de quitosano y agua de coco utilizadas en el medio de cultivo….15
ANEXO. 1. MEDIO DE CULTIVO MURASHIGE Y SKOOG…………….……...…..38
Tabla 1. Soluciones necesarias para obtener 1 litro de medio de cultivo para
la siembra de orquídeas…………………………………………...…………….……..38
Tabla 2. Solución stock de vitaminas de Morel…………..……..……..………..38
Tabla 3. Solución stock de micronutriente de MS 1962…………….…………39
Tabla 4. Solución stock macronutriente B5………………..……………….…..39
ANEXO. 2. RESULTADOS DE LAS DIFERENTE VARIABLE EVALUADAS….40
Tabla 1. Números de brotes de los diferentes tratamientos………..………...40
Tabla 2. Tallas de las vitroplantas de los diferentes tratamientos……………41
Tabla 3. Ancho en la parte central de la hoja de los diferentes tratamientos.42
Tabla 4. Longitud de raíces de los diferentes tratamientos………………......43
ANEXO. 3. ANALISIS DE VARIANZA…………………………………..…….....…..44
Tabla 1. Análisis de varianza en Números de brotes……….…….………...….44
Tabla 2. Análisis de varianza en las tallas de las vitroplantas.……….…….…45
Tabla 3. Análisis de varianza ancho central de hoja………………...….….….46
Tabla 4. Análisis de varianza Longitud de las raíces………...…………….….47
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ubicación geográfica Laboratorio Agrovitroparis……………….....…….13
Figura 2. Protocormos iniciales de orquídeas Cattleya sp……………………..….16
Figura 3. Medio de cultivo Murashige y Skoog…………………………………...…17
Figura 4. Porcentaje de mortalidad………………………………………...…………20
Figura 5. Número de brotes de orquídea Cattleya sp. obtenidos en los
tratamientos………………………………………………...……………….…….….….21
Figura 6. Tallas de las vitroplantas de la orquídea Cattleya sp. obtenidas en los
tratamiento……………………………………………………………………….......…..23
Figura 7. Ancho de las hojas de la orquídea Cattleya sp. en cada
tratamientos…………...………………………………………………………….......…24
Figura 8. Longitud de las raíces de la orquídea Cattleya sp. en cada
tratamientos………..…………………………………………………..………….....….25
Figura 9. Toma de datos…………………………………………………..….........….48
Figura 10. Registrando la talla de las Vitroplantas……………..………....….....…48
Figura 11. Tratamiento 150 mg / 250 mL…………………………..………..………49
Figura 12. Vitroplantulas desarrollada……………..………………………………...49
Figura 13. Vitroplantas de orquídeas in vivo……………………………..….………50
Figura 14. Plántulas de orquídeas cattleya sp aclimatadas en sustrato
de pomina in vivo……………………………………………………..…………………50
1
1. INTRODUCCIÓN
Las orquídeas han fascinado al mundo durante siglos y han sido
consideradas como flores místicas, algunos pueblos primitivos también las han
utilizado con fines medicinales. En la antigua Grecia eran vistas como un símbolo
de virilidad. Actualmente, debido a su belleza y al elevado costo que pueden
alcanzar, las orquídeas son motivo de cultivo por particulares e industriales como
flor cortada como planta ornamental y muchas llegan a tener una importancia
económica aún a nivel mundial (Giap et al., 2015). Sus flores poseen formas
extrañas y exóticas al tiempo que supone un reto cultivar y hacer florecer año tras
año a determinadas especies.
Las orquídeas como regla general tienen un aspecto herbáceo, aunque las
hay en una variadísima gama de formas, ello se debe principalmente a su clima y
hábitats característicos en su ambiente natural (Gil et. Al., 2007).
El gran valor comercial que poseen ciertas especies de orquídeas ha
determinado el saqueo indiscriminado de individuos silvestres, y a la vez la falta de
conocimientos en el cultivo de estas plantas ha sido causa de grandes pérdidas de
material valioso, con la consecuente erosión genética (Placencia, 2009).
Teofrasto (375 A.C), un discípulo de Aristóteles, dio el nombre de
orquídeas a estas plantas; el nombre proviene del Griego Orchis, cuyo significado
es “testículo” y se refriere a la similitud que presentan por la forma de sus
pseudobulbos. En la actualidad, éstas conforman las Orchidaceae y están
consideradas entre las familias que poseen la mayor diversidad de especies entre
las plantas vasculares. Se estima que existen alrededor de 35.000 especies de
2
orquídeas en todo el mundo, pertenecientes a unos 750 géneros (Jardín Botánico
Lankester, 2000). Ecuador es un país megadiverso, cuenta con 227 géneros y más
de 4.000 especies (Dodson, 2004).
1.1 GENERO CATTLEYA SP.
La orquídea Cattleya sp crece en forma epífita o algunas veces sobre rocas,
con flores muy virtuosas y de mayor tamaño, presenta una variedad enorme de
formas y colores desde el blanco puro hasta colores muy oscuros. Es una especie
de orquídea nativa de la región amazónica del Ecuador, que además se encuentra
en Venezuela, Colombia, Perú, Bolivia y Brasil, en bosques húmedos montanos en
elevaciones alrededor de 200 a 700 metros. Su crecimiento se da en climas
cálidos y fríos, florece en la primavera y principios de verano. (Maretzki y Hiraki,
1980).
Taxonomía del género Cattleya sp.
Phylum: Euphyta
División: Magnoliophyta
Clase: Liliopsida
Orden: Asparagales
Familia: Orchidaceae
Género: Cattleya sp
Fuente: (L. LINDEN Y RCHB.F, 1860)
Los cambios globales están implicando transformaciones substanciales en
todas las actividades humanas, inclusive en la forma cómo la agricultura es
practicada. Por tanto, la agricultura moderna será un sinónimo de la agricultura
3
científica. En un futuro cercano, la competitividad del agronegocio y el desempeño
de la actividad florícola ecuatoriana, serán total e irreversiblemente dependientes
de la capacidad científica y tecnológica del país.
