UNIVERSIDAD DE COLIMA

MAESTRÍA EN CIENCIAS MÉDICAS

EL DONADOR DEL OXIDO NITRICO NITROPRUSIATO DE SODIO EN

LA RESPUESTA INFLAMATORIA HEPÁTICA POSTERIOR A CHOQUE

HEMORRÁGICO NO CONTROLADO

Tesis que para obtener el Grado de

MAESTRO EN CIENCIAS MED ICAS

Presenta

M Esp. Roberto Anaya Prado

Asesor: Dr. Miguel Huerta Viera

Asesor Externo: Dr. Luis H Toledo Pereyra

Coasesores

M en C Alejandro González Ojeda

M Esp. Humberto Arenas Márquez

Dr. en C Emilio Prieto Díaz Chávez

Colima, Col. Julio de 2002

Colima, Colima, a 13 de Julio de 2002.

DR. BENJAMÍN TRUJILLO HERNÁNDEZ COORDINADOR ACADÉMICO DEL POSGRADO EN CIENCIAS MÉDICAS P R E S E N T E.

Muy estimado Dr. Benjamín Trujillo:

Por medio de la presente, hago de su conocimiento MI ACEPTACIÓN de la tesis de Maestría en Ciencias Médicas titulada "EL DONADOR DE OXIDO NITRICO NITROPRUSIATO DE SODIO EN LA RESPUESTA INFLAMATORIA HEPÁTICA POSTERIOR A CHOQUE HEMORRÁGICO NO CONTROLADO", que presenta el Médico Especialista en Cirugía ROBERTO ANAYA PRADO, la cual reúne las características necesarias para ser presentada y defendida en el examen recepcional para la obtención del grado de Maestro en Ciencias Médicas.

Sin más por el momento, quedo de usted.

Av. 25 de julio 965, Colima, Colima, México, C.P. 28000, Apartado postal 199 Tel. 01 (312) 316 11 29, Ext. Fax 47452

DEDICATORIAS

A mi esposa Connie y mis Hijos Michelle Marie, Roberto y Pablo Alejandro

Por su paciente y amorosa disposición a permanecer mas tiempo lejos, su cálida devoción por

mi gusto me ha permitido vivir con pasión una ilusión mas.....

A mi Padre Ramón y a mi Madre Bertha

Por el paso siempre firme e inquebrantable en la búsqueda de sus metas, sin renegar, siempre

con Dios y sus hijos en el corazón. Así allanaron el camino, así lo han ofrecido, así lo

tomamos....

A mis Hermanos

Por permitirme desempeñar el rol que siempre he tenido en la familia, eso me motiva a seguir

creciendo al ver retroalimentados mis anhelos y pasión por la ciencia....

A mis Amigos

Por el valor ofrecido en los momentos más débiles de mi vida, ahí han estado siempre....

A mis Maestros

Por el cariño paternal y sin prejuicios con que me han mostrado el camino del saber, porque les

gusta ilustrar, porque disfrutan departir y compartir todo lo que han aprendido, sin esperar

retribución alguna más allá del compromiso de transmitir lo que algún día han recibido de sus

propios maestros....

Que Dios los bendiga a todos.....

Roberto Anaya Prado

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad de Colima

Al Centro Universitario de investigaciones Biomédicas (CUIB). Universidad de Colima

Al Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS). Delegación Jalisco

Al Borgess Medical Center

A1 Borgess Research Institute

A1 Kalamazoo Center for Medical Studies. Michigan State University

A1 Departamento de Patología de la Escuela de Medicina. Universidad de Michigan

Todos en su medida han representado pilares fundamentales en el crecimiento académico, en la

amalgama de un proyecto ambicioso y en la culminación de un trabajo que aunque modesto, participa

ya del conocimiento científico que seguramente generará más dudas de investigación.

A Dios, por permitirme la salud y claridad de mente para culminar con júbilo un logro más en la

batalla por una vida productiva y equilibrada....

A todos mil gracias....

ÍNDICE

Tabla de Cuadros y Figuras 1

Resumen 2

Abstract 3

Introducción 4

Antecedentes 5

Oxido Nítrico y Choque Hemorrágico 6

Donadores Exógenos de Oxido Nítrico y Choque Hemorrágico 8

Planteamiento del Problema 9

Hipótesis 10

Objetivo 10

Objetivos Particulares 10

Material y Métodos 11

Ética del Estudio 11

Técnica Quirúrgica 11

Diseño Experimental 12

Tratamiento 14

Pruebas de Función Hepática 15

Mieloperoxidasa de Tejido Hepático (MPO) 15

Estudios Histológicos 16

Prueba de Protección de Ribonucleasa con Multisonda (PPR) 16

Análisis Estadístico 17

Resultados 17

Requerimientos Hídricos 17

Pruebas de Función Hepática 18

Mieloperoxidasa de Tejido Hepático 20

Resultados de Histología 21

Prueba de Protección de Ribonucleasa con Multisonda (PPR) 23

Sobreviva 24

Discusión 25

Conclusiones 28

Anexos 29

Abreviaturas usadas en este Trabajo 29

Bibliografía 30

1

TABLA DE CUADROS Y FIGURAS

Figura 1. Papel Dual del Oxido Nítrico y Lesión Orgánica. 7

Figura 2. Representación Esquemática del Diseño Experimental. 13

Figura 3. Requerimientos Hídricos 18

Figura 4. Niveles de AST y ALT. 19

Figura S. Actividad de MPO en Tejido Hepático. 20

Figura 6. Graduación Histológica de Lesión Hepática 21

Congestión, Vacuolización y Necrosis 21

Figura 7. Microfotografía de Tejido Hepático 22

Rata control sin Tratamiento 22

Figura 8. Microfotografía de Tejido Hepático 22

Rata Tratada con Nitroprusiato de Sodio 22

Figura 9. Expresión de Citocinas Proinflamatorias Mediante PPR 23

Figura 10. Representación Gráfica de los Porcentajes de Sobrevida. 24

Tabla 1. Grupos y Número de Animales Tratados. 14

Esquema 1. Fórmula Estructural del Nitroprusiato de Sodio. 14

2

RESUMEN

Antecedentes. El choque hemorrágico (CH) resulta en un estrés oxidativo celular y en una inducción

de respuesta inflamatoria, con una expresión incrementada de un número de mediadores

proinflamatorios y de citocinas. Nosotros investigamos la capacidad del donador de Oxido Nítrico

(NO) Nitroprusiato de Sodio (NP) para reducir la lesión tisular en un modelo animal de CH no

controlado.

