Çukurova Ünİversİtesİ fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ doktora...

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

DOKTORA TEZİ

Bülent ZORLUGENÇ

ÇEŞİTLİ GIDA MADDELERİNDEN Flavobacterium aurantıacum

İLE AFLATOKSİN B1

ÜZERİNE BİR ARAŞTIRMA

MİKTARININAZALTILMASI

GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI

ADANA, 2009

I

ÖZ

DOKTORA TEZİ

ÇEŞİTLİ GIDA MADDELERİNDEN Flavobacterium aurantiacum İLE AFLATOKSİN B1 MİKTARININ AZALTILMASI ÜZERİNE BİR ARAŞTIRMA

Bülent ZORLUGENÇ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI

Danışman : Prof.Dr. Bülend EVLİYA Yıl : 2009, Sayfa: 141 Jüri : Prof.Dr. Bülend EVLİYA

Prof. Dr. Halime PAKSOY Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Yrd. Doç. Dr. Işıl VAR Yrd. Doç. Dr. Ahmet Doğan DUMAN

Bu çalışmada, Flavobacterium aurantiacum NRRL B-184 suşunun potasyum fosfat tamponu (PFT) ortamında ve sıklıkla aflatoksin sorunu yaşanan kırmızı biber, mısır, zeytin, soya fasulyesi, kuru incir ve fındıkta aflatoksin B1 (AFB1)’i ortamdan uzaklaştırma yeteneği araştırılmıştır.

Aktifleştirilmiş F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun triptik soy broth (TSB) besiyerinde ve 30oC inkübasyon sıcaklığındaki gelişimine ait gelişme eğrisi elde edilmiş ve doğrusal olmayan regresyon analizi sonuçlarına göre gelişme eğrisini tanımlamada Modifiye Gompertz modelinin daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır. Modelden elde edilen verilere göre, F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun maksimum spesifik gelişme hızının 0.073 saat-1, lag süresinin ise 5.244 saat olduğu hesaplanmıştır. Ayrıca başlangıç hücre sayısı 1.32 x 107 kob ml-1 olan F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun 45 saatte 2.7 log’luk bir artışla durgun faza geçtiği ve 95. saat sonunda hala durgun fazda olduğu belirlenmiştir.

İnkübasyon süresince, F. aurantiacum NRRL B-184 içermeyen kontrol örneklerinin AFB1 içeriğinde önemli bir değişim görülmezken, bakteri hücrelerini içeren PFT ve gıda ortamlarında AFB1 miktarında sürekli bir azalma gerçekleşmiştir. Bu durum, toksin miktarındaki azalmanın F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin bir faaliyeti sonucu meydana geldiğini göstermektedir.

F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış PFT ve gıda ortamlarındaki azalmanın “Birinci Dereceden Reaksiyon Kinetiğine” uygun olduğu tespit edilmiştir. Bu modele göre birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını gösteren “k” değeri en yüksek PFT ortamlarında bulunmuş ve bunu öğütülmüş ürünlerde genel itibariyle incir, bütün ürünlerde ise zeytin izlemiştir. Öğütülmüş ve bütün haldeki ürünlerde çalışılan tüm aflatoksin konsantrasyonlarında en düşük k değerlerine soya fasulyesi örnekleri sahip olmuştur.

Konsantrasyon ve boyut önemsenmeksizin, inkübasyon süresi sonunda ürünlerin AFB1 içeriğindeki azalma 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün haldeki soya fasulyesinde %84.28 ile en düşük ve 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş fındıkta %99.84 ile en fazla olarak gerçekleşmiştir.

72 saatlik inkübasyon sonunda 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kırmızı biber, 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kuru incir ile 500 ve 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş fındık örnekleri Türk Gıda Kodeksinde bu ürünlerin insan gıdası olarak kullanılması durumunda izin verilen AFB1 düzeylerine inebilmiştir.

Anahtar kelimeler: Flavobacterium aurantiacum, Aflatoksin B1, Detoksifikasyon, Kinetik, Tahminsel

Mikrobiyoloji

II

ABSTRACT

PhD THESIS

A RESEARCH ON DEGRADATION OF AFLATOXIN B1 FROM

VARIOUS FOODS BY Flavobacterium aurantiacum

Bülent ZORLUGENÇ

DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES

UNIVERSITY OF ÇUKUROVA

Supervisor :Prof.Dr. Bülend EVLİYA Year :2009, Pages: 141 Jury :Prof.Dr. Bülend EVLİYA

Prof. Dr. Halime PAKSOY Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Yrd. Doç. Dr. Işıl VAR Yrd. Doç. Dr. Ahmet Doğan DUMAN

In this study, the ability of Flavobacterium aurantiacum NRRL B-184 strain to remove aflatoxin B1 in potassium phosphate buffer (PPB) solution and dry red pepper, corn, olive, soy bean, dry fig and also hazelnut, was investigated.

The activated F. aurantiacum NRRL B-184 strain was incubated in triptic soy broth (TSB) at 30°C and growing curve was obtained. According to non-linear regression analysis, Modified Gompertz model was fitted best with experimental data. The maximum specific growing rate (µmax) and lag time (λ) were found as 0.073 h-1 and 5.244 h, respectively. It was observed that F. aurantiacum NRRL B-184 strain increased by 2.7 log and reached to the stationary phase within 45 h. The bacteria were still in that phase at 95 h.

During incubation, aflatoxin B1 contents of control samples were not changed significantly. However in PPB and food mediums, the level of aflatoxin B1 was decreased continuously. This situation was indicated that, the reduction of aflatoxin B1 content was relevant to the activity of F. aurantiacum NRRL B-184 cells.

First order reaction kinetics was fitted best with the reduction kinetics. In PPB medium, the “k value” was found higher and followed by milled dry fig and whole olive. Also, the lower “k value” was found in soy bean samples.

At the end of incubation, the reduction of aflatoxin B1 content were resulted in the rate of % 84.28 and % 98.84 at whole soy bean (1000 ng g-1 AFB1) and milled hazelnut (500 ng g-1AFB1), respectively.

After incubation (72 h), aflatoxin content of milled red pepper, dry fig and hazelnut that contain 500 ng g-1 aflatoxin B1 and also whole hazelnut (1000 ng g-1 aflatoxin B1) decreased to permitted level of this toxin in Turkish Food Codex. Key words: Flavobacterium aurantiacum, Aflatoxin B1, Detoxification, Kinetic, Predictive

Microbiology

III

TEŞEKKÜR

Lisans ve lisansüstü eğitimim boyunca bana yol gösteren, araştırmamın

düzenlenmesi, gerçekleştirilmesi ve değerlendirilmesi sırasında yardımlarını

esirgemeyen danışman hocam Sayın Prof. Dr. Bülend EVLİYA’ya teşekkürlerimi

sunarım.

Öğrenim hayatım boyunca ilgi ve yardımlarını esirgemeyen Sayın Prof. Dr.

Hasan FENERCİOĞLU’na ve Yrd.Doç.Dr Sertaç ÖZER’e,

Manevi desteğinden dolayı eşim Arş. Gör. Feyza KIROĞLU

ZORLUGENÇ’e,

Bu araştırmanın gerçekleştirilmesi ve değerlendirilmesinde katkı ve

desteklerini gördüğüm; Sayın Prof.Dr. Halime PAKSOY’a, Doç.Dr. Hüseyin

ERTEN’e, Yrd.Doç.Dr. Işıl VAR’a ve Yrd.Doç.Dr. Ahmet Doğan DUMAN’a,

F. aurantiacum NRRL B-184 suşunu sağlayan United States Department of

Agriculture, Agricultural Research Service Midwest Area National Center for

Agricultural Utilization Research Labaratuvarı’na,

Toksin analizlerini yapabilmeme olanak sağlayan ve bu konudaki

deneyimlerini benden esirgemeyen Mersin İl Kontrol laboratuarından Gıda Yük.

Müh. İbrahim KARAYEL’e ve Ziraat Müh. Erhan DİNÇ ile Gaziantep İl Kontrol

laboratuarından Ziraat Yüksek Müh. Murat Reis AKKAYA’ya,

İlgi ve manevi desteklerini esirgemeyen değerli aileme,

Maddi ve manevi desteklerinden dolayı Ç.Ü. Araştırma Fonu ve Fen

Bilimleri Enstitüsü’ne,

teşekkürlerimi sunarım.

IV

İÇİNDEKİLER SAYFA

ÖZ ................................................................................................................................. I

ABSTRACT ................................................................................................................. II

TEŞEKKÜR ............................................................................................................... III

İÇİNDEKİLER .......................................................................................................... IV

ÇİZELGELER DİZİNİ ........................................................................................... VIII

ŞEKİLLER DİZİNİ ................................................................................................... XI

KISALTMALAR .................................................................................................... XVI

1. GİRİŞ ..................................................................................................................... 1

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ...................................................................................... 4

2.1. Aflatoksin ......................................................................................................... 4

2.2. Aflatoksinlerin Genel Özellikleri ..................................................................... 6

2.3. Aflatoksinler ve Biyosentezi ............................................................................ 8

2.4. Aflatoksinlerin Toksisitesi, Metabolizması ve Limitleri ............................... 10

2.5. Aflatoksinlerin Detoksifikasyonu .................................................................. 17

2.5.1. Fiziksel Ayırma ve Temizleme Yöntemleri ............................................. 17

2.5.2. Fiziksel Degradasyon Yöntemleri ............................................................ 18

2.5.2.1. Isı ..................................................................................................... 18

2.5.2.2. Işınlama ........................................................................................... 19

2.5.2.3. Adsorbsiyon .................................................................................... 19

2.5.2.4. Solventlerle Özütleme ..................................................................... 20

2.5.3. Kimyasal Detoksifikasyon Yöntemleri .................................................... 21

2.5.3.1. Asit Uygulaması .............................................................................. 21

2.5.3.2. Hidroksit ile Alkali Uygulaması ..................................................... 22

2.5.3.3. Bisülfit Uygulaması ........................................................................ 23

2.5.3.4. Hipoklorit Uygulaması .................................................................... 24

2.5.3.5. Amonyak Uygulaması ..................................................................... 25

2.5.3.6. Ozon Uygulaması ............................................................................ 27

2.5.4. Biyolojik Detoksifikasyon ....................................................................... 29

3. MATERYAL VE YÖNTEM ............................................................................... 43

3.1. MATERYAL ................................................................................................. 43

V

3.1.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Kültürü ........................................ 43

3.1.2. PFT Çözeltisi ............................................................................................ 43

3.1.3. İnce Tabaka Plakası .................................................................................. 43

3.1.4. Detoksifikasyonda Kullanılan Gıda Maddeleri ........................................ 43

3.1.5. Besiyerleri ve Kimyasal Maddeler ........................................................... 43

3.2. YÖNTEM ....................................................................................................... 44

3.2.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Canlandırılması ve Stok

Kültürlerin Hazırlanması .......................................................................... 44

3.2.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Gelişme Eğrisinin Elde

Edilmesi ................................................................................................... 44

3.2.3. F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Suşunun Durgun Faz Hücre

Süspansiyonunun Hazırlanması ............................................................... 44


Konsantrasyonunun Spektrofotometrik Olarak Belirlenmesi .................. 45

3.2.5. Durgun Faz da Bulunan F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu ile

Aşılanmış Ortamların AFB1 Konsantrasyonundaki Değişimin

Belirlenmesi ............................................................................................. 45

3.2.5.1. PFT İçerisinde F. aurantiacum NRRL B-184’un AFB1’in

Miktarı Üzerine Etkisinin Belirlenmesi .......................................... 45

3.2.5.2. PFT İçerisinde Değişik Gıda Ürünlerinde F. aurantiacum

NRRL B-184’ün AFB1’in Miktarı Üzerine Etkisinin

Belirlenmesi .................................................................................... 46

3.2.6. Aflatoksin Analizleri ................................................................................ 47

3.2.6.1. Gıda Örneklerinin Aflatoksin İçeriklerinin Kalitatif Olarak

Belirlenmesi .................................................................................... 47

3.2.6.2. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile AFB1

Analizi ............................................................................................. 47

3.2.6.2.(1). AFB1 Standart Çözeltisinin Hazırlanması ............................... 47

3.2.6.2.(2). PBS Çözeltisinin Hazırlanması ............................................... 47

3.2.6.2.(3). Ekstraksiyon ve Temizleme Aşamaları ................................... 48

3.2.6.2.(4). AFB1’in Belirlenmesi .............................................................. 48

VI

3.2.6.3. Geri Kazanım Oranının Belirlenmesi .............................................. 48

3.2.7. İstatistiksel Analizler ................................................................................ 49

3.2.8. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Eğrisinin

Matematiksel Modellere Uygunluğunun Belirlenmesi ............................ 49

3.2.9. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun AFB1 Degradasyon

Kinetiğinin Belirlenmesi ......................................................................... 49

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA .................................................. 50

4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Gelişme Eğrisinin Belirlenmesi ...... 50

4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Eğrisinin

Matematiksel Modellere Uygunluğunun Belirlenmesi ................................. 51

4.3. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Hücre Konsantrasyonunun

Belirlenmesi ................................................................................................... 54

4.4. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde Aflatoksini

Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği .......................................................... 55

4.4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde

Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi .................................................... 55

4.4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde

Aflatoksini Azaltmasının Kinetiği ........................................................... 57

4.5. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Değişik Gıda Ürünleri İçeren

PFT İçerisinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği .............. 63

4.5.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Aflatoksini Azaltmasının

Belirlenmesi ve Kinetiği .......................................................................... 63

4.5.1.1. AFB1’in Değişik Gıda Ürünlerindeki Geri Kazanım Oranları ........ 63

4.5.1.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru Kırmızı

Biberde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ............................. 64

4.5.1.3. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kırmızı Biberde

Aflatoksini Azaltmasının Kinetiği .................................................. 66

4.5.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Mısırda Aflatoksini

Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği .................................................... 73

4.5.2.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Mısırda Aflatoksini

Azaltmasının Belirlenmesi .............................................................. 73

VII


Azaltmasının Kinetiği ..................................................................... 75

4.5.3. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde

Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği ................................. 82

4.5.3.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde

Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ........................................... 82

4.5.3.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde

Aflatoksini Azaltma Kinetiği .......................................................... 84

4.5.4. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Soya Fasulyesinde

Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği ................................. 90

4.5.4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Soya Fasulyesinde



Aflatoksini Azaltma Kinetiği .......................................................... 92

4.5.5. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde Aflatoksini

Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği .................................................... 99

4.5.5.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde


4.5.5.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde

Aflatoksini Azaltma Kinetiği ........................................................ 101

4.5.6. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Fındıkta Aflatoksini

Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği .................................................. 107

4.5.6.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Fındıkta Aflatoksini

Azaltmasının Belirlenmesi ............................................................ 107


Azaltma Kinetiği ........................................................................... 109

5. SONUÇ VE ÖNERİLER ................................................................................... 116

6. KAYNAKLAR .................................................................................................. 119

ÖZGEÇMİŞ ............................................................................................................. 135

EKLER ..................................................................................................................... 136

VIII

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA

Çizelge 2.1. Aflatoksinlerin Kapalı Formülleri Erime Noktaları ve

Ultroviyole Işığında Verdikleri Renkler (Johnson ve Peterson,

1974; Jay, 1992). .................................................................................. 6

Çizelge 2.2. Türkiye’de Gıdalarda Bulunmasına İzin Verilen Aflatoksin

Düzeyleri (µg kg-1) (TGK, 2009) ...................................................... 15

Çizelge 2.3. Avrupa Birliği’nde Gıdalarda Bulunmasına İzin Verilen

Aflatoksin Düzeyleri (µg kg-1) (EC, 2008) ........................................ 16

Çizelge 4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun 30oC’de TSB

Besiyerindeki Gelişimine Ait Kültürel Sayım Sonuçları ................... 50

Çizelge 4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Verilerinin

Modifiye Gompertz ve Modifiye Logistik Modellerine Göre

Hesaplanan Parametre Değerleri. ....................................................... 53

Çizelge 4.3. Farklı Seyreltilerdeki F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri

Süspansiyonunun 540 nm’deki Absorbans Değerleri ve

İçerdikleri Canlı Hücre Sayısı. ........................................................... 54

Çizelge 4.4. PFT Çözeltilerinin (Kontrol ve F. aurantiacum NRRL B-184

Hücresi İçeren Diğer Örneklerde) AFB1

Konsantrasyonlarındaki (ng ml-1) Değişim ve % Azalma

Oranları .............................................................................................. 56

Çizelge 4.5. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından PFT Ortamında

AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi

Sonuçları. ........................................................................................... 60

Çizelge 4.6. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş

ve Bütün Kırmızı Biber Örneklerinin Aflatoksin

Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma

Oranları .............................................................................................. 65

Çizelge 4.7. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Kırmızı

Biberde AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon

Analizi Sonuçları. ............................................................................... 67

IX

Çizelge 4.8. Kırmızı Biberlerin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir

Limitlerin Altına İnme Süreleri .......................................................... 72


ve Bütün Mısır Örneklerinin Aflatoksin


Oranları .............................................................................................. 74

Çizelge 4.10. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Mısırda


Sonuçları ............................................................................................ 76

Çizelge 4.11. Mısır Örneklerinin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir



ve Bütün Siyah Zeytin Örneklerinin Aflatoksin


Oranları .............................................................................................. 83

Çizelge 4.13. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Siyah Zeytinde


Sonuçları ............................................................................................ 85

Çizelge 4.14. Siyah Zeytin Örneklerinin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir



ve Bütün Soya Fasulyesi Örneklerinin Aflatoksin


Oranları .............................................................................................. 91

Çizelge 4.16. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Soya

Fasulyesinde AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon

Analizi Sonuçları ................................................................................ 93

Çizelge 4.17. Soya Fasulyelerinin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir



ve Bütün Kuru İncir Örneklerinin Aflatoksin

X


Oranları ............................................................................................ 100

Çizelge 4.19. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Kuru İncirde


Sonuçları .......................................................................................... 102

Çizelge 4.20. Kuru İncirlerin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin

Altına İnme Süreleri ......................................................................... 107


Ve Bütün Fındık Örneklerinin Aflatoksin


Oranları ............................................................................................ 108

Çizelge 4.22. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Fındıkta


Sonuçları. ......................................................................................... 110

Çizelge 4.23. Fındık Örneklerinin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir

Limitlerin Altına İnme Süreleri ........................................................ 115

XI

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA

Şekil 2.1. Aflatoksinlerin kimyasal yapısı (Banwart, 1989). ............................... 7

Şekil 2.2. Poliketit yolu içinde norsolorinik asit oluşumu (Watanabe ve

Townsend, 2002). ................................................................................. 8

Şekil 2.3. Aflatoksin biyosentez yolu ve biyosentezde rol oynayan

genler (Sweeney ve Dobson, 1999). .................................................... 9

Şekil 2.4. AFB1’in vücuttaki metabolizma yolları (Ueno, 1985). ...................... 12

Şekil 2.5. AFB1-N7-Gua kompleksi (Ueno, 1985). ............................................ 13

Şekil 4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun 30oC’de TSB

besiyerindeki gelişme eğrisi ............................................................... 51

Şekil 4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun “Modifiye Gompertz”

ve “Modifiye Logistik” modellerinden yararlanılarak elde

edilen gelişme eğrileri ........................................................................ 52

Şekil 4.3. F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri süspansiyonu

seyreltilerine ait absorbans değerleri (540 nm’de) ile canlı

hücre sayısı arasındaki ilişki .............................................................. 55

Şekil 4.4. 500 ng ml-1 AFB1 içeren PFT ortamında aflatoksinin sıfırıncı

ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ..................... 61

Şekil 4.5. 1000 ng ml-1 AFB1 içeren PFT ortamında aflatoksinin

sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış

eğrileri ................................................................................................ 62

Şekil 4.6. 2000 ng ml-1 AFB1 içeren PFT ortamında aflatoksinin


eğrileri ................................................................................................ 62

Şekil 4.7. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kırmızı biberde

aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre

azalış eğrileri ...................................................................................... 68



azalış eğrileri ...................................................................................... 69

XII



azalış eğrileri ...................................................................................... 69

Şekil 4.10. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün kırmızı biberde aflatoksinin


eğrileri ................................................................................................ 70



eğrileri ................................................................................................ 70



eğrileri ................................................................................................ 71

Şekil 4.13. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş mısırda aflatoksinin


eğrileri ................................................................................................ 77



eğrileri ................................................................................................ 78



eğrileri ................................................................................................ 78

Şekil 4.16. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve

birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri .......................... 79

Şekil 4.17. 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün mısırda aflatoksinin sıfırıncı


Şekil 4.18. 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün mısırda aflatoksinin sıfırıncı


Şekil 4.19. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş siyah zeytinde


azalış eğrileri ...................................................................................... 86

XIII



azalış eğrileri ...................................................................................... 86



azalış eğrileri ...................................................................................... 87

Şekil 4.22. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün siyah zeytinde aflatoksinin


eğrileri ................................................................................................ 87



eğrileri ................................................................................................ 88



eğrileri ................................................................................................ 88

Şekil 4.25. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş soya fasulyesinde


azalış eğrileri ...................................................................................... 94



azalış eğrileri ...................................................................................... 95



azalış eğrileri ...................................................................................... 95

Şekil 4.28. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün soya fasulyesinde aflatoksinin


eğrileri ................................................................................................ 96



eğrileri ................................................................................................ 96

XIV



eğrileri ................................................................................................ 97

Şekil 4.31. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kuru incirde aflatoksinin


eğrileri .............................................................................................. 103



eğrileri .............................................................................................. 103



eğrileri .............................................................................................. 104

Şekil 4.34. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün kuru incirde aflatoksinin


eğrileri .............................................................................................. 104



eğrileri .............................................................................................. 105



eğrileri .............................................................................................. 105

Şekil 4.37. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş fındıkta aflatoksinin


eğrileri .............................................................................................. 111



eğrileri .............................................................................................. 112



eğrileri .............................................................................................. 112

XV

Şekil 4.40. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve

birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ........................ 113

Şekil 4.41. 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün fındıkta aflatoksinin sıfırıncı

ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ................... 113

Şekil 4.42. 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün fındıkta aflatoksinin sıfırıncı

ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri ................... 114

XVI

KISALTMALAR

AFB1 : Aflatoksin B1

AFB1a : Aflatoksin B1a

AFB2 : Aflatoksin B2

AFB2a : Aflatoksin B2a

AFG1 : Aflatoksin G1

AFG2 : Aflatoksin G1

AFM1 : Aflatoksin M1

AFM2 : Aflatoksin M2

PFT : Potasyum Fosfat Tamponu

TSB : Triptic Soy Broth

µm : Maksimum Spesifik Gelişme Hızı

λ : Lag Süresi

A : Asimtot

k : Reaksiyon Hız Sabiti

F : Regresyon Önem Aralığı

Co :Başlangıç Konsantrasyonu

Ct : t Zamanındaki Konsantrasyon

R2 : Belirtme Katsayısı

SEE : Tahminin Standart Hatası

RSS : Kalanların Kareler Toplamı

MSE : Hata Kareler Ortalaması

Exp : Üstel

P : Önem Düzeyi

Kob : Koloni Oluşturma Birimi

1.GİRİŞ Bülent ZORLUGENÇ

1

1. GİRİŞ

Küfler bir çok tarım ürününde; özellikle kırmızı biber, incir, fındık, mısır,

buğday, arpa, çavdar ve bir çok yağlı tohumda tarlada, bahçede, hasat sonrasında,

depolama süresince veya bu ürünlerin gıda ve hayvan yemi olarak işlenmeleri

sırasında doğal olarak gelişmektedirler.