La biotecnología ofrece alternativas rápidas y eficientes para la multiplicación
de plantas. La obtención de cultivares tolerantes a factores adversos, o portadores
de atributos que superen al donante, principalmente en cuanto a la calidad y el
rendimiento, son algunas de las problemáticas en las que las herramientas
biotecnológicas han sido aplicadas exitosamente.
Según Valerín (2005), el éxito de la técnica de cultivo de tejidos vegetales
como un instrumento en la propagación masiva de plantas, depende de la
capacidad para manejarlas a gran escala durante el periodo de adaptación en el
vivero, de esta manera se logra un alto grado de sobrevivencia a bajo costo.
Se ha demostrado que el tiempo, la mano de obra y el espacio, se pueden
reducir hasta más de la mitad del que toman los métodos tradicionales. Sin
embargo, la regeneración es el proceso fundamental para poder aplicar cualquiera
de los métodos y usos de nutrientes al cultivo in vitro.
El cultivo in vitro se hace en frascos cerrados y en condiciones controladas y
estériles. El sustrato de cultivo conocido normalmente como medio de cultivo a de
contener los elementos necesarios que contienen una solución de sales que
aportan con macro y micronutrientes esenciales acompañados por vitaminas,
reguladores de crecimiento, aminoácidos y una fuente de carbono (George et al.,
4
2008). Para que las plantas pueda crecer lo suficiente, para después ser
trasplantadas al sustrato definitivo.
El cultivo de tejidos vegetales consiste en un grupo de técnicas por medio de
las cuales se pueden obtener plantas a partir de una porción vegetal con
crecimiento activo de una planta donante; a esta porción se le denomina “explante”.
Su tamaño generalmente es pequeño, ocasionalmente microscópico y su
manipulación debe ser bajo condiciones de laboratorio aséptico e inoculado en
medios de cultivo apropiados, bajo condiciones ambientales controladas (Pachón,
2008).
Los medios nutritivos empleados en los cultivos de tejidos fueron
establecidos a partir de las exigencias internas de las plantas, con modificaciones
para atender las necesidades específicas in vitro. Así mismo, varios compuestos
son adicionados para suprimir las necesidades metabólicas, energéticas y
estructurales de las células, ya que las mismas vías bioquímicas básicas que
operan en las plantas son mantenidas en los cultivos in vitro (Stancoto, 2008).
La mayoría de las especies existentes en los bosques, como es el caso de
orquídeas, están sufriendo un proceso de disminución de sus poblaciones debido a
factores antropogénicos como tala y quema, así como la extracción de minerales,
alterando su hábitat natural. Cattleya sp. es una orquídea cuyas poblaciones son
depredadas y comercializadas ilegalmente, por lo que se considera que podría
llegar a desaparecer. Esta situación se podría compensar aplicando técnicas de
propagación in vitro a partir de explantes, siempre y cuando aseguremos su
5
reproducción en cantidades adecuadas y las plantas propagadas serían
distribuidas a viveros. Por tal motivo, en la presente tesis se plantea la búsqueda
de la dosis apropiada de quitosano y agua de coco que adicionada al medio de
cultivo in vitro, permita el desarrollo óptimo de Cattleya sp.
1.2 QUITOSANO
El quitosano es un compuesto biodegradable y no tóxico, es un polímero
policatiónico que contiene más de 5000 unidades de glucosamina, es un
compuesto derivado de la quitina en forma parcialmente desacetilada 2-amino2-
deoxy-β-D-glucosa (Pastor de Abram, 2004). Sus cargas positivas le confieren
numerosas propiedades fisiológicas y biológicas, con un gran potencial y amplio
intervalo de uso en la industria farmacológica, médica y agrícola (Liu et al., 2004;
Bautista et al., 2005).
La interacción de quitosano-membrana genera afectaciones en la integridad
de membrana e inclusive se ha observado en bicapas de lípidos y provoca la
formación transitoria de agujeros por donde podrían liberarse proteínas (Hong et
al., 2006).
Un estudio más reciente, relacionado con el crecimiento de tejidos vegetales,
ha mostrado que el origen del quitosano es un aspecto importante. Los quitosanos
procedentes de hongos necesitarán de dosis menores para la inducción de la
diferenciación de tejidos de plantas de orquídeas por dos razones: (a) la presencia
natural de quitosano en las paredes celulares no genera efectos adversos para el
6
microorganismo y (b) las interacciones electrostáticas del quitosano añadido
(exógeno), cargado positivamente, deberían verse menos favorecidas con paredes
celulares que poseen quitosano endógeno que cuando éstas poseen material con
cargas negativas que los oligómeros procedentes de caparazones de camarones
(Nge et al., 2006).
La quitina obtenida del exoesqueleto de camarones y cangrejos tiene una
estructura cristalográfica, en la que las cadenas principales están ordenadas en
agregados antiparalelos que les permite formar puentes de hidrógenos
intermoleculares muy fuertes, mientras que la procedente de las plumas de calamar
tiene una estructura b, con las cadenas ordenadas en arreglos paralelos y fuerzas
intermoleculares más débiles (Tolaimate et al., 2000). Además, estudios
demuestran que el quitosano estimula el crecimiento del ancho de la hoja de la
orquídea (Molina, 2012).
En lo que se refiere a Latinoamérica el uso de estos biomateriales en el área
de la agricultura se puede vislumbrar un panorama prometedor a corto y mediano
plazo. En primer lugar, algunos cálculos han estimado que la región genera
material quitinoso que permitiría producir quitina y quitosano en cantidad suficiente
para satisfacer más allá de la demanda mundial actual. En segundo término, ya
existen en la región varias empresas que producen y comercializan quitina y
quitosano, un paso importante para comenzar a garantizar el abastecimiento local
de estos productos, lo que obviamente dependerá de los vaivenes del mercado
internacional (Alvarado, 2008).