Métodos. Setenta y dos ratas Sprague-Dawley de entre 250 y 300 gramos fueron sometidas a un

modelo de CH no controlado. Fueron incluidos cuatro grupos de animales en este estudio (n = 18 por

grupo): sham/salina, sham/NP, shock/salina, shock/NP. El diseño experimental consistió en el

desarrollo de choque hemorrágico (3ml/100g) en un periodo de 15 minutos; corte de cola (75%) y

administración de la droga a los 30 minutos; reanimación hídrica (RH) con solución de Ringer Lactado

(RL) para alcanzar una presión arterial media (PAM) de 40 mmHg; una fase hospitalaria de 60

minutos con hemostasia y RH con solución de RL para alcanzar una PAM de 70 mmHg; y una fase de

observación de 3 días. El tratamiento al inicio de la reanimación consistió en solución salina (grupos 1,

3) o nitroprusiato de sodio (0.5 mg/kg) (grupos 2, 4). Fueron evaluados los siguientes parámetros:

requerimientos hídricos para reanimación, pruebas de función hepática, mieloperoxidasa de tejido

hepático (MPO), histología hepática, expresión de mRNA de citocinas (IL-1α , EL- 1β , TNFβ , EL-3,

IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNFα , IL-2, IFNγ) en el hígado mediante Prueba de Protección de

Ribonucleas con Multisonda (PPR) y sobrevida de tres días.

Resultados. El nitroprusiato de sodio redujo significativamente los requerimientos hídricos para

reanimación (p =0.0001). También observamos una mejoría estadísticamente significativa en las

pruebas que demuestran lesión hepática, infiltración neutrofilica evidenciada por UPO, y estudios

histológicos. La sobrevida también se incrementó de 40% en los controles a 60% con el tratamiento

con NP. La expresión de citocinas se redujo con el tratamiento con NP.

Conclusión. Estos datos sugieren que el exceso de NO media la lesión hepática inducida por el CH y

que la supresión de la biodisponibilidad de NO con el donador de NO nitroprusiato de sodio puede

reducir las consecuencias fisiopatológicas de hemorragia severa, posiblemente por el barrimiento del

anión superóxido (O2), limitando así la producción de radicales más tóxicos.

3

ABSTRACT

Background. Hemorrhagic shock (HS) results in an oxidative stress to cells and in the induction of the

inflammatory response, with an increased expression of a number of proinflammatory mediators and

cytokines. We tested the ability of the Nitric Oxide (NO) donor Sodium Nitroprusside (NP) to reduce

tissue injury in a rodent model of uncontrolled hemorrhagic shock.

Methods. Seventy-two Sprague-Dawley rats weighing 250 to 300 grams were subjected to a model of

uncontrolled hemorrhagic shock. Four groups of animals were included in this study (n = 18 per

group): sham/saline, sham/NP, shock/saline, shock/NP. Experimental design consisted of the

development of hemorrhagic shock (3m1/l00g) in a 15-minute period; tail amputation (75%) and drug

administration at 30 minutes; fluid resuscitation (FR) with lactated Ringer's (LR) solution to reach a

mean arterial pressure (MAP) of 40 mmHg; a hospital phase of 60 minutes with hemostasis and FR

with LR solution to reach a MAP of 70 mmHg; and a 3 day observation phase. The treatment at the

beginning of resuscitation included either normal saline (groups 1, 3) or sodium nitroprusside (0.5

mg/kg) (groups 2, 4). The following parameters were evaluated: fluid requirements for resuscitation,

liver injury tests, liver tissue myeloperoxidase (WO), liver histology, cytokine (IL-1α , IL-lβ , TNFβ,

IL-3, IL-4, IL-5, EL-6, IL-10, TNFα , IL-2, IFNγ) mRNA expression in the liver by Multi-probe

Ribonuclease Protection Assay (RPA), and three day survival.

Results. Sodium nitroprusside significantly reduced fluid requirements for resuscitation (p =0.0001).

We also observed an improved statistically significant difference in tests demonstrating hepatic injury

(p =0.0001), neutrophil infiltration as evidences by liver MPO (p <0.05), and histology studies (p

=0.001). Survival was also increased from 40% in controls to 60% with NP treatment. The expression

of cytokines was reduced by NP treatment.

Conclusion. These data suggest that excess NO mediates hemorrhage-induced liver injury, and that

the suppression of NO bioavailability with the NO donor sodium nitroprusside may reduce the

pathophysiological consequences of severe hemorrhage, possib ly by scavenging superoxide (O2), thus

limiting the production of more aggressive radicals.

4

INTRODUCCIÓN

El choque hemorrágico (CH) contribuye con la morbi-mortalidad a corto y largo plazo después de

lesiones traumáticas. Sin embargo, los mecanismos específicos involucrados en la fisiopatología de la

hemorragia han sido definidos en forma incompleta El choque hemorrágico resulta en un estrés

oxidativo de las células y en la inducción de una respuesta inflamatoria, con expresión incrementada

de un número de mediadores proinflamatorios y de citocinas.

El Oxido Nítrico (NO) ha demostrado que se combina con el superóxido (O2) para formar el radical

altamente tóxico de Peroxinitrito y producir daño oxidativo. El NO también juega un papel importante

en las señales celulares de transferencia proinflamatorias, alterando la expresión de genes celulares, la

actividad enzimática, y la activación de factor de transcripción. Además, el NO regula la

vasodilatación, la agregación plaquetaria y neutrofilica, y el flujo sanguíneo orgánico local. Por lo

tanto, el NO puede influir en la función celular y tisular posterior a hemorragia en diversas maneras. El

choque hemorrágico disminuye la actividad de la Sintasa endotelial constitutiva del Oxido Nítrico

(ecNOS) mientras incrementa la Sintasa inducible del Oxido Nítrico (iNOS). Trabajos previos han

demostrado que es benéfico el proporcionar donadores exógenos de NO en las fases tempranas de

choque y reanimación y que es lesivo inhibir la actividad de la ecNOS durante el choque. Otros

autores han demostrado que el inhibir la actividad de la Sintasa del Oxido Nítrico (NOS) reduce la

lesión orgánica y mejora la sobrevida, sugiriendo que es complejo el papel del NO en la fisiopatología

del choque hemorrágico. Todo este cuerpo de evidencias apoya la hipótesis de que el NO en exceso,

generado a partir de la iNOS, promueve la inflamación y lesión tisular.

La hipótesis arriba señalada sugiere que el remover el exceso de NO, en tanto se preservan los

niveles básales benéficos, podría mejorar la evolución después de la reanimación del choque

hemorrágico. Los problemas con la selectividad de las isoformas de la NOS y las relaciones de la

dosis respuesta complican la utilidad terapéutica potencial de los inhibidores de la NOS en los

estados de choque. Algunos compuestos han sido diseñados para "barrer"(eliminar, de Inglés:

"scavenge") el NO extracelular en exceso. En este estudio, evaluamos la capacidad del

5

Nitroprusiato de Sodio (NP), como donador exógeno del NO, para disminuir la lesión tisular después

de choque hemorrágico. Nuestros datos demuestran que la infusión de NP redujo la lesión hepática,

disminuyó la utilización de líquidos para reanimación, disminuyó la expresión de citocinas

proinflamatorias y los niveles de MPO de tejido hepático, y mejoró la sobrevida después de choque

hemorrágico.

