UNIVERSIDAD DE GRANADA

PROGRAMA OFICIAL DE DOCTORADO EN NUTRICIÓN HUMANA

Estudio experimental del efecto de ingredientes

alimentarios funcionales sobre la ingesta de alimento, peso

corporal y utilización digestiva y metabólica de nutrientes.

Posible utilización en dietas para sobrepeso y obesidad

Experimental study of the effect of functional food ingredients on food

intake, body weight and digestive and metabolic utilization of nutrients.

Possible application in diets for overweight and obesity

Tesis doctoral con Mención Internacional presentada por:

Jesús Manuel Alcalá-Bejarano Carrillo

Bajo la dirección de los doctores:

Emilio Martínez de Victoria Muñoz

María Dolores Yago Torregrosa

Mariano Mañas Almendros

Universidad de Granada Departamento de Fisiología

Facultad de Farmacia

Instituto de Nutrición y Tecnología de los

Alimentos “José Mataix Verdú”

Editor: Universidad de Granada.Tesis Doctorales Autor: Jesús Manuel Alcalá-Bejarano Carrillo ISBN: 978-81-9125-042-5 URI: http://hdl.handle.net/10481/39873 

D. Emilio Martínez de Victoria Muñoz, Catedrático del Departamento de Fisiología de

la Universidad de Granada.

Dña. María Dolores Yago Torregrosa, Profesora Titular del Departamento de Fisiología

de la Universidad de Granada.

D. Mariano Mañas Almendros, Catedrático del Departamento de Fisiología de la

Universidad de Granada.

Informan:

Que el trabajo titulado “Estudio experimental del efecto de ingredientes alimentarios

funcionales sobre la ingesta de alimento, peso corporal y utilización digestiva y

metabólica de nutrientes. Posible utilización en dietas para sobrepeso y obesidad” ha

sido realizado por Jesús Manuel Alcalá-Bejarano Carrillo bajo su dirección y reúne

todos los requisitos para ser defendido y optar al grado de Doctor.

Y para que conste donde proceda, se firma este informe en Granada a 29 de Octubre

de 2014.

D. Emilio Martínez de Victoria Muñoz Dra. Mª Dolores Yago Torregrosa

D. Mariano Mañas Almendros

El doctorando Jesús Manuel Alcalá-Bejarano Carrillo y los directores de la tesis Emilio Martínez de Victoria Muñoz, Maria Dolores Yago Torregrosa y Mariano Mañas Almendros. Garantizamos, al firmar esta tesis doctoral, que el trabajo ha sido realizado por el doctorando bajo la dirección de los directores de la tesis y hasta donde nuestro conocimiento alcanza, en la realización del trabajo, se han respetado los derechos de otros autores a ser citados, cuando se han utilizado sus resultados o publicaciones.

Granada 29/10/2014

Director/es de la Tesis Doctorando

Fdo.: Fdo.:

Este estudio forma parte del proyecto PRONAOS, incluido en el programa CENIT

(Consorcios Estratégicos Nacionales de Investigación Técnica), en el cual colaboran la

empresa Biosearch Life® y la Universidad de Granada.

Nunca te olvides de sonreír, porque

el día en que no sonrías será un día

perdido.

ABREVIATURAS

Ninguna condición es permanente; ninguna condición es fiable;

nada es ser. (Sidartha Gautama)

AA Aminoácido (Amino acid)

AgRP Péptido relacionado con la proteína agoutí (Agouti-Related

Peptide)

AMY Amilina (Amylin)

AP Área postrema (Area postrema)

BAT Tejido adiposo marrón (Brown adipose tissue)

BBB Barrera hematoencefálica (Blood-brain barrier)

BMI Índice de Masa Corporal (Body Mass Index)

BW Peso corporal (Body weight)

CART Transcrito regulado por cocaína y anfetamina (Cocaine and

anphetamine regulated transcript)

CCK Colecistoquinina (Cholecystokinin)

CNS Sistema nervioso central (Central nervous system)

DIO Obesidad inducida por la dieta (Diet-induced obesity)

ENS Sistema nervioso entérico (Enteric nervous system)

EEC Células enteroendocrinas (Enteroendocrin cells)

GIP Péptido insulinotrópico dependiente de glucosa (Glucose-

dependent insulinotropic peptide)

GLP-1 Péptido similar al glucagón-1 (Glucagon-Like Peptide-1)

GP Péptidos Gastrointestinales (Gastrointestinal peptides)

GRN Grelina (Ghrelin)

HFD Dietas con alto porcentaje de grasa (High Fat Diet)

HDC Hidratos de carbono (Carbohydrates)

HOSO Aceite de girasol alto oleico (High oleic sunflower oil)

INS Insulina (Insulin)

IOTF Grupo internacional de trabajo sobre obesidad (International

Obesity Task Force)

i.p. Intraperitoneal (Intraperitoneal)

i.v. Intravenoso (Intravenous)

LEP Leptina (Leptin)

LPB Núcleo lateral parabraquial (Lateral parabrachial nucleus)

NPY Neuropéptido Y (Neuropeptide Y)

NTS Núcleo del tracto solitario (Nucleus Tractus Solitarius)

OGTT Test de tolerancia oral a la glucosa (Oral glucose tolerance test)

POMC Péptido precursor de la Pro-opiomelanocortina (Pro-

opiomelanocortin peptide precursor)

PP Polipéptido pancreático (Pancreatic polypeptide)

PYY Péptido tirosina tirosina (Peptide YY)

T2DM Diabetes mellitus tipo 2 (Type 2 diabetes mellitus)

TG/s Triglicérido/s (Triglyceride/s)

TNFα Factor de necrosis tumoral alfa (Tumor Necrosis Factor-alpha)

WAT Tejido adiposo blanco (White adipose tissue)

WHO Organización Mundial de la Salud (World Health Organization)

AGRADECIMIENTOS

“Como un sueño, todo lo que disfruto se convertirá en recuerdo”

(Sidartha Gautama)

Debería haber otro índice para todas aquellas personas que con su ayuda, ánimo y cariño han contribuido con su granito de arena a esta tesis. Ese índice se guarda en el corazón y día a día se va haciendo más grande y completo, haciéndonos más grandes y mejores. Se cierra una etapa y se inicia otra nueva en la que espero estar acompañado por esas personas y muchas más. Como suele decirse, es de bien nacido...., así que me gustaría dar gracias a las siguientes personas (falta gente que no son menos): M. Carmen y Rafael, las personas que me lo han dado todo y me ha enseñado a esforzarme cada día más y mejor, mi ejemplo a seguir, os quiero.

Rosuchi, Taty, Cuña y Antoñico, sois parte de mí y os quiero como a nada.

A mi familia de Priego, Cataluña y Mallorca, aunque nos veamos de vez en cuando, son el mejor apoyo en los momentos importantes.

Mariano, Dolo y Emilio por confiar en mí, y por todo su esfuerzo y conocimientos para hacer posible esta tesis, me acordaré siempre del día en el que te mandé el correo Dolo!!.

Jesús y Gloria, por sus enseñanzas y sugerencias.

Me gustaría agradecer a la empresa Biosearch S. A, en especial a Mónica, Juristo, Luis y Manuel por su ayuda y la posibilidad de haber desarrollado este proyecto.

Canillo y Lupe, sabéis que soy el tito político del pequeño Elián y que me tenéis aquí para lo que haga falta. A mis biólogos y biólogas, Jarichuelis (y Juanlu), Clau, Elo, Arcas y Emlio, por esos días de excursiones, comedores, estudio, vogue y demás recuerdos. Además a los psicólogos, médicos y sector almeriense, Sasi y Guille, Lili y Diego, Maribélie, Curro, Víctor, Ana, Antonio, Andrés, Vero, Elena y Tomás, Ali y Chema, por esas jamonadas, cumpleaños y bodas..., por todos esos momentos que hemos pasado juntos y que pasaremos.

Cantero y Ali, valéis oro y lo sabéis. Jose, Marta, Mari, Gema, Pere, Edu y Laura, gracias por esos momentos, sabéis que aquí tenéis un amigo. Pape y Gema, en el futuro habrá más días de playa, lo sé. A Mari (Migue) y Pagul, por pasar la cabra “conmiguo”. A mis compis Sandra (y Cris), Laura y Adeline (Pablo y Corentin), por ese año tan bueno y los momentos que hemos pasado. Inesita, cuya sabiduría y bondad no tienen límites. Ameer y Cristina, thanks for all!! A Rafa, sin palabras. A Susana y family, por su ayuda y amistad, os llevo conmigo. A Dory, que sabe que vale millones y seguiré apostando por ello. Carlos y Jo, por ser los mejores guía en tierras frías. Mari Cruz y los warnings!

Estefanía, Josune y Miriam Alejandra, por ser tan apañadas. Dj bedca, por alegrarme el último tramo de la tesis. Vivi y Laura por ser unas máquinas en todos los aspectos. Óscar, por su valiosa amistad. Carola y Belén por ser mis maestras en el laboratorio. Gracias Alba por tu alegría y ayuda. Soto y Miguel, por ser personas como pocas hay. Shailis, solo un poco de relax!

Thanks to the people in CPH for the kind help and the moments that we spent together (Jens, Rune, Nicolai, Mónika, Suku, Bolette, Johanne, Nicolai, Radeck and Weronica, Nicoleta and Pedro).

Al grupo de Farmacia, Chari (Luismi)-Garry-Dani, the perfect team. Anilla y su furor. Elena, Lucía, Irene, Virginia, Pili, Carlos, Gerry, Cristina, y Encarna, por todos esos momentos dentro y fuera del laboratorio.

A mis compañeros y compañeras del CIBM (Puri, Carolina González, Dimas, Azahara, Fran, Ignacio, Julio, Sergio, Erika, Luis, María, Carolina Gómez, Samantha, Marina, Carmen, Angie...), por todos los momentos fuera y dentro del trabajo, vuestra ayuda, apoyo y cariño.

A María, Pilar, Ángel, Chiqui y MD por su ayuda en los momentos cruciales.

A mis compañeros y compañeras del Máster (Roberto, Ana y Viti, Aitor, Olga, Marta y Rodia, Eva, Adrián, Triana, Miriam y Edu...) porque aunque haya distancia, la amistad no se termina.

A los de “Darío” (Elena, Santos, Carolina, Laura, Marta, Huayqui, Carla...), porque vuestro vecino lo seré siempre.

Al personal del CIBM y de Farmacia (Rosa, Charo, Mercedes, Luismi, Toñi, Indalecio, Pablo, Ana vet. y Cristina...), por vuestra simpatía y ayuda en el día a día, que hace pasar los días más a gusto.

ÍNDICE

Un monje le preguntó a Yun Men: “¿Qué son las enseñanzas

de toda una vida?”. Yun Men dijo: “Una declaración

apropiada”. (Los anales del acantilado azul)

JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 31

ANTECEDENTES 35

2. OBESIDAD 37

2.1. DEFINICIÓN, TIPOS, EPIDEMIOLOGÍA Y REPERCUSIONES

SOBRE LA ECONOMÍA 37

2.1.1. Definición 37

2.1.2. Tipos de obesidad 39

2.1.3. Epidemiología 39

Obesidad adulta 39

Obesidad infantil 42

2.1.4. Repercusiones en la economía 45

2.2. ETIOLOGÍA 45

2.2.1. Factores genéticos 45

2.2.2. Factores fisiológicos y ambientales 47

Factores sensoriales

Factores nerviosos

Factores endocrinos

Factores psicológicos

Factores ambientales

2.2.3. Actividad física 48

2.3. EL TEJIDO ADIPOSO Y EL ADIPOCITO 48

2.3.1. El tejido adiposo y el adipocito 48

2.3.2. Lipogénesis y lipolisis 50

2.4. TRASTORNOS ASOCIADOS Y CONSECUENCIAS MÉDICAS 51

2.4.1. Trastornos asociados 51

Diabetes 51

Enfermedades cardiovasculares 52

Problemas respiratorios 52

Síndrome metabólico 53

Otros trastornos 53

2.5. ESTRATEGIAS CONTRA LA OBESIDAD 53

2.5.1. Tratamiento farmacológico 53

Fármacos, péptidos gastrointestinales y análogos 53

2.5.2. Cirugía 54

2.5.3. Tratamiento dietético 55

Componentes alimentarios y alimentos funcionales 55

Grasa y saciedad 57

Sistemas de liberación de lípidos 58

2.5.4. Terapia del comportamiento 62

2.6. MODELOS PARA EL ESTUDIO DE LA OBESIDAD 63

2.6.1. Celulares 63

2.6.2. Animales 63

3. REGULACIÓN DEL PESO CORPORAL. BALANCE DE ENERGÍA 66

3.1. INTRODUCCIÓN 66

3.2. ENTRADA DE ENERGÍA (INGESTA DE ALIMENTOS) Y SU REGULACIÓN 67

3.2.1. Recepción y generación de señales 67

Señales sensoriales y cognitivas 67

Señales generadas en el sistema digestivo y páncreas 68

Amilina (AMY) 69

Colecistoquinina (CCK) 74

Péptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP) 80

Péptido análogo al glucagón-1 (GLP-1) 84

Grelina (GRN) 89

Insulina (INS) 94

Polipéptido pancreático (PP) 98

Péptido tirosina tirosina (PYY) 101

Señales generadas en el tejido adiposo 104

Leptina (LEP) 104

Señales directas debidas a nutrientes 109

Otras señales 111

Ritmos circadianos 113

Estrés 113

3.2.2. Integración de las señales en el CNS 113

3.2.3. Otros factores que influyen en la ingesta de alimentos 116

Recompensa 116

Memoria y aprendizaje 117

Variedad 117

3.3. SALIDA DE ENERGÍA. GASTO ENERGÉTICO Y SU REGULACIÓN 118

3.3.1. Regulación del gasto energético 119

3.4. INTEGRACIÓN DE LA REGULACIÓN DE LA INGESTA

Y EL GASTO ENERGÉTICO 119

3.4.1. Fase sensorial y cognitiva 120

3.4.2. Fase post-ingestión 121

4. UTILIZACIÓN NUTRITIVA DE PROTEÍNA Y GRASA 124

4.1. CONCEPTOS 124

4.2. FACTORES QUE AFECTAN A LA UTILIZACIÓN NUTRITIVA 124

4.2.1. Dependientes de la dieta 124

Proteína 124

Cantidad y calidad proteica

Interacción con otros nutrientes

Estructura de la matriz del alimento

Componentes antinutricionales

Grasa 125

Interacción con otros nutrientes

4.2.2. Dependientes del modelo experimental 126

Estado fisiológico (obesidad) 126

Proteína 126

Grasa 128

MATERIAL Y MÉTODOS 130

1. ESTUDIO EXPERIMENTAL EN ANIMALES 132

1.1. ANIMALES 132

1.2. JAULAS 132

1.3. INGREDIENTES FUNCIONALES 133

1.4. DIETAS 133

1.4.1. PREPARACIÓN DE LA DIETA CONTROL, E1, E2 Y E3 135

Procedimiento

1.5. ANÁLISIS DE LAS DIETAS 135

1.5.1. HUMEDAD 135

1.5.2. CENIZAS 135

1.5.3. PROTEÍNA, GRASA Y CARBOHIDRATOS TOTALES 135

1.6. DISEÑO EXPERIMENTAL 136

1.6.1. EXPERIMENTO I (CORTO PLAZO) 136

1.6.2. EXPERIMENTO II (LARGO PLAZO) 137

1.6.3. EXPERIMENTO III

(LARGO PLAZO CON INDUCCIÓN PREVIA DE OBESIDAD) 138

1.7. CONTROL DE LA INGESTA Y DEL PESO 139

1.8. ANÁLISIS DE LA CONCENTRACIÓN PLASMÁTICA DE PÉPTIDOS

GASTROINTESTINALES Y HORMONAS 140

1.8.1. DISEÑO DEL ESTUDIO Y PROCEDIMIENTO DE RECOGIDA DE MUESTRAS

DE SANGRE 140

1.8.2. PROCESADO DE MUESTRAS 141

1.8.3. MEDICIÓN DE CONCENTRACIONES 141

Determinación de AMY (activa), GRN (activa), GIP (total), GLP-1 (activo), LEP,

INS, PP y PYY (total). 141

Fundamento 141

Equipo 143

Reactivos y material 143

Procedimiento 144

Determinación de CCK 145

Fundamento 145

Equipo 146

Reactivos y material 146

Procedimiento 147

1.9. ANÁLISIS DEL CONTENIDO DE NITRÓGENO EN HECES Y ORINA, Y DE GRASA

EN HECES 148

RECOGIDA DE LAS MUESTRAS 148

1.9.1. PROCESADO DE LAS MUESTRAS 148

Orina 148

Heces 148

1.9.2. ANÁLISIS DE MUESTRAS 148

Contenido en nitrógeno (heces y orina) 148

Contenido en grasa (heces) 148

1.9.3. ÍNDICES BIOLÓGICOS 149

1.10. CURVA DE GLUCEMIA (EXPERIMENTO III) 149

1.10.1. FUNDAMENTO 149

1.10.2. REACTIVOS Y MATERIAL 149

1.10.3. PROCEDIMIENTO 150

1.11. EUTANASIA Y OBTENCIÓN DE ÓRGANOS POSTMORTEN 150

1.11.1. EUTANASIA 150

1.11.2. OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS ÓRGANOS 150

1.12. DETERMINACIÓN DE COLESTEROL Y TRIGLICÉRIDOS EN HÍGADO 151

1.12.1. FUNDAMENTO 151

1.12.2. REACTIVOS Y MATERIAL 151

1.12.3. PROCEDIMIENTO 152

Extracción

Medición de triglicéridos

Medición de colesterol

Lectura y análisis de los resultados

1.13. ANÁLISID DE LAS MUESTRAS DE SANGRE TOMADAS AL SACRIFICO 153

1.13.1. HEMOGRAMA 153

1.13.2. ANÁLISIS BIOQUÍMICO DEL PLASMA 153

2. ESTUDIO EXPERIMENTAL EN HUMANOS 154

2.1. VOLUNTARIOS 154

2.2. PRODUCTOS 154

2.3. DISEÑO EXPERIMENTAL 154

2.4. ESTUDIO DE SACIEDAD 155

2.5. ANÁLISIS DE LA CONCENTRACIÓN PLASMÁTICA DE PÉPTIDOS

GASTROINTESTINALES 156

2.5.1. DISEÑO DEL ESTUDIO Y PROCEDIMIENTO

DE RECOGIDA DE MUESTRAS DE SANGRE 156

2.5.2. PROCESADO DE MUESTRAS 156

2.5.3. MEDICIÓN DE CONCENTRACIONES 157

Determinación de GRN (activa), GIP, LEP, INS, PP y PYY (total).

3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Y CÁLCULO DE LAS VARIABLES 158

RESULTADOS 160

1. COMPOSICIÓN DE LAS DIETAS Y DISEÑO EXPERIMENTAL 162

2. EXPERIMENTOS EN RATAS CON NORMOPESO 162

2.1. CORTO PLAZO 162

2.1.1. Ingesta 162

2.1.2. Peso corporal y de órganos 165

Evolución ponderal

Peso corporal y de órganos al sacrificio

2.1.3. Concentración plasmática de hormonas gastrointestinales 168

2.1.2. Largo plazo 174

Ingesta 174

2.1.4. Peso corporal 177

Evolución ponderal 177

Peso corporal y de órganos al sacrificio 179

2.1.5. Concentración plasmática de hormonas gastrointestinales 182

3. EXPERIMENTO EN RATAS OBESAS 189

3.1. PERIODO DE INDUCCIÓN DE OBESIDAD POR LA DIETA 189

3.1.1. Ingesta 189

3.1.2. Evolución ponderal 190

3.2. PERIODO EXPERIMENTAL 191

3.2.1. Ingesta 191

3.2.2. Peso corporal y de órganos 194

Evolución ponderal 194

Peso corporal y de órganos al sacrificio 196

3.2.3. Curva de glucemia 200

3.2.4. Concentración plasmática de hormonas gastrointestinales 202

4. PARÁMETROS HEMATOLÓGICOS Y BIOQUÍMICOS 207

4.1. PARÁMETROS HEMATOLÓGICOS 207

4.2. PARÁMETROS BIOQUÍMICOS PLASMÁTICOS Y HEPÁTICOS 210

5. EXPERIENCIA EN HUMANOS 212

5.1. Dieta del periodo experimental 212

5.2. Concentración plasmática de hormonas gastrointestinales 214

5.3. Parámetros de saciedad y hambre 218

DISCUSIÓN 219

1. ASPECTOS GENERALES 221

2. EXPERIMENTOS EN RATAS NORMOPESO 223

2.1. CORTO PLAZO 223

2.1.1. Ingesta 223

2.1.2. Evolución ponderal 224

2.1.3. Peso corporal y de órganos al sacrificio 224

2.1.4. Parámetros e índices de utilización nutricional de proteína y grasa 224

2.1.5. Concentración plasmática de hormonas gastrointestinales 225

2.2. LARGO PLAZO 231

2.2.1. Ingesta 231

2.2.2. Evolución ponderal 232

2.2.3. Peso corporal y de órganos al sacrificio 232

2.2.4. Parámetros e índices de utilización nutricional de proteína y grasa 232

2.2.5. Parámetros hematológicos y bioquímicos 233

2.2.6. Concentración plasmática de hormonas gastrointestinales 234

3. EXPERIMENTOS EN RATAS OBESAS 241

3.1. Modelo de obesidad 241

3.2. Experimento con ratas obesas 241

3.2.1. Ingesta 241

3.2.2. Evolución ponderal 242

3.3. Parámetros e índices de utilización nutricional de proteína y grasa 242

3.4. Parámetros hematológicos y bioquímicos 243

3.5. Concentración plasmática de hormonas gastrointestinales 243

4. COMPARACIÓN ENTRE RATAS NORMOPESO DE LA EXPERIMENTO A CORTO

PLAZO Y A LARGO PLAZO 250

5. COMPARACIÓN ENTRE RATAS NORMOPESO Y OBESAS 256

6. ESTUDIO EN HUMANOS 260

6.1. CONCENTRACIONES DE GP 260

6.2. SACIEDAD Y HAMBRE 263

CONCLUSIONES/ CONCLUSIONS 265

SUMMARY 271

1. INTRODUCTION 273

1. RATIONALE AND AIMS OF THE STUDY 275

2. METHODOLOGY 275

2.1. STUDIES IN RATS 275

2.2. STUDIES IN HUMANS 277

3. RESULTS AND DISCUSSION 277

3.1. SHORT TERM RAT STUDY (Experiment I) 277

3.2. LONG TERM STUDY IN NORMAL WEIGHT RATS (Experiment II) 278

3.3. LONG TERM STUDY IN DIETARY OBESE RATS (Experiment III) 279

3.4. ACUTE STUDY IN HUMANS 281

4. CONCLUSIONS 281

REFERENCIAS 283

ANEXO 343

JUSTIFICACIÓN Y

OBJETIVOS

“El conocimiento habla, la sabiduría escucha”

(Jimi Hendrix)

Ya decía el filósofo Feuerbach por el siglo XVII: “Somos lo que comemos”, que bien se

podría traducir de una forma más científica como “Lo que comes influirá en tu

organismo”.

Desde que existe vida como tal, ésta siempre ha necesitado adquirir materia y energía

exógena para poder perpetuarse, adquisición que evolutivamente se ha ido haciendo

más compleja hasta llegar a estar perfectamente regulada en el reino animal. En el ser

humano, esta situación se vuelve aún más complicada ya que éste puede elegir el tipo,

cantidad y calidad (dentro de unos límites económicos) de los alimentos que come,

estando muy influenciado por el efecto placentero que ciertas comidas producen en el

cerebro y que pueden llegar a convertirse en una adicción con los consecuentes

problemas que ello supone. Poco a poco, este hecho de ser consciente y sentir placer

por la comida, ha derivado de una alimentación para subsistir, a puro hedonismo,

circunstancia que casualmente casa con el hecho de que los alimentos que nos

reportan un mayor placer son más calóricos. Ello ha ido generando un ambiente

obesogénico que se ha ido propagando primeramente en los países desarrollados y

cuyo contagio a los países en vías de desarrollo está siendo inevitable. El problema ha

ido adquiriendo tintes de epidemia, siendo reconocido por organismos como la

Organización Mundial de la Salud/World Health Organization (OMS/WHO) o el Grupo

Internacional de Trabajo sobre Obesidad/International Obesity Task Force (IOTF), que

desde finales del siglo pasado a principios de éste ha llevado a plantear una serie de

estrategias para impedir su propagación, entre las que se encuentran una mejora de la

educación en materia de alimentación y actividad física, la creación de leyes que

favorezcan los alimentos más saludables o el desarrollo de alimentos funcionales que

complementen al resto de estrategias.

En la línea comentada anteriormente, se ha realizado esta Tesis Doctoral desarrollada

dentro del Proyecto PRONAOS, el cual es una aportación a favor de la estrategia NAOS

(Nutrición, Actividad física y Prevención de la Obesidad), auspiciada por los estados

miembros de la Organización Mundial de la Salud y cuyo objetivo principal es la

prevención de la obesidad. Se ha realizado en el Departamento de Fisiología y el

Instituto de Nutrición de la Universidad de Granada en colaboración con la empresa

Biosearch Life®. Dicho proyecto a su vez se enmarca en el Programa CENIT (Consorcios

Estratégicos Nacionales de Investigación Técnica), el cual pretende incentivar la

colaboración público-privada para el desarrollo de proyectos de investigación y

constituye uno de los instrumentos del Programa Ingenio 2010, recogido en las

estrategias de investigación y desarrollo del Gobierno Español en el campo científico-

tecnológico.

El objetivo general planteado para esta Tesis Doctoral ha consistido en evaluar el

efecto de tres ingredientes funcionales, facilitados por la empresa mencionada,

utilizando en una primera fase la rata Wistar (tanto normopeso como obesas inducidas

por la dieta) y en una segunda, humanos sanos con normopeso. Todo este trabajo

queda englobado en un objetivo global (en conjunción con otros centros de España),

que consiste en el desarrollo de alimentos funcionales que ayuden a prevenir la

obesidad (Proyecto PRONAOS).

Para abordar este objetivo general se plantearon los siguientes objetivos específicos:

1 Cambios en la ingesta de alimento.

2 Evolución ponderal.

3 Utilización digestiva y metabólica de la proteína y digestiva de grasa.

4 Determinación de las concentraciones plasmáticas, en ayuno y postprandiales,

de los péptidos gastrointestinales amilina (AMY), grelina (GRN),

colecistoquinina (CCK), péptido similar al glucagón 1 (GLP-1), péptido

insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP), polipéptido pancreático (PP) y

péptido tirosina tirosina (PYY) y de las hormonas leptina (LEP) e insulina (INS),

en el caso de las ratas, y GRN, LEP, INS, GIP, PP y PYY en humanos.

5 Evaluación de distintos parámetros de hambre y saciedad en humanos.

ANTECEDENTES

La confusión condiciona la actividad, la cual condiciona la

conciencia, la cual condiciona la personalidad encarnada, la

cual condiciona la experiencia sensorial, la cual condiciona el

impacto, el cual condiciona el estado de ánimo, el cual

condiciona el ansia, la cual condiciona el aferramiento, el cual

condiciona el devenir, el cual condiciona el nacimiento, el cual

condiciona el envejecimiento y la muerte.

(Sidartha Gautama)

37 Antecedentes

1. OBESIDAD

1.1. DEFINICIÓN, TIPOS, EPIDEMIOLOGÍA Y REPERCUSIONES

SOBRE LA ECONOMÍA

1.1.1. Definición

Ya en los años 50, investigadores como Jean Vague [1] proponían que el exceso de

grasa en el tronco (obesidad androide) podía acarrear mayores problemas metabólicos

que la grasa acumulada en los miembros (obesidad ginoide) [1]. Esta observación ha

sido confirmada en estudios tanto prospectivos como transversales siendo dicha

acumulación de grasa visceral, un factor determinante en el síndrome metabólico e

influyente en otros trastornos como la resistencia a la INS y otras enfermedades

crónicas [2].

Posteriormente, en 1985, la Metropolitan Life Insurance Company desarrolló tablas de

peso/altura para determinar el peso ideal e identificar la obesidad, llegando a la

conclusión de que más de un 20% por encima del peso ideal constituía un riesgo. Este

sistema tenía el defecto de que se basaba en un pequeño grupo de población, por ello

el National Institutes of Health (NIH) propuso adoptar el índice de Quetelet o Body

Mass Index (BMI) como medida de consenso, que consistía en el peso en kilos dividido

por la estatura en metros elevada al cuadrado. Este índice es igualmente propuesto en

los 90 por la Organización Mundial de la Salud (WHO) [3] como medida estándar, que

a día de hoy sigue siéndolo, y que muestra una visión general del estado de la

población. No obstante el BMI a nivel clínico, es un método de clasificación inexacto

que subestima la gravedad de la situación y puede contribuir al fracaso del

tratamiento. A día de hoy, el método más eficaz para conocer la adiposidad del

individuo es la absorciometría dual de rayos X o Dual-Energy X-Ray Absorptiometry

(DEXA) [4].

Los puntos de corte del BMI propuestos por la WHO se muestran en la Tabla 1 [5] y

son los que se adoptan tanto en las guías clínicas como en los estudios de obesidad.

38 Antecedentes

Table 1. The international classification of adult underweight, overweight and obesity according to BMI

CLASSIFICATION BMI (kg/m2)

UNDERWEIGHT <18.5

Severe thinness <16.00

Moderate thinness 16.00-16.99

Mild thinness 17.00-18.49

NORMAL RANGE 18.50-24.99

OVERWEIGHT ≥25.00

Pre-obese 25.00-29.99

OBESE ≥30.00

Obese class I 30.00-34.99

Obese class II 35.00-39.99

Obese class III >40.00

Taken from the WHO [5].

39 Antecedentes

1.1.2. Tipos de obesidad

Dependiendo de la distribución de la grasa en el cuerpo se pueden diferenciar cuatro

tipos de obesidad [6]:

- Tipo I: Exceso de grasa con distribución homogénea.

- Tipo II: Exceso de grasa abdominal-troncal (obesidad androide).

- Tipo III: Exceso de grasa abdominal-visceral.

- Tipo IV: Exceso de grasa glúteo-femoral (obesidad ginoide).

Por otra parte, dependiendo de la forma en que acumulen dicha grasa los adipocitos,

se puede diferenciar entre [7]:

- Obesidad hiperplásica: Incremento del número de adipocitos.

- Obesidad hipertrófica: Crecimiento del tamaño de los adipocitos sin aumento

del número.

1.1.3. Epidemiología

La liberación en el comercio global, el aumento de los ingresos familiares y la

urbanización ha hecho que se cree un ambiente obesogénico propicio para que se

produzca un aumento en la ingesta calórica y una reducción en la actividad física,

resultando en un balance positivo de energía que a largo plazo se convertirá en una

acumulación de tejido graso [8].

Obesidad adulta

La carga global de enfermedades no hereditarias continúa creciendo año tras año,

constituyendo unos de los mayores retos a los que se enfrentan los países

desarrollados en el siglo XXI. Las enfermedades cardiovasculares, diabetes, cáncer y

enfermedades crónicas respiratorias representaron 35 millones de muertes en 2005,

lo que supone el 60% de todas las defunciones globales. Todo esto no pasó

desapercibido en el mundo, proponiéndose en 2008 una estrategia para combatir esta

lacra, la cual se basó en diferentes objetivos como realizar mapas epidemiológicos,

reducir la exposición al tabaco, a las dietas insanas y reducir la inactividad física, así

como la elaboración de estrategias concretas basadas en evidencias científicas [9].

40 Antecedentes

De acuerdo con la WHO [10], el 10% y el 14% de hombres y mujeres (respectivamente)

mayores de 20 años presentaban obesidad en 2008. De estos adultos, 2.8 millones

mueren cada año, lo que hace de este el mayor problema de salud pública en

numerosas partes del mundo. Por otro lado la International Obesity Task Force (IOTF),

estimaba en el año 2010, la existencia de 1 billón de adultos con sobrepeso (BMI 25-

29.9 kg/m2) de los que 475 millones eran obesos (BMI ≥30 kg/m2). En la Figura 1 se

pueden observar según la IOTF, los datos más actuales de prevalencia de obesidad

(que van del 2008 al 2012, dependiendo del país).

Figure 1. Prevalence of obesity, males and females, ages 20+. Taken from International Obesity Task Force (IOTF) (Data from 2008 to 2012. The period varies depending on the country).

Uno de los primeros estudios y hasta la fecha el más completo, que analiza la

prevalencia de la obesidad y los trastornos asociados en Europa (incluyendo además

algunos países como Australia, China y USA) es el WHO MONICA (Monitoring Trends

and Determinants in Cardiovascular Disease). En él se examinó la evolución temporal

de los factores de riesgo de la enfermedad cardiovascular en 21 países con voluntarios

41 Antecedentes

de entre 35 y 64 años de edad. Comenzó en 1980 y finalizó en 1995, observándose

hechos como un mayor BMI en los países del este en comparación con los del oeste,

tanto al inicio como al final del estudio, hecho cuyo origen no parece tener un patrón

claro ya que, por ejemplo, en algunos países como España la ingesta energética es

grande debido a la ingesta de grasa total y dulces, pero en otros como Finlandia es

debido aparte de dulces, a otro tipo de alimentos [11].

Unos años después, en 1997, el Institute of European Food Studies (IEFS) realizó un

estudio cuyo objetivo era conocer la situación de sobrepeso y obesidad en los 15

países pertenecientes a la Unión Europea, con un total de 1000 participantes de cada

país. Este arrojó unos porcentajes elevados de obesidad en adultos, en torno al 12%

en Reino Unido y 11% en España [12,13].

Otro estudio a destacar es el EPIC (European Prospective Investigation into Cancer and

Nutrition), llevado a cabo por la International Agency for Research on Cancer (IARC) en

una población de 50-65 años y con un periodo de recogida de datos de entre 1992 y

2000, y en el cual participaron 23 centros de 10 países. El objetivo principal giraba en

torno al estudio de la etiología del cáncer en relación con el estilo de vida y los hábitos

alimentarios, aunque su diseño lo ha hecho útil también para investigar factores

genéticos, nutricionales y hormonales [14]. En la cohorte Diógenes se observó tras un

periodo de seguimiento de 6 años, que la obesidad aumentó de un 13% a un 17%

tanto en hombres como en mujeres [15].

A excepción de los estudios anteriormente comentados, los datos posteriores que se

tienen de cada país se deben a informes internos y han sido recogidos y analizados por

Berghöfer et al. [16] en una revisión sistemática realizada en 2008. En ella se llega a

una conclusión parecida al estudio MONICA, con los países del área mediterránea, del

este y centro con una mayor prevalencia de la obesidad que los del norte y oeste [16].

Hasta la fecha, la recogida de datos de mayor duración se ha llevado a cabo en Estados

Unidos gracias al programa National Health and Nutrition Examination Study

(NHANES), el cual comenzó en los años 60 realizándose de forma intermitente hasta

1999, cuando se estableció de forma continua cada año y cuyo objetivo consistió en

42 Antecedentes

evaluar de forma continua y representativa a la población americana. Los resultados

que se han obtenido desde los años 60 muestran que casi se ha triplicado la

prevalencia de obesidad en adultos, pasando aproximadamente del 13% al 36% en

2009-2010, y existiendo diferencias evidentes dependiendo de la edad, sexo y estatus

socioeconómico [17,18].

En nuestro país, los últimos datos publicados por la Organización para la Cooperación

Económica y el Desarrollo (OECD), revelan que existe un porcentaje de sobrepeso del

45% entre los adultos y que 1 de cada 6 personas es obesa. La tendencia en los últimos

años ha tendido a estabilizarse, hecho que no coincide con las previsiones pasadas que

estimaban un aumento [19].

Queda añadir, según los últimos estudios, la existencia de un descenso en el riesgo de

enfermedades cardiovasculares asociado a la obesidad, lo que aparentemente sólo es

a efectos de mortalidad ya que la calidad de vida o los años vividos sin discapacidad no

han disminuido, lo que en definitiva nos muestra los numerosos factores de confusión

que influyen en el estudio de la obesidad y los factores asociados a ella [20].

Obesidad infantil

De acuerdo con estimaciones de la WHO, la obesidad infantil constituye un problema

en muchos de los países tanto desarrollados como en vías de desarrollo, sobre todo en

ambientes urbanos. Las cifras que se han estimado según esta organización revelan un

aumento alarmante de la prevalencia de esta enfermedad desde un 4.2% en 1990 a un

6.7% en 2010, esperándose que alcance un 9.1% en 2020 si la tendencia no cambia

[21].

En general el porcentaje de obesidad es mayor en adultos que en niños en la mayoría

de los países, no obstante en países como Estados Unidos, Brasil o China esta situación

ha ido cambiando en los últimos años [22]. Paralelamente la globalización está

haciendo que muchos países adopten hábitos de comida rápida y bollería típicos de los

sitios occidentales, siendo un factor clave en el empeoramiento de la situación. De

hecho, ya existe una amplia evidencia de que los niños obesos lo serán también en la

adolescencia [23] y en la edad adulta [24-27].

43 Antecedentes

Sorprendentemente, el tema de la obesidad infantil apenas si ha empezado a cobrar

importancia de forma reciente, habiendo pocos registros o bastante incompletos.

Además no hay un consenso en la definición de obesidad infantil [28], existiendo

clasificaciones como la propuesta por la WHO en la cual se tienen en cuenta el BMI y

las desviaciones estándar o las que propone el Centers for Disease Control and

Prevention (CDC) y la IOTF (Tabla 2), éstas últimas con puntos de corte similares [28],

lo que complica la estandarización de los resultados a nivel mundial.

44 Antecedentes

Table 2. Current definitions of childhood obesity by the WHO, CDC and IOTF.

ORGANIZATION DEFINITION OF CHILDHOOD OBESITY

WHO

Birth to age 5 [29]:

- Overweight: BMI > 2 standard deviations above the WHO growth standard median.

- Obese: BMI > 3 standard deviations above the WHO growth standard median.

Ages 5 to 19 [30]:

- Overweight: BMI > 1 standard deviation above

the WHO growth standard median.

Obese: BMI > 2 standard deviations above the WHO growth standard median.

CDC In children from birth to age 2, the CDC uses a modified version of the WHO criteria [31].

In children ages 2 to 19, BMI is assessed by age- and sex-specific percentiles [32]:

- Normal weight: 5th < BMI < 85th percentile - Overweight: 85th < BMI < 95th percetile - Obese: BMI > 95th percentile

IOTF Provides international BMI cut points by age and sex for overweight and obesity for children age 2 to 18 [33].

- The cut points correspond to an adult BMI of 25 (overweight) or 30 (obesity).

45 Antecedentes

En España la situación queda reflejada en dos estudios que se han realizado

sucesivamente:

- El primero es el estudio enKid realizado del año 1998 al 2000 sobre una

muestra de 3500 individuos de entre 2 y 24 años, que reveló que un 26.3% de

los jóvenes tienen sobrepeso y de estos un 13.9% son obesos, tomando como

referencia el percentil 97 y 85 respectivamente [34] de las tablas de referencia

de Hernández et al. de 1988 [35].

- Posteriormente se realizó el estudio ALADINO (Alimentación, actividad física,

desarrollo infantil y obesidad), desarrollado por la Agencia de Seguridad

Alimentaria y Nutrición (AESAN) durante los años 2010-2011 sobre una

muestra de 7600 niños de entre 6 y 10 años. Este reveló una prevalencia del

26.2% de niños con sobrepeso y un 18.3% con obesidad según los estándares

de la WHO [36].

1.1.4. Repercusiones en la economía

Para una buena estimación de los costes que supone la obesidad hoy en día, hay que

tener en cuenta los que derivan directamente de ésta y los que surgen de los

trastornos asociados. Como una idea general podemos tomar datos de Estados Unidos

del 2008 que estiman unos 147 billones de dólares por año [37] y que según el ritmo

de crecimiento actual, prevén que dicho coste se incrementará en este país en torno a

48-66 billones por año de aquí a 2030 [38]. A nivel mundial, las estimaciones calculan

que el gasto medio debido a la obesidad supone en torno a 0.7-2.8% del presupuesto

dedicado a la sanidad de un país [39].

1.2. ETIOLOGÍA

1.2.1. Factores genéticos

El estudio de asociaciones genéticas con la obesidad es relativamente reciente, no

siendo hasta 1996 cuando se comenzó el proyecto que trató de relacionar el genoma

humano con la obesidad [40], describiéndose en el último informe alrededor de 200

tipos de obesidad asociados a un solo gen [41], las cuales son bastante graves y se

manifiestan desde una edad muy temprana. Por otra parte existe una evidencia

bastante contrastada de que la mayoría de los casos de obesidad tienen un

46 Antecedentes

componente poligénico con diferencias entre individuos a la hora de ganar peso, lo

cual supone una diferente predisposición a la obesidad de unos individuos respecto a

otros. Dicha predisposición lleva estudiándose desde hace más de 6 años [42] gracias a

los Genome-Wide Association Studies (GWAS), en los cuales se pretende asociar

variantes genéticas con un trastorno o enfermedad. Han supuesto una herramienta

que ha logrado relacionar un total de 32 variantes de forma significativa con el BMI y

18 con la distribución de la grasa corporal [43]. No obstante, a pesar de haberse

demostrado dicha correlación, el efecto de estos genes sobre la predisposición a la

obesidad es pequeño [44] y sólo puede explicar menos del 2% de la variación

fenotípica atribuida a la variación genotípica [45].

En el último informe del mapa genético relacionado con la obesidad, se nombran

como mínimo 127 genes con al menos una asociación positiva con alguna

característica de dicho fenotipo obeso, de los cuales 22 se encuentran respaldados por

diversas publicaciones [46].

Si observamos las funciones en las que están implicados dichos genes, emergen 5

grupos de genotipos susceptibles que muestran una tendencia [47]:

- Bajo metabolismo basal y termogénesis.

- Genotipo hiperfágico: Pobre regulación del apetito y la saciedad.

- Genotipo sedentario: Propenso a ser físicamente inactivo.

- Genotipo de baja oxidación lipídica: Tendencia a oxidar poco los ácidos grasos.

- Genotipo con una mayor capacidad de acumular grasa.

Por último, estudios en gemelos claramente denotan una predisposición genética a

ganar peso, ya que las diferencias en la ganancia de peso entre parejas son mayores

que dentro de las parejas [48], siendo estos últimos estudios los que demuestran de

forma más fehaciente la predisposición genética a la obesidad.

47 Antecedentes

1.2.2. Factores fisiológicos y ambientales

Factores sensoriales

Recientemente ha adquirido una gran importancia el hecho de la percepción sensorial

de los individuos hacia los alimentos, que puede relacionarse con diferencias en la

apreciación de la palatabilidad entre ellos, la cual si es mayor, puede redundar en un

aumento de la ingesta [49].

Factores nerviosos

Refiriéndonos al estrés nervioso, hay evidencias de que puede actuar a corto plazo

disminuyendo la ingesta, no obstante parece que a largo plazo el efecto es contrario

[50-52], hecho que se puede relacionar con la liberación de glucocorticoides e INS que

pueden hacer que la ingestión de “alimentos placenteros” reduzcan el efecto del

factor estresante [53].

Factores endocrinos

La obesidad se asocia en determinadas ocasiones a alteraciones endocrinas como el

hipotiroidismo, síndrome de Cushing, deficiencia de la hormona de crecimiento (GH) y

testosterona, síndrome de ovario poliquístico, insulinoma y lesiones hipotalámicas

[54].

Por otra parte, como se verá más adelante, la regulación de la ingesta y del peso

corporal (BW) está sometida a un complejo control endocrino y nervioso, el cual ha

adquirido protagonismo en los últimos años y cuyo estudio de forma más detallada

será clave para el entendimiento de la obesidad [55].

Factores psicológicos

Revisiones sistemáticas como la de Atlantis et al. [56] y Lupino et al. [57] indican la

existencia de una ligera correlación entre la obesidad y los trastornos afectivos

(depresiones y trastornos bipolares) sobre todo en mujeres más que hombres y en los

americanos más que en los europeos [56,57].

48 Antecedentes

Factores ambientales

La ingesta de alimento está motivada por la necesidad, pero influenciada por una

miríada de factores, de los cuales, los que afectan de forma más pronunciada son: la

variedad (hace que siga el interés por la comida), la ingesta en grupo, la ingesta de

alcohol (la energía de éste es aditiva a la energía total ingerida) y las horas de

visionado de la televisión [58]. Todos estos factores funcionan a corto plazo,

influyendo en el resultado a largo plazo, que va estar fuertemente determinado por la

capacidad del individuo de contenerse a ese estímulo, hecho que entre otros factores

está fuertemente influenciado por la herencia [59].

Un elemento que ha adquirido importancia en los últimos años son los cambios en el

tipo de microbiota intestinal, percibiéndose que las baterías de tipo Bacteroides y

Firmicutes son dominantes en humanos y roedores obesos, lo que hace que aumente

la capacidad de adquirir energía de la dieta [60]. Sobre este tema se están realizando

estudios con resultados prometedores, que pueden mostrar un fuerte impacto de la

microbiota en el desarrollo de obesidad [61].

1.2.3. Actividad física

Como se ha comentado, el sedentarismo constituye a día de hoy uno los principales

factores, el cual está influenciado por diversos aspectos de la vida moderna como los

medios de comunicación y de entretenimiento, ampliamente descrito en obras como

la de Bouchard et al. [62].

Los expertos de la American College of Sports Medicine (ACSM), recomiendan la

realización de ejercicio regular que incluya actividades variadas, tanto

cardiorrespiratorios como de resistencia y flexibilidad, de intensidad moderada con un

tiempo de aproximadamente 30 minutos al día durante 5 días a la semana [63].

1.3. EL TEJIDO ADIPOSO Y EL ADIPOCITO

1.3.1. El tejido adiposo y el adipocito

El tejido adiposo es de tipo conectivo y su función principal es la de almacenar energía,

estando implicado además en regulación de la ingesta, respuesta inmunitaria,

mantenimiento óseo o secreción de hormonas. Lo constituyen en su mayor parte

49 Antecedentes

adipocitos rodeados por una matriz de colágeno y otras células anejas como

leucocitos, macrófagos, preadipocitos o células estromales.

En mamíferos se distinguen el tejido adiposo blanco (WAT), especializado en el

almacenamiento de lípidos, el marrón (BAT), cuya principal función es la regulación de

la temperatura [64], y un tercero denominado beige que posee características

intermedias a los dos anteriores [65].

En el caso de humanos, el marrón y el beige se presentan más abundantemente en el

recién nacido que en el adulto, donde queda relegado a la zona supraclavicular,

cervical, mediastino y la zona suprarrenal (localizados gracias a las técnicas de emisión

computerizada de positrones) [66].

Hasta hace relativamente poco tiempo se pensaba que el tejido adiposo era

meramente un tejido de almacenamiento de grasa, concepto que ha ido cambiando

con el tiempo desde que se descubrió la LEP en 1994 y que ha ido posicionando a

dicho tejido como todo un órgano endocrino. Cabe destacar su producción de

moléculas como [67]:

- Adipoquinas: LEP, resistina, adiponectina, visfatina, apelina, omentina, vapina,

adipsina o angiopoyetina.

- Citoquinas: Factor de necrosis tumoral (TNF) o las interleuquinas 1, 4, 6 y 10.

- Quimioquinas: Interleuquina 8 (IL-8), proteína inducible debido a interferón 10

(IP-10) o la proteína de atracción de monocitos 1 (MCP-1).

Los adipocitos, por otra parte, poseen características diferentes según sean de BAT o

de WAT, con una maquinaria de biosíntesis lipídica desarrollada en el primer tipo y un

desarrollo de los sistemas implicados en la respiración y generación de energía en el

segundo. La diferenciación de estos es un proceso complejo en el que están

involucrados diferentes factores de transcripción y correguladores operando de forma

conjunta para establecer un patrón de expresión génica en el adipocito. Dicho

proceso, pese a que se ha caracterizado bastante, no está del todo dilucidado [67] .

50 Antecedentes

El origen de estas células son las denominadas células madre mesenquimales, las

cuales en primera instancia se diferencian hacia preadipocitos, para posteriormente

entrar en un estadio de compromiso generando adipocitos de tipo blanco o marrón

dependiendo de la exposición a factores como el receptor activado por el proliferador

de peroxisomas (PPAR), proteína de unión a los activadores CCAAT (C/EBP) y factor

dependiente de la diferenciación y determinación del adipocito 1/ Proteína de unión a

elementos de respuesta regulados por esteroles 1 (ADD-1/SREBP-1) [67].

1.3.2. Lipogénesis y lipolisis

La lipogénesis consiste en la formación de triglicéridos (TGs) a partir de ácidos grasos

libres (FFA) y glicerol, llevándose a cabo en el hígado y tejido adiposo. La provisión de

FFA resulta de procesos como la lipolisis producida en el adipocito, de la grasa

presente en el alimento que se almacena provisionalmente en los quilomicrones y de

la síntesis de novo en el hígado a partir de sustratos como la glucosa. Este último

proceso, es estimulado por dietas ricas en carbohidratos e inhibido por dietas ricas en

ácidos grasos poliinsaturados que suprimen la expresión de las enzimas implicadas

[68].

La lipolisis, por otra parte, es exclusiva del tejido adiposo y consiste en una rotura

hidrolítica de los TGs, llevada a cabo por las enzimas adipo-triglicérido-lipasa (ATGL),

lipasa sensible a hormonas (HSL) y monoacilglicerol lipasa (MGL) (Ver Figura 2), que

actúan al fosforilarse la proteína perilipina y dejan libre acceso a las gotas de grasa

[69].

Respecto a la regulación de la lipolisis, se ha visto una menor inducción de la HSL por

catecolaminas en personas obesas [70], así como un fallo en la regulación de la

lipolisis, que hace que se libere gran cantidad de FFA a la sangre, causando efectos

adversos que se detallarán más adelante.

51 Antecedentes

Figure 2. Schematic delineation of the coordinate breakdown of triacylglycerols. ATGL: adipose triacylglycerol lipase; DAG: diacylglycerol; G: glycerol; HSL: hormone-sensitive lipase; MAG: monoacylglycerol; MGL: monoacylglycerol lipase; NEFA:non-esterified fatty acid; TAG: triacylglycerol. Taken from Lass et al. [71].

1.4. TRASTORNOS ASOCIADOS Y CONSECUENCIAS MÉDICAS

1.4.1. Trastornos asociados

Es un hecho bastante contrastado, como reflejan revisiones como la de Iyer et al. [72],

que la obesidad abdominal produce un estado de inflamación de tipo crónico, en el

cual los adipocitos producen un amplio número de citoquinas proinflamatorias y

aumenta el número de macrófagos activados que colonizan el tejido adiposo [73,74].

Además, se ha observado un incremento de la LEP y la resistina (no en todos los

estudios), lo que conduce a un aumento de factores como el TNFα e IL6, que han sido

relacionados de forma directa con la inflamación e indirecta con la aterosclerosis a

través de la proteína C-reactiva. Por otro lado los valores bajos de adiponectina

observados en los individuos obesos, hacen que no haya respuesta ante el aumento de

LEP y resistina [67]. Todo ello deriva inicialmente en una resistencia a la INS local (a

nivel del tejido adiposo) que puede generalizarse, inflamación hepática y aterogénesis.

Todo este proceso inflamatorio hace que aumente la probabilidad de padecer

enfermedades de tipo cardiovascular, diabetes tipo 2 y problemas respiratorios [75].

Diabetes

Aproximadamente el 90% de los individuos obesos sufren diabetes mellitus tipo 2

(T2DM) [76], debido principalmente a que la acumulación de grasa visceral redunda en

una resistencia a la INS, hecho que cuando se acompaña con una disfunción en los

islotes β pancreáticos deriva en una T2DM [77].

En la obesidad, aparte del ya comentado proceso inflamatorio, hay un aumento de la

actividad de los glucocorticoides que promueven una gran actividad metabólica con la

consecuente acumulación de grasa especialmente en la zona abdominal.

52 Antecedentes

Paralelamente existe en esta zona una mayor sensibilidad a la acción lipolítica de la

noradrenalina, lo que hace que se tiendan a liberar FFA al sistema portal [78],

ejerciendo un efecto deletéreo en el hígado, reduciendo el aclaramiento hepático de

INS (agravándose la hiperinsulinemia) y aumentando la gluconeogénesis y producción

hepática de glucosa, con la consiguiente hiperglucemia. Este bucle hace que poco a

poco vayan aumentando los niveles de INS y glucosa, lo que fuerza al páncreas a

contrarrestar dicha hiperglucemia secretando más INS, hecho que a largo plazo hace

que se vaya generando una resistencia a dicha hormona, primero local y poco a poco

trasladándose a tejidos como el hueso o el músculo [79]. Recientemente se ha

propuesto el exceso energético como factor principal implicado en la T2DM, con el

concomitante aumento del ATP, como demuestra la mejora de los síntomas en

situaciones que disminuyen dicho exceso, como la realización de más ejercicio, una

restricción calórica o una pérdida de BW, abriendo esta teoría una senda inexplorada

en el desarrollo de fármacos para tratar dicho trastorno [80].