7
1.3 AGUA DE COCO
En cocos tiernos, técnicamente el líquido es uno de los nutrimentos más
puros y alimenticios que nos provee la naturaleza. Es una bebida a la cual se le
atribuyen muchas virtudes por su elevado contenido en sales minerales, vitaminas
y carbohidratos. Fue utilizada durante la segunda Guerra Mundial como sustituto
del suero glucosado, es una bebida isotónica natural con el mismo equilibrio
electrolítico que nuestra sangre, es el líquido de la vida por así decirlo afirma
(Satín, 2001).
1.3.1. COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS EN EL AGUA DE COCO:
Tabla 1. Composición de aminoácidos en el agua de coco
AMINOÁCIDOS
PORCENTAJE DE
PROTEÍNA TOTAL
Alanina 2.41
Arginina 10.75
A. aspártico 3.60
Cisteína 0.97-1.17
A. glutámico 9.76-14.5
Histidina 1.85-2.05
Leucina 1.95-4.18
Lisina 1.95-4.57
Prolina 1.21-4.12
Fenilalanina 1.23
Serina 0.59-0.91
Tirosina 2.83-3.00
8
1.4. PRINCIPALES COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO
Son combinaciones de sustancias químicas que los investigadores han
descrito después de numerosos experimentos y que permiten que las plantas
crezcan y se multipliquen in vitro (López, 1990).
Sales inorgánicas: Mezcla de macronutrientes y micronutrientes. Se han
llevado a cabo muchas investigaciones con el fin de optimizar las
necesidades de plantas específicas, lo cual ha traído como consecuencia la
formulación de varias mezclas salinas.
Los compuestos orgánicos: Se clasifican en tres grupos: Carbohidratos,
sustancias hormonales y vitaminas.
Carbohidratos: La sacarosa es la fuente de carbono más ampliamente usada
y se emplea a una concentración de 2 a 3 %; sin embargo, en ciertas
especies se emplean concentraciones muy elevadas.
Sustancias hormonales: Auxina. El nombre auxina (del griego auxein=
crecer) fue dado a la sustancia reguladora de crecimiento producida en el
ápice del coleóptilo de avena. Sin embargo, en la actualidad se sabe que
las auxinas están universalmente presentes en las plantas superiores. Se
piensa que AIA (ácido indol-3-acético) es la principal auxina en las plantas
superiores, aunque existen otras sustancias que tienen actividad auxínica.
Citoquininas. El nombre genérico de las citocininas es empleado para
aquellas sustancias químicas que pueden estimular principalmente la
división celular o citocinesis. Casi todas las citocininas conocidas, tanto
naturales como sintéticas son derivados de la adenina, en los cuales el
grupo amino lleva determinados sustituyentes en la posición 6.
9
2. ANTECEDENTES
En términos generales, la aplicación de quitosano ha mostrado efectos
positivos en el crecimiento de las plantas, tanto en la estimulación de la
germinación de semillas como en el crecimiento de raíces, retoños y hojas. En
algunos casos, se ha observado que la estimulación de la germinación de semillas
por tratamiento con quitosano ha logrado elevar el porcentaje de germinación a los
niveles requeridos para la certificación (Bhaskara et al., 1999).
Sardi L. et al., 2007. En su trabajo realizado, germinación y crecimiento en
orquídea Epidendrum secundum, con productos naturales (agua de coco y plátano
verde), a la medida de cuatro y cinco meses de observación se demostró
superiores resultados en el medio de agua de coco más plátano con MS (1,74 cm)
y coco con el plátano (1,18 cm). En cuanto al crecimiento de hojas, el agua de
coco más MS obtuvo las plantas con mayor número de hoja esto puede deberse a
la presencia de auxina en el agua de coco las cuales estimulan el crecimiento de
los ápices de las hojas. La concentración de los productos naturales pudo influir en
los resultados de germinación, crecimiento, enraizamiento y numero de hojas,
debido a la cantidad de agua de coco utilizada (30 mL 𝐿−1 ) fue una nueva prueba
en el medio para orquídea.
Investigaciones de Vargas (2012) señala que la utilización de agua de coco
al medio de cultivo al agregar 500 mL de agua de coco al medio de cultivo, a los 80
días después de la siembra hubo un crecimiento de 7.44 mm en la hoja y una
10
longitud en la raíz de 5.91 mm. La adición al medio de cultivo agua de coco influyo
de manera positivo al crecimiento de las plántulas ayudando en el desarrollo de la
hoja y raíces de las vitroplántulas.
Molina (2012) comprobó que el empleo del quitosano provocó un incremento
significativo del número de hojas, y altura de las vitroplantas con un valor
significativamente superior cuando se empleó la mayor dosis, lográndose 6.88
hojas por planta, superior estadísticamente a los tratamientos donde se emplea
300mg.ha-1 de quitosano con un promedio de 5,08 y 4,66 hojas por planta,
respectivamente, se obtuvo una altura de 8,4 cm, se aprecia resultados favorables
al incrementar mayor dosis de quitosano estimulando el vigor de la misma.
Rojas D. (2015) utilizó agua de coco en la propagación in vitro de la orquídea
Phalaenopsis violácea a través de la vara floral, obteniendo la mejor longitud en
raíces (1.6 cm) al añadir un 12% de agua de coco al medio de cultivo Murashige
Skoog.
11
3. HIPÓTESIS
HO: El uso de quitosano y agua de coco, no tendrá un efecto positivo
sobre el crecimiento in vitro de explantes de la orquídea Cattleya sp.