Mikotoksinler; küflerin gelişimi sırasında normal metabolizması için önemli

bir role sahip olmayan, ancak insan ve hayvanlarda kanserojen, mutajen, teratojen ve

östrojenik etkiler gibi akut ve kronik etkilere neden olabilen ikincil metabolitlerdir.

Genel olarak, poliketid (aflatoksinler), terpen (trikotesenler), amino asit (aflatoksin)

ve trikarboksilik asit (rubratoksin) yolu gibi çeşitli biyokimyasal yollarla oluşan

düşük molekül ağırlıklı ve antijenik olmayan metobolitlerdir (Jay, 1992; Smith,

2001).

Bazı mikotoksinler yalnızca sınırlı sayıdaki küf türleri tarafından oluşurken

diğerleri birçok cinse ait çeşitli türler tarafından üretilebilmektedir. Laboratuar

koşullarında en az 300-400 mikotoksin izole edilmiş ve bunların yaklaşık 20

tanesinin önemli düzeyde ve sıklıkta gıdalarda ve yemlerde oluştuğu belirlenmiştir.

Bu mikotoksinlerin çoğunun hayvanlarda önemli toksisiteye neden olduğu

görülmüştür. Mikotoksinler genelde insan ve hayvan besin sistemine doğrudan ve

dolaylı olarak girmektedir. Doğrudan bulaşı, gıda veya yemin toksijenik küflerle

enfekte olması ve sonradan toksin oluşmasıdır. Dolaylı bulaşı ise daha önce toksin

üreten bir küf ile kontamine olmuş bir katkı maddesindeki küflerin kendiliğinden

ölmesi veya işleme sırasında ortamdan uzaklaşmasına rağmen mikotoksinin

çoğunlukla son üründe kalması durumudur (Smith, 2001).

Mikotoksin içeren gıdaların tüketimi “mikotoksikozis” olarak adlandırılan

toksik semptomların insanlarda ve hayvanlarda görülmesine neden olabilmektedir

(Van Genderen, 1997).

Çiftlik hayvanlarının oldukça fazla miktarda tahıl ve yağlı tohumları

tüketmeleri nedeniyle mikotoksinli yemlerin hayvan sağlığı ve üretkenliği üzerindeki

olumsuz etkilerinin bildirildiği çok sayıda çalışma mevcuttur. Ancak insanlarda

görülen mikotoksikozis tam olarak anlaşılmamakla birlikte son yıllarda teşhisi


2

giderek artmakta ve konu ile ilgili çalışmalar yapılmaktadır (Smith, 2001, Richard,

2007).

Aflatoksinler; A. flavus, A. parasiticus türleri ve son yıllarda aflatoksikojenik

olduğu belirlenen üçüncü bir tür A. nomius tarafından üretilen hepatoksik (karaciğere

toksik) ve hepakarsinojenik (karaciğer kanseri etmeni) metabolitlerdir. Aynı

zamanda mutajenik (genetik değişim) ve teratojenik (embriyo üzerine etkili)

oldukları da bilinmektedir. (Banwart, 1989; İç ve Yavaş, 1993; Eley, 1996; Adams

ve Moss, 1997; Martins ve Martins, 1999; Das ve Mishra, 2000; Jaimez ve ark.,

2000; Preides ve ark., 2000).

Aflatoksin sorunu, insan sağlığı açısından büyük bir tehlike oluşturmasının

yanısıra, birçok ülke için ekonomik yönden de önem taşımaktadır. Aflatoksin

oluşmuş gıdaları ihraç etmek mümkün olmamakta ve çoğu kez ürün imha edilmek

zorunda kalınmakta veya denetim mekanizması yetersiz olan ülkelerde iç pazarda

tüketime sunulmaktadır. Bu durum ya ağır ekonomik kayıplara yol açmakta ya da

söz konusu ülkelerde insan sağlığı yönünden tehdit oluşturmaktadır. Ayrıca yemlerde

bulunan toksin de, hayvanlarda ölüme kadar giden çok çeşitli etkilerin yanı sıra

verim düşüklüğüne yol açarak ekonomik sorunlara neden olabilmektedir (Özkaya,

2001). Ayrıca hayvanlara ait ürünlerin tüketilmesi de insanlarda sağlık sorunlarına

yol açabilmektedir.

Dünyadaki tarımsal ürünlerin yaklaşık % 25’i her yıl mikotoksinlerden farklı

düzeylerde etkilenmekte, bu durum çiftlik hayvanları ve tahıl üreticileri ile işleyiciler

ve tüketiciler için büyük ekonomik sorunlara neden olmaktadır. ABD ve Kanada’da

yalnızca yemlerde ve çiftlik hayvanlarında mikotoksinlerin neden olduğu yıllık

kaybın 5 milyar $ düzeyinde olduğu tahmin edilmektedir (Smith, 2001).

Mikotoksinlerin yarattığı ekonomik ve sağlık sorunlarının farkına varılması,

önlem alma ve kontrol için uygun programların gerçekleştirilebilmesinde ilk

basamağı oluşturmaktadır. Bu programlar yalnızca tarım ürünlerinde mikotoksin

oluşumunu önlememeli ayrıca mümkün olması durumunda toksinlerin

detoksifikasyon veya yıkım yoluyla ortamdan uzaklaştırılmasını mümkün kılmalıdır

(Smith, 2001).


3

Aflatoksinlerin gıda maddesinden detoksifikasyonu için uygulanan fiziksel ve

kimyasal yöntemlerin sonuç vermemesi ve insan sağlığına zararlı etkileri nedeniyle;

biyolojik detoksifikasyon yöntemleri ve bunların ticari uygulamalarda

kullanılabilirliği üzerinde durulmaktadır (El Nezami ve ark., 1998a, b; Özkaya ve

ark., 1999; Peltonen ve ark., 2000).

Biyolojik detoksifikasyon amacıyla çeşitli mikroorganizmalar kullnaılmasıyla

ilgili gelişmeler mevcuttur. Bunlardan F. aurantiacum NRRL B-184 suşu ile

AFB1’in azaltılması ve toksik etkisinin giderilmesi konusunda yapılmış sınırlı sayıda

araştırma olmakla birlikte; mevcut çalışmalarda bu bakteriden aflatoksinin biyolojik

detoksifikasyonu amacıyla yararlanılabileceği ifade edilmiştir (Ciegler ve ark., 1966;

Hao ve Brackett, 1988).

Bu çalışmada, F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri suşunun TSB besiyeri

ortamında gelişme eğrisi belirlenmiş ve bakteriyel gelişimi ifade etmede

matematiksel modellerden yararlanılarak gelişme hızı ve lag süresi hesaplanmıştır.

Yüksek toksik ve kanserojenik aktiviteye sahip olan AFB1’in PFT

çözeltisinde ve model matriks olarak kuru kırmızı biber, mısır, siyah zeytin, soya

fasulyesi, kuru incir ve fındık gibi ticari potansiyeli olan ürünlerde F. aurantiacum

NRRL B-184 bakteri suşu ile biyolojik olarak detoksifikasyonu amaçlanmıştır.

Ayrıca AFB1’in degradasyon kinetiği incelenerek reaksiyon hızları hesaplanmıştır.

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bülent ZORLUGENÇ

4

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR

Tarımsal ürünler, işlenmiş gıdalar ve yemler için önemli bir bulaşı olan

küfler, toprakta ve havada yaygın olarak bulunmaktadır. Bazı küflerin, gıdaların ve

ilaçların üretiminde insanlara olumlu olarak hizmet etmelerinin yanısıra tarımsal

ürünlerin üretimlerinden hasat, depolama ve tüketimlerine kadar olan her evrede

bozulmalara sebep olmaları da söz konusudur.

Küfler metabolik etkinlikleri sırasında birincil ve ikincil metabolitler olarak

adlandırılan çeşitli ürünler üretmektedirler. Birincil metabolitler, organizmanın

gelişimi için gerekli olup; bunlar arasında yağ asitleri, steroller, proteinler ve

aromatik aminoasitler yer almaktadır. İkincil metabolizma ürünlerinin, küflerin

normal metabolik faaliyetleri açısından bir öneme sahip olmadığı ve logaritmik

gelişme fazının sonlarında sentezlendiği ifade edilmektedir (Heathcote ve Hibbert,

1978; Jay, 1992; Moss, 1992; Deacon, 1997; Pitt, 2000).

Küflerin ikincil metabolitleri olan mikotoksinler, insanlarda ve hayvanlarda

akut ve kronik toksik (karsinojenite, mutajenite, teratojenite ve östrojenik) etkilere

neden olabilmektedirler. Mikotoksin içeren ürünlerin, insanlar ve hayvanlar

tarafından tüketilmesi “mikotoksikozis” olarak bilinen toksik sendromla

sonuçlanmaktadır (Van Genderen, 1997).

Küf bulaşısı, gelişimi ve mikotoksin üretimi çevre koşullarına (hava ve nem)

bağlı olarak tarlada, hasat, işleme, depolama ve nakliye sırasında oluşabilmektedir.

Isı ve yüksek nem içeriği küf gelişiminde ani artışlara neden olabilmektedir. Küfler,

hasar görmüş tohumu istila ederek orada çoğalabilmekte ayrıca kuraklık veya başka

çevresel stresler de bitkilerde küf ve böcek zararını teşvik edici etki göstermektedir

(Omaye, 2004).

2.1. Aflatoksin

Aflatoksinler, A. flavus, A. parasiticus ve A. nomius’un bazı suşları tarafından

üretilen ikincil metabolizma ürünleri olup en önemli mikotoksinlerdendir (Moss,

1992; Doyle ve ark., 1997; Jaimez ve ark., 2000).


5

Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus’un aksine Aspergillus nomius’un

doğada yaygın olarak bulunmaması nedeniyle, bu küf üzerine az sayıda çalışma

yapılmış ve izolatlarının toksijenitesi tam olarak belirlenememiştir (Doyle ve ark.,

1997).

Aflatoksinler hakkında ilk bilginin elde edilmesi 1960’lara kadar

uzanmaktadır. İngiltere’de, Güney Amerika ve Afrika’dan ithal edilen yerfıstığı

küspesi ile beslenen 100.000 hindi palazının ölmesi üzerine yapılan çalışmalarda

yemlerden Aspergillus flavus izole edilmiş ve bu organizma tarafından oluşturulan

toksin ise aflatoksin (Aspergillus flavus Toxin – A-fla-toxin) olarak adlandırılmıştır.

Oluşan toksik bileşiklerin yapısı üzerine yapılan çalışmalar sonunda 4 bileşik (AFB1,

AFB2, AFG1, AFG2) belirlenmiştir (Detroy ve ark., 1971; Jay, 1992; Karadeniz ve

Ekşi, 2002).

Aflatoksinlerin keşfinden sonra mikotoksinler üzerine yapılan araştırmalar hız

kazanmış ve günümüze kadar yapılan çalışmalarda, toksik etki gösteren pek çok küf

metaboliti tanımlanmıştır.

Bu mikotoksinlerden bazıları mutajenik, bazıları kanserojenik iken bazıları

belirli organlar üzerine toksik etkiye sahiptir. En azından 14 mikotoksinin kanserojen

olduğu bilinmekte ve mikotoksinler arasında kanserojen etkisi en fazla olanın da

aflatoksin olduğu bildirilmektedir (Jay, 1992; FAO, 1993; Karadeniz ve Ekşi, 2002).

AFB1, insan gıdalarında ve hayvan yemlerinde sıklıkla rastlanan bir

mikotoksindir. Yüksek dozları akut toksik etki göstererek, önemli sağlık sorunlarına

ve ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Düşük dozları ise güçlü bir

hepatokarsinojen, mutajen ve teratojen olup ayrıca bağışıklık sistemini de

baskılamaktadır. Memelilerin, kuşların ve balıkların birçok türü aflatoksinin olumsuz

etkilerine karşı hassastırlar (Stark, 2001).

Oluşumu ve toksisitesi göz önüne alındığında AFB1 en önemlilerinden biri

olup bunu sırasıyla AFG1, AFB2 ve AFG2 izlemektedir. Aflatoksinlerin kendileri

karsinojenik özellikte olmayıp bunların bazı metabolitleri bu etkiye sahiptirler (Van

Genderen, 1997).


6

2.2. Aflatoksinlerin Genel Özellikleri

Aflatoksinler kimyasal yapı olarak lakton bağı ve bifuran halkası içeren

difurano kumarin türevleridir (Altuğ, 1991; Papp ve ark., 2002; Özkarslı, 2003).

Aflatoksinlerin belirlenmiş önemli 4 tipi AFB1, AFB2, AFG1 ve AFG2’dir.

Ultraviyole ışığı altında mavi veya yeşil floresans vermelerine dayandırılarak bu

şekilde adlandırılmışlardır (Omaye, 2004). AFB1 ve AFG1 difuran halkası içerirken

AFB2 ve AFG2 ise tetra bifuran halkası içermektedir (Sweeney ve Dobson, 1999).

Aflatoksinlerin kimyasal yapısı Şekil 2.1’de verilmiştir.

G serisi aflatoksinler de üçüncü lakton halkası, siklopentan halkasının yerine

geçmiştir. AFB1 ve AFG1 de merkezdeki furan halkasının 8. ve 9. karbon atomları

arasında çift bağ bulunmaktadır (Jaimez ve ark., 2000).

AFM1 ve AFM2 ise AFB1 ve AFB2’nin hidroksil formları olup bir adet

hidroksil grubu içerirler (Tunail, 2000). Aflatoksinlerin kapalı formülleri, erime

noktaları ve ultroviyole ışığı altında verdikleri renkler Çizelge 2.1.’de verilmiştir.

Çizelge 2.1. Aflatoksinlerin Kapalı Formülleri Erime Noktaları ve Ultroviyole Işığında Verdikleri Renkler (Johnson ve Peterson, 1974; Jay, 1992).

AFLATOKSİN KİMYASAL FORMÜL ERİME NOKTASI (oC) RENK

B1 C17 H12 O6 268-269 Mavi

B2 C17 H14 O6 286-289 Mavi

G1 C17 H12 O6 244-246 Yeşil

G2 C17 H17 O7 237-240 Yeşil-Mavi

M1 C17 H12 O7 299 Mavi-Menekşe

M2 C17 H14 O7 293 Menekşe


7

O

O O

Furan Halkası Kumarin

OO

O

O O

OCH3

OO

O

O O

OCH3 Aflatoksin B1 (AFB1) Aflatoksin B2 (AFB2)

OO

O O

OO

OCH3

OO

O O

OO

OCH3 Aflatoksin G1 (AFG1) Aflatoksin G2 (AFG2)

OHO

O

O

O O

OCH3

OHO

O

O O

OO

OCH3

Aflatoksin B2a (AFB2a) Aflatoksin G2a (AFG2a)

OO

O

OO

OH

OCH3

OO

O

OO

OH

OCH3 Aflatoksin M1 (AFM1) Aflatoksin M2 (AFM2)

Şekil 2.1. Aflatoksinlerin kimyasal yapısı (Banwart, 1989).


8

Aflatoksinler, kloroform ve metanol gibi polar çözücüler ve özellikle

dimetilsülfoksitte çözünebilmektedir. Aflatoksinler yüksek sıcaklıklara karşı oldukça

dayanıklı olup, normal pişirme sıcaklıklarında ve pastörizasyon sıcaklıklarına karşı

oldukça dayanıklıdır. Ayrıca aflatoksinin yapısında bulunan lakton halkası bu

molekülün alkali hidrolizine karşı hassas olmasını sağlamaktadır (McLean ve

Dutton, 1995).

2.3. Aflatoksinler ve Biyosentezi

Aflatoksinler poliketit yolu içinde sentezlenirler. Bir asetil ünitesi (Asetil

CoA) ile malonil (Malonil CoA) ünitesi karbondioksit kaybederek kısalır ve yağ

asidi sentez yolu ile hekzonat’a dönüşür. Hekzonat birbirini izleyen 7 malonoat

ünitesi ile tepkimeye girer ve poliketit sentezi sonucu norsolorinik asit oluşur

(Hocking, 1997). Şekil 2.2’de Poliketit yolu içinde norsolorinik ait oluşumu

verilmiştir.

Şekil 2.2. Poliketit yolu içinde norsolorinik asit oluşumu (Watanabe ve Townsend,

2002).

http://lib.bioinfo.pl/auth:Watanabe,CMH�

http://lib.bioinfo.pl/auth:Townsend,CA�


9

Bu poliketit, yaklaşık 12-17 kadar enzimatik değişimden geçer ve

Versicolorin B oluşur. Versicolorin B oluşumunu takiben enzimatik yol ikiye ayrılır.

1. kolda Versicolorin A oluşumunu takiben dimetil sterigmatosistinden AFB1 ve

AFG1 sentezlenir. Diğer kolda ise dihidro dimetil sterigmatosistinden AFB2 ve AFG2

sentezlenir (Swedney ve Dobson, 1999). Aflatoksin biyosentezinde düzenleyici gen

AfζR genidir. AfζR geni aflatoksin biyosentezini harekete geçirir ve aflatoksin

üretimini artırır (Papp ve ark., 2002). Aflastoksin biyosentez yolu ve biyosentezde

rol oynayan genler Şekil 2.3’de verilmiştir.

Şekil 2.3. Aflatoksin biyosentez yolu ve biyosentezde rol oynayan genler (Sweeney

ve Dobson, 1999).


10

2.4. Aflatoksinlerin Toksisitesi, Metabolizması ve Limitleri

Aflatoksinler, Aspergillus ve Penicillium cinslerinin ürünleri olup insanlarda

ve hayvanlarda oldukça güçlü akut toksik etki göstermektedirler. Sindirim sistemi

yoluyla vücuda alınan aflatoksinler bir çok canlıda akut toksisite ve karsinojeniteye

neden olmakla birlikte, etkilenen başlıca organ karaciğer olmaktadır. Diyetle alınan

aflatoksin karaciğerden kurtularak kolayca diğer organlara dağılabilir ve orada

metabolize olarak toksik veya karsinojenik etki gösterebilmektedir. Bazı türlerin

AFB1’in neden olduğu karsinojeniteye dayanıklı olması, genellikle AFB1’i

detoksifiye etme yeteneği ile ilişkilendirilmektedir ki, bu durum glutatyon ile

birleşmesine dayandırılmaktadır (Stark, 2001). Akut toksisite, tüketimi takip eden 3

hafta içerisinde oluşabilmektedir (Omaye, 2004).

Uganda ve Tayland’da ortaya çıkan akut aflotoksikozis sonucunda insanlarda

kusma, karın ağrısı, akciğer ödemi, karaciğerde nekroz ve yağlanma gibi

semptomplar görülmüştür. Yaklaşık 200 kadar Hindistan köyünde 6-16 mg L-1

aflatoksin içeren mısırların tüketilmesi ile özellikle gastrointestinal kanamaya bağlı

%25’in üzerinde ölüm vakası görülmüştür (Shank, 1977; Van Rensburg, 1977;

Shank, 1981). Akut aflatoksikozisin semptomları; karaciğer, böbrek ve kalpte gelişen

yağlanma ve beyin ödemiyle ilişkili olan kusma, çırpınma, koma ve ölüm olup

Reye’s sendromundan ayırt edilememektedir. Tayland (Shank, 1971) ve Amerika

Birleşik Devletleri’nde (Nelson, 1980) Reye’s sendromundan kaynaklandığı öne

sürülen 23 ölüm vakasının 22’sinde karaciğer, böbrek, beyin, safra ve gastrointestinal

sistemde AFB1 tespit edilmiştir (Stark, 2001).

Gıdalarda ve yemlerde yaygın olarak bulunmalarına ilave olarak aflatoksinler

havada da bulunabilmektedir. Örneğin, aflatoksinli tahılların tozlarına maruz kalan

yerfıstığı işleyen fabrikaların işçilerinde akciğer veya diğer organlarda görülen

kanser sebebiyle ölüm vakalarında önemli artış gözlenmiştir (Van Nieawenhaize,

1973; Sorenson, 1981; Hayes, 1984; Dvorackava, 1986). Akciğerler, aflatoksinlerin

diyetle alınması durumunda da risk altındadır (Stark, 2001).

Karaciğer kanseri gelişmekte olan ülkelerde çok yaygın olarak görülmekte ve

diyetle alınan aflatoksin ile karaciğer kanseri arasında doğrusal bir ilişkinin mevcut

olduğu bildirilmektedir (Van Genderen, 1997; Omaye, 2004). Küflü tahılların


11

tüketilmesi sonucu Hindistan’da ve Afrika’da karaciğer kanseri görülme oranının

yüksek olduğu bildirilmiştir (Omaye, 2004).

Yapılan son çalışmalar, aflatoksine maruz kalan insanlarda karaciğer kanseri

görülme oranının yüksek olmasına kronik enfeksiyonların da neden olabileceğini

ortaya koymuştur. AFB1’in deney hayvanlarında hücre bağışıklığını baskıladığı

görülmüştür (Van Genderen, 1997). Bağışıklık sisteminin baskılanması akut

aflatoksin intoksikasyonunun (zehirlenme) bir diğer belirleyici özelliğidir (Stark,

2001).