Enfermedades cardiovasculares

El incremento del BW deriva en un aumento en el volumen sanguíneo, lo que redunda

en una serie de adaptaciones cardíacas que finalmente hacen que se eleve el gasto

cardíaco para compensar, hecho que puede no llegar a ser suficiente y que puede

acabar en una disfunción sistólica y diastólica, lo que aumenta las posibilidades de un

fallo cardíaco [81,82]. Además, paralelamente, todo el proceso inflamatorio y fallo

hepático hace que se produzca una dislipemia con un aumento de los TGs circulantes,

colesterol LDL y disminución del colesterol HDL, hechos que se relacionan

directamente con problemas aterogénicos [83]. Hay que añadir que recientemente se

ha descubierto la expresión de angiotensinógeno en el tejido adiposo, lo que relaciona

la obesidad con la hipertensión de una forma más directa [84].

Problemas respiratorios

Un incremento en la masa grasa del pecho y el abdomen produce una disminución del

volumen pulmonar y una alteración en el patrón de ventilación, que se acentúa

cuando el individuo está tumbado. Durante el sueño puede ocurrir hipoventilación y

apnea lo que resulta en una caída temporal del oxígeno arterial (hipoxemia) y

53 Antecedentes

aumento del dióxido de carbono (hipercapnia). Todo esto, de persistir en el tiempo,

puede terminar en un fallo cardíaco y/o respiratorio [85].

Síndrome metabólico

Se denomina también síndrome X, y se caracteriza por una serie de anormalidades

metabólicas entre las que (aparte de una disminución de la tolerancia a la glucosa,

alteración de glucemia en ayunas o diabetes) se incluyen (dependiendo de si se sigue

la definición de la WHO (1999), EGIR (1999) o ATPIII (2001)) dislipemia, hipertensión,

obesidad central, resistencia a la INS, hiperinsulinemia y microalbuminuria [86,87].

Otros trastornos

La obesidad también aumenta la probabilidad de padecer problemas

gastrointestinales, musculares, genitourinarios y algunos tipos de cáncer [88].

1.5. ESTRATEGIAS CONTRA LA OBESIDAD

La principal estrategia contra la obesidad consiste en una dieta saludable y ejercicio

regular, aunque como bien se sabe, esto es complicado de llevar a cabo en el

ambiente obesogénico presente en los países desarrollados, de forma que se deben

plantear otras estrategias que pueden ser farmacológicas, quirúrgicas o alimentarias.

1.5.1. Tratamiento farmacológico

Fármacos, péptidos gastrointestinales y análogos

El desarrollo de los nuevos fármacos y análogos contra la obesidad se centra

principalmente en obtener una disminución de la ingesta (bloqueando factores

orexígenos o promoviendo los anorexígenos), un aumento del gasto energético o

ambos a la vez.

En el caso de la administración de fármacos, sólo se recomienda cuando la dieta y el

ejercicio no funcionan. Desde hace años se llevan desarrollando, pero la mayoría han

sido retirados del mercado debido sobre todo a los efectos secundarios que causan,

siendo a fecha de 2014 los usados a corto plazo la fentermina, dietilpropion,

zonisamida, topiramato, y a largo plazo el orlistat. De los anteriores la fentermina y el

54 Antecedentes

dietilpropión son análogos de las anfetaminas, y la zonisamida y el topiramato son

fármacos antiepilépticos, así como el orlistat tiene un efecto periférico inhibiendo la

lipasa pancreática. Pese a todo, lamentablemente todavía no se ha encontrado un

medicamento con una eficacia contrastada que no posea efectos secundarios [89] .

Por otro lado, los distintos péptidos gastrointestinales (GP) y sus análogos tienen un

gran potencial para ser usados en terapias contra la obesidad y muchos de ellos (solos

o en combinaciones) están siendo testados en ensayos clínicos, como la liraglutida

(análogo del GLP-1), que está en fase III, o la pramlinitida (análogo de la AMY) y la

obinepitida (análogo del PP y PYY), que está en fase II [90].

Ahora bien, refiriéndonos a los GP como tal, la GRN es la que mayor potencial tiene

para ser utilizada como herramienta para el desarrollo de nuevas estrategias

farmacológicas contra la obesidad, debido principalmente a sus efectos orexígenos.

Actualmente, se están probando compuestos relacionados con este GP como son [91]:

- Antagonistas y agonistas inversos (disminución de la actividad) del receptor

GHS-R1a.

- Neutralizadores de la GRN por vacunación y por unión de pequeños ARN

artificiales denominados “spiegelmers”.

- Antagonistas de los receptores del sabor amargo (T2R), los cuales parece ser

que están implicados en el aumento de las concentraciones plasmáticas de

GRN cuando son estimulados (hecho observado en ratones).

- Inhibidores de la grelina O-acetiltransferasa, siendo esta enzima necesaria

para la activación de la GRN.

Otros compuestos que se plantean son aquellos que evitan la degradación de los GP,

como por ejemplo, los inhibidores de la enzima DPP-4 que degrada a varios de ellos, e

incluso bloqueantes de las señales adipocitarias entre otros [92].

1.5.2. Cirugía

Hasta ahora la cirugía bariátrica es la forma más eficaz de perder peso corporal,

aunque sólo se utiliza si el paciente supera los 40 kg/m2 de BMI, ya que conlleva un

riesgo alto de mortalidad. Existen diversas técnicas las cuales se pueden dividir en

55 Antecedentes

restrictivas, malabsortivas o mixtas, siendo del último tipo la técnica más comúnmente

realizada hoy en día, la Roux-en-Y proximal (llamada así por el cirujano César Roux,

que fue el primero que la describió). Consiste en disminuir el tamaño del estómago

hasta casi 1/3 de su tamaño original y seccionar el duodeno conectando un extremo a

este “nuevo estómago”, de forma que el extremo que queda libre se une con una

porción más distal, haciendo que se disminuya tanto la capacidad de almacenar

alimento como su absorción.

Su eficacia a corto-medio plazo se debe sobre todo a cambios en las concentraciones

plasmáticas de los GP, entre los cuales se ha visto que hay una disminución en la LEP e

INS en ayunas y un incremento postprandial progresivo de enteroglucagón y GLP-1 en

6 meses [93] y del PYY hasta los 24 meses [94]. Además recientemente se ha descrito

que los pacientes con este tipo de operación poseen un gasto energético mayor

comparado con los sometidos a otras técnicas como la gastroplastia vertical en banda

[95], motivo que puede explicar en parte la pérdida de BW.

1.5.3. Tratamiento dietético

Componentes alimentarios y alimentos funcionales

A finales de los 80 y principios de los 90 se empezaron a relacionar de forma directa

los alimentos con distintas enfermedades, y ya en el siglo XXI se propuso la

denominada nutrición optimizada, que consiste en maximizar las funciones fisiológicas

y psicológicas a través de la alimentación [96].

Para concretar los conceptos sobre alimentos funcionales a nivel europeo el

International Life Science Institute (ILSI), dentro del proyecto denominado Functional

Food Science in Europe (FUFOSE), propuso que un alimento puede ser considerado

como funcional cuando muestra un efecto beneficioso sobre una o más funciones

diana del organismo, más allá de unos adecuados efectos nutricionales, de forma que

mejora el estado de salud del individuo y de bienestar y/o reduce el riesgo de padecer

una enfermedad [97].

Los objetivos de la nutrición funcional deben identificar las interacciones beneficiosas

entre un alimento en concreto y una o más funciones del organismo y obtener

56 Antecedentes

evidencias sobre los mecanismos implicados en la interacción. Estos objetivos deben

de alcanzarse a través de experimentos tanto in vitro, ex vivo e in vivo con una

metodología adecuada y en la que se integren los distintos campos de las ciencias de

la vida (fisiología, psicología, farmacología y medicina) [97].

Si nos referimos a los alimentos en general, hay que comentar que normalmente el

principal problema radica en el hecho de que una alta palatabilidad se relaciona con

una alta densidad energética y poca capacidad de saciedad y a la inversa. Lo ideal

serían alimentos con una alta palatabilidad y saciedad y una baja densidad energética

[98], siendo éste el objetivo de la mayoría de las industrias alimentarias.

Los efectos que se buscan a la hora de desarrollar un producto eficaz contra lo

obesidad son (por separado o con efectos conjuntos):

- Incremento de la saciedad.

- Actuación sobre la fisiología adipocitaria (disminución de la lipogénesis o

incremento de la lipolisis).

- Inhibición o disminución de la lipasa pancreática.

- Disminución de la absorción energética.

- Incremento del gasto energético.

El concepto de alimento funcional es amplio, de forma que puede ser [99]:

- Un alimento natural.

- “ “ “ con componentes añadidos.

- “ “ “ al que se le elimina/n algún/os componente/s.

- “ “ “ con algún componente al que se le modifica la

biodisponibilidad.

- Cualquier combinación de las anteriores.

Diferentes alimentos y componentes de estos (en combinación o aislados) llevan

investigándose desde hace tiempo y aunque hay muestras de efecto sobre distintos

parámetros, no son del todo concluyentes y se requiere una investigación más

57 Antecedentes

detallada. Todos estos se describen en los trabajos de Riccardi et al. y Martínez-

Augustín et al. [100,101] (Tabla 3).

Grasa y saciedad

En condiciones normales, la mayor parte de la grasa de la dieta se digiere y absorbe

antes de alcanzar el yeyuno, activándose en dicho tránsito mecanismos que

promueven la saciedad como una disminución en el vaciado gástrico o un aumento de

las concentraciones plasmáticas de la CCK (influye en el vaciado gástrico) y del PYY

[102-107]. Las comidas abundantes y el estado sólido de la grasa incluida en el

alimento pueden favorecer la llegada de fracciones sin absorber de este

macronutriente a las partes más distales del intestino [108,109]. La presencia de este

nutriente en estos segmentos distales activa mecanismos que desencadenan cambios

funcionales como una disminución de la motilidad intestinal y/o una estimulación de

la secreción de GLP-1 y PYY (estímulos que influyen en el freno ileal), y cuya

consecuencia es una disminución de la ingesta de alimentos [110-113].

Además, los FFA también estimulan la secreción de AMY [114], GIP [115], GLP-1, [116],

INS [117] y PYY [118] e inhiben la liberación de GRN (la de cadena larga

principalmente) [119].

Por otro lado, también es importante la actividad de la lipasa pancreática sobre los

triglicéridos de la dieta, ya que una inhibición de la actividad de esta enzima aumenta

el vaciado gástrico y disminuye la secreción de CCK, lo que teóricamente disminuye la

sensación de saciedad y también la absorción de los lípidos [120,121].

En general, parece ser que la inhibición de la ingesta debida a la grasa alimentaria está

relacionada de forma directa con la superficie intestinal expuesta a ella, siendo en

consecuencia esta inhibición mayor a medida que aumenta la superficie expuesta

[122-124].

Como ya se ha comentado, la situación en condiciones reales es mucho más compleja

ya que entran en juego factores relacionados con el componente de placer que

provocan los alimentos a nivel central, lo que hace que se puedan rebasar los

mecanismos homeostáticos que controlan la ingesta [125,126].

58 Antecedentes

Por último, hay que comentar que pese a que tradicionalmente se ha considerado que

la grasa tiene menor efecto saciante respecto al de HDC y proteína, a día de hoy esta

afirmación es objeto de debate [127]. Además, muchos autores han relacionado la

obesidad con la ingesta de grasa [128,129] y se ha postulado que este macronutriente

produce una atenuación de los mecanismos que desencadenan saciedad (ya

comentado) [130-132]. Hoy en día se está cuestionando si dicho nutriente juega un

papel tan determinante en la obesidad o constituye un factor de distracción en el

estudio de dicha enfermedad [133].

Sistemas de liberación de lípidos

La industria alimentaria es consciente, por distintos estudios de que la saciedad se

puede modificar dependiendo del tramo intestinal donde se liberen los ácidos grasos

[134-136], hecho que a su vez depende del grado de emulsión de la grasa.

Actualmente existe un extenso campo para el desarrollo de este tipo de

manipulaciones de la grasa dietética que puedan tener un efecto inhibidor de la

ingesta de alimentos [102,103,137]. Se están estudiando diferentes modelos entre los

que se incluyen: emulsiones convencionales, pequeños o grandes agregados

emulsionados y esferas rellenas de microgel [138].

Para conseguir dicha modificación de la ingesta y como ya se esbozó en los

antecedentes de forma general, en el caso de esta tesis, las emulsiones desarrolladas

tienen como objetivo la modificación de la actividad de la lipasa pancreática y/o de la

liberación de péptidos gastrointestinal y hormonas relacionadas.

Respecto al perfil de ácidos grasos de las emulsiones, se ha observado un aumento del

poder saciante cuando predominan los ácidos grasos de cadena larga (más de 12

carbonos) [139] y con un alto nivel de insaturación [140].

La influencia del tamaño de las partículas de las emulsiones en parámetros

relacionados con la ingesta (absorción de nutrientes, secreción de hormonas, etc...), se

ha estudiado en diferentes trabajos:

- En el estudio de Armand et al. [141], se ensayaron dos emulsiones

administradas intragástricamente, con tamaños de partícula de 0.7±0.2 µm y

59 Antecedentes

10±0.9 µm respectivamente Se produjo un ligero retraso en la absorción de

triglicéridos en el caso de la emulsión de diámetro más pequeño, relacionado,

en este caso, con una disminución del vaciado gástrico, aunque la absorción

de grasa no se modificó en ningún momento [141].

- Seimon et al. [142] administraron intraduodenalmente emulsiones con

diferentes tamaños de gotículas (0.26, 30 y 170 µm), observándose un mayor

efecto sobre la disminución del vaciado gástrico y el aumento de los niveles

plasmáticos de CCK y PYY con la emulsión de 0.26 µm, aunque no se

encontraron diferencias significativas en la saciedad para ninguna de las

emulsiones [142].

- Por último, Maljaars et al. [143] compararon los efectos que sobre saciedad,

hambre y secreción de CCK y PYY tenía la administración intraduodenal y/o

intraileal de emulsiones con partículas pequeñas (0.88 µm) o grandes (15.5

µm). Se observó un aumento de la sensación de saciedad y una disminución

de vaciado gástrico en la emulsión con menor tamaño de partícula. Por otro

lado, la administración en íleon aumentó la secreción total de CCK, aunque no

se observaron diferencias significativas en parámetros como el PYY y los

niveles de saciedad [143].

En ratas hay poco estudios sobre el efecto de las emulsiones grasas sobre la ingesta,

pudiéndose destacar el estudio de Wang et al. [144], donde prueban emulsiones

vegetales y biopolímeros con y sin almidón, demostrándose una mayor influencia

sobre la ingesta debido a la presencia de almidón más que la atribuible a la emulsión

de la grasa [144].

La gran mayoría de los estudios realizados hasta la fecha en humanos, se han realizado

con emulsiones comerciales, entre las que destaca Fabuless™ u Olibra™. En los

estudios realizados a corto plazo con esta emulsión [128,145-147], se ha observado un

aumento de la saciedad así como su contribución al mantenimiento del BW, tras una

pérdida de éste en mujeres obesas [148]. Por otro lado, no se han observado

resultados concluyentes en otros estudios realizado a corto [149] y largo plazo

[150,151] o con diferentes formatos de consumo [152]. Como se resume en la revisión

de Appleton et al. [153], la variedad de resultados puede deberse a la influencia de

60 Antecedentes

distintos factores como el tipo de procesado del producto o las distintas dosis

utilizadas.

En otro estudio realizado en humanos se utilizaron cuatro tipos de emulsiones: control

(Ivelip®), aceite de canola estabilizado con estearoil lactilato de sodio (SSL-LO), aceite

de canola más aceite hidrogenado de colza y estearoil lactilato (SSL-LO/SF) y un último

grupo con canola y colza más una mezcla de caseinato de sodio y monoglicéridos

(CasMag). Los mejores resultados se obtuvieron en el grupo CasMag que mostró una

menor liberación postprandial en plasma de TG, aunque no se observaron diferencias

significativas en la liberación postprandial de GP (CCK, GLP-1 y PYY) con respecto al

control [154].

Recientemente se ha desarrollado una patente en Estados Unidos [155] basada en

emulsiones ricas en ácido palmítico y esteárico con lecitina y/o galactolípidos como

emulgente. Estas emulsiones son capaces de formar cristales en el intestino delgado,

lo que promueve la llegada de lípidos sin digerir a íleon y en consecuencia la activación

de las señales de saciedad previamente comentadas [155].

A pesar de todos los estudios antes expuestos, todavía no existen evidencias

científicas relevantes que permitan presentar un producto con alguna alegación

funcional, por lo menos a corto plazo.

61 Antecedentes

Table 3. Examples of foods or food ingredients that may potentially be considered as “functional” in the field of body weight regulation.

FOOD/INGREDIENT TARGET

Soy Satiety

Low glycemic index starchy foods

Medium chain triglycerides

Polyunsaturated fat (PUFA) and Omega-3

Fiber-rich foods

Low dairy products Adipocyte

physiology

Non-caloric sweeteners

Phenolic compounds

Medium chain triglycerides

Fat replacers Energy intake

Caffeine, capsaicin and green tea Energy expenditure

Oleyl Estrone

Plant extracts (algae, tea polyphenols and

metabolites of microorganisms) Pancreatic lipase

Taken from Riccardi et al. and Martínez-Augustín et al. [100,101].

62 Antecedentes

Por otra parte, es sabido desde hace muchos años, que distintas plantas medicinales

utilizadas en China o Corea tienen efectos beneficiosos sobre la salud. Sobre esta base

diferentes grupos de todo el mundo se encuentran investigando extractos de plantas

que puedan tener efectos beneficiosos en las personas obesas. Son muchos los

compuestos que se han probado o se están probando, tal y come se recoge en el

trabajo de Yun et al. [156].

Mención especial merecen los compuestos que producen una inhibición de la lipasa

pancreática (emulando el efecto del orlistat), los cuales se han aislado de plantas,

algas, hongos o bacterias, más concretamente. La mayoría de dichas sustancias son

polifenoles y saponinas presentes en el té, soja, ginseng, mate, manzana o uva [157] o

procedentes de corteza y madera de plantas como Juniperus communis e Illicium

religiosum [158].

Finalmente, la revisión sistemática de Hasani-Ranjbar et al. [159], se centra en

estudios en animales y humanos que miden parámetros relacionados directamente

con la grasa corporal y/o la ingesta tales como la masa grasa/masa total, porcentaje

grasa/grasa visceral, pliegues cutáneos, circunferencia de cadera o cintura, apetito o

cantidad de alimento ingerido. Los resultados más significativos se observaron con

extractos procedentes de efedra (Ephedra Sinica), ginseng (Panax ginseng), melón

amargo (Momordica charantia), jengibre (Zingiber officinale) y Cissus quadrangularis

[159].

1.5.4. Terapia del comportamiento

Las terapias de comportamiento que hagan cambiar la alimentación y el ejercicio físico

deben basarse en adquirir hábitos y técnicas como auto-seguimiento, manejo del

estrés con meditación o técnicas anti estrés, control de estímulos o reestructuración

cognitiva para cambiar pensamientos negativos; éstas pueden hacer perder a un

sujeto hasta un 10% del BW en un periodo de un año o menos, siendo el factor clave

que el sujeto adquiera dichas recomendaciones para no perderlas a largo plazo [160].

63 Antecedentes

1.6. MODELOS PARA EL ESTUDIO DE LA OBESIDAD

Desde hace más de medio siglo se lleva intentando desarrollar modelos animales que

mimeticen todos o muchos de los desórdenes fisiológicos que posee un individuo

obeso. A nivel genético, los estudios GWAS, ha servido de guía para conocer los genes

sobre los que realizar el principal esfuerzo de estudio, pero como la mayoría de los

casos de obesidad son poligénicos, otros modelos como los de obesidad inducida por

la dieta nos dan una visión más general de dicho trastorno.

1.6.1. Celulares

Un conocimiento detallado de las rutas moleculares que regulan el desarrollo y el

metabolismo del adipocito son necesarios para desarrollar estrategias frente a las

enfermedades metabólicas ya mencionadas. Actualmente se emplean líneas celulares

como las 3T3-L1, 3T3-F442A y Ob17 (que son preadipocitos) o las células C3H10T1/2,

“ES” y “DFEAT” como ejemplos de células madre capaces de diferenciarse en

adipocitos. Dichos modelos se utilizan en cultivos tridimensionales, aisladas o

cocultivadas con otros tipos celulares para estudiar la relación del tejido adiposo con

otros tejidos [161].

1.6.2. Animales

Los modelos animales han supuesto una gran contribución para el entendimiento de

los parámetros que regulan el apetito y el balance energético. Dentro de ellos se

pueden diferenciar diferentes tipos según el origen de la obesidad, los cuales se

resumen en la siguiente tabla [162,163]:

64 Antecedentes

Table 4. Animal models of obesity.

MODELS EXAMPLES

Genetic Single-gene mutation

dominant

- Agouti mice

Single-gene mutation

recessive

- Ob mice

- Db mice

- Zucker rat

Polygenic mutation - New Zealand mice

- KK mice

- NH mice

Random mutation

Genetically engineered - Knockout of NPY1 receptor

- Beta 3 adrenergic receptor

Nutritional Diet-Induced Obesity - Wistar with cafeteria diet or

high fat diets (HFD)

- Sprague Dawley with HFD

- DR/DS SD rat

Pharmacological - Ciproheptadine

- Clonidine

Surgery Hypothalamus - Hypothalamic lesions

Ovaries - Ovariectomy

Others Selective breeding

Taken from Speakman et al. and Lutz et al. [162,163]

65 Antecedentes

De todos ellos, el fenotipo que más se acerca a la situación que experimenta el ser

humano es el modelo de obesidad inducida por la dieta, del cual hay numerosas

variantes normalmente utilizando ratas Wistar, Sprague Dawley o Long Evans

alimentadas con dietas hipercalóricas como la dieta cafetería o las dietas con alto

contenido en grasa (HFD), cuyo contenido en este macronutrientes está en torno al

45-60% [164]. En general estos modelos presentan la mayor parte de las

características del fenotipo obeso humano, tales como un aumento de los FFA,

triglicéridos, glucosa e INS en sangre, esteatosis hepática moderada o grave y aumento

de los factores inflamatorios [165]. Las características de dicho modelo dependerán

del tipo de grasa (manteca de cerdo, oliva, pescado o coco), del porcentaje presente

en la dieta y de la duración del periodo de inducción, observándose una obesidad y

resistencia a la INS más marcada con las dietas que contienen grasa procedente de

aceite de oliva o manteca de cerdo [166].

Entre las alteraciones asociadas a la ingesta de HFD se incluyen:

- Modificación de la morfología intestinal: incremento de la altura de las

vellosidades, de la profundidad de las criptas y del grosor de las

microvellosidades, lo que hace que se incremente el número de enterocitos

por vellosidad y se aumente la absorción de grasa [167,168].

- Cambios en las funciones gastrointestinales:

o Modificación de la secreción pancreática [169], en particular

incremento de la secreción de lipasa pancreática [170] y disminución

de la amilasa pancreática en respuesta a CCK [171].

o Mayor velocidad de vaciado gástrico [131], aceleración del tránsito en

intestino delgado [172] y aumento de la motilidad

antropiloroduodenal [130], todo ello relacionado con la menor

exposición del intestino distal a la grasa al aumentar la eficacia de

absorción [173].

- Transcritos de genes relacionados con la absorción de grasa que están

disminuidos tras una ingesta de HFD a corto plazo [174] y aumentados a largo

plazo (más de un 20% de energía en forma de grasa) [175].

66 Antecedentes

- Disminución del periodo entre comidas así como aumento del tamaño de la

segunda y la tercera comida [176].

- Remodelación neuronal del hipotálamo, que redundaría en una alteración del

balance energético en el individuo y una reprogramación al alza del BW

teórico en el hipotálamo [177].

Además existen otros modelos como los cerdos minipig [164] o los monos rhesus,

macaco o babuino a los cuales también se les induce obesidad por medio de la dieta,

aunque son mucho menos utilizados debido a la necesidad de instalaciones y permisos

específicos [178].

2. REGULACIÓN DEL PESO CORPORAL. BALANCE DE ENERGÍA

2.1. INTRODUCCIÓN

El equilibrio de energía corporal tiene dos componentes: las entradas de energía,

representadas por la ingesta de alimentos y, por lo tanto, la energía absorbida y

metabolizada que contienen, y las salidas de energía, es decir, los gastos energéticos.

La estabilidad del BW requiere que la cantidad de energía ingerida y la cantidad de

energía consumida (o gasto energético total (GET)) se encuentren en equilibrio. Si el

equilibrio anterior no está balanceado se puede producir un déficit de energía (si es

prolongado haría que disminuyera el BW) o un exceso, que a medio-largo plazo hace

que la energía se almacene en forma de grasa con el consecuente aumento del BW

[179].

La ingesta de alimentos es un proceso que se encuentra altamente regulado tanto por

un control nervioso y endocrino de carácter homeostático como por otros factores

que actúan de un modo no homeostático, dícese de la apariencia de la comida, el

sabor, disponibilidad, factores sociales, culturales y económicos. En conjunto dichos

factores interaccionan generando respuestas orexigénicas o anorexigénicas según el

momento [180].

67 Antecedentes

Dicha regulación homeostática se encuentra encaminada a controlar tanto la cantidad

de alimento ingerido en una comida (saciación), como el tiempo transcurrido entre

una comida y otra (saciedad). Ambos conceptos a menudo se confunden en la

bibliografía y a la saciedad la definen como una combinación entre saciación y

saciedad [181].

Aparte de los anteriores, existen otros conceptos necesarios para entender la

regulación de la ingesta [98]:

- Hambre: Sensación biológica de necesidad de alimento.

- Apetito: Deseo de alimento.

- Tasa de ingesta: Cantidad de alimento/duración de la comida.

- Relación de saciedad: Intervalos entre comidas/cantidad de alimento.

- Palatabilidad: Medición subjetiva de placer debida a la comida.

- Índice de saciedad: Cálculo de la saciedad basado en índices subjetivos

después de ingerir alimentos.

2.2. ENTRADA DE ENERGÍA (INGESTA DE ALIMENTOS) Y SU

REGULACIÓN

La regulación de la ingesta involucra principalmente una red neuronal que incluye

estructuras desde el hipotálamo hasta el bulbo raquídeo, la cual es sensible a señales

relacionadas con la ingesta y con el estado energético del individuo así como otra red

que se encarga de procesos relacionados con el apetito y de la recompensa

(involucrado entre otros el sistema cortico-límbico), la cual no posee un control

homeostático y que se encuentra constantemente bombardeada por señales externas

del ambiente que pueden resultar en un incremento de energía en individuos

genéticamente predispuestos [182].

2.2.1. Recepción y generación de señales

Señales sensoriales y cognitivas

Los alimentos ingeridos entran por la cavidad bucal siendo triturados y lubricados por

la saliva e iniciándose la digestión de los hidratos de carbono y los TGs en menor

68 Antecedentes

medida. Esta cavidad posee un componente sensitivo importante a la hora de

informar de los sabores de los diferentes alimentos, detectando el sabor dulce, salado,

ácido, amargo y umami (asociado al glutamato) [183]. Recientemente se ha visto en

ratones que existen unos receptores de unión a ácidos grasos denominadas CD36,

posiblemente asociadas a vías gustativas [184], lo que puede indicar que el cerebro

pueda “saborear” las grasas, así como ciertos receptores detectarían aminoácidos (AA)

[185]. Ambos hechos revelan una posible detección de nutrientes ya en la cavidad

bucal. Por otra parte también se genera información sobre diferentes parámetros

físicos del alimento, como la textura y la temperatura, que pueden influir sobre la

ingesta [186].

Señales generadas en el sistema digestivo y páncreas

Cuando la comida pasa al estómago, en él se producen cambios de volumen, los cuales

son detectados por mecanorreceptores que captan tensión y estiramiento,

transmitiendo dicha información a través de aferencias vagales, lo que puede inhibir la

ingesta de forma acusada [187-189].

El sistema digestivo tiene enormemente desarrollada la función secretora endocrina

siendo el mayor sistema endocrino del cuerpo. Las células encargadas de dicha función

se denominan enteroendocrinas (EEC) y se localizan en la mucosa, intercaladas entre

el resto de células, constituyendo el 1% del total. Se distribuyen desde el estómago

hasta las partes más distales del intestino y se caracterizan (con alguna excepción) por

poseer una diferenciación apical con el típico borde en cepillo y una base con una

desarrollada maquinaria secretora. Poseen distintos receptores capaces de detectar

los nutrientes y otras sustancias presentes en la luz, y se pueden distinguir al menos 20

tipos diferentes, cuyos productos ejercen diversas funciones relacionadas con la

ingesta y sistema inmune, entre otras [190,191].

En los últimos 50 años, poco a poco se ha ido aclarando la compleja red que supone la

regulación del apetito y la ingesta, descubriéndose numerosos reguladores peptídicos

que, además de en el control de la ingesta, participan en diversas funciones del

sistema digestivo como la motilidad gastrointestinal, digestión y absorción de

nutrientes, efecto trófico digestivo y secreción de otros péptidos. Sus mecanismos de

69 Antecedentes

acción son variados, actuando de forma neurocrina, endocrina, paracrina y autocrina

[192].

De entre estos péptidos nos vamos a centrar en algunos de los que por ahora mejor se

han estudiado, como son la AMY, CCK, GIP, GLP-1, PP y PYY, todos ellos relacionados

con la ingesta a corto plazo. Revisaremos también el papel de las hormonas INS y LEP,

más implicadas en la regulación a largo plazo.

Amilina (AMY)

Descubrimiento y estructura

A principios del siglo pasado se describieron por primera vez los denominados

agregados amiloides que se presentaban de una forma muy marcada en el páncreas

de enfermos con T2DM [193]. Posteriormente en 1987, dos laboratorios de forma

independiente analizaron más detalladamente dichas formaciones desvelándose la

estructura del polipéptido amiloide de los islotes o amilina (AMY) [194,195].

Se trata de un polipéptido de 37 AA, formado por un núcleo central bastante

conservado y dos secuencias variables que lo flanquean, las cuales son eliminadas

[196]. Comparte homología con la calcitonina y el péptido relacionado con el gen de la

calcitonina (CGRP), agrupándose en la familia de péptidos de la calcitonina [197].

Una de sus características es la existencia de un puente disulfuro entre dos cisteínas

en las posiciones 2 y 7 que es clave en su actividad biológica [198], así como la

formación de los ya comentados agregados amiloides en humanos y felinos, no así en

otros mamíferos con una secuencia similar, lo que ha hecho que su implicación en la

T2DM no haya sido generalmente aceptada. Dichos agregados han sido ampliamente

estudiados y se conoce bastante su fisiología, sin embargo, se desconoce exactamente

el mecanismo concreto por el cual afectan a las células pancreáticas en la T2DM [199].

Secreción y regulación

La AMY se obtiene a partir de un precursor de 89 AA denominado proamilina la cual es

procesada en el retículo endoplasmático y aparato de Golgi para ser almacenada junto

con la INS y el péptido C en los gránulos de las células β del páncreas [200]. Dicha

colocalización con la INS hace que ambas tiendan a secretarse juntas en una relación

70 Antecedentes

AMY:INS de 1:100, proporción que puede variar dependiendo del estímulo [201] y del

estado fisiológico del individuo, como en el caso de la obesidad, donde se produce un

desajuste (con un aumento de la AMY respecto a la INS) tanto en humanos como en

roedores [202,203].

El principal estimulante de su secreción es la glucosa, produciéndose en humanos una

respuesta postprandial aguda tras la ingesta de alimento que puede llegar a

cuadruplicar o quintuplicar la concentración de AMY basal y que va en proporción de

la cantidad ingerida de éste [204]. Además, se produce un aumento significativo ante

una comida estándar [205] o rica en carbohidratos [206].

Receptores: tipos, señalización y localización

El caso de los receptores de la AMY es poco común, ya que no posee receptores

específicos, sino que son complejos formados por el receptor de la calcitonina (CTR) y

por una proteína modificadora de la actividad del receptor (RAMP). La unión de RAMP,

hace que aumente la afinidad por la AMY unas 20 o 30 veces más que sin ésta (según

estudios en células COS-7) [207]. Existen dos tipos de CTR (a y b) y tres tipos de RAMPs

(1, 2 y 3), los cuales se pueden combinar de seis formas diferentes [208]. Estudios de

hibridación in situ han puesto de manifiesto la expresión de CTRa-RAMP2 y CTRa-

RAMP3 en el área postrema (AP) [209].

En estudios como el anterior y otros [210], se ha visto que la lesión en el AP bloquea la

respuesta a la AMY y que si los antagonistas de este péptido disminuyen la actividad

en dicha zona, todo lo cual muestra de forma evidente que el AP es crucial para la

regulación de la ingesta mediada por la AMY. No obstante, la AMY también podría

actuar (probablemente de forma indirecta debido al aislamiento por la barrera

hematoencefálica (BBB)) en otras zonas del tronco encefálico, como el núcleo del

tracto solitario (NTS) y el núcleo parabraquial (NPB) [211-213]. Tampoco se descarta

una actuación de la AMY sobre el hipotálamo y núcleo central de la amígdala mediante

acciones indirectas mediadas por neuronas histaminérgicas [214-216].

Por último, en experimentos en los que se alimenta a ratas con dietas altamente

palatables se ha visto una disminución de la ingesta a corto y largo plazo tras la

administración del péptido, lo que se asocia a la activación del NA (implicado en los

71 Antecedentes

fenómenos de recompensa y hedonismo), efecto que probablementesea indirecto,

como en el caso del NTS y NPB [217].

Concentraciones circulantes, tiempo de vida media y degradación

Las concentraciones basales de AMY están en torno a 50-138 pg/ml en ratas [218,219]

y 15.6 pg/ml en humanos, con un tiempo de residencia media en estos últimos de

aproximadamente 180 minutos tras un test de tolerancia a glucosa (OGTT) [220].

Debido a que este péptido tiene la tendencia a agregarse en condiciones que

favorecen la T2DM, conviene diferenciar entre la degradación intracelular, llevada a

cabo por la enzima degradadora de INS (capaz de degradar gran parte de la AMY

presente) [221] y la degradación sistémica que se produce en el riñón casi en su

totalidad [222].

Efectos sobre la ingesta

En numerosos estudios se puesto de manifiesto una disminución en la ingesta tras la

administración periférica de AMY [223-225], subrayando que dicho efecto parece ser

independiente de las concentraciones plasmáticas basales de dicho péptido y está más

influenciado por el aumento súbito postprandial [226]. Dicha acción puede estar

mediada en menor o mayor medida por una disminución en el vaciado gástrico [227-

229].

La administración periférica (subcutánea) de AMY produce en ratas un efecto mayor y

más sostenido durante el periodo diurno que nocturno, mientras que cuando la

administración es central -intracerebroventricular- ocurre a la inversa Olsson et al.

[230], lo que hace pensar que hay variaciones en el mecanismo de acción

dependiendo de la fase del día [230]. La acción anorexigénica de la AMY no es debido

a un efecto de aversión por la comida [231]. En ratas Zucker obesas genéticas

(hiperinsulinémicas, hiperleptinémicas e hiperamilinémicas) [232,233], la

administración de un antagonista de la AMY (AC 187) aumenta la ingesta respecto a

los controles [234].

Las investigaciones que se han hecho a largo plazo, han demostrado también una

disminución de la ingesta y del BW, sobre todo debido a la disminución del tejido

72 Antecedentes

adiposo [235]. Como es de esperar, el bloqueo de la AMY propicia un incremento de la

ingesta y de la adiposidad a largo plazo [236].

En humanos la mayoría de estudios se han llevado a cabo con el análogo pramlinitida

(usado como tratamiento de la diabetes), la cual puede tener un gran potencial como

tratamiento contra la obesidad [237,238].

Obesidad y AMY

En los últimos años diferentes estudios han puesto de manifiesto un posible papel de

la AMY (además de como señal a corto plazo) como reguladora del gasto energético y

a través de actuaciones a largo plazo:

- Efectos a largo plazo, como inhibir la frecuencia de la ingesta tras una

administración crónica [239].

- En situaciones de obesidad en animales y en humanos aumentan las

concentraciones plasmáticas basales de AMY en comparación con individuos

delgados [240,241]. No obstante, parece que no se desarrolla resistencia como

ocurre con la LEP y la INS, tal y como demuestran estudios en los que la

administración aguda de AMY en dosis altas a ratas con obesidad inducida por

la dieta, sigue produciendo efectos anorexígenos hasta 10 semanas desde la

introducción de la dieta, disminuyendo solo ligeramente tras periodos más

largos [242].

- Además se ha observado un aumento en el gasto energético en ratas tras la

administración en agudo del péptido [243].

- Como mencionamos anteriormente, la administración a ratas Zucker obesas

genéticas (hiperinsulinémicas, hiperleptinémicas e hiperamilinémicas), de un

antagonista de la AMY (AC 187) aumenta la ingesta respecto a los controles

[234].

Todos estos argumentos revelan un gran potencial de la AMY en su uso en la obesidad,

ya que aparentemente en dicho estado no se produce una resistencia, al contrario de

lo que ocurre con la INS, LEP y probablemente con la CCK.

73 Antecedentes

Relación con otros péptidos

CCK

Existe un efecto sinérgico muy acusado entre la CCK y la AMY en la disminución de la

ingesta a corto plazo [244]. De acuerdo con los trabajos de Mollet et al. [245] en

ratones, parte del efecto anorexigénico de la CCK se debe a la AMY, posiblemente

porque module la acción de la CCK a nivel del sistema nervioso central (CNS) [245].

Leptina

Se han llevado a cabo diferentes estudios en ratas [246-248] que han demostrado

tanto una disminución en la ingesta (hasta el 15%) como en el BW tras la

administración conjunta de AMY y LEP. La disminución del BW se debía, además, a una

reducción de los depósitos grasos, a su vez relacionada con un descenso de la

expresión de las enzimas implicadas en la síntesis de grasa y un aumento de las

relacionadas con la utilización de lípidos [246-248].

Los mecanismos de cooperación de AMY y LEP se han estudiado ampliamente,

existiendo revisiones como la de Trevaskis et al. [249], que destacan una posible

interacción de ambos péptidos a nivel tanto del tallo (AP) y del hipotálamo

(principalmente ARC), aunque se desconoce la espacio-temporalidad. Estos estudios

constituyen un campo para posibles fármacos anti-obesidad.

En humanos sometidos a un ayuno prolongado (disminución de la LEP en un 21% y de

la AMY en un 67%), el reemplazo de la LEP no afecta a las concentraciones plasmáticas

de AMY ni de forma aguda, ni crónica (en mujeres con hipoleptinemia no severa),

hecho que no excluye la interacción de ambos péptidos a otro nivel [250].

GLP-1

Ambos péptidos, AMY y GLP-1, activan neuronas del AP en situación de ayunas, hecho

que revierte tras la administración de aminoácidos. No obstante, estudios de marcaje

neuronal indican que las vías de actuación de estos dos péptidos no solo son

complejas, sino que difieren entre sí [251]. En humanos, la secreción de AMY, al igual

que la de INS, se estimula por GLP-1, sin producirse cambios en la proporción

INS:AMY.

74 Antecedentes

INS

Aunque no existe demasiada información al respecto, parece ser que tras la

administración conjunta de AMY e INS conjuntamente en ratas genera una

disminución en la ingesta acumulada en un plazo de 4 horas, hecho que no se produce

tras su administración por separado [252].

PYY

Roth et al. [253] refieren una disminución de la ingesta en 24 horas en dos tipos de

ratas y uno de ratón con obesidad inducida por HFD [253] tras la administración de

forma intraperitoneal (i.p.) de AMY junto con PYY (3-36). Dicho efecto parece

producirse a nivel del área postrema [254]. No obstante no se conocen en profundidad

los mecanismos de la interacción entre ambos péptidos.

Perspectivas futuras

En general, aunque se conocen bastantes aspectos de la fisiología de la AMY, quedan

por dilucidar muchos de los mecanismos subyacentes en relación con la regulación de

la ingesta, del BW y del gasto energético. Nuevas técnicas como el análisis mediante

escáner cerebral y más estudios en humanos serán vitales para aclarar su fisiología,

pudiendo así servir de herramienta eficaz en la lucha contra la obesidad.

Puntos clave

Existen numerosas evidencias de su papel como señal anorexígena a corto plazo.

Posible influencia sobre la ingesta a largo plazo con la consecuente implicación en la

obesidad.

Sus características convierten a este péptido en un buen candidato a ser utilizado

como fármaco (sobre todo análogos como la pramlinitida).

Colecistoquinina (CCK)

Descubrimiento y estructura

El péptido colecistoquinina (que literalmente significa “movedora de bilis de la

vesícula”), fue descubierto, o más bien propuesta su existencia por Ivy y Oldberg [255]

en 1928 cuando observaron una contracción de la vesícula biliar tras la inyección de

75 Antecedentes

una infusión lipídica en el intestino delgado. Un tiempo después (1943), Harper y

Raper [256] extrajeron una sustancia de la mucosa intestinal que inducía la secreción

pancreática denominándola pancreozimina. No fue hasta 1968 cuando Jorpes y Mutt

[257] aislaron de la mucosa intestinal del cerdo un péptido de 33 aminoácidos que

resultó ser la misma sustancia que la CCK y pancreozimina, denominándola de la

primera forma definitivamente.

Dicha molécula es sintetizada a partir de un péptido precursor de 95 AA designado

pro-CCK, el cual tras someterse a un proceso de amidación en la secuencia 84-86 (Gly-

Arg-Arg), es procesado por convertasas y carboxipeptidasas para producir en primera

instancia un péptido de 83 AA denominado CCK-83 que puede ser escindido

(dependiendo el tejido), obteniéndose las denominadas CCK-58, CCK-33, CCK-22 o

CCK-8, hallándose todas tanto en roedores como en humanos [258].

Secreción y regulación

La CCK es secretada por las células EEC de tipo I, que se encuentran mayoritariamente

en la zona superior del intestino delgado (duodeno y yeyuno) [259]. Son típicas células

secretoras endocrinas, con una marcada polaridad apical-basal, en cuya base se

encuentran los gránulos que contienen la CCK, así como unas estructuras parecidas a

pseudópodos recientemente descubiertas que pueden relacionarse con la

comunicación con células adyacentes [260].

Su secreción es estimulada principalmente por proteínas [261] y grasa [261,262] y en

menor medida por carbohidratos [261]. Dicha estimulación concuerda con el hecho de

que los alimentos ricos en esos nutrientes muestran el mayor índice de saciedad [263].

En el caso de la grasa se observa un mayor efecto por parte de los ácidos grasos de

cadena larga (>12 C) [264]. Además, dichos FFA actúan de forma indirecta sobre el

vago ya que promueven la liberación de CCK que actúa de forma paracrina sobre

receptores para CCK presentes en las terminaciones aferencias vagales del intestino

[265]. Es capaz de estimular la secreción de lipasa gástrica hasta el cuádruple de la

secreción normal [266]. Se observa un incremento de los niveles de CCK con la edad

en humanos [267].

76 Antecedentes

Respecto a las concentraciones circulantes, en diversos estudios en los que se utilizan

diferentes inhibidores de proteasas en sangre, se detectaba fundamentalmente la

CCK-8, 22 y 33 y ausencia de la CCK-58. Tras un revelador estudio llevado a cabo por

Reeve et al. [268], usando CCK de los diferentes tipos marcadas radioactivamente, se

llegó a la conclusión de que el protocolo utilizado para obtener las muestras causaba

una alta degradación de la CCK-58 y de que los anticuerpos utilizados fallaban en su

detección, proponiéndose un método optimizado de recuperación gracias al cual se

dedujo que la CCK58 es la forma predominante en ratas (probablemente también en

humanos y perros) [268].

Receptores: tipos, señalización y localización

Existen dos tipos de receptores para la CCK que pertenecen al grupo de los receptores

acoplados a proteína G identificados conocidos como CCK1R (CCKAR) y CCK2 (CCKBR),

los cuales tienen un 50% de homología entre sí. El CCK1R se localiza en la capa

muscular de la vesícula biliar, neuronas pancreáticas (en humanos, en ratas además

los hay en las células acinares), músculo liso pilórico y neuronas entéricas. Los CCK2R

se sitúan en la mucosa oxíntica del estómago y en diversas zonas del encéfalo como el

núcleo estriado, corteza y sistema límbico, lugares que se relacionan con su función

como neurotransmisor [269].

Concentraciones circulantes, tiempo de residencia media y degradación

Gran parte de la CCK secretada actúa de forma paracrina activando las fibras nerviosas

vagales y el resto entra en la circulación portal y pasa por el hígado antes de

detectarse en plasma [270]. Debido a la degradación que se produce en dicho

recorrido la concentración de CCK en estado de ayunas está en torno a 70-250 pg/ml

[271,272] en ratas y 1-2,5 pM en el ser humano, aumentando hasta 5-6 pM alrededor

de los 15-30 minutos postprandiales y produciéndose un descenso paulatino hasta el

retorno a valores basales más allá de los 60 minutos [273,274].

Efectos sobre la ingesta

Como se ha comentado, las concentraciones plasmáticas de CCK son bajas en ayunas,

lo que por un lado hace que aumente la expresión de receptores cannabinoides de

tipo 1 (CB1) [275] y hormona concentradora de melanina 1 (MCH-1) [276], y por otro

77 Antecedentes

se bloquee la expresión del transcrito regulado por cocaína y anfetamina (CART) en las

neuronas vagales, hechos que redundan en una estimulación de la ingesta. Los

sucesos opuestos ocurren cuando se ingiere alimento y se secreta CCK (disminuye la

expresión de los receptores CB1 y MCH-1 [276] y la expresión del péptido CART [277]),

de forma que se inhibe la ingesta. No obstante se ha propuesto que dichas

regulaciones se llevan a cabo gracias a la cooperación de la CCK con la LEP (ver más

adelante).

Es un hecho bastante conocido que la CCK secretada por las células de tipo I actúa en

parte a nivel de las terminaciones nerviosas que expresan CCK1R [278,279]. Este

hecho se manifiesta en una activación del NTS en conexión con la amígdala [280], lo

que deriva en una serie de efectos que van desde disminución del vaciado gástrico

[281] hasta contracción de la vesícula biliar [282] y estimulación de la secreción

pancreática [283].

En relación con la ingesta, numerosos estudios en diferentes modelos (entre los que se

encuentra el ser humano) han puesto de manifiesto que tras una inyección

intravenosa (i.v.) de CCK-8 se produce una disminución del tamaño de las comidas

[284-286], no así la ingesta total diaria, lo que revela una implicación principalmente

en el proceso de terminación de la comida o saciación más que en la duración del

periodo entre comidas o saciedad [281].

No obstante, podría haber también un efecto sobre la ingesta a largo plazo. Así, las

ratas OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty), las cuales no expresan los

receptores CCK1R, se caracterizan por una mayor ingesta de alimento en un mismo

periodo de tiempo respecto al control, con el consecuente desarrollo de obesidad

[287]. En estas ratas, la ausencia de receptores CCK1R en el hipotálamo dorsomedial

(DHM) hace que en esta región se sobre-exprese el neuropéptido Y (NPY) [288], siendo

esto la causa del aumento en la ingesta y el BW en este modelo.

Por otra parte, en ratones con una mutación similar se produce un aumento del

tamaño de las comidas pero la ingesta total diaria es similar a los controles [289]. Al

contrario que las ratas, éstos son capaces de compensar la falta de señal de la CCK sin

78 Antecedentes

que aumenten los niveles de NPY, lo que hace que no se produzca la hiperfagia y

obesidad de las primeras [290].

De los estudios anteriores parece deducirse una relación entre la CCK y NPY más

compleja de lo que se pensaba, lo que requiere la realización de estudios más

detallados.

Obesidad y CCK

El papel de la CCK en la obesidad no está del todo claro, ya que en algunos modelos de

ratas existe una disminución de la sensibilidad a la CCK [291], pero en otros como las

ratas con obesidad inducida por dieta o diet-induced obesity (DIO) aumenta [292]. En

humanos se ha descrito una respuesta bilio-pancreática a CCK exógena menor en

obesos [293], sugiriendo una disminución de la sensibilidad a la acción del péptido. Sin

embargo, otros trabajos han mostrado un efecto saciante similar en sujetos obesos y

delgados tras una la administración de una infusión de CCK [294]. Por otro lado las

concentraciones circulantes en humanos permanecen iguales [295] o aumentan en

mujeres obesas [296].

Estos datos, junto con los comentados anteriormente, muestran que la interacción de

la CCK con el resto de péptidos (véase LEP, GRN e INS) es clave en la regulación de la

ingesta y el BW tanto en roedores como en humanos.

Relación con otros péptidos

Grelina

Estudios como el de Kobelt et al. [297] han demostrado que la CCK inhibe el efecto

orexigénico de la GRN cuando ambas se administran de forma periférica [297].

Insulina

En humanos la CCK parece potenciar la secreción de INS estimulada por aminoácidos

[298]. Por otro lado, la administración de CCK en ratas es capaz de reducir el aumento

en el tamaño de la comida y la hiperfagia inducidas por dosis hipoglucemiantes de INS

[299]. Todo ello hace pensar en la acción de la CCK no sólo como señal periférica y

central de saciedad, sino también con una implicación en vías glucorreguladoras.

79 Antecedentes

Leptina

La importancia de la CCK en la regulación del BW es significativa, observándose en

diferentes estudios que ésta actúa en conjunción con la LEP sobre el hipotálamo

[300,301], de forma que produce una disminución del BW respecto a los controles,

hecho que por separado no ocurre y que probablemente se deba a que la CCK facilita

la acción de la LEP sobre el sistema nervioso central [302]. La interacción entre LEP y

CCK podría darse adicionalmente a nivel periférico, como sugiere la colocalización de

receptores para ambos péptidos en neuronas aferentes vagales [303].

PP

Aunque son escasos y algo antiguos los estudios que relacionan ambos péptidos, se ha

descrito que la CCK secretada en respuesta a la comida promueve la secreción del PP

en humanos y en perros [304,305].

PYY

Estudios realizados en perros [104] indican que la CCK es capaz de estimular la

secreción de PYY.

Perspectivas futuras

Por sí sola, la CCK no tiene una influencia determinante a medio-largo plazo sobre la

ingesta; no obstante, la conexión que tiene con el resto de péptidos tanto a corto

(GRN y AMY) como a largo plazo (LEP e INS) es determinante para su acción fisiológica.

En este sentido, la combinación de las distintas hormonas para tratar la obesidad

supone un campo inexplorado de estudio.

80 Antecedentes

Puntos clave

La secreción de CCK se estimula preferentemente por nutrientes como AA y ácidos

grasos de cadena larga.

Actuación sobre los receptores Y2 (situados en el nervio vago) y estimulación de la

expresión de la proteína reguladora CART, así como inhibe la acción de los receptores

CB1 y la expresión del MCH-1.

Interacción con péptidos que actúan sobre la ingesta a corto plazo (GRN y AMY) y a

largo plazo (INS y LEP).

Péptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP)

Descubrimiento y estructura

En 1971 Brown y Dryburgh [306] fueron los primeros en publicar la secuencia del

péptido que denominaron péptido inhibidor gástrico, ya que en perros (no así en

humanos) se observó un efecto inhibidor de la secreción gástrica [307] La

denominación inicial derivó en péptido insulinotrópico dependiente de glucosa,

quedando clara su implicación en la homeostasis glucídica [308,309]. De este modo, se

ha agrupado al GIP junto al GLP-1 en el denominado grupo de hormonas incretinas,

concepto propuesto por primera vez por Starling y Bayliss hace más de un siglo [310].

El efecto incretina se define como la amplificación de la respuesta insulínica que se

produce tras la ingestión oral de glucosa frente a la administración de una cantidad

equivalente por vía intravenosa. Este efecto se debe a la estimulación que GLP-1 y GIP

ejercen sobre el páncreas [311], contribuyendo ambas a tal efecto de forma equitativa

[312].

El GIP deriva de un péptido precursor denominado preproGIP que consta de 144 AA en

roedores y 153 en humanos, cuya maduración parece llevarse a cabo de forma

mayoritaria debido a la proteasa PC1/3, según muestran estudios en roedores

knockout para dicha proteína. Dicho proceso genera de forma predominante el GIP 1-

42 que se considera como la forma activa, siendo la mejor estudiada, aunque se

pueden producir procesamientos alternativos que generan GIP 1-30 amida y otro

péptido de 6.5 kDa, cuyo efecto no es del todo conocido [313].

81 Antecedentes

Secreción y regulación

Secretado por las células K que se encuentran de forma predominante en el duodeno

y yeyuno superior, se detecta también en células endocrinas en las que el GLP-1 y GIP

se co-localizan [314]. Además de en el intestino, se ha puesto de manifiesto la

presencia de ARNm de GIP en el páncreas, glándulas salivares, estómago y diferentes

áreas del encéfalo, aunque poco se conoce sobre la función del GIP en dichos lugares

[313].

La ingestión de comida en humanos produce un aumento de la secreción de GIP

proporcional al tamaño de ésta (mayor estímulo con grasas y glucosa), con un pico

máximo que aparece entre los 15-30 minutos [315,316], y permaneciendo sus

concentraciones elevadas hasta por lo menos 2 horas más tarde [317]. Dicho

incremento postprandial es más rápido que lo cabría esperar en base a la interacción

de dichos nutrientes con las células K, por lo que se ha postulado que la secreción de

GIP está en parte sometida a regulación nerviosa [318].

La secreción de este péptido se correlaciona con la absorción de nutrientes [319],

prueba de ello es la disminución drástica de su secreción hacia la linfa [320-322] tras la

administración de un inhibidor de la síntesis de quilomicrones. En definitiva, para que

los lípidos estimulen la secreción de GIP es necesario que se absorban [319].