HA: El uso de quitosano y agua de coco, tendrá un efecto positivo sobre el
crecimiento in vitro de explantes de la orquídea Cattleya sp
12
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Investigar la dosis apropiada de quitosano y agua de coco para el desarrollo in
vitro en la orquídea Cattleya sp.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Evaluar el efecto de la adición de quitosano y agua de coco en el cultivo in vitro
de la orquídea Cattleya sp sobre el número de brotes, talla y ancho de hoja y
longitud de raíces.
Obtener vitroplantas de orquídeas Cattleya sp. Listas para su endurecimiento y
aclimatación in vivo.
13
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. ÁREA DE ESTUDIO
Figura 1. Ubicación geográfica del laboratorio Agrovitroparis.
La presente investigación se llevó a cabo en el laboratorio de cultivos de
tejidos in vitro AGROVITROPARIS, ubicada en:
Provincia: Guayas
Cantón: Daule
Dirección: Av. Piedrahita y Jaime Roldós, Mz. 434
Latitud Sur: 1º 51' 37,77" S (613866.52 UTM)1/
Longitud Occidental: 79º 58' 34,42" W (9794326.09 UTM)1/
Número telefónico: 042797639
14
5.1.1. Datos geográficos:
La empresa está localizada al noreste del cantón, a una altitud de 15
m.s.n.m y en un terreno de topografía plana.
5.1.2. Datos climáticos:
La temperatura media anual es de 28°C, tiene una precipitación media anual
de 1607,86 mm y una humedad relativa anual de 76%. (Fuente:
http://www.mundivideo.com/coordenadas_chrome.htm. 2014)
5.1.3. Duración del experimento
Se inició durante los meses de junio a diciembre del 2015.
5.2. DISEÑO EXPERIMENTAL
Se evaluaron 5 variables: Número de brotes de las vitroplantas, tallas de las
vitroplantas, ancho en la parte central de la hoja, longitud de raíces e índice de
mortalidad. El diseño experimental consta de 5 tratamientos, 5 dosis de quitosano
y agua de coco adicionado a un medio de cultivo estándar y 15 repeticiones por
tratamiento.
Previo a los ensayos se realizaron pruebas de crecimiento con el fin de evaluar el
desarrollo de los protocormos y la elección de las dosis a utilizar. Los medios de
cultivo utilizados fueron:
Medio de cultivo estándar sin agua de coco y quitosano
Medio de cultivo estándar con agua de coco
Medio de cultivo estándar con quitosano
15
5.3. ETAPA DE CULTIVO
Fase Ɩ. Iniciación (siembra o cultivo inicial).
Fase II. Multiplicación de brotes.
Fase III. Enraizamiento
5.4. MEDIO DE CULTIVO
Se utilizó el medio de cultivo Murashige y Skoog (ANEXO 1), suplementado
con quitosano y agua de coco, utilizando cinco tratamientos (Tabla 2).
Tabla 2. Dosis de quitosano y agua de coco utilizadas en el medio de cultivo
Tratamientos Agua de coco
(mL)
Quitosano (mg)
T1 50 50
T2 100 80
T3 150 100
T4 200 125
T5 250 150
5.5. MATERIAL VEGETAL
Se utilizó explantes de orquídeas de Cattleya sp. en etapa de protocormos
(Fig. 2).
16
Figura 2. Protocormos iniciales de orquídeas
Cattleya sp
5.6. CONDICIONES AMBIENTALES
Fase I y II. Intensidad lumínica de 1 000 hasta 2 000 luxes, temperatura de
26°C ± 2°C, fotoperiodo 16/8 horas de iluminación, humedad relativa de 80 a
90 %.
Fase III: Intensidad lumínica de 8 000 a 10 000 luxes, temperatura de 26°C ±
2°C, fotoperiodo 16/8 horas de iluminación, humedad relativa de 80 a 90 %.
5.7. METODOLOGÍA DE LA SIEMBRA
El medio de cultivo (Fig. 3) se dispensó en frascos de 200 mL con 20 mL del
medio, se taparon con papel aluminio y se esterilizaron en autoclave a 1 Kg/cm2 de
presión durante 5 minutos.
17
Figura 3. Medio de cultivo
Murashige y Skoog
A cada frasco se les inoculó una pequeña cantidad de los protocormos
expandidos en la parte superior del mismo. La base del protocormo quedó
"sentada" sobre la superficie del medio de cultivo del frasco aséptico. El frasco se
tapó con papel aluminio y se transfirió al cuarto de incubación.
5.8. VARIABLES A MEDIRSE.
5.8.1. Número de brotes de las vitroplantas
Los brotes de cada uno de los tratamientos se contaron visualmente a los 30
días de la siembra.
5.8.2. Tallas de las Vitroplantas
Las tallas de las vitroplantas de cada uno de los tratamientos se midieron a
los 60 días de siembra, con la ayuda de un calibrador Vernier, desde la parte basal
hasta el ápice de la hoja.
18
5.8.3. Ancho en la parte central de la hoja y longitud de raíces
A los 120 días de la siembra, se midió el ancho de las hojas y la longitud de
raíces con la ayuda de un calibrador Vernier.
5.8.4. Aclimatación
Una vez establecidos los mejores resultados, las vitroplantas se sembraron
en sustrato de pomina para su endurecimiento y aclimatación in vivo. (Anexo 4,
Fig.12).
5.9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE LA PRUEBA DE TUKEY 5%
Para conocer si existían diferencias estadísticas significativas entre los cinco
tratamientos de quitosano ** y agua de coco * (T1: 50 mg**50 ml*; T2: 80 mg**100
ml*; T3: 100 mg**150 ml*; T4: 125 mg**200 ml*; T5: 150 mg**250 ml*) con 15
repeticiones, se realizó un diseño experimental al azar, se comparó mediante el
Análisis de varianza de un factor (ANOVA) utilizando el programa estadístico
InfoStat/E licencia estudiantil. Las comparaciones de las medias de los
tratamientos se las realizó mediante la prueba de Tukey con un 95% de
significancia.