Aflatoksinin LD50’si 0.5 mg kg-1 (vücut ağırlığı) dır ve 72 saat içinde

karaciğer hasarı, bağırsak sisteminde ve karın boşluğunda kanama nedenleriyle ölüm

gerçekleşmektedir (Omaye, 2004).

Birkaç günle birkaç hafta arasında subletal (yarı öldürücü) konsantrasyonda

aflatoksin tüketimi orta ya da şiddetli karaciğer hasarına yol açmaktadır. Karaciğerde

görülen hasarlar veya karaciğerin safra kanalı bölgesinde aşırı hücre gelişimi (biliary

hyperplasia)’dir. Ayrıca yaygın olarak yağ birikimi ve karaciğerin renginin mor-

kırmızıdan sarı-kırmızıya dönüştüğü görülür. Epidemiyolojik çalışmalar, dünyanın

çeşitli bölgelerinde diyetle alınan aflatoksin miktarı arasında doğrudan bir ilişki

olduğunu göstermektedir. Ayrıca, hepatit B virüsü ile karaciğer kanseri arasında

ilişki olduğu ortaya koyulmuştur (Omaye, 2004).

Aflatoksinler, akut toksik ve karsinojenik etki gösterebilmeleri için oksidatif

metabolizmaya uğramalıdırlar (Stark, 2001). Aflatoksin metabolizması, esas olarak

karaciğer hücrelerinin endoplazmik retikulumunda bulunan sitokroma bağlı enzimler

ile O2 ve NADPH’a bağımlı enzimlerin karmaşık bir organizasyonu sonucu

oluşmaktadır (Groopman ve ark., 1988). Aktivasyon düzeyi, DNA’ya bağlanma,

mutasyona uğrama sıklığı ve belirli hücre tiplerinde akut toksik etkilere karşı

hassasiyet, sitokrom P-450’nin tipine ve bunların bu hücrelerdeki düzeyine bağlı

olarak değişmektedir (Mace, 1997; Stark, 2001).

Aflatoksin molekülünün 8, 9 konumu oksidasyon sonucu Aflatoksin-8, 9-

oksite dönüşür, sonra da kovalent bağla; DNA, RNA ve proteine bağlanır.

Aflatoksinin hidroksillenmesiyle ayrıca AFM1, AFP1, AFQ1, AFB2a ve aflatoksikol

oluşur. Bunlar Aflatoksin-8, 9- oksit’den daha az toksik ve karsinojenik olup


12

aflatoksinin detoksifikasyon metabolitleridirler. Aflatoksin-8, 9- oksit,

detoksifikasyon enzimi olan epoksit hidrolaz tarafından 8, 9-dihidrodiol’e

dönüştürülmektedir. 8, 9-dihidrodiol ve hidroksillenmiş aflatoksinler glutatyon

(GSH) transferaz tarafından glutatyon konjugatlarına dönüşür ve merkapturik asit

olarak idrarla atılırlar. Ayrıca, AFB1-8, 9-diol ve AFB2a enzimatik olmayan yolla

fenolat iyonu formuna dönüşerek kovalent bağla proteinlere de bağlanabilmektedir

(Stark, 2001). Bu sistemlerde AFB1’in metabolizma yolları ve biyotransformasyonu

Şekil 2.4’de verilmiştir.

OO

O

O O

OO

O

O O

OCH3

OO

O

OCH3

OO

OH

OO

O

O O

OH

OO

O

O O

OH

OO

O

O O

O

OCH3

SitoplazmikRedüktazSistemi

İndirgeme

KaraciğerMikrosomasındaMeydana Gelen

Oksitleyici Sistemler

Hidroksillenme

P450

P448

OCH3

Aflatoksin Q

Aflatoksin M1Demetilasyon

Aflatoksin P1OCH3

Epoksidasyon

Afkatoksin B1 - epoxide

Şekil 2.4. AFB1’in vücuttaki metabolizma yolları (Ueno, 1985).

AFB1’in oksidatif metabolizması sonucu stabil olmayan, oldukça reaktif

epoksid metabolitler oluşmaktadır. Hidroksillenmiş metabolitlerin sülfat veya

glukuronik asit ile enzimatik konjugasyonu sonucu suda çözünür sülfat veya

glukuronid esterler oluşur ve bunlar idrar veya safra ile dışarı atılırlar. Böylece


13

AFB1’in detoksifikasyonu gerçekleşmiş olur. AFB1’in organizmadan

uzaklaştırılmasındaki diğer bir yol ise epoksid metabolitin glutatyon ile enzimatik

olarak reaksiyona girmesi ve safra ile dışarı atılmasıdır (Groopman ve ark., 1988).

Sitokrom P450 vasıtasıyla aflatoksinin 8, 9-epoksid formuna dönüşmesi ile

bazı metabolitler etkinleşir ve ana bileşikten farklı olarak kanser etmeni özellik

kazanırlar (Van Genderen, 1997; Omaye, 2004). AFB1’in metabolizması sırasında

reaktif elektrofilik epoksid, DNA, RNA ve protein gibi hücresel makro moleküllerin

çeşitli nükleofilik merkezleri ile örneğin DNA’nın N7 konumundaki guanine

kovalent bağ ile bağlanabilmektedir (Şekil 2.5). Bu aktivasyon reaksiyonu sonucu,

hücre veya organizma için potansiyel bir biyolojik tehlike olarak görülen toksik,

karsinojenik ve genotoksik etkiler ortaya çıkmaktadır (Groopman ve ark., 1988).

NH

N N

N

NH2

OOO

OHO

O O

OCH2

Şekil 2.5. AFB1-N7-Gua kompleksi (Ueno, 1985).

Yüksek miktarda AFB1’e maruz kalan insanlarda görülen karaciğer

kanserlerinde p53 geninin 249 kodonunda mutasyon görülmüştür. Ancak AFB1’den

hiç etkilenmeyen veya düşük dozda etkilenen kişilerde bu mutasyonun

gerçekleşmediği tespit edilmiştir (Stark, 2001).

AFB1’in ayrıca enzimleri inhibe ederek ATP üretimini azalttığı ve buna ek

olarak DNA sentezini, DNA’ya bağlı RNA polimeraz aktivitesini, mRNA ve protein

sentezini inhibe ettiği bildirilmiştir (Doyle ve ark., 1997; Wang ve Groopman, 1999).

Aflatoksin, 1993 yılında Dünya Sağlık Örgütü ile Uluslararası Kanser

Araştırma Kurumu (WHO-IARC) tarafından kanserojenik madde olarak kabul


14

edilmiş ve AFB1 yapılan sınıflandırmada insan kanserojeni olarak 1A grubunda

yeralmıştır (El-Nezami ve ark., 1998a; El-Nezami ve ark., 2000; Hussein ve Brasel,

2001).

Bugün dünyada hemen hemen bütün ülkeler, bu tehlikelerden korunmak ve

ihraç ettikleri ürünlerin geri dönüşünü azaltmak amacı ile yasal bazı sınırlamalar

getirmektedirler. Ülkemizde Türk Gıda Kodeksi’nde (TGK, 2009) gıdalar, için

aflatoksin limitleri belirlenmiştir. Çizelge 2.2’de Türkiye’de gıdalarda bulunmasına

izin verilen aflatoksin düzeyleri ve Çizelge 2.3’de ise Avrupa Birliği’nde gıda

maddelerinde bulunmasına izin verilen en yüksek aflatoksin düzeyleri (EC, 2008)

verilmiştir.


15

Çizelge 2.2.Türkiye’de Gıdalarda Bulunmasına İzin Verilen Aflatoksin Düzeyleri

(µg kg-1) (TGK, 2009)

No GIDA MADDELERİ B1 Toplam

(B1+B2+G1+G2) M1

1 Yerfıstığı (Doğrudan tüketime sunulmadan veya

gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce

sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi

tutulacak olan)

8 15 -

2 Fındık, antep fıstığı gibi sert kabuklu meyveler,

yerfıstığı, yağlı tohumlar, kuru meyveler ve

bunlardan üretilen işlenmiş gıdalar

- 10 -

3 Tahıllar (Karabuğday (Fagopyrum sp.) dahil ve

bunlardan üretilen işlenmiş gıdalar (Doğrudan

tüketilen veya gıda bileşeni olarak kullanılan)

2 4 -

4 Mısır (Doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda

bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma,

ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi tutulacak

olan)

5 10 -

5 Çiğ süt, ısıl işlem görmüş süt, süt bazlı ürünlerin

üretiminde kullanılan süt

- - 0.050

6 Baharatların aşağıdaki türleri için ;

- Kırmızıbiber (Capsicum spp.) (Bunların kurutulmuş meyveleri, kırmızı biberin bütün ve toz hali dahil)

- Karabiber (Piper spp.) (Bunların meyveleri, akbiber ve karabiber dahil)

- Hindistan cevizi / Muskat (Myristica fragrans) - Zencefil (Zingiber officinale) - Zerdeçal (Curcuma longa)

5 10 -

7 Tahıl bazlı işlenmiş gıdalar, bebek ve küçük çocuk

gıdaları

0.1 - -

9 Bebekler formülleri ve devam formülleri (bebek

sütleri ve devam sütleri dahil)

- - 0.025

9 Bebekler için özel tıbbi amaçlı diyet gıdalar 0.1 - 0.025

10 Diğer gıda maddeleri (bulunması muhtemel riskli

gıdalar)

5 10 0.5


16

Çizelge 2.3. Avrupa Birliği’nde Gıdalarda Bulunmasına İzin Verilen Aflatoksin Düzeyleri (µg kg-1) (EC, 2008)

No GIDA MADDELERİ B1 Toplam

(B1+B2+G1+G2) M1

1 Yerfıstığı (Doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi tutulacak olan)

8 15 -

2 Fındık, antep fıstığı gibi sert kabuklu meyveler, yerfıstığı (Doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi tutulacak olan)

5 10 -

3 Fındık, antep fıstığı gibi sert kabuklu meyveler (Doğrudan insan tüketimine sunulan veya gıda bileşeni olarak kullanılan ve bunların işlenmiş ürünleri)

2 4 -

4 Kuru meyveler (Doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi tutulacak olan)

5 10 -

5 Kuru meyveler ve bunların işlenmiş ürünleri (Doğrudan insan tüketimine veya gıda bileşeni olarak kullanılması düşünülen ve bunların işlenmiş ürünleri)

2 4 -

6 Tüm tahıllar ve bunlardan üretilen ürünler (7,10, 12’de listelenen gıdalar hariç)

2 4 -

7 Mısır (Doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi tutulacak olan)

5 10 -

8 Çiğ süt, ısıl işlem görmüş süt, süt bazlı ürünlerin üretiminde kullanılan süt

- - 0.050

9 Baharatların aşağıdaki türleri için ; - Kırmızıbiber (Capsicum spp.) (Bunların

kurutulmuş meyveleri, kırmızı biberin bütün ve toz hali dahil)

- Karabiber (Piper spp.) (Bunların meyveleri, akbiber ve karabiber dahil)

- Hindistan cevizi (Myristica fragrans) - Zencefil (Zingiber officinale) - Zerdeçal (Curcuma longa)

5 10 -

10 Tahıl bazlı işlenmiş gıdalar, bebek ve küçük çocuk gıdaları

0.1 - -

11 Bebekler formülleri ve devam formülleri (bebek sütleri ve devam sütleri dahil)

- - 0.025

12 Bebekler için özel tıbbi amaçlı diyet gıdalar 0.1 - 0.025


17

2.5. Aflatoksinlerin Detoksifikasyonu

Toksik ve kanserojen özellikte olmaları nedeniyle aflatoksin oluşmuş

ürünlerin, insan ve hayvanlar tarafından tüketilmesi önemli sağlık sorunları ve

ekonomik kayıplara yol açabilmektedir. Bu nedenle, aflatoksin kontrol ve izleme

programlarına ihtiyaç duyulmaktadır.

Aflatoksin sorununu çözmede temel ve öncelikli prensip aflatoksin

oluşumunu önleyici tedbirleri almaktır. Ancak, toksin oluşmuş olan bir üründe

aflatoksini uzaklaştırmaya, parçalamaya, azaltmaya ve bağlamaya yönelik

çalışmalar da aflatoksinlerin keşfinden bu yana yapılmaktadır.

Detoksifikasyon işlemlerinde,

1. Toksin tamamen uzaklaştırılmalı, inaktive edilmeli veya parçalanmalı,

2. Üründe hiçbir toksik, karsenojenik ve mutajenik kalıntı kalmamalı ve

herhangi bir yeni toksik madde oluşmamalı,

3. Ürünün fiziksel ve duyusal özellikleri ile besin değerinde olumsuz değişimler

oluşmamalı,

4. Küf sporlarının ve misellerinin yok edilerek mikotoksin oluşumu

önlenebilmeli,

5. Teknik ve ekonomik olarak uygulanabilir olmalıdır (Rustom, 1997; Piva ve

ark., 1995; Scott, 1998; Bata ve Lasztity, 1999; Galvano ve ark., 2001).

Ancak, bugüne kadar bütün bu özellikleri karşılayan bir detoksifikasyon

yöntemi bulunamamıştır. Çoğu yöntemin sonuçları henüz toksikolojik yönden

incelenmemiştir (Özkaya ve ark., 1999).

2.5.1. Fiziksel Ayırma ve Temizleme Yöntemleri

Mikotoksin oluşmuş bir üründe, bozuk, kırık, zedeli tanelerin ayıklanmasının,

kabuk, kepek ve yabancı maddelerin temizlenmesinin mikotoksin düzeyini önemli

ölçüde azaltığı görülmüştür. Gelişmiş ülkelerde bu ayıklama işlemlerinde elektronik

göz ve optik cihazlar kullanılmaktadır (Goldblatt ve Dollear, 1977; Heatcote ve

Hibbert, 1978; Özay, 1988; Scott, 1998; Özkaya ve ark., 1999; Yılmaz ve Özay,

2001; Karadeniz ve Ekşi, 2002). Antep ve yerfıstığı gibi iri taneli ürünlerde bozuk


18

olan “koyu renkli tanelerin” el ile veya fotoelektrik hücrelerden geçirilmesiyle

aflatoksinli taneler ayrılabilmektedir (Özay, 1988; Anonim, 2002).

Mikotoksin oluşmuş ürünün çoğu kez mikotoksin oluşmamış ürüne göre

farklı fiziksel özellik göstermesi nedeniyle, küçük taneli ürünlerde ve özellikle

mısırda yoğunluğa göre ayrım uygulanabilmektedir (Huff ve Hagler, 1982; Özay,

1988; Özkaya ve ark., 1999; Bata ve Lasztity, 1999; Placinta ve ark., 1999)

Ayrıca; mısır, pamuk tohumu ve kuru incir gibi bazı ürünlerde aflatoksin

nedeniyle UV (365 nm) ışığı altında parlak yeşilimsi sarı (BGY) bir floresans

meydana gelmektedir. Bu floresans ile ürünün aflatoksin içeriği arasında sıkı bir

ilişki bulunmuş olup, floresans veren tanelerin ayıklanması ile etkili bir

dekontaminasyon sağlanabilmektedir. Bu yöntem, ülkemizde kuru incir ihracatındaki

dar boğazın aşılmasını sağlamıştır (Çoksöyler, 1994; Hocking, 1997; Scott, 1998;

Özkaya ve ark., 1999).

2.5.2. Fiziksel Degradasyon Yöntemleri

Isı, ışınlama ve adsorbsiyon, mikotoksinler üzerindeki etkilerinin araştırıldığı

üç fiziksel faktördür (Doyle ve ark., 1982; Özkaya ve ark., 1999).

2.5.2.1. Isı

Aflatoksinler, 237 ile 306°C arasında değişen yüksek dekompozisyon

sıcaklıklarına sahip olmaları nedeniyle ısıya oldukça dayanıklıdırlar. Aflatoksinlerin

kısmen parçalanabilmeleri için sıcaklığın 150oC’nin üzerinde olması gereklidir.

Aflatoksinin ısı ile degradasyonunda kritik faktör ürünün nem içeriğidir. Nem

içeriğinin fazla olması aflatoksinin ısı ile inaktivasyonunu oldukça

kolaylaştırmaktadır. Nemin varlığı, AFB1’in lakton halkasının açılarak terminal

karboksilik asit oluşmasına neden olmaktadır. Daha sonra karboksilik asit ısının

etkisiyle dekarboksilasyona uğramaktadır (Doyle ve ark., 1982; Samarajeewa ve ark.,

1990).

Bu konuda yapılan bir çalışmada; yağlı tohum küspesinde ki nem artışının,

sıcaklık ve ısıtma süresinin sabit tutulması halinde aflatoksin miktarındaki azalışı

artırdığı görülmüştür. %30 nem içeren küspenin 100oC'de 2.5 saat tutulması, mevcut


19

toksinin yaklaşık %85’inin azalmasıyla sonuçlanmıştır. Aynı koşullarda %6.6 nem

içeren küspede ise aflatoksinin %50 oranında azaldığı bildirilmiştir (Doyle ve ark.,

1982; Özkaya ve ark., 1999).

2.5.2.2. Işınlama

AFB1, pH’nın 3’ten küçük ya da 10’dan büyük olması durumunda UV ışığına

karşı oldukça hassastır (Samarajeewa ve ark., 1990). Samarajeewa ve Gamage

(1988), UV ışığına maruz kalan AFB1’in 12 yeni toksik bileşiğe dönüştüğünü

bildirmişlerdir. Yapılan başka bir çalışmada, 10 cm kalınlığındaki yerfıstığı küspesi 8

saat UV ışığına tutulmuş ve toksinin floresansında görünür bir değişiklik olmamıştır.

UV ile muamele edilen bu yerfıstığı ekstraktları, ördek yavrularına yedirildiğinde,

hayvanlar birkaç gün içerisinde ölmüş ve karaciğerlerinde aflatoksinin neden olduğu

karakteristik lezyonlar görülmüştür (Doyle ve ark., 1982; Özkaya ve ark., 1999).

Benzer sonuçlar 2,5 Mrad dozunda gama ışını verilen aflatoksin içeren

yerfıstığı küspesinde de elde edilmiştir. Bu işlemin etkisiz kalmasına, aflatoksin gibi

karmaşık organik maddelerin gama ışınlarından doğrudan etkilenmemelerinin neden

olabileceği belirtilmiştir. Oysaki, suyun ve başka basit bileşiklerin radyolizi sonucu

meydana gelen serbest radikallerin daha sonra organik moleküllerle reaksiyona

girmesi ışınlamanın dolaylı etkisini ortaya çıkarmaktadır. Suyun varlığı bu prosesin

etkinliğini belirleyen önemli bir faktördür (Doyle ve ark., 1982; Samarajeewa ve

ark., 1990; Rustom, 1997).

X-ışınları ve elektron ışınlamanın aflatoksinler üzerine etkileri de araştırılmış

ve aflatoksini etkili bir şekilde parçalamak için gerekli dozun ışınlanmış ürünü de

harap ettiği bildirilmiştir (Doyle ve ark., 1982; Özkaya ve ark., 1999).

2.5.2.3. Adsorbsiyon

AFB1’in bir sıvı içerisinde bentonit tarafından adsorbe edilebildiği ve daha

sonra bentonitin uzaklaştırılması ile aflatoksinin tamamına yakınının

uzaklaştırılabildiği belirlenmiştir. Parçacık büyüklüğü ve ısıl işlem bentonitin

adsorblama yeteneğini etkilemektedir (Özkaya ve ark., 1999). Yapılan bir çalışmada,


20

bentonitin sütün içerisindeki aflatoksini %65-79 oranında azalttığı ve bentonit

miktarının artmasıyla adsorbsiyonun da arttığı belirtilmiştir (Doyle ve ark., 1982).

Bahar ve Altuğ (1997) yaptıkları bir çalışmada, kontamine kuru incirlerden

iki farklı teknikle elde edilen incir pekmezlerine aflatoksin geçiş düzeylerini

araştırmışlardır. Pekmez toprağı kullandıkları birinci teknikle elde edilen bütün incir

pekmezinde başlangıçtaki incirlere göre ortalama %62; öğütülmüş incir pekmezinde

ise ortalama %29 oranında azalma olduğunu belirtmişlerdir. Jelatin kullandıkları

ikinci teknikte ise elde edilen bütün incir pekmezinin toplam aflatoksin düzeyinde

%38’lik bir azalma görülmüştür.

2.5.2.4. Solventlerle Özütleme

Yağlı tohumların işlenmesinde uygulanan proses, aflatoksinlerin tamamına

yakın kısmının uzaklaşmasını sağlamaktadır (Goldblat ve Dollear, 1977). İşlem

sırasında tohumda mevcut olan aflatoksinin bir kısmı ham yağa geçmektedir. Yağa

geçen aflatoksin oranı genellikle işleme şekli, koşulları ve hammadde kalitesine

bağlıdır. Rafinasyon sırasında bitkisel yağlarda bulunan aflatoksinin uzaklaştırıldığı,

büyük bir kısmının ham yağın alkali ile muamelesinde "soapstock" ’ta kaldığı

belirtilmiştir (Parker ve Melnick, 1966).

Konvensiyonel rafinasyon ve ağartma proseslerinin uygulandığı ABD’de

yağlarda aflatoksin problemi bulunmamaktadır. Çünkü zeytinyağı dışında yenilebilir

ham yağ tüketilmemektedir. Fakat yağın, ham yağ olarak kullanıldığı yerlerde

özellikle yerfıstığının çok üretildiği ülkelerde örneğin Hindistan’da, rafine edilmemiş

ham yerfıstığı yağı ucuz oluşu, hoş aroma ve lezzeti ile geniş bir halk kesimi

tarafından tercih olunmaktadır. Ham yerfıstığı yağından aflatoksinin giderilmesi için

yağ koalin ile işleme sokulmuş, %1.0, 1.5, 3.0 oranında koalin 15-30 dakika 80oC'de

denemeler sonucu, %3'lük koalin ile 15 dakikalık süren işlemde en iyi sonuç

alınmıştır (Miller ve ark., 1985).

Solventlerle özütleme işlemi için sayısız solvent kombinasyonları

denenmiştir. Özellikle yağlı tohumlara uygulanabilen en etkin solvent sistemi su,

aseton, hekzan içermektedir (Gardner ve ark., 1968). Aseton+su (90:10 v/v) ikili


21

sistemi ile özütlemenin yerfıstığı, pamuk tohumu üzerinde %96-98 etkili olduğu

belirtilmiştir (Gardner ve ark., 1971).