Además, referido a la secreción estimulada por nutrientes, existen diferencias entre

humanos y roedores:

- En humanos, se estimula por la ingestión de comidas mixtas [323], así como

carbohidratos [323] y grasas [115], siendo más potentes los FFA de cadena

larga (>12 C) e insaturados [115,324]. En humanos, la manteca y la palmito

oleina interesterificada (IPO) disminuyen la secreción del GIP en comparación

con el aceite de girasol alto oleico (HOSO) y la palmito oleína (PO) [325]. Esto

sugiere que la conformación de los TG afectan a la secreción de GIP (el IPO

tiene idéntica composición que el PO pero mayor proporción de palmítico en

sn-2). La proteína parece tener poco efecto estimulante [323], aunque algunos

AA libres favorecen su secreción [326].

82 Antecedentes

- En ratas y cerdos, la grasa por sí sola estimula débilmente la secreción de GIP,

hecho que cambia cuando se administra conjuntamente con glucosa

[327,328]. La acción estimuladora de la glucosa requiere del transporte de

ésta al interior de la célula K, como demuestra la ausencia de secreción de GIP

tanto en presencia de phloridzina (un inhibidor del transportador SGLT-1)

[329] como en ratones knockout para dicho transportador [330]. La secreción

se estimula de forma significativa debido a TG [331], pero los monoglicéridos y

diglicéridos hacen que disminuya la secreción de GIP, aparentemente debido a

una interacción con los transportadores de glucosa (SGLT-1) y de grasa

(FAT/CD36), aunque se desconocen el resto de mecanismos que pueden estar

implicados [331]. Además, parece observarse en ratas [332] y perros [333] una

respuesta marcada ante la administración intragástrica de proteína, hecho que

está influido por la acidez de la secreción gástrica [332].

Receptores: tipos, señalización y localización

El receptor del GIP (GIPR), es un receptor acoplado a proteínas G cuya expresión es

bastante ubicua, hallándose su ARNm en páncreas, estómago, intestino delgado,

tejido adiposo, glándula pituitaria, corazón, testículos, células endoteliales, así como

en varias regiones cerebrales como el córtex cerebral, hipocampo y bulbo olfatorio

[334].

Concentraciones circulantes, tiempo de residencia media y degradación

Este péptido sufre una degradación muy rápida por la dipeptidil peptidasa-4 (DPP-4),

habiéndose establecido su vida media en sangre en tan sólo 7 minutos hasta que se

degrada a la forma inactiva GIP 3-42 [317]. Esto hace que las concentraciones

plasmáticas en ayunas sean bajas, alrededor de 20-100 pg/ml en ratas [218,335] y 20

pg/ml en humanos [336].

Efectos sobre la ingesta

Existe toda una plétora de estudios en relación con el papel del GIP en la secreción de

INS inducida por glucosa y en la disminución de la apoptosis de las células β

pancreáticas, así como su implicación en el metabolismo lipídico, remodelación ósea

83 Antecedentes

[337,338] y actuación como neurotransmisor y posible factor neuroprotector [339-

341].

Respecto a su papel en la ingesta y apetito no hay un efecto inhibidor ni en roedores

[342,343] ni en humanos [344,345] en situación normal, no así en otras condiciones

como las del estudio de Kim et al. [346], donde se observó que en ratones

transgénicos que sobreexpresaban el GIP mantenidos con una HFD durante 18

semanas, se producía una inhibición del apetito y reducción de la adiposidad y la

inflamación, todo ello en asociación con una mayor expresión de dicho péptido en

zonas del hipotálamo relacionadas con la regulación de la ingesta [346].

Obesidad y GIP

La ingestión de grasas y glucosa incrementa de forma significativa la secreción de GIP,

cuyas concentraciones plasmáticas están aumentadas en individuos obesos,

generándose una insensibilidad a dicho GP [347,348]. Además, el GIP promueve la

acumulación de grasa en los adipocitos y su ausencia provoca un aumento del gasto

energético asociado a la combustión de grasas, lo que se relaciona con el hecho de

que dicho péptido aumenta la actividad lipoproteína lipasa (LPL) en el tejido adiposo

[349]. Este efecto es dependiente de la INS, ya que en ausencia de ésta, el GIP no tiene

capacidad lipogénica [350].

En íntima relación con lo descrito anteriormente, cabe resaltar que los ratones

knockout para el receptor GIPR son resistentes a la obesidad inducida tanto por HFD

[350] como por ovariectomía [351]. En este último trabajo, la menor ingesta de

alimento observada en los animales deficientes en GIPR se asoció con una menor

expresión hipotalámica de NPY, lo que sugiere la existencia de interacciones entre

GIPR y los estrógenos a nivel de la regulación hipotalámica de la ingesta. Este último

hecho puede ser importante de cara a desarrollar fármacos para tratar la obesidad

[351].

Relación con otros péptidos

GLP-1

La colocalización del GIP con GLP-1 en algunas células EEC y su efecto común sobre la

secreción de INS son el exponente de la relación entre ambos péptidos, la cual

84 Antecedentes

aparentemente no va más allá de la colaboración en el efecto incretina. El GLP-1 está

más implicado en el control de la ingesta y funciones relacionadas con el sistema

cardiovascular, mientras que el GIP se relaciona más con funciones óseas.

Perspectivas futuras

Existen muchas lagunas en lo referente al papel del GIP en la regulación de la ingesta,

hecho que cambiará a corto plazo debido al auge del estudio de estos péptidos en

relación con el tratamiento de la obesidad.

Puntos clave

Debido a sus acciones en la lipogénesis y a su efecto incretina, el GIP influye en la

adiposidad del individuo.

No se descarta que el GIP tenga un papel en la regulación de la ingesta y el apetito,

pero se necesitan estudios más detallados.

Péptido análogo al glucagón-1 (GLP-1)

Descubrimiento y estructura

Ya se había observado en los años 60 en islotes pancreáticos de peces y mamíferos la

existencia de ARNm con dos secuencias peptídicas en tándem relacionadas con el

glucagón, las cuales no fueron secuenciadas hasta 1983 en hámster por el equipo de

Bell, denominándose péptidos similares al glucagón 1 y 2 (GLP-1 y GLP-2) [352].

En humanos y en ratas existen dos formas activas, el GLP-1 (7-37), que es el

predominante, y el GLP-1 (7-36) amida, las cuales son degradadas a GLP-1 (9-36)

amida y GLP-1 (9-37) [353].

Secreción y regulación

El precursor proglucagón es un péptido de 160 AA que se expresa por un lado en las

células α pancreáticas, dando lugar al polipéptido pancreático relacionado con la

glicentina (GRPP), el glucagón, y el fragmento principal del proglucagón (MPF), y por

otro, en las células L intestinales donde es procesado para producir el péptido

glicentina, GLP-1 y GLP-2 [354,355].

85 Antecedentes

Es importante destacar el hecho de que el GLP-1 se expresa tanto en el sistema

nervioso central (existen células inmunoreactivas para este péptido en el NTS de

ratas, monos y humanos [356,357]) como en el sistema digestivo. Es producido en las

células L, las cuales son EEC de tipo abierto y se encuentran más concentradas en el

yeyuno e íleon en humanos y cerdos, y en el íleon en ratas, aunque se encuentran de

forma dispersa por todo el intestino delgado y grueso [358].

Su secreción aumenta con la mera presencia de nutrientes en el intestino [319,359] y

se correlaciona con el tamaño de la comida [323]. Su principal estímulo es la glucosa (a

través de los transportadores SGLT) [360] y también se estimula por la grasa [116],

con una mayor secreción en respuesta a ácidos grasos de cadena larga (>12 C) [361] y

preferentemente los monoinsaturados respecto a los poliinsaturados [362], aunque no

está del todo claro hasta qué punto el grado de insaturación influye en la respuesta

[363]. Proteínas y AA también promueven su secreción [323,364].

Su secreción en humanos es bifásica, con un pico postprandial a los 10-15 minutos

seguido de un aumento menos marcado a los 30-60 minutos. Se ha propuesto para la

fase temprana la existencia de mecanismos nerviosos, aunque esto ha sido

cuestionado por estudios con íleon aislado y perfundido, que indican que la inervación

simpática del intestino inhibe la secreción del GLP-1, mientras que la inervación

extrínseca vagal no tiene efecto; en general una actividad colinérgica intrínseca parece

ser la predominante [365-367]. En ratas se produce un aumento progresivo en las

concentraciones circulantes hasta alcanzar un máximo a los 30 minutos, momento en

el que los valores van descendiendo de forma progresiva [368].

En mujeres se ha observado que con la edad se produce una mayor secreción de GLP-

1 tras la ingesta de HDC [369], aunque otros autores no han encontrado diferencias

entre sujetos mayores y de mediana edad (de ninguno de los dos sexos) en la

respuesta de GLP-1 a una comida estándar [370].

Receptores: tipos, señalización y localización

El receptor GLP-1R, del tipo asociado a proteína G, se encuentra ampliamente

distribuido en lugares como islotes pancreáticos, pulmones, corazón, riñón, estómago,

intestino, pituitaria, piel, ganglios nerviosos y diferentes regiones del CNS [371,372].

86 Antecedentes

Concentraciones circulantes, tiempo de residencia media y degradación

La vida media del GLP-1 es de menos de 2 minutos debido a que es rápidamente

degradado intravascularmente por la enzima DDP-4 a GLP-1 (9-37) o GLP-1 (9-36)

[373]. El sitio más aparente de limpieza de éste es el riñón [374].

Del 100% que se secreta sólo el 25% entra intacto en la vena porta [375] y llega al

hígado, donde se produce una degradación del 40-50%, estimándose que únicamente

un 10% alcanza el nivel sistémico. Las concentraciones plasmáticas basales del péptido

activo se encuentran en ratas en un intervalo de 50-120 pg/ml [218,376,377] y 30-50

pg/ml en humanos [336,378]. Los metabolitos producidos son también rápidamente

degradados en el riñón, con una vida media de 4-5 minutos [367].

Efectos sobre la ingesta

El GLP-1 es capaz de inhibir el vaciamiento gástrico en dosis fisiológicas y de manera

dosis-dependiente, de forma que la presencia de nutrientes en el íleon inhibe la

motilidad antro-piloro-duodenal así como el tono del fundus, y a la vez aumenta el

tono pilórico haciendo que disminuya la transferencia de nutrientes hacia el intestino

distal, lo que se denomina “freno ileal” [379]. Estos efectos se llevan a cabo, al menos

en parte, a través de mecanismos nerviosos, como se ha observado en animales con

ablación de las aferencias vagales [380,381]. Junto con el GIP, el GLP-1 interviene en el

aumento postprandial de las concentraciones plasmáticas de INS (efecto incretina).

Además, el GLP-1 promueve la síntesis de INS e inhibe la secreción de glucagón,

estimula la diferenciación y proliferación de las células β pancreáticas y tiene una

acción conservadora del hueso [382].

Respecto a la ingesta, en roedores se ha visto una disminución tras la administración

de GLP-1 tanto central [383,384], como intraperitoneal [385,386] e intravenosa [387],

así como de los análogos liraglutida y exendina-4 en agudo y crónico, periférico y

central [388]. Además la administración central de exendina-9 (antagonista del GLP-1)

anula el efecto anorexígeno del GLP-1 administrado directamente al CNS, pero no el

efecto del GLP-1 periférico. Por su parte, la exendina-9 periférica anula el efecto del

GLP-1 periférico, pero no tiene efecto si la administración de GLP-1 es central [389]. Se

ha advertido que si se une el GLP-1 con albúmina (evitando así el paso de la BBB) se

87 Antecedentes

sigue produciendo una disminución en la ingesta [390]. Además tanto en animales

[381,391], como en humanos [392], la vagotomía previene el efecto anorexígeno del

GLP-1.

Todos los efectos anteriores parecen deberse a su acción sobre zonas del tallo

encefálico como el NTS y el AP, y a nivel hipotalámico en los núcleos LH, PVN, DMH y

VMH [393,394] y en el ARC, donde sin embargo el efecto parece más relacionado con

el control de la homeostasis glucídica que de la ingesta [395]. Recientemente se ha

descubierto que el efecto anorexígeno producido por el GLP-1 en el cerebro depende

de la presencia de glucosa en sangre [396].

Teniendo en cuenta todos los estudios anteriores, parece evidente que el GLP-1 está

implicado en la regulación de la ingesta a corto plazo, no obstante, no queda del todo

claro si el efecto es predominantemente periférico o central. Ello es debido a varios

factores, como el hecho de que los experimentos en los que se administra de forma

exógena pueden no simular las condiciones fisiológicas, ya sea por la amplia

distribución del GLP-1R o porque los compuestos sintéticos tienen una vida media más

larga. Además en el cerebro no se sintetiza DPP-4 lo que también hace que el efecto

sea posiblemente más prolongado. En definitiva el factor clave para conocer los

efectos locales será el conocer los receptores que se activan en los diferentes lugares

en los que se administre [397].

Obesidad y GLP-1

Aunque el GLP-1 parece jugar un papel importante en la regulación de la ingesta, la

influencia en la obesidad no está tan clara. Tanto en obesos como en obesos mórbidos

parece ser que la respuesta a la comida [398] y la secreción total, estimada por el AUC

[399], es menor en comparación con individuos normopeso. Una pérdida de BW en los

individuos obesos normaliza la situación [399], y así como también el bypass yeyuno-

ileal, en asociación con el aumento de la secreción de las células L ante un incremento

de la llegada de nutrientes no absorbidos a la porción distal del intestino [400]. A

pesar de esto, el efecto inhibidor de la ingesta aparentemente no se modifica en la

obesidad [401].

88 Antecedentes

En estudios con obesidad inducida por HFD en ratas se observa un retardo en el efecto

que producen los agonistas del GLP-1, así como un aumento de los GLP1R en el

intestino y disminución en el cerebro [402]. Además, otros estudios con obesidad

inducida por dieta pero diferenciando entre ratas propensas o resistentes a desarrollar

la obesidad, sugieren que esta se asocia a un defecto en la secreción y actuación del

GLP-1, cuya resultante sería la hiperfagia y ganancia de BW [403].

Relación con otros péptidos

CCK

Son diversas las similitudes en la forma de actuar de ambas hormonas, liberándose

rápido y siendo degradadas también en poco tiempo y ejerciendo su efecto

anorexigénico a nivel del NTS. Igualmente, existen numerosas evidencias, del papel de

estos dos péptidos en la ingesta a corto plazo [389]. Además la CCK es capaz de activar

las neuronas productoras de GLP-1 que se encuentran en el tallo y que proyectan a

regiones del hipotálamo, lo que podría relacionarlas con los mecanismos de saciedad

de dichos péptidos [404].

PYY

En ratas, la administración i.p. conjunta de PYY y GLP-1 en dosis (3 y 30 nmol/kg,

respectivamente) que por sí solas no producen efecto (subumbrales), causa una

reducción significativa en la ingesta de alimento, Resultados similares se han descrito

en ratones delgados y obesos, así como en humanos. Este efecto aditivo muy

probablemente tiene lugar a nivel del ARC [405,406]. Por otra parte, se ha descrito en

humanos que el GLP-1 exógeno inhibe la secreción de PYY, lo que sugiere la existencia

de un feedback negativo del GLP-1 sobre las células L [407].

Perspectivas futuras

Como se ha visto, parece estar claro que el GLP-1 regula la ingesta a corto plazo

debido a su acción sobre los centros de integración nerviosos, aunque no se sabe

concretamente si el efecto se lleva a cabo a través de vías nerviosas (vagal),

endocrinas (acción directa sobre el encéfalo) o incluso debido a su expresión in situ en

este último. En resumen, queda mucho trabajo por realizar para concretar la fisiología

de este GP.

89 Antecedentes

Puntos clave

Su efecto anorexígeno a corto plazo es evidente, aunque queda por dilucidar si se lleva

a cabo a través de una actuación en el vago, debido a una acción endocrina del GLP-1

en el encéfalo o al propio GP que es expresado en este último.

El desarrollo de análogos que posean una mayor resistencia a la degradación está

suponiendo el principal avance en el desarrollo de herramientas contra la obesidad.

Grelina (GRN)

Descubrimiento y estructura

Es uno de los péptidos más recientemente descubiertos, en torno a 1999, cuando el

grupo de Kojima [408] logró aislarlo del estómago de la rata, tras una larga

investigación previa en búsqueda de un compuesto liberador de hormona del

crecimiento que actuaba por una vía diferente de la hormona liberadora de hormona

del crecimiento (GHRH) [409].

Consta de 28 AA y es sintetizado a partir de un péptido mayor de 117 AA denominado

preprogrelina (del cual se obtiene también la obestatina [307]), que es procesado por

la convertasa PC 1/3 y modificado por la grelina O-aciltransferasa (GOAT). Esta enzima

le añade un ácido graso de cadena media (radical acilo) en la serina 3, un tipo de

modificación única en péptidos de este tipo y que le confiere gran parte de su

actividad biológica. Dicha modificación puede ser de tipo octanoica (8:0), decanoica

(10:0) o decenoica (10:1) Aunque la GRN desacilada (sin adición) se ha considerado

inactiva, trabajos recientes informan de un posible un efecto orexígeno [410].

Secreción y regulación

Las células X/A (P/D en humanos) se identifican como células productoras de GRN,

denominándose “X” por no conocerse su producto de secreción y “A” por la similitud

de sus gránulos con los de las células α del páncreas [411]. Se localizan en la mucosa

gástrica y en el íleon, ciego y colon, siendo las gástricas en su mayoría de tipo cerrado

(morfología poco común en las células EEC) y las otras de tipo abierto [412].

90 Antecedentes

Los mecanismos fisiológicos en el tipo cerrado han sido difíciles de estudiar; no

obstante, estudios in vivo han mostrado que su secreción está regulada por el vago, ya

que en ratas vagotomizadas disminuyen las concentraciones circulantes a corto plazo

pero aumentan con el tiempo, lo que hace ver una regulación más compleja [413].

Además la mayoría de los nutrientes producen una inhibición de su secreción [414], al

igual que hace la INS, somatostatina (no en todos los experimentos) e hiperglucemia

[415].

Resultados de distintos estudios muestran la complejidad de esta regulación. Por

ejemplo, se ha descrito que la administración i.p. de gastrina y CCK aumenta la

secreción de GRN (activa y total) en ratas [416], Sin embargo, el hecho de que gastrina

y CCK se secretan después de la comida y exhiben concentraciones plasmáticas bajas

en ayunas nos llevaría más bien a pensar que ambos péptidos inhiben la secreción de

GRN. Por otro lado, la GRN estimula la secreción ácida del estómago vía nervio vago

[417], lo que sugiere que CCK y gastrina podrían estimular la GRN para aumentar la

secreción gástrica.

La supresión de la secreción se encuentra directamente relacionada con las calorías

ingeridas la una comida [418] y parece depender de la longitud de exposición del

intestino delgado (al menos en el caso de la glucosa) [419]. Respecto a los

macronutrientes, en ratas se ha observado el mismo nivel de inhibición con proteínas

(caseína y peptona), aceite de maíz, mezcla de triglicéridos de cadena media y por

último dextrosa [414], todo ello administrado intragástricamente. En humanos la

mayor inhibición se debe a glucosa [420] y a proteína [421] (aunque no en todos los

estudios [422]), siendo el efecto de la grasa menor en comparación con los otros dos

macronutrientes [423,424]. En ratas se ha observado una mayor supresión de la

secreción tras la administración intraduodenal de FFA de cadena larga (12 C) en

comparación a los de cadena corta (10C) [119].

El perfil de secreción en ratas es bimodal, con un pico sobre las 15.00 h y otro sobre

las 6.00 h, lo que coincide con el menor y mayor volumen gástrico, respectivamente,

hecho que a priori no concuerda con la función orexigénica de la GRN y que

probablemente se deba a una mayor complejidad en la función de esta. Una posible

91 Antecedentes

explicación, de nuevo, es que el primer pico estimule la ingesta y el segundo la

secreción gástrica. Se deben plantear estudios más detallados para dilucidar

exactamente la función de la GRN en ratas [416].

En humanos, a pesar de que existe una gran variabilidad interindividual, por término

medio se observa un pico alrededor de las 8.00 de la mañana para decaer a la mitad

de estos valores después del desayuno, ocurriendo lo mismo antes y después del

almuerzo y la cena (aunque los niveles mínimos son progresivamente mayores), y

culminando en un ascenso durante la noche hasta la mitad de ésta con un posterior

descenso previo el amanecer [425].

Respecto a la influencia de la edad sobre los niveles circulantes, han referido

aumentos en ratas adultas [426], no existiendo un consenso en humanos aunque

parece que disminuye [427] o no cambia [428]. Las concentraciones plasmáticas de

esta hormona están influenciadas por el sexo (hasta tres veces superiores en mujeres

que en hombres) [429] y también por el BMI [430], factores que pueden influir en los

resultados obtenidos en los diferentes estudios.

Receptores: tipos, señalización y localización

La GRN es un ligando endógeno del receptor denominado GHS-R o GRLN-R, el cual se

expresa en diferentes áreas del encéfalo, en el nervio vago, islotes pancreáticos,

hígado y en menor medida en músculo [431].

La acción de la GRN es directa sobre el sistema nervioso central, ya que es capaz de

atravesar la BBB actuando sobre el ARC donde activa las neuronas que expresan el

neuropéptido Y/péptido relacionado con la proteína agoutí (NPY/AgRP) e inhibe las

que poseen el péptido precursor de la pro-opiomelanocortina/transcrito regulado por

cocaína y anfetamina (POMC/CART). Además, recientemente se ha visto que activa

neuronas del área hipotalámica lateral y del NTS (muy posiblemente a través del

nervio vago), así como de la amígdala, corteza orbitofrontal, ínsula anterior y núcleo

estriado, que controlan el comportamiento respecto a la comida [432]. Por último hay

que añadir que la GRN se expresa en el CNS, más concretamente en neuronas

adyacentes al tercer ventrículo, entre los núcleos dorsal, ventral, PVN y ARC. Usando

técnicas de registro electrofisiológico se ha revelado la acción de este péptido

92 Antecedentes

imitando al NPY en el PVN, esto es indicativo de una acción directa in situ en el CNS,

además de las ya comentadas [433].

Concentraciones circulantes, tiempo de residencia media y degradación

La concentración sanguínea del péptido activo suele estar en torno a 80-90 pg/ml en

ratas [434,435]. En humanos oscilan alrededor de 500-600 pg/ml para la GRN total y

200-250 pg/ml para la forma activa [436].

El tiempo de residencia media depende de las señales que regulan negativamente la

ingesta como se ha comentado anteriormente, y de su degradación. Sobre esta última

se sabe que la eliminación del grupo acilo es llevada a cabo por la enzima

lisofosfolipasa APT1 en el estómago y quizás en sangre [437], y se ha propuesto la

posibilidad de una degradación por proteólisis N-terminal por carboxipeptidasas [438].

Efectos sobre la ingesta

La GRN es el único péptido circulante cuyo efecto es orexigénico, demostrado en

diferentes estudios tras administración tanto central en roedores [439] como

periférica en humanos [440], lo que se ve reforzado por el efecto opuesto de algunos

antagonistas de los GRLN-R [441,442]. Su concentración es más alta en individuos con

anorexia y se produce una mejora de los síntomas de la caquexia tras su

administración exógena [443]. Además de su acción sobre el ARC [444], recientemente

se ha puesto de manifiesto su posible actuación a nivel del PVN [445]. Teniendo en

cuenta lo anterior parece quedar claro que la GRN tiene un efecto en la ingesta a corto

plazo sobre todo por acción directa sobre el CNS.

Por otra parte, estudios en ratas confirman que la vagotomía anula el efecto

orexigénico de la GRN en administración periférica (4,9 μg/rata), pero no si la dosis es

de 12 μg/rata [446]. Estos efectos dosis-dependientes merecen estudio más detallado,

aunque parece claro que la GRN puede actuar por vía endocrina o nerviosa.

La GRN, al estimular la ingesta, hace que a largo plazo se acumule tejido adiposo [447],

existiendo una interacción más o menos directa con la INS y posiblemente con la LEP,

como se abordará más adelante.

93 Antecedentes

Obesidad y grelina

Como es de esperar, y de manera opuesta a lo que ocurre en pacientes con anorexia

[448], las concentraciones plasmáticas de GRN están disminuidas en individuos obesos

[449]. Paralelamente existe una correlación negativa entre concentraciones

circulantes y BMI, así como una menor supresión postprandial de su secreción, factor

que puede ser importante para una predisposición a la obesidad [449].

Además, la concentración basal de este péptido también se encuentra disminuida en

ratones obesos [450].

Relación con otros péptidos

CCK, GLP-1 y AMY

La acción orexigénica de la GRN como es lógico pensar, está inhibida por CCK [297] y

GLP-1 [451], no siendo así en el caso de la AMY [452].

Insulina

La relación entre uno y otro péptido es de antagonismo, claramente demostrado en

roedores [453,454] y en humanos (niveles farmacológicos) [455,456]. Además, como

se ha mencionado anteriormente, las células X/A muestran mecanismos para la

detección de glucosa, lo que concuerda claramente con las observaciones de que las

concentraciones de una y otra hormona se relacionan inversamente [425].

Leptina

Hay suficientes evidencias, como muestra la revisión de Wisser et al. de 2010 [457],

que sugieren un antagonismo entre ambas hormonas. Ejemplos de esto son la

inhibición mutua al administrarse periféricamente, o la estimulación de la ingesta por

parte de la GRN debido a la activación de las neuronas NPY/AgRp del ARC, ocurriendo

a la inversa en el caso de la LEP [457].

Perspectivas futuras

La GRN presenta un futuro prometedor en el tratamiento contra la obesidad con

diferentes frentes abiertos, como son el desarrollo de antagonistas, o el bloqueo de la

GOAT y/o de la secreción [91]. Los problemas que se pueden presentar, como casi

siempre en estos casos, se asocian a los efectos secundarios.

94 Antecedentes

Puntos clave

Es la única señal circulante con efectos orexigénicos lo que la hace una diana

interesante de cara al desarrollo de fármacos antiobesidad.

El efecto sobre la ingesta se produce directamente en el encéfalo (hipotálamo, NTS y

otras áreas superiores), debido a su capacidad para atravesar la BBB, y posiblemente

también de manera indirecta a través de vías aferentes vagales.

Insulina (INS)

Descubrimiento y estructura

Su nombre deriva del latín insula, que significa isla, en alusión a su síntesis en los

islotes de Langerhans, tratándose de uno de los péptidos que mejor se ha

caracterizado.

Es un péptido de 51 AA [458,459] producido por las células β pancreáticas, cuya

principal función es regular la concentración plasmática de glucosa gracias a un

feedback negativo, lo que hace que en caso de ausencia, resistencia o disminución del

transporte al CNS provoque la enfermedad denominada diabetes tipo I para el primer

caso y II para los otros respectivamente [460]. Dicha enfermedad ya fue descrita por

los antiguos egipcios como un trastorno en el cual se perdía mucho BW y se orinaba en

abundancia. Poco a poco se fueron haciendo avances; en 1889 Mering y Minkowski

descubrieron la muerte de perros por diabetes al eliminarles el hígado y páncreas, y en

1910 Sharpey-Schafer propusieron la existencia de una sustancia producida en el

páncreas que era responsable de la diabetes. No fue hasta 1921 cuando Banting y Best

revirtieron la diabetes en perros con un extracto de páncreas, a partir del cual

consiguieron (colaborando con Collip y Macleod) purificar la INS, siendo los primeros

en administrarla a pacientes diabéticos [461].

Secreción y regulación

La secreción de INS se encuentra principalmente regulada por glucosa como se ha

comentado, siendo ésta capaz de entrar en la célula β pancreática por difusión

facilitada, y activar la maquinaria energética lo que eleva el cociente adenosín

95 Antecedentes

trifosfato/adenosín difosfato (ATP/ADP), que en última instancia hace que se cierren

los canales de potasio sensibles a ATP (KATP), generando una despolarización en la

membrana que abre los canales de calcio dependientes de voltaje, estimulándose la

exocitosis de los gránulos de INS. Posteriormente hay una segunda fase de secreción

dependiente de nucleótidos de adenina basada en un aumento de la eficacia del calcio

en la secreción de los gránulos [462]. Además existen evidencias de un efecto

autocrino así como una estimulación por el factor de crecimiento insulínico (IGF) y una

inhibición por la AMY, NPY y otros factores [463].

Las concentraciones plasmáticas son bajas en ayunas y aumentan postprandialmente

de forma aguda, debido principalmente a nutrientes en sus formas más simples como

monosacáridos, AA y FFA de cadena larga [117], siempre que la glucemia sea normal

(con excepción de la leucina [464]) y de forma proporcional a la cantidad de grasa del

cuerpo [465].

Receptores: tipos, señalización y localización

El receptor de la INS o IR, está formado por una cadena α superficial y dos β

transmembrana, y tiene actividad tirosin-quinasa intrínseca, de manera que al

activarse es capaz de fosforilar diferentes proteínas llamadas en conjunto sustratos del

receptor de INS (IRS), del que existen cuatro tipos: 1, 2, 3 y 4, así como otras moléculas

implicadas en la cascada de señalización de los receptores [466]. Quizás la similitud

entre los IRS, su coexpresión en tejidos y la implicación de otras moléculas asociadas

hagan su estudio algo más complejo que el del resto de péptidos. Al estudiar la acción

de la INS en ratones knockout para los diferentes IRS [467,468], se ha puesto de

manifiesto un papel más destacado del IRS-1 en tejido muscular mientras que la

implicación de IRS-3 sería mayor en hígado, tejido adiposo y en la respuesta

compensadora del páncreas a la resistencia insulínica. IRS-1 e IRS-3 también se

expresan a nivel cerebral [469,470].

La INS es capaz de atravesar la BBB debido a un transporte mediado por los receptores

IR [471], siendo sobre todo captada en la áreas del puente/bulbo e hipotálamo (en el

ARC principalmente) [472], así como es capaz de adentrarse en regiones tales como el

bulbo olfatorio o la amígdala [473].

96 Antecedentes

Concentraciones circulantes, tiempo de residencia media y degradación

En ayunas, la concentración plasmática de INS en ratas Wistar es de aproximadamente

500 pg/ml [474,475], y de 420 pg/ml en humanos [378], aunque los valores varían

mucho dependiendo de la cantidad de grasa corporal.

La vida media de este péptido (en humanos) se encuentra en torno a 5-10 minutos,

dependiendo del sexo [476,477], siendo dicho tiempo difícil de medir, ya que la

mayoría de la INS secretada es captada y metabolizada por el hígado [478]. Al llegar al

riñón, antes de ser degradada, ejerce sobre éste un efecto positivo en la reabsorción

de minerales [479].

Efectos sobre la ingesta

Mientras la INS periférica ejerce un control metabólico sobre las rutas anabólicas y

almacenamiento de grasa [480], de forma central actúa como señal homeostática

energética, incidiendo sobre las redes neuronales hipotalámicas (del ARC

fundamentalmente), donde inhibe las neuronas de tipo NPY/AgRP y activa las

POMC/CART lo que redunda en una disminución de la ingesta [481], efecto que se

observa tanto en roedores [482] como en monos [483]. Por otro lado, en humanos,

aunque parece haber diferencias dependiendo del sexo, existen pruebas de que la

administración intranasal disminuye la ingesta, hecho que puede ser debido al

aumento de los niveles cerebroespinales [484,485].

La señal en el CNS es indispensable para una correcta homeostasis energética, como

confirman estudios con ratones knockout para los IR, a los que se somete a una

restauración selectiva de los mismos en distintos tejidos [486]. Además estudios

recientes [487], también indican que el efecto anorexigénico de la INS no solo se debe

a su acción a nivel hipotalámico, sino también sobre la amígdala (relacionada con la

recompensa). Esta respuesta es muy sensible a la elevación de la cantidad de grasa

ingerida, puesto que desaparece después de tan solo 3 días con una HFD [487].

Por último, un aspecto importante a tener en cuenta es que el efecto anorexigénico de

la INS sólo se producen en situaciones de euglucemia [488,489], lo que es lógico, ya

que las consecuencias podrían ser fatales si persiste este efecto en caso de

hipoglucemia.

97 Antecedentes

Obesidad e insulina

Hace ya más de 50 años se planteó le idea dela existencia de señales que informan al

encéfalo del tamaño de los almacenes de grasa en el cuerpo, lo que se denominó

feedback negativo adiposo. Con el tiempo se ha ido llegando a la conclusión de que

este feedback está mediado únicamente por INS y LEP, ya que cumplen los requisitos

necesarios: sus concentraciones circulantes son proporcionales a la cantidad de grasa

corporal [465,490] y su bloqueo en el CNS hace que se incremente la ingesta y el BW

[491]. No obstante, autores como Gloy et al. [492] ponen esto en duda; en su estudio

en ratas, la alimentación forzada por tubo intragástrico produjo obesidad y aumento

en la INS circulante. Sin embargo, la normalización de su alimentación hizo que la

concentración de INS disminuyera de forma drástica y muy rápidamente, incluso

cuando la cantidad de tejido adiposo era todavía elevada.

Las concentraciones basales de INS en ratones alimentados con una HFD (45% de Kcal

en forma de grasa) [493] y en ratas DIO (HFD/HFS durante 18 semanas) están

aumentadas en comparación a las control, así como también es mayor la respuesta

ante una carga oral de glucosa [494].

Una de las características de la obesidad es la hiperinsulinemia, la cual puede tener

distintos orígenes, ya sea por el aumento de la secreción de INS, una disminución de

su degradación o una combinación de ambas [495,496]. Otro rasgo típico en las

personas obesas es la pérdida de la sensibilidad a la INS [76], la cual mejora cuando se

pierde BW y se agrava al ganarlo [497]. Una de las explicaciones más plausibles a dicha

resistencia se relaciona con diferentes hechos como la disminución del transporte al

CNS (roedores y perros obesos) [498], cambios en la permeabilidad de la BBB a la INS

[499] o bien a una disfunción de los receptores encefálicos [500].

Relación con otros péptidos

CCK

Hay evidencias de una influencia positiva en la secreción de INS, mecanismo que

parece depender de la presencia de aminoácidos como la arginina [298].

98 Antecedentes

GLP-1 Y GIP

Es bien conocido, como se ha comentado, el efecto positivo que tienen ambos

péptidos sobre la síntesis y secreción de INS, aunque los estudios que se han llevado a

cabo están más relacionados con la regulación del metabolismo glucídico que con el

papel de la INS en la regulación de la ingesta.

Leptina

Aunque existe una controversia acerca del hecho de si la INS promueve la secreción de

la LEP, hay indicios de que es así a largo plazo [501], existiendo algunos puntos en

común en el modo de acción a nivel hipotalámico [502].

Perspectivas futuras

El CNS siempre se ha considerado un sistema independiente de la INS, idea que está

cambiando según se van caracterizando las acciones de esta hormona a ese nivel,

entre las que se encuentra la de la regulación de la ingesta o funciones cognitivas.

Trastornos como la obesidad provocan un menor transporte insulínico al CNS,

fenómeno que puede ser clave en el desarrollo de la obesidad, y que podría ser

atajado con medicamentos que lo faciliten.

Puntos clave

Actúa a nivel central como señal anorexigénica y reguladora de la homeostasis

energética.

La resistencia periférica y central a la INS que se produce en la obesidad puede ser un

factor clave en el desarrollo de este trastorno.

Polipéptido pancreático (PP)

Descubrimiento y estructura

El descubrimiento del PP se produjo en 1973 en estudios de purificación de INS en

pollos [503]. Se trata de un péptido de 36 AA sintetizado de forma mayoritaria en el

páncreas, más concretamente en las células PP o F de los islotes de Langerhans [504],

aunque una pequeña parte se sintetiza en el colon y recto [505]. Forma parte de la

familia PP junto con el PYY y el NPY, debido a que comparte el “pliegue PP”

99 Antecedentes

característico de estos péptidos, siendo bastante probable que compartan origen a

partir de un gen común [506].

Secreción y regulación

La secreción de PP está claramente condicionada por una respuesta vagal ante la

ingesta de alimento [507,508] y es estimulada por glucosa [509], una comida estándar

[510,511] o comidas ricas en proteína [512] o en grasa [513], generándose en

humanos pico muy pronunciado alrededor de los treinta minutos, descendiendo y

surgiendo otra elevación mucho menos pronunciada, para ir disminuyendo de forma

paulatina a lo largo de 4 a 6 horas [514,515]. Se observa un ritmo circadiano diurno

con un pico máximo en torno a las 7 de la tarde [715] y unas concentraciones

circulantes superiores en hombres [516].

Existen pocos trabajos donde se aborde el efecto de la edad sobre esta hormona,

aunque se han referido aumentos en su secreción en individuos mayores de 35 años

[517,518].

Receptores: tipos, señalización y localización

Los receptores para este péptido forman parte del grupo de receptores tipo Y,

asociados a proteínas G y de los cuales existen 6 subtipos (del Y1 al Y6) [519]. El Y4 es

el que muestra más afinidad por el PP [520], estando presente en diferentes

localizaciones, incluyendo áreas del CNS relacionadas con la ingesta como el AP, NTS,

DVN, ARC y PVN [521], aunque existe una gran proporción en el AP [522].

Concentraciones circulantes, tiempo de residencia media y degradación

El PP es degradado de forma rápida, probablemente por diferentes peptidasas

circulantes entre las que se encuentran la aminopeptidasa P, merpina, DPP-4 o

neprilisina [523,524], lo que hace que el tiempo de residencia media sea de

aproximadamente 7 minutos en humanos [525] y probablemente parecido en

roedores. Esta pronta degradación hace que las concentraciones plasmáticas basales

se encuentren en torno a 20-40 pg/ml en ratas [526,527] y 50 pg/ml en humanos

[336].

100 Antecedentes

Efectos sobre la ingesta

El PP ejerce toda una serie de acciones en el organismo entre las que destacan la

inhibición del vaciado gástrico, de la motilidad de la vesícula biliar y de la secreción

pancreática exocrina [528]. Además, administrado periféricamente es capaz de inhibir

la cantidad de alimento ingerida en roedores [529] y en humanos [530,531].

No está del todo claro si el efecto anorexigénico se debe a una acción directa sobre el

encéfalo, aunque hay bastantes indicios de que es así. Es posible el acceso al AP, al

estar libre de la BBB [522], existiendo también datos que sugieren una acción directa

sobre el hipotálamo (ARC principalmente), ya que se ha puesto de manifiesto un

transporte de este péptido a través de la BBB [532] y una expresión de sus receptores

en dicha región [533].

La administración periférica de PP activa neuronas en las zonas encefálicas antes

mencionadas, lo cual sugiere que también existe una acción indirecta del PP sobre el

CNS mediada por vías vagales [534].

Obesidad y PP

La comparación de la concentración circulante de PP entre sujetos delgados y obesos

es poco concluyente [535], aunque parece ser que las concentraciones plasmáticas

son menores en estos últimos [536], mientras que en enfermos de anorexia se han

observado respuestas muy marcadas a la ingestión de comida [537]. Además en el

síndrome de Prader-Willi, sus concentraciones están disminuidas pudiendo contribuir

ello a la hiperfagia observada en estos enfermos [538].

Relación con otros péptidos

GRELINA

Las concentraciones plasmáticas de GRN están disminuidas tanto en ratones que

sobreexpresan PP como en ratones normales a los que se administra PP exógeno

[529]. Por otra parte, estudios en humanos han mostrado que la administración de

GRN se asocia a aumentos en la secreción de PP [539]. Poco se conoce de la fisiología

de esta interacción.

101 Antecedentes

Perspectivas futuras

Dicho péptido es uno de los candidatos para el desarrollo de fármacos antiobesidad,

centrándose sobre todo en la síntesis de análogos con una mayor vida media en

sangre.

Puntos clave

Su efecto a corto plazo deja claro que el PP es una de las señales de terminación de la

comida, aunque los mecanismos y circuitos implicados no se conocen de forma exacta.

Péptido tirosina tirosina (PYY)

Descubrimiento y estructura

Se aisló y caracterizó en 1982 por Tatemoto et al. [540] a partir de extractos de

intestino superior de cerdos. Comparte homología con el PP y el NPY, perteneciendo

estos a la ya comentada familia con el “pliegue PP”.

Secreción y regulación

Consta de 36 aminoácidos (PYY 1-36) y es co-secretado con el GLP-1 por las células L

(especialmente abundantes en íleon y colon) [541] tras la ingestión de nutrientes y de

manera proporcional a la energía ingerida [542]. No existen resultados concluyentes

respecto a la estimulación de su secreción por glucosa y proteína en humanos

[543,544], siendo más claros los que se refieren a la grasa, la cual la aumenta de forma

clara [118,545]. Respecto a tipo de grasa, parece ser que los FFA de cadena larga (12

C) [119] y los monoinsaturados [546] promueven una mayor secreción.

En humanos se produce un pico entre la primera y segunda hora postprandial [547], el

cual parece tener un componente nervioso ya que aparece mucho antes de que los

nutrientes hayan alcanzado el intestino distal. Además, su secreción se inhibe por la

vagotomía, y por bloqueo de la señal nerviosa [548].

Una vez secretado, es rápidamente degradada por la DDP-4, que elimina los dos

primeros AA para pasar a PYY (3-36), siendo esta última la forma predominante en la

circulación [549].

102 Antecedentes

Con la edad las concentraciones plasmáticas de PYY tienden a aumentar, tanto en

ratas como en humanos [550]. Este péptido está relacionado con el freno ileal,

estimulado sobre todo por ácidos grasos no absorbidos que puedan llegar a las partes

distales del intestino delgado y colon [607].

Receptores: tipos, señalización y localización

El PYY (1-36) posee una alta afinidad por los subtipos Y1, Y2 e Y5 de los receptores de

tipo Y. Sin embargo, su conversión en PYY (3-36) aumenta la afinidad por el subtipo Y2

[551].

Concentraciones circulantes, tiempo de residencia media y degradación

La concentración basal tanto en ratas como en humanos es baja, alrededor de 17-25

pg/ml [218,377,552] en las primeras y 20-80 pg/ml en los segundos [336,378].

La vida media del PYY en humanos es bastante corta, de aproximadamente 8 minutos

[553]. Aunque no se ha estudiado exhaustivamente, las mismas peptidasas que

degradan el PP podrían ser las que intervienen en la degradación del PYY.

Efectos sobre la ingesta

La administración i.v. de PYY, en dosis que dan lugar a concentraciones plasmáticas

dentro del rango fisiológico, inhibe la ingesta tanto en humanos delgados [554] como

obesos (náuseas y vómitos a dosis altas) [555]. En roedores la administración i.p. tanto

aguda [556] como crónica [557] produce una disminución de la ingesta acumulada

además de disminuir el BW [558]. No obstante no hay un consenso absoluto respecto

a su efecto sobre la ingesta, como muestra la intensiva revisión de Tschop et al. [559].

El PYY (3-36) se une a los receptores Y2 por los que tiene más afinidad, siendo capaz

de actuar en el ARC hipotalámico, donde disminuye la expresión del NPY/AgRP y

aumenta la expresión de POMC/CART. Además, es plausible un efecto a nivel vagal, ya

que estos receptores también están presentes en las terminaciones vagales aferentes

del sistema digestivo [558,560].

Parece ser que las proteínas tienen un papel principal en el efecto saciante del PYY, ya

que en ratones knockout para el PYY se produce una resistencia al efecto saciante y

103 Antecedentes

antiobesogénico de las dietas ricas en proteína, todo lo cual revierte tras la

administración exógena del péptido [544].

Obesidad y PYY

Los ratones knockout para el PYY son obesos, desapareciendo este estado si se

administra el péptido exógeno [558]. Los humanos parecen no desarrollar resistencia a

este péptido, ya que la ingesta calórica durante una comida ad libitum ofrecida 2 horas

tras la infusión i.v. de PYY disminuyó hasta en un 30% tanto en sujetos obesos como

delgados [555]. Se ha descrito una disminución de las concentraciones plasmáticas de

PYY, tanto basales como postprandiales, en personas con sobrepeso y obesidad

mórbida [561,562].

Relación con otros péptidos

CCK y GRELINA

Existen evidencias en perros de la estimulación de la secreción de PYY por CCK [563]

También hay relación entre PYY y GRN, puesto que ambos péptidos actuarían sobre el

mismo grupo de neuronas en el ARC: PYY las inhibiría cuando el estatus de energía es

positivo, mientras que la GRN las activaría cuando el estatus de energía es negativo

[444].

INSULINA

Los trabajos de Sloth et al. [564], muestran que el PYY (en dosis altas de 0.8

pmol/kg/min) potencia la secreción de INS en respuesta a una comida ingerida a

posteriori. El mecanismo propuesto por los autores se basa en el efecto lipolítico de la

infusión de PYY, de modo que sería el aumento en los FFA circulantes los directamente

responsables de la mayor respuesta insulínica observada posteriormente, tras la

administración de la comida. Una mayor profundización en dicha relación deberá

abordarse en un futuro [564].

LEPTINA

Estudios en ratas mostraron que la administración de LEP durante 7 días (en dosis

subumbrales para su efecto sobre la ingesta) prolonga el efecto anorexigénico del PYY

(3-36) desde 2 días (si se inyecta sólo) hasta 6 días (de hacerlo combinado con LEP),

además de disminuir el BW [565]. Por otra parte, en humanos sometidos a ayuno (lo

104 Antecedentes

que hace disminuir el PYY y la LEP en torno a un 40-60% y 20-30%, respectivamente),

no se presentan cambios en los niveles de PYY tras restaurar la LEP hasta sus

concentraciones fisiológicas [566].

Perspectivas futuras

Queda mucho para entender de forma global la fisiología del PYY, debiéndose centrar

el trabajo futuro en los mecanismos de degradación para el desarrollo de fármacos

cuya vida media sea más larga que la del péptido original.

Puntos clave

Su papel en la disminución de la ingesta a corto plazo sigue siendo controvertido.

Su implicación en la obesidad no parece ser determinante, aunque se requieren

estudios más completos en este sentido.

Señales generadas en el tejido adiposo

Leptina (LEP)

Descubrimiento y estructura

A finales de los 70, Coleman et al. [567] describieron los denominados ratones ob/ob

cuya mutación en el cromosoma 6, generaba hiperfagia y obesidad, así como los

mutantes db/db (mutación en el cromosoma 4), con un fenotipo similar [567], pero no

fue hasta 1994 cuando el grupo de Zhang consiguió clonar el “gen obeso” o gen ob

[568], del que deriva este péptido cuyo peso molecular es de 16 kDa y posee 146

aminoácidos, proviniendo su nombre del griego leptos que significa delgado [569].

Secreción y regulación

La LEP es producida en el tejido adiposo (la mayor parte) de forma que su secreción es

proporcional a la cantidad de dicho tejido en humanos y roedores [570,571], siendo

las concentraciones circulantes de LEP y el grado de obesidad más evidente en ratas

que en humanos, donde hay más variabilidad [570]. Su liberación es pulsátil,

ocurriendo 3-4 pulsos diarios cada 2 ó 3 horas después de las comidas [572], sin

105 Antecedentes

observarse aumentos postprandiales muy acusados [573]. Las concentraciones medias

son mínimas en plasma durante el día y aumentan durante la noche [572].

Poco a poco se ha ido evidenciando que, además de en el tejido adiposo, se expresa

en otros tejidos como placenta [574], músculo esquelético [575] o estómago [576]. En

el caso del estómago se ha observado la presencia de este péptido tanto en las células

principales como en células de tipo endocrino, ambas situadas en las glándulas

fúndicas [577-579], hecho que podría tener relación con algún efecto a nivel de la

mucosa gástrica, ya que se expresan los receptores para la LEP en ella, aunque se

desconoce tal efecto [580,581].

De acuerdo con algunos trabajos, la secreción de esta hormona no se modifica

significativamente tras la ingesta de una comida mixta [582], aunque otros han

descrito aumentos ligeros después de 6 h de un desayuno rico en grasa [583] y tras 4

horas de una comida rica en carbohidratos [584]. Referente a la influencia de la edad

en su secreción, en ratas se ha visto un incremento con la vejez [585-587] aunque no

en todos los estudios [588]. En humanos en general también se ha observado un

aumento con la edad [267,589], aunque hay estudios en los que no cambian los

valores basales ni la respuesta [590,591], todo lo cual puede estar en parte

relacionado con la complejidad de su regulación.

Receptores: tipos, señalización y localización

El receptor de la LEP se conoce en general como Ob-R y pertenece a la familia de las

citoquinas de clase I. Se ha observado que debido a splicing alternativos se producen

los tipos a, b, c, d y e, que se encuentran tanto en roedores como en humanos de

forma muy ubicua. La forma Ob-Rb posee una alta plasticidad funcional debido a su

interacción con diferentes cascadas de activación como las JAK/STAT, fosfoinositol 3-

quinasa, quinasas activadoras de mitógenos, etc., hecho que deja ver la importancia

de la LEP en diferentes funciones como el control de la masa corporal, la reproducción,

angiogénesis, inmunidad, etc. [592].

En el encéfalo, el receptor Ob-R se expresa en diferente regiones, tanto del tallo

encefálico (NTS) como en el ARC (mayor densidad), PVN y LHA hipotalámicos [593], así

como en zonas relacionadas con la percepción sensorial [594].

106 Antecedentes

Concentraciones circulantes, tiempo de residencia media y degradación

El tiempo de residencia media es variable dependiendo de la especie; en humanos y

en pollos se ha estimado en aproximadamente 23-24 minutos [595], 96.4 en monos y

49.5 en ratones (administración de LEP humana) [596] así como 5.46 minutos en ratas

Zucker delgadas y 6.99 en obesas [597]. La degradación se produce principalmente en

el riñón [598].

Las concentraciones plasmáticas en ayunas dependen en gran parte a la cantidad de

grasa del cuerpo, aunque en general en ratas se encuentran en un rango de 1300-1600

pg/ml [474,599] y en humanos giran en torno 6000-10000 pg/ml en ambos sexos

[378].

Efectos sobre la ingesta

La administración aguda de LEP por vía periférica, es capaz de disminuir la ingesta en

ratas en ayunas pero no en ratas con acceso libre a la comida [600,601]. Inyectada de

forma crónica reduce la ingesta en ratas, tanto ad libitum como pair fed [602]. Cuando

se administra a nivel central disminuye el tamaño de la comida así como la tasa de

ingesta (tamaño comida/duración comida) [603].

En principio, como se dijo anteriormente, las concentraciones plasmáticas de LEP no

cambian postprandialmente de forma marcada [572], lo que ha sugerido que el efecto

sobre la ingesta es a medio-largo plazo. Sin embargo este hecho se está empezando a

cuestionar debido a diferentes hallazgos como:

- Expresión de sus receptores en neuronas aferentes y eferentes del nervio vago

[604].

- Activación del NTS e hipotálamo tras administración periférica [605].

- Disminución del tamaño de la comida tras su administración a nivel de la

arteria celíaca [606].

- Inervación del tejido adiposo, aunque por ahora se ha relacionado más con el

proceso de lipolisis controlada por el CNS [607].

- Secreción de LEP gástrica en respuesta a CCK [608].

- Existencia de una interacción funcional entre la LEP y los receptores CCK,

interacción que se da a nivel de fibras vagales y que causa inhibición del

107 Antecedentes

vaciamiento gástrico y disminución a corto plazo de la ingesta de alimentos

[609].

- En ratones en ayunas las concentraciones plasmáticas de LEP caen de forma

considerable y se producen una serie de cambios a nivel de los ejes gonadal,

adrenal y tiroideo en machos, así como el retraso de ovulación en hembras,

todo lo que se previene con la administración exógena de LEP, no siendo así en

el caso de la disminución del BW o de la glucosa en sangre [610].

- En personas sometidas a periodos prolongados de ayuno, la concentración

plasmática de LEP disminuye más de lo que cabría esperaren a base a la

reducción en la masa grasa [611].

En conjunto, todos estos datos hacen que se plantee un mecanismo adicional a corto

plazo de la LEP, hecho que requiere una investigación más detallada en un futuro.

El mecanismo de actuación de la LEP a nivel central se ha estudiado en numerosos

trabajos, tal y como se recoge en diversas revisiones de las cuales se puede concluir

que existe una acción a nivel del tallo (NTS), la cual es suficiente para disminuir la

ingesta. Gracias a receptores Ob-Ra, la LEP atraviesa la BBB accediendo al hipotálamo,

más concretamente al ARC, donde inhibe las neuronas NPY/AgRP y potencia las

POMC/CART de forma que se reduce la ingesta, además de influir sobre otros circuitos

neuronales que generan información sobre la homeostasis energética, produciéndose

un crosstalk con el resto de hormonas [612-614].

Obesidad y leptina

La LEP, al igual que se dijo anteriormente de la INS, posee las características que

definen a una señal de homeostasis energética, como es el hecho de que sus

concentraciones plasmáticas se correlacionan con la cantidad de grasa corporal

[570,571] (siendo más bajas en individuos con anorexia nerviosa y disminuyendo tras

una pérdida de BW) [615], tiene un efecto anorexígeno [602,603,616], y la

disminución de su señal aumenta la ingesta [568,617].