19
6. RESULTADOS
6.1. ENSAYOS PREVIOS
6.1.1 Medio de cultivo estándar sin agua de coco ni quitosano.
A los 30 días no hubo ningún crecimiento, a los 90 días un pequeño brote, a
los 120 días se obtuvo una altura de 0,3 cm sin hojas ni raíz.
6.1.2 Medio de cultivo estándar con agua de coco.
A los 30 días no hubo ningún crecimiento, a los 60 días un pequeño brote, a
los 120 días se obtuvo una altura de 1,4 cm con dos pequeñas hojas de 0,28 cm de
ancho y una raíz 0,90 cm.
6.1.3 Medio de cultivo estándar con quitosano.
A los 30 días no hubo ningún crecimiento, a los 60 días un pequeño brote, a
los 120 días se obtuvo una altura de 1,8 cm con tres pequeñas hojas de 0,40 cm de
ancho y una raíz 1,20 cm.
20
6.2. ÍNDICES DE MORTALIDAD
De los resultados obtenidos se observó un mayor porcentaje de mortalidad
en los tratamientos con menor cantidad de quitosano y agua de coco. El
tratamiento T1 presentó un 20% de mortalidad, T2 un 10.5%, T3 con un 13.64%,
T4 con 3.23% y T5 con 2.86% (Fig. 4).
Figura 4. Porcentaje de mortalidad
20,00%
10,53%
13,64%
3,23% 2,86%
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
Tratamiento
% M
ort
alid
ad
** Quitosano * Agua de Coco
T1 T2 T3 T4 T5
21
6.3. NÚMEROS DE BROTES
Los tratamientos T4 y T5 produjeron el mayor número de brotes (Fig. 5,
Anexo 2, Tabla 1) encontrándose diferencias significativas con los demás
tratamientos (p>0.05).
Figura 5. Número de brotes de orquídea Cattleya sp. obtenidos en los
tratamientos.
Para poder determinar los porcentajes de diferencia que existe entre los
tratamientos, es necesario utilizar un método estadístico denominado:
Números Índices, el cual consiste de un número que expresa el cambio relativo en
longitud comparado con un promedio que lo tomamos como base. La base o
15
19
22
31
35
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Nú
mer
o B
rote
s
T1 T2 T3 T4 T5
22
promedio siempre debe ser el promedio menor del tratamiento y ese equivale al
cien por ciento (100%) (Lind, Marchal y Wathen, 2008).
De esta manera podemos determinar el porcentaje de los diferentes tratamientos,
haciendo la siguiente relación:
X1= 1 X5 X4 X3 X2 X1 1 100%
X2= 1,27 2,33 2,07 1,47 1,27 1 x= 1,27
X3= 1,47 x= 1,47
X4= 2,07 233% 207% 147% 127% 100% x= 2,07
X5= 2,33 26% 20% 27% x= 2,33
Hay significancia entre los tratamientos, entre el T1 y T2 se obtuvo un 27%,
entre T2 y T3 del 20%, entre el T4 y T5 del 26%, existiendo una diferencia
significativa entre los tratamientos (Anexo 3, Tabla 1).
6.4. TALLAS DE LAS VITROPLANTAS
Con respecto al desarrollo caulinar de las vitroplantas, se encontró que a
mayor dosis de quitosano y agua de coco, los explantes alcanzaron mejor
desarrollo. Las mejores tallas se obtuvieron con los tratamiento T4 (2.3 cm) y T5
(2.8 cm) (Fig. 6, Anexo 2, Tabla 2), encontrándose diferencias significativas con los
demás tratamientos (p>0.05).
23
Figura 6. Tallas de las vitroplantas de la orquídea Cattleya sp. obtenidas en los
tratamientos
Entre los tratamientos T1 y T2 no hay diferencia significativa, entre los
tratamiento T2 y T3 hay una diferencia del 18%, el tratamiento T4 y T5 tuvo 54%
más de crecimiento presentando una diferencia del 36% en la talla de las
vitroplantas (Anexo 3, Tabla 2).
1
1,4
1,6
2,3
2,8
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Pro
medio
de las ta
llas (
cm
)
T1 T2 T3 T4 T5
24
6.5. ANCHO DE LAS HOJAS
La presencia de hojas bien desarrolladas se observó al cabo de los 120 días
después de la siembra in vitro, las hojas presentaron un brillo intenso y un verde
muy asentado. El mayor ancho de la hoja fue de 1.02 cm, éste se obtuvo con el
tratamiento T5; lográndose los mayores valores, no así los explantes que contenían
los tratamientos T1, T2 y T3, con menos dosis de quitosano y agua de coco
tuvieron menor ancho de hoja (Fig. 7, Anexo 2, Tabla 3). Se encontraron
diferencias estadísticas entre los tratamientos T4 y T5 del 54% con los demás
tratamientos (p>0.05), los tratamientos T1, T2, T3 obtuvo un 4% no presentando
diferencias estadísticas entre ellos. (Anexo 3, Tabla 3).
Figura 7. Ancho en la parte central de las hojas de la orquídea Cattleya sp. en
cada tratamientos.