Solventle özütleme işlemlerinin avantajları:

1. Aflatoksinin tamamına yakın kısmının üründen uzaklaştırılabilmesi,

2. Üründe yeni bozunma ürünlerinin oluşmaması,

3. Ürün proteinlerinin fazla tahrip olmaması,

4. Besin değerinin korunmasıdır (Özay, 1988).

2.5.3. Kimyasal Detoksifikasyon Yöntemleri

Gıdalardaki aflatoksinlerin kimyasal detoksifikasyonu uygulanabilir bir hasat

sonrası yaklaşımıdır. Yapılan araştırmalar aflatoksinlerin degradasyonunda asitler,

bazlar, bisülfitler, klorlu bileşikler ve okside edici maddelerin kullanılabileceğini

göstermiştir.

2.5.3.1. Asit Uygulaması

Kuvvetli asitler, hidrasyon süresince aflatoksini hemiasetal formlarına

dönüştürerek degrade olmasına neden olmaktadırlar (Van Nieawenhuize, 1973).

Başka bir ifadeyle, AFB1’e suyun eklenmesiyle AFB2’nin hidroksi analoğu olan

AFB2a oluşmakta aynı şekilde AFG2a da AFG1’in asidülasyonu ile meydana

gelmektedir.

Pons ve ark. (1972) AFB1 ve AFG1’i daha az toksik olan formlarına yani

sırasıyla AFB2a ve AFG2a’ya asitlerle dönüştürme üzerine çalışmışlardır.

Araştırıcılar, pH’nın azalması veya sıcaklığın artışıyla dönüşüm oranının arttığını

bildirmişlerdir. Çalışmada, pH’sı 3.0 olan sulu çözeltideki AFB1’i hidroksi

anoloğuna %95 oranında dönüştürmek için 100oC’de 6 saate ihtiyaç duyulduğu

belirtilmektedir. Ayrıca, AFB2 ve AFG2’nin AFB1 ve AFG1 ile kıyaslandığında asit

degradasyonuna daha az duyarlı olduğu da ifade edilmiştir.

Williams ve Dutton (1988) asitlerin, doğal olarak kontamine olmuş yerfıstığı

ununda aflatoksinleri degrade etme üzerine etkilerini araştırmışlardır. Bir reaktör

içinde (129°C’de 160kPa basınçta) hidrolize sebze proteini üretimi sırasında 3M

hidroklorik asit ilavesinin aflatoksinlerin toksik veya mutajenik bileşik oluşturmadan


22

tamamen degrade olmasına neden olmuştur. Başka bir çalışmada ise, 100°C’deki yağ

banyosuna yerleştirilmiş ağzı kapalı deney tüplerindeki yerfıstığı unundaki AFB1, 5

N hidroklorik asit ilavesiyle tamamen parçalanmıştır (Wattanapat ve ark., 1995). Her

iki çalışmada, aflatoksinli yerfıstıklarından uygun şartlar altında aflatoksin içermeyen

hidrolize sebze proteini elde edilebileceğini göstermektedir.

Ağzı pamukla kapatılan erlen içerisine konulan sorguma (süpürge darısı)

ilave edilen 3 N’lik salisilik, sülfamik ve sülfosalisilik asit, 1 mg L-1 düzeyindeki

AFB1’in %90 oranında azalmasına neden olmuştur. Çalışmada ayrıca, 5 N

anthranilik, benzoik, borik, okzalik ve propionik asit ilavesiyle aynı

konsantrasyondaki AFB1’in %90 ve daha fazla oranda azalmasıyla sonuçlanmıştır.

Güçlü asitlerle muamele AFB1’in degrade edilmesinde etkili bulunurken, AFB2 ve

AFG2 üzerinde az etkili ya da etkisiz bulunmuş ve AFB2a’nın toksik etkisinin devam

ettiği görülmüştür (Hasan, 1996).

2.5.3.2. Hidroksit ile Alkali Uygulaması

Çeşitli araştırmalar, inorganik veya organik bazlı alkali uygulamalarının

aflatoksinlerin degradasyonunda etkili ve ekonomik olarak uygulanabilir bir metot

olduğunu göstermektedir. Alkaliler, AFB1’in lakton halkasının hidrolizine neden

olmaktadır. Bununla birlikte, yapılan çalışmalar hidrolize olan lakton halkalarının

asidik koşullar altında tekrar kapanabileceğini ve AFB1’in yeniden oluşabileceğini

göstermektedir (King ve Prudente, 2005).

Price ve Jorgensen (1985) alkali uygulamaların, mısırdan tortilla üretimi

sırasındaki koşullar nedeniyle aflatoksinlerin parçalanması üzerine etkilerini

araştırmışlardır. Mısırın %0.5’ten daha az kalsiyum hidroksit ile muamele

edilmesiyle aflatoksin içeriği %43 oranında azalmıştır. Asit uygulaması başlangıç

konsantrasyona dönüş ile sonuçlanmıştır.

Yapılan başka bir çalışmada; yüksek düzeylerdeki kalsiyum hidroksit

aflatoksin degradasyon oranını artırmamış ve çok güçlü alkali tat ile kokuya sahip

olması nedeniyle duyusal açıdan daha az kabul edilebilir bir ürün elde edilmiştir

(Arriola ve ark., 1988).


23

Kalsiyum hidroksit ile muamele şartları, mısır ürünlerinin yalnızca pH

düzeylerinin yaklaşık olarak 7’ye yükselmesine neden olmuştur. Bu pH

derecelerinde aflatoksinin detoksifikasyon işlemi, asit uygulaması ile tersine

çevrilebilmiş ve bu durum orijinal aflatoksin yapısının yeniden oluşmasıyla

sonuçlanmıştır (Torres ve ark., 2001).

Arriola ve ark. (1988)’nın yaptıkları bir çalışmada doğal olarak 1600 ng g-1

toksinle kontamine olmuş mısır, 100°C’de 4 dk süreyle %3’lük sodyum hidroksit ile

kaynatılmış ve toplam AFB1 ve AFB2 düzeyleri %93 oranında azalmıştır. Aynı

mısırlar asitle muamele edildikten sonra orijinal AFB1 yapısına %18 oranında geri

dönüşüm gerçekleşmiştir. Ayrıca mısır çerezi yapmak için gerekli olan 196°C’de 15

dk kızartma işlemi ile otoklavlama ile yapılan ısıl işlem, ürünün aflatoksin içeriğinin

insan gıdası olarak kullanımını mümkün kılan bir düzeye (20 ng g-1’den daha az)

inmesine neden olmuş ve mutajenite gözlenmemiştir (Park, 1993).

Yapılan bir çalışmada örnek ağırlığına bağlı olarak %2 kalsiyum hidroksit ve

%0.5 metilamin kullanımının 400 ng g-1 aflatoksin içeren yerfıstığı ununda geri

dönüşüm olmaksızın toksin içeriğinin kabul edilebilir standartlar içerisine düştüğü

belirtilmiştir (Park ve ark., 1981).

Epsoy (1972), patentli bir çalışmada Ca(OH)2’yi su ile çamurlaştırarak yağlı

tohumları detoksifiye etmek için kullanmıştır. Bu işlem pratikte ABD’de kurutulmuş

hindistan cevizinin detoksifikasyonunda uygulanmaktadır. Mikotoksin oluşmuş

ürünlerde mikotoksinlerin kimyasal detoksifikasyonunda en etkin ve uygulamalarına

başlanmış bir yöntemdir.

2.5.3.3. Bisülfit Uygulaması

Bisülfit; enzimatik ve enzimatik olmayan esmerleşme reaksiyonları ile bir

çok mikroorganizmanın gelişimini engellemesi nedeniyle bazı gıdalarda yaygın

olarak kullanılan bir kimyasaldır (King ve Prudente, 2005).

Sodyum bisülfitin, terminal furan halkasının 8, 9 konumundaki çift bağ ile

reaksiyona girdiği ve toksinin suda daha çok çözünür hale geldiği varsayılmaktadır.

AFB2’de bu çift bağın olmayışı bisülfit ile degradasyonunu mümkün kılmamaktadır.

Sodyum sülfonat (B1S) oluşumu aflatoksin ile sülfonik asidin en önemli reaksiyon


24

ürünlerinden biri olduğunun kanıtı olarak görülmektedir (Hagler ve ark., 1983;

Yagen ve ark., 1989).

Nem içeriği, sodyum bisülfit miktarı, süre ve sıcaklık derecesi AFB1’in

degradasyonu üzerinde önemli etkiye sahip olup bu faktörler AFB2 üzerine etki

göstermemektedirler (King ve Prudente, 2005). Doyle ve Marth (1978) pH’nın 5.5

olduğu bir tampon sistemde sitrik asit veya metanol varlığında sodyum bisülfitin

aflatoksinleri parçalama oranının düştüğünü gözlemlemişlerdir. Yaklaşık 235 ng g-1

aflatoksin içeren mısırda %0.5 ve %1’den daha düşük konsantrasyondaki sodyum

bisülfitin AFB1’in parçalanmasında aynı düzeydeki sodyum hidroksit veya amonyak

çözeltisinden daha etkili bulunmuştur (Moerck ve ark., 1980).

Altuğ ve ark. (1990) 250 ng g-1 AFB1 ile kontamine olan incirler, %1’lik

bisülfit uygulamasından önce %0.2 hidrojen peroksit ile muamele edilmiş ve tek

başına bisülfit uygulaması ile kıyaslandığında 25°C’de 72 saat içinde AFB1’in

%57’den fazlası parçalanmıştır.

Doğal olarak toksinle kontamine olmuş yerfıstığı ezmesi sodyum bisülfit ve

sodyum hidroksit ile ayrı olarak muamele edilmiş ve 24 saatlik depolama sonunda

aflatoksin düzeyinde azalma görülmüştür. Ancak oda koşullarında 10 ve 20 gün

depolandıktan sonra örneklerin toplam aflatoksin miktarında artış gözlenmiştir. Bu

durum küflerin yeniden gelişim göstermesine bağlanmıştır. Aspergillus flavus

aşılanan yerfıstığı ezmeleri %10 nem içerecek şekilde %1’lik sodyum bisülfit ile

muamele edilmiş ve oda sıcaklığında küf gelişimi ile aflatoksin üretimi tamamen

engellenmiştir (Ghosh ve Chhabra, 1995).

2.5.3.4. Hipoklorit Uygulaması

Klorlu su, gıda işleme ekipmanlarının dezenfeksiyonu ile çeşitli

hammaddelerin işleme öncesinde yıkanmasında ve ayrıca bazı ülkelerde ağartıcı ve

okside edici madde olarak un endüstrisinde kullanılmaktadır (Wei ve ark., 1985;

Samarajeewa ve ark., 1990).

Sodyum hipokloritin, sodyum hidroksit veya amonyum hidroksit için gerekli

olan konsantrasyondan daha düşük miktarlarının bile florasanla belirlenen AFB1’in

düzeyinde oldukça etkili azalmaya neden olduğu belirtilmiştir. Sodyum hipokloritin


25

organizmalar üzerinde toksik etki göstermesi nedeniyle “Ames” analizi ile

toksisitesinin belirlenmesi mümkün olmamıştır (Draughon ve Childs, 1982).

Bandara ve ark. (1991) su içerisine daldırılan yarı pişmiş pirinçlerin AFB1

düzeylerinin arttığını gözlenmiş ancak 10 µg g-1 kalsiyum hipoklorit ilavesinin ise

AFB1 miktarında önemli derecede azalmaya neden olduğunu bildirmişlerdir.

AFB1’in degradasyonu ve OH radikalinin oksidasyonuna bağlı olarak mutajen

özelliğinde azalma açısından değerlendirildiğinde, hipoklorik asidin sodyum

hipokloritten daha çok etkili olduğu görülmüştür (Suzuki ve ark., 2002).

2.5.3.5. Amonyak Uygulaması

Amonyak uygulaması, mısır işleme endüstrisince kabul gören ve geniş çapta

kullanılan bir yöntemdir (Park ve Njapau, 1989; Weng ve ark., 1994). Amonyum

hidroksit veya amonyak gazı kullanılmasıyla mısır, yerfıstığı küspesi, pamuk tohumu

ve ürünlerinde aflatoksinin %99’dan fazla azalması sağlanmıştır (Özay, 1988). Bu

reaksiyon sonucu oluşan ürünler, AFB1’den çok daha az toksiktir. Ancak,

amonyaklanan üründen havalandırma ile amonyağın uçurulması gerekmektedir.

ABD’de Food and Drug Administration (USFDA) tarafından, amonyak işlemi

görmüş yem hammaddesinin (pamuk tohumu için) %20'den fazla katılmaması ve

uyarıların etikette bulunması gibi koşullarla geviş getiren hayvanlarda yem olarak

kullanımına izin verilmiştir (Özkaya ve ark., 1999). Amonyaklama diğer

detoksifikasyon yöntemlerine nazaran daha ekonomik olup büyük miktarda ürüne

uygulanabilmektedir. Toksisite denemeleri ile amonyaklanmış ürünün emniyetli

olduğu saptanmıştır (Özay, 1988).

Lee ve ark. (1984) %4 amonyak uygulanmış AFB1 içeren silika jelleri,

100°C’de 30 dk süreyle 40 psi basınç altında tutmuşlar ve uygulama sonunda

AFB1’in %99’unun degrade olduğunu bildirmişlerdir. Ancak, molekül ağırlıkları 286

ve 206 olan iki yeni bileşik oluşmuştur. Çözücü fraksiyonlar, amonyaklanmamış

AFB1’den 2000 ile 20000 kez daha az toksik etki göstermiştir (Haworth ve ark.

1989).

Amonyaklanmamış pamuk tohumu ununun metilen klorit fraksiyonunda

radyoaktif olarak işaretlenen ürünün %90’ı, amonyaklanan unda ise yalnızca %25’i


26

bulunmuştur (Park ve ark. 1984). Lawlor ve ark. (1985) yaptıkları çalışmada

radyoaktif olarak işaretlenen ürünlere protein bağlandığını bildirmişlerdir.

500 ng g-1 AFB1 ile kontamine olmuş kuru hindistancevizi, %20 nem içerecek

şekilde %1.5 amonyum hidroksit ile muamele edilmiş ve 5 gün sonunda ana bileşiğe

dönüş olmadan toksin miktarı 20 ng g-1’nin altına düşmüştür (Mercado ve ark.,

1991). Yapılan başka bir çalışmada; toksinin dekontamine edilmesindeki en önemli

faktörlerin, ürünün nem içeriği ile amonyaklama işleminin yapıldığı sıcaklık

derecesinin olduğu belirtilmiştir (Weng ve ark., 1994). Yüksek sıcaklık (121°C) ve

nem içeriğinin (%16) oldukça etkili olduğu, bu şartlar altındaki mısırlardaki toksinin

%99’unun giderildiği bildirilmiştir. Ayrıca, bu ürünlerin mide asidine karşı dayanıklı

oldukları ve % 0.05’ten azının aflatoksine geri dönüştüğü ifade edilmiştir (King ve

Prudente, 2005).

Ticari ölçekli bir çalışmada, aflatoksin içeren öğütülmüş pamuk tohumuna

99°C’de ve 0.7 bar buhar basıncında % 1 amonyak uygulanmış, kalitede bir değişim

olmaksızın %97 oranında detoksifikasyon sağlanmıştır (Ahmed ve ark., 1996). Başka

bir çalışmada ise, %2’lik amonyum persülfatın mısırlarda AFB1’in degradasyonunda

etkili olduğu ve bu durumun etanol üretimini etkilemediği ifade edilmiştir (Burgos-

Hernandes ve ark., 2002).

Burgos-Hernandes ve ark. (1996), fermentasyon işlemiyle etanol üretiminde 3

farklı pestisit ile amonyum persülfat kullanımının aflatoksinle kontamine mısırlarda

detoksifikasyona etkisini araştırmışlardır. Fermentasyon sırasında %2 ve üzerindeki

miktarlarda amonyum persülfat, ayrıca farklı aşamalarda H2O2, ozodicarbonamide ya

da benzyl peroxide ilave etmişlerdir. Aflatoksinin en çok %2 amonyum persülfat

kullanılması durumunda parçalandığı bildirilmiştir.

Mercado ve ark. (1991), aflatoksinle kontamine olmuş kurutulmuş hindistan

cevizinin amonyak ile kimyasal detoksifikasyonu üzerinde çalışmışlar ve %7-24

arasında nem içeren ürünlere ilave edilen %1.5’lik amonyum hidroksitin, 5’inci gün

sonunda toksin miktarında %67 oranında bir azalmaya neden olduğunu

belirtmişlerdir.


27

2.5.3.6. Ozon Uygulaması

Ozon, klor bazlı kimyasallar yerine geçerek özellikle et ve su endüstrilerinde

olmak üzere, gıda işlemede sanitasyon amaçlı olarak geniş çapta kullanılmaya

başlanmıştır (McKenzie ve ark., 1997).

Aflatoksinli pamuk tohumu ve yerfıstığı ununun %30 nemde ve 100°C’de 2

saat süreyle ozonlanmasıyla AFB1 tamamen degrade olurken, başlangıçtaki %9

oranındaki AFB2’nin aynen kaldığı bildirilmiştir (Dwarakanath ve ark., 1968).

Ozonlanmış yerfıstığı unu, yavru ördeklerin yemlerine %60 oranında karıştırılmış ve

bu ördeklerin vücut ağırlıklarının aflatoksinli yem yiyen ördeklere göre daha düşük

bulunduğu belirtilmiştir (Dollear ve ark., 1968). Aflatoksinli mısırla

karşılaştırıldığında, ozonla muamele edilen unlarda protein etkinlik oranının azaldığı

bulunmuştur. Bu sonuca, ya temel besin öğelerinin yıkımının ya da yeni toksinlerin

oluşumunun neden olduğu düşünülmektedir (King ve Prudente, 2005).

Maeba ve ark. (1988) saf AFB1, AFB2, AFG1 ve AFG2’nin ayrı ayrı %5’lik

çözeltilerini ozonla muamele etmişlerdir. AFB2 ve AFG2’nin ozonla oksidasyona

AFB1 ve AFG1’den daha dayanıklı olduğu ve oksidasyonları için daha yüksek

konsantrasyonlara ve uzun sürelere ihtiyaç duyulduğu belirtilmiştir. Ozonlanan

aflatoksinlerin civciv embriyo analiziyle toksik olmadığı tespit edilmiştir. Ames testi

ile de ozonlanan AFB1 ve AFG1’in mutajenik olmadığı bulunmuştur. Ozonlama ile

AFB1’in bağışıklığı azaltan aktivitesi de ortadan kaldırılmıştır (Chatterjee ve

Mukherjee, 1993).

Aflatoksinli tahılların dekontaminasyonunda daha sonra hayvan yemleri için

de kullanılabilecek yeni bir ozonlama işlemi geliştirilmiştir. Bu yöntem, oksijen ve

elektrik akımı kullanılan geleneksel metotlardan farklıdır çünkü ozon, su ve

elektroliz hücresi kullanılarak üretilmektedir. Bu ozonlama yöntemi kullanılarak 30

kg mısır tanesi ile yapılan çalışmada 92 saatte örneklerin aflatoksin içeriği %95

oranında azalmıştır. Ozonla muamele edilen mısır, yerfıstığı ve bunların soya unu ile

karışımlarını tüketen hindi palazlarının ağırlık kazanımları, karaciğer ağırlıkları ve

kan kimyaları kontrol örneklerle aynı bulunmuş, aflatoksinli yemlerle beslenen

hayvanlarda ise olumsuz farklar görülmüştür (McKenzie ve ark., 1998). Bu sonuçlar

ozonlama öncesinde kontamine olan veya olmayan mısırlar için de benzer bulunmuş


28

olup, ozonlama işlemi ile zararlı bileşiklerin oluşmadığının bir göstergesidir (King ve

Prudente, 2005).

Aflatoksinsiz ve doğal olarak aflatoksin içeren mısır örnekleri ozonlanmadan

önce ve sonra AFB1 içeriklerinin belirlenmesi amacıyla analiz edilmiştir.

Ozonlanmış ve ozonlanmamış toksinsiz mısırların 2 ng g-1’den daha az AFB1

içerdikleri, ozonlanmış ve ozonlanmamış toksinli mısırların ise sırasıyla 48 ng g-1 ve

587 ng g-1 AFB1 içerdiği tespit edilmiştir. Çalışmada inaktif hale geçen aflatoksinin

ana bileşiğe geri dönmediğini göstermiştir (Prudente ve King, 2002).

Asidik bir ortama maruz kalan 47 ng g-1 AFB1 içeren ozonlanmış örneklerin

toksin içerikleri 29 ng g-1’ye düşmüştür. Asit uygulaması, AFB1’in furan halkasının

8, 9-olefinik bağının hidrasyonuna öncülük ederek AFB1’in 1/200’ü kadar az toksik

olan AFB2a’nın oluşmasına neden olmuştur (Samarajeewa ve ark., 1990). Hekzan

ekstraktları sürekli olarak saf AFB1’in potansiyel mutajenik etkisini azaltmaktadır

(Prudente ve King, 2002). Bu sonuç, mısırın kaba (crude) ekstraktları içindeki

mevcut maddelerin aflatoksinin mutajenik aktivitesini engellediğini

desteklemektedir. Ayrıca ozonlanmış aflatoksin içeren mısır ekstraktlarının diğer

ekstraktlarla karşılaştırıldığında daha az engelleyici etkisinin olduğu görülmüştür.

Elde edilen bulgular, ozonlama işlemi ile mutajenik etkiye sahip yeni reaksiyon

ürünlerinin oluşmuş ya da ozonlamanın toksinli mısırlardaki doğal mutajen

inhibitörlerini tahrip etmiş olabileceğini göstermektedir (Prudente ve King, 2002;

King ve Prudente, 2005).

Yapılan bazı çalışmalarda, linoleik asidin antimutajenik aktivite gösterirken

otooksidasyona uğrayan linoleik ve oleik asitlerin ise mutajenik aktivite gösterdiği

bildirilmiştir (Aikawa ve Komatsu, 1987; Aikawa, 1988; Ho ve ark., 1995). Prudente

ve King (2002) ozonla muamele edilen ve doğal olarak aflatoksin içeren mısırların

palmitik asit miktarlarının %15.8’den %18.2’ye çıktığını ve linoleik asitin

%58.7’den %56.2’ye düştüğünü belirtmişlerdir.