108 Antecedentes

Comúnmente la obesidad cursa con concentraciones elevadas de LEP, lo que se

relaciona con una resistencia a dicho péptido, y ello se observa tanto en ratones [618]

como en humanos [619]. Aun así, no se conoce exactamente si la obesidad es causa o

consecuencia a esta resistencia [620]; lo que parece claro es que se produce una

alteración de la señal a nivel central, cuyo origen puede ser diverso, por ejemplo, un

menor transporte, una disminución de los receptores o un problema en la señalización

en las neuronas diana [621,622].

Además de las funciones mencionadas, la LEP posee una acción lipolítica, confirmada

tanto en ratones ob/ob como delgados (a dosis altas) aunque no ocurre así en ratones

db/db, lo que muestra el papel del receptor Ob-Rb en este cometido [623].

De nuevo el estudio de Gloy et al. [492] se opone a la idea de que LEP y grasa corporal

siempre estén correlacionados, ya que tras inducir obesidad en ratas mediante

alimentación, la vuelta a la alimentación normal hace que las concentraciones

circulantes de LEP disminuyan de forma drástica y rápida, aun cuando la cantidad de

tejido adiposo no se reduce de forma proporcional.

Relación con otros péptidos

GLP-1

El pretratamiento de ratas con LEP (sub-umbral) antes de administrar GLP-1 i.p.

consigue un aumento del efecto anorexígeno y de la disminución de BW en 24 horas

[386], efecto que aparentemente parece producirse a nivel del tallo encefálico [624].

Además, la exendina-9 (antagonista del GLP-1), bloquea el efecto anorexígeno de la

LEP administrada tanto por vía i.p. como intracerebroventricular (i.c.v) [625].

Perspectivas futuras

La LEP resulta ser eficaz para disminuir la ingesta de algunos individuos obesos en los

cuales no se produce la resistencia antes comentada, pero estos casos son raros. Para

el resto, el futuro está en desarrollar fármacos que aumente la sensibilidad a esta

hormona.

109 Antecedentes

Puntos clave

El papel de la LEP como señal de homeostasis energética está bien estudiando, no así

su posible actuación a nivel vagal como señal a corto plazo.

Su función en la obesidad es importante, como sugiere el hecho de que su ausencia se

asocia a obesidad, así como la aparición de resistencia en algunos casos.

La interacción con otras hormonas en el NTS es clave para la actividad de este péptido.

Señales directas debidas a nutrientes

Los nutrientes juegan un papel principal en la regulación de la ingesta ya que son las

únicas señales que informan de lo que estamos ingiriendo, pudiendo actuar de forma

directa o a través de los GP.

En ratas y humanos (con algunas excepciones en el caso de determinados nutrientes)

se ha observado que las proteínas son las que producen una mayor saciedad, seguidas

por los carbohidratos y, por último, las grasas [626,627].

Dicha saciedad se produce a través de diversos mecanismos, los cuales en principio no

son excluyentes y normalmente varían de un nutriente a otro:

- Actuando de forma directa sobre los centros de regulación de la ingesta (sobre

el hipotálamo y NTS predominantemente).

- Incidiendo sobre el sistema nervioso periférico, que de forma indirecta va a

activar o inhibir diferentes regiones del CNS.

- Promoviendo la liberación de GP, los cuales juegan un papel fundamental en la

regulación de la ingesta y BW.

No todos los carbohidratos siguen un mismo patrón respecto a la regulación de la

ingesta. En el caso de la glucosa, aparte de desencadenar diversas señales endocrinas,

actúa de forma directa en el encéfalo activando la ruta glucolítica en las neuronas con

el consiguiente aumento en el ATP y descenso de la actividad de la AMP quinasa

(AMPK) y del AMP. Por otro lado, la acetil CoA carboxilasa (ACC) es activada para

producir malonil-CoA, sobre el cual existen numerosas evidencias de su papel como

110 Antecedentes

señal del estado energético corporal a nivel del hipotálamo, suprimiéndose la ingesta

cuando se acumula, mediante la inhibición del NPY/AgRP y aumento de la expresión

del POMC/CART. Respecto a la fructosa, parece no activar la ruta del malonil-CoA,

causando así un efecto orexigénico. Por último, la fibra no posee un efecto claro sobre

la ingesta o tiende a inhibirla (seguramente debido a mecanismos diferentes a la

glucosa) [628].

Las grasas son capaces de ser detectadas ya a nivel oral, debido principalmente a los

receptores CD36 y diversos tipos de receptores acoplados a proteínas G (GPR), los

cuales se asocian con respuestas relacionadas con la recompensa (lo que puede

derivar en una preferencia hacia el consumo de grasas) y otras respuestas como un

aumento de los triglicéridos, inducción de la lipasa gástrica y enzimas pancreáticas, y

liberación de algunos GP [629].

Una vez liberados y absorbidos los ácidos grasos de cadena larga (LCFA), pueden pasar

a la sangre y llegar al CNS donde son captados por las neuronas del hipotálamo gracias

a los transportadores CD36 o FATP1 o penetrando por difusión simple, siendo

esterificados (LCFA-CoA) por las acyl-CoA sintetasas y transportados a la mitocondria -

vía carnitina palmitoil transferasa 1 y 2 (CPT-1 y CPT-2)- donde sufren β oxidación

hasta malonil-CoA. Este último (que puede provenir tanto de ácidos grasos como de

glucosa), cuando se acumula en gran cantidad inhibe la CPT1, con lo cual no se

transportarán más LCFA-CoA a la mitocondria y esto produce a nivel hipotalámico

inhibición de la ingesta; por otro lado se da una interacción con receptores N-metil-D-

aspartato (relacionados con la sensibilidad a lípidos) en las neuronas del complejo

dorsal vagal (DVC), gracias a lo cual se envían órdenes vía eferencias vagales para que

se inhiba la producción hepática de glucosa [630].

Respecto a las proteínas, es más complejo su estudio en relación con la ingesta. Está

claro que existe una actuación de los AA mediada por los GP (CCK, GLP-1 y PYY), que

pueden actuar sobre el CNS por vía vagal o directamente. Paralelamente hay estudios

que muestran un efecto de los AA sobre el vago hepatoportal y directamente sobre el

ARC [631,632], que redundaría en una disminución de la ingesta. De entre ellos, la

111 Antecedentes

leucina es de la que se tienen más evidencias de su efecto anorexigénico llevado a

cabo a través del eje tallo encefálico-hipotálamo [633].

Como hemos ido viendo, la fisiología de algunos GP es más conocida que la de otros,

sobre todo en lo referente a la respuesta ante nutrientes, la cual en mayor o menor

medida se ha estudiado tanto en animales como en humanos, como se recoge en

diferentes revisiones como la de Karhunen et al. [634]. De ésta [634] se puede

destacar lo siguiente:

- Los macronutrientes ejercen un efecto inhibidor de la secreción de GRN.

- Las proteínas, grasas y carbohidratos simples tienden en general a aumentar la

secreción de los GP, con alguna excepción en que no hay efecto.

- Los carbohidratos complejos y la fibra, o no tienen efecto o bien hacen que la

secreción esté disminuida.

Otras señales

Además de los péptidos gastrointestinales, hay una diversidad de moléculas que

parecen influir sobre la ingesta (con más o menos importancia), encontrándose entre

ellas determinados neuropéptidos [635], citoquinas y adipoquinas, así como la

apolipoproteína A-IV (glicoproteína secretada en el intestino y que forma parte de los

quilomicrones). Todos ellos se muestran en la Tabla 5, en asociación con aquellos

trabajos realizados en humanos y animales que muestran indicios de un efecto sobre

la ingesta. No obstante, algunos de estos estudios no reproducen condiciones

fisiológicas, hecho que si ocurre en estudios con ratones knockout, que muestran

efectos variables dependiendo sobre todo del receptor implicado [636].

112 Antecedentes

Table 5. Intake related peptides

ANOREXIGENIC PEPTIDES OREXIGENIC

PEPTIDES

GP GLP-2 [637]

Glucagon [638]

Oxyntomodulin [639,640]

Enterostatin [641]

Secretin [642]

Protein

transports

Apolipoprotein A-IV [643,644]

Adipokines Resistin [645]

Adiponectin (indirect effect) [646]

Cytokines TNF-α and IL-1β [647]

Neuropeptides

NPY [648,649]

AgRP [650]

Orexins A and B [651]

Cannabinoids

[652,653]

Melanin-concentrating

hormone (MCH) [654]

Corticotrophin-

releasing factor (CRF)

[655]

Cocaine-amphetamine-regulated

transcript (CART) [656]

113 Antecedentes

Ritmos circadianos

Los ritmos circadianos son muy importantes en la regulación de muchos procesos del

organismo. Estos ritmos se encuentran controlados de forma principal por el

denominado “reloj biológico” localizado en el núcleo supraquiasmático (SCN), el cual,

junto a relojes secundarios como el tejido adiposo y el hígado, ajusta las fases de los

comportamientos rítmicos como el sueño/vigilia, alimentación, o actividad

anticipatoria a la comida. Dichos comportamientos están influidos por señales

externas, u osciladores externos, en un continuo feedback [657].

Estrés

Un factor que influye en el comportamiento hacia la ingesta de alimento es el estrés,

entendido como una reacción fisiológica ante algún factor tanto interno como

externo, que va en contra de la homeostasis del organismo, como puede ser el

hambre, frío, heridas o una restricción física. La respuesta del organismo a largo plazo

hace que se liberen, entre otras hormonas, los glucocorticoides, los cuales estimulan

comportamientos relacionados con la obtención de placer, de forma que favorecen la

ingesta [658].

2.2.2. Integración de las señales en el CNS

El estudio del efecto que la comida produce en el CNS se ha llevado a cabo

mayoritariamente determinando la expresión de c-fos, lo cual tiene algunos

inconvenientes como la imposibilidad de detectar activación neuronal en momentos

concretos o la incapacidad de detectar inhibición neuronal, lo que lo convierte en una

herramienta muy limitada [659]. Posteriormente han ido surgiendo técnicas como la

electrofisiología o el análisis de la imagen por resonancia magnética funcional (fMRI),

que sí permiten analizar la secuencia de cambios en el tiempo e incluso el

comportamiento de una red de neuronas [660].

Una de las regiones con gran influencia en la regulación de la ingesta es el tallo

encefálico, donde se localizan una serie de núcleos como el complejo dorsal vagal

(DVC, que engloba al NTS, AP y el núcleo dorsal motor del vago (DMV)), así como el

núcleo parabraquial (NPB). Dichos núcleos integran información periférica recogida

114 Antecedentes

por aferencias vagales con información proveniente del hipotálamo; además, el AP

detecta directamente señales del torrente circulatorio ya que queda libre de la BBB.

Los detalles de relación entre estos núcleos, los GP y el vago (se detallarán más

adelante) [661,662]. Además, en el tallo encefálico se localizan los centros de

integración para actividades como la masticación o la deglución [663] y es capaz por sí

mismo de controlar la terminación de la ingesta [664].

Otra región encefálica importante en la regulación de la ingesta de alimentos es el

hipotálamo, formado por varias poblaciones o núcleos que se reparten de forma

simétrica a ambos lados del tercer ventrículo. Las neuronas de estos núcleos están

interconectadas entre sí, además de comunicarse con otras regiones como el tallo

(NTS) y zonas superiores de la corteza. Los núcleos hipotalámicos más involucrados en

la regulación de la ingesta y la homeostasis energética son (como hemos venido

nombrando previamente) el núcleo arcuato (ARC), el núcleo paraventricular (PVN),

núcleo ventromedial (VMH), núcleo dorsomedial (DMH) y el hipotálamo lateral/área

perifrontal (LHA/PFA). Estas poblaciones neuronales secretan neurotransmisores

específicos que median efectos diversos, además de existir conexión entre ellas a

diferentes niveles [665].

En el ARC se encuentran dos tipos de neuronas de primer orden bien diferenciadas,

mostradas en rojo y verde en la Figura 3 [666,667]:

- Neuronas NPY/AgRP promueven el anabolismo (señales orexigénicas):

Coexpresan el NPY (el cual por sí constituye una señal que actúa vía receptores

NPY) y la AgRP, que bloquea la acción de la hormona estimulante de

melanocitos (α-MSH).

- Neuronas POMC/CART que favorecen el catabolismo (señales anorexígenas),

que expresan CART y POMC; este último se escinde para generar α-MSH, que

a su vez se une a receptores específicos (MC3R y MC4R) en neuronas de otras

estructuras cerebrales.

Ambos grupos neuronales proyectan sus axones hacia otras regiones cerebrales,

muchas de ellas comunes a los dos, como el PVN, en el cual se expresan

neuropéptidos anorexígenos como la hormona liberadora de corticotropina (CRH),

115 Antecedentes

oxitocina (OXY), o como el LHA/PFA, en el que se localizan las orexinas y la hormona

concentradora de melanina (MHC) con carácter orexigénico [667].

Por último, hay que citar que estas neuronas del núcleo arqueado son sensibles a

niveles locales de nutrientes energéticos, como glucosa [668] o ácidos grasos como el

oleico [669].

En definitiva, tanto por sus conexiones como por su BBB relativamente permeable, el

ARC resulta clave como centro de control de la homeostasis energética, la ingesta de

alimentos y la regulación del BW, pues integra señales tanto periféricas como

centrales.

Asimismo todas estas estructuras se encuentran conectadas formando una compleja

red, como muestra la Figura 3, existiendo conexiones nerviosas entre las áreas

comentadas y otras regiones del encéfalo [670], destacando:

- AP y NTS en el tallo encefálico.

- Centros superiores como el hipocampo y la amígdala (memoria).

- NA y globo pálido (recompensa).

- Región orbitofrontal y la circunvolución del cíngulo (representación de la

comida y expectativa de recompensa),

- Ejecución de funciones motoras situadas en la corteza dorsolateral y

prefrontal.

116 Antecedentes

Figure 3. Neuronal network within CNS control energy homeostasis. AMY: amygdala, AP: area postrema, ARC: arcuate nucleus, LHA: lateral hypothalamic area, NAc: nucleus accumbens, NTS: nucleus of the tractus solitarius, PBN: parabraquial nucleus, PVN: paraventricular nucleus, VMN: ventromedial nucleus, VTA: ventral tegumental area. Taken from Field et al. 2010 [670].

2.2.3. Otros factores que influyen en la ingesta de alimentos

De todos los factores que regulan la ingesta, existen aquellos que no implican

estructuras del sistema cortico-límbico y que constituyen un sistema homeostático,

existiendo por otro lado otros que sí implican la intervención de este sistema y que se

encuentran fuera de este feedback metabólico denominándose no homeostáticos,

como son aspectos cognitivos, de recompensa y emocionales.

Recompensa

Se puede definir la recompensa como un estímulo de refuerzo que también es

placentero, desencadenando la activación de circuitos implicados en la sensación de

117 Antecedentes

placer (ver más abajo). Dicho refuerzo se produce cuando se incrementa la relación

entre el estímulo y el comportamiento que desencadena, como por ejemplo cada vez

que un ratón presiona un botón se le recompensa con azúcar [671].

De acuerdo con las teorías de Berridge et al. [672], la recompensa tienen tres

componentes: placer, aprendizaje y motivación, los cuales son distinguibles a nivel

cerebral, por ejemplo, la dopamina parece contribuir al refuerzo del aprendizaje pero

no al placer [672] .

Refiriéndose al placer derivado de la comida, se activan sistemas

GABA/benzodiacepinas situados en la zona ventral del globo pálido y el área gustativa

primaria del tallo. Por otro lado la motivación debida al apetito se localiza más en la

zona del NA y la amígdala con implicación de sistemas dopaminérgicos. Dichos

hallazgos se deben fundamentalmente a estudios en animales, como aquel en el que

se administró a ratas 6-hidroxidopamina (6-OHDA), lo que inhibió la ingesta pero dejó

intacta la percepción del placer, ya que seguían eligiendo azúcar y rechazando la

quinina [672-674].

Además, con el tiempo se han ido acumulando evidencias sobre el papel de péptidos

como la LEP y GRN en la recompensa, observándose que dichos péptidos están

involucrados en rutas dopaminérgicas, pudiendo la primera (junto con la INS)

disminuir tanto la secreción basal como estimulada de dopamina en el área ventral

tegumental (VTA), un efecto opuesto al de la GRN [675,676].

Memoria y aprendizaje

La memoria ante un estímulo, la asociación de ese estímulo con la recompensa y la

asociación de la respuesta con el refuerzo, se produce en la zona de la amígdala,

siendo la corteza orbitofrontal la que se encarga de mantener dichas asociaciones y

actualizarlas [677].

Variedad

Como se ha visto antes la “variedad” -entendida como la posibilidad de escoger entre

diferentes alimentos- se relaciona con un aumento en la ingesta en humanos, debido a

118 Antecedentes

mecanismos como la deshabituación de la respuesta salival y el efecto positivo sobre

el feedback sensorial. Además intervienen otros factores como la socialización, la

ingesta de alcohol o el visionado de televisión durante las comidas, que también

tienden a aumentar la ingesta [58].

Finalmente, tras la integración de todas las señales comentadas, se producirá el cese

de la ingesta, situación que a priori puede ser simple, pero como se ha visto depende

una red compleja de regulación.

2.3. SALIDA DE ENERGÍA. GASTO ENERGÉTICO Y SU

REGULACIÓN

Las salidas de energía se pueden agrupar en lo que se denomina el gasto energético

total (GET), el cual engloba a una serie de componente que son los siguientes:

- Gasto energético basal (GEB) (60-75% del GET): Cantidad de energía que se

consume en estado de reposo y ayunas; es la energía necesaria para mantener -en

las condiciones mencionadas- los procesos metabólicos de las células y tejidos,

incluyendo el mantenimiento de la temperatura corporal.

- Gasto energético por actividad física (15-30% del GET): Tanto ejercicio físico

programado como espontáneo (asociado a las actividades cotidianas).

- Termogénesis inducida por los alimentos (5-10% del GET): Energía necesaria para

digerir, transportar y metabolizar los alimentos. Su valor depende del tipo de

alimentación.

En ciertas situaciones fisiológicas (embarazo, lactancia, crecimiento…), hay que

considerar otros componentes del GET, como la energía destinada al crecimiento del

feto, formación de leche y formación de estructuras corporales, respectivamente.

Distintos factores (estado psicológico, enfermedades, fármacos y otras sustancias)

pueden modificar el GET, normalmente porque afectan a alguno de los componentes

anteriores (fundamentalmente al GEB).

119 Antecedentes

2.3.1. Regulación del gasto energético

La regulación global depende principalmente del hipotálamo, el cual recibe señales

tanto nerviosas como endocrinas provenientes de la periferia y de otras estructuras

del CNS y, actúa como centro integrador responsable de la homeostasis energética

[665].

El GET puede ser modificado principalmente debido a la modificación de la actividad

física y/o la termogénesis adaptativa, regulación llevada a cabo debido al sistema

nervioso central y periférico y sistema endocrino, con la implicación de hormonas

como la del crecimiento, INS, esteroides sexuales y la tiroxina [64].

En el caso de la termogénesis adaptativa, ésta ocurre principalmente en el tejido

adiposo marrón, el cual está inervado por neuronas que provienen del rafe caudal y

que se encargan de la regulación de dicha la actividad termorreguladora [678].

Además, al tejido adiposo blanco llegan fibras nerviosas que provienen de la medula

ventrolateral y del NTS, capaces de influir en la movilización de grasa en dicho tejido

[679].

2.4. INTEGRACIÓN DE LA REGULACIÓN DE LA INGESTA Y EL

GASTO ENERGÉTICO

En base a lo comentado anteriormente, el tamaño de la comida, la frecuencia de las

comidas o ambas cosas deben estar supeditadas a las reservas energéticas. El principal

factor que influye en el tamaño de la comida es el inicio de la saciación, el cual es un

estado neuro-humoral generado durante el proceso de alimentación y que promueve

la terminación de la ingesta. Por otra parte el inicio de la comida está supeditado por

diferentes señales tanto homeostáticas como no homeostáticas, no así la finalización,

que parece estar más controlada por señales homeostáticas [680].

Tanto factores homeostáticos como no homeostáticos son capaces de modularse unos

a otros, denominándose “bottom-up” cuando las señales metabólicas influyen en

funciones nerviosas superiores como la recompensa o cognición del individuo.

Ejemplo de ello lo tenemos en la LEP, que, por tener receptores en diferentes áreas

120 Antecedentes

(corticales, hipotálamicas, relacionados con los receptores del sabor etc.), consigue

influir sobre procesos tanto homeostáticos como no homeostáticos [681].

Por otra parte, las funciones superiores, como las cognitivas o de recompensa, pueden

afectar al metabolismo periférico y/o los sistemas cerebrales implicados en el estado

energético del individuo, lo que se denomina procesos “top-down”. Como ejemplo, las

ratas sobrealimentadas con dietas ricas en grasas y azúcares, a pesar de que producen

señales anorexigénicas, siguen ingiriendo un exceso de energía, lo que muestra una

disfunción en su recepción a nivel central [682].

En general todos estos factores se pueden integrar en el ciclo de iniciación y

finalización de la ingesta, en el cual se distingue claramente una fase sensorial y

cognitiva de anticipación a la comida, y una fase post ingestión, en la cual se generan

señales que determinan el cese de la comida y otras que influyen en el tiempo hasta

que se produce la siguiente comida. No obstante, no hay una delimitación estricta,

siendo más bien un proceso continuo [683].

2.4.1. Fase sensorial y cognitiva

La mayoría de las señales que han sido integradas en centros del tallo o el hipotálamo

alcanzan la corteza orbitofrontal (OFC), combinándose con información de

experiencias previas y sensaciones olfativas y visuales. Dicha integración se

correlaciona con los índices subjetivos del placer del sabor y del olor de la comida. Los

factores cognitivos tales como descripciones a nivel de palabras y la atención modulan

la representación de la recompensa hacia un alimento en la OFC y la región sobre la

que esta proyecta, la corteza anterior del cíngulo. Estos hallazgos nos muestran una

base para el entendimiento de cómo la información que se genera en la boca se

representa debido a información generada por canales independientes, cómo la

información de estos canales se combina y cómo y dónde la recompensa y el valor

subjetivo de la comida se representa y está influenciado por las señales de saciedad

[684,685]. Todo ello genera una decisión acerca del comportamiento relacionado con

la ingestas de alimento, que será más o menos consciente dependiendo de la especie

a la que nos refiramos.

121 Antecedentes

Paralelamente, conforme va pasando el tiempo desde la finalización de la anterior

comida, se van produciendo señales orexigénicas como la GRN o el NPY que hacen que

vaya aumentando la sensación de hambre y otras asociadas a la fase cefálica de la

digestión (disparada por estímulos visuales, olfativos, etc.), como el aumento de las

concentraciones circulantes de GLP-1, CCK, AMY, INS y PP, y que preparan al cuerpo

para evitar una hiperglucemia [686].

Las señales percibidas en la cavidad bucal (sabor, temperatura, textura, composición,

etc.) influyen (como se ha visto) en la ingesta, aunque esta influencia es mínima

respecto al resto de señales como muestran experimentos de “alimentación simulada”

usando animales fistulizados (a nivel del esófago o estómago), para impedir el

feedback postprandial debido a los nutrientes [687].

2.4.2. Fase post-ingestión

Una vez que se ingiere el alimento, se inician una serie de señales que poco a poco

generan una sensación de saciación, siendo uno de los estímulos más poderosos la

distensión del estómago, la cual es captada por mecanorreceptores de la pared de

este órgano, dando lugar a señales nerviosas que informan al CNS a través del nervio

vago [688].

Además, como se ha ido describiendo, un conjunto muy numeroso de señales está

constituido por distintos GP y hormonas, algunos de los cuales pueden ser secretados

incluso antes de que los nutrientes alcancen el intestino delgado, debido a una

influencia nerviosa, como es el caso de GIP [318], PP [507,508] y PYY [548], o bien

secretarse al paso de los nutrientes por el intestino proximal (CCK y GIP) o distal (GLP-

1 y PYY [689]. De entre estos péptidos, la CCK (junto con la LEP) [609] y el GLP-1 son

capaces de disminuir el vaciamiento gástrico y además el GLP-1 ralentiza el paso de

nutrientes por el intestino delgado debido al “freno ileal” [689]. Junto a estos GP

también se secretan de forma aguda desde el páncreas la INS [117] y la AMY [204], así

como de forma más amortiguada la LEP desde el tejido adiposo [573].

Respecto a su acción sobre el CNS, CCK [690], PYY [558,560] y GLP-1 [381,391] parecen

ejercer sus acciones fundamentalmente a nivel vagal, aunque GLP-1 junto con la AMY

122 Antecedentes

[210] y PP [522] también actúan sobre el romboencéfalo. Además, GLP-1 [393,394] y

PP [532] junto con INS y LEP actúan sobre el hipotálamo.

Toda esta red compleja de regulación de la ingesta, dista todavía mucho de ser

comprendida en su totalidad (se muestra en gran parte en la Figura 4), encontrándose

este campo abierto para futuras investigaciones que puedan mejorar su comprensión

y aplicarlo a los problemas de obesidad del ser humano.

123 Antecedentes

Figure 4. Schematic diagram showing some factors (no all) determining neural control of appetite. The brain monitors the nutrient sensing the internal hormonal and neural nutrient sensing mechanisms and is under constant influence of the environment (conditioned and unconditioned stimuli) through the senses and mainly the cognitive and emotional brain. The internal and external stimuli are integrated to generate adaptive behavioral (food intake) and autonomic/endocrine responses determining nutrient partitioning, energy expenditure and overall energy balance. Nutrients stimulate the release of gut hormones like LEP and GRN from the stomach, and the former from the adipose tissue, AMY, PP, GIP and INS from the pancreas and GLP-1, PYY and CCK from the intestine with may influence food intake at three sites: the vagus nerve, brainstem and hypothalamus. Release of PP, GIP and PYY can be mediated by the vagus and GLP-1 and GIP stimulate the release of INS (incretin effect).

124 Antecedentes

3. UTILIZACIÓN NUTRITIVA DE PROTEÍNA Y GRASA

3.1. CONCEPTOS

Referido a la utilización nutritiva de los nutrientes en general, existen una serie de

términos que son base para entender todo este proceso [691,692]:

- Digestibilidad: Índice que muestra la efectividad del paso de un alimento desde el

intestino al medio interno.

- Biodisponibilidad: La fracción los nutrientes ingeridos que están disponibles para

su utilización en condiciones normales fisiológicas.

- Bioeficacia: Fracción de los nutrientes ingeridos que tiene un efecto nutricional.

- Bioaccesibilidad: Fracción que es liberada de la matriz del alimento y que está

disponible para su absorción intestinal (basado en experimentos in vitro).

3.2. FACTORES QUE AFECTAN A LA UTILIZACIÓN NUTRITIVA

3.2.1. Dependientes de la dieta

Proteína

Cantidad y calidad proteica

El principal factor que condiciona la calidad nutritiva de una proteína es su propia

composición en aminoácidos. La riqueza en aminoácidos esenciales, la variedad y una

buena distribución porcentual de dichos aminoácidos, el elevado valor de graduación

química (Chemical score) del aminoácido limitante y la disponibilidad de todos los

aminoácidos esenciales y no esenciales, son los factores que definen una proteína de

elevada calidad biológica [693].

Un concepto importante relacionado con la fuente proteica es el balance de AA

referido a la proporción en la que se presentan los AA esenciales en ella [694]. Este se

puede corregir bien mediante suplementación artificial o bien ingiriendo una mayor

cantidad de proteínas de menor calidad. En general la mejor estrategia es ingerir

proteínas de distinta procedencia de forma que se complementen [695].

125 Antecedentes

La digestibilidad de una proteína parece estar sobre todo influenciada por la secuencia

de aminoácidos y por su configuración espacial [696], y mucho menos por la

proporción de proteína presente en la dieta [697].

Interacción con otros nutrientes

Aparentemente, los carbohidratos no afectan a la digestibilidad de la proteína, pero sí

los lípidos, que son capaces de disminuir el vaciamiento gástrico facilitando la

digestión ácida de las proteínas [698].

Estructura de la matriz del alimento

El efecto de la matriz sobre la digestibilidad de la proteína se ha investigado sobre

todo en estudios de alergenicidad de semillas y legumbres. En ellos se ha visto que la

liberación de las proteínas en este tipo de alimentos está directamente relacionada

con la composición de dicha matriz y de la existencia de interacciones entre proteínas,

fitoquímicos, inhibidores de proteasas y otras sustancias [699].

Componentes antinutricionales

Existen diversos componentes que se incluyen en los alimentos y se denominan

antinutricionales, ya que son capaces de dificultar la absorción de nutrientes. Para las

proteínas existen inhibidores de la tripsina presentes en las legumbres, que pueden

disminuir la absorción hasta en un 50%, o los fitatos de cereales y semillas, que la

dificultan en torno a un 20% en animales de laboratorio [700].

Grasa

Los factores que determinan su digestión y absorción son [701-705]:

- El tipo de grasa, siendo los triglicéridos (TG) con ácidos grasos de cadena corta

más fáciles de absorber que los de cadena larga.

- El estado de cristalización de los lípidos, ya que tienen más probabilidad de

formar cristales cuando los ácidos grasos sobrepasan los 16 carbonos.

126 Antecedentes

- La presencia de galactolípidos que favorecen la formación de cristales y

“atrapan” los ácidos grasos libres reduciendo su absorción y permitiendo que

alcancen porciones más distales del intestino.

- La posición del ácido graso en el TG determina si se absorbe como FFA o

diacilglicérido.

- Incorporación de la grasa (normalmente emulsionada) en la matriz alimentaria

o presentación como emulsión en una solución hidrosoluble, siendo en el

último caso más fácil la digestión cuanto más pequeñas sean las gotículas en

las que estén incluidos las grasas, ya que de esta forma la lipasa tiene más fácil

acceso.

Interacción con otros nutrientes

Una interacción con el calcio puede ser motivo de una disminución en la absorción de

ácidos grasos saturados ya que se forman jabones insolubles, como bien ha sido

confirmado por diferentes investigadores tanto en ratas como en el hombre [706,707].

3.2.2. Dependientes del modelo experimental

Lo normal es que en los modelos experimentales habituales (roedores y humanos)

tanto la digestibilidad de la proteína como la de la grasa sean altas (más de un 95%),

con pequeñas variaciones dependiendo del modelo en concreto y la fuente

alimentaria [708,709].

Estado fisiológico (obesidad)

Proteína

La inducción de obesidad (ratas Wistar con dieta cafetería) no parece interferir en la

asimilación de uno u otro tipo de aminoácidos, lo que hace pensar en la fuerte

regulación de estos procesos en dichos animales [710].

Estudios con ratas Zucker en los que se incluyen delgadas (Fa/?) alimentadas con dieta

comercial o con dieta cafetería así como obesas genéticas (fa/fa) con las mismas

dietas, se observaron los siguientes hechos [711]:

127 Antecedentes

- El grupo cafetería tanto delgado como obeso genético poseía una mayor

digestibilidad, absorción y retención de aminoácidos, así como una menor

excreción urinaria.

- Existen diferencias en el aprovechamiento de los aminoácidos de la dieta

dependiendo de si eran obsesas inducidas o genéticas: las primeras

conseguían absorber y retener una mayor proporción de aminoácidos que las

segundas.

- La deposición de proteína durante el crecimiento es mayor en el grupo

cafetería que en el control y posteriormente disminuye para igualarse con este

último. Este hecho no ocurre con las obesas genéticas, en las cuales no hay

cambios (al menos en el periodo del estudio).

- El porcentaje de energía obtenido de la proteína era mayor en las ratas

alimentadas con dieta de referencia comparado con las de dieta cafetería,

hecho que puede influir en los cambios observados en el metabolismo

proteico.

Así mismo, en un estudio similar pero realizado en ratas Wistar, se observó una

retención de proteína bruta similar. No obstante, las perdidas urinarias, aunque

pequeñas en ambos grupos, fueron mayores en el grupo control, lo que llevaba a un

porcentaje de retención respecto a la absorción superior en el grupo obeso. Se ha

propuesto que el menor porcentaje calórico de proteína en la dieta cafetería ‐y no su

cantidad en términos absolutos‐ puede desencadenar algún mecanismo de control

que posiblemente se asocia a una mayor biodisponibilidad de aminoácidos, lo que

conlleva un aumento de la deposición de proteína total [712].

En humanos se ha estudiado poco el tema, aunque podemos destacar que la obesidad

no genera cambios en el metabolismo proteico (síntesis, oxidación proteica y

proteólisis) o quizás aumenta ligeramente la proteólisis; que la oxidación proteica

parece relacionarse directamente con la oxidación de la glucosa e inversamente con la

oxidación lipídica; y por último, que la cantidad de grasa visceral se correlaciona

negativamente con los parámetros de metabolismo proteico anteriores [713,714].

Además, aunque no hay un consenso unánime, parece que la obesidad disminuye el

anabolismo proteico estimulado por INS, produciéndose una disminución de la tasa

128 Antecedentes

de síntesis proteica en el músculo esquelético en el periodo postprandial y en

respuesta a otros factores estimuladores [715,716].

Grasa

Apenas hay información de cómo afecta a largo plazo la obesidad al aprovechamiento

de la grasa, habiéndose descrito sin embrago a corto plazo un aumento de la

apolipoproteína B y AIV, y la proteína de transferencia de triglicéridos microsomal

(MTP) en el intestino de ratones, lo que derivaría en una mayor absorción de grasa y

formación de quilomicrones de mayor tamaño [717,718]. Además más recientemente

(ver revisión de Khan et al. [719]), se ha sugerido que las dietas ricas en grasa (HFD)

afectan las proteínas de las uniones estrechas, de forma que puede que aumenten la

permeabilidad intestinal [719].

Los cambios fisiológico en la digestibilidad y metabolismo lipídico en situación de

obesidad (tanto genética como inducida por HFD), han sido explorados relativamente

poco, aunque se han hecho grandes avances gracias a estudios en roedores con

obesidad inducida por la dieta (DIO) y humanos obesos [629].

Hasta la fecha, uno de los grupos que ha trabajado más intensamente en este campo

es el de Frank Duca y Mihai Covasa, los cuales han observado que las HFD aumentan la

eficiencia en la digestión, absorción, metabolismo y excreción de la grasa, debido a

cambios fisiológicos tanto a nivel de pared del tubo digestivo como en las rutas

metabólicas Además un factor importante es la interacción con la microbiota, la cual

se ve alterada en los individuos obesos, pudiendo ser determinante en algunos

procesos relacionados con la digestibilidad y metabolismo lipídico [629]

MATERIAL Y MÉTODOS

“No hay nada que no sea practicado por los que están

inspirados por Buda. Cuando son capaces de vivir de esta

manera, no hay nada carente de valor”.

(SidarthaGautama)

132 Material y Métodos

1. ESTUDIO EXPERIMENTAL EN ANIMALES

1.1. ANIMALES

Se utilizaron ratas Wistar macho (Rattus Norvegicus) como modelo experimental,

siendo facilitadas por Harlan Laboratories® (Estados Unidos) y Charles Rivers® (Estados

Unidos).

El número, BW y edad de los animales empleados en cada experimento fue el

siguiente:

- Experimento I: 30 ratas de 6 semanas de edad y 192±7.85 g de peso inicial.

- Experimento II: 30 ratas de 6 semanas de edad y 180±5.82 g de peso inicial.

- Experimento III: 30 ratas de 6 semanas de edad y 199±7 g de peso inicial.

Los animales se dispusieron en jaulas de policarbonato individuales

(para el control de la ingesta de alimento y periodos de recogida de

heces y orina) o grupales, con un ciclo de luz/oscuridad de 12/12

horas, una temperatura controlada de 21-23oC y dieta ad libitum según

el grupo asignado.

Las condiciones de bienestar animal siguieron las directrices que se postulan en el BOE

(Real Decreto 53/2013), el cual regula la investigación con animales de

experimentación.

1.2. JAULAS

Se utilizaron dos tipos de jaulas (Fig. 5):

- Jaulones de policarbonato grupales para 3 ratas con rejilla de acero inoxidable

(Tecniplast®).

- Jaulas metabólicas de policarbonato con recogida automática de heces y orina

(Tecniplast®).

133 Material y Métodos

Figure 5. Metabolic cage and normal cage

1.3. INGREDIENTES FUNCIONALES

Los ingredientes funcionales utilizados en las dietas experimentales fueron facilitados

por Biosearch Life®, nombrándose como E1, E2 y E3, por cuestiones de

confidencialidad y posible desarrollo de patentes, y por tratarse de emulsiones

obtenidas con distinta tecnología. La emulsión E1 se ensayó tanto en los experimentos

realizados en ratas como los realizados en humanos.

1.4. DIETAS

La dieta base sobre la que se partió es la AIN-93M (Tabla 6), dieta semisintética

formulada en el Instituto Americano de Nutrición [720] para cubrir los requerimientos

nutricionales de las ratas adultas.

Como dieta control (siguiendo las recomendaciones de BiosearchLife®) usamos como

base la dieta AIN-93M, sustituyendo el aceite de soja por aceite de girasol alto en

oleico (HOSO). Por su parte, en las dietas experimentales (nombradas como E1, E2 y

E3) el HOSO se reemplazó por una emulsión (E1, E2 o E3 según el caso) que contenía

las sustancias bioactivas a testar, de tal forma que el tipo y cantidad total de grasa en

todas las dietas era la misma. Todas las dietas utilizadas eran isocalóricas e

isoproteicas, excepto la dieta semisintética D21492 (Research Diets®, Estados Unidos)

que se utilizó para la inducción de obesidad en las ratas en el experimento III (ver tabla

6). Antes de cada experimento se confeccionó la cantidad de dieta necesaria para

llevarlo a cabo.

134 Material y Métodos

Table 6. Composition of the control and experimental diets (formulation) C

OM

PO

NEN

T CONTROL

DIET (AIN-93M

mod.) (g/100 g)

E1 DIET (g/100g)

E2@ DIET (g/100 g)

D12492

DIET (g/100 g)

Casein 14 14 14 25.9

Methionine 0.5 0.5 0.5 0.39

Sucrose 10 10 10 8.89

Cellulose 5 5 5 6.46

Fat 4† (HOSO) 4

‡ 4

‡ 34.89

¤

Choline 0.25 0.25 0.25 0.26

Starch 62,1 62,1 62,1 -

Maltodextrin - - - 16.2

Mineral

complex

3.5ɸ 3.5ɸ 3.5ɸ 1.29

¥

+1.68 CaHPO4

+0.71 CaCO3

+2.13

C6H5K3O7·H2O

Vitamin complex

1£ 1

£ 1

£ 1.29Ø

† HOSO (4%) + 6% of water, ‡ 4% fat emulsified components, ¤ 3.23 g of soy oil + 31.66 g of lard, ɸ Mineral complex AIN-93M, ¥ Mineral complex S10026, £ Vitamin complex AIN-93M and Ø Vitamin complex V10001. @ The E3 diet is the same as E2 with a different technical process for making the emulsion. HOSO: High oleic sunflower oil. CaHPO4: Dicalcium phosphate, CaCO3: Calcium carbonate, C6H5K3O7: Potassium citrate. FM: fresh matter.

135 Material y Métodos

1.4.1. PREPARACIÓN DE LA DIETA CONTROL, E1, E2 Y E3

Se eligió como proveedores de los ingredientes a Farmusal® (Granada) y Panreac®

(Barcelona).

Procedimiento

1- Todos los componentes se mezclaron en orden creciente de peso, añadiendo

la grasa o la emulsión en última instancia procurando no dejar ningún resto en

el recipiente en el que se haya pesado esta.

2- Finalmente las dieta control, E1, E2 y E3 se envasaron en bolsas opacas a 7oC

hasta su uso (máximo un mes) y la 12492D directamente se conservó a la

misma temperatura.

1.5. ANÁLISIS DE LAS DIETAS

1.5.1. HUMEDAD

El objetivo de esta prueba analítica es el de determinar el contenido en agua de las

dietas. Se realizó mediante desecación en estufa (Memmert®, Alemania) a 105±1° C,

hasta alcanzar peso constante.

1.5.2. CENIZAS

Las cenizas se determinaron mediante horno mufla (Mod. L9/C19, Nabertherm®,

Alemania), programado a 550oC durante 3600 minutos, hasta obtener cenizas de

aspecto blanquecino.

1.5.3. PROTEÍNA, GRASA Y CARBOHIDRATOS TOTALES

Se analizaron la proteína y grasa mediante las mismas técnicas que se detallan más

adelante en el análisis de heces y orina. Los carbohidratos totales se estimaron

mediante diferencia con el resto de componentes medidos (agua, proteína, grasa total

y cenizas).

136 Material y Métodos

1.6. DISEÑO EXPERIMENTAL

1.6.1. EXPERIMENTO I (CORTO PLAZO)

Se utilizaron 30 ratas, a las cuales se dispuso de forma aleatoria en los grupos

denominados control, E1 y E2, resultando 10 ratas en cada grupo.

Tras 2 días de adaptación con pienso comercial (Teklad Global Diets 2014 Harlan

Laboratories®), los animales se alojaron en jaulas metabólicas durante 6 días, con libre

acceso a las dietas semisintéticas (C, E1 y E2), y realizándose a diario un control de la

ingesta, así como la recogida de heces y orina. Las ratas se pesaron al inicio, mitad y

final periodo dietético así como al final del Experimento (al sacrificio). Tras finalizar el

periodo dietético se llevó a cabo un estudio con el objetivo de determinar las

concentraciones plasmáticas de distintos péptidos gastrointestinales y hormonas en

los estados de ayuno y postprandial (ver apartado 1.8.1).

Figure 6. Time schedule of Experiment I. The diets used were control (C), E1 and E2.

137 Material y Métodos

1.6.2. EXPERIMENTO II (LARGO PLAZO)

Se dispusieron 30 ratas de la misma forma que en el Experimento I. E igualmente, tras

una adaptación de 2 días con pienso comercial las ratas se ubicaron en jaulas

metabólicas y se mantuvieron con la dieta control o las dietas experimentales (las

mismas que en el experimento I), en este caso durante 10 semanas, controlándose la

ingesta de forma diaria y el peso semanalmente, y llevándose a cabo una recogida de

heces y orina a lo largo de la semana 5. Al final del periodo dietético se realizó el

mismo estudio que en el experimento I para determinar las concentraciones

plasmáticas de péptidos gastrointestinales y hormonas.

Figure 7. Time schedule of Experiment II. The diets used were control (C), E1 and E2.

138 Material y Métodos

1.6.3. EXPERIMENTO III (LARGO PLAZO CON INDUCCIÓN PREVIA DE

OBESIDAD)

Para la inducción de obesidad se utilizó una dieta rica en grasa (D12492, Research

Diets®, Estados Unidos) (ver Tabla 6), la cual se ofreció a los animales ad libitum

durante 9 semanas, periodo que, tal y como se discute más adelante, se consideró el

más conveniente para nuestros objetivos tras una revisión bibliográfica exhaustiva.

Posteriormente, terminado el periodo de inducción de obesidad, se distribuyeron las

ratas de forma que hubiera en los diferentes grupos tanto ratas resistentes como

propensas a la inducción de obesidad (hecho que ocurre de forma natural), y se les

alimentó ad libitum con las dietas de estudio durante otras 10 semanas

experimentales. Este diseño nos permitirá comparar la influencia de las dietas en ratas

obesas -experimento III- con ratas no obesas -experimento II-.

Durante ambos periodos se realizó un control diario de la ingesta, así como una

recogida de heces y orina durante 7 días en la semana 5 del periodo experimental. El

BW se registró semanalmente y al final del segundo periodo dietético se realizó el

estudio para determinar las concentraciones plasmáticas de hormonas y péptidos,

como en los estudios anteriores.

Para comprobar si las dietas experimentales modificaban la tolerancia a la glucosa con

respecto a la situación durante la inducción de obesidad, se realizaron tests de

tolerancia a la glucosa (OGTT) en ambos periodos (ver epígrafe 1.10).

139 Material y Métodos

Figure 8. Time schedule of Experiment III. The diet used in the obesity induction period was the diet D12492, and those used in the experimental period were control (C), E1 and E3.

1.7. CONTROL DE LA INGESTA Y DEL PESO

Para el control de la ingesta se alojaron los animales en las jaulas metabólicas

individuales:

1- Se pesaron los comederos vacíos (Mod. 125A, Precisa®, Suiza), anotándose el

valor.

2- Se llenaron de forma que posibilitase una alimentación ad libitum.

3- Tras 24 horas, aproximadamente, se volvió a pesar el comedero.

El control de BW se realizó en los animales en estado de ayunas. Concretamente, se

retiraba la comida de las jaulas aproximadamente a las 21.00 horas y los animales se

pesaban en ayunas al día siguiente alrededor de las 9.00 horas.

140 Material y Métodos

1.8. ANÁLISIS DE LA CONCENTRACIÓN PLASMÁTICA DE

PÉPTIDOS GASTROINTESTINALES Y HORMONAS

1.8.1. DISEÑO DEL ESTUDIO Y PROCEDIMIENTO DE RECOGIDA DE MUESTRAS

DE SANGRE

Para la obtención de las muestras de plasma se dejó a los animales en ayunas (36h). Al

finalizar este periodo los animales se pesaban y a continuación se iniciaba el estudio.

Se inmovilizó a los animales en un restrainer o cepo (Mod. LE502, Panlab®, Barcelona)

y se tomó una muestra de sangre en ayunas (basal) practicando un pequeño corte en

el extremo de la cola y ejerciendo presión sobre ésta. A continuación se les introdujo

en la jaula con acceso ad libitum a la comida durante 15 minutos. En general, la

ingesta observada durante este tiempo osciló entre 1 y 3 gramos. Se anotó como

tiempo 0 el momento en que se les volvió a retirar el alimento, tomándose la siguiente

muestra a los 15 minutos (muestra S15) y, sucesivamente, a los 30 (S30), 60 (S60) y

120 (S120) minutos, como indica la Fig. 9.

Figure 9. Time schedule of the blood sample recollection.

141 Material y Métodos

1.8.2. PROCESADO DE MUESTRAS

Tras recogerse las correspondientes muestras de sangre en viales con EDTA 0,340 M

en salina tamponada con fosfatos (PBS), con una relación de 60 µl por cada ml de

sangre, se añadieron inmediatamente los inhibidores de proteasas según las

cantidades recomendadas por el fabricante, siendo estas:

- Aprotinina (Ref: A1153, Sigma-Aldrich®): Tras preparar una solución acuosa del

producto, se añadió a la muestra el volumen adecuado para lograr una

actividad final de unos 500 KIU/ml sangre

- Pefabloc (Ref: 11429868001, Roche®): Tras preparar una solución acuosa del

producto, se añadió a la muestra el volumen adecuado para lograr una

concentración final (en sangre) de 4 mM.

- DPPIV (Ref: DPP4-010, Millipore®): La solución comercial (lista para su uso) se

añadió en proporción de 10 μl/ml sangre.

Conforme se iban recogiendo las muestras en viales (tras reunir un número de 10), se

procedía a su centrifugación (Mod. 5810R, Eppendorf®, Alemania) a 2057xg durante

15 minutos, para posteriormente separar el plasma del sedimento. Tras disponerse en

viales de polipropileno, se guardaron dichas muestras a -80º para su posterior análisis.

1.8.3. MEDICIÓN DE CONCENTRACIONES

Determinación de AMY (activa), GRN (activa), GIP (total), GLP-1 (activo),

LEP, INS, PP y PYY (total).

Fundamento

La determinación de las hormonas y péptidos mencionados se llevó a cabo gracias a la

tecnología MilliplexTM Luminex® X-Map® (resumida en la Fig. 10), más concretamente

usando el kit LINCOplex Kit #RGT-88K (Rat Gut Hormone Panel), suministrado por la

empresa Millipore® (España).

La tecnología xMAP® en la que se basa el kit consiste en asociación de un citómetro de

flujo y una reacción de tipo ELISA en sándwich utilizando como superficie la de unas

microesferas.

142 Material y Métodos

Para la detección del tipo de microesfera se lleva a cabo un marcaje fluorescente

gracias a dos colorantes que se encuentran en proporciones que van del 1% al 99% y

del 99% al 1%, respectivamente. Así se consiguen un total de 100 diferentes tipos de

microesferas marcadas en el rango que va desde el rojo al infrarrojo, de forma que

teóricamente se pueden medir 100 analitos diferentes en una misma muestra.

Por otro lado se asocia a cada tipo de microesfera el anticuerpo primario al que se va a

unir el analito en cuestión, asociándose posteriormente a este conjugado un

anticuerpo secundario ligado a biotina, la cual reacciona con la estreptavidina-

ficoeritrina para producir fluorescencia. Así, el aparato lleva un láser rojo que detecta

el tipo de microesfera, y otro verde que detecta la cantidad de fluorescencia de la

estreptavidina-ficoeritrina. La concentración del analito en la muestra se puede

determinar tras extrapolar dichos valores en una curva estándar de

concentración/fluorescencia.

Figure 10. Principle of the technology Milliplex™ Luminex® X-Map®.

143 Material y Métodos

Respecto a la sensibilidad para cada analito y el rango de medición del kit se muestran

en la Tabla 7.

Table 7. Sensitivities and ranges of the kit LINCOplex Kit #RGT-88K.

SENSITIVITY RANGE

AMY (pg/ml) 20 41.2-30000

GIP (pg/ml) 1 2.7-2000

GLP-1 (pg/ml) 28 41.2-30000

GRN (pg/ml) 2 6.9-5000

INS (pg/ml) 28 68.5-50000

LEP (pg/ml) 27 68.5-50000

PP (pg/ml) 17 6.9-5000

PYY (pg/ml) 16 6.9-5000

Equipo

El equipo es el modelo Luminex 200™ y consta de una unidad encargada de gestionar

los fluidos y un citómetro con los dos láseres mencionados, todo ello asociado al

software xPonent®, que gestiona las datos obtenidos.

Reactivos y material

- Kit LINCOplex #RGT-88K

o Placa de 96 pocillos

o Estándar de péptidos gastrointestinales y hormonas de rata (1 vial)

o Controles 1 y 2 (2 viales)

o Solución de ensayo (1 vial)

o Diluyente de microesferas (1 vial)

o Solución de lavado 10X (1 vial)

o Anticuerpos de detección (1 vial)

o Estreptavidina-ficoeritrina (1 vial)

o Botella para mezcla de microesferas

144 Material y Métodos

o Viales con solución de las microesferas (8 viales)

- Muestras de plasma con inhibidores de proteasas

- Pipetas calibradas (Eppendorf®, Alemania)

- Puntas de pipeta VWR® (EE.UU)

- Agitador de placas (Mod. PSU-2T, Boeco®, Alemania)

- Vortex (Mod. SA6, Stuart Scientific®, Reino Unido)

- Sonicador (Mod. 200, Branson®, Estados Unidos)

- Material general de vidrio (Pyrex®, Reino Unido y Pobel®, Madrid)

- Papel de filtro y absorbente

Procedimiento

1- Preparación de las microesferas: Se sonicaron (30 segundos) y agitaron en

vortex (1 minuto) los 8 viales que contienen las microesferas para cada una de

las hormonas/péptidos. De cada vial se obtuvieron 150 µl que se iban

añadiendo a un vial especial de mezcla y al que posteriormente se adicionaron

1800 µl de diluyente de microesferas, para así alcanzar un total de 3 ml de

nuestra mezcla de microesferas.

2- Preparación de los controles: Se reconstituyeron el control QC1 y el QC2, los

cuales contienen, respectivamente, dos concentraciones conocidas de todas

las hormonas/péptidos a ensayar.

3- Preparación de la curva estándar:

a. Disponer 6 viales numerados del 1 al 6.

b. Reconstituir el vial con la solución estándar original y a partir de ésta

realizar diluciones seriadas de 1:4 con solución de ensayo.

4- Montaje de la placa:

a. Primero se añade el estándar, controles y solución de ensayo.

b. Centrifugamos las muestras de plasma a 3000xg durante 5 minutos y

cogiendo 25 μl de la zona superior se agregan al pocillo

correspondiente.

c. Por último se añaden las microesferas a todos los pocillos.

145 Material y Métodos

5- Incubación nocturna durante 18 horas a 4oC con agitación constante y

posteriormente 3 lavados utilizando solución de lavado, centrifugando a

1300xg durante 5 minutos, volcando y secando la placa.

6- Adición del anticuerpo segundario e incubación durante 30 minutos a

temperatura ambiente.

7- Agregar la estreptavidina-ficoeritrina e incubar durante 30 minutos a

temperatura ambiente.

8- Realizar tres lavados de la misma forma que en el punto 5 y añadir líquido

vehiculizador finalmente.

9- Leer utilizando el equipo Luminex 200™.

10- Análisis de los resultados mediante el software Luminex® xPonent®, el cual

calcula las concentraciones de la muestra en base a la curva estándar.

Determinación de CCK

Fundamento

Se ha dispuesto del kit CCK (26-33) Extraction Free (EKE-069-04) de Phoenix

Pharmaceuticals®, cuya sensibilidad es de 0.04 ng/ml y rango de medida de 0-100

ng/ml.

Dicho kit se basa en un inmunoensayo de tipo ELISA sándwich, para el cual se dispone

de una placa de 96 pocillos en los cuales se ha asociado a la superficie el anticuerpo

secundario con las uniones no específicas bloqueadas. El anticuerpo primario puede

unirse al Fragmento cristalizable (Fc) del anticuerpo secundario y, por otro lado, el

fragmento de unión al antígeno (Fab) del anticuerpo primario puede unirse de forma

competitiva bien a un péptido biotinilado (que nos servirá para la detección) o bien al

péptido problema que se desea medir en las muestras (analito).