ANTECEDENTES

La disminución del aporte sanguíneo a órganos y tejidos (isquemia) con reperfusión subsecuente

(isquemia/reperfusión) representa uno de los fenómenos patológicos más frecuentes asociado a una

morbi-mortalidad incrementada en la economía humana. El choque, las oclusiones arteriales, las

lesiones por trauma y la respuesta vascular post-trasplante son algunas de las áreas que se podrían

beneficiar potencialmente al modificar los efectos lesivos de la isquemia/reperfusión (I/R).1

El choque hemorrágico severo se caracteriza por una falla circulatoria con hipotensión y pérdida de la

reactividad a los agonistas adrenérgicos. Esto conduce a lesión tisular, falla orgánica múltiple (FOM) y

finalmente a la muerte. Así, el choque hemorrágico contribuye con la morbi-mortalidad a corto y largo

plazo después de lesiones traumáticas. Sin embargo, los mecanismos precisos que se ven involucrados

en la fisiopatología de la hemorragia y FOM subsecuente no han sido definidos completamente.1

El choque hemorrágico inicia una respuesta inflamatoria caracterizada por la ac tivación y expresión de

citocinas y acúmulo de neutrófilos en los tejidos. Estos cambios son más prominentes en los pulmones

y el hígado, y es probable que contribuyan al daño orgánico final y resulten en disfunción después de

choque. Así, el insulto hemorrágico resulta en un estrés celular oxidativo y en la inducción de una

respuesta inflamatoria, con expresión incrementada de un número de mediadores proinflamatorios y de

citocinas.2 Los mecanismos por los cuales la hemorragia dispara ésta respuesta inflamatoria aun son

pobremente entendidos. Se ha sugerido que la actividad adrenérgica profunda, y la liberación

sistémica de agentes proinflamatorios provenientes del intestino, contribuyen a la lesión

pulmonar aguda después de hemorragia. Además, se producen radicales reactivos después de

6

la isquemia/reperfusión del choque hemorrágico, que han sido implicados en un número de vías de

señales de transferencia.3 El choque hemorrágico resulta entonces en un insulto combinado a los

tejidos, oxidativo e inflamatorio, que puede contribuir a la disfunción celular, producir lesión tisular, y

alterar profundamente la función orgánica.1

Oxido Nítrico y Choque Hemorrágico

Entre los radicales importantes producidos durante el choque hemorrágico está la molécula

bioreguladora del Oxido Nítrico (NO)2Los radicales libres que ocurren en forma natural, típicamente

tienen un electrón no par con base en oxígeno o nitrógeno. Los ejemplos clásicos son el anión

superoxido (O2), el radical hidroxilo (HO), y el óxido nítrico (ON)3 El radical libre de NO es

sintetizado del grupo guanidino de la L-arginina por una familia de enzimas denominadas sintasas del

ON (NOS). Se han descrito y clonado tres isoformas: NOS de la célula endotelial (ecNOS, o tipo 3), la

NOS cerebral (bNOS, nNOS, o tipo 1), y la NOS del macrófago tipo inducible (iNOS, o tipo 2). Todas

las isoformas de NOS contienen cuatro grupos protésicos: dinucleótido de flavin-adenina, flavin

mononucleótido, tetrahidrobiopterina, y un complejo heme, el hierro protoporfirina IX.

Recientemente, fue identificado el zinc como un grupo protésico adicional de la NOS.4

Se ha demostrado que, durante la reperfusión, el óxido nítrico se combina con el anión superóxido

para formar el radical altamente tóxico de peroxinitrito y producir una gran variedad de reacciones

oxidativas (lesión). Estas incluyen la iniciación de la nitración de tirosina, la peroxidación lipídica, la

inhibición directa de las enzimas en cadena de la respiración mitocondrial, la inactivación de la

gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, la inactivación de los canales de sodio de la membrana, y

otras modificaciones oxidativas de las proteínas (figura 1).4-6

7

Figura 1. Esta figura describe el papel dual del NO generado por la iNOS en el choque hemorrágico. El iNOS es

activado durante el choque severo. El NO generado durante la reanimación, se combina con el superóxido para

formar el peroxinitrito. El peroxinitrito generado durante la reanimación puede ejercer toxicidad directa mediante un

daño nitroso y oxidativo y activación de PARS. El NO, y quizás el peroxinitrito, pueden activar las cascadas

inflamatorias a través de la activación del NFκB. Esto resulta en inflamación manifestada con expresión de citocinas,

activación de STAT3, y acumulación neutrofifca. Estas acciones combinadas producen daño y falla orgánica. iNOS,

sintasa inducible de óxido nítrico; NO, Oxido Nítrico; STAT3, transductor de señal y activador de transcripción (por

sus siglas en inglés, Signal Transducer and Activator of Transcription 3); CH, choque hemorrágico; R, reanimación;

Org, orgánico; PARS, poli (ADP ribosa) sintetasa (por sus siglas en inglés, poly (ADP ribose) synthatase).

El óxido nítrico juega un papel importante en las señales celulares proinflamatorias, alterando la

expresión de genes, la actividad enzimática y la activación de factor de transcripción.7 Las citocinas

proinflamatorias tales como el Factor de Necrosis Tumoral (TNF), la Interleucina 1 (IL-1), y la

Interleucina 6 (EL-6) se han encontrado elevadas posterior a trauma hemorrágico tan solo 45 minutos

después de la inducción de la hipotensión.8 También, el NO regula la vasodilatación, la agregación

8

plaquetaria y de neutrófilos, y el flujo orgánico local.7 Por lo tanto, el NO puede influir en la función

celular y de tejidos posterior a la hemorragia en una variedad de formas. Por un lado, el choque

hemorrágico disminuye la actividad de la sintasa endotelial constitutiva del óxido nítrico (ecNOS)9

pero, por otro lado, incrementa la actividad y la expresión de 1NOS (figura 1).10,11

Donadores Exógenos de Oxido Nítrico y Choque Hemorrágico

Trabajos previos han demostrado que, el proporcionar donadores exógenos de NO en las fases

tempranas del choque es benéfico, y que el inhibir la actividad de ecNOS durante el choque es

dañino.2,12 También se ha demostrado que la inhibición de la actividad de la NOS reduce la lesión

orgánica y mejora la sobrevida, sugiriendo que el papel del NO en la fisiopatología del choque

hemorrágico es compleja.13 Por un lado, la inhibición selectiva de la iNOS después de hemorragia

reduce la lesión pulmonar, la activación de factores de transcripción, y la expresión de citocinas

proinflamatorias. Así, distintas isoformas de NOS pueden regular diferentes aspectos metabólicos y

fisiológicos de la respuesta a la hemorragia y el exceso de NO a partir de la iNOS promueve la lesión e

inflamación tisulares (figura 1).2

La mayoría de los estudios que investigan el uso de inhibidores de la NOS en choque hemorrágico, sin

embargo, están limitados por el uso de inhibidores que son ya sea mas selectivos para ecNOS o no

selectivos, inhibiendo ambas isoformas (ecNOS e iNOS). Incluso inhibidores altamente selectivos para

iNOS pueden interferir potencialmente con la actividad de ecNOS a altas dosis o concentraciones

tisulares elevadas.14 Los problemas con la selectividad de las isoformas de la NOS y la relación dosis-

respuesta complican la utilidad terapéutica potencial de los inhibidores de la NOS en los estados de

choque.