Zorlugenç ve ark. (2008) yaptıkları çalışmada, ozonlama öncesi kuru

incirlerde mikotoksin oluşumuna neden olan A. flavus ve A. parasiticus’un

bulunduğunu ve 15 dakika süreyle ozon gazı ve ozonlu su ile muamele edilen incir

örneklerinde küflerin tamamen yok edildiklerini bildirmişlerdir. Araştırıcılar ayrıca,


29

incirlerin AFB1 içeriklerinin 180 dakikalık ozon gazı ve ozonlu su uygulaması

sonrasında 21.00 ng g-1’dan sırasıyla 1.01 ve 2.39 ng g-1’a düştüğünü belirtmişlerdir.

2.5.4. Biyolojik Detoksifikasyon

Mikotoksinler ile kontamine olmuş tarımsal ürünlerin detoksifikasyonunda

mevcut fiziksel ve kimyasal metotların kullanımı, besin içeriğindeki kayıplar, sınırlı

etki ve maliyet gibi sorunlar nedeniyle kısıtlanmaktadır. Bu durum mikotoksin

sorununa karşı biyolojik yaklaşımı cazip hale getirmektedir (Bata ve Lasztity, 1999;

Shapira ve Paster, 2004).

Biyolojik degradasyonla ilgili ilk bulgular, aflatoksinin keşfedildiği 1960’lı

yıllarda, aralarında küf, maya, aktinomiset, bakteri ve alglerin bulunduğu yaklaşık

1000 mikroorganizmanın, AFB1 ve AFG1’i parçalama veya biyo-dönüşüme

uğratması yönünde etkilerinin olup olmadığının test edildiği çalışma ile elde

edilmiştir. Çalışmada, aflatoksin üzerine hiçbir maya, aktinomiset ve algin etkili

olmadığı belirlenmiştir. Bazı Pseudomanas türlerinin aflatoksini azalttığı görülmüşse

de, bunun ortam pH’sındaki yükselmeye bağlı olduğu belirtilmiştir. Küf ve küf

sporları ile yapılan denemelerde, Aspergillus niger suşlarının AFB1’i belli ölçüde

azalttığı, ancak bunun uzun bir inkübasyon süresince gerçekleştiği; Penicillium

raistrickii ve bazı küf sporlarının da, AFB1’in bir kısmını ince tabaka

kromotografisinde farklı Rf’lerde floresans veren maddelere dönüştürdüğü

bildirilmiştir. Ayrıca çalışmada Flavobacterium’un 7 farklı türü de dahil olmak üzere

test edilen bütün bakterilerin aflatoksin üzerinde etkisiz olduğu görülürken, yalnız F.

aurantiacum NRRL B-184 suşunun aflatoksini ortamdan uzaklaştırılabildiği

belirlenmiştir (Ciegler ve ark., 1966).

Mikotoksinlerin biyolojik detoksifikasyonu çoğunlukla, sorpsiyon veya

enzimatik degradasyon yolu ile gerçekleşmektedir. Canlı mikroorganizmalar

mikotoksini ya hücre duvarı bileşenlerine bağlamakta ya da aktif internalizasyon

(özümseme) ve akümülasyon ile absorbe etmektedirler. Ölü mikroorganizmalar da

mikotoksinleri absorbe edebilmekte ve bu durumdan akışkanların dekontaminasyonu

için biyofiltre oluşturmada veya probiyotiklerin bağlanarak bağırsaktan mikotoksini

uzaklaştırmalarında yararlanılabileceği belirtilmiştir (Shapira ve Paster, 2004).


30

Enzimatik degradasyon ise hücre dışı veya hücre içi enzimler tarafından

gerçekleşebilmektedir. Enzimatik degradasyon tamamlandığında son ürün CO2 ve su

olur. Diğer bir seçenek ise enzimatik modifikasyon ile toksinin başka bir forma

dönüşmesi, azalması veya tamamen yok olmasıdır (Shapira ve Paster, 2004).

Mikroorganizmaların AFB1’i bağlama yeteneklerinin araştırıldığı çeşitli

çalışmalarda, laktik asit bakterilerinin, bifidobakterlerin ve propionibacterium’ların

bazı suşlarının AFB1’i bağlayabildikleri tespit edilmiştir (El-Nezami ve ark., 1998a;

El-Nezami ve ark., 1998b; El-Nezami ve ark., 2000; Oatley ve ark., 2000; Haskard

ve ark., 2001).

F. aurantiacum NRRL B-184 dışında AFB1’i detoksifiye eden

mikroorganizmaların; Corynebacterium rubrum, Candida lipolytica, Aspergillus

niger, Trichoderma viride ve Mucor ambiguous ile bazı Rhizopus, Neurospora ve

Phoma türlerinin olduğu bazı araştırıcılar tarafından bildirilmiştir (Mann ve Rehn,

1976; Nout, 1989; Shantha, 1989).

Flavobacterium, agarlı kültür besiyerinde sarı-kırmızı renkli kolonileri ile

karakterize olan ve karbonhidratlardan zayıf asit oluşturabilen, gram negatif,

fakültatif anaerob, çubuk şeklinde bir bakteri cinsidir (Holmes ve ark., 1984).

Flavobacterium cinsine giren türler genelde 30oC ve hemen altındaki sıcaklıklarda

gelişebilmektedir. Bu bakterinin çok az sayıdaki türünün 37oC’de üreyebildiği

belirtilmiştir (Weeks, 1974).

Bergey’s Manual’in sekizinci baskısında (Weeks, 1974) tür sayısı 12 olarak

belirtilmekle birlikte, 1984 yılında yayınlanan baskısında (Holmes ve ark., 1984)

Flavobacterium cinsi içine F. aquatile, F. breve, F. balustinum, F. meningosepticum,

F. odoratum, F. multivorum, F. spiritivorum olmak üzere 7 tür dahil edilmektedir.

Sözü edilen Bergey’s Manual baskılarında F. aurantiacum NRRL B-184 türüne ise

rastlanılmamıştır. F. aurantiacum NRRL B-184 suşu Amerika Birleşik Devletleri

“Kuzey Bölgesi Araştırma Laboratuarınca (Northern Regional Research Laboratory-

NRRL) tanımlanan ve isimlendirilen bir bakteridir (Özkaya, 2001).

Ciegler ve ark. (1966) yaptıkları bir araştırmada, “Flavobacterium

aurantiacum” olarak izole edilen ve “F. aurantiacum NRRL B-184” olarak

tanımlanan bu bakterinin Bergey’s Manual’in altıncı baskısında yer alan F.


31

aurantiacum’un ve diğer Flavobacterium türlerinin özelliklerine tam uyum

göstermediğine değinmişlerdir. Araştırıcılar F. aurantiacum NRRL B-184 olarak

isimlendirilen bu bakterinin, aerobik, gram negatif, çubuk şekilli, hareketsiz bir

bakteri olduğunu ve “tryptone-glucose-yeast extract (TGY)” agarlı besiyerinde,

yuvarlak, parlak turuncu renkte, kubbeli, pürüzsüz ve sınırları belirgin koloniler

oluşturduğunu belirtmiştir. Ayrıca çalışmada, bakterinin jelatini sıvılaştırmadığı,

litmuslu süt besiyerinde 48 saatte 5mm’nin üzerinde alkali reaksiyon verdiği,

nitrattan nitrit oluşturmadığı, sitratta gelişmediği ve indol, nişasta hidrolizi, glukoz,

sukroz ve laktoz negatif özellik gösterdiği belirtilmiştir.

F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun sınıflandırılmasıyla ilgili yapılan

çalışmalarda bakterinin sınıflandırılmasında hata yapıldığı belirlenmiş ve bakteri

Nocardia corynebacteriodes olarak yeniden adlandırılmıştır (Yassin ve Schaal,

2005).

Ciegler ve ark. (1966) tarafından yapılan çalışmada, 107-1010 kob ml-1

konsatrasyonda F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri hücresi tarafından, modifiye

TGY sıvı besiyerinde bulunan değişik konsantrasyondaki (270-5000 µg 50ml-1)

AFB1’in 44 saat içinde %38-74 arasında değişen oranlarda uzaklaştırıldığı

görülmüştür. Aflatoksinli ve aflatoksinsiz TGY sıvı besiyerinde geliştirilen durgun

faz hücreleri, aflatoksin içeren fosfat tamponunda inkübe edilmiş; her iki durumda da

toksinin ortamdan uzaklaştığı görülmüş ve toksinli besiyerinde geliştirilen hücrelerle,

toksinsiz olanlarda geliştirilen hücrelerin aflatoksini uzaklaştırma oranları benzer

bulunmuştur. Toksindeki azalma, hücre sayısı ve inkübasyon süresinin artırılmasıyla

orantılı olarak artmıştır. Çalışmada, otoklavlanmamış F. aurantiacum NRRL B-184

kültüründeki ölü hücrelerin, hücre sayısı ile orantılı olarak AFB1’i çözeltiden

uzaklaştırdığı tespit edilmiştir. Bu çalışmada, 3x1012 kob 50 ml-1 hücreyle inkübe

edilen AFB1’in yaklaşık olarak %70’i uzaklaştırılmıştır. Ancak, ölü hücreler

çözeltiden uzaklaştırılıp, hücre peleti suyla yıkandığında toksinin tamamı geri

alınmıştır. Ayrıca, hücre sayısının ve inkübasyon süresinin artırılmasının toksinin

%70’inden daha fazlasının uzaklaştırılması üzerine etkili olmadığı görülmüştür.

Buna karşılık canlı durgun faz hücreleri (2x1013 kob 50ml-1), 1’er mg AFB1 ve G1

içeren sudaki toksinlerin tamamını 3-4 saat içerisinde uzaklaştırmışlardır. Canlı


32

hücrelerin ortamdan uzaklaştırdığı toksin, su ya da kloroformla yıkamayla veya sonik

işlemle dahi geri alınamamıştır. Canlı hücrelerin inkübasyondan sonra

otoklavlanması da toksinin geri dönüşünü sağlamamıştır. Bu nedenle araştırıcılar,

aflatoksinin geri dönüşümsüz olarak bağlanıp ortamdan uzaklaştırılabilmesi için F.

aurantiacum NRRL B-184’ün canlı hücrelerine gereksinim duyulduğu sonucuna

varmışlardır.

Aynı çalışmada aflatoksinin tamamının uzaklaştırıldığının ve degradasyon

ürünlerinin toksik olup olmadığının belirlenmesi amacıyla, AFB1 ve AFG1 ile inkübe

edilen F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin sulu süspansiyonları yavru

ördeklere verilmiştir. Tek başına 8 µg AFB1 ve 7 µg AFG1 verilen ördeklerde “Bile

Duct Hyperplasia” görülürken, canlı hücrelerle işlem görmüş 52.5 µg AFB1 veya 30

µg AFG1 verilen ördeklerde ise bu hastalık görülmediği gibi herhangi bir histolojik

değişiklik de gözlenmemiştir. Araştırıcılar, canlı F. aurantiacum NRRL B-184

hücrelerinin çözeltideki aflatoksini detoksifiye ettiğini ve yeni toksik parçalanma

ürünlerinin oluşmadığını belirtmişlerdir (Ciegler ve ark., 1966).

Ciegler ve ark. (1966), F. aurantiacum NRRL B-184’ü çeşitli gıdalar

üzerinde de denemişlerdir. Bu denemelerde, toksijenik bir A. flavus suşu

geliştirilerek aflatoksin oluşumu sağlanan ürünlerde çalışılmıştır. 1013 kob ml-1 canlı

F. aurantiacum NRRL B-184 hücresi ile 28oC de 12 saatlik inkübasyon sonunda

soya fasulyesindeki 8 µg g-1 düzeyindeki AFB1 2 µg g-1’e düşmüş, inkübasyon süresi

uzatıldığında soya fasulyesinde kalan aflatoksininde giderildiği belirlenmiştir. Mısır

ve yerfıstığında, sırasıyla 16 ve 13 µg g-1 düzeyindeki AFB1’in %100 oranında

ortamdan uzaklaştığı belirtilmiştir. Süt, bitkisel yağ ve fıstık ezmesi gibi sıvı ve yarı

katı ürünlerde ise 2x1013 kob ml-1 bakteri hücresi ile 12-14 mg L-1 düzeyindeki

AFB1’in 2-3 saat gibi kısa sürelerde sıfıra veya iz miktarlara düştüğü ortaya

konulmuştur.

Lillehoj ve ark. (1967) AFB1’in F. aurantiacum NRRL B-184 hücreleri

üzerine etkisini ve toksinin organizmaya bağlanma miktarı ile bağlanma

mekanizmasını incelemişlerdir. Bu çalışmada, 5µg ml-1 ve daha yüksek

konsantrasyonda aflatoksin bulunan ortamda gelişen F. aurantiacum NRRL B-184

hücrelerinin morfolojisinin değiştiği; hücre boyunun belirgin şekilde uzadığı, ipliksi


33

bir görünüm alan bu hücrelerde daha sonra da şişkinlik ve dallanmalar meydana

geldiği görülmüştür. Penisilin bulunan ortamda gelişen F. aurantiacum NRRL B-184

hücrelerinde de benzer morfolojik değişimlerin görüldüğü belirtilmiştir. Çalışmada,

test çözeltilerine eklenen %1 glikoz, 0,01M azid ve 1000 ünite ml-1 penisilinin,

AFB1’in uzaklaştırılması üzerine etkili olmadığı ifade edilmiştir. Aflatoksinin durgun

fazdaki hücreler tarafından uzaklaştırılmasının inkübasyon ortamının sıcaklığına ve

pH’sına karşı oldukça duyarlı olduğu ve en fazla azalmanın 35oC’de ve pH 6,75’de

gerçekleştiği belirtilmiştir.

Aynı çalışmada, 1011 kob ml-1 düzeyinde durgun faz hücresi içeren bir sıvı

ortama 7µg ml-1 AFB1 ilave edilmiş ve 4 saat’lik inkübasyonun sonunda toksinin tam

olarak uzaklaştığı belirtilmiştir. Toksinin canlı hücreden suyla yıkama ve sonik

uygulama ile geri alınamadığı da bildirilmiştir. Aynı deneme otoklavlanmış

hücrelerle yapıldığında AFB1’in yaklaşık olarak aynı oranda ortamdan

uzaklaştırıldığı, yıkama işlemi ile toksinin geri alınabildiği ve inkübasyon süresinin

uzaması durumunda toksin azalışının devam etmediği ifade edilmiştir.

Ayrıca, hücre duvarı öğütülmüş bakteri ve hücre duvarı preparatları da toksini

uzaklaştırmada kısmen başarılı bulunmuş, ancak bu preparatlar suyla yıkandığında

toksin geri alınabilmiştir. Bu durumun, aflatoksinin başlangıçta hücre dış yüzeyine

muhtemelen “Hidrojen” veya “Van Der Waals” bağlarıyla zayıf olarak bağlanması

ile açıklanmıştır. Araştırıcılar, toksinin canlı hücreler tarafından metabolik olarak

kullanıldığı ve geri dönüşümsüz olarak giderilmesi için sağlam ve tam hücre yapısına

ihtiyaç olduğu sonucuna varmışlardır.

Lillehoj ve ark. (1967), AFG1’in gelişme dönemindeki F. aurantiacum NRRL

B-184 hücreleri üzerine etkisi ile toksinin durgun faz ve otoklavlanmış hücrelerden

uzaklaştırılmasını inceledikleri çalışmada; 2.5 mg L-1 AFG1, F. aurantiacum NRRL

B-184’ün gelişmesi üzerine etki etmezken, 48 saatlik inkübasyon sonunda 7.5 ve

37.5 µg g-1 toksin, bakteri gelişiminin sırasıyla %55 ve %90 oranında azalmasına

neden olmuştur. Gelişme ortamındaki AFG1 konsantrasyonunun artması lag fazı

süresinin de artmasına neden olmuş ancak 96 saat sonrasında tüm kültürler için

toplam gelişme süresi benzer bulunmuştur. AFG1 ile karşılaştırıldığında AFB1’in test


34

mikroorganizmasının gelişimini engelleyici etkisinin 2-3 kat fazla olduğu

belirtilmiştir.

Araştırıcılar, AFB1 ve AFG1’in hücrenin aynı bölgesine bağlanıp

bağlanmadığını test etmek için hücreleri AFG1 ortamına ilave etmeden önce AFB1 ile

muamele etmişlerdir. Deneme sonucunda hücrelerin AFB1’i bağladıktan sonra

AFG1’i de ortamdan uzaklaştırabildiği bu durumun her iki toksinin hücrenin farklı

bölgelerinde tutulduğunu gösterebileceğini belirtmişlerdir.

Lillehoj ve ark. (1971), F. aurantiacum NRRL-184’ ün gelişme ve durgun

fazdaki hücrelerinin AFM1’in giderilmesi üzerine etkilerini inceledikleri çalışmada 8

μg ml-1 AFM1 içeren sıvı ortama 5x1010 kob ml-1 olacak şekilde durgun fazda hücre

inkübe edilmiş ve dört saat sonra AFM1 tamamen uzaklaştırılmıştır. AFM1’in

gelişme dönemindeki hücreler üzerindeki olumsuz etkisinin ise AFG1 ve AFB1’den

daha az olduğu belirtilmiştir.

Hao ve Brackett (1988) 109 kob ml-1 durgun faz hücresini içeren fosfat

tamponu ile yağlı ve yağı kısmen uzaklaştırılmış yerfıstığı sütünden F. aurantiacum

NRRL B-184’ün AFB1’i uzaklaştırma yeteneğini araştırmışlardır. 24 saat’lik

inkübasyon sonunda, aflatoksin miktarının fosfat tamponunda %40, yağı alınmamış

ve yağı %50 azaltılmış olan yerfıstığı sütünde sırasıyla %23 ve %74 oranında

azaldığını belirtmişlerdir.

Hao ve Brackett (1989) tarafından yapılan diğer bir çalışmada ise, F.

aurantiacum NRRL B-184’ün, durgun faz hücrelerinin elde edilmesi için uygun olan

besiyeri belirlenmiş ve bu bakterinin yerfıstığı sütündeki gelişme karakteristikleri

incelenmiştir. Durgun faz hücrelerinin elde edilmesinde en uygun besiyerinin, ticari

olarak bulunabilen bir ürün olması, kullanımı sırasında özel bir hazırlık

gerektirmemesi ve en iyi gelişimin bu besiyerinde gerçekleşmesi nedeniyle TSB

olduğu belirtilmiştir. F. aurantiacum NRRL B-184’ün yağlı yerfıstığı sütünde, yağ

miktarı yaklaşık %50 oranında azaltılmış olana göre daha yavaş durgun faza ulaştığı

ve bakterinin stabilitesinin en iyi pH 7.0’de korunduğu ifade edilmiştir.

Line ve ark. (1994)’nın F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından

gerçekleştirilen aflatoksin degradasyonunun mekanizmasını belirlemeye yönelik

yaptıkları çalışmada, radyoaktif olarak işaretlenmiş olan AFB1, canlı ve ölü bakteri


35

hücreleri ile 72 saat süreyle inkübe edilmiştir. Örnekler kloroformla ekstrakte edilmiş

ve belirli periyotlarla sulu ve polar olmayan fazlar 14C içeriği yönünden analiz

edilmiştir. Kloroformda çözünen [14C] AFB1’in canlı F. aurantiacum NRRL B-184

hücreleri tarafından hızla suda çözünür ürünlere dönüştürüldüğü görülmüştür. Canlı

hücrelerin varlığında 6 saat sonunda kloroform fazında radyoaktivitenin yalnızca

%24.1’i kalmıştır. F. aurantiacum NRRL B-184 hücresi içermeyen kontrol

örneklerinde ise 72 saat sonunda kloroform fazında radyoaktivitenin %99.7’si

kalmıştır. Denemenin sürdürüldüğü zaman içerisinde radyoaktividedeki azalma ile

suda çözünür degradasyon ürünlerinin oluşum hızlarının benzer olduğu görülmüştür.

Sabit biyokütlede ve sürekli olarak azalan substrat düzeylerinde hız, kalan substratın

konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Bu durum, topraktaki ve sudaki birçok bileşiğin

dekompozisyonunda da görülen birinci derece kinetiğe uygun bulunmuştur.

Araştırıcılar ayrıca, bir miktar aflatoksinin ölü F. aurantiacum NRRL B-184

hücreleri tarafından bağlandığını ancak suda çözünür bileşiklere ya da karbon

dioksite dönüştürülemediğini ifade etmişlerdir.

Line ve Brackett (1995a) AFB1’in F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından

uzaklaştırılmasını etkileyen faktörleri inceledikleri çalışmada kültür yaşı ve hücre

sayısının aflatoksinin degradasyonunda etkili olduğu ifade edilmiştir. 24 saatlik

kültürün aflatoksini uzaklaştırmada tamamen etkisiz bulunduğu, 48 saatlik durgun

faz kültürünün ise toksin üzerinde etkili olarak AFB1’i 24 saat içerisinde %19

oranında azalttığı bildirilmiştir. Ayrıca, 72 saatlik geç durgun faz kültürünün toksini

ortamdan %33 oranında uzaklaştırdığı da belirtilmiştir. Araştırıcılar bu durumun tam

olarak anlaşılamadığını ancak, yaşlanmaya bağlı olarak hücrenin bazı

konformasyonal veya metabolik değişiklik geçiriyor olmasına bağlanabileceğini

belirtmişlerdir. 1x1010 kob ml-1 hücrenin, 1x109 kob ml-1 hücre ile kıyaslandığında

aflatoksini ortamdan daha hızlı olarak uzaklaştırdığı ancak uzaklaştırılan toplam

toksin miktarında bir değişiklik görülmediği de ifade edilmiştir.