El péptido biotinilado es capaz de interaccionar con la estreptavidina-peroxidasa de

rábano (SA-HRP), que a su vez podrá actuar sobre un sustrato produciendo color

amarillo. La intensidad de color se correlaciona directamente con la concentración de

anticuerpo biotinilado e inversamente con la concentración de péptido problema de la

146 Material y Métodos

muestra. Una curva estándar de concentraciones conocidas del péptido problema nos

permitirá determinar su concentración en la muestra por extrapolación.

Figure 11. ELISA immunoassay for CCK measurement.

Equipo

El equipo utilizado para la lectura de la placa fue un lector de placas (Mod. Synergy™

HT, BioTek® Instruments, Alemania), que consta del módulo de lectura y un ordenador

asociado con el software Gen 5 para análisis de los resultados.

Reactivos y material

- Kit CCK 26-33 (Human, Rat, Mouse) EIA Extraction Free (EKE-069-04)

o Solución de ensayo concentrada 20x (1 vial)

o Placa de 96 pocillos con anticuerpo secundario adherido

o Péptido (CCK) estándar (1 vial)

147 Material y Métodos

o Péptido biotinilado (1 vial)

o Estreptavidina-peroxidasa de rábano (SA-HRP) (1 vial)

o Control positivo (2 viales)

o Solución sustrato (TMB) (1 vial)

o 2N HCl (1 vial)

o Solución diluyente (1 vial)

- Pipetas calibradas Eppendorf® (Alemania)

- Puntas de pipeta VWR® (EE.UU)

- Agitador de placas Boeco® (Alemania)

- Material general de vidrio general

- Papel de filtro y absorbente

Procedimiento

1- Preparación de las soluciones y componentes del kit:

a. Diluir 20x la solución de ensayo con agua bidestilada.

b. Rehidratar y llevar a 5 ml con solución de ensayo y diluyente el

péptido biotinilado y el anticuerpo primario.

c. Reconstituir el control positivo.

2- Reconstituir el vial del estándar y preparar la curva estándar en 5 viales con

una proporción 1:5 de forma seriada.

3- Montaje de la placa:

a. Añadir la solución de dilución en los pocillos de unión total, la curva

estándar y los controles positivos.

b. Disponer las muestras (previa centrifugación a 3000 rpm durante 5

minutos) en los pocillos correspondientes de acuerdo con la plantilla.

c. Agregar el anticuerpo primario y el péptido biotinilado. Tapar e

incubar durante dos horas a temperatura ambiente. Descartar el

contenido, secar y lavar 4 veces con solución de ensayo.

d. Añadir el SA-HRP y lavar como en el punto anterior.

e. Adicionar el TMB e incubar 1 hora y posteriormente el HCl 2N para

detener la reacción.

f. Leer en el lector de placas a 450 nm en un tiempo de 20 minutos.

148 Material y Métodos

g. Análisis de los resultados con el programa Gen 5™, utilizar una curva

de 4 parámetros para interpolar los resultados en la curva estándar.

1.9. ANÁLISIS DEL CONTENIDO DE NITRÓGENO EN HECES Y

ORINA, Y DE GRASA EN HECES

RECOGIDA DE LAS MUESTRAS

La recogida de heces y orina se llevó a cabo por una mera separación mecánica gracias

al diseño de la jaula metabólica.

Para que el nitrógeno de la orina no se evaporase, se dispuso en cada tubo una

cantidad de aproximadamente 10 ml de solución de ácido de ácido clorhídrico (5N)

junto con el indicador Shiro-Tashiro, cuyo viraje nos indica el pH de la muestra.

1.9.1. PROCESADO DE LAS MUESTRAS

Orina

Las orinas se filtraron y se llevaron a un volumen conocido de orina en solución ácida

(ácido clorhídrico (5N) e indicador Shiro-Tashiro).

Heces

Recolección, molienda (Foss®, Barcelona) y liofilización (Cryodos, Telstar®, España) de

las heces del periodo de recogida y posterior congelación a -80oC.

1.9.2. ANÁLISIS DE MUESTRAS

Contenido en nitrógeno (heces y orina)

El nitrógeno total de origen orgánico se cuantificó median el método Kjeldahl [721],

aplicada de manera automatizada (Mod. K-350/K-355, Buchi®, Suiza).

Contenido en grasa (heces)

Para conocer la grasa total presente en la muestra inicialmente se realizó una hidrólisis

149 Material y Métodos

ácida (para liberar la grasa de la matriz que la contiene) y después la extracción con

solvente orgánicos (Soxhlet) (Mod. B-811/B-811 SLV, Buchi®, Suiza) [722].

1.9.3. ÍNDICES BIOLÓGICOS

A partir de los datos de I (ingerido), F (excreción fecal) y U (excreción urinaria), se

calcularon los siguientes índices biológicos [723]:

Coeficiente de digestibilidad aparente (CDA) (apparent digestibility coefficient, ADC):

Es la relación porcentual entre la cantidad absorbida de la ingerida, sin tener en

cuenta las pérdidas endógenas.

(

)

Balance o retención (R) (balance or retention): Refleja la retención (de nitrógeno en

nuestro caso) en el organismo en valor absoluto.

( )

Relación porcentual de lo retenido en relación al absorbido (% R/A, percent of

retention/absorption): Expresa porcentualmente la cantidad retenida con respecto a la

absorbida.

(( ( ))

)

1.10. CURVA DE GLUCEMIA (EXPERIMENTO III)

1.10.1. FUNDAMENTO

Se realizó un test de tolerancia a la glucosa (OGTT) (véase más abajo), siguiendo el

protocolo descrito en el trabajo de Prieto et al. [724].

1.10.2. REACTIVOS Y MATERIAL

- Medidor de glucosa (Accu-Chek® Compact Plus, Roche®, Alemania) y tiras

reactivas

150 Material y Métodos

- Jeringas de 1 ml y 5 ml

- Sonda intragástrica de material plástico

- Cepo (Mod. LE5025, Panlab®, Barcelona)

- Agua caliente

- Tijeras (varias)

- Solución glucosada extemporánea

1.10.3. PROCEDIMIENTO

1- Preparar la solución de glucosa en solución salina de concentración 1,725 M.

2- Pesar al animal (Mod. Alc 30100.2, Aculab®, Reino Unido) y calcular el

volumen de solución de glucosa a administrar (dosis: 4 µl de la anterior

solución glucosada por cada gramo de BW).

3- Cargar dicha cantidad en una jeringa.

4- Medir la glucosa al inicio del experimento (Accu-Chek® Compact Plus, Roche®,

Alemania) (ayunas). Se practica un pequeño corte en la punta de la cola y se

deposita una gota de sangre en la tira reactiva.

5- Administrar la glucosa mediante la sonda intragástrica, procurando un

manejo que minimice el estrés del animal.

6- Medir de nuevo la concentración de glucosa en sangre a los 15, 30, 60 y 90

minutos.

1.11. EUTANASIA Y OBTENCIÓN DE ÓRGANOS POSTMORTEN

1.11.1. EUTANASIA

Se anestesió a los animales con Ketamina/Xilacina (40-90/5-10 mg/kg) mediante

inyección i.p., extrayéndose la sangre por punción cardiaca.

1.11.2. OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS ÓRGANOS

1- Se obtuvieron los órganos mencionados a continuación (si no se indica

experimento en concreto se extrajeron en los tres) y de la forma más rápida

posible se dispusieron en paquetes hechos con papel de aluminio:

o Hígado

151 Material y Métodos

o Colon

o Ciego

o Bazo

o Cerebro (Experimento II y III)

o Grasa (Experimento III)

i. Subcutánea

ii. Epididimal

iii. Abdominal

2- Dichos paquetes se introdujeron lo más rápido posible en nitrógeno líquido y

se conservaron a -80oC en congelador (Thermo Scientific®, Alemania).

1.12. DETERMINACIÓN DE COLESTEROL Y TRIGLICÉRIDOS EN

HÍGADO

1.12.1. FUNDAMENTO

La determinación de triglicéridos y colesterol se llevó a cabo mediante kits comerciales

(Ref: 1001310 y 1001091, respectivamente; Spinreact®, Gerona).

1.12.2. REACTIVOS Y MATERIAL

- Kit GPO-POD Enzimático Colorimétrico (Spinreact®, Gerona) para triglicéridos

y para colesterol.

o Buffer R1 (buffer) y Buffer R2 (enzimas)

o Control

- Reactivos para extracción

o Solución etanólica de hidroxitolueno butilado (BHT) al 0,01% (p/v)

o Mezcla de etanol (0,01% BHT) y KOH 11M (razón 10:1)

o NaCl (9%)

o Hexano (95%)

- Centrífuga de viales (Mod. 5810R, Eppendorf®, Alemania)

- Pipetas y puntas (Eppendorf®, Alemania)

- Material de vidrio (tubos especiales para sonicar)

- Microbatidora (Miccra®, Alemania) y sonicador (Bandelin®, Alemania)

- Baño caliente automático (Memmert®, Alemania)

152 Material y Métodos

- Nitrógeno gaseoso (Air Liquide®, Granada)

- Tubos y aparataje para evaporación

- Liofilizador (Mod. Cryodos, Telstar®, España)

1.12.3. PROCEDIMIENTO

Extracción

1- Liofilizar el hígado durante 48 horas el hígado.

2- Triturar 0,3 g de hígado.

3- Homogeneizar y sonicar, añadiendo al tejido 1 ml de NaCl (9%) y 3 ml de

etanol (0,01% BHT).

4- Adicionar 0.5 ml de la solución de etanol:KOH.

5- Saponificar en baño caliente (Memmert®, Alemania) a 60oC durante 40

minutos.

6- Extracción con hexano y agua bidestilada.

7- Centrifugar a 790xg durante 10 minutos.

8- Tomar la fase orgánica que queda en la parte superior.

9- Evaporar con nitrógeno gaseoso en campana.

10- Adicionar hexano hasta 1 ml y conservar las muestras a -20º C.

Medición de triglicéridos

1- Mezclar buffer 1 y 2 (Solución de ensayo).

2- Añadir en una placa de 96 pocillos la solución de ensayo solamente y ésta

mezclada con hexano por duplicado.

3- Disponer el control por duplicado.

4- Adicionar las muestras por duplicado en los pocillos asignados.

Medición de colesterol

1- Realizar los mismos pasos que en los TGs.

Lectura y análisis de los resultados

1- Leer en el lector de placas BIO-TEK® a 505 nm.

153 Material y Métodos

2- Realizar los cálculos pertinentes para obtener los mg/ml de TGs y colesterol y

en relación al peso total del hígado.

1.13. ANÁLISID DE LAS MUESTRAS DE SANGRE TOMADAS AL

SACRIFICO

Se obtuvo toda la sangre posible en tubos con EDTA tripotásico 0,324 M (20 µl/500 µl

de sangre) y aprotinina (8 µl/500 ml de sangre). Se tomó una alicuota de sangre fresca

para el estudio hematológico, y el resto se centrifugó para obtener el plasma, el cual

se alicuotó y congeló hasta su posterior análisis.

1.13.1. HEMOGRAMA

En una alícuota de sangre fresca se midieron los siguientes parámetros mediante un

analizador hematológico (Mod. kx-21, Sysmex®, Japón):

o WBC (White blood cells): Recuento de glóbulos blancos.

o RBC (Red blood cells): Recuento de glóbulos rojos.

o HGB (Haemoglobin): Concentración de hemoglobina en sangre.

o HCT (Haematocrit): Hematocrito.

o MCV (Mean corpuscular volume): Volumen corpuscular medio.

o MCH (Mean corpuscular haemoglobin): Hemoglobina corpuscular

media.

o MCHC (Mean corpuscular haemoglobin concentration ): Concentración

de hemoglobina corpuscular media.

o PLT (Platelets): Recuento de plaquetas.

1.13.2. ANÁLISIS BIOQUÍMICO DEL PLASMA

La determinación de la concentración de triglicéridos y colesterol plasmáticos se llevó

a cabo mediante kits comerciales (Ref: 1001310 y 1001091, respectivamente;

Spinreact®, Gerona).

154 Material y Métodos

2. ESTUDIO EXPERIMENTAL EN HUMANOS

2.1. VOLUNTARIOS

Quince voluntarios normoglucémicos jóvenes sin ninguna complicación médica (9

mujeres y 6 hombres) de Granada (España) cuyas características eran las siguientes

(media±EEM):

- Edad: 28,13±4,63 años

- Peso: 70,45±12,64 kg

- Altura: 165,9±9,6 cm

- BMI: 21,15±3,06 kg/m2

- Superficie corporal: 1,78±0,19 m2

2.2. PRODUCTOS

Los productos a testar fueron para el grupo control un desayuno estándar que

consistió en una rebanada de pan integral (28 g), un plato de pasta (30 g /m2 de área

corporal), un yogur desnatado, y aceite de girasol (50 g/m2 de área corporal), y para el

grupo E1 el mismo desayuno adicionado con 10 gramos de emulsión E1.

La superficie de área corporal (SAC) se calculó según la fórmula de Dubois y Dubois

[725]:

( )

SAC = Superficie de área corporal (m2)

a = altura (cm)

p = peso (kg)

2.3. DISEÑO EXPERIMENTAL

Todos los voluntarios ingresaron por la mañana en la Unidad Metabólica de Biosearch

Life® (10-12 horas de ayuno, tomando solo agua) y permanecieron en la Unidad

Metabólica (climatizada a 22ºC), en reposo.

155 Material y Métodos

Tras tomar una primera muestra de sangre en ayunas, los participantes consumían el

desayuno estándar a lo largo de un periodo de 10 minutos. Durante las ocho horas

siguientes se les tomaron muestras de sangre y se evaluó la saciedad (ver protocolo

más adelante).

Todo el protocolo se repitió al día siguiente, pero en vez del desayuno estándar los

participantes ingirieron el desayuno adicionado con la emulsión E1.

La dieta de los voluntarios fue controlada a lo largo del estudio mediante encuestas

nutricionales de recordatorio 24 horas y un cuestionario de frecuencia de consumo de

alimentos dónde se muestran las diferencias observadas entre ambos productos con

respecto a los cambios en la ingesta diaria de energía, macronutrientes y ciertos

micronutrientes a lo largo del estudio.

2.4. ESTUDIO DE SACIEDAD

Como se ha comentado, cada hora se realizó a los voluntarios una encuesta basada en

la escala de Haber [726], que cuantifica la sensación de hambre o saciedad puntuando

en una escala de 10 (saciedad) a -10 (hambre):

- Extremadamente hambriento …………………………..….….….… -10

- Hambriento …………………………………………..………….…..… -8

- Bastante hambriento (deseo comer) …………...………………...… -6

- Poco hambriento (no hambriento pero me complacería comer) ... -4

- Hambre muy ligera …………….……...……………………….….…. -2

- Sin hambre ………………………...…………………………..….…… 0

- Parcialmente satisfecho …………………….….……………..……… 2

- Saciado pero podría comer algo más ............................................ 4

- Saciado de forma complaciente …………………………….….…… 6

- Demasiado lleno …………………………………………….….…….. 8

- Absolutamente saciado (no puedo más) ...................................... 10

Se analizaron 4 parámetros: tiempo de saciedad, intensidad de saciedad (incremento

del área bajo la curva para saciedad), tiempo de hambre e intensidad de hambre

(incremento del área bajo la curva para hambre).

156 Material y Métodos

2.5. ANÁLISIS DE LA CONCENTRACIÓN PLASMÁTICA DE

PÉPTIDOS GASTROINTESTINALES

2.5.1. DISEÑO DEL ESTUDIO Y PROCEDIMIENTO DE RECOGIDA DE MUESTRAS

DE SANGRE

Las muestras de sangre se obtuvieron de la vena antecubital mediante la colocación

de una vía. Tras recogerse una muestra de sangre en ayunas (basal, tiempo 0)), los

participantes ingirieron el desayuno (a lo largo de 10 min), tomándose sucesivas

muestras de sangre (3,5 ml) durante el periodo postprandial (1ª, 2ª, 3ª, 4ª, 5ª y 8ª

horas).

Figure 12. Time schedule of the blood sample recollection.

2.5.2. PROCESADO DE MUESTRAS

Conforme se iban recogiendo las muestras en viales (tras reunir un número de 15), se

procedía a coagulación durante 30 minutos, para posteriormente retirar el coágulo y

centrifugar el suero remanente a 1000xg (Mod. 5810R, Eppendorf®, Alemania)

durante 10 minutos.

Posteriormente se dispuso el suero en viales de 60 añadió al vial de suero

- Cóctel de inhibidores de proteasas (Ref: 04693116001, Roche®): Se preparó la

solución acuosa 1X de la cual se tomaron 40 μl por cada mililitro de sangre.

157 Material y Métodos

- Pefabloc (Ref: 11429868001, Roche®): Tras preparar una solución acuosa del

producto, se añadió a la muestra el volumen adecuado para lograr una

concentración final (en sangre) de 4 mM.

- DPPIV (Ref: DPP4-010, Millipore®): La solución comercial (lista para su uso) se

añadió en proporción de 10 μl/ml sangre.

Tras disponerse en viales de polipropileno, se guardaron dichas muestras a -80º para

su posterior análisis.

2.5.3. MEDICIÓN DE CONCENTRACIONES

Determinación de GRN (activa), GIP, LEP, INS, PP y PYY (total).

Se llevó a cabo gracias al kit LINCOplex#HGT-68K (Human Gut Hormone Panel),

suministrado por la empresa Millipore® (España).

El fundamento, equipo, reactivos y material y procedimiento fueron mismos ya

descritos para los péptidos gastrointestinales y hormonas de rata, siendo en este caso

la sensibilidad y el rango para cada analito los recogidos en la Tabla 8.

Table 8. Sensitivities and ranges of the kit LINCOplex Kit #RGT-88K.

SENSITIVITY RANGE

GIP (pg/ml) 0.2 2.7-2000

GRN (pg/ml) 1.8 13.7-10000

INS (pg/ml) 44.5 137-100000

LEP (pg/ml) 157.2 137-100000

PP (pg/ml) 2.4 13.7-10000

PYY (pg/ml) 8.4 13.7-10000

158 Material y Métodos

3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Y CÁLCULO DE LAS VARIABLES

En primer lugar se realizó una estadística descriptiva básica para cada uno de los

grupos. La normalidad de la distribución de valores se examinó mediante el test de

Shapiro-Wilk. Para las variables que no siguieron una distribución normal, se

sometieron a transformación logarítmica con base 10, logarítmica neperiana y a raíz

cuadrada, de forma que si no cambió la distribución se utilizaron los test no

paramétricos U de Mann-Whitney y H de Kruskal-Wallis.

Para las variables con una distribución normal, se aplicó el test de Dunnet de

homogeneidad de varianzas, examinándose posteriormente las diferencias entre las

medias de los diferentes grupos experimentales mediante ANOVA de una vía

(procedimiento one-way de SPSS), seguido del test a posteriori (post-hoc) de Duncan,

o bien, dependiendo de la variable a analizar, un test de la t de Student (t-test) para

muestras relacionadas.

El área bajo la curva se calculó mediante el método trapezoidal [727] y se analizaron

las diferencias mediante un t-test para variables no relacionadas teniendo en cuenta la

homogeneidad de varianzas para la significación.

Los resultados presentados en el texto, tablas y figuras son valores medios y sus

errores estándar (media±EEM). En todos los casos, sólo se consideraron significativas

aquellas diferencias con valores de P<0.05.

Para el análisis estadístico se utilizó la aplicación informática SPSS para Windows

(versión 19.0).

RESULTADOS

“El trabajo científico consiste en ver lo que todo el mundo ha

visto, pero pensar en lo que nadie ha pensado”.

(Albert Szent-Györgyi)

162 Resultados

1. COMPOSICIÓN DE LAS DIETAS Y DISEÑO EXPERIMENTAL

Table 9. Composition of experimental diets.

E1 E2@ C DIO

HUMIDITY (%)

13.33 ± 0.34 12.80 ± 0.41 12.23 ± 0.81 3.60 ± 0.20 *

PROTEIN (%)

13.14 ± 0.56 13.12 ± 0.52 12.17 ± 0.41 21.16 ± 0.26 *

FAT (% )

3.88 ± 0.05 4.08 ± 0.15 3.62 ± 0.13 34.76 ± 1.25 *

TOT CHO (%)

68.11 ± 0.64 68.16 ± 0.76 70.34 ± 1.17 40.30 ± 1.20 *

ASH (%) 1.80 ± 0.13 2.02 ± 0.07 2.02 ± 0.07 0.21 ± 0.01 *

Values are expressed as mean ± SEM (n=6-8). @ The E3 diet has the same composition as the E2 but the emulsion was made by a different technological process. DIO: Diet for the induction of obesity (D12492, Research Diets®). The asterisk (*) indicates that all the parameters of the DIO diet differ significantly from the other diets. Abbreviations: TOT CHO (total carbohydrates).

Se muestran los resultados analíticos de las dietas utilizadas en los diferentes

experimentos.

2. EXPERIMENTOS EN RATAS CON NORMOPESO

2.1. CORTO PLAZO

2.1.1. Ingesta

163 Resultados

0 1 2 3 4 5

60

70

80

90

100

110

b

Time (days)

To

tal in

take (

Kcal/d

)

0 1 2 3 4 5

20

22

24

26

28

30

a

Time (days)

To

tal in

take (

g/d

)

0 1 2 3 4 5

12

14

16

18

20

22

c

Time (days)

To

tal ch

o in

take (

g/d

)

0 1 2 3 4 5

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

d

Time (days)

Fat

inta

ke (

g/d

)

0 1 2 3 4 5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

e

Time (days)

Pro

tein

in

take (

g/d

)

E1 E2 C

Figure 13. Daily intake of food (a),energy (b), total carbohydrates (c), fat (d) and protein (e) in rats fed for 6 days with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E2). Values represent mean ± SEM (n = 8-10). For a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: α: C vs E2, β: C vs E1, and ε: E1 vs E2. Abbreviations: CHO (carbohydrates). The age of the rats at the beginning of the experimental period was 6-7 weeks.

164 Resultados

La ingesta de alimento (Fig. 13 a) y de energía (Fig. 13 b) es similar en los tres grupos a

lo largo de la mayor parte del periodo experimental exceptuando el día 0, en que los

valores de ambos parámetros en los grupos experimentales (E1 y E2) son

significativamente mayores que en el grupo control, y el día 5, en que las diferencias

significativas aparecen exclusivamente entre los grupos E1 y E2, con valores mayores

en el último.

Refiriéndonos a los HDC (Fig. 13 c), existen diferencias significativas el día 0, con una

ingesta mayor en el grupo E2 frente a control, el día 3, en el que la ingesta de HDC del

grupo control es significativamente mayor que en E1, y el día 5, en el que las

diferencias alcanzan significación estadística entre los grupos E1 y E2, siendo los

valores mayores en E2.

Como se aprecia en la Fig. 13 d, la ingesta de grasa en el día 0 es diferente (P<0.05)

entre todos los grupos de nuestro estudio, siendo mayor en E2, intermedia en E1 y

menor en el grupo control. Del día 1 al 5, las diferencias significativas se ponen de

manifiesto solamente entre el grupo E2 frente los otros dos (mayor en E2).

En cuanto a la ingesta de proteína (Fig. 13 e), a lo largo de la mayor parte del periodo

experimental (excepto en el día 3), aparecen diferencias (P<0.05) entre los grupos E2 y

control, con menores valores en el último. Comparando el grupo E1 y el control,

podemos ver que la ingesta proteica es mayor en el grupo E1 durante los tres primeros

días, y si comparamos los grupos E1 y E2 se observan diferencias significativas en el

primer y último día, siendo mayor el valor observado en E2.

El patrón de evolución temporal de ingesta de alimento, energía y macronutrientes es

similar en los tres grupos, de forma que disminuye la ingesta de forma significativa los

días 1 y 2, y posteriormente se mantienen constantes hasta el final del periodo

experimental, existiendo un ligero aumento, no significativo, en el día 3.

165 Resultados

2.1.2. Peso corporal y de órganos

Evolución ponderal

Figure 14. Body weight evolution in rats fed for 6 days with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E2). Values represent mean ± SEM (n = 8-10 per group). The age of the rats at the beginning of the experimental period was 6-7 weeks.

.

El peso de los animales (Fig. 14) aumenta de forma significativa desde el inicio al final

de la experiencia, siendo el aumento más pronunciado entre los días 0 y 2.

160

180

200

220

240

260

0 2 5

Time (days)

Bo

dy

we

igh

t (g

)

166 Resultados

Peso corporal y de órganos al sacrificio

Table 10. Body and organ weight at sacrifice.

E1 E2 C

BODY WT

(g)

255.50 ± 3.85 a 254.44 ± 1.37 a 267.89 ± 3.94 b

LIVER (g) 7.31 ± 0.39 8.23 ± 0.37 8.35 ± 0.42

COLON (g) 0.98 ± 0.07 0.96 ± 0.04 0.97 ± 0.04

CECUM (g) 0.54 ± 0.02 b 0.61 ± 0.02 a 0.62 ± 0.02 a

SPLEEN (g) 0.55 ± 0.03 0.56 ± 0.02 0.55 ± 0.01

LIVER

(g/100g BW)

2.87 ± 0.14 3.21 ± 0.15 3.19 ± 0.17

COLON

(g/100g BW)

0.39 ± 0.03 0.3 ± 0.02 0.37 ± 0.02

CECUM

(g/100g BW)

0.22 ± 0.01 0.24 ± 0.01 0.24 ± 0.01

SPLEEN

(g/100g BW)

0.22 ± 0.01 0.22 ± 0.01 0.20 ± 0.01

Rats were previously fed for 6 days with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E2). Results are expressed as absolute weight (g) and relative organ weight (g per 100 g of body weight). Values represent mean ± SEM (n = 8-10 per group). Different letters in the same row indicate significant difference (P<0.05) between the groups.

El peso de los animales al sacrificio es significativamente mayor en el grupo control al

compararlo con los otros dos grupos.

Además el peso total del ciego es significativamente menor en el grupo control

respecto a los otros dos grupos. No existen diferencias significativas en el peso de los

demás órganos recogidos.

167 Resultados

2.1.3. Coeficientes de utilización digestiva y nutricional de proteína y grasa

Figure 15. Coefficients of digestive and nutritive utilization of protein and fat in rats fed for 6 days with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E2). Values represent mean ± SEM (n = 8-10 per group). For a given parameter, different letters indicate significant difference (P<0.05) between the groups. Abbreviations: N INT (nitrogen intake), N ABS (nitrogen absorbed), N FECES (fecal nitrogen), N URI (urinary nitrogen), BAL N (nitrogen retention), FAT INT (fat intake), FAT FECES (fecal fat), FAT ABS (fat absorbed), ADC PROT (apparent digestibility coefficient of protein), R/A N (percent nitrogen retention/nitrogen absorption), ADC FAT (apparent digestibility coefficient of fat).

Como puede apreciarse en la Fig. 15, la cantidad nitrógeno ingerido, absorbido y

excretado en heces es significativamente mayor en el grupo E2 respecto a los otros

dos grupos. El nitrógeno urinario en el grupo control es significativamente mayor

(P<0.05) al compararlo con el grupo E1, mostrando el grupo E2 valores intermedios.

Por otro lado, los índices de utilización digestiva (CDA, balance y R/A) no presentan

diferencias significativas al comparar los tres grupos.

N IN

T

N A

BS

N F

ECES

N U

RI

BAL N

0

100

150

300

450 a ab a ab

aab

b

a b a

mg

/d

ADC P

ROT

R/A

N

ADC F

AT

0

60

120

%

FAT IN

T

FAT F

ECES

FAT A

BS

0

25

50

500

1000 a b a

a ab

a b a

mg

/d

E2E1 C

168 Resultados

La ingesta, absorción y excreción de grasa del grupo E2 es significativamente superior

a la encontrada en los grupos control y E1, siendo similar en estos dos últimos. La

digestibilidad de la grasa no presenta diferencias significativas entre los grupos.

2.1.4. Concentración plasmática de hormonas gastrointestinales

40

50

60

70

80

90

-15 0 15 30 60 120

*

a

Time (minutes)

AM

Y (

pg

/ml)

0

100

200

300

-15 0 15 30 60 120

* *

*** *

**

*

*

*

b

Time (minutes)

GIP

(p

g/m

l)

60

70

80

90

100

110

-15 0 15 30 60 120

c

Time (minutes)

GL

P-1

(p

g/m

l)

E1 E2 C

E1 E2 C0

1

2

3

AU

C A

MY

((p

g/m

l)*1

0-3

))

E1 E2 C0

5

10

15

20

aa

b

AU

C G

IP (

(pg

/ml)

*10

-3))

E1 E2 C0

10

20

30

AU

CG

LP

-1 (

(pg

/ml)

*10

-2))

Figure 16. Plasma concentrations of AMY (a), GIP (b) and GLP-1 (c) in rats previosly fed for 6 days with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E2). Results are expressed as time-course changes (left) and as area under the curve (AUC, right) . Values represent mean ± SEM (n = 8-10). Time-course charts: the blue bar indicates the duration of the meal; for a given group, the asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05) compared to basal (-15); for a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: α: C vs E2, β: C vs E1, and ε: E1 vs E2. Bar charts: different letters indicate significant difference (P<0.05) between the groups.

169 Resultados

Las concentraciones plasmáticas basales de AMY son: 54.4±8.36 pg/ml en el grupo E1,

60.39±5.97 pg/ml en el grupo E2 y 59.91±3.75 pg/ml en el grupo control (C), no

existiendo diferencias significativas entre estos valores. Tras la ingesta de alimento

(ver Fig. 16 a), únicamente se observa una elevación significativa de la concentración

con respecto al basal en el grupo E2 a los 120 minutos. En este último tiempo la

concentración plasmática de AMY en el grupo E2 alcanza valores significativamente

superiores (P<0.05) que las del grupo C. No existen diferencias significativas en el AUC

entre ninguno de los grupos.

En el caso del GIP (Fig. 16 b), las concentraciones en ayunas son muy similares en

todos los grupos (22.3±3.76 pg/ml en E1, 21.1±2.8 pg/ml en E2y 27.4±5.56 pg/ml en

C). También en todos ellos se produce una respuesta significativa a la ingestión de

alimento, manteniéndose los valores elevados con respecto al basal (P<0,05) durante

todo el periodo postprandial (con excepción del grupo C, en el que la concentración de

GIP a los 120 min. vuelve a valores similares a los de ayunas). La concentración

postprandial de GIP tiende a ser menor en el grupo C que en los otros dos grupos,

alcanzándose significación estadística a los 30, 60 y 120 min. con respecto al grupo E1,

y únicamente a los 60 min. con respecto al grupo E2. La respuesta integrada,

expresada por el AUC, es similar en E1 y E2, y a su vez significativamente mayor a la

del grupo control.

Las concentraciones basales de GLP-1 son: 72.6±6.15 pg/ml, 80.7±7.62 pg/ml y

83.6±7.19 pg/ml en los grupos E1, E2 y control, respectivamente, sin observarse

diferencias significativas en ningún caso (Fig. 16 c). No hay una respuesta significativa

a la comida en ninguno de los grupos. No obstante, pequeñas variaciones a lo largo del

periodo digestivo hacen que existan diferencias significativas puntuales en el minuto

30 entre los grupos E1 y E2, y en el minuto 120 entre los grupos E2 y C. No aparecen

diferencias entre los grupos en lo que respecta al AUC.

170 Resultados

0

500

1000

1500

2000

2500

-15 0 15 30 60 120

*

**

**

* *

e

Time (minutes)

INS

(p

g/m

l)

0

1000

2000

3000

4000

-15 0 15 30 60 120

* * * *

* ** *

* *

f

Time (minutes)

LE

P (

pg

/ml)

E1 E2 C

0

50

100

150

-15 0 15 30 60 120

* **

**

d

Time (minutes)

GR

N (

pg

/ml)

E1 E2 C0

2

4

6

8

10

AU

C I

NS

((p

g/m

l)*1

0-4

))

E1 E2 C0

5

10

15

AU

C L

EP

((p

g/m

l)*1

0-4

))

E1 E2 C0

1

2

3

4

5

AU

C G

RN

((p

g/m

l)*1

0-3

))

Figure 17. Plasma concentrations of GRN (d), INS (e) and LEP (f) in rats previosly fed for 6 days with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E2). Results are expressed as time-course changes (left) and as area under the curve (AUC, right). Values represent mean ± SEM (n = 8-10). Time-course charts: the blue bar indicates the duration of the meal; for a given group, the asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05) compared to basal (-15); for a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: α: C vs E2, β: C vs E1, and ε: E1 vs E2.

171 Resultados

En condiciones basales, las concentraciones de GRN en plasma no presentan

diferencias significativas entre los grupos, siendo los valores: 112.04±15,75pg/ml en el

grupo E1, 100.55±11.53pg/ml en el grupo E2 y 84.02±14.31pg/ml en el grupo C. Tras la

ingesta de alimento, dichas concentraciones disminuyen significativamente (P<0.05)

en el grupo E1 a los 15 minutos y en los otros dos (E2 y C) en el minuto 30, momento

en el que se alcanzan los valores mínimos para todos ellos (Fig. 17 d). Al final del

periodo postprandial se vuelven a recuperar los valores basales en todos los grupos.

No se aprecian diferencias significativas entre grupos en relación al AUC.

La concentración de INS en ayunas es de 703±138 pg/ml en el grupo E1, 672±117

pg/ml en el grupo E2, y 1165±124 pg/ml en el grupo C, siendo este último valor (como

se observa en la Fig. 17 e) significativamente mayor que el obtenido en los grupos E1 y

E2. Existe una clara respuesta a la ingestión de las dietas experimentales, de forma

que las concentraciones plasmáticas de la hormona se muestran significativamente

mayores que las de ayunas en los minutos 15 y 30 en el grupo C, en los minutos 15 y

120 en el grupo E1 y en los minutos 30, 60 y 120 en el caso del E2. La concentración de

INS en el grupo control vuelve a valores estadísticamente similares a los basales al final

del periodo postprandial, no así en el caso de los grupos E1 y E2, en los que se

mantienen elevadas (P<0,05). Las AUC no muestran diferencias entre los grupos de

estudio.

En condiciones basales (tiempo -15 min.), la concentración circulante de LEP en el

grupo E2 (977±97 pg/ml) es significativamente menor que la de E1 (1465±136 pg/ml) y

control (2002±225 pg/ml). En los grupos E1 y E2, la ingestión de alimento se asocia a

aumentos significativos de la LEP plasmática (en comparación con el basal) que se

ponen de manifiesto ya a los 15 min., manteniéndose los valores elevados durante

todo el periodo postprandial (Fig. 17 f). Por el contrario, en el grupo control solo hay

diferencias significativas respecto al basal en los minutos 60 y 120. La comparación

entre grupos a los distintos tiempos del periodo postprandial revela la existencia de

diferencias significativas entre los grupos E1 y E2 en el minuto 30, y entre los grupos

E2 y C en el minuto 60. La secreción total de LEP en respuesta al alimento,

representada por el área bajo la curva, es similar en todos los grupos.

172 Resultados

E1 E2 C

10

15

20

25

30

-15 0 15 30 60 120

**

g

Time (minutes)

PP

(p

g/m

l)

25

30

35

40

45

50

-15 0 15 30 60 120

*

h

Time (minutes)

PY

Y (

pg

/ml)

E1 E2 C0

2

4

6

8

10

ab

a

b

AU

C P

P (

(pg

/ml)

*10

-2))

E1 E2 C0

5

10

15

20

AU

C P

YY

((p

g/m

l)*1

0-2

))

Figure 18. Plasma concentrations of PP (g) and PYY (h) in rats previosly fed for 6 days with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E2). Results are expressed as time-course changes (left) and as area under the curve (AUC, right). Values represent mean ± SEM (n = 8-10). Time-course charts: the blue bar indicates the duration of the meal; for a given group, the asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05) compared to basal (-15); for a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: α: C vs E2, β: C vs E1, and ε: E1 vs E2. Bar charts: different letters indicate significant difference (P<0.05) between the groups.

En condiciones de ayunas, las concentraciones de PP en plasma son semejantes en los

tres grupos de animales, con valores de 16.05±1.83 pg/ml en el grupo E1, 16.84±3.15

pg/ml en el grupo E2, y 19.64±2.07 pg/ml en el grupo control. Como puede verse en la

Fig. 18 g, no existe en ningún caso una respuesta clara a la ingestión de alimento,

siendo los valores de PP plasmático al final del periodo postprandiales similar a los

173 Resultados

basales en todos los grupos. Tampoco se aprecian en los distintos tiempos del periodo

digestivo diferencias significativas en las concentraciones de la hormona entre los

diferentes grupos. A pesar de ello, el AUC en el grupo E2 es mayor (P<0,05) que en el

grupo C, mostrando el grupo E1 valores intermedios.

No existen diferencias significativas en la concentración basal del PYY al comparar los

tres grupos estudiados (E1: 38.10±5.51 pg/ml; E2: 34.04±2.80 pg/ml; C: 35.68±2.21

pg/ml), ni existe una respuesta marcada a la comida en ninguno de ellos (Fig. 18 h). No

obstante, pequeños cambios en la evolución temporal de las concentraciones

plasmáticas de este péptido en los distintos grupos, hacen que en el minuto 60 los

valores del grupo C sean significativamente inferiores a los de los grupos E1 y E2. No

hay diferencias en ningún caso para el AUC, aunque tiende a ser menor (sin alcanzarse

significación estadística) en el grupo control.

174 Resultados

2.2. LARGO PLAZO

2.2.1. Ingesta

Figure 19. Weekly intake of food (a) and energy (b) in rats fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E2). Values represent mean ± SEM (n = 8-10). For a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: α: C vs E2, β: C vs E1, and ε: E1 vs E2. The age of the rats at the beginning of the experimental period was 6-7 weeks.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

15

20

25

30

a

Time (weeks)

To

tal in

tak

e (

g/d

)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

50

60

70

80

90

100

b

Time (weeks)

To

tal in

tak

e (

kc

al/d

)

E1 E2 C

175 Resultados

Como muestra la Fig. 19, el grupo E1 ingiere una cantidad mayor de alimento y energía

que el grupo E2, y ambos a su vez mayor que el grupo control, de forma sostenida

desde la semana 3 a la 7. En la primera semana del periodo experimental no hay

diferencias significativas entre los grupos, y en las semanas 2, 8, 9 y 10 sigue

manteniéndose la diferencia entre los grupos E1 y C.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

10

12

14

16

18

20

c

Time (weeks)

To

tal c

ho

(g

/d)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

d

Time (weeks)

Fa

t in

tak

e (

g/d

)

E1 E2 C

Figure 20. Weekly intake of total carbohydrates (c) and fat (d) in rats fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E2). Values represent mean ± SEM (n = 8-10). For a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: α: C vs E2, β: C vs E1, and ε: E1 vs E2. Abbreviations: CHO (carbohydrates). The age of the rats at the beginning of the experimental period was 6-7 weeks.

176 Resultados

La ingesta de HDC (Fig. 20 c) es significativamente mayor en el grupo E1 comparado

con el grupo E2 y a su vez ambas superiores a los valores observados en el grupo

control desde la semana 2 a la 5. En la semana 6 y 7 se observan diferencias

significativas entre los dos grupos experimentales (E1 y E2) y el control, así como en la

semana 8 y 9 las diferencias significativas se presentan entre E1 y los otros dos grupos.

La ingesta de grasa en los dos grupos experimentales es significativamente superior a

la del grupo control en todas las semanas del periodo experimental (Fig. 20 d). Existen

únicamente diferencias puntuales significativas entre los grupos experimentales E1 y

E2 en las semanas 2 y 6.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

e

Time (weeks)

Pro

tein

in

tak

e (

g/d

)

E1 E2 C

Figure 21. Weekly intake of protein (e) in rats fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E2). Values represent mean ± SEM (n = 8-10). For a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: α: C vs E2, β: C vs E1, and ε: E1 vs E2. The age of the rats at the beginning of the experimental period was 6-7 weeks.

La ingesta de proteína es mayor (P<0.05) en el grupo E1 respecto al grupo E2 y a su vez

ambos superiores respecto al control desde la semana 3 a la 9, igualándose los valores

de los grupos experimentales (E1 y E2) a la vez que se mantienen las diferencias con el

grupo control en las semanas 1 y 10 (Fig. 21).

177 Resultados

Desde el inicio del periodo experimental y en todos los parámetros de ingesta (Fig. 19-

21), el grupo control experimenta una ligera subida hasta la mitad del mismo para

luego caer, recuperarse y volver a descender las últimas dos semanas aunque de

forma más moderada. Los patrones de ingesta en los grupos E1 y E2 son similares, con

un ascenso continuo hasta la semana 6, en que se inicia un descenso progresivo hasta

que en la última semana los valores se acercan ligeramente a los de partida.

2.2.2. Peso corporal

Evolución ponderal

El BW inicial de los animales es de 194±0.7 g en el grupo E1, 193±0.7 g en el grupo E2 y

191±3.5 g en el grupo control, siendo la evolución ponderal ascendente y pronunciada

hasta la semana 4, a partir de la cual dicho incremento es más amortiguado (Fig. 22).

Los animales del grupo E1 muestran, a partir de la semana 4, un mayor BW que los de

los otros grupos. En comparación con el grupo C, las diferencias alcanzan significación

estadística en las semanas 4 a 7, y además en la semana 9. Por su parte, en relación al

grupo E2, las diferencias significativas (P<0.05) se observan desde la semana 4 hasta la

10.

178 Resultados

Figure 22. Body weight evolution in rats fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E2). Values represent mean ± SEM (n = 8-10 per group). For a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: α: C vs E2, β: C vs E1, and ε: E1 vs E2. The age of the rats at the beginning of the experimental period was 6-7 weeks.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

100

200

300

400

500

E1 E2 C

Time (weeks)

Bo

dy w

eig

ht

(g)

179 Resultados

Peso corporal y de órganos al sacrificio

Table 11. Body and organ weight at sacrifice.

E1 E2 C

BODY WT

(g)

402.89 ± 6.58 a 366.56 ± 8.88 b 383.44 ± 8.80 ab

LIVER (g) 7.95 ± 0.20 7.59 ± 0.29 7.45 ± 0.26

COLON (g) 0.91 ± 0.03 a 1.14 ± 0.09 ab 1.21 ± 0.03 b

CECUM (g) 0.61 ± 0.02 0.57 ± 0.03 0.57 ± 0.02

SPLEEN (g) 0.67 ± 0.01 0.62 ± 0.04 0.67 ± 0.04

BRAIN (g) 2.02 ± 0.02 a 1.90 ± 0.03 b 1.93 ± 0.02 b

LIVER (g/100 g BW)

2.04 ± 0.04 2.02 ± 0.03 1.94 ± 0.05

COLON

(g/100 g BW)

0.24 ± 0.01 a 0.32 ± 0.02 b 0.31 ± 0.01 b

CECUM

(g/100 g BW)

0.15 ± 0.01 0.16 ± 0.01 0.15 ± 0.01

SPLEEN

(g/100 g BW)

0.17 ± 0.01 0.16 ± 0.01 0.18 ± 0.01

BRAIN

(g/100 g BW)

0.50 ± 0.01 0.51 ± 0.01 0.49 ± 0.01

Rats were previously fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E2). Results are expressed as absolute weight (g) and relative organ weight (g per 100 g of body weight). Values represent mean ± SEM (n = 8-10 per group). Different letters in the same row indicate significant difference (P<0.05) between the groups.

180 Resultados

Tal y como se puede apreciar en la Tabla 11, el peso del colon, expresado como valor

absoluto, es mayor (P<0.05) en el grupo control que en el E1, mostrando el grupo E2

valores intermedios. Tras expresarlo como peso relativo al BW se igualan los valores

de los grupos E2 y control, haciéndose significativamente mayores respecto al grupo

E1.

El peso del encéfalo, también expresado en términos absolutos, es significativamente

mayor en el grupo E1 que en los otros dos, desapareciendo estas diferencias al

expresarlo en términos relativos al BW.

2.2.3. Coeficientes de utilización digestiva y nutricional de proteína y grasa

Figure 23. Coefficients of digestive and nutritive utilization of protein and fat in rats fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E2). Values represent mean ± SEM (n = 8-10 per group). For a given parameter, different letters indicate significant difference (P<0.05) between the groups. Abbreviations: N INT (nitrogen intake), N ABS (nitrogen absorbed), N FECES (fecal nitrogen), N URI (urinary nitrogen), BAL N (nitrogen retention), FAT INT (fat intake), FAT FECES (fecal fat), FAT ABS (fat absorbed), ADC PROT (apparent digestibility coefficient of protein), R/A N (percent nitrogen retention/nitrogen absorption), ADC FAT (apparent digestibility coefficient of fat).

N IN

T

N A

BS

N F

ECES

N U

RI

BAL N

0

20

40

60

250

500 a b c a b c

ba a

a cb

mg

/d

ADC P

ROT

R/A

N

ADC F

AT

0

60

120a b b

aba b

aba b

%

FAT IN

T

FAT F

ECES

FAT A

BS

0

100

600

750

900

a ab b

a b c a b c

mg

/d

E2E1 C

181 Resultados

Los valores de ingesta, absorción y excreción fecal de nitrógeno (Fig. 23) difieren de

forma significativa entre los tres grupos, siendo superiores en el grupo E2, intermedios

en el grupo E1 e inferiores en el grupo C. El contenido de nitrógeno urinario es similar

en los dos grupos experimentales (E1 y E2) y a su vez significativamente superiores al

valor obtenido en el grupo control.

La digestibilidad de la proteína es inferior en el grupo E1 de forma significativa

respecto a los otros dos grupos. El balance de nitrógeno no varía en ningún caso y el

nitrógeno R/A en el grupo control es significativamente superior al del grupo E2,

situándose el grupo E1 en valores similares a ambos.

Los valores de ingesta y absorción de grasa difieren de forma marcada y significativa

de acuerdo con este orden: E2>E1>C. La grasa en heces es mayor (P<0.05) en el grupo

E1 respecto al control e intermedia en el E2.

La digestibilidad de grasa (Fig. 23) es superior en el grupo E2 de forma significativa al

grupo E1, situándose entre ambos los valores del grupo C.

182 Resultados

2.2.4. Concentración plasmática de hormonas gastrointestinales

0

50

100

150

-15 0 15 30 60 120

* **

a

Time (minutes)

AM

Y (

pg

/ml)

0

100

200

300

400

-15 0 15 30 60 120

* * *

*

**

*

c

Time (minutes)

GIP

(p

g/m

l)

0

100

200

300

-15 0 15 30 60 120

*

* **

b

Time (minutes)

CC

K (

pg

/ml)

E1 E2 C

E1 E2 C0

1

2

3

AU

C A

MY

((p

g/m

l)*1

0-3

))

E1 E2 C0

5

10

15

20

25

a

a

b

AU

C G

IP (

(pg

/ml)

*10

-3))

E1 E2 C0

2

4

6

8

10

a

b

b

AU

C C

CK

((p

g/m

l)*1

0-3

))

Figure 24. Plasma concentrations of AMY (a), CCK (b) and GIP (c) in rats previosly fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E2). Results are expressed as time-course changes (left) and as area under the curve (AUC, right) . Values represent mean ± SEM (n = 8-10). Time-course charts: the blue bar indicates the duration of the meal; for a given group, the asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05) compared to basal (-15); for a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: α: C vs E2, β: C vs E1, and ε: E1 vs E2. Bar charts: different letters indicate significant difference (P<0.05) between the groups.

183 Resultados

Las Figuras 24-26 muestran los cambios en la concentración de péptidos

gastrointestinales y otras hormonas en ayunas y en respuesta a la comida en ratas

previamente alimentadas durante 10 semanas con las dietas control, E1 y E2. Las

concentraciones plasmáticas basales de AMY son: 79.7±5 en el grupo E1, 63.9±5.1 en

el grupo E2 y 87.7±12.2 en el grupo C, no existiendo en este momento (t= -15 min.)

diferencias significativas entre los diferentes grupos. Como se ve en la Fig. 24 a, sólo se

observa una respuesta significativa a la comida en el grupo control. Al final del

experimento, la concentración de AMY en todos los grupos vuelve a valores similares a

los de ayunas. Durante el periodo postprandial, las mayores concentraciones de AMY

se dan en el grupo C, alcanzándose significación estadística en comparación con el

grupo E2 a los tiempos 15, 30 y 60 min. En el tiempo 15 min. también los valores de E1

son mayores (P<0.05) que los de E2. Respecto al AUC, no existen diferencias

significativas entre grupos.

En lo que respecta la CCK (Fig. 24 b), la concentración plasmática en condiciones

basales es significativamente menor en el grupo control (75±13 pg/ml) en relación a

los grupos experimentales (158±22 pg/ml en el grupo E1 y 147±21 pg/ml en el grupo

E2). Se aprecia una respuesta significativa a la ingestión de alimento tanto en el grupo

control como en el E2, aunque en el primer caso (grupo C) los valores se mantienen

significativamente elevados frente al valor de ayunas hasta el final del periodo

postprandial, mientras que en el grupo E2 el aumento es transitorio, solo significativo

con respecto al basal en el tiempo 15 min, y volviendo a continuación a valores

cercanos a los basales. Existen diferencias significativas entre el grupo E2 y control

(con mayores valores en el primero) en los minutos 15, 30 y 60 del periodo

postprandial. La secreción total de CCK en respuesta al alimento, expresada como

AUC, es significativamente mayor en los grupos control y E2 que en el grupo E1.

La concentración basal de GIP es superior (P<0.05) en el grupo control (39±5.1 pg/ml)

que en el grupo E2 (20.4±2.8 pg/ml), mostrando valores intermedios en el grupo E1

(21.3±3.1 pg/ml). La ingestión de alimento produce un aumento significativo en los

grupos control y E1, alcanzándose en el primero concentraciones plasmáticas más de

tres veces superiores respecto al basal (Fig. 24 c). El rápido y pronunciado aumento

postprandial en este grupo hace, además, que se alcancen valores de GIP en plasma

184 Resultados

muy superiores a los de los grupos experimentales E1 y E2, aunque al final del

experimento se retorna a valores próximos a los basales, lo que sin embargo no ocurre

en el grupo E1, en el que la concentración de GIP se mantiene todavía a los 120 min.

significativamente elevada en comparación con el valor basal. La secreción total de GIP

(AUC) en el grupo control es marcada y significativamente mayor que la de los grupos

experimentales (E1 y E2), y semejante en estos dos últimos.

185 Resultados

0

50

100

150

200

250

-15 0 15 30 60 120

e

Time (minutes)

GR

N (

pg

/ml)

0

1000

2000

3000

-15 0 15 30 60 120

**

**

*

*

*

*

f

*

Time (minutes)

IN

S (

pg

/ml)

0

50

100

150

-15 0 15 30 60 120

*

d

Time (minutes)

GL

P-1

(p

g/m

l)

E1 E2 C

E1 E2 C0

5

10

15

AU

CG

LP

-1 (

(pg

/ml)

*10

-2))

E1 E2 C0

2

4

6

8

AU

CG

RN

((p

g/m

l)*1

0-2

))

E1 E2 C0

5

10

15

ab

a

b

AU

C I

NS

((p

g/m

l)*1

0-4

))

Figure 25. Plasma concentrations of GLP-1 (d), GRN (e) and INS (f) in rats previosly fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E2). Results are expressed as time-course changes (left) and as area under the curve (AUC, right) . Values represent mean ± SEM (n = 8-10). Time-course charts: the blue bar indicates the duration of the meal; for a given group, the asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05) compared to basal (-15); for a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: α: C vs E2, β: C vs E1, and ε: E1 vs E2. Bar charts: different letters indicate significant difference (P<0.05) between the groups.

186 Resultados

En ayunas, la concentración de GLP-1 en plasma es muy superior (P<0.05) en el grupo

E1 (101.6±8.6 pg/ml) respecto a los otros dos grupos (71.7±4.1 pg/ml en E2 y 63.6±5.9

pg/ml en C). No se observa una clara respuesta a la comida en ninguno de los grupos

de estudio y prácticamente se mantienen los valores de concentración constantes

hasta el final del periodo postprandial (Fig. 25 d). La concentración de GLP-1 en el

grupo E1 se mantiene en valores significativamente mayores que en los otros dos

grupos a lo largo del experimento. Además, a partir del 60 min. y hasta el final (120

min.), también la concentración de GLP-1 en el grupo E2 alcanza valores

significativamente mayores que los del grupo control. No se aprecian diferencias

significativas en el área bajo la curva en ningún caso.

Como puede advertirse en la Fig 25 e, las concentraciones basales de GRN son

significativamente superiores en los grupos E1 (171.3±25.3 pg/ml) y E2

(148.9±13.3pg/ml) respecto al control (79.5±16 pg/ml). La ingestión de las

correspondientes dietas no causa cambios significativos en la GRN plasmática en

ningún grupo, siendo en todos ellos las concentraciones finales (120 min.) son

similares a las basales. La secreción total, estimada mediante el cálculo del AUC, es

comparable en los tres grupos.

Las concentraciones basales de INS son semejantes en todos los grupos (1008±131

pg/ml (E1), 798±88 pg/ml (E2) y 1047±152 pg/ml (C)). Tras la ingestión de alimento, en

todos los grupos se producen ya a los 15 min. aumentos significativos en la

concentración de INS en plasma (Fig. 25 f). Sin embargo, en los grupos control y E1 los

valores se mantienen elevados (P<0.05) con respecto a los basales hasta el final del

periodo postprandial, en tanto que en el grupo E2, aunque tienden a mantenerse

elevados, se pierde la significación estadística a partir del min. 30. El gráfico de AUC

para el GLP-1 muestra valores mayores (P<0.05) en el grupo control respecto al grupo

E2, situándose entre ellos los del grupo E1.