0,31
0,42 0,43
0,84
1,02
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Pro
medio
A
ncho d
e h
oja
(cm
)
T1 T2 T3 T4 T5
25
6.6. LONGITUD DE RAÍCES
En cuanto a la longitud de las raíces, no se registraron diferencias
significativas entre los tratamientos T1 (0.83 cm), T2 (1.08 cm), y T3 (1.55 cm). La
mejor longitud de raíces con un promedio de 3.49 cm de largo se obtuvo con el
tratamiento T5 (Fig. 8, Anexo 2. Tabla 4). Lo cual demostró que a medida que se
eleva la dosis de quitosano y agua de coco se produce la elongación radicular de
las vitroplantas. Se evidenció una gran cantidad de raíces largas muy visibles de
color blancas verdosas. Se encontraron diferencias significativas entre los
tratamientos T4 y T5 del 74% con los demás tratamientos (p>0.05). (Anexo 3,
Tabla 4).
Figura 8. Longitud de las raíces de la orquídea Cattleya sp. en cada
tratamientos.
0,83
1,08
1,55
2,78
3,49
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
longitud d
e R
aic
es (
cm
)
T1 T2 T3 T4 T5
26
7. DISCUSIÓN
La mayor dosis de agua de coco y quitosano adicionado al medio de cultivo
produjo los mejores resultados en las variables medidas en la presente
investigación con relación al número de brote, tallas, ancho de la hoja y longitud de
raíces, en lo cual hubo un menor porcentaje de mortalidad.
A los ensayos previos evaluados con diferentes dosis de medio de cultivo se
observó crecimiento, pero al adicionar quitosano y agua de coco hubo un mayor
crecimiento lo que demuestra que estos bioestimulantes ofrecen mayor resultado
para el desarrollo de la vitroplanta.
Con relación al número de brotes se pudo notar que al aplicar mayor dosis
de quitosano y agua de coco se logró tres brotes por frasco, esto pudo deberse a
la presencia de auxina en el agua de coco lo cual estimula el crecimiento. Sardi et
al., (2007) señala que la concentración de los productos naturales influye en los
resultados de germinación de semillas así como en el crecimiento.
La talla de las vitroplantas tuvo resultados menores en comparación con la
investigación de Molina (2012) señalan que, la utilización de la mayor dosis de
quitosano obtuvo una altura de 8.4 cm, resultados mucho mayores que en la
presente investigación donde se obtuvo 3.30 cm de altura. Esto pudo haber sido
causado porque este trabajo se realizó a nivel de laboratorio y de Molina a nivel de
campo abierto, pero concuerda que el quitosano en un buen bioestimulante para el
27
crecimiento de las vitroplantas y al combinar con el agua de coco ejerce un efecto
benéfico.
Investigaciones de Vargas (2012) señalan que la utilización de agua de coco
tuvo un crecimiento de 0.74 cm en la hoja, resultados menores que el de la
presente investigación donde se obtuvo un ancho de hoja de 1.40 cm. Esto pudo
haber sido causado porque este trabajo tuvo como material vegetal protocormos y
Vargas trabajo con semillas y según sus condiciones en el laboratorio, pero
concuerda que la adición de agua de coco al medio de cultivo es un buen
bioestimulante para el crecimiento de las hojas y al combinar con el quitosano
influye de manera positiva al crecimiento de las vitroplantas ayudando el desarrollo
de la hoja.
En la presente investigación al combinar agua de coco y quitosano se obtuvo
raíces con una longitud de 4.50 cm, mientras que Rojas D. (2015) con el uso de
agua de coco observó la aparición de raíces con una longitud de 1.6 cm, con menor
desarrollo. Esto pudo deberse a que Rojas sólo trabajo con agua de coco, por lo
que se demuestra que la combinación de ambos bioestimulantes en el presente
trabajo es un medio muy completo, siendo una respuesta favorable al agregar al
medio de cultivo.
28
8. CONCLUSIONES
Del trabajo experimental realizado, los dos bioestimulante utilizado como
promotores de crecimiento in vitrio de la orquídea Cattleya sp, promovieron
crecimiento en la planta en relación al números de brotes, tallas, ancho de la hoja y
longitud de raíces, trayendo la formación de una planta completa.
El tratamiento T5 (150 mg de quitosano y 250 mL de agua de coco) logró los
mejores resultados en todas las variables evaluadas, debido que se utilizó mayor
dosis de quitosano y agua de coco.
Se obtuvo una planta completa con 3 brotes una altura de 3.30 cm, ancho de
la hoja 1.40 cm y raíces vigorosas de 4.50 cm, con un porcentaje de mortalidad del
2.86%.
Los bioestimulantes quitosano y agua de coco, constituyen una alternativa
favorable en la propagación de la orquídea Cattleya sp, mejorando
significativamente el desarrollo in vitro de la misma en un corto plazo.
29
9. RECOMENDACIONES
Utilizar la presente investigación como referencia para la siembra aséptica
con otras especies de orquídeas de clima tropical y hacerlo extensivo a otros
laboratorios del país.
Realizar estudios a nivel in vitro de otras sustancias químicamente no
definidas como son: puré de banano, jugo de piña etc.
Efectuar otros proyectos con la presencia de quitina.
En futuras investigaciones de orquídeas in vitro utilizar el quitosano y agua
de coco interaccionando con hormonas como TDZ y AIB.
30
9. BIBLIOGRAFÍA.
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Universidad de Guayaquil. 62 p.
36
10. GLOSARIO
ASEPTICO: Aquello que está libre de algún tipo de infección o contaminación.
AUXINAS: Forma parte un grupo de hormonas vegetales (fitohormonas) que
promueven la división y la diferenciación celular.
BIOTECNOLOGÍA: Se refiere a toda aplicación tecnológica que utilice sistemas
biológicos y organismos vivos o sus derivados para la creación o
modificación de productos o procesos para usos específicos
BIODEGRADABLE: Que puede descomponerse en elementos químicos naturales
por la acción de agentes biológicos, como el sol, el agua, las bacterias, las
plantas o los animales.
CULTIVO IN VITRO: Significa hacer el cultivo en recipientes de vidrio bajo
condiciones asépticas en el laboratorio
CITOCINAS: Son proteínas que regulan la función de las células que las producen
u otros tipos celulares.