Line ve Brackett (1995b) tarafından yapılan başka bir araştırmada, F.

aurantiacum NRRL B-184 tarafından AFB1’in mikrobiyel dönüşümü üzerine toksin

konsantrasyonunun ve ikinci karbon kaynağının etkisi incelenmiştir. Bu amaçla

bakteri hücresi içeren fosfat tamponu veya TSB test çözeltilerinin bir kısmına


36

radyoaktif olarak işaretlenmiş AFB1, diğer bir kısmına da hem işaretlenmiş hem de

işaretlenmemiş AFB1 eklenmiş ve 28oC’de 72 saat inkübe edilmiştir. Radyoaktif

karbondioksitin ve hücre süpernatantının suda ve kloroformda çözünen kısımlarının

analiz edilmesiyle, ilave olunan besin öğelerinin ve işaretlenmemiş toksinin AFB1’in

mikrobiyel dönüşümü üzerine önemli bir etkisinin bulunmadığı ortaya koyulmuştur.

Araştırıcılar çalışmadan elde edilen sonuçları, AFB1’in F. aurantiacum NRRL B-184

tarafından degradasyonunun ko-metabolizma ile ilişkili olmadığı ancak,

organizmaların hem karbon hem de enerji kaynağı olarak tek bir bileşikten

yararlandığı metabolizma şekli olan “mineralizasyon” sonucu meydana gelebileceği

şeklinde yorumlamışlardır. Bu çalışmayla ileri sürülen “degradasyonun bir

mineralizasyon prosesi içerisinde gerçekleştiği ve dışarıdan bir enerji kaynağına

ihtiyaç göstermediği” hipotezinin doğrulanmasının bu yöntemle detoksifiye edilen

gıdalarda ve yemlerde besin kalitesinin olumsuz etkilenmeyeceğini düşündürmüştür.

D’souza ve Brackett (1998) degradasyon prosesleri ile ilişkili olduğu

düşünülen enzim sistemlerinde yer alan bazı metal ko-faktörlerin (Cu+2, Mn+2, Zn+2

ve Co+2), F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından AFB1’in degradasyonunda etkili

olup olmadığını ve bu etkinin Etilendiamintetraasetikasit (EDTA) ve 1,10 fenantrolin

(OPT) varlığında da sürüp sürmediğini araştırmışlardır. 1 ve 10 mM

konsantrasyonlarda iki değerlikli bakır içeren ortamlarda; 4, 24 ve 48 saatlik, 0.1 mM

konsantrasyonda ise 24 ve 48 saatlik inkübasyondan sonra AFB1’in

degradasyonunun kontrollerden önemli ölçüde düşük olduğu görülmüştür. 1mM

EDTA veya 1mM OPT ilavesi, Cu+2’nin AFB1’in degradasyonu üzerindeki inhibe

edici etkisini önleyememiştir. Araştırıcılar Cu+2’nin bakteriler üzerine toksik etki

gösterebileceğini, yaptıkları ön denemelerde 0.1, 1 ve 10 mM Cu+2 içeren ortamlarda

48 saat inkübe edilen hücrelerin sayısında 1.5-2 log düzeyinde bir azalma

gördüklerini bildirmişlerdir. Ancak bu toksik etkinin bir enzim veya enzim sistemi

üzerinde de olabileceği ve AFB1 degradasyonuyla ilişkili bir redüktaz sistemini

inhibe etme olasılığı üzerinde de durulmuştur.

0.1 mM Mn+2 ilavesinin toksin degradasyonu üzerine etkisi önemli

bulunmazken, 1 ve 10 mM konsantrasyonda ise 4 ve 24 saatlik inkübasyondan sonra

degradasyonda önemli bir azalma olduğu görülmüştür. Ön çalışmalarda Mn+2


37

bulunan ortamlarda hücre sayısında azalma gözlendiğinden yüksek

konsantrasyonlardaki iki değerlikli manganın, AFB1 degradasyon sisteminin

genlerini baskılayabileceği veya enzimin degradasyon için inaktif veya daha düşük

affiniteye sahip bir hale dönüşmesine neden olabileceği belirtilmiştir.

Yalnızca Mn+2 ilavesi ile karşılaştırıldığında 1mM Mn+2’nin 1mM EDTA

veya OPT tarafından bağlanması, 4 ve 24 saat sonra AFB1’in degradasyonunu

önemli ölçüde artırırken, 1 mM OPT’nin 10 mM Mn+2 içeren ortama eklenmesi ise

artırmamıştır. Bu bulgu araştırıcılar tarafından, Mn+2’nin AFB1 degradasyonu

üzerine inhibisyon etkisinin yalnız yüksek konsantrasyonlarda olduğu şeklinde

değerlendirilmiştir.

İki değerlikli çinko eklenen örneklerde de degradasyon, 1 ve 10 mM

konsantrasyonlarda; 4, 24 ve 48 saat sonra önemli ölçüde azalırken, 0.1 mM Zn+2

varlığında önemli bir değişiklik görülmemiştir. 1 mM EDTA, 1 ve 10 mM Zn+2’nin

bu inhibitör etkisini önleyemezken, OPT Zn+2 ’ye bağlanmış ve degradasyonun

inhibisyonunu önlemiştir. Ancak, 10 mM konsantrasyondaki Zn+2 varlığında OPT

yalnız Zn+2 bulunanlara göre daha yüksek bir degradasyon sağlanmıştır. Buna

rağmen, yalnız AFB1 bulunan ortamdaki kontrol hücrelerinin degradasyon oranından

daha az degradasyon gerçekleşmiştir. Zn+2’nin degradasyon ile ilişkili olan enzim

veya enzim sisteminde konformasyonal bir değişikliğe neden olarak aktiviteyi

etkileyebileceği üzerinde de durulmuştur. Çalışmada Co+2’nin degradasyonda hiçbir

değişikliğe neden olmadığı görülerek başka denemeler yapılmamıştır.

Araştırıcılar sonuç olarak, Cu+2, Mn+2 ve Zn+2’nin degradasyonda gösterdiği

inhibisyonun, AFB1 degradasyonu ile ilişkili özel bir enzim veya enzim sisteminin

kesin kanıtlarını sağlamadığını; ancak bir redüktaz sisteminin bu organizma

tarafından aflatoksinin degradasyonunda rol oynadığını öne sürebileceklerini ifade

etmişlerdir. Ayrıca bu katyonların ham (crude) enzim preparatları üzerine etkisini

belirlemede hücresel fraksiyonların kullanıldığı ilave araştırmalara gerek görüldüğü

de belirtilmiştir.

D’souza ve Brackett (2000) yaptıkları çalışmada, F. aurantiacum NRRL B-

184 tarafından AFB1’in degradasyonunda kalsiyum ve magnezyumun rolü ile şelatlar

ve ayrıca şelatların varlığında iki değerlikli katyonların etkilerinin belirlenmesi


38

amaçlanmıştır. Araştırmada Ca+2 ve Mg+2’nin kullanılma nedeni olarak, bu

elementlerin enzimlerin büyük bir bölümünde doğal aktivatörler olmaları

gösterilmiştir. F. aurantiacum NRRL B-184’ün 72 saatlik kültürü üzerine 10 µg ml-1

AFB1 ilave edildikten sonra 0.1, 1 ve 10 mM Ca+2 eklenip 48 saat süreyle inkübe

edilmiştir. Süre sonunda Ca+2 ilave edilmemiş hücrelerle kıyaslandığında toksin

miktarında sırasıyla %11.8, 13.5 ve 14.0 oranında azalma görülmüştür. Aynı

konsantrasyonlardaki Mg+2 ilavesi ise sırasıyla %13.8, 13.3 ve 13.1’lik bir azalmaya

neden olmuştur. Her iki katyon için 16 ve 24 saatlik inkübasyon süresi aflatoksinin

degradasyonunda önemli bir etkiye sahip bulunmamıştır. 0.1, 1 ve 10 mM EDTA ile

0.1 ve 1 mM OPT ilavesinin 24 saat sonunda AFB1’in degradasyonunda önemli bir

artışa neden olduğu bildirilmiştir. 10 mM OPT kullanılması durumunda ise daha az

toksin degrade edilebilmiştir. AFB1 ile inkübe edilmiş kontrol örnekler ile Ca+2 ya da

Mg+2 içeren kontrol örneklerde önemli bir toksin degradasyonu gerçekleşmemiştir.

Aflatoksin degradasyonundaki artışın, ilave edilen bu divalent katyonların glikoliz ve

trikloroasetik asit döngüsündeki çeşitli dehidrogenazlar ve dekarboksilazların önemli

kofaktörleri olmalarına bağlı olabileceği ifade edilmiştir.

Divalent katyonlar (Ca+2 ve Mg+2) olmaksızın EDTA (0.1, 1 ve 10 mM)

ilavesi ile 24. saatteki degradasyon önemli ölçüde artmış, 16. ve 48. saatlerdeki

artışlar ise önemli bulunmamıştır. Aynı şekilde 0.1 ve 1 mM OPT ilavesi de 24 saat

inkübasyondan sonra önemli ölçüde yüksek degradasyon sağlamıştır. Ancak 10 mM

OPT ilave edilen örnekte 16 ve 24 saatlik inkübasyondan sonra bir azalma

görülmüştür. 1 mM EDTA bulunan ortama ilave edilen Ca+2 toksin degradasyonunda

önemli bir değişikliğe neden olmamıştır. Buna karşın 1 mM OPT ile Ca+2’nin birlikte

bulunması durumunda degradasyonda azalma görülmüştür. En yüksek degradasyon 1

mM OPT varlığında 10 mM Ca+2 ilavesi ile gerçekleşirken yine 1 mM OPT

varlığında 0.1 ve 1 mM Ca+2 ilavesi degradasyonda azalma ile sonuçlanmıştır.

Kontrol örneklerle karşılaştırıldığın d a, 1 mM EDTA v eya 1 mM OPT varlığında

Mg+2 ilavesi AFB1’in degradasyonunda önemli derecede azalmayla sonuçlanmıştır.

Elde edilen bu sonuçlar, Ca+2 ve Mg+2’un AFB1’in F. aurantiacum tarafından

degradasyonunu teşvik ettiğini, bu katyonların şelatörlerle bağlanması durumunda F.

aurantiacum NRRL B-184 hücreleri tarafından kullanılamadığını ve böylelikle


39

toksinin degradasyonunda azalma meydana geldiğini göstermiştir. Araştırıcılar

AFB1’in degradasyon mekanizması üzerine; bir redüktaz-dehidrogenaz enzim sistemi

yoluyla furan halkası oluşumunda meydana gelen azalmanın, dekarboksilazlar

aracılığı ile AFB1’in kumarin halkasının dekarboksilasyona uğramasının ve ayrıca

birden fazla enzimin etkili olabileceğini belirtmişlerdir.

Araştırıcılar, degradasyon mekanizması ve meydana gelen degradasyon

ürünlerinin tam olarak anlaşılamaması durumunda, bu yöntemin uygulamaya

sokulmasının mümkün olmadığı sonucuna varmışlardır. Ancak degradasyon ile

ilişkili enzim veya enzim sistemleri belirlendikten sonra; enzimlerin gen

kodlamasının yapılarak, plazmidlerin içine yerleştirilebileceği ve dekontaminasyon

işlemlerinde kullanılmak üzere başka bir organizmaya transfer edilebileceği ya da

dirençli ürünler elde etmek amacıyla genetik materyalin doğrudan bitkide

kullanılmasına olanak sağlayacak çalışmaların yapılabileceği belirtilmektedir.

Smiley ve Draughon (2000), F. aurantiacum NRRL B-184’ün ham protein

ekstraktlarının sulu çözeltide AFB1’i degrade etme yeteneğini belirlemeyi

amaçladıkları çalışmada proteinaz K, DNase I ve pH’nın degradasyon üzerindeki

etkileri de incelenmiştir. Protein ekstraktları (800 μg toplam protein/ml) sulu

çözeltilerdeki AFB1’i % 75 oranında ortamdan uzaklaştırmıştır. Isıl işlem görmüş

ham protein ekstraktı ise AFB1’i yalnızca % 5.5 oranında degrade edebilmiş ve bu

oran kontrol ile benzer bulunmuştur. Araştırıcılar bu bulgunun, diğer hücre

bileşenlerinin ve yapılarının da sıcaklığa dayanıklı olmaması nedeniyle,

degradasyonun bir enzime bağlı olduğunun kesin kanıtı olamayacağı görüşüne

varmışlardır. Proteinaz K ile işlem görmüş protein ekstraktlarının AFB1’i %34.5

oranında azalttığı görülmüştür. Proteinaz K spesifik olmayan bir proteazdır ve

protein ektraktında bulunan bütün proteinler ile reaksiyona girmektedir. Protein

ekstraktındaki diğer proteinlerde proteinaz K için substrat olabileceğinden, AFB1’in

degradasyonun tamamen inaktive olması beklenilmemiştir. Araştırıcılar proteinaz K

ile işlem görmüş protein ekstraktlarının degradasyon aktivitesinin azalmasının,

degradasyonun bir proteine ve belki de bir enzime bağlı olduğunu gösterdiğini ifade

etmişlerdir. Toksin degradasyonun, bakterinin genomik DNA’sına spesifik olmayan

bir bağlanmayla ilişkili olup olmadığını anlamak amacıyla ham protein ekstraktı


40

DNase I ile muamele edilmiştir. İşlem sonucunda degradasyon %80.5 oranında

gerçekleşmiştir. DNase I, 3'- hidroksil oligonükleotidleri üreten tek ve çift heliksli

DNA’yı parçalayan bir enzimdir. DNase I ile muamele sonrasında degradasyonda

azalmanın olmaması aflatoksinin F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından

uzaklaştırılmasının bakterinin kromozal DNA’sına bağlanmayla ilgisi olmadığını

açıkça ortaya koymuştur. AFB1’in DNA’ya bağlanmadan önce epoksi forma

dönüşmesi gerekmektedir, ancak bakterinin mikrosomal enzimleri olmadığı için

epoksidasyon da beklenmemekte ve böylelikle DNA’ya bağlanma

gerçekleşmemektedir. Degrade edilen AFB1 miktarı üzerine pH’nın etkisini

belirlemek amacıyla çözelti pH’sı 5, 6, 7 ve 8 ayarlanarak denemeler yapılmış ve

degradasyonun en fazla pH 7’de gerçekleştiği ifade edilmiştir. Araştırıcılar, AFB1

degradasyonu ile pH arasında bulunan ilişkiyi tipik bir enzimatik reaksiyon olarak

değerlendirmişlerdir.

D’souza ve Brackkett (2001), yaptıkları başka bir araştırmada indirgenme

koşulları ile seril ve sülfidril grubu inhibitörlerin AFB1 degradasyonu üzerine etkisini

araştırmışlardır. Araştırmada, redüksiyon koşullarının etkisini incelemek amacıyla

0.1, 1 ve 10 mM L-sistein kullanılmış ancak degradasyon üzerine bir etkisi

görülmemiştir. Bu sonuç, L-sisteinin, F. aurantiacum NRRL B-184 tarafından

gerçekleştirilen AFB1 degradasyonunda etkili bir redüksiyon ajanı olmadığı ya da

redüksiyon koşullarının degradasyonda önemli olmadığı şeklinde değerlendirilmiştir.

Seril ve sülfidril gruplarının degradasyondaki önemini anlayabilmek amacıyla da, bu

grupların inhibitörleri olan, sırasıyla fenilmetilsulfonil florür (PMSF) ve Cd+2

kullanılmıştır. 1 ve 10 mM Cd+2 varlığında inhibisyon meydana gelmiş; 1mM EDTA

ve 1 mM OPT eklenmesi de inhibisyonu önleyememiştir. PMSF ile inkübe edilen

hücrelerde de 1 mM konsantrasyonda önemli inhibisyon görülmüştür. Araştırıcılar

inhibisyona; degradasyonla ilişkili enzim sistemindeki seril ve sülfidril gruplarının

inaktif hale gelmesinin ya da metabolizması için ihtiyaç duyduğu seril ve sülfidril

gruplarını inaktif hale getirerek mikroorganizmanın kendisine de toksik etki

gösteriyor olmasının neden olabileceğini belirtmişlerdir. Sonuç olarak, seril ve

sülfidril gruplarının önemli olduğu belirlenmiş, bunların degradasyonla ilişkisini

ortaya koyacak başka çalışmaların yapılması gerektiği ifade edilmiştir.


41

Özkaya (2001), tarafından yapılan Türkiye’de aflatoksin sorunu yaşanan

yerfıstığı ve kırmızı biberlerde AFB1’in F. aurantiacum NRRL B-184 ile giderilmesi

konulu araştırmada; F. aurantiacum NRRL B-184 suşu AFB1’i 48 saat içinde fosfat

tamponu çözeltisinde %79-98.9 oranında, yerfıstığı ortamında %92.6-99.8 oranında,

kırmızı biber ortamında ise %88.7-100 oranlarında azaltmıştır. Regresyon analizleri,

AFB1’in F. aurantiacum NRRL B-184 suşu bulunan her üç ortamdaki azalışın birinci

derece reaksiyon kinetiğine uygunluk gösterdiğine işaret etmektedir. F. aurantiacum

NRRL B-184 suşunun AFB1 içeren bu ortamlarda canlılığını inkübasyon süresince

başlangıç düzeylerindekine yakın olarak koruduğu bildirilmiştir.

Üreme eğrisi ile ilgili yapılan çalışmalarda ise F. aurantiacum NRRL B-184

suşunun durgun faza 45-50 saatte ulaştığı ve generasyon süresinin gıdalarda gelişen

birçok bakteriye göre uzun (8.15-8.66 saat) olduğu bildirilmiştir.

Bütün bu sonuçlar değerlendirildiğinde; F. aurantiacum NRRL B-184

suşundan kırmızı biber ve yerfıstıklarında bulunan AFB1’i uzaklaştırmada

yararlanılabileceği ve bu konuda yapılacak daha ayrıntılı araştırmalarla da olumlu

sonuç alınması durumunda F. aurantiacum NRRL B-184 kullanılarak

biyodegradasyona uğratılmış kırmızı biber ve yerfıstıkları, gıda katkısı veya salça,

sos ve ezme gibi gıdalar şeklinde değerlendirilebileceği; ancak öncelikle söz konusu

gıdalarda oluşan yeni metabolitlerin toksik olmadığının ortaya konulması gerektiği

vurgulanmıştır.

AFB1’in Rhodococcus erythropolis ile biyolojik degradasyonu hücre

içermeyen ekstraktlarla sıvı ortamda gerçekleştirilmiştir. R. erythropolis hücrelerinin

varlığında 48 saat sonunda aflatoksinin %17’si ve 72 saat sonunda ise %3-6’sı

kalmıştır. Dört bakteri suşunun R. erythropolis (DSM 14303), Nocardia

corynebacteriodes (DSM 12676), N. corynebacteriodes (DSM 20151) ve

Mycobacterium fluarantherivarans sp nov. (DSM 44556T)’ın hücre içermeyen

ekstraktları, bakteri hücrelerinin french basınç hücresinde parçalanması ile

üretilmiştir. AFB1, dört bakteri suşunun hücre içermeyen suşları ile de etkili bir

şekilde degrade olmuştur. N. corynebacteriodes (DSM 12676) (-ki daha önceden

yanlışlıkla F. aurantiacum NRRL B-184 olarak sınıflandırılmıştır) ile 24 saat

sonunda AFB1 degradasyonu %60 düzeylerinde görülürken N. corynebacteriodes


42

(DSM 20151) ile aynı sürede %90’ın üzerinde degradasyon gözlenmiştir. R.

erythropolis ve M. fluarantherivarans, 30oC’de 4 saatte AFB1’in %90’ından fazlasını

degrade etmiş ve 8 saat sonunda ise AFB1 tespit edilememiştir. Yüksek degradasyon

oranı ve geniş bir sıcaklık aralığında degrade edebilmeleri nedeniyle R. erythropolis

ve M. fluarantherivarans gıda ve yem işleme uygulamaları için bir potansiyele sahip

bulunmuştur (Teniola ve ark., 2005).

3. MATERYAL VE YÖNTEM Bülent ZORLUGENÇ

43

3. MATERYAL VE YÖNTEM

3.1. MATERYAL

3.1.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Kültürü

F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri kültürü Amerika Birleşik Devletleri

Tarım Bakanlığı, National Center for Agricultural Utilization Research, Microbial

Genomics & Bioprocessing Research Unit Laboratuarından liyofilize formda temin

edilmiştir.

3.1.2. PFT Çözeltisi

PFT çözeltisi 0.067 M ve pH 6.7 olacak şekilde hazırlanmıştır (Lurie, 1975).

3.1.3. İnce Tabaka Plakası

Çalışmada 20x20 cm ebatlarında silica jel 60 kaplı ince tabaka plakaları

(TLC, Merck 5553) kullanılmıştır.

3.1.4. Detoksifikasyonda Kullanılan Gıda Maddeleri

Araştırmada kullanılan mısır, soya, siyah zeytin, fındık ve kuru incir

Adana’dan, kuru kırmızıbiber ise Kahramanmaraş’tan temin edilmiştir.

3.1.5. Besiyerleri ve Kimyasal Maddeler

Çalışmada kullanılan AFB1 standardı Sigma (Almanya), TSB, TSA, agar agar

Merck (Almanya), methanol, hekzan, diklorometan, fosforik asit, kloroform,

asetonitril, dietileter Merck (HPLC grade, Almanya), sodyum klorür, susuz sodyum

sülfat, Merck (Almanya); immnooaffinite kolonlar Aflaprep (R-Biopharm Rhone,

Glasgow, Scotland), Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kolonları Ace

(ABD) firmalarından sağlanmıştır.


44

3.2. YÖNTEM

3.2.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Canlandırılması ve Stok

Kültürlerin Hazırlanması

Liyofilize formdaki F. aurantiacum NRRL B-184 suşu, 50 ml TSB bulunan

erlenmayerde aşılanmış ve 30oC’de 48 saat süreyle inkübe edilmiştir. Bu süre

sonunda gelişen kültürlerden bir öze dolusu alınarak, 50 ml steril TSB bulunan

erlenmayere aşılanmış ve aynı koşullarda inkübe edilmiştir.

TSB kültüründen stok kültür hazırlamak üzere, tüpteki yatık TSA besiyerine

aktarımlar yapılmış ve yine aynı koşullarda inkübasyonları sağlanmıştır. Stok

kültürler kullanım öncesinde, TSB’den yararlanılarak üç kez transfer edilmiş ve

canlandırılmaları sağlanmıştır. Stok kültürün muhafazası ve aktifleştirilmesinde Hao

ve Bracklett (1988)’den yararlanılmıştır.