Por éstas limitantes, las investigaciones se han orientado directamente sobre el óxido nítrico y la

cascada proinflamatoria a que da lugar.15-21 Recientemente ha sido desarrollado un número de

compuestos que están diseñados para "barrer" el exceso de NO extracelular. Debido a que estos

barredores se enlazan al NO que difunde del sitio de su producción, podrían reducir potencialmente

9

la toxicidad derivada de la actividad en exceso de la iNOS.15

Así, se ha implementado el manejo de donadores exógenos de óxido nítrico. Uno de estos donadores

es el Nitroprusiato de Sodio (NP), que ha sido investigado en modelos de lesión por

isquemia/reperfusión orgánica aislada con buenos resultados, logrando disminuir la lesión por

reperfusión pulmonar, mejorando profundamente la oxigenación, la hemodinamia y la formación de

edema pulmonar; y reduciendo la lesión mucosa y orgánica posterior a isquemia/reperfusión gástrica y

del páncreas.16-21 El nitroprusiato de sodio también ha demostrado reducir la activación endotelial

inducida por citocinas, revirtiendo comp letamente la permeabilidad microvascular incrementada e

inhibiendo la agregación plaquetaria y el tiempo prolongado de trombosis.15 Sin embargo, su utilidad

en isquemia/reperfusión total (choque hemorrágico) no ha sido aun investigada. El hígado ha sido

seleccionado como órgano blanco debido al papel central que juega como modulador de inflamación

inducida por choque y reperfusión subsecuentes.22 También, debido a que el hígado y el intestino

parecen ser los sitios mayormente responsables de la producción incrementada de NO que se observa

posterior a trauma y hemorragia.23 Los agentes farmacológicos que remueven el exceso del oxido

nitrico podrían ser auxiliares útiles para mejorar la función hepática y así disminuir la incidencia de

falla orgánica múltiple y muerte posterior a trauma y hemorragia.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La mayoría de los estudios que han investigado el uso de inhibidores de la NOS en choque

hemorrágico, están limitados por el uso de inhibidores que son ya sea más selectivos para ecNOS o

son no selectivos, inhibiendo ambas isoformas (ecNOS e iNOS). Incluso inhibidores altamente

selectivos para iNOS pueden interferir potencialmente con la actividad de ecNOS a altas dosis o

concentraciones tisulares elevadas. Por lo tanto, el problema ha sido el eliminar el exceso del óxido

nítrico mientras se mantienen niveles básales benéficos.

Hasta éste momento el donador potente del óxido nítrico nitroprusiato de sodio ha demostrado

10

disminuir la lesión tisular y mejorar la función orgánica en diversos modelos de isquemia/reperfusión

aislada de pulmón, corazón, páncreas e intestino.16-21 Nuestra pregunta de estudio fue: ¿ El uso del

donador del óxido nítrico nitroprusiato de sodio reducir la respuesta inflamatoria hepática posterior a

choque hemorrágico no controlado?.

HIPÓTESIS

El uso del nitroprusiato de sodio como donador del Oxido Nítrico reduce la respuesta inflamatoria

hepática posterior a choque hemorrágico no controlado.

OBJETIVO

Determinar si el uso del donador del óxido nítrico nitroprusiato de sodio puede reducir la respuesta

inflamatoria hepática posterior a choque hemorrágico no controlado.

OBJETIVOS PARTICULARES

1. Determinar el efecto sobre la función hepática en animales sometidos a choque hemorrágico

no controlado y el uso del donador del óxido nítrico nitroprusiato de sodio.

2. Determinar la actividad de la mieloperoxidasa hepática (MPO) en animales sometidos a

choque hemorrágico no controlado y el uso del donador del óxido nítrico nitroprusiato de sodio

3. Evidenciar los cambios histopatológicos de la glándula hepática en animales sometidos a

choque hemorrágico no controlado y el uso del donador del óxido nítrico nitroprusiato de

sodio.

4. Determinar la expresión hepática de citocinas IL-lα , IL-1β , TNFβ , IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL

10, TNFα , IL-2, IFNγ en animales sometidos a choque hemorrágico no controlado y el uso del

donador del óxido nítrico nitroprusiato de sodio.

5. Determinar la cantidad de líquidos requeridos para reanimar, en animales sometidos a

11

choque hemorrágico no controlado y el uso del donador del óxido nítrico nitroprusiato de

sodio.

6. Determinar la sobrevida en animales sometidos a choque hemorrágico no controlado y el uso

del donador del óxido nítrico nitroprusiato de sodio.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para este estudio se utilizaron setenta y dos (72) ratas macho Sprague-Dawley (Charles River

Breeding Laboratories, Inc., portage, MI) con un peso de entre 250 - 300 gramos. Se les permitió

acceso libre a comida y agua ad libitum hasta el día de la operación. Después de ser pesadas, las ratas

fueron anestesiadas con pentobarbital sódico (Nembutal®, Abbott Laboratories, North Chicago, IL)

intraperitonealmente (50 mg/kg). Se colocaron entonces en un colchón térmico (MUL-T-PAD®;

Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY), que se conectó a una unidad de terapia de calor

(1VIICRO-TEMP® Pump; Seabrook Medical Systems, Inc., Cincinnati, OH) y se rasuró la región

inguinal. El protocolo experimental fue revisado y aprobado por el Comité de cuidado y uso de

Animales del Borgess Research Institute en el Borgess Medical Center, en Kalamazoo, Michigan, en

los Estados Unidos de Norteamérica. Todos los experimentos fueron practicados en conformidad con

la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" de los Institutos Nacionales de Salud.

Técnica Quirúrgica

Después de aplicar solución de isodine-pivodine, se cubrió la región inguinal en preparación para un

procedimiento quirúrgico estéril. Se disecó y canuló la arteria y vena femoral derechas con un catéter

intravenoso (no. 22 GA y no. 19 GA, respectivamente. Intracath; Becton Dickinson, Sandy, UT). El

catéter arterial se conectó a un transductor (Transpac; Abbot Critical Care Systems, North Chicago,

IL). El transductor se conectó entonces a un monitor de presión Hewlett-Packard (no. 78353A; Palo

Alto, CA). La línea arterial se utilizó para monitoreo continuo de presión arterial media (PAM) y para

toma de sangre. El catéter venoso fue utilizado para la infusión de líquidos.