187 Resultados

0

30

60

90

-15 0 15 30 60 120

i

Time (minutes)

PY

Y (

pg

/ml)

0

3500

7000

10500

14000

-15 0 15 30 60 120

*

g

Time (minutes)

LE

P (

pg

/ml)

0

20

40

60

-15 0 15 30 60 120

h

Time (minutes)

PP

(p

g/m

l)

E1 E2 C0

10

20

30

40

AU

C L

EP

((p

g/m

l)*1

0-4

))

E1 E2 C0

1

2

3

4

5

AU

C P

P (

(pg

/ml)

*10

-2))

E1 E2 C0

2

4

6

8

10

AU

C P

YY

((p

g/m

l)*1

0-2

))

E1 E2 C

Figure 26. Plasma concentrations of LEP (g), PP (h) and PYY (i) in rats previosly fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E2). Results are expressed as time-course changes (left) and as area under the curve (AUC, right) . Values represent mean ± SEM (n = 8-10). Time-course charts: the blue bar indicates the duration of the meal; for a given group, the asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05) compared to basal (-15); for a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: α: C vs E2, β: C vs E1, and ε: E1 vs E2.

188 Resultados

En ayunas, la concentración plasmática de LEP es similar en todos los grupos:

4186±641pg/ml en el grupo E1, 3834±455 pg/ml en el grupo E2 y 5635±714 pg/ml en

el grupo control. No se observan aumentos significativos tras la ingestión de alimento

en ninguno de los casos (Fig. 26 g), aunque los valores del grupo control (C)

experimentan a partir del min. 30 una tendencia a elevarse de manera progresiva,

haciéndose finalmente significativos con respecto al valor basal a los 120 min. Debido

a este comportamiento, la comparación de los 3 grupos de estudio a los distintos

tiempos pone de manifiesto la existencia de diferencias significativas (P<0.05) entre el

grupo control (mayores) en relación a los dos grupos experimentales (E1 y E2). Las

AUC son, no obstante, similares en los tres grupos.

Las concentraciones circulantes de PP en condiciones basales (ayunas) son de 27.6±2

pg/ml (grupo E2), 37±3.2 pg/ml (grupo control), y 33±2 pg/ml (grupo E1), con

significación estadística entre los grupos C y E2 (Fig. 26 h). No hay una clara respuesta

postprandial en ningunos de los grupos, a pesar de lo cual los valores de concentración

en grupo control son significativamente mayores que los de los grupos E1 y E2 desde

el min. 15 hasta el 60. El área bajo la curva (AUC) para el PP es similar en todos los

grupos.

En cuanto al péptido tirosina tirosina (PYY), los resultados de nuestro estudio (Fig. 26 i)

muestran concentraciones basales del orden de 55.4±2.6 pg/ml en el grupo E1,

42.5±2.5 pg/ml en el grupo E2, y 49.6±3.1 pg/ml en el grupo C, siendo los valores

medios de los grupos E1 y E2 significativamente diferentes entre sí. No hay cambios

tras la ingestión de alimento en ninguno de los grupos. No obstante, la concentración

de PYY en plasma alcanza en el grupo E1 valores superiores (P<0.05) a los observados

en los grupos E2 y C a lo largo de todo el periodo postprandial. La secreción total

(AUC) no difiere significativamente entre ninguno de los grupos.

189 Resultados

3. EXPERIMENTO EN RATAS OBESAS

3.1. PERIODO DE INDUCCIÓN DE OBESIDAD POR LA DIETA

3.1.1. Ingesta

Figure 27. Weekly intake of food (a), energy (b), total carbohydrates (c), fat (d) and protein (e) in rats fed for 9 weeks with the DIO diet (D12492, Research Diets®). Values represent mean ± SEM (n = 28-30). Abbreviations: CHO (carbohydrates), DIO (diet-induced obesity). The age of the rats at the beginning of the obesity induction period was 6-7 weeks.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

14

16

18

20

22

24

a

Time (weeks)

To

tal in

tak

e (

g/d

)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

60

80

100

120

140

b

Time (weeks)T

ota

l in

tak

e (

Kc

al/d

)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

4

5

6

7

8

9

Fa

t in

tak

e (

g/d

)

d

Time (weeks)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

5

6

7

8

9

10

c

Time (weeks)

To

tal c

ho

in

tak

e (

g/d

)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

2

3

4

5

d

Time (weeks)

Pro

tein

in

tak

e (

g/d

)

190 Resultados

Durante el periodo de inducción de obesidad, la ingesta de alimento y de energía, que

parte inicialmente de valores en torno a 22 g/d y 122 kcal/d, respectivamente,

experimenta una disminución progresiva hasta llegar a un mínimo en la semana 7 (con

valores medios de 14.9 g/d y 82 kcal/d), para volver a continuación a aumentar

ligeramente durante las 3 últimas semanas (Fig. 27 a y b).

La ingesta inicial de HDC, grasa y proteína (Fig. 27 c-e) se sitúa en unos valores medios

de 8.9, 7.7 y 4.8 g/d, respectivamente, y su evolución temporal presenta un patrón

similar al de la ingesta de alimento y de energía (antes descrito), con un mínimo en la

semana 7 donde se alcanzan valores medios de 6, 5.5 y 3.2 g/d, respectivamente.

3.1.2. Evolución ponderal

El peso de los animales al inicio del periodo de inducción es de 184±1.2 g, aumentando

de forma acusada la primera semana para después ir disminuyendo el incremento

ponderal de forma paulatina hasta prácticamente estabilizarse en la última semana en

un valor de 441±10 g (Fig. 28).

Figure 28. Body weight evolution in rats fed for 9 weeks with the DIO diet (D12492, Research Diets®). Values represent mean ± SEM (n = 28-30 per group). Abbreviations: DIO (diet-induced obesity). The age of the rats at the beginning of the obesity induction period was 6-7 weeks.

0

100

200

300

400

500

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Time (weeks)

Bo

dy w

eig

ht

(g)

191 Resultados

3.2. PERIODO EXPERIMENTAL

3.2.1. Ingesta

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

14

16

18

20

22

24

a

To

tal in

tak

e (

g/d

)

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

50

60

70

80

b

Time (weeks)

To

tal in

tak

e (

kc

al/d

)

CE1 E3

Figure 29. Weekly intake of food (a) and energy (b) in DIO rats subsequently fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E3). Values represent mean ± SEM (n = 8-10). For a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: α: C vs E3, β: C vs E1, and ε: E1 vs E3. Abbreviations: DIO (diet-induced obesity).The age of the rats at the beginning of the experimental period was 16 weeks.

192 Resultados

Tal y como se aprecia en la Fig. 29, la ingesta de alimento (Fig. 29 a) y de energía (Fig.

29 b) tras la asignación de las ratas obesas a los distintos grupos experimentales (C, E1

y E3) muestra valores semejantes a los alcanzados en la última semana de inducción

de obesidad, estando alrededor de 16 g y 55 kcal, respectivamente, y sin existir

diferencias significativas entre grupos. En las dos semanas siguientes se observa un

aumento muy acusado (25%), para posteriormente estabilizarse en torno a 20 g y 70

kcal hasta el final del periodo experimental. Cabe destacar en el grupo control la

existencia de una ligera disminución entre las semanas 17 a 19 para volver de nuevo a

alcanzar, en la última semana, los valores mencionados anteriormente. Este

comportamiento en el grupo C lleva a que aparezcan, en ambos parámetros,

diferencias significativas con respecto a los dos grupos experimentales (E1 y E3) en las

semanas 17 a 19.

193 Resultados

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

10

12

14

16

c

To

tal c

ho

(g

/d)

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

d

Fa

t (g

/d)

CE1 E3

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

1.5

2.0

2.5

3.0

e

Time (weeks)

Pro

tein

(g

/d)

Figure 30. Weekly intake of total carbohydrates (c), fat (d) and protein (e) in DIO rats subsequently fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E3). Values represent mean ± SEM (n = 8-10). For a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: α: C vs E3, β: C vs E1, and ε: E1 vs E3. Abbreviations: DIO (diet-induced obesity. The age of the rats at the beginning of the experimental period was 16 weeks.

194 Resultados

La ingesta de HDC, al igual que la de alimento y la de energía, experimenta en los tres

grupos experimentales un aumento del 25% durante las dos primeras semanas para

posteriormente estabilizarse en valores medios cercanos a 13-14 g hasta la semana

final del experimento (Fig. 30 c). En este caso sólo existe una diferencia puntual

(P<0.05) en la semana 18 entre los grupos E3 y control, con mayores valores en el

primero, no existiendo diferencias significativas en ningún otro momento entre los

grupos de estudio.

La evolución temporal de la ingesta de grasa (Fig. 30 d) sigue de nuevo la misma pauta

que lo descrito para los HDC. En este caso los valores alcanzados por el grupo E3 son

significativamente superiores a los del grupo control a lo largo de todo el experimento

(excepto en la semana 14) y superiores (P<0.05) a los del grupo E1 en las semanas 11-

13, 18 y 19. Por su parte, el propio grupo E1 muestra valores de ingesta de grasa

mayores (P<0.05) que el grupo control (C) en las semanas 10, 13, y 15-19.

Con la ingesta de proteína ocurre lo mismo (Fig. 30 e), aunque en este caso los grupos

E1 y E2 muestran valores muy semejantes entre sí, y a su vez mayores (P<0.05) que los

del grupo control durante la mayor parte del periodo experimental.

3.2.2. Peso corporal y de órganos

Evolución ponderal

Al comenzar a alimentar a los animales con las diferentes dietas experimentales se

produce un pequeño descenso inicialen el BW (Fig. 31), el cual da paso a un ligero

aumento hasta la semana 14 para volver a disminuir en la semana 15. A partir de este

momento el BW aumenta hasta que se estabiliza en la última semana. En general, los

mayores valores de BW se dan en el grupo E1, aunque la diferencia solo alcanza

significación estadística al comparar con el grupo E3 y únicamente durante la primera

mitad del periodo experimental (semanas 10-14), ya que posteriormente los valores

medios de todos los grupos se hacen comparables..

195 Resultados

Figure 31. Body weight evolution in DIO rats subsequently fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E3). Values represent mean ± SEM (n = 8-10 per group). For a given time point, the symbol ε indicates a significant difference (P<0.05) between E1 and E3. Abbreviations: DIO (diet-induced obesity). The age of the rats at the beginning of the experimental period was 16 weeks.

350

400

450

500

550

E1 E3 C

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Time (weeks)

Bo

dy w

eig

ht

(g)

196 Resultados

Peso corporal y de órganos al sacrificio

Table 12. Body and organ weight at sacrifice.

E1 E3 C

BODY WT (g) 477.7 ± 8.9 448.8 ± 13.9 471.9 ± 6.02

LIVER (g) 10.34 ± 0.49 10.24 ± 0.37 9.57 ± 0.13

COLON (g) 1.55 ± 0.05 a 1.05 ± 0.07 b 1.60 ± 0.10 a

CECUM (g) 1.09 ± 0.10 a 1.16 ± 0.11 a 0.71 ± 0.03 b

SPLEEN (g) 0.86 ± 0.09 a 0.74 ± 0.04 ab 0.67 ± 0.03 b

KIDNEY (g) 2.30 ± 0.06 2.28 ± 0.07 2.27 ± 0.06

GASTROCN.

(g)

4.67 ± 0.16 ab 4.93 ± 0.15 a 4.31 ± 0.20 b

HEART (g) 1.19 ± 0.03 a 1.14 ± 0.02 ab 1.09 ± 0.02 b

SUB FAT (g) 5.93 ± 0.50 6.24 ± 0.85 7.34 ± 0.69

EPI FAT (g) 18.54 ± 0.98 a 15.30 ± 0.92 b 17.22 ± 0.79 ab

ABD FAT (g) 17.51 ± 1.33 15.48 ± 1.38 18.49 ± 1.26

BRAIN (g) 2.08 ± 0.04 a 1.96 ± 0.03 b 2.02 ± 0.03 ab

DIO rats were subsequently fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E3). Results are expressed as absolute weight (g). Values represent mean ± SEM (n = 8-10 per group). Different letters in the same row indicate significant difference (P<0.05) between the groups. Abbreviations: DIO (diet-induced obesity), GASTROCN. (gastrocnemius), SUB FAT (subcutaneous fat) fat,EPI FAT(epididymal fat) ABD FAT (abdominal fat).

197 Resultados

Table 13. Relative organ weight at sacrifice.

E1 E3 C

LIVER (g/100 g

BW)

2.22 ± 0.06 a 2.18 ± 0.06 ab 2.04 ± 0.03 b

COLON (g/100 g

BW)

0.34 ± 0.01 a 0.23 ± 0.02 b 0.35 ± 0.02 a

CECUM (g/100 g

BW)

0.24 ± 0.02 a 0.24 ± 0.02 a 0.16 ± 0.01 b

SPLEEN (g/100 g

BW)

0.19 ± 0.04 0.16 ± 0.01 0.14 ± 0.01

KIDNEY (g/100 g

BW)

0.49 ± 0.01 0.52 ± 0.01 0.50 ± 0.01

GASTROCN.

(g/100 g BW)

1.03 ± 0.03 a 1.08 ± 0.04 a 0.94 ± 0.03 b

HEARTH (g/100 g

BW)

0.25 ± 0.01 0.24 ± 0.01 0.23 ± 0.01

SUB FAT (g/100 g

BW)

1.29 ± 0.09 1.32 ± 0.14 1.60 ± 0.17

EPI FAT (g/100 g

BW)

4.02 ± 0.23 3.51 ± 0.17 3.71 ± 0.14

ABD FAT (g/100

g BW)

4.02 ± 0.31 3.40 ± 0.25 3.98 ± 0.21

BRAIN (g/100 g

BW)

0.44 ± 0.01 0.43 ± 0.02 0.45 ± 0.01

DIO rats were subsequently fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E3). Results are expressed as relative organ weight (g per 100 g of body weight). Values represent mean ± SEM (n = 8-10 per group). Different letters in the same row indicate significant difference (P<0.05) between the groups. Abbreviations: DIO (diet-induced obesity), GASTROCN. (gastrocnemius),SUB FAT (subcutaneous fat), EPI FAT (epididymal fat) and ABD FAT (abdominal fat).

198 Resultados

El grupo control presenta un peso del ciego, tanto absoluto como relativo,

significativamente menor comparado con los grupos experimentales (E1 y E3).

El peso del gastrocnemio en valor absoluto (Tabla 12) es significativamente menor en

el grupo control que en el E3, y ambos a su vez iguales al grupo E1. Al expresarlo

relativo al BW (Tabla 13), el valor es menor en el grupo control respecto a E1 y E3.

En cuanto a bazo y corazón, el peso absoluto es mayor (P<0.05) en el grupo E1 en

comparación con el grupo C, situándose entre ambos el grupo E3. Las diferencias

desaparecen al expresar el peso en términos relativos.

No hay diferencias en el peso absoluto del hígado entre los 3 grupos del estudio. Sin

embargo, el peso del órgano relativo a 100 g de animal es significativamente menor en

el grupo control que en el E1, mostrando el grupo E3 valores intermedios.

La cantidad total de grasa epididimal y el peso del encéfalo son menores (P<0.05) en el

grupo E3 con respecto al grupo E1, y ambos a su vez similares al control (Tabla 12). Al

expresar este parámetro como peso relativo los valores obtenidos son similares en

todos los grupos (Tabla 13).

El peso del colon, tanto absoluto como relativo, es significativamente menor en el

grupo E3 respecto a los otros dos grupos.

199 Resultados

3.2.3. Coeficientes de utilización digestiva y nutricional de proteína y grasa

N IN

T

N A

BS

N F

ECES

N U

RI

BAL N

0

40

80

200

300

400ab

a b

a a b

aba b ab

a b

mg

/d

ADC P

ROT

R/A

N

ADC F

AT

0

60

120 aba b ba c

%

FAT IN

T

FAT A

BS

FAT F

ECES

0

50

100

400

800 ba a ba a

aa b

mg

/d

E1 E3 C

Figure 32. Coefficients of digestive and nutritive utilization of protein and fat in DIO rats subsequently fed for 5 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E3). Values represent mean ± SEM (n = 8-10 per group). For a given parameter, different letters indicate significant difference (P<0.05) between the groups Abbreviations: N INT (total nitrogen intake), N ABS (nitrogen absorbed), N FECES (fecal nitrogen), N URI(urinary nitrogen), BAL N (nitrogen retention), FAT INT (total fat intake), FAT ABS (fat absorbed), FAT FECES(fecal fat), ADC PROT (apparent digestibility coefficient of protein), R/A N (percent nitrogen retention/nitrogen absorption), ADC FAT (apparent digestibility coefficient of fat).

Tal y como se puede apreciar en la Fig. 32, la ingesta, absorción y balance de nitrógeno

es significativamente mayor en el grupo E3 en comparación con el grupo control,

mostrando el grupo E1 valores intermedios. En lo que se refiere al nitrógeno en heces,

los valores de los grupos experimentales (E1 y E3) son similares entre ellos y

superiores (P<0.05) al control. La digestibilidad de proteína en el grupo control (C) es

mayor (P<0.05) que en el grupo E1 y ambos a su vez semejantes al grupo E3.

200 Resultados

En cuanto a los parámetros de utilización de la grasa, los valores de grasa ingerida y

absorbida son significativamente mayores en el grupo E3 respecto a los otros dos

grupos, que tienen valores similares entre sí. La cantidad de grasa en heces es más

elevada (P<0.05) en los grupos E1 y E3 comparado con el grupo control. Respecto a la

digestibilidad de grasa, los tres grupos poseen valores significativamente diferentes,

mostrando el grupo control la mayor utilización digestiva de este nutriente, seguido

del grupo E3 y, finalmente, del grupo E1.

3.2.4. Curva de glucemia

50

100

150

200

250

DIO E1 E3 C

***

*

*

**

** ** *

**

*

*

15 30 60 900

Time (minutes)

Glu

co

se (

mg

/dl)

Figure 33. Plasma glucose concentrations during oral glucose tolerance tests (OGTT) conducted at the end of the obesity induction period (DIO) and, subsequently, after feeding the obese rats for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E3). Values represent mean ± SEM (n = 28-30 for DIO, and n=8-10/group for C, E1 and E3). For a given group, the asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05) compared to basal (time 0); for a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: ν: DIO vs. E1, E3 and C.

201 Resultados

La Fig. 33 muestra los cambios en la concentración de glucosa plasmática durante tests

de tolerancia a glucosa oral (OGTT) realizados en el periodo de inducción de obesidad

(DIO) y, posteriormente, en el periodo experimental, en el que las ratas obesas fueron

asignadas a los grupos control, E1 y E3. En condiciones de ayunas, la concentración de

glucosa en el grupo DIO es menor (P<0.05) que la registrada en los animales durante el

periodo experimental (C, E1 y E3). Se observa respuesta a la glucosa oral en todos los

grupos y también en todos ellos la glucemia se mantiene significativamente elevada

con respecto al basal hasta el min. 90, aunque en las ratas DIO los valores van cayendo

progresivamente en tanto que en los grupos C, E1 y E3 se mantienen constantes a

partir del min. 30. Todo ello hace que en los dos puntos finales del test (60 y 90 min.)

la glucosa plasmática en el grupo DIO muestre valores significativamente menores

respecto a los obtenidos cuando el test se realizó durante el periodo experimental (C,

E1 y E3).

202 Resultados

3.2.5. Concentración plasmática de hormonas gastrointestinales

0

100

200

300

400

500

-15 0 15 30 60 120

a

Time (minutes)

AM

Y (

pg

/ml)

0

50

100

150

200

-15 0 15 30 60 120

b

Time (minutes)

CC

K (

pg

/ml)

0

100

200

300

400

-15 0 15 30 60 120

*

** **

* *

*

**

*

*

c

Time (minutes)

GIP

(p

g/m

l)

E1 E3 C

E1 E3 C0

5

10

AU

C A

MY

((p

g/m

l)*1

0-3

))

E1 E3 C0

10

20

30

40

AU

C G

IP (

(pg

/ml)

*10

-3))

E1 E3 C0

2

4

6

AU

C C

CK

((p

g/m

l)*1

0-3

))

Figure 34. Plasma concentrations of AMY (a), CCK (b) and GIP (c) in DIO rats subsequently fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E3). Results are expressed as time-course changes (left) and as area under the curve (AUC, right). Values represent mean ± SEM (n = 8-10). Time-course charts: the blue bar indicates the duration of the meal; for a given group, the asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05) compared to basal (-15); for a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: α: C vs E3, β: C vs E1, and ε: E1 vs E3. Abbreviations: DIO (diet-induced obesity).

203 Resultados

Como pone de manifiesto la Fig. 34 a, no existen diferencias significativas en

concentración basal de AMY entre ninguno de los grupos (248.3±36.3 pg/ml (E1),

337.1 ±38.2 pg/ml (E3) y 266.4±32.1 (C)). Tampoco hay en ninguno de ellos una

respuesta significativa tras la ingestión de alimento. A los distintos tiempos del

periodo postprandial, las mayores diferencias se dan entre los grupos E3 y E1, con

mayores (P<0.05) valores en E3 a excepción del min. 120. No existen diferencias

significativas en el AUC en ningún caso.

Refiriéndonos a las concentraciones basales de CCK, son: 94±15 pg/ml en el grupo E1,

95±0.9 pg/ml en el grupo E3 y 89±1 pg/ml en el grupo control, muy similares entre sí.

La ingestión de alimento no ocasiona cambios en las concentraciones circulantes de

este péptido, ni tampoco se presentan diferencias significativas entre los grupos en

ninguno de los tiempos medidos (Fig. 34 b). Las AUC de los tres grupos son también

semejantes.

Las concentraciones plasmáticas de GIP en condiciones de ayunas difieren (P<0.05)

entre el grupo E1 (32.9 ±5.4 pg/ml) y E3 (54.8±4.5 pg/ml), siendo ambas similares a las

del grupo control (40.1±5.7 pg/ml). Existe una marcada y significativa respuesta al

alimento en todos los grupos de estudio (Fig. 34 c), con valores que, aunque tienden a

disminuir, siguen elevados (P<0.05) en comparación con el basal hasta el final (min.

120). Cabe resaltar la ausencia de diferencias significativas entre los tres grupos para

cualquiera de los tiempos del periodo postprandial. El AUC tampoco varía de forma

significativa en ninguno de los casos.

204 Resultados

0

50

100

150

-15 0 15 30 60 120

e

Time (minutes)

GR

N (

pg

/ml)

0

1200

2400

3600

-15 0 15 30 60 120

*

f

E3

Time (minutes)

INS

(p

g/m

l)

0

50

100

150

200

250

-15 0 15 30 60 120

d

Time (minutes)

GL

P-1

(p

g/m

l)

E1 E3 C

E1 E3 C0

10

20

30

40

AU

CG

LP

-1 (

(pg

/ml)

*10

-2))

E1 E3 C0

1

2

3

4

5

AU

C G

RN

((p

g/m

l)*1

0-3

))

E1 E3 C0

2

4

6

8

10

AU

C I

NS

((p

g/m

l)*1

0-4

))

Figure 35. Plasma concentrations of GLP-1 (d), GRN (e) and INS (f) in DIO rats subsequently fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E3). Results are expressed as time-course changes (left) and as area under the curve (AUC, right . Values represent mean ± SEM (n = 8-10). Time-course charts: the blue bar indicates the duration of the meal; for a given group, the asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05) compared to basal (-15); for a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: α: C vs E3, β: C vs E1, and ε: E1 vs E3. Abbreviations: DIO (diet-induced obesity).

205 Resultados

Respecto al GLP-1 (Fig. 35 d), la concentración basal para el grupo E1 es de 185.7±14.2

pg/ml, para el grupo E3 de 191.8±22.2 pg/ml y 143.8±22.6 pg/ml en el grupo C, no

existiendo diferencias significativas entre estas. No se aprecian aumentos

postprandiales estadísticamente significativos en ningún caso y tampoco hay

diferencias entre grupos en las concentraciones plasmáticas de GLP-1 a los diferentes

tiempos. La secreción total en respuesta al alimento, estimada por el AUC, es similar

en todos los grupos.

Las concentraciones basales de GRN son semejantes en los tres grupos, mostrándose

unos valores de 76±18.3 pg/ml en el grupo E1, de 85.9±16.6 pg/ml en el E3, y

81.1±16.8 pg/ml en el control. En lo que respecta a la GRN postprandial (Fig. 35 e), le

es de aplicación todo lo dicho anteriormente para el GLP-1.

Las concentraciones de INS en situación de ayunas se sitúan en torno a 1330±250

pg/ml en el grupo E1, 2043±378 pg/ml en el grupo E3 y 1695±283 pg/ml en el grupo C.

Aunque en algunos grupos se pueden apreciar ligeros aumentos en la INS plasmática

tras la comida (Fig. 35 f), los cambios en general no alcanzan significación estadística,

con la excepción del valor observado en el grupo E3 al final del estudio (120 min.), que

llega a ser inferior (P<0.05) al correspondiente basal. No existen diferencias

significativas en ningún momento entre los grupos y tampoco en las AUC.

206 Resultados

0

30

60

90

120

-15 0 15 30 60 120

*

i

Time (minutes)

PY

Y (

pg

/ml)

0

3500

7000

10500

14000

-15 0 15 30 60 120

* *

**

g

Time (minutes)

LE

P (

pg

/ml)

0

20

40

60

80

-15 0 15 30 60 120

*

h

Time (minutes)

PP

(p

g/m

l)

E1 E3 C

E1 E3 C0

10

20

30

40

AU

C L

EP

((p

g/m

l)*1

0-4

))

E1 E3 C0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

AU

C P

P (

(pg

/ml)

*10

-2))

E1 E3 C0

5

10

15

20

AU

C P

YY

((p

g/m

l)*1

0-2

))

Figure 36. Plasma concentrations of LEP (g), PP (h) and PYY (i) in DIO rats subsequently fed for 10 weeks with standard diet (C) or diets containing two different functional ingredients (E1 and E3). Results are expressed as time-course changes (left) and as area under the curve (AUC, right . Values represent mean ± SEM (n = 8-10). Time-course charts: the blue bar indicates the duration of the meal; for a given group, the asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05) compared to basal (-15); for a given time point, statistical significance (P<0.05) between the groups is indicated as follows: α: C vs E3, β: C vs E1, and ε: E1 vs E3. Abbreviations: DIO (diet-induced obesity).

207 Resultados

La LEP presenta concentraciones basales de 9913±646 pg/ml en el grupo E1,

8833±1038 pg/ml en el grupoE3 y 8982±540 pg/ml en el grupo control, todos

semejantes entre sí (Fig. 36 g). Existe una respuesta significativa al alimento en el

grupo E3 en los minutos 30 y 120, y el caso del grupo control en los minutos 60 y 120.

Por el contrario, no hay cambios en la concentración plasmática de esta hormona tras

la ingestión de comida en el grupo E1. Existen diferencias significativas puntuales

entre los grupos E1 y E3 en el tiempo 15, y entre E1 y control en los minutos 30 y 120.

Las AUC de los tres grupos son similares.

En situación de ayunas, la concentración circulante de PP es de 36.8±4.6 pg/ml en el

grupo E1, 46.4±6.2 pg/ml en el grupo E3 y 37.6±5.1pg/ml en el grupo C. Únicamente se

producen cambios postprandiales en el PP plasmático en el grupo control y al final del

experimento (120 minutos). De acuerdo con nuestros datos (Fig. 36 h), no existen

diferencias entre los grupos en ninguno de los tiempos estudiados. Los valores de AUC

son similares entre los tres grupos.

Por último, los valores de concentración basal para el PYY son: 76±6.6 pg/ml en el

grupo E1, 76±7.9 pg/ml en el grupo E3 y 65.1±10.2 pg/ml en el grupo C, no existiendo

diferencias (P<0.05) entre ellos. En términos generales (ver Fig. 36 i), la ingestión de

alimento no produce cambios importantes en la concentración de PYY en plasma,

apareciendo únicamente una disminución significativa respecto al basal en el grupo

E1, en el último tiempo. Aunque los valores en el grupo E3 tienden a ser ligeramente

mayores que los de los otros grupos a lo largo del periodo postprandial, sólo en el

minuto 30 la diferencia alcanza significación estadística al comparar con el grupo E1.

No existen diferencias en la secreción total de péptido (AUC) en ningún caso.

4. PARÁMETROS HEMATOLÓGICOS Y BIOQUÍMICOS

4.1 PARÁMETROS HEMATOLÓGICOS

208 Resultados

Table 14. Hematologic parameters of the three experiments.

E1 E2 C EXPERIMENT I

WBC (x103/ μl) 4.86 ± 0.85 6.02 ± 0.48 6.19 ± 0.41

RBC (x106/ μl) 7.37 ± 0.16 7.13 ± 0.15 7.20 ± 0.19

HGB (g/dl) 7.88 ± 3.67 13.38 ± 0.21 10.76 ± 2.77

HCT (%) 40.39 ± 0.93 39.98 ± 0.74 25.99 ± 10.11

MCHC (g/dl) 33.06 ± 0.24 33.08 ± 0.29 32.86 ± 0.12

EXPERIMENT II

WBC (x103/ μl) 5.13 ± 0.83 6.67 ± 0.53 6.62 ± 0.82

RBC (x106/ μl) 8.56 ± 0.23 a 7.95 ± 0.09 b 7.71 ± 0.21 b

HGB (g/dl) 14.98 ± 0.35 a 13.96 ± 0.11 b 14.30 ± 0.37 ab

HCT (%) 46.63 ± 0.74 a 43.01 ± 0.36 b 40.72 ± 0.86 c

MCV (fL) 53.33 ± 0.26 54.10 ± 0.39 53.22 ± 0.34

MCH (pg) 17.53 ± 0.18 17.80 ± 0.18 17.70 ± 0.46

MCHC (g/dl) 32.85 ± 0.38 32.55 ± 0.13 27.23 ± 6.23

EXPERIMENT III

E1 E3 C

WBC (x103/ μl) 3.59 ± 0.42 a 4.92 ± 0.44 a 8.10 ± 0.74 b

RBC (x106/ μl) 7.97 ± 0.42 8.09 ± 0.26 8.72 ± 0.10

HGB (g/dl) 13.41 ± 1.19 14.08 ± 0.54 14.53 ± 0.17

HCT (%) 42.19 ± 2.30 a 40.32 ± 1.53 a 48.42 ± 0.39 b

MCV (fL) 52.34 ± 1.33 49.82 ± 0.54 55.56 ± 0.57

MCH (pg) 17.01 ± 0.50 17.39 ± 0.22 16.85 ± 0.18

MCHC (g/dl) 30.83 ± 2.06 34.91 ± 0.15 30.01 ± 0.17

Blood was collected at sacrifice. Experiment I: lean rats, short-term (6 days) administration of experimental diets; Experiment II: lean rats, long-term (10 weeks) administration of experimental diets; Experiment III: DIO rats, long-term (10 weeks) administration of experimental diets. Values represent mean ± SEM (n = 8-10 per group). Different letters in the same row indicate significant difference (P<0.05) between the groups. Abbreviations: DIO (diet-induced obesity), WBC (White blood cells), (Red blood cells), HGB (Haemoglobin), MCV (Mean corpuscular volume), MCH (Mean corpuscular haemoglobin) and MCHC (Mean corpuscular haemoglobin concentration.

209 Resultados

Como puede apreciarse en la Tabla 14, no existen diferencias significativas en ninguno

de los parámetros hematológicos medidos en el primer experimento (corto plazo).

En el experimento a largo plazo en ratas normopeso (II), el recuento de glóbulos rojos

(RBC) es significativamente menor en los grupos E2 y control en comparación con el

grupo E1. El hematocrito (HCT) muestra valores diferentes (P<0.05) entre los grupos,

de forma que el menor valores el del grupo control, seguido del grupo E2 y por último

el grupo E1. La concentración de hemoglobina (HGB) disminuye significativamente en

el grupo E2 respecto al E1, siendo ambos valores similares a los del grupo control.

Respecto al resto de parámetros, no se encuentran diferencias significativas entre los

grupos.

En el tercer experimento (largo plazo en ratas obesas), el recuento de glóbulos blancos

(WBC) y el hematocrito (HCT) son significativamente superiores en el grupo C respecto

a los otros dos grupos, entre los que no existe diferencia. En el resto de parámetros

hematológicos no existen diferencias significativas entre los grupos (Tabla 14).

210 Resultados

4.2 PARÁMETROS BIOQUÍMICOS PLASMÁTICOS Y HEPÁTICOS Table 15. Biochemical parameters in plasma and liver

E1 E2 C

EXPERIMENT II

GLU PL (mg/dl)

82.48 ± 5.12 91.88 ± 5.15 75.78 ± 5.86

CHL PL (mg/dl)

49.00 ± 3.10 55.74 ± 5.56 50.18 ± 4.17

HDL CHL PL (mg/dl)

11.66 ± 2.70 16.18 ± 1.41 15.38 ± 1.74

TRG PL (mg/dl)

71.46 ± 6.71 104.16 ± 18.46 86.40 ± 14.10

PLFA PL (mg/dl)

89.86 ± 6.50 104.70 ± 7.95 96.08 ± 8.17

CHL LIV (mg/g liv)

3.37 ± 0.43 3.97 ± 0.75 2.86 ± 0.12

TRG LIV (mg/g liv)

4.98 ± 0.92 a 3.73 ± 0.59 a 8.44 ± 0.55 b

EXPERIMENT III

E1 E3 C

GLU PL (mg/dl)

157.73 ± 13.50 a 166.42 ± 11.70 a 113.31 ± 4.95 b

CHL PL (mg/dl)

63.60 ± 2.85 60.38 ± 2.80 64.60 ± 6.64

HDL CHL PL (mg/dl)

23.23 ± 0.97 22.77 ± 1.61 22.39 ± 2.29

TRG PL (mg/dl)

128.17 ± 20.37 98.87 ± 35.65 110.43 ± 20.11

PLFA PL (mg/dl)

133.81 ± 6.85 116.33 ± 7.97 129.51 ± 13.12

CHL LIV (mg/g)

4.60 ± 0.19 a 2.80 ± 0.48 b 3.54 ± 0.70 ab

TRG LIV (mg/g liv)

8.45 ± 1.09 10.16 ± 3.09 12.51 ± 1.68

Samples collected at sacrifice. Experiment I: lean rats, short-term (6 days) administration of experimental diets; Experiment II: lean rats, long-term (10 weeks) adm. of exp. diets; Experiment III: DIO rats, long-term (10 weeks) adm. of exp. diets. Values represent mean ± SEM (n = 8-10 per group). Different letters in the same row indicate significant difference (P<0.05) between the groups. Abbreviations: GLU PL (plasma glucose), CHL PL (plasma cholesterol), HDL CHL PL (High-density lipoprotein cholesterol in plasma), TRG PL (plasma triglycerides), PLFA PL (plasma phospholipids), CHL LIV (liver cholesterol), and TRG LIV (liver triglycerides).

211 Resultados

En el experimento II, los triglicéridos hepáticos en el grupo control son superiores

(P<0.05) a los de los grupos experimentales E1 y E2, como puede apreciarse en la

Tabla 15. En el resto de variables no existen diferencias significativas entre los grupos.

La concentración de glucosa en plasma en la tercera experiencia (III) es

significativamente mayor en los grupos E1 y E3 con respecto al grupo control. Por otro

lado, como se puede apreciar en la Tabla 15, el colesterol en hígado es mayor (P<0.05)

en el grupo E1 que en el E3, mostrando el grupo C valores intermedios. No hay

cambios significativos en el resto de variables.

212 Resultados

5 EXPERIENCIA EN HUMANOS

5.1 Dieta del periodo experimental

Table 16. Energy, macro- and micronutrient intakes of human volunteers during the experimental period assessed by 24-h recall.

PARAMETERS CONTROL E1

Energy (Kcal) 1592.62 ± 86.33 1545.00 ± 107.46

Water (g) 1858.57 ± 255.53 1869.91 ± 220.44

Proteins (g) 76.24 ± 4.18 74.23 ± 4.70

Fat (g) 69.88 ± 5.53 62.12 ± 6.00 *

Saturated fat (g) 14.65 ± 1.22 12.98 ± 1.62

Mon. fat (g) 17.80 ± 1.68 15.64 ± 1.76 *

Pol. fat (g) 23.02 ± 2.37 18.57 ± 1.90 *

Cholesterol (mg) 228.09 ± 22.04 205.87 ± 25.66

Carbohidrates (g) 160.37 ± 9.98 162.53 ± 10.76

Dietary fiber (g) 11.10 ± 0.91 9.67 ± 0.61

Sodium (mg) 1415.81 ± 139.73 1261.05 ± 131.19 *

Potasium (mg) 1852.23 ± 111.87 1815.46 ± 108.10

Calcium (mg) 796.95 ± 37.28 796.95 ± 50.47

Magnesium (mg) 234.98 ± 15.77 218.59 ± 14.36

Phosphorus (mg) 1142.17 ± 52.43 1106.47 ± 74.77

Iron (mg) 20.97 ± 7.50 11.51 ± 0.91

Copper (mg) 0.63 ± 0.06 0.64 ± 0.12

Zinc (mg) 7.60 ± 0.79 5.96 ± 0.56 *

Chloride (mg) 1048.35 ± 129.61 1036.64 ± 94.33

Manganese (mg) 7.43 ± 2.44 4.99 ± 1.78

Selenium (μg) 44.70 ± 3.80 50.27 ± 8.52

Iodine (μg) 36.60 ± 5.01 30.80 ± 3.34

Vita A 509.72 ± 39.40 503.68 ± 40.81

Vitamin B1 1.41 ± 0.20 3.85 ± 1.45

Vitamin B2 1.53 ± 0.07 1.44 ± 0.12

Vitamin B3 24.39 ± 2.20 22.04 ± 1.89

Vitamin B5 3.45 ± 0.26 3.37 ± 0.23

Vitamin B6 1.61 ± 0.09 1.59 ± 0.09

Vitamin B7 5.15 ± 0.98 3.68 ± 0.65 *

Vitamin B9 165.43 ± 10.14 160.23 ± 16.19

Vitamin B12 5.58 ± 0.45 5.67 ± 0.60

Vitamin C 65.38 ± 9.03 53.35 ± 6.78

Vitamin D 3.41 ± 0.46 4.95 ± 1.36

Vitamin E 19.10 ± 1.95 15.12 ± 1.99 *

Values represent mean ± SEM (n = 8-15 per group). For a given parameter, the asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05) between the groups. Abbreviations: Mon. (Monounsaturated) and Pol. (Polyunsaturated).

213 Resultados

La ingesta de nutrientes en el periodo experimental, evaluada a través de

recordatorios de 24 h, resultó en algunas diferencias significativas entre los dos grupos

de voluntarios, en particular en lo referente a ingesta de grasa total, grasa

monoinsaturada y poliinsaturada, sodio, zinc, biotina y vitamina E, siendo los valores

en todos los casos menores en el grupo E1.

214 Resultados

5.2 Concentración plasmática de hormonas

gastrointestinales

0

50

100

150

200

0 1 2 3 4 5 8

** * *

* *

**

* ** *

a

Time (hours)

GIP

(p

g/m

l)

0

50

100

150

0 1 2 3 4 5 8

* ** * *

*

* *

b

Time (hours)

GR

N (

pg

/ml)

0

200

400

600

0 1 2 3 4 5 8

* *

* *

c

Time (hours)

INS

(p

g/m

l)

C E1

E1 C0

2

4

6

8

10

a

b

AU

C G

IP (

(pg

/ml)

*10

-4))

E1 C0

1

2

3

4

5

AU

C G

RN

((p

g/m

l)*1

0-3

))

E1 C0

5

10

15

a

b

AU

CIN

S (

(pg

/ml)

*10

-4))

Figure 37. Plasma concentrations of GIP (a), GRN (b), and INS (c) in healthy volunteers before (time 0) and after the administration of a standard meal (group C) or the standard meal added with the functional ingredient E1 (group E1). Values represent mean ± SEM (n = 8-15). For a given group the asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05) compared to basal (0). For a given time point the symbol δ denotes a significant difference (P<0.05) between the groups.

215 Resultados

Las concentraciones basales de GIP fueron: 15.4±1.8 pg/ml en el grupo control y

9.6±1.9 pg/ml en el grupo E1, siendo la diferencia entre medias estadísticamente

significativa (Fig. 37 a). En respuesta al alimento se producen en ambos grupos

aumentos significativos, manteniéndose las concentraciones plasmáticas elevadas

(P<0.05) con respecto al valor de ayunas hasta la 8ª hora postprandial, pudiéndose

apreciar diferencias significativas entre ambos grupos en la 3ª y 4ª hora tras la comida,

con mayores valores en el grupo control. La respuesta postprandial total, estimada por

el AUC, fue significativamente mayor en el grupo control.

Para la GRN, las concentraciones basales se sitúan en el grupo control en 97.9±19.9

pg/ml y en 51.3±5.1 pg/ml en el grupo E1 (P<0.05), sin aparecer diferencias

significativas entre los grupos en los distintos tiempos del periodo postprandial. La

comida causa una marcada (P<0.05) disminución en el grupo control, alcanzándose

valores significativamente inferiores a los de ayunas hasta el final del estudio como

refleja la Fig. 37 b. En el grupo E1, el descenso postprandial es menor y solo se alcanza

significación estadística en comparación con el basal en la primera y tercera hora. El

AUC es similar en ambos grupos.

Nuestros resultados (Fig. 37 c) muestran concentraciones basales de INS de 256±19.2

pg/ml en el grupo control y 162.4±21.5 pg/ml en el grupo E1, valores estadísticamente

comparables. La respuesta al alimento es significativa en el grupo E1, aunque

únicamente hasta la cuarta hora. Tras la comida, la insulinemia muestra valores

similares en ambos grupos exceptuando la quinta hora, donde la concentración de

esta hormona es significativamente superior en el grupo control comparada con la

observada en el grupo E1. El AUC es mayor (P<0.05) en el grupo control que en el E1.

216 Resultados

0

50

100

150

0 1 2 3 4 5 8

** ** * *

* * * * **

f

Time (hours)

PY

Y (

pg

/ml)

0

50

100

150

200

0 1 2 3 4 5 8

* *

* *

**

**

* **

*

e

Time (hours)

PP

(p

g/m

l)

0

5000

10000

15000

0 1 2 3 4 5 8

*

*C

d

Time (hours)

LE

P (

pg

/ml)

E1 C0

5

10

15

AU

C L

EP

((p

g/m

l)*1

0-5

))

E1 C0

2

4

6

8

AU

C P

P (

(pg

/ml)

*10

-4))

E1 C0

1

2

3

4

a

b

AU

C P

YY

((p

g/m

l)*1

0-4

))

C E1

Figure 38. Plasma concentrations of LEP (d), PP (e) and PYY (f) in healthy volunteers before (time 0) and after the administration of a standard meal (group C) or the standard meal added with the functional ingredient E1 (group E1). Values represent mean ± SEM (n = 8-15). For a given group the asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05) compared to basal (0). For a given time point the symbol δ denotes a significant difference (P<0.05) between the groups.

217 Resultados

Las concentraciones basales de LEP son de 8937±1472 pg/ml en el grupo control y

6558±1096 pg/ml en el grupo E1, similares entre sí. No existe una respuesta

significativa tras la ingesta de alimento en ningún grupo (excepto en algún punto

aislado) y los valores de concentración a lo largo del periodo postprandial son

semejantes en los dos grupos (Fig. 38 d). El AUC no se ve afectada por los tratamientos

experimentales.

En condiciones de ayunas, la concentración plasmática de PP es mayor (P<0.05) en el

grupo control que en el grupo E1 (45.6±10.8 pg/ml y 19.8±4.6 pg/ml,

respectivamente). La ingesta de la comida se asocia a una respuesta marcada (Fig. 38

e), con valores que se mantienen en los dos grupos significativamente elevados frente

al basal hasta el final de la experiencia. La existencia de patrones temporales

ligeramente distintos en los dos grupos hace que en la tercera hora postprandial la

concentración de PP del grupo control sea superior (P<0.05) a la del grupo E1. No

obstante, el área bajo la curva es similar en los dos grupos.

La Fig. 38 f refleja los cambios en la concentración circulante de PYY en los pacientes

de nuestro estudio. Las concentraciones basales fueron: 48.8±4.4 pg/ml en el grupo

control y 35.3±5.6pg/ml en el grupo E1 (similares entre ellas). Tras la administración

de la comida, el PYY aumenta significativamente en ambos grupos y se mantiene

elevado (P<0.05) por encima de los valores basales hasta la finalización del

experimento. Se observan diferencias significativas puntuales entre los grupos en las

horas 2 y 8, con concentraciones mayores en el grupo control. La secreción total de

péptido (AUC) es significativamente superior en el grupo control comparado con el

E1.

218 Resultados

5.3 Parámetros de saciedad y hambre

AUC s

atie

ty

AUC h

unger

Sat

iety

(h)

Hunger

(h)

0

10

20

30

40

CE1

Figure 39. Hunger/satiety parameters in healthy volunteers after the administration of a standard meal (group C) or the standard meal added with the functional ingredient E1 (group E1). Satiety/hunger feelings were assesed hourly during the postprandial period according to Haber [726]. Satiety and hunger intensity is expressed as area under the curve (AUC) of satiety and hunger, respectively. Satiety and hunger time is expressed in hours. Values represent mean ± SEM (n = 8-15).

No existen diferencias significativas entre los dos grupos en las AUC indicativas de la

intensidad de saciedad o hambre, ni tampoco en el tiempo que los sujetos están

saciados o hambrientos.

DISCUSIÓN

“Un buen viajero no tiene planes fijos ni la intención de llegar”.

(Lao Tse)

221 Discusión

1. ASPECTOS GENERALES

En el estudio de los aspectos relacionados con la fisiología, los modelos in vitro

presentan limitaciones de cara a su posible extrapolación a los seres humanos, lo que

hace que se necesiten modelos que simulen las condiciones propias de un organismo

complejo. El modelo animal más utilizado en este sentido son los roedores [728],

existiendo numerosos tipos dependiendo de los objetivos de estudio. Concretamente,

en el campo de la fisiología de la nutrición se suelen utilizar modelos con alteraciones

genéticas (globales o locales) u obtenidos por cría selectiva [162]. Además existen

también modelos que nos revelan aspectos ambientales, tales como: la influencia de

dietas altas en grasas y/o en azúcares, los efectos de la restricción dietética sobre la

masa corporal o el impacto de distintos fármacos sobre algunos componentes del

equilibrio energético [162].

En el trabajo que nos ocupa, la rata Wistar macho fue elegida como modelo

experimental debido a una serie de ventajas (aparte de su fácil manejabilidad y

mantenimiento):

- Amplio conocimiento de su fisiología tanto gastrointestinal como

neuroendocrina, y posible extrapolación al ser humano, como se ha recogido

en los antecedentes de esta tesis.

- Recientemente se han podido realizar estudios postprandiales más completos

en la rata gracias a la tecnología MilliplexTM X-Map®, que adaptada

específicamente a esta especie, nos permite trabajar con pequeños volúmenes

de plasma.

- Los machos poseen una mayor proporción de grasa visceral en comparación a

las hembras (como ocurre en humanos), lo que se asocia a una obesidad de

tipo androide, la cual es más severa que la ginoide [729].

Respecto a la dieta utilizada se escogió la AIN-93M como control y base de la dieta

experimental. Se trata de una dieta semipurificada estándar cuya formulación fue

publicada en 1993 [720] y que ha sido ampliamente utilizada en estudios relacionados

222 Discusión

con la fisiología de la ingesta y el BW [730-732]. Además nuestro Departamento posee

una amplia experiencia tanto en su preparación, como en su utilización en estudios de

este tipo [733,734].

En relación al diseño experimental, primero se decidió realizar un experimento a corto

plazo como estudio piloto para estudiar el comportamiento general de los parámetros

objeto de nuestro estudio en respuesta a las dietas experimentales a ensayar, tras su

administración durante un periodo breve de tiempo. Con este conocimiento previo, se

planteó un estudio a largo plazo (segundo experimento), el cual simula mejor la

realidad de un posible uso en humanos de estos ingredientes funcionales con el

objetivo de controlar el BW. Ambos se llevaron a cabo en animales con normopeso.

Por último, se planteó un tercer experimento con animales con obesidad inducida por

la dieta, para conocer el papel de las dietas experimentales en la pérdida de peso y los

posibles mecanismos implicados (cambios en la ingesta de alimentos, en la utilización

digestiva y metabólica de los macronutrientes y en las concentraciones plasmáticas,

basales y postprandiales, de diferentes péptidos gastrointestinales y hormonas

implicados en el control del balance de energía corporal. Para llevar a cabo este último

experimento se realizó una revisión bibliográfica exhaustiva sobre los modelos

animales de obesidad más usados y se optó por un modelo de obesidad inducida por

la dieta en ratas utilizando una dieta hipercalórica con el 60% de las kilocalorías en

forma de grasa. En general, está aceptado que este tipo de modelo es el que más se

asemeja a la situación de obesidad que ocurre mayoritariamente en humanos [165].

Además, se incluye un estudio agudo en humanos con uno de los ingredientes

funcionales (E1), en el que se evalúan parámetros relacionados con la sensación de

hambre y saciedad de los participantes, así como las concentraciones plasmáticas, en

ayunas y tras la comida, de algunos de los péptidos y hormonas más importantes en la

regulación de la ingesta de alimentos.

Por último, hay que destacar que no existe a día de hoy ningún estudio en el que se

haya probado el efecto de este tipo de componentes dietéticos sobre parámetros de

digestibilidad, metabólicos y concentraciones circulantes de hormonas

223 Discusión

gastrointestinales relacionadas con el control de la ingesta. Todo ello subraya lo

novedoso de este estudio, que permitiría obtener datos inéditos de gran valor que

podrían apoyar la posible utilización de estos componentes en dietas dirigidas al

control del BW, objetivo del proyecto global donde se enmarca esta memoria, el

Proyecto PRONAOS.

2. EXPERIMENTOS EN RATAS NORMOPESO

2.1. CORTO PLAZO

2.1.1. Ingesta

La ingesta media de alimento en las ratas control a lo largo del periodo experimental

fue de 23.6±0.53 g/d. Esta ingesta promedio es semejante a la obtenida por Bocanegra

et al. [735] y Donato et al. [736], con valores medios de 20.2±1.7 g/d y 22.6 g/d

respectivamente.

Por otro lado, la ingesta de energía a lo largo del periodo experimental disminuyó de

forma progresiva y significativa desde 359±10 Kj/d al inicio hasta 322±9 Kj/d al final. En

el trabajo de Jean et al. [737], las ratas comienzan con una ingesta energética de

366±4 Kj/d manteniéndose constante durante un periodo comparable al nuestro. Las

diferencias entre dicho estudio y el nuestro pueden considerarse poco relevantes, ya

que la evolución ponderal es la misma en ambos casos.

Volviendo a nuestro estudio, se observa que el patrón temporal de ingesta de

alimento, calorías y macronutrientes es similar en los tres grupos, exceptuando algún

punto aislado donde aparecen diferencias significativas. Como puede apreciarse en la

Fig. 13, hay una disminución significativa (excepto el primer día en los grupos E1, E2 y

control, y el tercer día en el último grupo) de la ingesta de alimento en todo el periodo

experimental, que puede deberse probablemente al cambio de la dieta de adaptación

en “pellets” (Teklad 2014) a la dieta en polvo utilizada, que hace que la rata ingiera

menos cantidad de dieta a corto plazo [738,739], hasta que se produce una

adaptación a dicha textura y se estabiliza la ingesta [740]. No podemos descartar que

224 Discusión

las pérdidas de comida que se producen con esta dieta no granulada, tengan una

influencia en el descenso observado.

Por otra parte, las diferencias existentes entre el grupo E2 y el control en la ingesta de

proteína y grasa se pueden atribuir a ligeras diferencias (no significativas) en la

cantidad de estos macronutrientes en la dieta, que ejercen un efecto aditivo en la

ingesta diaria.

En definitiva, las emulsiones E1 y E2 no causan una modificación significativa en la

ingesta de alimento y de energía ni de macronutrientes a corto plazo.

2.1.2. Evolución ponderal

La evolución ponderal del grupo control fue similar a la publicada en el estudio de Jean

et al. [737], único trabajo en el que se controla el BW durante un periodo de tiempo

similar.

La presencia en la dieta de grasa en forma de emulsiones obtenidas con distinta

tecnología (ingredientes funcionales E1 y E2), no afectó a la evolución ponderal, al

menos a corto plazo, lo cual se corresponde con ingestas de energía similares en los

tres grupos estudiados.

2.1.3. Peso corporal y de órganos al sacrificio

Los pesos de los diferentes órganos están dentro de la normalidad para esta cepa

alimentada con esta dieta, de acuerdo con datos de experimentos realizados en el

Departamento de Fisiología [Porres et al., comunicación personal] en condiciones

similares a las nuestras.