EXPLANTE: Se refiere a cualquier parte vegetal que ha sido separada de la planta,
que puede ser un tejido (fragmentos de hojas, tallos, raíces, pétalos, etc.).
37
FOTOPERIODO: Tiempo relativo diario luz y oscuridad los que los distintos
organismos se ven sometidos.
FITOHORMONAS: También llamadas hormonas vegetales, son sustancias
producidas por células vegetales en sitios estratégicos de la planta y estas
hormonas vegetales son capaces de regular de manera predominante los
fenómenos fisiológicos de la planta.
GLUCOSAMINA: La glucosamina es un amino-azúcar que actúa especialmente
como precursor en la glicosilación de las proteínas y de los lípidos.
MEDIO DE CULTIVO: Es una solución acuosa en donde se encuentran disueltas
sales minerales que aportan los elementos esenciales para el crecimiento y
desarrollo de los tejidos vegetales in vitrio, Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y
Mg) y Micronutrientes (Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co). Una fuente de carbono,
la sacarosa debido a la escasa actividad fotosintética de los tejido in vitro.
Puede ser enriquecido con Aminoácidos, Vitaminas y Reguladores del
Crecimiento.
PROTOCORMO: Masas de células producidos a partir de la germinación de
embriones de orquídeas.
Ph: Es una medida de la acidez o basicidad de una disolución
VITROPLANTAS: Plantas clonadas en recipientes de laboratorio.
38
11. ANEXOS
ANEXO 1. MEDIO DE CULTIVO MURASHIGE Y SKOOG
Tabla 1. Soluciones necesarias para obtener 1 litro de medio de cultivo
para la siembra de orquídeas.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Tabla 2. Solución stock de vitaminas de Morel
REACTIVO Cant. (g/L)
Mio-inositol 2.000
Ácido icotínico 0.01
Piridoxina 0.01
Thiamine HCL 2x10−3
Glicina 0.04
Sustancias Cantidad
Macroelementos B5 1 mL
Microelementos MS 2 mL
Vitaminas de Morel 2 mL
Agua de coco y quitosano De acuerdo a los
tratamientos
Sacarosa 20 g
BAP 5x10−4g
ANA 2,5x10−5g
Phytagel 1.5 g
Llevar a 1000 mL con agua destilada. Ajustar a pH 4
39
Tabla 3. Solución stock de micronutriente de MS 1962
8.
9.
10.
Tabla 4. Solución stock macronutriente B5.
REACTIVO Cant. (g/L)
K N𝑶𝟑. 𝑯𝟐0 2.500
Ca C𝒍𝟐. 2𝑯𝟐0 0.15
Mg S𝑶𝟒. 7𝑯𝟐0 0.25
(N𝑯𝟒)𝟐 S𝑶𝟒 0.134
N𝒂𝟐 EDTA 0.0373
Fe S0. 7𝑯𝟐0 0.0278
REACTIVO Cant. (g/L)
𝑯𝟑 B𝑶𝟑 1.24
Mn S𝑶𝟒. 7𝑯𝟐O 3.38
Zn S𝑶𝟒. 7 𝑯𝟐O 1.72
KI 0.166
N𝒂𝟐2Mo0. 2𝑯𝟐0 0.05
Cu S𝑶𝟒. 5𝑯𝟐0 5x10−3
Co C𝒍𝟐. 6𝑯𝟐0 5x10−3
40
ANEXO 2. RESULTADOS DE LAS DIFERENTES VARIABLES EVALUADAS
Tabla 1. Números de brotes de los diferentes tratamientos
Número de Brotes
# Muestras Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4 Tratamiento 5
1 1 1 1 3 3
2 1 1 2 2 2
3 2 1 1 1 3
4 1 2 0 3 2
5 1 2 2 2 2
6 2 1 2 3 2
7 1 0 2 3 0
8 0 2 2 2 3
9 1 1 0 1 2
10 1 2 0 3 3
11 2 0 2 2 3
12 0 2 2 3 3
13 0 1 3 0 2
14 1 2 2 1 3
15 1 1 1 2 2
∑ Total 15 19 22 31 35
41
Tabla 2. Tallas de las vitroplantas de los diferentes tratamientos
Tallas de las Vitroplantas (cm)
# Muestra Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4 Tratamiento 5
1 1,30 1,80 2,00 2,60 2,80
2 1,20 1,50 2,10 2,40 2,80
3 1,40 1,60 2,00 2,20 3,10
4 1,10 1,60 0,00 2,70 2,80
5 1,50 1,80 2,10 2,60 2,90
6 1,30 1,60 1,30 2,40 3,00
7 1,40 0,00 1,80 2,10 0,00
8 0,00 1,80 2,10 2,10 3,00
9 1,00 1,80 0,00 2,80 3,30
10 1,20 1,40 0,00 2,60 3,00
11 1,00 0,00 2,10 2,40 3,00
12 0,00 1,60 2,30 2,50 3,20
13 0,00 1,60 1,80 0,00 3,00
14 1,50 1,50 2,00 2,10 3,10
15 1,00 1,40 2,00 2,60 3,20
Promedio 0,99 1,40 1,57 2,27 2,81
42
Tabla 3. Ancho en la parte central de la hoja de los diferentes tratamientos
Ancho de la parte central de las hojas (cm)
# Muestras Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4 Tratamiento 5
1 0,40 0,40 0,50 0,80 1,40
2 0,30 0,50 0,60 0,90 1,20
3 0,40 0,50 0,50 0,80 1,10
4 0,30 0,60 0,00 1,00 1,20
5 0,30 0,40 0,40 1,00 1,00
6 0,30 0,50 0,50 0,80 1,00
7 0,40 0,00 0,60 0,90 0,00
8 0,00 0,40 0,60 0,80 1,00
9 0,40 0,50 0,00 0,70 1,30
10 0,40 0,50 0,00 0,90 1,10
11 0,50 0,00 0,50 0,90 0,90
12 0,00 0,50 0,50 1,00 1,00
13 0,00 0,50 0,60 0,00 0,80
14 0,50 0,50 0,50 1,10 1,00
15 0,40 0,50 0,60 1,00 1,30
Promedio 0,31 0,42 0,43 0,84 1,02
43
Tabla 4. Longitud de raíces de los diferentes tratamientos
Longitud de raíces (cm)
# Muestra Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4 Tratamiento 5
1 0,90 1,50 1,80 2,80 4,40
2 0,60 1,20 2,00 3,20 4,10
3 1,00 1,30 1,80 2,80 3,80
4 1,00 1,40 0,00 3,00 3,90
5 1,20 1,40 2,20 3,00 3,60
6 0,90 1,20 1,90 2,60 3,80
7 1,00 0,00 1,80 3,30 0,00
8 0,00 1,30 1,80 3,20 3,80
9 0,90 1,40 0,00 2,90 4,00
10 0,80 1,00 0,00 2,90 3,60
11 1,20 0,00 2,20 2,70 3,20
12 0,00 1,10 1,80 2,90 3,00
13 0,00 1,10 2,00 0,00 3,20
14 1,30 1,10 1,90 3,20 3,50
15 1,60 1,20 2,10 3,20 4,50
Promedio 0,83 1,08 1,55 2,78 3,49
44
ANEXO 3. ANÁLISIS DE VARIANZAS
Tabla 1. Análisis de varianza en Números de brotes.