12

Diseño Experimental

El experimento fue realizado utilizando un modelo de choque hemorrágico no controlado descrito

previamente.22 Brevemente, el insulto inició (tiempo cero) con la extracción de sangre (3 mL/100g) a

través de la cánula arterial en un periodo de 15 minutos, seguido por un periodo de estabilización de

15 minutos. A los 30 minutos, se agregó choque hemorrágico no controlado mediante la amputación

de la cola en un 75% de su longitud, medida desde la punta (extremo más distal). La sangre obtenida

de la herida de la cola se midió y se desechó. Esta fase se denominó "fase prehospitalaria" y se

continuó por 60 minutos. Durante este periodo, se consiguió la reanimación con solución de Ringer

Lactado (RL) y la meta era mantener una PAM de 40 mmH g, iniciando inmediatamente posterior al

corte de la cola. A los 90 minutos, empezó una fase que simula el tratamiento hospitalario ("fase

hospitalaria") mediante la reparación (sutura) de la herida de la cola. Esta fase se continuó por 60

minutos. Durante esta fase, la reanimación hídrica fue mantenida con solución de RL, y el objetivo

terminal era el mantener una PAM de 70 mmHg. Se documentó la cantidad de solución de RL

utilizada en la reanimación. Las ratas que sobrevivieron el experimento por 150 minutos (n =10 por

grupo) se les retiró los catéteres, se les suturó la herida y se colocaron en contenedores plásticos para

observación tardía (tres días). Los animales utilizados para exámenes de laboratorio (n = 8 por grupo)

fueron sacrificados con una sobredosis de pentobarbital sódico a las 4 horas (240 minutos) del

experimento (figura 2).

13

Figura 2. El diseño experimental para este estudio. Hubo cuatro grupos (n = 18 por grupo). A todas las ratas se les

extrajo sangre (3 ml/l00g) durante los 15 minutos iniciales. A los 30 minutos, se agregó choque hemorrágico no

controlado amputando el 75% de la cola, y se administró la droga. Durante los siguientes 60 minutos, todas las ratas

recibieron reanimación hídrica (RH) "prehospitalaria" para mantener una presión arterial media (PAM) de 40 mmhg

con solución de Ringer Lactado (RL). En la "fase hospitalaria", se controló el sangrado y se continuó la reanimación

con RL a una PAM de 70 mmhg. Pre-Hosp, prehospitalaria; admon, administración; Exam Lab, exámenes

laboratoriales.

Se analizaron cuatro grupos de animales (n = 18 por grupo): sham mas solución salina (grupo 1, sham

sin tratamiento, o sham operado sin tratamiento); Sham mas nitroprusiato de sodio (0.5 mg/kg)18

(grupo 2, sham mas tratamiento, o sham operado mas tratamiento); solución salina (grupo 3, shock sin

tratamiento, o control); nitroprusiato de sodio (0.5 mg/kg)18 (grupo 4, shock mas tratamiento). Los

animales sham-operados (sham, simulan modelo experimental) fueron sometidos a anestesia e

instrumentación (canulados) en forma y tiempos identicos a los animales chocados, y con aplicación

de los tratamientos estipulados, pero no se realizó choque hemorrágico en ellos. En la tabla número 1

se resumen los grupos de tratamiento utilizados.

14

Tabla 1. DISEÑO EXPERIMENTAL

(Grupos y Número de animales tratados)

SOBREVIVA EXÁMENES LAB TOTAL

Sham + Sol. Salina 10 8 18

Sham + NP 10 8 18

Shock + Sol. Salina 10 8 18

Shock + NP 10 8 18

Total 40 32 72

Lab, laboratoriales; Sham, simulado; Sol, solución; NP, nitroprusiato

Tratamiento

Todas las ratas fueron tratadas al momento de inicada la reanimación (tiempo 30 minutos) con uno

de los siguientes: solución salina (grupos 1 y 3), y con nitroprusitato de sodio (0.5 mg/kg, grupos 2

y 4).18 El nitroprusiato de sodio (Gensia Pharmaceuticals, INC. Irvine, CA) es disodio

pentacyanonitrosylferrato(2-)dihidrato, un agente hipotensor inorgánico cuya formula estructura es:

cuya formula molecular es Na2[Fe(CN)5NO]•2H2O, y cuyo peso molecular es 297.95. La principal

15

acción farmacológica del NP es relajación del músculo liso vascular y dilatación consecuente de las

arterias y venas periféricas. En la práctica clínica, el NP esta indicado en la reducción inmediata de la

presión arterial de pacientes en crisis hipertensivas. El NP también esta indicado en el tratamiento de

insuficiencia cardiaca congestiva aguda. Como señalamos y justificamos con suficiencia en el marco

teórico de este trabajo, el enfoque biomolecular de la utilización del NP como donador exógeno de

Oxido Nítrico, busca los efectos benéficos sobre la cascada proinflamatoria generada, en nuestro

modelo, por el choque hemorrágico y de ahí la originalidad de la idea.

Pruebas de Función Hepática

Para estimar la lesión hepática y obtener un estudio indicador de falla hepática, determinamos los

niveles séricos de aspartato aminotransferasa (AST) y alanino aminotransferasa (ALT) a los 150

minutos del experimentos (n = 8 por grupo). Los niveles de las enzimas fueron medidos con analizador

automático marca Hitachi, modelo 917 (Hitachi Ltd., Tokyo, Japón).

Mieloperoxidasa de Tejido Hepático (MPO)

Se evaluó la actividad de la MPO en homogenados de tejido hepático y fueron utilizados como un

índice de acumulación neutrofilica en el higado (n = 8 por grupo). Las muestras de tejido fueron

obtenidas 4 horas después de la reanimación, congeladas en nitrógeno líquido, y almacenadas a 79°C

hasta el análisis. Las muestras de higado (200 - 300 mg) fueron homogenizadas en 5 mL de un buffer

de fosfato de potasio de 50-mmol/L que contiene 0.5% de HTAB y entonces fueron sonicadas, dos

veces deshieladas, resonicadas, y centrifugadas por 10 minutos a 14,000 X g a 4°C. La actividad

de la MPO fue evaluada incubando por 3 minutos 100 ? L de los sobrenadantes a 37°C en una

solución de reacción que contiene 40% de salina amortiguada con fosfato, 8% de DMFA, 1.6

mmol/L de TMB, 0.3 mmol/L de H2O2, y 80 mmol/L de fosfato de sodio (pH 5.4) 24,25 La reacción

se detuvo agregando 800 mmol/L de solución de ácido acético enfriada en hielo (pH 3.0) y

colocando los tubos de ensayo en hielo. La absorvancia fue leída a 655 nm. La actividad de la MPO

fue calculada como el cambio en la absorvancia por minuto por gramo de tejido hepático y

16

multiplicado por el factor de dilución.

Estudios Histológicos

Se obtuvieron treinta y dos muestras de tejido hepático (n = 8 por grupo) 4 horas después de la

reanimación, fijadas en formaldheido al 10%, y embebidas (sumergidas) en parafina. Se cortaron las

muestras (5, µ m de espesor) y se tiñeron con hematoxilina y eosina para su examen con microscopio

electrónica. Se aplicó análisis ciego a todas las muestras. Los cambios histológicos se graduaron de 0 a

4 basados en la clasificación de Suzuki y colaboradores.26 El grado de necrosis hepática se determinó

como sigue: 0, nada; 1, necrosis de una sola célula; 2, ≤30% de necrosis lobular; 3, ≤60% de necrosis

lobular; y 4, >60% de necrosis lobular.