2.1.4. Parámetros e índices de utilización nutricional de proteína y grasa

En el grupo control, el Coeficiente de Digestibilidad Aparente de la proteína (CDA

proteína) alcanzó un valor de 91±1%, similar al observado en trabajos que utilizan la

misma cepa y edad [741,742]. La ingesta de proteína en nuestro estudio para ese

grupo se situó alrededor de 14.9±0.4 g/semana, la cual se aproxima a lo descrito en el

único estudio comparable con el nuestro desarrollado por Gudiel-Urbano et al. [742],

en el que la ingesta total de proteína se situó en 19.3±0.8 g/semana.

225 Discusión

La utilización digestiva (CDA proteína) y metabólica (Balance y R/A) de nitrógeno del

grupo control no presentó diferencias con los valores obtenidos en el grupo E1, pero sí

con los del grupo E2.

La utilización digestiva de la grasa, estimada por su coeficiente de digestibilidad, fue

de 96±0.14%, en el grupo control, similar a lo recogido en el trabajo de Kapravelou et

al. (96.5±0.27%) [733] y algo menor que el valor referido por Gudiel-Urbano

(99±0.24%) [742], siendo esta última diferencia poco relevante si se tiene en cuenta el

rango tan elevado de valores en el que nos movemos.

Como se ha comentado, los valores de los diferentes índices en el grupo control están

de acuerdo con la bibliografía. Además, no se produce un cambio notable en los

índices de utilización digestiva y metabólica de los macronutrientes estudiados al

comparar los grupos experimentales con el grupo control.

2.1.5. Concentración plasmática de hormonas gastrointestinales

La concentración plasmática basal de AMY fue de 59.91±3.75 pg/ml en el grupo

control, ligeramente superior a los valores obtenido por Shin et al. [218], Hallam [743]

y Zhao et al. [744]. La edad de los animales en los estudios antes citados fue de 27, 22

y 13 semanas respectivamente, factor que en el caso de los dos primeros estudios

puede explicar las diferencias observadas con nuestros resultados, desconociéndose la

causa de la discrepancia con el último trabajo (Zhao et al. [744]) ya que no existen

diferencias en la cepa, dieta, edad o en el método analítico utilizado. No se han

encontrado estudios en ratas que investiguen la influencia de la edad sobre las

concentraciones basales de este péptido, pero sí hay datos en humanos, observándose

menores concentraciones plasmáticas de AMY en individuos de mediana edad (41-60

años) respecto a individuos más jóvenes (20-40 años) [745]. Este efecto de la edad que

parece darse en humanos concuerda con lo observado en los dos primeros estudios

[218,743] en comparación al nuestro, ya que a esas edades (22-27 semanas) las ratas

se consideran adultas de edad media (equivalencia a 50-60 años en humanos) [746].

No hay respuesta de AMY al alimento en el grupo control, al igual que encuentran

Maurer et al [747] en tests de tolerancia a glucosa oral (OGTT), y que contrasta con lo

226 Discusión

observado en el estudio de Shin et al. [218] donde se describe un aumento

significativo de las concentraciones de esta hormona a los 10 minutos, descendiendo

progresivamente hasta alcanzar valores cercanos a los basales a los 40 minutos. La

discrepancia en la respuesta al alimento entre el último estudio y el nuestro puede

deberse a la composición de la dieta experimental (standard chow vs. AIN-93M) y/o a

las diferencias en los experimentos de ayunas-postprandial (administración intraoral

por fístula de 1 ml/min (5 en total) de solución de Ensure® vs. ingesta ad libitum de

dieta en nuestro caso). En otros modelos como el felino tampoco se ha descrito una

respuesta significativa tras la ingesta de alimento [748], aunque en humanos parece

que si se produce [205].

Si comparamos la respuesta a la comida del grupo control respecto a la del grupo E1,

no se observan diferencias significativas. Por su parte, los mayores valores de AMY que

encontramos de manera aislada (120 minutos) en el grupo E2 en comparación con el

control se asocian a un aumento postprandial (pequeño pero significativo) que se da al

final del experimento, para el cual no tenemos una explicación plausible.

Teniendo en cuenta el papel de esta hormona en la saciación, la ausencia de aumentos

postprandiales en los grupos experimentales teóricamente haría que no se produjera

la señal anorexigénica que este péptido posee en base a estudios en los que se

administró periféricamente [223-225].

Por otro lado, la co-secreción de AMY con INS en proporción 1/100 [201,218], no se

corresponde con lo observado en el grupo control (en que esta relación fue 0.05) ni en

los grupos experimentales (0.09 y 0.08 en los grupos E2 y E1, respectivamente).Se

desconocen las causas de la no correspondencia con la literatura científica; respecto a

nuestro experimento, la diferencia en la relación AMY/INS entre el grupo control y los

grupos experimentales posiblemente se deba a la emulsión (ingrediente funcional),

que es la única variable que se modificó entre dichos grupos.

La concentración plasmática basal de GIP en el grupo control fue de 27.4±5.56 pg/ml,

la cual es similar a la encontrada en la bibliografía, que se sitúa en torno a 20-50 pg/ml

en ratas [218,335]. El perfil temporal de respuesta al alimento en este grupo (ver Fig.

227 Discusión

16), fue similar al descrito por Kindel et al. [335], aunque la caída desde el pico

máximo fue menos acusada en dicho estudio en comparación al nuestro. Las ratas del

citado estudio tenían 6 semanas más de edad, lo que seguramente no sea un factor a

tener en cuenta, ya que no se conoce que exista una influencia de la edad en la

secreción de GIP en ratas normopeso. En humanos, la edad tampoco influye en la

concentración plasmática de este péptido, ni en condiciones de ayuno ni en respuesta

a un OGTT [749].

Las dietas experimentales (conteniendo las emulsiones E1 y E2) también inducen una

respuesta significativa al alimento. Además, la secreción total (AUC) es

significativamente superior en los dos grupos experimentales en comparación con el

control. En roedores se ha observado que los triglicéridos y los FFA estimulan tanto la

liberación de INS como de GIP [115,117,331]. Por otro lado los monoglicéridos (como

la 1-monooleína) y los DG disminuyen la secreción de GIP e INS [331]. Es posible que

cambios en las proporciones de los diferentes productos de la digestión de la grasa

presentes en la luz intestinal puedan explicar el comportamiento del GIP en los grupos

experimentales, aunque con la información disponible no se puede ofrecer una

explicación más concreta.

En relación a la ingesta, el aumento de la secreción de este péptido no afectaría en

principio a la ingesta a corto ni a largo plazo en roedores con normopeso [342,343],

pudiendo influir de forma positiva sobre el anabolismo lipídico [349], hecho que hay

que comprobar si se produce a largo plazo y que en principio sería de relevancia, ya

que el objetivo de estas emulsiones es disminuir el BW y por tanto los depósitos de

grasa.

En nuestras condiciones experimentales, la concentración plasmática basal en el grupo

control para el GLP-1 fue de 83±7 pg/ml, similar a la observada por Reimer et al. [730]

y Zhao et al. [744], que osciló en torno a 60±20 pg/ml. Respecto a la respuesta

postprandial en comparación con lo descrito por Reimer et al. [730], para un OGTT (2

g/kg). Estos autores no encuentran ninguna elevación postprandial, manteniéndose

las concentraciones en torno a 40-60 pg/ml. En nuestro estudio las concentraciones

228 Discusión

medias del péptido en el periodo postprandial del grupo control se situaron alrededor

de 70-90 pg/ml, valores ligeramente superiores a los comentados [730].

No se puede asegurar con certeza el incremento (no significativo) al final del

experimento en el grupo E2, pudiéndose especular alguna hipótesis como una

estimulación tardía debido a ácidos grasos que alcanzan las partes distales del

intestino como consecuencia de que las emulsiones favorecen este hecho, que

estimularían al GLP-1 [116,750,751].

En ayunas, la concentración plasmática de GRN en el grupo control fue de 84±14.3

pg/ml, semejante a la referida por Ghanbari-Niaki et al. [435], aunque muy inferior a la

observada en las ratas del estudio de Zhao et al. [744] que fue de aproximadamente

190 pg/ml. La diferencia con el segundo estudio citado puede radicar en el tiempo de

ayuno, que es de 48 horas en comparación con las 36 horas de nuestro estudio,

habiéndose descrito una correlación lineal positiva entre tiempo de ayuno y

concentraciones circulantes de ghrelina [752]. Por otro lado, la disminución que se

produce en nuestro grupo control en repuesta a la comida se asemeja a la de otros

estudios como el de Reimer et al. [730], aunque ellos sólo miden el péptido hasta los

90 minutos tras la ingestión de alimento y no observan una recuperación de los niveles

basales, hecho que si ocurre en nuestro caso a partir de los 60 minutos.

Cuando comparamos el perfil postprandial del grupo control frente a los grupos

experimentales (E1 y E2) se observa que la caída inicial tras la comida se prolonga

hasta los 60 minutos en el primero y sólo hasta los 30 minutos en los dos últimos. El

descenso más prolongado en el grupo control teóricamente redundaría en una

saciedad más mantenida en el tiempo, aunque dicha asunción se basa en los

resultados de trabajos en humanos a los que se administró GRN exógena [440].

La insulinemia basal en estudios similares al nuestro [218,335] se encuentra alrededor

de 1000-1500 pg/ml, lo que coincide con los valores que hemos obtenido en el grupo

control. La respuesta a la comida en el citado grupo es comparable a la encontrada por

Kindel et al. [335] y Shin et al. [218] en sus investigaciones, por lo que se puede asumir

que la respuesta es la normal para estas ratas.

229 Discusión

Tanto en el grupo E1 como en el E2 las concentraciones basales de INS se encuentran

significativamente disminuidas respecto al grupo control. No tenemos una explicación

para dicho comportamiento ya que no se ha encontrado bibliografía relacionada. A

priori, un menor valor de INS en ayunas en los grupos experimentales (E1 y E2) podría

contribuir a un aumento de la ingesta a largo plazo si tenemos en cuenta el papel de

dicha hormona como señal anorexigénica a nivel central [481].

En lo referente a la hormona LEP, su concentración basal fue de 1375±184 pg/ml en el

grupo control, mayor que la que dan autores como Yavuz et al. [753] (780±120 ng/ml).

Aparentemente esta diferencia no se debe al peso de los animales, ya que las ratas de

Yavuz y colaboradores [753] pesan de hecho algo más que las nuestras, por lo que

posiblemente haya que buscar la causa en el método de medida. Aunque en la

publicación [753] no se menciona, un hipotético empleo de RIA para medir la LEP en

las muestras de plasma podría resultar en mayores valores plasmáticos, ya que

generalmente este método posee una mayor sensibilidad que el utilizado por

nosotros. Este trabajo [753] es el único con el que se pueden comparar nuestros

resultados, ya que el resto de bibliografía encontrada difiere mucho en los valores de

BW y, por tanto, en la masa grasa de los animales, siendo esto último un factor

determinante de las concentraciones plasmáticas de esta hormona. Respecto a la

respuesta postprandial de LEP, la bibliografía para ratas con este rango de peso es

nula, pudiéndose comentar que en ratas de 600 g de peso se produce un aumento

significativo a los 30 minutos, estando la concentración plasmática de LEP en un rango

de valores de hasta más de tres veces mayores que los nuestros [730].

Hay que destacar que las concentraciones en ayunas de LEP en nuestros grupos

experimentales (E1 y E2) fueron significativamente menores que las del grupo control,

lo cual probablemente no se pueda asociar a una menor cantidad de grasa corporal en

los grupos experimentales [570,571], ya que ha transcurrido muy poco tiempo desde

que están tomando la dieta.

Hemos observado que existe respuesta al alimento en nuestros tres grupos de estudio,

aunque en el grupo control se encuentra retrasada en el tiempo. Este hecho hace más

complejo el poder explicar el efecto que las emulsiones E1 y E2 tienen sobre la

230 Discusión

secreción de esta hormona. Por último, las dietas experimentales no afectan a la

secreción total de LEP (AUC) respecto al control.

En definitiva, la menor leptinemia en ayunas en los grupos E1 y E2 (con significación

estadística para el grupo E2) redundaría en una menor señal anorexigénica a largo

plazo en comparación con el grupo C, haciendo aumentar la ingesta de los grupos

experimentales (especialmente E2). Por otro lado, la respuesta postprandial

significativa (y más temprana) observada en estos últimos podría quizás tener el

efecto contrario, aunque dicho efecto no está del todo claro y únicamente se ha

podido estudiar tras administración exógena de la hormona [602].

La concentración basal de PP en el grupo control (19.6±2 pg/ml) es semejante a la

referida en el único estudio comparable encontrado en la literatura científica, que fue

de 18±2 pg/ml (Zhao et al. [744]). Cabe destacar en lo referente a este péptido la

ausencia de estudios que examinen su respuesta postprandial en ratas; solamente

hemos encontrado un trabajo en el que administran una suplemento nutricional por

vía intragástrica y describen un aumento postprandial a partir de los 15 minutos de

dicha administración [754]. Dado el componente nervioso que tiene la respuesta

postprandial del PP [507,508], el hecho de que nuestra primera muestra postprandial

se tomara a los 30 minutos desde el inicio de la comida podría haber enmascarado la

posible respuesta al alimento. En humanos se suele producir un aumento significativo

a los 15 minutos y un descenso acusado en los siguientes 15 minutos para luego

decrecer paulatinamente [248,283].

No hemos hallado, en los distintos tiempos del periodo postprandial, diferencias

significativas entre los grupos E1 o E2 con respecto al control, siendo además el patrón

temporal de respuesta a la comida similar en E1 y control, mientras que en el grupo

E2, la ingestión de alimento produce un aumento (no significativo) en el minuto 30,

posiblemente responsable de que la secreción total (AUC) de PP en E2 sea mayor

(P<0.05) respecto al control, con valores intermedios en el grupo E1. Una mayor

secreción total de PP teóricamente se asociaría a un efecto anorexigénico, el cual no

se traduce en una disminución de la ingesta como se ha descrito antes.

231 Discusión

La concentración basal de PYY en plasma en nuestras ratas control fue de 35.7±2.2

pg/ml, que es ligeramente menor a la obtenida por Zhao et al. [744] y Shin et al. [218],

que encuentran unas concentraciones en torno a 50 pg/ml, siendo en el primero las

condiciones experimentales muy similares a las de nuestro estudio y en el segundo la

única diferencia es la cepa de ratas (Sprague Dawley). No podemos, por tanto,

justificar la falta de concordancia entre nuestros datos y los de Zhao et al. [744]. Por

otro lado, la respuesta a la comida en el estudio de Shin et al. [218] no fue

significativa, lo mismo que ocurre con el grupo control en nuestro caso.

Tras la comida, las concentraciones plasmáticas de PYY se incrementan ligeramente en

ambos grupos experimentales (E1 y E2), aunque los valores solo se hacen significativos

frente al basal en el grupo E2 en el minuto 60. Aquí sí parece haber un efecto de las

emulsiones testadas, las cuales quizás posibilitan la llegada de más productos de

digestión de la grasa sin absorber al intestino distal, lo que se vería reflejado en el

aumento de las concentraciones de este GP. De hecho, la secreción total (AUC) es

superior en los dos grupos experimentales, aunque no se alcanza significación

estadística.

2.2. LARGO PLAZO

2.2.1. Ingesta

La ingesta media en el grupo control fue de 19.6±0.3 g/d y 68.3±1.1 kcal/d (alimento y

energía, respectivamente), similar a la publicada en los estudios de Reimer et al. [730]

y de Totani et al. [755], por lo que se puede considerar normal para esta especie y

cepa.

Como se mencionó en Resultados, ambas emulsiones producen un aumento en la

ingesta de alimento y energía, hecho que no se puede comparar con bibliografía

similar en roedores. Por otra parte, en humanos a los que se administra la emulsión

Olibra™ (ver apartado de Antecedentes) se observa, a diferencia de nosotros, una

menor ingesta de alimento [145,146] o no se produce modificación significativa

[147,148].

232 Discusión

Debido a que la composición y la densidad energética de las tres dietas es la misma,

excepto en lo que se refiere a las características fisicoquímicas de la grasa, podemos

atribuir este aumento en la ingesta en los grupos E1 y E2 o bien a cambios en la

palatabilidad o a una influencia sobre los factores que regulan la ingesta, lo que se

comentará más adelante.

2.2.2. Evolución ponderal

La evolución ponderal de los animales del grupo control se encuentra dentro del rango

normal para la rata Wistar alimentada con dieta AIN-93M [743,756].

El mayor BW observado en el grupo E1 durante la mayor parte del periodo

experimental se puede corresponder con el aumento de la ingesta de energía antes

mencionado. Sin embargo, y a diferencia de lo que sucede en el grupo E1, el BW de los

animales del grupo E2 es similar al control, a pesar de tener una ingesta energética

mayor que este último.

2.2.3. Peso corporal y de órganos al sacrificio

En nuestras condiciones experimentales, se observan diferencias significativas en el

peso de algunos órganos lo que puede atribuirse a la variación normal entre los

individuos de una población y que no posee mayor relevancia.

2.2.4. Parámetros e índices de utilización nutricional de proteína y grasa

La ingesta de nitrógeno en el grupo control fue de 318.7±6.5 mg/d, valor que está por

debajo de los mostrados en el estudio de Lecumberri et al. [757] y Martín-Carrón et al.

[758], siendo estos de aproximadamente 425 y 409 mg/d, respectivamente. La

discrepancia con el primer trabajo [757] se puede deber al periodo de 21 días

muestreado frente a los 7 días del nuestro, y con el segundo [758] a pequeñas

diferencias en la composición de la dieta AIN-93M (relacionadas con el contenido en

almidón y el tipo de grasa), o en el contenido proteico de la caseína utilizada en las

dietas (más raramente).

En nuestro experimento a largo plazo en ratas normopeso, el CDA (digestibilidad de la

proteína) y el balance de nitrógeno se sitúan en 94.5±0.5% y 148±15.8 mg/d,

respectivamente. Si comparamos estos datos con los de Martín-Carrón et al. [758],

233 Discusión

que obtuvieron valores respectivos de 89.1±0.2% y 130±10 mg/d, vemos que nuestros

valores son mayores para ambos parámetros. Aunque no sabemos a qué pueden

deberse estas diferencias creemos que no tienen mucha relevancia, ya que en los dos

estudios los valores se mueven dentro de un rango muy alto. Por otra parte, no se han

encontrado datos comparables sobre la utilización metabólica de la proteína

expresada como nitrógeno retenido frente al absorbido (R/A).

En el grupo E1 se observa una digestibilidad proteica menor (P<0.05) que en el grupo

control, lo cual, de nuevo, no posee mayor significación biológica debido a que los

valores son muy altos y en este rango las diferencias no deberían suponer un factor a

tener en cuenta. El balance y el R/A son similares entre el grupo E1 y control, lo que

indica que la emulsión E1 no modifica la utilización metabólica de la proteína.

En el grupo E2 no se modifica la digestibilidad de proteína ni tampoco el balance de

nitrógeno respecto al control. Sí lo hace, de forma significativa, la retención de

nitrógeno en relación al absorbido (R/A), con menores valores en el grupo E2 que en el

control. Considerando que la rata en este periodo se encuentra en fase de

crecimiento, este hecho podría explicar la ausencia de diferencias en el BW entre estos

dos grupos, a pesar de una mayor ingesta en el grupo E2.

Con respecto a la utilización digestiva de la grasa, Martín-Carrón et al. [758] dan un

CDA de 94.1±0.8%, similar al obtenido por nosotros (95.9±0.6%) en el grupo C

(control).

En el grupo E1 la digestibilidad de la grasa es similar al grupo control, observándose en

el grupo E2 un aumento ligero (aunque significativo) de este parámetro en

comparación con el primero. De nuevo, el alto aprovechamiento digestivo de este

macronutriente en los tres grupos estudiados nos hace descartar una influencia

decisiva de este factor sobre la evolución del BW en el grupo E2.

2.2.5. Parámetros hematológicos y bioquímicos

El perfil hematológico de las ratas del grupo control está dentro de los valores

normales para una rata de la cepa Wistar de edad similar [733,759]. Para algunos

parámetros hematológicos se han encontrado de manera puntual diferencias entre los

234 Discusión

grupos. En principio dichas diferencias no se escapan del rango descrito en la

bibliografía [733,759].

En cuanto a la bioquímica plasmática, los valores observados en el grupo control

concuerdan con lo descrito por Aparicio et al. [760,761]. Ninguna de las emulsiones

administradas con las dietas experimentales (E1 y E2) induce cambios significativos en

los parámetros bioquímicos medidos en el experimento.

En comparación con otro estudio de Aparicio et al. [734], los niveles de colesterol en

hígado del grupo control son similares y los triglicéridos en este órgano son superiores

en nuestro caso. En el caso del estudio de Aparicio et al. se utiliza como fuente de

grasa aceite de oliva en contraste con el HOSO utilizado por nosotros. Esto contrasta

con lo observado en el estudio de Perona et al. [762], en el cual se observan valores

superiores de triglicéridos en hígado en el grupo que ingiere aceite de oliva con fuente

de grasa dietética respecto al que ingiere HOSO.

Hay que destacar que los triglicéridos presentes en hígado son significativamente

menores en los animales que ingieren las emulsiones que en los del grupo control, lo

que no es atribuible a la fuente de grasa, ya que en todos los grupos la fuente de grasa

en las dietas es HOSO.

2.2.6. Concentración plasmática de hormonas gastrointestinales

La concentración plasmática basal de AMY fue de 87.7±12.2 pg/ml en el grupo control,

superior a la que da Hallam (43.1±6.8 pg/ml) [743]. Esta diferencia puede deberse a la

edad de sus animales, que es de 22 semanas, frente a 16 semanas de los nuestros,

como ya discutimos anteriormente en el experimento I. Respecto al perfil de

respuesta a la ingesta de alimento del grupo control, es similar al descrito en el

estudio de Shin et al. [218].

La respuesta postprandial observada en el grupo control desaparece en ambos grupos

experimentales, lo que podría en parte contribuir a la mayor ingesta observada en los

animales de ambos grupos, ya que de acuerdo con la literatura [763], la acción

anorexígena de este péptido depende en gran medida de su aumento postprandial.

235 Discusión

Si comparamos el perfil de respuesta al alimento de esta hormona (ver Fig. 24) con el

de la INS (ver Fig. 25), ambas hormonas se comportan de igual forma, lo cual es lógico

teniendo en cuenta la co-secreción de ambas por las células beta pancreáticas [200].

Además, la proporción AMY/INS en los grupos experimentales es similar a la que estos

mismos grupos mostraron en el experimento a corto plazo (I), no siendo así en el caso

del grupo control, donde la relación está aumentada en este experimento (largo plazo,

0.08) en comparación al anterior (corto plazo, 0.05). En principio, la única variable a la

que esto se puede atribuir es a la diferencia de edad entre los animales, aunque no

tenemos datos de otros autores que hayan descrito este hecho.

La concentración plasmática de CCK en ayunas para el grupo control fue de 75±13

pg/ml, similar a la descrita por Katanyutanon et al. [272]. Los cambios producidos en

este grupo tras la ingestión de alimento únicamente se pueden cotejar con los datos

aportados por Forssten et al. [764], que miden las concentraciones plasmáticas de

este péptido gastrointestinal a los 180, 300 y 480 minutos tras la administración de un

producto lácteo. En dicho estudio observan una respuesta a los 180 minutos de

aproximadamente 75 pg/ml, la cual contrasta con la de nuestro estudio que fue de

106±5 pg/ml. Esta discordancia se puede deber al patrón temporal de toma de

muestras.

En comparación con el grupo control, los animales que ingieren la emulsión E1

presentan mayores concentraciones plasmáticas basales de esta hormona y no

muestran respuesta a la comida. Por otra parte, en el grupo que recibió la emulsión E2

se observan mayores valores de ayunas, igual que en E1, junto con una respuesta

postprandial transitoria.

Ambas emulsiones modifican tanto las concentraciones basales con la respuesta

postprandial. Esto podría deberse a factores relacionados con la naturaleza de la

emulsión como el tamaño de partícula o la accesibilidad de la lipasa para ejercer su

actividad, que pueden hacer que se liberen los FFA en distintas porciones del intestino,

lo que influye en la secreción de este péptido tal y como muestran los estudios de

Seimon et al. [142] y Maljaars et al. [143]. Además, Elrichmann et al. [765] observan

que la presencia de un inhibidor de la lipasa disminuye la secreción de CCK.

236 Discusión

El comportamiento de este péptido se relaciona con la cantidad de alimento ingerida

por los respectivos grupos, de forma que las dos emulsiones inducen aumentos en la

ingesta de alimento en comparación con el grupo control. Es decir, la no respuesta (o

la respuesta transitoria) postprandial de CCK en ambos grupos experimentales podría

justificar en parte la mayor ingesta de estos grupos, mientras que la respuesta

postprandial más marcada (y significativa) observada en el grupo control estaría

asociada con una mayor saciación y, en consecuencia, una menor ingesta en este

grupo. No obstante, habrá que considerar otros factores en lo que se refiere a la

evolución del BW, ya que la emulsión E1 incrementa el BW de forma paralela a la

mayor ingesta, mientras que esto no ocurre en el grupo E2.

La concentración plasmática basal de GIP en el grupo control mostró un valor de

39±5.1 pg/ml, el cual se asemeja a la que figura en el estudio de Kindel et al. [335],

siendo inferior al valor comunicado por Gniuli et al. [766] (100 pg/ml). En cuanto a la

respuesta a la ingesta de alimento del grupo control, fue comparable a la descrita por

Shin et al. [218] y más marcada que la que encuentran Gniuli et al. [766], aunque esto

último es lógico si tenemos en cuenta que la respuesta de este péptido a una dieta

que contiene grasa y carbohidratos es mayor que cuando solo se ingieren

carbohidratos [327], como es el caso del citado trabajo [766] .

Nuestros datos ponen de manifiesto que la administración a largo plazo de las dietas

E1 y E2 tiene un profundo impacto sobre la secreción postprandial de GIP. Podemos

ver en la Fig. 24 que la respuesta de los grupos experimentales E1 y E2 es

sensiblemente menor o no existe si comparamos con el grupo control. Según nuestra

información, no se ha examinado hasta la fecha la influencia de distintos tipos de

emulsiones sobre la secreción de GIP y sus concentraciones circulantes. Es posible que

nuestros resultados se puedan explicar en base al diferente patrón de liberación de

FFA en los distintos segmentos intestinales con ambas emulsiones utilizadas.

La concentración plasmática en ayunas de GLP-1 fue de 63.6±5.9 pg/ml en el grupo

control, semejante a la que dan Le Roux et al. [376]. Respecto al periodo postprandial,

si comparamos con un estudio similar (Gniuli et al. [766]), se observa que como en

nuestro caso, no existe una respuesta significativa, lo que también se ha confirmado

237 Discusión

en otros estudios realizados en ratas [730,767]. Cabría resaltar que las

concentraciones de GLP-1 en el trabajo de Gniuli et al. [766] se mueven dentro de un

rango bastante inferior al nuestro (una tercera parte, aproximadamente), siendo en

principio la única diferencia destacable la cantidad y calidad de la grasa utilizada (3.2%

de grasa (p/p), de la cual 1.3% es tripalmitina frente a la nuestra, que fue 4% de girasol

alto oleico). El tipo de grasa puede quizás explicar las diferencias, ya que los ácidos

grasos monoinsaturados (mayoritarios en la grasa de nuestro estudio) [362] estimulan

la secreción de GLP-1 de forma más potente que los saturados y poliinsaturados. Es

posible que, aunque no haya una clara respuesta postprandial, la administración a

largo plazo de una dieta conteniendo ácido oleico (nuestra dieta control) haya hecho

que las concentraciones circulantes de GLP-1 en este grupo estén elevadas con

respecto a las descritas por autores como Gniuli et al. [766].

Cabe resaltar que, a largo plazo, la emulsión E1 claramente provoca la aparición de

mayores concentraciones plasmáticas de GLP-1, basales como postprandiales, sin que

se aprecie una respuesta significativa tras la ingesta de alimento. Las mayores

concentraciones de este péptido en plasma respecto al control se pueden deber a la

llegada de una mayor cantidad de ácidos grasos a los últimos segmentos del intestino

delgado, donde se libera este péptido [768]; a este efecto, además, contribuiría el

largo periodo de tiempo (10 semanas) que los animales están ingiriendo la emulsión

E1, puesto que no observamos nada similar en el experimento I (corto plazo).

Por el contrario, la emulsión E2 no modifica de forma ostensible las concentraciones

de esta hormona en sangre respecto al grupo control.

La concentración de GRN basal en el grupo control osciló alrededor de 80 pg/ml

(concretamente 79.5±16 pg/ml), siendo superior a la encontrada por Reimer et al.

(≈50 pg/ml) en animales de más edad y BW. Por el contrario, Englander et al. [426]

encuentran en ratas jóvenes concentraciones plasmáticas muy superiores a las

nuestras, aunque estos autores no especifican el tipo de GRN medida, con lo que

suponemos que debe de ser GRN total, mientras que nosotros medimos únicamente la

forma activa. En el estudio de Reimer et al. [730], la respuesta a una carga oral de

glucosa da lugar a una disminución significativa y acusada de la GRN en plasma hasta

238 Discusión

los 30 minutos, momento en el cual se estabilizan los valores. En nuestro caso no

observamos una disminución tras la comida, permaneciendo las concentraciones

similares a las basales hasta el final del ensayo. Sin embargo, debemos tener en cuenta

que Reimer et al. [730] estudian la respuesta a glucosa oral, monosacárido que

produce una importante respuesta supresora de esta hormona (en humanos) [420],

mientras que nosotros examinamos la respuesta a una dieta mixta.

Para este GP orexigénico, se ha observado una influencia en la secreción debido a

factores como el tipo de alimento [769], la osmolaridad de la dieta [770] o el hecho de

si la alimentación es ad limitum o con un periodo prefijado de acceso a la comida

[771]. En definitiva hay numerosas variables que pueden influir sobre la interpretación

de los resultados obtenidos.

Es de destacar que las concentraciones basales de GRN en ambos grupos

experimentales (E1 y E2) fueron significativamente superiores a las obtenidas en el

grupo control, lo que se puede relacionar de forma directa con la mayor ingesta

observada en dichos grupos.

Nuestro grupo control mostró una insulinemia en situación de ayunas de 1047±152

pg/ml, similar a la observada en otros estudios con condiciones parecidas (Kindel et al.

[335] y Reimer et al. [730]). La respuesta a la comida en el citado grupo es, no

obstante, más marcada que la referida por Kindel et al. [335] (a pesar de que estos

autores realizan un test de glucosa) y similar a la descrita por Reimer et al. [730].

La respuesta postprandial observada en el grupo E1 fue similar a la del grupo control,

en tanto que en el grupo E2 encontramos una disminución de la respuesta global a la

ingesta de alimento (únicamente significativa en el minuto 15). Dicha disminución

queda reflejada de forma clara en la secreción total de INS (AUC). Estudios con

infusión de lípidos en distintos segmentos intestinales han mostrado que estos pueden

interferir con la absorción de glucosa [772]. Así, cabe sugerir que diferencias en la

liberación de FFA desde las emulsiones o en la cantidad de estos que alcanzan el

intestino distal podrían ser responsables de la menor respuesta insulínica a la comida

en los grupos experimentales, especialmente E2.

239 Discusión

El patrón de secreción de esta hormona en este experimento (II, largo plazo) se

relaciona de forma directa con el de AMY y GIP, hecho que es lógico debido a la

relación funcional entre ellos mencionada en secciones previas de esta Memoria.

Al comienzo del ensayo, en ayunas, la concentración plasmática de LEP alcanzó valores

en torno a 5635±714 pg/ml en el grupo control, coincidiendo con lo observado en el

trabajo de Benatti et al. [773] (ratas alimentadas con un pienso comercial y utilizando

RIA como método de análisis) y con el de Reimer et al. [730] (a pesar de la comentada

diferencia de edad y BW). Los últimos autores [730] encontraron un aumento acusado

a los 30 minutos tras la ingestión de alimento, cuando en nuestro ensayo, el aumento

se produce al final del periodo postprandial (120 minutos).

Curiosamente, esta respuesta de la LEP al alimento que encontramos en el grupo

control desaparece en los grupos experimentales, hecho que no se ha descrito en la

bibliografía en el caso de ratas. En humanos existe gran controversia sobre la

existencia, o no, de aumentos postprandiales de LEP tras la ingestión de dietas mixtas

[573,774].

Además, se sigue mantenido la correlación entre las concentraciones sanguíneas de

INS y LEP, como ocurría en el experimento a corto plazo, quedando más patente si

observamos las AUC de ambas hormonas. También se ha postulado que la secreción

postprandial de LEP se ve favorecida por la respuesta insulínica, especialmente tras

comidas ricas en sacarosa [775,776].

La concentración basal de PP en el grupo control fue de 37±3.2 pg/ml, similar a la

observada en los estudios de Havel et al. [777] y Akpan et al. [527]. Como se comentó

anteriormente, no hemos encontrado en la literatura científica referencia alguna

sobre estudios en ratas que examinen la respuesta del PP a la ingesta oral de alimento,

aunque los datos en otros roedores y en humanos revelan un comportamiento

bifásico con un pico a los 15-30 minutos el cual se normaliza para volver a elevarse de

forma menos pronunciada y sostenida en las siguientes 4 a 6 horas [514,515]. En

nuestro grupo control solo hemos detectado un ligero aumento (no significativo) en el

tiempo 15 minutos, aunque como dijimos en páginas anteriores (ver discusión del

240 Discusión

Experimento I) nuestro patrón temporal de recogida de muestras de sangre podría

haber enmascarado una posible respuesta al alimento

La ingesta a largo plazo de dietas conteniendo las emulsiones E1 y E2 se asocia a

menores concentraciones de PP tanto basales como postprandiales, aunque sin

respuesta a la comida en ningún caso. Como dijimos en páginas anteriores (ver

discusión del Experimento I), nuestro patrón temporal de recogida de muestras de

sangre podría haber enmascarado una posible respuesta al alimento. Probablemente

la modificación de las propiedades fisicoquímicas de la grasa en las dietas E1 y E2

(emulsionada) pueda también explicar las diferencias entre las concentraciones

plasmáticas del péptido en los dos grupos experimentales respecto al control.

En condiciones basales, la concentración de PYY se situó en valores de 49.6±3.1 pg/ml

en el grupo control, algo inferior a la encontrada por Le Roux et al. [376], lo que puede

deberse a su utilización de RIA para la determinación de este péptido. No se observa,

en nuestro caso ni en el estudio de Reimer et al. [730], una respuesta postprandial

evidente, al igual que se ha indicado en humanos, en los que se produce un aumento

gradual de la concentración plasmática, alcanzando un máximo a las 2 horas de la

ingestión de alimento [547]. Además, la respuesta postprandial de PYY parece ser

proporcional a la ingesta calórica [778], y en nuestros estudios de ayunas-postprandial

la ingesta era pequeña, ya que se retiraba la comida a los animales a los 15 minutos.

En cualquier caso, las concentraciones (tanto basales como en respuesta al alimento)

son superiores en el grupo E1 respecto al control y E2. Este comportamiento en el

grupo E1 puede deberse a la llegada, de forma continua a lo largo de 10 semanas, de

mayores cantidades de ácidos grasos a porciones distales del intestino delgado, lo que

produciría mayores tasas de secreción de PYY [111], hecho que coincide con lo dicho

anteriormente para el GLP-1 [116,750,751] y que es totalmente razonable debido a

que ambos péptidos se liberan en el mismo segmento intestinal y se ha descrito que

en parte se co-secretan [314] por la misma célula.

241 Discusión

3. EXPERIMENTOS EN RATAS OBESAS

3.1. Modelo de obesidad

Basándonos en la revisión de Buettner et al. [165], no existe un consenso sobre el

periodo y dieta más adecuada para la inducción de obesidad en ratas. En dicha

revisión se concluye que existen cambios significativos en parámetros cruciales como

el BW, insulinemia y leptinemia desde la tercera semana con una dieta que contiene

como mínimo un 45% de las kilocalorías en forma de grasa. Teniendo en cuenta esta

recomendación, se estimó un tiempo de 9 semanas y una dieta con un 60% de las kcal

en forma de grasa como adecuados para inducir obesidad en nuestros animales.

La ingesta de las ratas durante el periodo de inducción de obesidad fue ligeramente

superior a la observada en el estudio de Xu et al. [756] y algo inferior en comparación

al estudio de So et al. [779], utilizándose en estos dos últimos la misma dieta que la

empleada por nosotros. La evolución ponderal en nuestros animales es similar a la que

se recoge en los estudios antes citados [756,779], por lo que las ligeras diferencias

observadas en la ingesta no parecen influir en la ganancia de peso de los animales.

En base a estos dos parámetros, consideramos que nuestro modelo de inducción de

obesidad es correcto y se encuentra dentro de la normalidad observada en la

bibliografía [756,779].

3.2. Experimento con ratas obesas

3.2.1. Ingesta

Tras el periodo de inducción de obesidad, nuestros datos muestran que existe un

periodo de adaptación de 2 semanas a las dietas AIN-93M, durante el cual las ratas

adecúan su ingesta a la nueva densidad calórica de la dieta, que es mucho menor que

la anterior. No se han encontrado estudios anteriores que tengan un diseño

experimental parecido al nuestro. Si comparamos la ingesta energética a partir de

nuestra 3ª semana experimental con la descrita por Reimer et al. [596], que alimentan

ratas normopeso con AIN-93, y nos fijamos en el mismo periodo de edad que tienen

242 Discusión

nuestros animales, los valores están en un rango de 80-100 kcal/día y el nuestro en 65-

73 kcal/día, diferencias que creemos poco relevantes.

La presencia en la dieta de las emulsiones E1 y E3 no modificó el patrón de ingesta de

alimento en estos animales, aunque hubo diferencias puntuales en las 2 últimas

semanas. Esta situación contrasta con la observada para el grupo E1 normopeso en el

experimento a largo plazo (II), el cual presenta una ingesta de alimento superior al

grupo control durante la mayor parte del periodo experimental.

3.2.2. Evolución ponderal

La evolución ponderal del periodo de inducción de obesidad como hemos visto fue la

normal para este modelo [756,779], existiendo posteriormente tras el paso a la dieta

experimental una pequeña disminución de peso relacionado con la adaptación a la

dieta. No existe bibliografía que muestre la evolución ponderal después de la

inducción de obesidad de forma exacta a nuestro modelo, aunque si comparamos con

las curvas de peso de ratas Wistar alimentadas con dieta estándar se puede observar

que los pesos mostrados en nuestro experimento se sitúan ligeramente por encima y

se van acercando hasta que se igualan [746].

3.3. Parámetros e índices de utilización nutricional de proteína

y grasa

No se han encontrado estudios que nos permitan comparar parámetros de utilización

digestiva y metabólica en este modelo de rata obesa. Nuestros datos no revelan

ningún efecto destacable de la emulsión E1, con la excepción del CDA de proteína y

grasa, aunque no consideramos esto como algo especialmente resaltable ya que en

ambos casos se supera el 90%, encontrándose en el rango normal para este tipo de

roedores.

Más adelante se analizarán las diferencias con el experimento a largo plazo realizado

en animales normopeso (II).

243 Discusión

3.4. Parámetros hematológicos y bioquímicos

Si comparamos nuestros resultados con los del artículo de Artiss et al. [780], en el cual

se utilizó para inducir obesidad una dieta con el 40% de kcal en forma de grasa

durante 6 semanas, observamos que los valores de triglicéridos y colesterol total en

plasma son semejantes a los de nuestro estudio. En comparación con el estudio de

Reimer et al. [781], ambos parámetros son superiores en nuestro caso

(probablemente de forma significativa), aunque quizás la diferencia se justifica en

parte en que estos autores [781] emplean ratas con obesidad genética. De cualquier

forma, los parámetros bioquímicos determinados en nuestro muestran valores

significativamente superiores en los animales del experimento III (obesas) que II

(normopeso), lo cual indica que a pesar de haber estado durante 10 semanas

ingiriendo dietas AIN-93M, las ratas obesas todavía no han vuelto a la normalidad al

final del estudio.

3.5. Concentración plasmática de hormonas gastrointestinales

Refiriéndonos a los GP y hormonas estudiadas, hay que comentar que la mayoría de la

bibliografía encontrada, que se irá citando en lo sucesivo, se centra en los cambios que

ocurren en los animales durante o inmediatamente después de la inducción de

obesidad, siempre en comparación con sus respectivos controles con dietas estándar.

Nuestros resultados solo pueden ser comparables con los de dichos artículos en el

sentido examinar si la administración durante 10 semanas de dietas estándar (AIN-

93M) modifican las concentraciones de péptidos y hormonas con respecto al estado

de obesidad. En definitiva, la existencia de diferencias entre nuestros resultados y los

encontrados en la bibliografía podría achacarse a nuestro modelo de intervención,

puesto que la determinación de las concentraciones plasmáticas de las hormonas y

péptidos tuvo lugar al final de las 10 semanas de periodo experimental.

A lo anterior hay que añadir que se han encontrado escasos trabajos con un modelo

de inducción de obesidad similar al utilizado por nosotros, en los que además se

estudien los perfiles de estas hormonas y péptidos tanto en ayunas como,

especialmente, en respuesta a la comida. En definitiva, estamos convencidos de que

los estudios realizados en los próximos años se asemejarán a nuestro modelo, ya que

244 Discusión

éste refleja la realidad de una típica intervención nutricional llevada a cabo en un

individuo obeso y coadyuvada con un producto funcional que maximice la eficacia de

la dieta. Todo esto hace que consideremos nuestros resultados como bastante

novedosos.

La concentración basal de AMY en el grupo control fue de 266.4±32.1 pg/ml, valor

semejante al observado en ratas obesas genéticas (Zucker) alimentadas durante 12

semanas con una dieta que contiene el 60% de Kcal en forma de grasa[782], por lo que

parece que para esta hormona no ha habido un cambio en los valores observados en

la obesidad tras las 10 semanas del periodo experimental. Hay que añadir que Boyle et

al. [242], observan una correlación entre el peso del animal y la concentración

circulante de esta hormona, aunque otros autores como Shin et al. [218] no

encuentran diferencias en entre ratas obesas y normopeso [218]. En niños obesos se

observan incrementos en la AMY plasmática de hasta tres veces en comparación con

los delgados [783]. Además en este estudio se observa que la pérdida de peso se

relaciona con una recuperación de las concentraciones de este péptido observadas en

sujetos normopeso [783]. Nuestros resultados en ratas normopeso y obesas sugieren

que la inducción de obesidad por una dieta rica en grasa causó una elevación en la

AMY circulante que no disminuyó tras la ingesta durante 10 semanas de una dieta

estándar, probablemente porque no se produjo en nuestro caso una reducción en el

BW de los animales (Figura 31). En relación con la respuesta al alimento, Shin et al.

[218] refieren una respuesta a los 10 minutos, lo que contrasta con nuestro estudio

donde no se observa respuesta postprandial significativa. Además, comparado con lo

que ocurre en nuestros animales normopeso tratados a largo plazo (experimento II),

en los obesos se produce una pérdida de respuesta al alimento, lo que contrasta con el

estudio de Shin et al. [218], en el cual la respuesta fue similar en ratas delgadas y

obesas.

En el caso de los grupos E1 y E3, no se ve una influencia de las correspondientes dietas

experimentales sobre la concentración basal de AMY. Tampoco aparecen, en ninguno

de estos dos grupos, aumentos significativos tras la comida. Ligeros cambios durante

el periodo postprandial en los grupos hacen que, durante esta parte del ensayo, los

valores sean significativamente mayores en los animales del grupo E3 frente a los E1 a

245 Discusión

lo largo de la primera hora. Aunque tiene difícil explicación este hecho, puede

especularse con un posible papel de las diferencias en el proceso tecnológico utilizado

para obtener ambas emulsiones.

La proporción AMY/INS en este caso es de 0.19 en el grupo E1, 0.17 en el grupo E3 y

0.16 en el grupo control, las cuales difieren del experimento a corto y largo plazo, lo

que indica que las emulsiones han tenido un efecto sobre ambas hormonas, haciendo

que aumente la AMY en relación a la INS. Por otra parte, nuestros resultados sugieren

que la obesidad hace que aumente la proporción AMY/INS (debido al aumento de

AMY respecto a INS), lo cual no se ha descrito hasta el momento en ratas,

observándose por el contrario en humanos que esta proporción disminuye

ligeramente [784].

La concentración basal de CCK fue de 89±10 pg/ml en el grupo control. Las

investigaciones de Li et al. [785] dan como resultado una concentración de 180±30

pg/ml en ratas con obesidad inducida por una dieta alta en grasa y 86.30 pg/ml en el

grupo control, valor que es similar al nuestro. Esto nos lleva a pensar que los valores

de CCK en ayunas se ven más influenciados por los niveles de grasa en la dieta que por

el estado obeso, lo que coincide con otros autores [786]. Además, el que nuestros

valores de CCK en plasma se asemejen más al grupo control normopeso cordel estudio

de Li et al. [785], nos da indicios de que ha habido una recuperación de los valores

normales de CCK tras alimentadas nuestras ratas obesas con una dieta estándar. Por

otra parte, en nuestras condiciones experimentales no se aprecia en el grupo control

una respuesta significativa al alimento, la cual si aparece en el estudio de Guilmeau et

al. [787] en ratas Zucker obesas genéticas. De nuevo, las diferencias en los diseños

experimentales podrían explicar la ausencia de respuesta a la comida en nuestras

ratas obesas tras 10 semanas de periodo experimental.

Ni las concentraciones de CCK basales ni las postprandiales muestran diferencias

significativas entre los tres grupos (E1, E3 y control), lo cual parece apuntar que las

emulsiones no tienen ninguna influencia sobre la secreción de dicho péptido en ratas

obesas.

246 Discusión

Las concentración plasmática basal de GIP en el grupo control fue de 40.1±5.7 pg/ml,

en consonancia con la que dan Gniuli et al. (≈51 pg/ml) [766] y Shin et al. [218] (50-100

pg/ml), siendo en ambos casos ratas con obesidad inducida por la dieta. La respuesta

al alimento en ambos estudios ([766], [218]) en las ratas obesas es más acusada pero

menos mantenida en el tiempo que en nuestro ensayo, Esto puede estar relacionado

con el hecho de que ambos estudios emplean ratas obesas y en el nuestro las ratas

obesas llevan 10 semanas con dieta estándar, lo que puede haber influido en la

secreción de este péptido. No obstante, nuestra respuesta tampoco es como la de sus

ratas normopeso ([766], [218]), en las cuales la magnitud de la respuesta postprandial

es similar a la de sus ratas obesas pero moviéndose en un rango menor de

concentraciones plasmáticas.

Como ocurriera con la CCK, la obesidad (experimento III) hace desaparecer los efectos

diferenciales de las emulsiones sobre la secreción de GIP que sí vimos en ratas

normopeso (experimento II).

Respecto al GLP-1, la concentración basal en el grupo control fue de 143.8±22.6 pg/ml.

En ratas con inducción dietética de obesidad se observaron valores basales alrededor

de 50 pg/ml en el estudio de Shin et al. [218] y 16 pg/ml en el Pyra et al. [788]. Por

otro lado, en ratas Wistar obesas genéticas [789] y Zucker [790] se han referido

concentraciones basales de este péptido similares a nuestras ratas obesas (tras el

periodo de normalización de la dieta sin cambios en el BW). Estas últimas

observaciones, junto con los valores (más bajos) que encontramos en el grupo control

de ratas normopeso (experimento II) sugieren la ausencia de una recuperación de los

niveles de este péptido en nuestras ratas.

Los tratamientos experimentales (E1 y E3) no afectan a las concentraciones de GLP-1,

que son en todo momento similares a las del grupo control. De hecho, el efecto de la

emulsión E1 que pudimos observar en el experimento anterior (II), consistente en

mayores concentraciones de GLP-1 en comparación con los otros dos grupos,

desaparece en los animales obesos.

247 Discusión

En condiciones de ayunas, la concentración de GRN en plasma fue de 81.1±16.8 pg/ml

en el control, sensiblemente menores que los que encuentran Pyra et al. [788] y Shin

et al.[218], que se sitúan en torno a 226pg/ml y 250 pg/ml, respectivamente. La no

concordancia entre nuestro estudio y el primero [788] podemos atribuirla quizás a

diferencias en el modelo de inducción de obesidad, puesto que ellos utilizan una dieta

alta en grasa y sacarosa (HF/HS) durante 13 semanas, aunque autores como Lindqvist

et al. [791] encuentran menores concentraciones de GRN en ayunas tras una dieta

HF/HS al comparar con su correspondiente control. Respecto al estudio de Shin et al.

[218], sus ratas reciben la misma dieta que nosotros para inducir la obesidad, pero

ellos la administran durante aproximadamente 28 semanas. No obstante, estos

autores [218], al igual que otros [792] no ven diferencias entre las ratas normopeso y

las obesas. Es conveniente apuntar que las investigaciones realizadas en humanos

muestran, en términos generales, una disminución de la GRN plasmática en individuos

obesos [448). En nuestro caso, los valores obtenidos en ratas control normopeso

(Experimento II) y ratas control obesas (Experimento III) están dentro del mismo rango

(en torno a 75-80 pg/ml), aunque es difícil con nuestros datos precisar si se debe a que

no ha habido cambios o a que los valores han vuelto a la normalidad tras las 10

semanas consumiendo la dieta estándar. En cualquier caso, habría que puntualizar que

la metodología empleada en los últimos años para cuantificar la GRN en plasma

complica enormemente la comparación entre estudios, especialmente debido a que

algunos autores miden GRN total y otros GRN activa [218,730,793].

En nuestras condiciones experimentales, la inducción de la obesidad y posterior

alimentación durante 10 semanas con la dieta AIN-93M conteniendo emulsión E1 hace

que los valores basales de GRN se asemejen a los del grupo control, desapareciendo

las diferencias existentes entre estos dos grupos en las ratas normopeso (experimento

II). Por lo tanto, se observa que la obesidad hace que el efecto de la emulsión se

modifique.

La concentración plasmática basal de INS alcanzó valores de 1695±283 pg/ml en el

grupo control. La insulinemia en ratas con DIO varía desde 1000 pg/ml en el trabajo de

Shin et al. [218] a 1800 pg/ml en el estudio de Gniuli et al. [766], encontrándose por

tanto nuestros valores dentro de ese margen. No podemos asegurar si en nuestras

248 Discusión

ratas la insulinemia se encontraba más alta justo al terminar el periodo de inducción

de obesidad que al final de la experiencia (después de 10 semanas), tal y como han

confirmado Guo et al. [794] en ratones, aunque sí es probable, ya que los valores de

ayunas del grupo control en este experimento III (Figura 35) son superiores en

comparación con los correspondientes de nuestras ratas normopeso (Figura 25).

Es interesante resaltar que en el grupo control (ratas obesas que posteriormente

reciben durante 10 semanas la dieta estándar control) no hay respuesta en INS al

alimento, lo que quizás esté relacionado con el estado metabólico de estos animales.

De hecho, el test de tolerancia a glucosa oral (OGTT) realizado durante el periodo

experimental (Figura 33) muestra unas curvas que, junto con los elevados valores de

INS basales, indican una situación compatible con una resistencia a la INS y un cierto

grado de disfunción de la célula beta-pancreática [795,796]. Aun así, otros autores sí

observan respuesta insulínica a la comida y a glucosa oral (OGTT) en condiciones de

obesidad [797,798].

No aparecen diferencias significativas entre los tres grupos de estudio en ningún

momento a lo largo del periodo postprandial. Al igual que observamos en ratas

normopeso (exp. II), la concentración de INS durante el periodo postprandial fue

ligeramente superior en el grupo control que en el E1, sin alcanzarse tampoco

significación estadística.

La LEP presentó una concentración basal de 8982±540 pg/ml en el grupo control. En el

estudio de Li et al. [785], en el que la duración del periodo de inducción de obesidad

fue de 10 semanas con una dieta con un 45% de la energía en forma de grasa, se

observó una concentración basal de 5660±660 pg/ml en las ratas con predisposición a

la obesidad (DIO), de 3170±520 pg/ml en las resistentes a la inducción (DR) y de

2430±420 pg/ml en las control. Las diferencias con nuestros datos se deben, en el caso

de las resistentes y controles, a las diferencias en el BW existente entre los animales

(384 g en las DR y 410 g en el control frente a los 468 g de nuestras ratas obesas

control). Sin embargo, los valores plasmáticos de LEP en las DIO [785] son inferiores a

los obtenidos por nosotros para pesos muy similares (467 g frente a 468 g), lo que

quizás podría justificarse en base a diferencias en la composición corporal de las ratas

249 Discusión

por el mayor contenido en grasa de nuestra dieta obesogénica (60% de las kcal), en el

periodo de tiempo con la dieta estándar tras la inducción de la obesidad, en la edad de

los animales o en el método utilizado para medir la LEP en los estudios mencionados.

Guo et al. [794] observaron en ratones DIO con un posterior cambio a una dieta

estándar que la concentración plasmática de LEP no volvió a niveles considerados

“normales”, al menos a lo largo del periodo estudiado (19 semanas), lo que

probablemente coincide con la situación que ocurre en nuestras ratas.

Las emulsiones no afectaron a las concentraciones basales de esta hormona, al igual

que ocurría en las ratas normopeso en el experimento a largo plazo (II).

La emulsión E1 se asocia a una ausencia de respuesta a la comida (que sí se observa en

el grupo control), lo mismo que ocurría en nuestras ratas normopeso (experimento II),

hecho del que no existe bibliografía relacionada. Existen algunas diferencias

significativas puntuales (a los 30 y 120 minutos) entre los grupos control y E1, que

posiblemente no tengan especial relevancia.