Análisis de varianza de un factor
RESUMEN
Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza
50mg**50ml* 15 15 1 0,42
80mg**100ml* 15 19 1,26 0,49
100mg**150ml* 15 22 1,46 0,83
125mg**200ml* 15 31 2,06 0,92
150mg**250ml* 15 35 2,33 0,66
ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las variaciones
Suma de cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados
F Probabilidad Valor crítico para F
Entre grupos 18,6 4 4,65 6,94 9,15 2,50
Dentro de los grupos
46,9 70 0,67
Total 65,54 74
Test: Tukey Alfa=0,05
Error: 0,6705 gl: 70
Tratamiento Medias n E.E.
1 1 15 0,21 A
2 1,27 15 0,21 A B
3 1,47 15 0,21 A B
4 2,07 15 0,21 B C
5 2,33 15 0,21 C
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
45
Tabla 2. Análisis de varianza Tallas de las vitroplantas
Análisis de varianza de un factor
RESUMEN
Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza
50mg**50ml* 15 14,9 1,0 0,3
80mg**100ml* 15 21 1,4 0,3
100mg**150ml*
15 23,6 1,6 0,7
125mg**200ml*
15 34,1 2,3 0,4
150mg**250ml*
15 42,2 2,8 0,6
ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las variaciones
Suma de cuadrado
s
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados
F Probabilidad Valor crítico para F
Entre grupos 32 4 8 16 1,7 2,50 Dentro de los grupos
34 70 0,5
Total 66 74
Test: Tukey Alfa=0,05
Error: 0,4841 gl: 70
TRATAMIENTO
Medias n E.E.
1 0,99 15 0,18 A 2 1,40 15 0,18 A 3 1,57 15 0,18 A 4 2,27 15 0,18 B 5 2,81 15 0,18 B
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
46
Tabla 3. Análisis de varianza del Ancho central de la hoja
Análisis de varianza de un factor
RESUMEN
Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza
50mg**50ml* 15 4,6 0,31 0,03
80mg**100ml* 15 6,3 0,42 0,03
100mg**150ml* 15 6,4 0,43 0,05
125mg**200ml* 15 12,6 0,84 0,07
150mg**250ml* 15 15,3 1,02 0,11
ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las variaciones
Suma de cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados
F Probabilidad Valor crítico para F
Entre grupos 5,74 4,00 1,43 25,21 5,94 2,50 Dentro de los grupos
3,98 70,00 0,06
Total 9,72 74,00
Test: Tukey Alfa=0,05
Error: 0,0569 gl: 70
Tratamiento Medias n E.E. 1 0,31 15 0,06 A 2 0,42 15 0,06 A 3 0,43 15 0,06 A 4 0,84 15 0,06 B 5 1,02 15 0,06 B
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
47
Tabla 4. Análisis de varianza Longitud de las raíces
Análisis de varianza de un factor
RESUMEN
Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza
50mg**50ml* 15 12,4 0,83 0,24
80mg**100ml* 15 16,2 1,08 0,21
100mg**150ml* 15 23,3 1,55 0,67
125mg**200ml* 15 41,7 2,78 0,63
150mg**250ml* 15 52,4 3,49 1,11
ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las variaciones
Suma de cuadrados
Grados de
libertad
Promedio de los
cuadrados
F Probabilidad Valor crítico para
F Entre grupos 78,70 4,00 19,68 34,41 7,17 2,50
Dentro de los grupos
40,02 70,00 0,57
Total 118,73 74,00
Test: Tukey Alfa=0,05
Error: 0,5718 gl: 70
Tratamiento Medias n E.E.
1 0,83 15 0,2 A
2 1,08 15 0,2 A
3 1,55 15 0,2 A
4 2,78 15 0,2 B
5 3,49 15 0,2 B
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
48
ANEXO 4. REGISTRO FOTOGRÁFICO
Figura 9. Toma de datos.
Figura 10. Registrando la talla de las Vitroplantas.
49
Figura 11. Tratamiento 150mg/250ml.
Figura 12. Vitroplantulas desarrolladas.
50
Figura 13. Vitroplantas de orquídeas in vivo.
Figura 14. Plántulas de orquídeas cattleya sp aclimatadas en sustrato
de pomina in vivo