Prueba de Protección de Ribonucleasa con Multisonda (PPR)

Para evaluar si el nitroprusiato de sodio (NP) disminuye la producción de citocinas proinflamatorias en

estos experimentos, medimos en el hígado la expresión del mRNA de IL-lα , IL- 1β, TNFβ , IL-3, IL-4,

IL-5, IL-6, IL-10, TNFα , IL-2, IFNγ mediante PPR (del Inglés, Multi-probé Ribonuclease Protection

Assay, RPA). Las muestras de hígado se obtuvieron inmediatamente después del sacrificio de los

animales (tiempo, 4 horas de la reanimación), congeladas en nitrógeno líquido, y almacenadas a -79°C

hasta el análisis. Se aislaron RNAs celulares totales de homogenados de hígado. Se utilizó una placa

rCK-1 de cDNA (Pharmingen, Inc., San Diego, CA) para sintetizar una multisonda antireceptores

cRNA con [32P]-α UTP (800 Ci/mmol, 10 mCi/ml; NEN-Dupont, Boston, MA) como un identificador,

usando un kit de transcripción in vitro de acuerdo al protocolo del manufactor (Pharmingen, Inc.).

Brevemente, se hibridaron 15 l,g de RNA por cada una de las muestras, con la sonda antireceptora de

RNA a 56°C por 12 horas. Después de la hibridación, la sonda libre y el RNA

no protegido fueron digeridos con una solución de RNasa (RNasa A + RNasa TI). El RNA de

doble cadena fue entonces extraído en alcohol cloroform/isoamil (50:1), precipitado en etanol

y separado en un gel de poliacrilamida de 7 M urea/6%. Una línea con la sonda no digerida

sirvió como los marcadores medidos. Se secó entonces el gel, se expuso a una placa de X-Omat

17

(Eastman Kodak, Rochester, NY).

La placa de rCK cDNA contiene fragmentos que corresponden a genes de citocinas EL- lα , IL-1β,

TNFβ , EL-3, IL-4, EL-5, IL-6, IL-10, TNFα , IL-2, IFNγ de rata y dos fragmentos de genes de

respaldo para L32 (gen de la proteina Ribosomal L32 del mRNA) y GAPDH (gen de Gliceraldehido

3Fosfato Deshidrogenasa). Se utilizó una gráfica estándar con los marcadores de la sonda no digerida

para identificar las bandas de varios genes en las muestras experimentales.

Análisis Estadístico

Todos los valores en el texto y en las figuras incluyen media + error estándar de la media (SEM). Un

valor de p <0.05 fue aceptado como estadísticamente significativo. Los datos fueron analizados

mediante procedimientos de one-way ANOVA (prueba de F para interacción, prueba de F para efectos

principales, pruebas de Fisher's); la prueba de Kruskal-Wallis seguida de pruebas de MannWhitney

(para igualdad de rangos); y prueba de registro de rangos para efecto de sobrevida (pairwise Log-Rank

test). El análisis fue practicado utilizando SAS (versión 6.2), SPSS (versión 8.0), Minitab (versión

12.23), y SigmaStat® (versión 2.0).

RESULTADOS

Requerimientos Hídricos

Fue necesaria solución de RL para reanimación en todos los grupos, excepto en los sham-operados

(grupos 1 y 2). Los requerimientos hídricos promedio para cada uno de los grupos se muestran en la

figura 3. Los valores a las 2.5 horas del experimento fueron: 16.39 ± .43, 9.15 ± .08 mL para los

controles (grupo 3) y los tratados (grupo 4), respectivamente. Los animales en el grupo control

requirieron significativamente mayor cantidad de solución de RL que el grupo tratado (p =0.0001). La

diferencia de líquidos entre los grupos 3 y 4 es significante.

_

18

Figura 3. Requerimientos hídricos para mantener una presión arterial media de 40 mmhg durante la "fase

prehospitalaria" y 70 mmHg durante la "fase hospitalaria". El tratamiento con nitroprusiato de sodio administrado al

inicio de la reanimación (grupo 4) demostró una diferencia significativa (p x.0001) en comparación con el grupo

control (grupo 3). Valores expresados en mililitros. Sal, salina; NP, nitroprusiato; mL, mililitros.

Pruebas de Función Hepática

Las enzimas evaluadas en este estudio (AST y ALT) se muestran en la figura 4. A la conclusión de la

"fase hospitalaria" (150 minutos), los niveles séricos de AST fueron: 65.50 ± 1.36, 63.87 ± 1.60,

242.12 ± 11.97, y 69.37 ± 2.62 IU/L para los grupos sham sin tratamiento, sham con tratamiento,

control y shock mas NP, respectivamente. Los niveles de AST fueron significativamente mas bajos (p

< 0.001) cuando se comparó el grupo de shock mas NP (grupo 4) con el control (grupo 3). También se

encontraron niveles de AST significativamente menores (p =0.0001) cuando se compararon los grupos

sham-operados (grupos 1 y 2) con el control (grupo 3). A los 150 minutos, los niveles séricos de ALT

fueron: 46.12 ± 3.30, 46.12 ± 3.29, 213.62 ± 3.04, y 55.75 ± 1.03 IU/L

19

para los grupos sham sin tratamiento, sham con tratamiento, control y shock mas NP, respectivamente.

Los niveles disminuidos de ALT fueron significativamente diferentes (p =0.0001) cuando los grupos

sham operado (grupos 1 y 2) y shock mas NP (grupo 4) fueron comparados con el control (grupo 3).

Figura 4. (A) Niveles séricos de aspartato aminotransferasa (AST) y (B) alanino aminotransferasa (ALT) a la

conclusión de la "fase hospitalaria"(150 minutos). La utilización de nitroprusiato de sodio produjo una disminución

significativa (p =0.0001) de AST y ALT. Sal, salina; NP, nitroprusiato; IU, Unidades Internacionales.

B

A

20

Mieloperoxidasa de Tejido Hepático (MPO)

Determinamos la actividad de la MPO hepática como un índice de acumulación neutrofilica en el

higado después de choque hemorrágico no controlado (figura 5). Cuatro horas después del choque

hemorrágico y reanimación, los niveles de UPO estuvieron significativamente disminuidos (p < 0.05)

en las ratas tratadas con NP (grupo 4, 10 ± 0.7 U/g) y en las ratas sham operadas (grupos 1 y 2, 8.7 ± 1

y 13 ± 1 U/g, respectivamente) cuando se compararon con los controles (19.1 ± 1 U/g). Las diferencias

entre los grupos 1, 2 y 4 no fueron significativas por análisis de varianza.

Figura 5. Actividad de la mieloperoxidasa (MPO) en el tejido hepático 4 horas después de la reanimación. El

tratamiento con nitroprusiato de sodio produjo un efecto protector significativo cuando se comparó con el grupo

control (P < 0.05). De igual suerte, los grupos sham-operados mostraron niveles de MPO significativamente

menores (p < 0.05), cuando se compararon con el grupo control.