3.2.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Gelişme Eğrisinin Elde Edilmesi

TSB’de aktifleştirilmiş F. aurantiacum NRRL B-184 kültüründen erlenmayer

içindeki 100 ml steril TSB besiyerine 1ml ekim yapılmış ve erlenmayer 30oC’de 50

rpm’de çalkalamalı su banyosunda inkübasyona bırakılmıştır. Ekimin yapıldığı

andan başlayarak (0. saat) inkübasyonun 96. saatine kadar belirli periyotlarla birer ml

örnek alınarak kültürel sayımlar gerçekleştirilmiştir (Temiz, 1994). Bu amaçla, ilk

önce örneklerin seri dilüsyonları hazırlanmış ve her bir dilüsyondan içerisinde TSA

besiyeri bulunan 2 petri kutusuna drigalski özesi kullanılarak yüzeye yayma

yöntemiyle ekimler yapılmış ve 30oC’de 48 saat inkübasyonları sağlanmıştır.

İnkübasyon sonunda sayım için en uygun dilüsyona ait petriler sayılmış ve iki paralel

petrideki sayımların ortalaması dilüsyon faktörü de dikkate alınıp hesaplanarak

sayım sonuçları kob ml-1 olarak belirlenmiştir.


Süspansiyonunun Hazırlanması

Bu amaçla içinde 50 ml TSB bulunan erlenmayerlere aktifleştirilmiş F.

aurantiacum NRRL B-184 kültüründen 1 ml aşılanmış ve erlenmayer 30oC’deki

çalkalamalı su banyosunda (Memmert) 72 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon


45

sonunda kültür sıvısı 3500 rpm’de 20 dakika santrüfüj edilmiş ve üstteki sıvı faz

(süpernatant) kısmı atılmıştır. Bakteri hücre peleti steril potasyum fosfat tamponu

(0.067M; pH 6.7) ile yıkanmış, ardından santrüfüjleme ve yıkama işlemi

tekrarlanmıştır. Bunu takiben elde edilen son hücre peleti PFT ile yeniden süspanse

edilmiştir.


Konsantrasyonunun Spektrofotometrik Olarak Belirlenmesi

Bölüm 3.2.3’de belirtildiği şekilde hazırlanan F. aurantiacum NRRL B-184

suşunun durgun faz hücre süspansiyonu PFT çözeltisi (0.067 M; pH 6.7) ile 1/5, 2/5,

3/5, 4/5 ve 1/10 oranlarında seyreltilmiş ve UV-visible spektrofotometrede

(Shimadzu) 540 nm dalga boyunda absorbans değerleri ölçülmüştür (Lillehoj ve ark.,

1967). Bunun yanısıra hücre süspansiyonu seyreltilerinin her birinden, ayrıca uygun

seri dilüsyonlar hazırlanarak petri kutusundaki TSA besiyerinde yüzeye yayma

yöntemiyle kültürel sayımlar gerçekleştirilmiştir. Kültürel sayım sonuçları

(kob ml-1), absorbans değerlerine karşı grafiğe geçirilerek regresyon eğrisi ve eşitliği

elde edilmiştir. Bu regresyon eğrisinden belirli bir absorbans değerine karşılık gelen

hücre sayısının belirlenmesinde yararlanılmıştır.

3.2.5. Durgun Faz da Bulunan F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu ile Aşılanmış

Ortamların AFB1 Konsantrasyonundaki Değişimin Belirlenmesi

3.2.5.1. PFT İçerisinde F. aurantiacum NRRL B-184’un AFB1’in Miktarı

Üzerine Etkisinin Belirlenmesi

Üç farklı konsantrasyonda (500, 1000 ve 2000 ng ml-1) AFB1 çözeltisi ilave

edilen erlenler, toksin standardında bulunan çözücünün uzaklaştırılabilmesi için

30oC’de azot gazı (N2) altında tamamen kurutulmuştur. Kalıntılar üzerine 50’şer ml

steril PFT çözeltisi eklenerek toksin çözündürülmüştür. Toksin içeren erlenlerden

kontrol grubu dışında kalanlarına bölüm 3.2.3. ve 3.2.4.’e göre hazırlanan F.

aurantiacum NRRL B-184 durgun faz hücre süspansiyonlarından yaklaşık 107

kob ml-1 hücre içerecek şekilde aşılama yapılmıştır. Bütün denemeler 3 tekkerrür ve


46

2 paralel olarak gerçekleştirilmiştir. Bu işlemler her bir inkübasyon süresi için ayrı

ayrı uygulanmıştır.

Erlenlerin tamamı 30oC’deki çalkalamalı su banyosunda 50 rpm’de

inkübasyona alınmış ve 0, 6, 12, 24, 36, 48 ve 72. saatlerde aflatoksin

konsantrasyonları yönünden bölüm 3.2.6.2’ye göre aflatoksin analizine tabi

tutulmuşlardır.

3.2.5.2. PFT İçerisinde Değişik Gıda Ürünlerinde F. aurantiacum NRRL B-

184’ün AFB1’in Miktarı Üzerine Etkisinin Belirlenmesi

F. aurantiacum NRRL B-184’ün PFT içerisinde bulunan gıda ürünlerinin

AFB1 içeriklerinin belirlenmesi amacıyla; öncelikle içerisinde öğütülmüş (50 g) ve

bütün halde (50 g) gıda ürünleri içeren 250 ml hacimli alüminyum folyoya sarılı

rodajlı erlenler 121oC’de 15 dk süre ile sterilize edilmiştir. Gıda örneklerinin her biri

için örnekler üzerine; 500, 1000 ve 2000 ng g-1 düzeyinde olacak şekilde AFB1

çözeltisi ilave edilmiştir. Dairesel hareketlerle karıştırma işlemi yapılarak toksinin

örneklerin tüm yüzeyleri ile teması sağlanmaya çalışılmıştır. Daha sonra karanlık ve

serin bir ortamda yaklaşık 2 saat boyunca toksinin örneklere homojen olarak nüfuz

etmesi için beklenilmiştir (Das ve Mishra 2000). Toksin konsantrasyonları ayarlanan

steril kırmızı biber, soya fasulyesi, fındık, incir, mısır ve siyah zeytin besi

ortamlarının kontrol örneği dışındakilerine F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun

durgun faz hücre süspansiyonundan yaklaşık 107 kob ml-1 hücre içerecek şekilde

aşılama yapılmış ve örneklere akışkanlık sağlayacak 1/1 oranında steril PFT çözeltisi

eklenmiştir. Bütün denemeler 3 tekkerrür ve 2 paralel olarak gerçekleştirilmiştir. Bu

işlemler her bir inkübasyon süresi için ayrı ayrı uygulanmıştır.

Erlenmayerler 30oC’deki çalkalamalı su banyosunda 50 rpm’de inkübasyona

alınmış ve inkübasyonun 0, 6, 12, 24, 36, 48 ve 72. saatlerinde aflatoksin analizi için

örnekler alınmış ve bölüm 3.2.6.2’ye göre aflatoksin analizine tabi tutulmuşlardır.


47

3.2.6. Aflatoksin Analizleri

3.2.6.1. Gıda Örneklerinin Aflatoksin İçeriklerinin Kalitatif Olarak

Belirlenmesi

Gıda ürünlerinin denemelerde kullanılmadan önce AFB1 içeriklerinin kalitatif

olarak belirlenmesinde “alternatif metot” yöntemi ile ekstraktlar elde edilmiş

(Anonim, 1998) ve sonra İnce Tabaka Kromatografisi ile aflatoksin analizi

yapılmıştır (Takahashi, 1993; Lin ve ark., 1998). Analiz sonucunda, aflatoksin

içermeyen örnekler denemelerde kullanılmıştır.

3.2.6.2. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile AFB1 Analizi

3.2.6.2.(1). AFB1 Standart Çözeltisinin Hazırlanması

AFB1 kristaleri toluen-asetonitril (98:2, v/v) karışımında çözündürülerek stok

çözelti hazırlanmıştır. AFB1 kalibrasyon standartlarının konsantrasyonları 0.08 ng g-1

ile 4 ng g-1 arasında olacak şekilde hazırlanmıştır. Toluen-asetonitril çözeltileri oda

sıcaklığında azot gazı (N2) altında tamamen kurutulmuştur.

Her şişeye, 4 ml MeOH ilave edilerek karıştırılmış ve ultra saf su ile 10 ml’ye

seyreltilerek yeniden karıştırılmıştır. Çözeltiler; koruyucu giysi, eldiven ve gaz

maskesi kullanılarak çeker ocak altında hazırlanmıştır. Çalışma alanı ve aflatoksinle

temas eden cam malzemeler %5’lik sodyum hipoklorit çözeltisi ile yıkanmıştır. Atık

çözeltiler ise çamaşır suyu içerisinde etkisiz hale getirilmiştir.

3.2.6.2.(2). PBS Çözeltisinin Hazırlanması

900 ml ultra saf su içerisine 0.2 g potasyum klorit, 0.2 g potasyum dihidrojen

fosfat, 1.16 g susuz disodyum hidrojen fosfat ve 8 g sodyum klorit ilave edilerek

çözündürülmüştür. 0.1 M HCl veya 0.1 M NaOH kullanılarak pH 7.4’e ayarlanmış

ve ultra saf su ilavesi ile çözelti hacmi 1000 ml’ye tamamlanmıştır (AOAC, 2000).


48

3.2.6.2.(3). Ekstraksiyon ve Temizleme Aşamaları

AFB1’in gıda örneklerinden ekstrakte edilmesinde ekstraksiyon çözeltisinin

su içeriği örneğin içerisinde bulunduğu fosfat tamponu miktarına göre yeniden

ayarlanarak AOAC (2000) yöntemi kullanılmıştır.

Temizleme aşaması immünoaffinite kolonlar için verilen talimatlara uygun

olarak gerçekleştirilmiştir. 5 ml PBS immünoaffinite kolonundan akış hızı dakikada

3 ml olacak şekilde geçirilmiştir. Kolon 10 ml’lik ultra saf su ile 2 kez yıkandıktan

sonra kalan su vakum ile uzaklaştırılmıştır. 1 ml metanol akış hızı dakikada 1 ml

olacak şekilde kolondan geçirilerek AFB1 kolondan uzaklaştırılmış ve amber renkli

bir şişede toplanmıştır. Kolondan 1 ml ultra saf su geçirilmiş ve aynı şişede

toplanmıştır. Eluat, direkt olarak HPLC’de analiz edilmiştir.

3.2.6.2.(4). AFB1’in Belirlenmesi

AFB1, AOAC 999.07 (2000) metodu kullanılarak belirlenmiştir. 100 µl örnek

HPLC’ye enjekte edilerek AFB1 düzeyi Hewlett Packard HPLC sistemi (Hewlett

Packard, Agilent 1100, Palo Alto, USA) kullanılarak tahrik dalga boyu 360 nm ve

emisyon dalga boyu ise 440 nm olacak şekilde floresans dedektör kullanılarak tespit

edilmiştir. Ayırım, Ace 5 C18 (25cm-4.6mm i.d.) (Advanced Chromatography

Technologies, Aberdeen, Scotland) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Mobil faz, 120

mg L-1 potasyum bromid ve 350 µl nitrik asit ilave edilen asetonitril-metanol-su

(2:3:6, v/v/v) karışımı olup ve akış hızı dakikada 1 ml’dir. Kolon sonrası

türevlendirme Kobra Cell (Rhone Diagnostics, Glasgow, UK) kullanılarak

gerçekleştirilmiştir.

Bazı örneklerin AFB1analizine ait HPLC kromatogramları EK-1’de

verilmiştir.

3.2.6.3. Geri Kazanım Oranının Belirlenmesi

Geri kazanım oranının belirlenmesi için, analizi yapılmış ve aflatoksinsiz

olduğundan emin olunan gıda ürünleri parçalanarak 50’er gramlık analiz örnekleri

hazırlanmıştır. Öğütülen örneklerin üzerine 10 ve 50 ng g-1 aflatoksin olacak şekilde

AFB1 standardından ilave edilmiştir. Örneklere uygulanan ekstraksiyon ve temizleme


49

işlemleri aynen uygulanarak AFB1 içeriği HPLC kullanılarak belirlenmiş ve ilave

edilen aflatoksinin geri kazanım oranı hesaplanarak bulunmuştur.

3.2.7. İstatistiksel Analizler

Üç tekerrürlü olarak yürütülen araştırma bulguları SPSS (10.0) istatistik

yazılım programı kullanılarak değerlendirilmiştir. Faktörlerin etkisini belirlemek

amacıyla varyans analizi uygulanmış ve önemli çıkan gruplar arasındaki farklılıklar

Duncan çoklu karşılaştırma testi ile %95 önem düzeyinde belirlenmiştir.(Watts ve

ark., 1989)

3.2.8. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Eğrisinin

Matematiksel Modellere Uygunluğunun Belirlenmesi

Modifiye Gompertz ve Modifiye Logistik eşitliklerinin gelişme verilerine

uyumu Sigma Plot (10.0) programı kullanılarak doğrusal olmayan regresyon analizi

sonuçlarına göre belirlenmiştir.

3.2.9. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun AFB1 Degradasyon Kinetiğinin

Belirlenmesi

F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun AFB1’i değişik gıda maddelerinde

azaltma kinetiği Sigma Plot (10.0) programı kullanılarak belirlenmiştir.

4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bülent ZORLUGENÇ

50

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA

4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Gelişme Eğrisinin Belirlenmesi

Aktifleştirilmiş F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun TSB besiyerinde ve

30oC’deki gelişimine ait üreme eğrisinin elde edilmesinde yararlanılan kültürel sayım

sonuçları Çizelge 4.1’de verilmiştir.

Çizelge 4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun 30oC’de TSB Besiyerindeki

Gelişimine Ait Kültürel Sayım Sonuçları Süre (Saat) Sayım Sonucu

kob ml-1 Sayım Sonucu Log kob ml-1

0 1.32 x 107 7.12

5 1.60 x 107 7.20

10 4.50 x 107 7.65

15 8.00 x 107 7.90

20 1.40 x 108 8.15

25 3.70 x 108 8.57

30 6.00 x 108 8.78

35 8.50 x 108 8.93

40 1.92 x 109 9.28

45 4.30 x 109 9.63

50 4.45 x 109 9.65

55 4.90 x 109 9.69

70 7.20 x 109 9.86

75 8.40 x 109 9.92

85 4.75 x 109 9.68

90 4.75 x 109 9.68

95 4.70 x 109 9.67

Bir bakterinin gelişme eğrisi; lag (gecikme), log (logaritmik), durgun (sabit)

ve ölüm olmak üzere dört ana faz sergilemektedir. Bakterilerin gelişme eğrileri, üs

cinsinden üreme gösterdikleri dikkate alınarak, çoğunlukla üremenin (log N/No)

zamana karşı grafiğe geçilmesiyle elde edilmektedir (No: İnkübasyonun

başlangıcındaki canlı bakteri sayısı, N: İnkübasyonun belirli bir periyodundaki canlı

bakteri sayısı) (Şahin, 1990).


51

F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun 30oC’de TSB besiyerindeki gelişme

eğrisi Şekil 4.1’de verilmiştir.

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

0 20 40 60 80 100

Süre (Saat)

Log

(N/N

o)

Şekil 4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun 30oC’de TSB besiyerindeki gelişme

eğrisi

4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Eğrisinin Matematiksel

Modellere Uygunluğunun Belirlenmesi

Belirli fiziksel veya kimyasal koşullar altında mikroorganizmaların

gelişimlerinin tanımlanmasında matematiksel modellerden yararlanılmaktadır. Bu

modeller, ürünlerin mikrobiyal güvenliğinin veya raf ömrünün tahmin edilmesi ile

üretimin kritik kısımlarının ve prosesteki dağılımının tespitini mümkün kılmaktadır

(Zwietering ve ark., 1990; Giannuzzi ve ark., 1997). Simülasyon çalışmaları, pahalı

ve zaman alan deneylerin sayısında azalmaya neden olması nedeniyle proses tasarımı

ve optimizasyonunda oldukça yarar sağlamaktadır (Van Impe ve ark., 1992).

F. aurantiacum NRRL B-184 suşuna ait gelişme eğrisini tanımlamada

sigmoidal fonksiyonlardan “Modifiye Gompertz” ve “Modifiye Logistik”

modellerinden yararlanılmış ve elde edilen gelişme eğrileri Şekil 4.2’de verilmiştir.

Zwietering ve ark. (1990) tarafından tanımlanan 3 parametreli Modifiye

Gompertz ve Modifiye Logistik modellerine ait eşitlikler aşağıdaki gibidir.


52

Modifiye Gompertz Model; ( )

+−

⋅−= 1expexp t

Ae

Ay m λµ

( 4.1 )

Modifiye Logistik Model; ( )

+−+

=2

4exp1 t

A

Aym λ

µ ( 4.2 )

Gelişme eğrisi, popülasyon büyüklüğünün (y = LogNt /No) logaritmasının

zamana karşı bir fonksiyonu olarak tanımlanmaktadır. Gelişme eğrisinin lag, log ve

durgun fazı üç parametre ile açıklanmaktadır. Bunlar,

1. Maksimum spesifik gelişme hızı (µm): Bükülme noktasının tanjantı,

2. Lag süresi (λ): Bu tanjantın x eksenini kestiği nokta,

3. Asimptot (A): Ulaşılan en yüksek değer’dir (Zwietering ve ark.,1990).

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Süre (Saat)

Log

(N/N

o)

Deneysel Gompertz Logistic

Şekil 4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun “Modifiye Gompertz” ve “Modifiye

Logistik” modellerinden yararlanılarak elde edilen gelişme eğrileri

Bu eşitliklerin gelişme verilerine uyumunu belirlemede doğrusal olmayan

regresyon analizinden yararlanılmıştır.


53

Deneysel olarak elde edilen gelişme verilerini ifade etmede kullanılacak en

uygun modelin belirlenmesinde “tahminin standart hatası (SEE)”, “kalanların

kareleri toplamı (RSS)”, “hata kareler ortalaması (MSE)” ve “belirtme katsayısı

(R2)” değerlerinden yararlanılmıştır.

Çizelge 4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşuna Ait Gelişme Verilerinin Modifiye Gompertz ve Modifiye Logistik Modellerine Göre Hesaplanan Parametre Değerleri.

Model A µm

(saat-1) λ

(saat) SEE RSS MSE R2

Modifiye Gompertz 2.693 0.073 5.244 0.120 0.201 0.012 0.987

Modifiye Logistik 2.651 0.072 6.393 0.125 0.218 0.013 0.985

Çizelge 4.2’de, her iki modele ait A değeri ile maksimum spesifik gelişme

hızı değerlerinin benzer olduğu, lag süresinin ise Gompertz modelinde 5.244 saat,

Logistik modelinde ise 6.393 saat olduğu görülmektedir. Tahminin standart hatası,

kalanların kareleri toplamı ile hata kareler ortalaması değerlerinin en küçük ve

belirtme katsayısı en büyük olan modelin deneysel verileri daha iyi ifade ettiği göz

önüne alındığında F. aurantiacum NRRL B-184 suşuna ait gelişme eğrisini

tanımlamada Modifiye Gompertz modelinin daha uygun olduğu sonucuna

varılmıştır.

Modifiye Gompertz modelinden elde edilen sonuçlara göre, başlangıç hücre

sayısı 1.32 x 107 kob ml-1 olan F. aurantiacum NRRL B-184 suşu bir saatlik

periyotlar içerisinde bir önceki popülasyonu %7.3 oranında aşacak şekilde gelişerek

45 saatte 2.7 log’luk bir artışla durgun faza geçmiştir. F. aurantiacum NRRL B-184

hücrelerinin 95. saat sonunda hala durgun fazda oldukları belirlenmiştir. Hao ve

Brackett (1989) tarafından yapılan çalışmada F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun

aynı besiyeri ve koşullardaki inkübasyonu sonucunda da benzer bir üreme eğrisi elde

edilmiştir. Araştırıcılar, durgun faza 36. saatten sonra geçildiğini ve ölçümün

sonlandırıldığı 72. saatte de durgun fazda olduğunu ifade etmişlerdir. Aynı bakteri

suşu ile çalışılan başka bir araştırmada ise maksimum spesifik gelişme hızı 0.085

saat-1 olarak bulunmuş ve 45-50 saatlik bir sürede 2 log’luk bir artış göstererek


54

durgun faza ulaşıldığı belirtilmiştir. Ayrıca çalışmada lag süresinin güvenli olarak

tespit edilemediği bildirilmiştir.

4.3. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşunun Hücre Konsantrasyonunun

Belirlenmesi

Mikrobiyolojide spektrofotometrik sayım yöntemi, direkt sayım yöntemleri

arasında yer almakta ve bu yöntemden özellikle saf mikroorganizma kültürlerinin

konsantrasyonu hakkında hızlı bilgi edinebilmek amacıyla yararlanılmaktadır

(Temiz, 1994).

Bu çalışmada, denemelerde kullanılacak olan bakteri süspansiyonunun hücre

yoğunluğunu hesaplayabilmek amacıyla değişik oranlarda seyreltilmiş olan F.

aurantiacum NRRL B-184 hücre süspansiyonlarının hem spektrofotometrede

absorbansları ölçülmüş, hem de bu seyreltilerden kültürel sayımlar yapılmıştır. Farklı

oranlarda seyreltilmiş olan tampon çözelti içerisindeki F. aurantiacum NRRL B-184

hücre süspansiyonlarına ait absorbans değerleri ve kültürel sayım sonuçları Çizelge

4.3’de verilmiştir.

Çizelge 4.3. Farklı Seyreltilerdeki F. aurantiacum NRRL B-184 Bakteri Süspansiyonunun 540 nm’deki Absorbans Değerleri ve İçerdikleri Canlı Hücre Sayısı.

Seyreltme Oranı Absorbans Bakteri Sayısı (kob ml-1)

4/5 0.425 5.40x 107

3/5 0.327 4.80 x 107

2/5 0.267 3.76 x 107

1/5 0.148 1.91 x 107

1/10 0.060 1.16x 107

Çizelge 4.3’de verilmiş olan absorbans değerleri ve canlı hücre sayısı

arasındaki ilişki Şekil 4.3’de görülmektedir.