En general hemos encontrado concentraciones superiores de esta hormona en ratas

obesas en comparación a las normopeso, lo cual es lógico teniendo en cuenta la

diferencia en la cantidad de grasa corporal debido tanto a la inducción previa de la

obesidad como a la edad de los animales.

La concentración basal de PP osciló en torno a los 37 pg/ml (37.6±5.1pg/ml) en el

grupo control. En relación a la bibliografía disponible, no se han encontrado trabajos

que midan concentraciones basales o postprandiales de PP en ratas con obesidad

inducida por la dieta. Se puede comparar con los valores observados en ratas

normopeso [527,777] y con nuestras propias ratas del segundo experimento, lo que

pone de manifiesto la existencia de concentraciones semejantes, tanto en ayunas

como en respuesta al alimento. En principio el comportamiento observado parece no

coincidir con lo descrito en humanos (ver sección de Antecedentes).

En cualquier caso, parece que la obesidad hace que desaparezca la ligera respuesta a

la comida observada en el grupo control, así como las diferencias entre los grupos de

estudio.

250 Discusión

En situación de ayunas, la concentración plasmática de PYY alcanzó valores de

65.1±10.2 pg/ml en el grupo control, semejante a la observada en las ratas obesas de

los estudios de Shin et al. [218] y Li et al. [785]. Además, coincidimos con ambos

autores en la ausencia de diferencias significativas en las concentraciones basales de

este péptido entre animales obesos y normopeso. Por ello creemos que, tal y como

han descrito otros autores, la secreción de este péptido depende más de la cantidad

de grasa presente en la dieta que del BW. Además, aunque los modelos

experimentales no son iguales, nuestros resultados coinciden con los de Shin et al.

[218] en que no hay en ningún caso respuesta al alimento. Esto parece indicar que las

concentraciones de este péptido en ratas no se modifican de forma significativa con la

obesidad.

En general, tanto los valores basales como los obtenidos en respuesta a la comida no

se ven afectados por las emulsiones (E1 y E3) respecto al grupo control, aunque las

concentraciones tienden a ser ligeramente mayores en el grupo E3.

4. COMPARACIÓN ENTRE RATAS NORMOPESO DE LA EXPERIMENTO A CORTO PLAZO Y A LARGO PLAZO

Si comparamos la ingesta del grupo control en el periodo equivalente entre el

experimento a corto plazo y el de largo plazo, se observa que en el primero los

animales ingieren una cantidad mayor de alimento en comparación con el segundo,

tendiéndose a igualar al final de esa semana, y ocurriendo algo similar con la evolución

ponderal, lo cual no tiene gran relevancia debido a que ambos se encuentran en los

rangos normales para esta cepa según la bibliografía anteriormente comentada

[730,735,736,755].

Los índices de digestibilidad de la proteína se sitúan en un rango de 93-94%, siendo las

diferencias entre los dos experimentos (I y II) muy pequeñas para ser consideradas de

importancia. Por otro lado, el índice R/A revela una mayor retención de nitrógeno en

las ratas de la experiencia a corto plazo (I), lo que a priori coincide con lo observado en

este animal por otros autores [799], que han mostrado una disminución del balance

251 Discusión

de nitrógeno con la edad (aunque son ratas mayores que las nuestras). Observaciones

en el mismo sentido se han hecho en otras especies, como el ternero [800].

Analizando de forma global las concentraciones plasmáticas de péptidos

gastrointestinales y hormonas encontradas en el grupo control en las dos experiencias

realizadas a corto (I) y largo (II) plazo observamos que:

- Las concentraciones en ayunas en las ratas del grupo control fueron

semejantes en el caso de la AMY, GIP, GLP-1, GRN e INS. Las concentraciones

de LEP fueron, sin embargo, superiores en los animales de la experiencia a

largo plazo (II), lo que está relacionado con la mayor masa grasa corporal que

por razones de edad deben de poseer los animales de dicha experiencia en

comparación con la primera [570,801]. Por otro lado, también encontramos

concentraciones plasmáticas basales superiores de PP y PYY en la experiencia

a largo plazo (II). Respecto al PYY, no se ha visto en humanos un aumento de la

secreción con la edad [545], aunque en ratas sí se ha descrito un aumento del

número de células productoras de dicho péptido [802]; respecto al PP, sí hay

estudios, al menos en humanos, que confirman la existencia de aumentos de

su concentración en plasma con la edad [517,518].

- Comparando la respuesta postprandial entre el grupo control a corto y largo

plazo, encontramos que en el segundo caso (II) existe una mayor respuesta al

alimento para INS, GIP, y AMY, estando las dos últimas relacionadas en

roedores con la cantidad de energía ingerida [204,315,316,803], y también en

humanos en el caso de la INS [804,805]. Estos cambios pueden estar

relacionados con diferencias en la cantidad de alimento ingerido durante el

tiempo que se les facilita comida en los ensayos de ayunas/postprandial.

Además, también puede haber una influencia de la edad sobre GIP e INS,

puesto que se ha visto una mayor respuesta con la edad en humanos

[369,749] en el caso del primero, y en ratones, en el caso de la segunda

[806,807]. Respecto a la AMY, sólo se ha observado una disminución en los

individuos de mediana edad comparado con los jóvenes. Además, como se ha

mencionado en secciones previas, INS, AMY y GIP se relacionan entre sí

[201,315], por lo que unos pueden influir en el aumento de otros. Por último,

252 Discusión

el típico descenso postprandial de la GRN plasmática, muy obvio en el grupo

control de la experiencia I, no se observa en los animales de mayor edad, lo

que concuerda con lo que ocurre en humanos [591], existiendo gran

controversia sobre este aspecto en los roedores [426,808].

Cuando analizamos las concentraciones de péptidos y hormonas en los animales del

grupo E1 de ambas experiencias, encontramos lo siguiente:

- En el caso de AMY, GLP-1, GRN, LEP y PP, se observan diferencias significativas

en las concentraciones basales entre la experiencia a corto (I) y largo (II) plazo,

con mayores valores en la segunda. Para la LEP podemos argumentar que el

incremento se debe al aumento en la masa grasa de los animales por la mayor

edad [809]. En el caso del PP se desconoce la causa, pudiendo deberse al

propio aumento observado con la edad, como se ha visto en humanos

[517,518]. En el resto de péptidos (AMY, GLP-1 y GRN) los cambios observados

podemos únicamente atribuirlos al efecto acumulativo que habría tenido la

ingesta de la dieta con emulsión E1 de forma continuada durante 10 semanas

(largo plazo).

- En el experimento II, la respuesta a la comida se atenúa en el caso del GIP y

desaparece en la GRN y LEP. En el GIP, este efecto podría relacionarse con el

hecho de que las emulsiones lipídicas pueden interferir con la absorción

intestinal de carbohidratos, que son el principal estímulo para la liberación de

esta péptido [327], aunque es sólo una hipótesis que no se ha estudiado. En el

caso de la GRN, el comportamiento del grupo E1 en el experimento II se podría

explicar de la misma forma que lo hemos hecho para el grupo control.

Respecto a la LEP, Respecto a la LEP, la desaparición de su respuesta

postprandial en los grupos experimentales (E1 y E2) en el experimento II es

difícil de explicar. Aunque en el grupo control se observa cierta atenuación, en

los grupos experimentales (E1 y E2) el efecto es mucho más drástico, por lo

que es posible que pueda ser más aún si tenemos en cuenta la consecuencia

de la administración a largo plazo de las emulsiones. Sin embargo, no

podemos ofrecer un mecanismo plausible, más aun teniendo en cuenta el

poco consenso existente en la bibliografía acerca de la respuesta al alimento

253 Discusión

de esta hormona, habiendo autores que la encuentran y otros que no

(humanos) [584,730,810,811].

En cuanto al grupo E2:

- Al igual que en el E1 y el control se observan concentraciones basales

superiores en la LEP y PP. Este hecho parece apoyar nuestra interpretación

previa acerca del efecto de la edad sobre estos péptidos.

- Solo aparecen diferencias entre las experiencias a corto y largo plazo en la

respuesta postprandial del grupo E2 en el GIP y GRN. En ambos casos la

respuesta al alimento está atenuada en la experiencia a largo plazo (II), lo cual

se puede explicar de acuerdo con lo dicho para la emulsión E1, ya que en esta

última el comportamiento es similar.

El análisis de los resultados obtenidos en los experimentos en animales normopeso a

corto y largo plazo nos conduce a los siguientes comentarios generales:

En los experimentos a corto plazo no se observa diferencias significativas entre el

grupo control y los dos grupos que ingieren las emulsiones E1 y E2 en los parámetros

estudiados. No aparecen diferencias relevantes en la ingesta de alimento, energía y

macronutrientes, BW, utilización digestiva y metabólica ni en las concentraciones

plasmáticas de distintos péptidos gastrointestinales, INS o LEP y, si aparecen, no

pueden atribuirse, en principio, a la presencia de las emulsiones de grasa en la dieta.

En los experimentos a largo plazo, la presencia de las emulsiones grasas en la dieta (E1

y E2) si tiene efectos sobre distintos parámetros al compararlos con los obtenidos en

el grupo control. Así, ambas emulsiones inducen un aumento significativo en la ingesta

de alimento, energía y macronutrientes, siendo dicho aumento mayor en el caso de la

emulsión E1. Del mismo modo se comporta el BW, siendo significativamente mayor

frente al control y E2 el peso alcanzado por los animales que ingerían la dieta con la

emulsión E1. Esto ocurre aunque la ingesta en E1 y E2 es mayor que la del control. Por

254 Discusión

tanto, a pesar de una ingesta de alimento y energía mayor, los animales del grupo E2

no incrementan su BW.

Es de destacar, asimismo, que la utilización metabólica de la proteína estimada por la

relación de nitrógeno retenido frente al absorbido es inferior en ambos grupos

experimentales, E1 y E2 que la obtenida en el grupo control, siendo las diferencias

significativas para el E2.

Por último, aparecen diferencias en las concentraciones plasmáticas de los distintos

péptidos y hormonas estudiados, tanto en ayunas como postprandiales. Respecto a la

GRN, péptido orexígeno, las mayores concentraciones plasmáticas las presenta el

grupo E1, siendo estas diferencias significativas en los valores obtenidos en ayunas.

Este hecho habla a favor de una mayor ingesta en los animales que tienen valores

preprandiales elevados de este péptido gástrico.

En relación a las concentraciones plasmáticas de INS y LEP, dos hormonas relacionadas

con las señales metabólicas que a largo plazo regulan la ingesta de alimentos, nuestros

resultados muestran una menor respuesta postprandial en ambos grupos

experimentales, E1 y E2, frente al control, lo que es compatible con la mayor ingesta

observada en ellos.

Los dos péptidos que se liberan en el intestino distal, el PYY y el GLP-1, con acción

anorexígena (“freno ileal”) y cuyo principal estímulo es la presencia de productos de la

digestión de la grasa en el lumen de esos segmentos, presentan concentraciones

plasmáticas mayores en el grupo E1, lo que sin embargo no concuerda con la mayor

ingesta de alimento observada en este grupo.

De igual forma, las concentraciones plasmáticas de CCK, péptido anorexígeno que se

secreta por la presencia de productos de la digestión de la grasa en segmentos

proximales del intestino delgado, presenta mayores concentraciones basales en los

grupos E1 y E2, que a su vez tienen mayor ingesta, aunque bien es cierto que la

respuesta a la comida (marcada y significativa en el grupo control durante todo el

periodo postprandial) en esos grupos o no existe (E1) o es muy efímera (E2). Esta

ausencia de incrementos postprandiales impediría que la CCK ejerciera su efecto de

255 Discusión

saciación (inhibición de la ingesta). Por otro lado, las menores concentraciones

plasmáticas de AMY en los dos grupos experimentales, junto con la ausencia de

respuesta al alimento, si está de acuerdo con las mayores ingestas que se aprecian en

ambos grupos, ya que este péptido co-secretado con la INS, tiene un efecto

anorexígeno a corto plazo.

En conjunto los resultados obtenidos en ratas normopeso nos hablan de que la posible

acción de las emulsiones lipídicas (E1 y E2) sobre la ingesta de alimentos, la utilización

digestiva y metabólica de la grasa y la proteína, las concentraciones plasmáticas de

péptidos y hormona relacionadas con la ingesta de alimentos y, en último término,

sobre el BW, no se produce por su administración a corto plazo. Para observar estos

efectos las emulsiones deben administrarse durante varias semanas. Sin embargo, el

pretendido efecto anorexígeno o un efecto encaminado a disminuir la eficiencia

digestiva de energía y nutrientes de la dieta, no se observa en nuestro estudio, ya que

de hecho, la ingesta de alimento en los animales con las dietas que incluyen las

emulsiones (E1 y E2) es mayor, y la digestibilidad de la grasa y la proteína es muy

similar, y con valores muy altos, a la observada en el grupo control. El comportamiento

de las concentraciones plasmáticas (basales y postprandiales) de los péptidos y

hormonas estudiadas tampoco nos permite concluir si globalmente predomina una

estimulación de la ingesta o un efecto anorexígeno. Solo podemos destacar un hecho

que debe ser estudiado más a fondo, y es la menor utilización metabólica de la

proteína que presentan los animales del grupo E2 que, al mismo tiempo y teniendo

una mayor ingesta que el grupo control, no difieren de este en el BW.

Creemos, a la vista de estos resultados, que los pretendidos mecanismos de acción de

las emulsiones ensayadas, que eran la obstaculización del acceso de la lipasa

pancreática a la grasa y la llegada a los últimos segmentos del intestino delgado de

una mayor cantidad de productos de digestión de la grasa no absorbidos para así

disminuir por un lado la absorción de grasa (y en consecuencia de calorías) y por otro

estimular la liberación de péptidos gastrointestinales relacionados con la ingesta de

alimentos y con el “freno ileal”, no han conseguido tener, en nuestras condiciones

experimentales y en este modelo animal, el efecto deseado.

256 Discusión

5. COMPARACIÓN ENTRE RATAS NORMOPESO Y OBESAS

Tanto la ingesta como el BW del grupo control son similares a lo descrito en la

bibliografía.

En ambos experimentos (II y III) se observa que el CDA de proteína y grasa se sitúa por

encima del 90%; por otra parte, el porcentaje R/A de nitrógeno en el experimento III

alcanza un valor de casi el doble con respecto al observado en el experimento II. No

existe bibliografía disponible que muestre una mejora de la eficacia metabólica

(utilizando los mismos índices que nosotros) tras la inducción de obesidad, aunque sí

se observa en otros trabajos una adaptación del intestino dirigida a la mejora de la

absorción de grasa en situación de obesidad [812,813].

Comparando las concentraciones plasmáticas del grupo control en los experimentos a

largo plazo sin (II) y con (III) inducción de obesidad, se observa:

- AMY, GLP-1 Y LEP del grupo obeso poseen una mayor concentración basal,

permaneciendo el resto sin variaciones significativas. Se ha observado una

elevación de las concentraciones plasmáticas de AMY en individuos obesos

aunque parece que está asociada a hiperinsulinemia [232,233], hecho que

aquí no se observa, por lo que este efecto tiene difícil explicación debido a la

escasa bibliografía. Si cabe destacar que estas concentraciones elevadas de

AMY se asocian a un estado de insensibilidad al efecto de la AMY aguda [242].

En relación al GLP-1, en humanos no parece haber cambios asociados con la

obesidad [814], o bien se produce una disminución [399], hecho que contrasta

con lo observado en nuestra experiencia, aunque tampoco se conoce con

seguridad la causa. Las concentraciones plasmáticas de LEP están en las ratas

obesas control (experimento III) dentro del rango esperado, y parecen reflejar

el aumento de la masa grasa corporal, aunque el BW sea similar al del

experimento II. De hecho, nuestras ratas obesas experimento III tienen más

grasa corporal (ver Tabla 13) que las ratas normopeso con peso y edad similar

del estudio de DiGirolamo et al. [809].

257 Discusión

Respecto E1 se puede comentar:

- Concentraciones basales superiores en el grupo E1 normopeso (experimento

II) para la CCK y GRN. Estas diferencias se deben probablemente a la obesidad,

que anula el efecto que provocaba la emulsión E1 en el experimento a largo

plazo en normopeso (II).

- Para AMY, GLP-1, LEP y PYY, las concentraciones basales son significativamente

más elevadas en el grupo obeso (III), lo que en el caso de la AMY [232,240,241]

y LEP [572,815,816] se puede relacionar directamente con el aumento descrito

en sus concentraciones circulantes en situación de obesidad. En ratas, el GLP-1

aparentemente no modifica sus concentraciones en la obesidad [218], y las de

PYY disminuyen [561,562] al menos humanos. En relación a los dos últimos

péptidos, no se descarta un efecto de la emulsión, aunque se desconoce el

mecanismo por el cual actuaría.

- Las concentraciones circulantes de AMY y LEP en el grupo E1 obeso (III) son

significativamente superiores que las que muestra el grupo E1 normopeso (II),

y eso se mantiene a lo largo de todo el periodo postprandial. En el caso de la

AMY, no serían atribuibles a la obesidad ya que como se observa en el estudio

de Shin et al. [218] no existen diferencias entre normopeso y obesas, aunque

las condiciones experimentales no son exactamente las mismas que las

nuestras. En el caso de la LEP, resulta lógica la correlación positiva entre sus

concentraciones plasmáticas y la cantidad de tejido adiposo [570,571].

En conjunto, los resultados obtenidos en el experimento III, realizado en ratas con

obesidad inducida por una dieta rica en grasa (60% de las calorías totales), nos

permiten hacer las siguientes consideraciones:

No vamos a incluir en estos comentarios a los animales que han ingerido la dieta con

la emulsión E3, ya que esta emulsión no está incluida en el diseño experimental de los

258 Discusión

ensayos realizados en ratas normopeso. Por ello las comparaciones se harán entre el

grupo control y el que ingería la dieta con la emulsión E1.

Las diferencias en la ingesta de alimento y de energía entre los grupos C y E1 son

mínimas, se circunscriben a las últimas semanas del experimento y, además, son

aparentemente transitorias. Sí se observan en el grupo E1 ingestas mayores de grasa y

proteína a partir de la tercera semana de iniciado el experimento III.

Las pequeñas diferencias en la ingesta de alimento, energía y macronutrientes no se

reflejan en el BW de los animales ni en su evolución a lo largo del experimento, no

apreciándose diferencias significativas entre los grupos C y E1.

Si examinamos los resultados de utilización digestiva de la grasa y la proteína

observamos que la emulsión E1 disminuye de forma significativa, respecto al control,

los coeficientes de digestibilidad aparente (ADC) de ambos macronutrientes, aunque

aun así los valores se mantienen dentro del rango de normalidad para este parámetro

(mayores del 90%). Sin embargo, la utilización metabólica de la proteína, estimada por

el porcentaje de nitrógeno retenido frente al absorbido, no muestra diferencias entre

grupos (Control vs. E1).

En ratas obesas no existen, en ningún caso, diferencias entre los grupos control y el E1

en las concentraciones plasmáticas en ayunas de ninguno de los péptidos y hormonas

estudiados. Si exceptuamos al GIP, ninguno de los otros péptidos y hormonas presenta

una respuesta clara y significativa a la ingestión de alimento. En la que sí existe esta

respuesta, GIP, no aparecen diferencias significativas entre los dos grupos, control y

E1.

Todo ellos nos lleva a poder afirmar que, en animales en los que se ha establecido una

obesidad inducida por la dieta, la emulsión E1 no parece afectar a los patrones de

secreción de ningunos de los péptidos y hormonas relacionados con la ingesta de

alimento, lo que a su vez se ve reflejado en los patrones de ingesta de alimento y

energía y en la evolución ponderal de los animales, siempre teniendo en cuenta la

utilización digestiva de grasa y proteína (mayor ingesta, menor CDA de grasa y

proteína, igual peso).

259 Discusión

La obesidad incrementa los valores de AMY en plasma de forma significativa en todos

los grupos. No existe respuesta a la ingestión de alimento en ningún grupo obeso, a

diferencia de lo observado en animales normopeso. Podemos apuntar que en

animales obesos la emulsión E1 no afecta, como si ocurría en los normopeso, a la

respuesta postprandial.

Las concentraciones plasmáticas basales y postprandiales de CCK de los grupos control

y E1 en los animales obesos y del grupo control en los normopeso son semejantes.

Existe respuesta a la comida en las ratas normopeso del grupo control que desaparece

con las emulsiones.

En el caso del GIP, en los experimentos a largo plazo con animales normopeso si se

detecta una clara influencia de las emulsiones frente al grupo control. La respuesta es

máxima en este último, mientras que las concentraciones postprandiales en E1

aumentan significativamente con respecto al basal pero con una respuesta

marcadamente inferior a la del grupo control, y finalmente en E2 no existe respuesta.

En obesas, no cambian los niveles basales y en todas existe una respuesta a la comida

similar que se mantiene durante todo el periodo postprandial estudiado (120 min).

Respecto a los péptidos ileales (GLP-1 y PYY), sus concentraciones plasmáticas no

presentan en ratas obesas el mismo comportamiento observado en ratas normopeso;

en estas, la emulsión E1 tuvo un efecto similar sobre las concentraciones de ambos

péptidos, elevándolas. En ratas obesas, las concentraciones plasmáticas basales de

ambos péptidos son superiores a las de normopeso, aunque tampoco existe respuesta

a la comida. La emulsión E1, sin embargo, no ejerce ningún efecto a diferencia del

observado en ratas normopeso a largo plazo (II).

El péptido orexígeno GRN presenta en los dos grupos de ratas obesas, C y E1, valores

similares a los correspondientes del grupo control normopeso. De nuevo, la obesidad

hace desaparecer el efecto (aumento) que tenía la emulsión E1 sobre las

concentraciones plasmáticas de esta hormona en animales no obesos.

El comportamiento diferencial de la INS es la desaparición de la respuesta postprandial

en los animales obesos, sin haber diferencias entre controles y E1 como tampoco las

260 Discusión

había en ratas normopeso. La INS, como era de esperar, presenta concentraciones

plasmáticas más elevadas en los animales obesos en ayunas y durante todo el periodo

experimental. En el caso de la emulsión E1, parece producirse un efecto contrario en

ambos modelos (disminución de la concentración de LEP en normopeso y aumento en

obesas), aunque se trata de cambios puntuales. .

En conjunto, los resultados obtenidos en ratas obesas (experimento III) muestran una

ausencia de efecto de la emulsión sobre las concentraciones plasmáticas de los

distintos péptidos y hormonas estudiadas (anorexígenos y orexígenos), a diferencia de

lo descrito en animales normopeso a largo plazo (experimento II). Las diferencias más

destacables respecto a las ratas no obesas se circunscriben a concentraciones basales

superiores de AMY, GLP-1 y PYY, tres péptidos anorexígenos, y de INS, relacionada con

la mayor masa grasa de los animales obesos.

6. ESTUDIO EN HUMANOS

6.1. CONCENTRACIONES DE GP

La concentración basal de GIP en el grupo control fue de 15.4±1.8 pg/ml, ligeramente

inferior a lo observado en diferentes estudios [336,362,817]. En cuanto a la respuesta

a la ingesta de alimento, los incrementos sobre el valor basal son similares a los del

estudio de Thomsen et al. [362] y Cani et al. [336], por lo que se puede considerar que

nuestro grupo control se encuentra dentro del rango normal en el patrón de secreción

de este péptido en respuesta a la comida.

La concentración este péptido en ambos grupos (control y E1) se diferencia de forma

significativa en las horas 3 y 4 postprandial. La emulsión da lugar a una menor

secreción total de GIP, como muestra el AUC. La causa puede estar en un

impedimento en la liberación de FFA en el intestino proximal debido a la estructura de

la emulsión, lo que pone de manifiesto la necesidad de la absorción de estos FFA para

que se secrete dicho péptido [319].

Si lo comparamos con los experimentos realizados en ratas, la tendencia es similar a la

observada en la experimento a largo plazo en ratas normopeso, lo que contrasta con

261 Discusión

el hecho de que en humanos se trata de una experiencia en agudo y en ratas en

crónico. Esto realza la importancia de realizar estudios a más largo plazo en humanos.

La concentración de GRN basal alcanzó valores en torno a 97.9±19.9 pg/ml en el grupo

control, valor ligeramente inferior al referido por Korner et al.[436], y similar al

registrado por Jacobsen et al. [817]. La respuesta al alimento de este péptido es muy

variable en humanos dependiendo de distintos factores[818], lo que la hace difícil de

comparar los resultados con los de otros estudios.

Existe una diferencia altamente significativa en las concentraciones basales de esta

hormona entre los grupos C y E1, siendo menor en los individuos del último grupo.

Teniendo en cuenta el carácter orexígeno del péptido, cabría esperar que en los

individuos del grupo experimental (E1) la sensación de hambre al principio del

experimento fuera menor, sin embargo no se observan estas diferencias cuando

estudiamos dicha sensación a través de un test subjetivo (Figura 39). Por otro lado, la

presencia de la emulsión en la dieta parece provocar una menor respuesta

postprandial para dicho péptido en este grupo experimental (E1), cuya magnitud es

proporcional a las concentraciones en ayunas. Debido a que aparentemente no se

modifica la ingesta a corto plazo, sería interesante administrar dicha emulsión a largo

plazo, como se realizó en las ratas, para ver posibles cambios en las concentraciones

plasmáticas de este péptido y en la sensación de saciedad.

La INS mostró una concentración basal de 256±19.2 pg/ml en el grupo control, la cual

se encuentra en consonancia con la encontrada por Korner et al. [436] y Juntunen et

al. [819]. En cuanto a la respuesta a la comida, es superior en ambos estudios ([436],

[819]) respecto a la observada por nosotros, debido seguramente a diferencias en el

diseño experimental y en los métodos empleados, como que ellos miden la hormona

por RIA, y el tipo de alimento administrado es Optifast® (474 ml) en el primer artículo

y pasta (179 g) en el segundo. Salvo esos detalles, se puede considerar normal la

respuesta de nuestro grupo control.

A pesar de que en el grupo control se observa una secreción total superior de péptido,

no existe una respuesta significativa al alimento. En el grupo E1, al contrario, se

262 Discusión

observa una menor secreción total y una repuesta significativa a alimento en las

primeras 4 horas postprandiales. No podemos explicar estas diferencias en base a la

presencia de la emulsión en la dieta.

Si tenemos en cuenta el papel anorexigénico de esta hormona a largo plazo, los

resultados de insulinemia podrían relacionarse con un aumento de la ingesta en el

grupo E1, hecho que no puede comprobarse debido al carácter agudo del

experimento.

En condiciones de ayunas, la concentración de LEP en el grupo control fue de

8937±1472 pg/ml, la cual junto con la respuesta al alimento, es similar a la que

muestra el estudio de Karl et al. [378]. En general, la posibilidad de comparación con

otros estudios es muy limitada debido a la variabilidad en la masa grasa en los

individuos. En humanos, no existe en general respuesta significativa de la LEP

plasmática al alimento a corto plazo [817,820], aunque sí se observa a más largo plazo

[821].

La emulsión no provocó ningún cambio significativo en los niveles basales, la respuesta

al alimento ni en la secreción total.

En nuestro estudio en humanos, el PP mostró una concentración plasmática basal de

45.6±10.8 pg/ml, coincidiendo este valor con el referido por Kanaley et al. [822] y

Jacobsen et al. [817]. En cuanto a la respuesta a la comida, y en comparación con

ambos estudios ([822], [817]) la mayor diferencia radica en que nosotros no

encontramos un pico máximo tan pronunciado como en esos estudios, aunque

después de dicha respuesta máxima las concentraciones sí son similares.

La respuesta postprandial de este péptido es cuantitativamente similar en ambos

grupos, aunque se aprecian diferencias en la evolución temporal. Hemos encontrado

diferencias significativas (con valores mayores en el grupo control) tanto en la

concentración basal como en la 3ª hora tras la comida, aunque creemos que poseen

poca relevancia, a tenor de los valores obtenidos en los parámetros de saciedad.

263 Discusión

En el grupo control, la concentración basal de PYY fue de 48.8±4.4 pg/ml, similar a la

que dan Cani et al. [336] y Batterham et al. [555]. La respuesta al alimento fue mayor

en nuestro caso si lo comparamos con el primer trabajo [336], en el cual no se produce

una respuesta significativa; la discordancia de resultados probablemente se debe a

diferencias en el tipo y cantidad de alimento ingerido, que en su caso fue un desayuno

de libre elección. Por otro lado, en el estudio de Keogh et al. [154] sí se observa una

respuesta similar a la nuestra.

Tanto las concentraciones basales como postprandiales son similares en nuestros dos

grupos, aunque los valores del grupo control tienden a mantenerse ligeramente por

encima, pero en cualquier caso solo se alcanza significación estadística en las horas 2 y

8. Por otro lado, la secreción total fue superior en el grupo control comparado con el

E1.

Si tenemos en cuenta la secreción total de dicho péptido, la señal anorexigénica

asociada a éste sería menor en el grupo E1, hecho que como ocurre con el resto de GP

y hormonas medidos, no se refleja en los niveles de saciedad estimados en los

individuos que participan en este estudio.

6.2. SACIEDAD Y HAMBRE

En general, los cambios observados en la concentración de los diferentes péptidos

relacionados con la ingesta no contribuyeron a cambios en los niveles de saciedad y

hambre en ambos grupos. Esto se relaciona con lo observado en otros estudios en los

que se administra grasa directamente en el intestino, hecho que modificó las

concentraciones de algunos péptidos pero no produjo un cambio en la saciedad de los

individuos [142,143]. Todo ello nos vuelve a mostrar la complejidad de la regulación

de la ingestión de alimentos y la importancia de analizar cada uno de los factores

implicados en ella.

CONCLUSIONES/

CONCLUSIONS

“Un viaje de mil millas comienza con el primer paso”

(Lao Tse)

267 Conclusiones

El posible efecto de los ingredientes funcionales utilizados (E1 y E2) sobre la ingesta

de alimento y el peso corporal en ratas normopeso solo se observa a largo plazo, pero

no a corto.

A potential effect of functional ingredients E1 y E2 on food intake and body weight in

normal-weight rats becomes evident only in the long term, but not in the short term.

En general, en las ratas normopeso del estudio a largo plazo, el comportamiento de las

concentraciones plasmáticas basales y postprandiales de la mayoría de los péptidos y

hormonas estudiados, si exceptuamos el PYY y el GLP-1, nos permiten explicar las

mayores ingestas observadas en los grupos experimentales (E1 y E2) pero no así las

diferencias en la evolución ponderal, que únicamente podrían atribuirse a la menor

utilización metabólica de la proteína en el grupo que ingiere el ingrediente funcional

E2.

In normal-weight rats of the long-term study, changes in fasting and postprandial

plasma concentrations of most hormones and peptides studied, except for PYY and

GLP-1, explain in general terms the higher food intake observed in the experimental

groups (E1 and E2), but not the differential effects on body weight evolution, which

could only be attributable to the reduced metabolic utilization of protein observed in

rats given the E2 ingredient.

En nuestras condiciones experimentales, las ratas con obesidad inducida por la dieta

que posteriormente ingieren a largo plazo el ingrediente funcional E1, no presentan

diferencias que merezcan destacarse con respecto a las controles en la ingesta

alimento y energía, evolución ponderal, ni utilización nutritiva de la grasa y la proteína.

Además, la obesidad hace que se modifiquen los perfiles plasmáticos observados en

las ratas normopeso para la mayoría de los péptidos y hormonas estudiados, tanto en

el grupo control como en el E1, no apareciendo respuesta a la comida.

In our experimental conditions, the dietary obese rats that were subsequently long-

term fed with the diet containing the E1 ingredient did not show remarkable

differences in food intake, body weight, and nutritive utilization of protein and fat

compared with the control group. Furthermore, related to normal-weight rats, the

268 Conclusiones

obese state modified the plasma profile of almost all the hormones and peptides

examined, both in the control and E1 groups, abolishing the response to food.

En humanos, la administración aguda del ingrediente E1 solo produce ligeros cambios

en la concentración plasmática de algunos de los péptidos estudiados, pero no en la

sensación de hambre/saciedad, por lo que en principio no cabe esperar un claro

efecto sobre la ingesta de alimento. Esto coincide en cierto modo con lo mostrado en

ratas a corto plazo, lo que hace necesario el planteamiento, en un futuro cercano, de

estudios en los que los ingredientes funcionales sean consumidos a largo plazo, tanto

por individuos normopeso como obesos.

In humans, the acute administration of ingredient E1 evoked only slight changes in the

plasma concentration of some of the peptides studied, but not in the sensation of

hunger/satiety; therefore, a clear effect on food intake is not expected. This agrees in

part with the observations in the rats of our short-term study, and makes necessary to

consider, for the near future, an approach where the functional ingredients are long-

term administered, both to obese and nonobese subjects.

A la vista de estos resultados, los pretendidos mecanismos de acción de los

ingredientes ensayados, que eran la obstaculización del acceso de la lipasa pancreática

a los triglicéridos luminales y la llegada a los últimos segmentos del intestino delgado

de una mayor cantidad de productos de digestión de la grasa, para así disminuir las

calorías absorbidas y/o favorecer la secreción de péptidos gastrointestinales con

efecto anorexígenico, parecen no tener, en nuestras condiciones experimentales con

nuestros modelos, el efecto deseado sobre la ingesta y consecuentemente sobre el

peso corporal.

In view of our findings, the alleged mechanism of action of the functional ingredients,

that is, restricting the access of pancreatic lipase to luminal triglyceride and arrival of a

higher amount of fat digestion products to distal gut (so less calories are absorbed

and/or more anorexigenic gut peptides are secreted), is not producing, in our

experimental conditions, the sought effect on food intake and, consequently, on body

weight.

269 Conclusiones

Es la primera vez que se describe en ratas el efecto de este tipo de ingrediente

funcional sobre los diferentes parámetros estudiados, hecho que recalca lo novedoso

de nuestro estudio. Además, la falta de estudios similares y la amplia variedad de

diseños experimentales descritos en la literatura científica, dificultan la comparación y

por tanto la posibilidad de profundizar en las causas que expliquen los resultados

obtenidos. En definitiva, sería importante armonizar la metodología y el diseño

experimental de este tipo de estudios para así comprender mejor esta compleja red

que supone el control de la ingesta y la regulación del peso corporal.

To our knowledge, this is the first time that the effect of this type of functional

ingredient on all the parameters studied has been described in the rat, which

emphasizes the novelty of this study. Moreover, the lack of similar studies and the

wide variety of experimental designs in the scientific literature render the comparison

more difficult and reduce the possibility to study in depth the causes for the observed

results. In essence, it should be an important issue to harmonize the methodology and

experimental designs used in these studies in order to improve our understanding of

this complex network that is the regulation of food intake and body weight.

270 Conclusiones

SUMMARY

273 Summary

1. INTRODUCTION

“Globesity” is the term that the World Health Organization (WHO) employs to define

the growth of obesity in the world from 80’s onwards [823]. The current situation has

been driven by the interaction of different factors that are linked to the development

of a country, such as global trade liberalization, economic growth, or urbanization,

which have created an obesogenic environment where the caloric intake tend to

increase and the physical activity goes in the opposite way, resulting in a positive

balance of energy that leads to fat accumulation [8]. Giving a picture of the more

recent situation, the International Obesity Task Force estimated that in 2010, there

were 1 billion of overweight adults, of which 457 millions were obese [824]. The

progression of this epidemic, in tandem with cardiovascular disease and other

morbidities associated with obesity, is expected to slow or reverse the decline in

mortality that has been noted in most of the developed countries over the past 40

years [825].

Governments and international organizations are aware of the problem and are now

trying to implement measures to fight it. One example is the NAOS strategy, which has

been developed by the Ministry of Health and Consumer Affairs of Spain following the

guidelines of the WHO. The main objective of the NAOS strategy is to promote a

healthy diet and physical activity to reverse the upward trend in the prevalence of

obesity and, consequently, reduce the morbidity and mortality associated to chronic

diseases [826]. Within the NAOS strategy, the PRONAOS project (which in turn

comprises the current work) aims to develop novel functional foods intended for

weight management. There are few food products on the marked that have proved to

be effective in promoting satiety and weight maintenance and many others are

currently under development, most of them based on plant and animal-derived

ingredients [100,101] and innovative emulsions [827].

Obesity is a complex trait that emerges from a complicated network of contributory

components including genomic and environmental factors. With this knowledge, the

need to unravel the mechanisms regulating appetite control has received significant

attention. This disease is characterized by an excessive accumulation of fat in adipose

274 Summary

tissue, which is accompanied by low-grade inflammation, adipokine secretion

dysregulation, hypoxia, oxidative stress and an alteration of the secretion of gut

hormones and food intake-related peptides [828]. At present, among approved anti-

obesity therapies, only bariatric surgery can effectively lead to considerable weight

loss sustained over the long term [689]. However, it has largely been rendered

impractical as a useful anti-obesity approach, in large part due to its high cost and rate

of mortality. However, there has been growing evidence that the resulting weight loss

following surgery is due, at least in part, to an alteration in the circulating

concentrations and physiology of certain gut hormones such as CCK, PP, PYY, GLP-1,

and diminished release of the orexigenic peptide GRN [750]. Also, there are convincing

proofs that the obese state leads to different alterations in the circulating

concentration of AMY [240,241], GIP [347,348], GLP-1 [398,399,829], GRN [449], INS

[495,496] and LEP [619].

Gut hormones, as we see, play an important role in the homeostatic control of food

intake and offer an alternative to centrally acting drugs [830]. The gut-brain axis and a

variety of hormone signaling pathways have been emerging as potentially powerful

anti-obesity tools. A wide new field of research is open to determine the influence of

nutrients and bioactive compounds on the secretion of gut hormones. The literature is

sparse and still focused on human studies, most of them related to the form in which

fat is present. Novel fat emulsions produced by the use of modern food technology are

currently in full development and aim at promoting the anorexigenic signals and/or

decreasing orexigenic ones [141-143]. We know the effect of certain nutrients on gut

peptide release [634,831] and, also, what happens when these peptides are

administered separately (exogenously, either peripherally or centrally), but the whole

picture of food intake regulation is certainly unknown, mostly because of the

complexity of the interactions among the different factors and mechanisms involved.

Continued research into the potential to exploit endogenously occurring appetite-

regulating gut hormones in an effort to regulate energy homeostasis is required, but

certainly holds great promise to lead to the development of safe and effective anti-

obesity treatments, and to contribute to combating the unbridled global rise in

obesity.

275 Summary

2. RATIONALE AND AIMS OF THE STUDY

As mentioned above, work performed for this PhD Thesis has been fulfilled in the

Department of Physiology and Institute of Nutrition and Food Technology of the

University of Granada, in collaboration with Biosearch Life®, a biotechnology company

present in international markets within the pharmaceutical, nutraceutical and

functional food sectors.

The main objective of this PhD Thesis was to assess the effect of three functional

ingredients, provided by Biosearch Life®, initially in Wistar rats (both normal-weight

and dietary obese rats) and later in normal-weight humans (one of the ingredients).

Specific objectives were to assess the effects on:

- Food intake.

- Body weight evolution.

- Protein digestibility and metabolism.

- Fat digestibility.

- Fasting and postprandial plasma concentrations of AMY, CCK, GIP, GLP-1, GRN,

INS, LEP, PP and PYY (in rats) and GIP, GRN, INS, LEP, PP and PYY (in humans).

- Satiety and hunger parameters in humans.

3. METHODOLOGY

3.1. STUDIES IN RATS

Ninety male Wistar rats (initial body weight 150±5 g) were used. We conducted three

experiments in the following time sequence:

- Experiment I (short term, normal-weight rats): Rats were divided into three

groups (n=10 each) named as control, E1 and E2 and fed ad libitum for 6 days

(experimental period) with AIN-93M rodent diet with 4% high-oleic sunflower

oil (control group) or the same diet where the fat component was emulsified

(E1 and E2) (Figure 6).

276 Summary

- Experiment II (long term, normal-weight-rats): Rats were divided into three

groups (n=10 each) named as control, E1 and E2 and fed ad libitum for 10

weeks (experimental period) with the same diets employed in the short term

study (Fig. 7).

- Experiment III (long-term, dietary obese rats): Rats (n=30) were fed with a

high-fat obesogenic diet (D12492, Research Diets®) for 9 weeks (obesity

induction period). Then, they were divided into three groups (10 rats each:

control, E1 and E3) and received for 10 weeks (experimental period) the same

diets of the short and long term studies (except that E2 emulsion was replaced

by a modification of E2 emulsion, now called E3) (Fig. 8).

Formulated diets were chemically analyzed by standard methods: protein (Kjeldahl, N

× 6.25), fat (Soxhlet), water (by drying until a constant weight), ash (incineration in a

muffle furnace) and total carbohydrates (by difference).

During the experimental period of the short term study (Experiment I), food intake

was recorded daily and body weight every 3 days. Feces and urinary output were also

collected daily for digestibility and balance studies (Fig. 6).

In Experiments II and III, rats had daily food intake and weekly body weight monitored

throughout the whole 10-wk experimental period. Feces and urine were collected

during the 5th week of the experimental period (Fig. 7-8).

Feces and urine samples were analyzed for protein (N × 6.25) and/or fat by the

Kjeldahl and Soxhlet methods, respectively. The following coefficients were calculated:

apparent digestibility coefficient (CDA, fat and protein), nitrogen retention (balance),

and percent nitrogen retention/absorption (%R/A).

For the peptide and hormone study (performed at the end of the experimental period

in Experiments I, II and III), blood samples were taken in fasting conditions by cutting

tail tip. The animals were then given free access to their respective diets during 15

minutes (setting time 0 when the food was withdrawn) and repeated tail blood

samples were subsequently collected at 15, 30, 60, and 120 minutes (Fig. 9). Plasma

277 Summary

was analyzed for hormones and gut peptide by ELISA (CCK only) and Luminex X-MAPTM

technology (AMY, GIP, GLP-1, GRN, INS, LEP, PP and PYY).

3.2. STUDIES IN HUMANS

Subsequent to the rat studies, an acute experiment was completed in humans. A total

of 15 healthy participants were selected. After collection of a fasting blood sample,

volunteers were given a standard breakfast that included sunflower oil (50 g/sq m

body surface). The meal was ingested within 10 minutes and, then, additional samples

were drawn at 1, 2, 3, 4, 5 and 8 hour postprandially (Fig. 12). The same test was

repeated in the next day, but fat was replaced by the E1 emulsion that had been

assayed in rats. Luminex X-MAPTM technology was used to determine, in plasma, the

concentration of GIP, GRN, INS, LEP, PP and PYY.

All data were checked for normality and homogeneity of variances, and, accordingly

means were compared by either non-parametric or parametric tests (Student’s t-test

or one-way ANOVA with post-hoc Duncan’s multiple range test). Means were

considered to be significantly different when P<0.05. Areas under the curve (AUC) in

the hormone assays were calculated by the trapezoidal method.

4. RESULTS AND DISCUSSION

4.1. SHORT TERM RAT STUDY (Experiment I)

In general, there were no relevant differences between control and experimental (E1

and E2) groups in almost any of the different parameters determined (food and energy

intake, body weight, metabolic and/or digestive utilization of protein and fat, and the

concentration of hormones and gut peptides (Fig. 13 to 18). In case differences

existed, they cannot be ascribed, in principle, to the effect of functional ingredients

(emulsions E1 and E2).

278 Summary

4.2. LONG TERM STUDY IN NORMAL WEIGHT RATS (Experiment

II)

Long term (10 weeks) administration of diets containing the functional ingredients

(emulsions E1 and E2) had marked effects on many parameters. To start with, both

emulsions evoked, compared with the control group, a significant enhancement of

food, energy and macronutrient intake (Fig. 19). However, while body weight in group

E1 increased accordingly, value in group E2 did not (Fig. 22), keeping similar to control,

and this occurred despite a higher energy intake compared with the latter.

As for nutritional management, the metabolic utilization of protein, estimated by the

percent N retention/N absorption, was lower experimental groups (E1 and E2) as

compared to control, with the difference reaching statistical significance in group E2

(Fig. 23).

It has to be noted that the highest plasma concentrations of ghrelin were found in

group E1, though this difference achieved significance only in fasting conditions. This

may be related to the greater intake mentioned above, considering the orexigenic role

of this peptide [439] (Fig. 25). In referring to leptin and insulin (two hormones with

anorexigenic action that are involved in the long-term, metabolic, regulation of food

intake [483,602]), our data showed a lower postprandial response in both

experimental groups (E1 and E2) compared to control, in good agreement with the

food intake results (Fig. 25 and 26). In contrast, the two peptides released mainly by

unabsorbed fatty acids reaching the distal intestine (GLP-1 and PYY) were, in

Experiment I, significantly elevated in group E1, which is not in accordance with the

food intake recorded in this group, in view of their anorexigenic effect (Fig. 25 and 26).

CCK, an anorexigenic peptide that is secreted in response to protein and fat digestion

products in the proximal intestine, showed in our experimental conditions a significant

and prolonged postprandial response in the control group while this was absent in E1

and E2 (Fig.24). This lack of response to food ingestion could result in insufficiency of

this peptide to effectively trigger its anorexigenic signal [281,284-286] thus leading to

bigger meals and a higher intake. Concerning amylin (AMY), an anorexigenic peptide

279 Summary

co-secreted with insulin from pancreatic β cells [223-225], the observation in

experimental groups (E1 and E2) of lower plasma concentrations together with no

clear postprandial increases (Fig. 24), is again compatible with the higher intake

recorded in those groups.

Overall, our findings in normal weight rats indicate that food intake, digestive and

metabolic utilization, circulating concentration of hormones and gut peptides involved

with food intake regulation and, at last, body weight, are not affected by our two

functional ingredients (emulsions E1 and E2) in the short term. For the effects to

occur, E1 and E2 diets must be fed over several weeks. Even though, we have been

unable to find the effects we were seeking, i.e. reduced food intake or diminished

digestive efficiency of macronutrients and energy. Indeed, on the basis of a nutrient

digestibility similar to that of the control group (and showing very high values), food

intake in groups E1 and E2 was higher compared with the latter. In addition, analysis

of hormone and peptide profiles, both in the fasting and postprandial situations, did

not show a clear predominance of anorexigenic over orexigenic factors (or vice versa),

which, on the other hand, was somehow expected given the complexity of food intake

regulation and the many factors involved. Still, we have to emphasize a fact that

should be studied further. That is, the reduced metabolic utilization of protein shown

in group E2 rats, which also displayed a higher intake than control group without the

corresponding increase in body weight.

4.3. LONG TERM STUDY IN DIETARY OBESE RATS (Experiment

III)

For comparative purposes with previous Experiments, we will focus in this section on

groups control and E1.

Long term (10 weeks) administration of either control or E1 diet to rats previously fed

with an obesogenic high-fat diet (dietary obese or DIO rats) produced minor, transient,

differences in food and energy intake, limited to the last weeks of the experimental

period (Fig. 29). As for protein and fat intake, values in group E1 were higher from the

third week onwards. In any case, the above differences in food, energy and

280 Summary

macronutrient intake were not paralleled by differential body weight gain throughout

the Experiment.

Concerning the digestive utilization of protein and fat, we found that emulsion E1

decreased the apparent digestibility coefficient (ADC) for both nutrients compared to

control, although all values were very high (more than 90%) and within normal range

for this strain (Fig. 32). On the other hand, the metabolic utilization of protein, as

estimated by the percent N retention/N absorption, was similar in control and E1

groups (Fig. 32).

In dietary obese rats, E1 ingredient did not affect fasting plasma concentrations of the

different hormones and gut peptides studied (Fig. 34 to 36). Furthermore, none of

them exhibited a clear and significant response to food intake, except for GIP, which

showed similar values in groups E1 and control throughout the postprandial period

(Fig. 34).

Overall comparison between normal-weight and obese rats fed over 10 weeks with

the study diets (Experiments II and III) revealed the following:

- Digestive utilization of protein and fat, expressed as apparent digestibility

coefficient (ADC), was high and similar in all the groups studied. In contrast,

nitrogen retention (balance) and percent nitrogen retention/nitrogen

absorption (%R/A) were significantly higher in obese than in lean rats, with no

effect of fat emulsification (E1) in any case.

- In contrast with the observations in normal-weight rats (Experiment II), long-

term administration of the functional ingredient (emulsion E1) to obese rats

(Experiment III) failed to influence the circulating concentrations of hormone

and gastrointestinal peptides, both the orexigenic and the anorexigenic ones.

Other noticeable differences induced by obesity are related to: i) the higher

concentration of plasma AMY, GLP-1, LEP and PYY, in line with the literature

on rodents [240,241,618,766] except for PYY [218], and ii) the loss of the

postprandial response of AMY and INS.

281 Summary

4.4. ACUTE STUDY IN HUMANS

Our data in humans showed a modest effect of acute administration of emulsion E1 on

plasma concentrations of hormones and peptides (Fig. 37 and 38). In general, the

breakfast containing E1 tended to evoke lower postprandial concentrations compared

with the standard breakfast, although statistical significance was reached only at

specific time points. The integrated response to the meal, estimated as the AUC, was

lower (P<0.05), in group E1 for GIP, INS and PYY (Fig. 37 and 38). Given that GIP is not

considered to be involved in the regulation of food intake in normal conditions [342-

345] and taking into account the anorexigenic action of INS and PYY, a higher satiety

feeling could have been expected in the control group. However, satiety/hunger

parameters were comparable in both groups (Fig. 39), probably in part because of the

acute nature of the experiment.

5. CONCLUSIONS

A potential effect of functional ingredients E1 y E2 on food intake and body weight in

normal-weight rats becomes evident only in the long term, but not in the short term.

In normal-weight rats of the long-term study, changes in fasting and postprandial

plasma concentrations of most hormones and peptides studied, except for PYY and

GLP-1, explain in general terms the higher food intake observed in the experimental

groups (E1 and E2), but not the differential effects on body weight evolution, which

could only be attributable to the reduced metabolic utilization of protein observed in

rats given the E2 ingredient.

In our experimental conditions, the dietary obese rats that were subsequently long-

term fed with the diet containing the E1 ingredient did not show remarkable

differences in food intake, body weight, and nutritive utilization of protein and fat

compared with the control group. Furthermore, related to normal-weight rats, the

obese state modified the plasma profile of almost all the hormones and peptides

examined, both in the control and E1 groups, abolishing the response to food.

282 Summary

In humans, the acute administration of ingredient E1 evoked only slight changes in the

plasma concentration of some of the peptides studied, but not in the sensation of

hunger/satiety; therefore, a clear effect on food intake is not expected. This agrees in

part with the observations in the rats of our short-term study, and makes necessary to

consider, for the near future, an approach where the functional ingredients are long-

term administered, both to obese and nonobese subjects.

In view of our findings, the alleged mechanism of action of the functional ingredients,

that is, restricting the access of pancreatic lipase to luminal triglyceride and arrival of a

higher amount of fat digestion products to distal gut (so less calories are absorbed

and/or more anorexigenic gut peptides are secreted), is not producing, in our

experimental conditions, the sought effect on food intake and, consequently, on body

weight.

To our knowledge, this is the first time that the effect of this type of functional

ingredient on all the parameters studied has been described in the rat, which

emphasizes the novelty of this study. Moreover, the lack of similar studies and the

wide variety of experimental designs in the scientific literature render the comparison

more difficult and reduce the possibility to study in depth the causes for the observed

results. In essence, it should be an important issue to harmonize the methodology and

experimental designs used in these studies in order to improve our understanding of

this complex network that is the regulation of food intake and body weight.

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ANEXO

34 5 Anexo

APORTACIONES A CONGRESOS

Alcalá-Bejarano J, Olivares M, Pérez Martínez L, Yeste M, Aranda P, López-Jurado M,

Martínez MA, Urbano G, Porres JM, Yago MD, Mañas M, Martínez-Victoria E. Influence

of two functional ingredients on the plasma concentrations of insulin, leptin, ghrelin

and peptide YY (PYY) in rats. Acta Physiologica 2012; Volume 206, Supplement

693:P161.

Alcalá-Bejarano J, Olivares M, Pérez Martínez L, Yeste M, Aranda P, López-Jurado M,

Urbano G, Porres JM, Yago MD, Mañas M, Martínez-Victoria E. Effects of two

functional ingredients on food intake, nutrient digestibility and body weight gain in

rats. Acta Physiologica 2012; Volume 206, Supplement 693:P156.

Alcalá-Bejarano J, Olivares M, Pérez Martínez L, Yeste M, Aranda P, López-Jurado M,

Urbano G, Porres JM, Yago MD, Mañas M, Martínez-Victoria E. Influence of two

functional ingredients on the plasma concentrations of leptin, ghrelin and glucagon

like peptide-1 in lean and obese rats. Annals of Nutrition and Metabolism 2013;

Volume 31, Supplement 1:P519.

Alcalá-Bejarano J, Olivares M, Pérez Martínez L, Yeste M, Martínez-Burgos MA, Porres

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Alcalá-Bejarano J, Olivares M, Porres JM, Yago MD, Mañas M, Martínez-Victoria E.

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34 6 Anexo

PUBLICACIONES

Alcalá-Bejarano J1, Yago MD1, Mañas M1, López-Millán MB1, Martínez-Burgos MA1,

Martínez-Victoria E1 Macronutrientes, ingesta de alimentos y peso corporal. Papel de

la grasa. [Macronutrients, food intake and body weight. The role of fat]. Nutr Hosp.

2014. In press.