21

Resultados de Histología

Cuatro horas después del choque y reanimación (figura 6), la severidad de la congestión sinusoidal

(3.37 ± 0.18) y la vacuolización citoplásmica (3.50 ± 0.18) fueron mas evidentes en el grupo control (p

=0.001) y el grado de necrosis fue de 2.0 ± 0.26 (p =0.001). El uso del NP (grupo 4) redujo

significativamente el daño al hígado, resultando en calificaciones de severidad de 0.25 ± 0.16 (p =

0.001). En las figuras 7 y 8 presentamos el daño histológico observado en los controles y el grupo

tratado con NP, respectivamente.

Figura 6. Hallazgos histológicos evaluados de acuerdo con el sistema de graduación de Suzuki y asociados26 en los

grupos Sham-operados (con y sin administración de NP), el control (grupo 3), y en el tratado con NP (grupo 4)

después de choque hemorrágico no controlado y reanimación. Se observó una congestión, vacuolización y necrosis

incrementados en el grupo con choque sin tratamiento. El uso de nitroprusiato de sodio (grupo 4, ShockINP) redujo

significativamente el daño al higado, asi evidenciado por calificaciones de severidad disminuidos (p -0.001).

22

Figura 7. Análisis microscópico del hígado de una rata control muestra una congestión sinusoidal y vacuolización

citoplásmica severos. Hematoxilina y eosina; magnificación original X 100.

Figura 8. Análisis microscópico del hígado de una rata lesionada tratada con nitroprusiato de sodio muestra una

congestión leve y vacuolización citoplásmica mínima. Hematoxilina y eosina; magnificación original X 100.

23

Prueba de Protección de Ribonucleasa con Multisonda (PPR)

Para evaluar si el nitroprusiato de sodio (NP) disminuye la producción de citocinas proinflamatorias en

estos experimentos, medimos en el hígado la expresión del mRNA de IL-lα , EL- 1β , TNFβ, IL-3, IL-

4, IL-5, IL-6, IL-10, TNFα , IL-2, IFNγ, mediante PPR (Prueba de Protección de Ribonucleasa con

Multisonda). Las ratas sham-operadas (sham + salina, grupo 1) tuvieron niveles bajos de mRNA de

IL-lα , IL-1β , TNF-β, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α , IL-2, IFNγ presentes en el hígado, y estos

niveles bajos no se afectaron con el tratamiento con nitrorpusiato de sodio (sham mas NP, grupo 2).

Las ratas sometidas a choque hemorrágico (shock mas salina, grupo 3) demostraron un expresión

hepática incrementada de mRNA de IL- lα , EL- 1β , TNFβ , IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 10, TNFα , IL-2,

IFNγ, y la expresión de todas estas citocinas se redujo con el tratamiento con nitrorpusiato de sodio

(shock mas NP, grupo 4) (figura 9).

Figura 9. El nitrorpusiato de sodio disminuyó la expresión hepática de mRNA de IL-lα , IL-1β, TNFβ, EL-3, EL-4,

IL-5, IL-6, IL-10, TNFα , IL-2, IFNγ. La expresión de estas cotocinas proinflamatorias fue determinado mediante

Prueba de Protección de Ribonucleasa con Multisonda (PPR) en muestras de tejido hepático obtenidas a las 4 horas

de choque hemorrágico y reanimación. NP, nitroprusiato.

24

Sobrevida

El efecto del nitroprusidato de sodio (grupo 4) en la sobrevida se demuestra en la figura 10. Se

observaron mejores tasas de sobrevida en este grupo (60%), que en control (40%), aunque esta

diferencia no fue estadísticamente significativa.

Minutos Días

Figura 10. En esta figura se muestran los porcentajes de sobrevida (n = 10 por grupo). Se observó mejor sobrevida

en el grupo de choque hemorrágico tratado con nitroprusiato de sodio (60%), en comparación con el grupo choque

sin tratamiento (40%), aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa.

25

DISCUSIÓN

El Oxido Nítrico juega un papel importante en un vasto arreglo de funciones celulares mediando vías

de señales de trasnferencia intracelulares, modulando el estrés oxidativo celular, regulando la

activación del factor de transcripción nuclear, y mediando la expresión de genes.27,28 El NO también

puede alterar profundamente la función orgánica mediante la regulación del flujo sanguíneo regional y

la perfusión orgánica.28 Sin embargo, a medida que ha incrementado nuestro conocimiento en relación

a los numerosos efectos del NO, se ha hecho más evidente la complejidad del papel del NO durante el

choque hemorrágico. La mayoría de los estudios que examinan el papel del NO en choque

hemorrágico han utilizado inhibidores de la NOS (Sintasa del Oxido Nítrico) que actúan ya sea

predominantemente contra ecNOS o inhibiendo en forma no selectiva ecNOS e iNOS. La actividad de

ecNOS esta disminuida después de choque hemorrágico,9 y el proporcionar NO con donadores

exógenos en las fases tempranas de la reanimación mejora la presión sanguínea y la sobrevida a corto

plazo.15 La inhibición de la NOS con compuestos que no son selectivos o que parcialmente inhiben la

ecNOS incrementan la lesión tisular, sugiriendo que la actividad de la ecNOS es esencial para

mantener la perfusión orgánica y tisular durante la hipovolemia.12 El uso de inhibidores con mayor

selectividad hacia iNOS, sin embargo, es benéfico contra la lesión tisular inducida por el choque.2 Por

lo tanto, el mantener los efectos protectores de la actividad de la NOS (ecNOS) mientras se previenen

los efectos lesivos potenciales de la actividad de la NOS (iNOS excesiva), es un obstáculo significante

en los intentos para manipular terapéuticamente la actividad de la NOS después de choque

hemorrágico. Aun los inhibidores más selectivos de la iNOS pueden inhibir potencialmente la ecNOS

si se usa una dosis suficiente, debido a que el inhibidor perfectamente selectivo de la NOS no ha sido

aun desarrollado.

La utilidad potencial de reducir los niveles excedidos de NO después de choque hemorrágico y las

limitaciones de los inhibidores de la NOS desarrollados hasta ahora, se combinan para favorecer la

utilidad potencial de compuestos desarrollados para "barrer" o enlazar el NO en exceso. Un "barredor"

de NO debe ser suministrado en una manera que no interfiera con la función esencial de la ecNOS y

aun neutralizar el NO producido en exceso a partir de la iNOS, que puede mediar el daño

26

tisular. En nuestros experimentos, nosotros utilizamos un donador exógeno de NO (nitroprusiato de

sodio) al inicio de la reperfusión (reanimación) después del choque hemorrágico en cuatro grupos

diferentes de animales (sham-operados, control y un tratado). En el grupo de animales sometidos a

choque hemorrágico, el tratamiento con nitroprusiato de sodio disminuyó la cantidad de líquidos

requeridos para reanimación y redujo la lesión hepática inducida por el choque en comparación con los

controles tratados con solución salina. La administración de NP también mejoró la sobrevida a tres

días, comparado con los animales tratados con solución salina, y no representó efectos nocivos

aparentes en los animales sham-operados. Ciertamente esta mejoría no reflejó una significancia

estadística. Sin embargo, vale la pena recordar que el modelo de choque hemorrágico practicado en

nuestros experimentos es muy agresivo por naturaleza. Pretende simular a aquellas víctimas de trauma

con apoyos de atención muy elementales. Nuestro objetivo se ha centrado en valorar la respuesta

inflamatoria de un órgano blanco (el hígado) en estas circunstancias. Los resultados encontrados con

las terapias utilizadas (nitroprusiato de sodio) sugieren que mejorando la respuesta inflamatoria, junto

con un apoyo integral intensivo se pudiera mejorar los índices de sobrevida en condiciones de choque

hemorrágico. Por consiguiente, el limitar la respuesta inflamatoria es tan solo parte del manejo integral

de los pacientes víctimas de trauma que caen en falla orgánica múltiple y finalmente los conduce a la

muerte. La reducción de la lesión con NP estuvo asociada con una disminución en la infiltración de

polimorfonucleares (PMN), sugiriendo que el NP puede reducir la lesión tisular, en parte, reduciendo

el infiltrado celular inflamatorio inducido por el choque.

La habilidad del NP para reducir la lesión hepática inducida por el choque, en nuestro trabajo, es

similar a hallazgos previos de reducción de lesión tisular inducida por choque en ratas tratadas con el

uso del inibidor de iNOS L-N6-(1-iminoethil)lisina y en ratones sin iNOS (genéticamente

manipulados).2,15 En esos animales, la inhibición de la 1NOS después de choque estuvo asociada con

infiltración pulmonar disminuida de PMN y con una reducción en la respuesta inflamatoria, con una

expresión disminuida de IL-6 y del factor estimulante de la colonia granulocitaria, y con una

activación disminuida del nuclear factor-κB y STAT3.2 Similarmente, el tratamiento con NP produjo

una expresión disminuida de las citocinas IL-lα , EL- 1β , TNF-β, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α ,

IL-2, IFNγ después de hemorragia en estos experimentos. Estos hallazgos sugieren que una

27

reducción en la respuesta proinflamatoria por el NP puede contribuir a sus efectos benéficos posterior

a hemorragia.

Se ha hipotetizado que la interacción de NO con el superóxido (O2) produce peroxinitrito que

contribuye con la lesión tisular después de isquemia y hemorragia. 5,6,29 Nosotros detectamos niveles

reducidos de AST y ALT como pruebas de funcionamiento hepático y niveles bajos de MPO como un

índice de infiltración (acumulación) neutrofilica en el hígado. Estos hallazgos pudieran sugerir que los

efectos benéficos del NP en la lesión hepática también se deben, en parte, a menor biodisponibilidad

de NO en el sitio de la lesión, imposibilitando la formación de peroxinitrito vía interacción con el

superóxido y subsecuente limitación del daño. De la misma manera, el tratamiento con NP y la

consecuente disminución en la expresión de citocinas proinflamatorias, demostradas en estos

experimentos, bloquearía la expresión de moléculas de adhesión intercelulares (1CAMs),12,17 ,20 con

limitación del rodamiento, aplanamiento e infiltración neutrofilica subsecuente. Por lo tanto, el

tratamiento con nitroprusiato de sodio después de hemorragia esta asociado con un número de efectos

benéficos potenciales, incluyendo una reducción en la producción de citocinas proinflamatorias, en la

formación de peroxinitrito, infiltración tisular neutrofilica, y el daño tisular inducido por el choque.

Los hallazgos en el sentido de que los pacientes victimas de trauma que han experimentado

hipotensión expresan iNOS en tejido hepático30 sugieren que se necesita trabajo adicional en el papel

del NO en choque hemorrágico.

Otros autores han hipotetizado que el NO media la descompensación vascular asociada al choque

hemorrágico prolongado y que el inhibir el NO puede mejorar el tono vascular e incrementar el flujo

sanguíneo a tejidos vitales.11 Aunque aun tiene que ser demostrado si el NO es responsable de la

descompensación vascular después de la hemorragia, en nuestro diseño experimental, el NP se

administró después que había ocurrido la descompensación vascular. Las ratas tratadas con NP

tuvieron menor requerimiento hídrico para reanimación que las ratas tratadas con solución salina. Por

lo tanto, si el NO contribuye con la descompensación vascular inducida por el choque, es posible

entonces que el NP mejore el tono vascular y/o la perfusión tisular al "barrer" el superóxido (O2),

limitando así la biodisponibilidad de NO (producido en exceso vía iNOS) y la formación de radicales

28

más potentes. El determinar si el NP puede prevenir o retrasar la descompensación vascular después

de hemorragia, requerirá más estudios. Por lo tanto, el nitroprusiato de sodio representa un compuesto

prometedor para estudiar la producción de NO y el efecto de la síntesis de NO en los sistemas in vivo,

utilizando otros órganos como blanco y en modelos de choque hemorrágico. El investigar al

nitroprusiato de sodio en un modelo de choque hemorrágico nos ha permitido demostrar sus bondades

como donador potente de Oxido Nítrico. Si bien se usa en el terreno clínico como un potente

hipotensor, en la forma que se ha empleado no demostró alteraciones hemodinámicas incontrolables y

con repercusiones en la cascada proinflamatoria de los animales tratados. Se necesitan más

investigaciones en la arena clínica para determinar la verdadera eficacia del nitroprusiato de sodio

como terapia adyuvante a la reanimación, posterior a choque hemorrágico. De igual suerte, siguen

teniendo un papel importante las investigaciones con los inhibidores selectivos de la Sintasa inducible

del Oxido Nítrico. El poder limitar la producción de NO en exceso, generado por esta vía, representa

una interesante alternativa de estudio, con impacto directo en la limitación del daño multiorgánico y

muerte posterior a trauma y hemorragia.

CONCLUSIONES

En conclusión, en este estudio demostramos que la administración de nitroprusiato de sodio, como un

donador potente de Oxido Nítrico, después de choque hemorrágico, mejora la respuesta hemodinámica

a la hemorragia, reduce la lesión tisular, la expresión de citocinas proinflamatorias, la acumulación

neutrofilica, y mejora la sobrevida a tres días, comparado con animales tratados con solución salina.

Estos datos apoyan la hipótesis de que el Oxido Nítrico excesivo, generado a través de la iNOS,

contribuye a la lesión tisular inducida por la hemorragia y que el reducir la biodisponibilidad en

exceso de ese NO puede ser benéfico después de la hemorragia.

29

ANEXOS

Abreviaturas usadas en este Trabajo

CH Choque Hemorrágico

RH Reanimación Hídrica

RL Ringer Lactado

PAM Presión Arterial Media

NO Oxido Nítrico

PPR Prueba de Protección de Ribonucleasa con Multisonda

MPO Mieloperoxidasa

NOS Sintasa del Oxido Nítrico

iNOS Sintasa Inducible del Oxido Nítrico

ecNOS Sintasa Endotelial Constitutiva del Oxido Nítrico

HS Hemorrhagic Shock

FR Fluid Resuscitation

LR Lactated Ringer's

MAP Mean Arterial Pressure

I/R Isquemia/Reperfusión

FOM Falla Orgánica Múltiple

30

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