55

y = 1E+08x + 3E+06R2 = 0,978

0,0E+00

1,0E+07

2,0E+07

3,0E+07

4,0E+07

5,0E+07

6,0E+07

0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400 0,450

Absorbans

kob/

ml

Şekil 4.3. F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri süspansiyonu seyreltilerine ait

absorbans değerleri (540 nm’de) ile canlı hücre sayısı arasındaki ilişki

Çizelge 4.3 ve Şekil 4.3’de görüldüğü gibi, 540 nm’deki absorbans değeri ile

canlı hücre arasındaki ilişkiye ait R2 değeri yüksek (0.978) bulunmuştur. Bu nedenle,

denemelerde kullanılmak üzere hazırlanan bakteri süspansiyonlarının hücre

konsantrasyonu elde edilen;

68 10310 ×+= χy ( 4.3 )

regresyon denklemine göre hesaplanmıştır.

4.4. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde Aflatoksini

Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği

4.4.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde Aflatoksini

Azaltmasının Belirlenmesi

500, 1000 ve 2000 ng ml-1 düzeylerinde aflatoksin içeren PFT çözeltilerinde;

bakteri kültürü aşılanmayan kontrol örnekleri ile bakteri kültürü aşılanmış diğer


56

örneklerin 0-72. saatler arasındaki AFB1 konsantrasyonlarındaki değişim

Çizelge 4.4’de verilmiştir.

Çizelge 4.4. PFT Çözeltilerinin (Kontrol ve F. aurantiacum NRRL B-184 Hücresi

İçeren Diğer Örneklerde) AFB1 Konsantrasyonlarındaki (ng ml-1) Değişim ve % Azalma Oranları

Süre (Saat)

500 1000 2000

Kontrol AFB1 %

Azalma Kontrol AFB1

%

Azalma Kontrol AFB1

%

Azalma

0 502.56 509.80 0.00 1013.30 997.80 0.00 2008.20 2012.40 0.00

2 495.00 401.00 21.34 996.40 800.00 19.82 1995.50 1800.00 10.55

4 490.00 300.00 41.15 990.30 650.00 34.86 1990.70 1377.00 31.57

6 498.50 268.00 47.43 998.50 561.00 43.78 1998.80 1246.00 38.08

8 487.10 239.00 53.12 987.10 500.00 49.89 1987.30 929.00 53.84

12 489.60 173.57 65.95 990.60 345.00 65.42 1990.10 658.59 67.27

24 478.40 64.00 87.45 978.40 157.00 84.27 1978.60 267.00 86.73

36 495.90 31.73 93.78 996.90 69.54 93.03 1996.70 115.00 94.29

48 488.70 15.00 97.06 988.70 34.00 96.59 1988.00 73.00 96.37

72 493.20 2.37 99.53 993.20 5.90 99.41 1993.80 10.11 99.50

Çizelge 4.4’de görüldüğü gibi, F. aurantiacum NRRL B-184 suşu

aşılanmamış üç farklı konsantrasyonda AFB1 içeren kontrol örneklerinin inkübasyon

süresince aflatoksin miktarlarında önemli bir değişim olmazken, F. aurantiacum

NRRL B-184 suşu aşılanmış olan PFT çözeltilerinin aflatoksin içeriğinde sürekli bir

azalma gerçekleşmiştir. Kontrol grubu dışındaki bütün örneklerin AFB1 içeriklerinde

8. saat sonunda %49.89-53.84’lük, 36. saat sonunda %93.03-94.29’luk ve 72. saatin

sonunda ise %99’dan fazla azalma meydana gelmiştir.

F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin PFT çözeltisi içinde AFB1

miktarını azaltması üzerine aflatoksin konsantrasyonunun ve inkübasyon süresinin

etkisi istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.05).

AFB1’in ortamdaki F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerine ait enzim veya

enzim komplekslerinin substratı olduğu düşünüldüğünde, araştırmadan elde edilen

bulgulara göre toksin miktarının enzimler için doygunluk düzeyine ulaşmadığını

söylemek mümkündür. Bu durum yüksek toksin düzeylerinde neden daha çok


57

toksinin degrade olduğunu açıklar niteliktedir. Buna göre, ortama bakterilerin

aşılandığı ilk anda toksin en yüksek düzeyde olduğu için en fazla parçalanma ilk

zaman dilimlerinde olmuştur. Daha sonraki zaman dilimlerinde ise ortamda daha az

toksin kaldığından ve degradasyon da o anda var olan toksin konsantrasyonu ile

orantılı olduğundan daha az azalma meydana gelmektedir.

4.4.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin PFT İçerisinde Aflatoksini

Azaltmasının Kinetiği

F. aurantiacum NRRL B-184 içermeyen kontrol örneklerinin AFB1 içeriğinde

önemli bir değişimin görülmemesi, bakteri hücrelerini içeren PFT ortamında oluşan

aflatoksin azalmasının F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin bir faaliyeti sonucu

meydana geldiğini göstermektedir. Aflatoksinin, canlı F. aurantiacum NRRL B-184

hücreleri tarafından hücre duvarına zayıf bağlarla bağlanıp daha sonra da

biyotransformasyon için hücre içine taşındığı ya da hücre duvarına bağlanmadan

doğrudan hücre içine aktarıldığı konusunda tartışmalar mevcuttur (Özkaya, 2001).

Bu bakteri ile yapılan sınırlı sayıdaki çalışmada aflatoksin degradasyonu

üzerine enzim veya enzim sistemlerinin etkili olabileceği ileri sürülmüştür. İleri

sürülen düşünceye göre; aflatoksin, bu enzim ya da enzim sistemleri tarafından

substrat olarak kullanmaktadır (D’souza ve Brackett, 1998; D’souza ve Brackett,

2000; Smiley and Draugon, 2000; D’souza ve Brackett, 2001).

Enzimatik reaksiyonlar doygunluk kinetiği gösteren reaksiyonlardır. Diğer bir

ifadeyle, bu reaksiyonların hızları belli bir düzeye kadar substrat konsantrasyonu ile

birlikte artar, ancak daha yüksek konsantrasyonlarda reaksiyon hızları daha fazla

artmayarak bir doygunluğa ulaşır ve hız sabit kalır.

Enzimatik reaksiyonlar genel olarak Michealis-Menten denkliği olarak anılan

aşağıdaki eşitliğe uygun olarak gerçekleşir.

[ ][ ]SKSV

Vm +

= max ( 4.4 )


58

Bu eşitlikte V reaksiyon hızını, [S] ise substrat konsantrasyonunu ifade

etmektedir. Michealis-Menten sabiti olarak tanımlanan Km ve maksimum reaksiyon

hızı olan Vmax reaksiyon koşularında sabit değerlerdir.

Bu eşitlik [S]’nin paydada Km’nin yanında ihmal edilmesine imkan verecek

kadar düşük değerleri için;

[ ]SK

VV

m

×

= max ( 4.5 )

şeklinde yaklaşır ve reaksiyon hızının substrat konsantrasyonuna bağlı olarak arttığı

birinci derece kinetiğine uygun hareket eder. Bu küçük değerlerde substrat miktarı ile

enzim hızı arasında doğrusal bir ilişki vardır ve substrat konsantrasyonundaki

artışlar, hızda orantısal artışlara neden olur.

Buna karşılık; eşitlik substrat konsantrasyonunun paydada Km’nin ihmal

edilmesine imkan verecek kadar büyük değerleri için;

maxVV = ( 4.6 )

olarak sabit bir değerde kalarak sıfırıncı dereceden reaksiyon kinetiğine benzerlik

gösterir (Gözükara, 1997; Kalaycıoğlu ve ark., 1998).

Farklı reaksiyon derecelerini tanımlayan çeşitli matematiksel modellerin

tümünün temelini “genel hız yasası” oluşturmaktadır. Bu yasaya göre, bir reaksiyon

sonucu ortamdaki bir bileşiğin miktarının azalması aşağıdaki eşitlikle 4.7

tanımlanmaktadır.

nnCk

dtdCV =−= ( 4.7 )

Eğer reaksiyonun hızı, reaksiyona giren ya da oluşan ürünlerden birinin

konsantrasyonunun sıfırıncı kuvvetine bağlı ise bu tip reaksiyonlara “sıfırıncı

dereceden reaksiyon” denilmektedir. 4.7 no’lu diferansiyel eşitliğin sıfırıncı derece


59

reaksiyon için integrali alınırsa, zamana göre sıfırıncı derece reaksiyonu tanımlayan

4.8 no’lu eşitlik elde edilmektedir.

tkCC to .=− ( 4.8 )

Eğer reaksiyonun hızı, reaksiyona giren ya da oluşan ürünlerden birinin

konsantrasyonunun birinci kuvvetine bağlı ise bu tip reaksiyonlara “birinci dereceden

reaksiyon” denilmektedir. 4.8 no’lu diferansiyel eşitliğin birinci derece reaksiyon

için integrali alınırsa, zamana göre birinci derece reaksiyonu tanımlayan 4.9 no’lu

eşitlik elde edilmektedir.

tkCC to .lnln =− veya ( ) tkCC tO .ln = ( 4.9 )

Bu eşitliklerde Co başlangıç AFB1 konsantrasyonunu, Ct belli bir süre

sonunda AFB1 konsantrasyonunu, k reaksiyon hız sabitini, t ise süreyi ifade

etmektedir (Tebbutt,1995).

AFB1 konsantrasyonunun zamana karşı değişimini değerlendirmede “en

küçük kareler yöntemine” dayanan regresyon analizinden yararlanılmıştır. Verilerin

doğrusal bir eğriye ne kadar iyi uyduğunun ölçütü, regresyon işlemi ile hesaplanmış

olan “belirtme katsayısı” yani R2 değeridir. R2 değerinin 1’e eşit olması, deneysel

verilerin kusursuz bir doğrusal eğri sağladığının kanıtıdır.

Her iki regresyon analizinde de, başlangıç konsantrasyonu (Co), hız sabiti (k),

k’nın güven aralığı, regresyonun önem aralığını gösteren F değeri ve verilerin

modele uygunluğunu gösteren R2 değeri hesaplanmış olup, sonuçlar Çizelge 4.5’te

verilmiştir.


60

Çizelge 4.5. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından PFT Ortamında AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları.

Konsantrasyon

(ng ml-1)

Reaksiyon

Derecesi

C0

(ng ml-1) k*

k için güven

aralığı F Değeri** R2 Değeri***

500 Sıfırıncı 329.893 6.106 7.520-4.746 18.642 0.700

Birinci 6.188 0.093 0.099-0.033 826.944 0.990

1000 Sıfırıncı 673.696 12.343 15.017-9.669 21.309 0.727

Birinci 6.869 0.085 0.089-0.081 1711.361 0.995

2000 Sıfırıncı 1399.511 25.977 31.940-20.014 18.979 0.704

Birinci 7.625 0.091 0.097-0.085 1572.392 0.995 * k zamana bağlı değişim katsayısıdır. k’nın birimi sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği için ng ml-1saat-1 olup konsantrasyon azalmasının saatteki hızını ifade

etmektedir; birinci derece reaksiyon kinetiği için ise k’nın birimi saat-1 olup birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını göstermektedir. ** F değeri regresyon kareler ortalaması / hata kareler ortalaması ile hesaplanmıştır. *** R2 değeri verilerin modele uygunluk oranını göstermektedir.


61

Deneysel olarak elde edilen verilerin modele uygunluğunu gösteren R2 değeri

sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği modelinde AFB1’in her üç konsansantrasyonu için

oldukça düşük bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde ise R2

değerleri 0.990-0.995 arasında değişmiştir. Regresyonun tesadüfilikten uzaklığını

gösteren F değeri, birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre yapılan

değerlendirmede daha yüksek bulunmuştur.

Şekil 4.4, 4.5 ve 4.6’da 500, 1000 ve 2000 ng ml-1 AFB1 içeren PFT

ortamlarında aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış

eğrileri görülmektedir.

y = 486,853e-0,093x

R2 = 0,990

y = -6,106x + 329,893R2 = 0,700

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g m

l-1)

AFB1 Kontrol AFB1 Birinci derece Sıfırıncı derece

Şekil 4.4. 500 ng ml-1 AFB1 içeren PFT ortamında aflatoksinin sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri


62

y = 961,820e-0,085x

R2 = 0,995

y = -12,343x + 673,696R2 = 0,727

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g m

l-1)



y = 2049,465e-0,091x

R2 = 0,995

y = -25,977x + 1399,511R2 = 0,704

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

0 20 40 60 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g m

l-1)




63

R2 ve F değerlerinin birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek

bulunmasının yanısıra şekil 4.4, 4.5 ve 4.6’daki kinetik modellere ait azalış

eğrilerinden de görüldüğü üzere; PFT ortamında F. aurantiacum NRRL B-184

hücrelerinin neden olduğu AFB1 azalışının birinci derece reaksiyon kinetiğine daha

uygun olduğu sonucuna varılmıştır.

Line ve Brackett (1995a) bir çalışmalarında, radyoaktivite ile izledikleri suda

çözünebilir degradasyon ürünlerinin artış hızı ve oranı ile, kloroform fazında

çözünenlerin azalma hızı ve oranının hemen hemen aynı olduğunu ve azalışı tipik

“Birinci Derece Reaksiyon” kinetiğine uygun bulduklarını belirtmişlerdir. Özkaya

(2001)’da PFT içerisinde 8.4x109 ile 6.6x1012 kob ml-1 bakteri içeren denemelerinde

aflatoksin miktarındaki azalışın “Birinci Derece Reaksiyon” kinetiğine uygun

olduğunu bildirmiştir.

Birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını gösteren “k”

değeri birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre yapılan değerlendirmede

istatistiksel olarak güvenli bulunmuş (p<0.05) ve 500, 1000 ve 2000 ng ml-1 AFB1 ile

yapılan denemelerde sırasıyla 0.093, 0.085 ve 0.091 saat-1 olarak hesaplanmıştır.

4.5. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Değişik Gıda Ürünleri İçeren

PFT İçerisinde Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi ve Kinetiği

4.5.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Aflatoksini Azaltmasının

Belirlenmesi ve Kinetiği

4.5.1.1. AFB1’in Değişik Gıda Ürünlerindeki Geri Kazanım Oranları

AFB1’in standart eğrisinin belirtme katsayısı 0.9998 olarak bulunmuştur.

Örnekler yapay olarak AFB1 ile iki farklı konsantrasyonda (10 ve 50 ng g-1)

kontamine edilmiştir. Ortalama geri kazanım (n=12) oranları kuru kırmızı biber için

%87±4.33, mısır için %92±3.52, siyah zeytin için %93±3.66, soya fasulyesi için

%90±3.26 ve fındık için %95±4.12 olarak hesaplanmıştır.


64

4.5.1.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru Kırmızı Biberde

Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi

Bakteri kültürü aşılanmayan kontrol örnekleri ile F. aurantiacum NRRL B-

184 suşu aşılanan öğütülmüş ve bütün halde kırmızı biber içeren PFT çözeltilerine

500, 1000 ve 2000 ng g-1 düzeylerinde AFB1 ilave edilmiştir. Toksin içeriğinin

inkübasyon sırasındaki değişimi ve azalma oranları Çizelge 4.6’da verilmiştir.

İnkübasyon süresince kontrol örneklerinin AFB1 düzeylerinde istatistiksel olarak

önemli bir değişim olmamıştır. F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan

gerek öğütülmüş gerekse bütün haldeki kırmızı biber örneklerinin toksin

içeriklerinde ise sürekli bir azalma görülmüştür. 72 saat sonunda kontrol grubu

dışındaki örneklerdeki azalma, başlangıç aflatoksin miktarı artıkça oransal olarak

azalmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng g-1 aflatoksin içeren öğütülmüş kırmızı biber

örneklerinde 72. saat sonunda sırasıyla %99.17, %98.65 ve %96.52 düzeylerinde

azalma olmuştur. Bütün olarak denemeye alınan örneklerde ise sırasıyla %96.78,

%95.99 ve %95.00 oranında azalma gerçekleşmiştir.

Aflatoksin konsantrasyonunun ve inkübasyon süresinin F. aurantiacum

NRRL B-184 hücrelerinin kırmızı biberde AFB1 miktarının azalması üzerine etkisi

istatistiksel olarak önemli bulunurken (p<0.05), ürün boyutunun etkisi önemli

bulunmamıştır. AFB1 miktarının azalmasında konsantrasyon ve sürenin birlikte ortak

etkisi önemli bulunmuş (p<0.05); ancak konsantrasyon-boyut ve süre-boyut ilişkisi

istatistiksel açıdan önemsizdir.


65

Çizelge 4.6. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün

Kırmızı Biber Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma Oranları

Konsantrasyon

(ng g-1)

Süre

(Saat)

Öğütülmüş Bütün

Kontrol AFB1 %

Azalma Kontrol AFB1

%

Azalma

500

0 447.45 435.11 0.00 453.60 440.53 0.00

6 452.21 358.08 17.70 468.12 398.25 9.60

12 435.54 209.36 51.88 442.52 259.11 41.18

24 424.67 82.44 81.05 439.76 168.34 61.79

36 448.02 39.23 90.98 454.67 93.41 78.80

48 452.71 21.42 95.08 461.10 43.04 90.23

72 441.80 3.62 99.17 460.00 14.18 96.78

1000

0 923.40 870.22 0.00 949.80 881.78 0.00

6 914.60 796.12 8.52 902.50 817.88 7.25

12 890.30 469.28 46.07 915.34 512.11 41.92

24 896.45 290.37 66.63 894.12 352.02 60.08

36 873.12 101.39 88.35 871.30 177.33 79.89

48 906.87 53.40 93.86 894.50 112.44 87.25

72 893.60 11.79 98.65 886.50 35.37 95.99

2000

0 1823.54 1740.36 0.00 1816.43 1752.36 0.00

6 1891.34 1622.20 6.79 1795.45 1634.36 6.73

12 1787.45 983.23 43.50 1792.01 1226.80 29.99

24 1874.07 658.39 62.17 1804.23 752.40 57.06

36 1873.21 348.27 79.99 1827.34 456.34 73.96

48 1836.87 193.22 88.90 1814.50 239.41 86.34

72 1833.60 60.54 96.52 1792.78 87.59 95.00

F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin, kırmızı biberlerin AFB1 içeriklerini

azaltma yeteneğine sahip olduğu görülmüştür. Benzer bulgular, F. aurantiacum

NRRL B-184’ün kırmızı biberdeki aflatoksini azaltma yeteneği üzerine Özkaya

(2001)’nın çalışmasında da mevcuttur. Araştırmacı, yaklaşık 300, 500 ve 1500 ng g-1

doğal AFB1 içeren steril bulamaç halindeki kırmızı biber örneklerinde 48 saat

sonunda sırasıyla %92.8, %99.9 ve %98.3’lük bir azalma meydana geldiğini ifade

etmiştir. Bu çalışmada elde edilen azalma oranlarının Özkaya (2001)’nın yapmış


66

olduğu çalışmadan elde edilen oranlardan daha düşük bulunmasına örneğe aşılanan

F. aurantiacum NRRL B-184 hücre sayılarındaki farklılığın neden olabileceği

düşünülmektedir.

4.5.1.3. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kırmızı Biberde Aflatoksini


Öğütülmüş ve bütün haldeki kırmızı biberlerde AFB1’in azalma kinetiğini

inceleyebilmek amacıyla regresyon analizleri yapılmıştır. Regresyon analizlerinde,

Co, k, k’nın güven aralığı, F ve R2 değerleri hesaplanmış olup sonuçlar Çizelge

4.7’de verilmiştir.


67

Çizelge 4.7. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Kırmızı Biberde AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi

Sonuçları.

Ürün Konsantrasyon

(ng g-1)

Reaksiyon

Derecesi

C0

(ng g-1) k*

k için güven


Öğü

tülm

üş

500 Sıfırıncı 330.524 5.881 7.397-4.365 15.054 0.751

Birinci 6.124 0.062 0.068-0.056 305.595 0.984

1000 Sıfırıncı 721.431 12.411 15.095-9.727 21.389 0.811

Birinci 6.835 0.051 0.058-0.044 177.281 0.973

2000 Sıfırıncı 1483.513 24.133 28.852-19.414 26.157 0.840

Birinci 7.517 0.044 0.049-0.039 200.812 0.976

Büt

ün

500 Sıfırıncı 375.366 6.115 7.238-4.992 29.638 0.856

Birinci 6.137 0.044 0.048-0.040 306.735 0.984

1000 Sıfırıncı 756.539 12.156 14.449-9.863 28.092 0.849

Birinci 6.834 0.043 0.048-0.038 224.827 0.978

2000 Sıfırıncı 1575.835 24.655 28.491-20.819 41.312 0.892

Birinci 7.533 0.038 0.041-0.035 314.040 0.984

* k zamana bağlı değişim katsayısıdır. k’nın birimi sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği için ng g-1saat-1 olup konsantrasyon azalmasının saatteki hızını ifade etmektedir; birinci derece reaksiyon kinetiği için ise k’nın birimi saat-1 olup birim zamanda konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını göstermektedir.

** F değeri regresyon kareler ortalaması / hata kareler ortalaması ile hesaplanmıştır. *** R2 değeri verilerin modele uygunluk oranını göstermektedir


68

Sıfırıncı derece reaksiyon kinetiği modeline göre, üç farklı konsantrasyonda

AFB1 içeren öğütülmüş ve bütün kırmızı biberlere ait R2 değerleri oldukça düşük

bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinde ise R2 değerleri öğütülmüş

kırmızı biberlerde 0.973-0.984, bütün haldeki biberlerde ise 0.978-0.984 arasında

değişmiştir. Regresyonun tesadüfilikten uzaklığını gösteren F değeri birinci derece

reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek bulunmuştur.

Şekil 4.7, 4.8, 4.9’da öğütülmüş, Şekil 4.10, 4.11 ve 4.12’de ise bütün kırmızı

biberlerdeki AFB1’in sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri

görülmektedir.

y = 456,821e-0,062x

R2 = 0,984

y = -5,881x + 330,524R2 = 0,751

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.7. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve

birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri


69

y = 929,393e-0,051x

R2 = 0,973

y = -12,411x + 721,431R2 = 0,811

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)




y = 1839,425e-0,044x

R2 = 0,976

y = -24,133x + 1483,513R2 = 0,840

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)





70

y = 462,734e-0,044x

R2 = 0,984

y = -6,115x + 375,366R2 = 0,856

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.10. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün kırmızı biberde aflatoksinin sıfırıncı ve


y = 929,242e-0,043x

R2 = 0,978

y = -12,156x + 756,539R2 = 0,849

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)





71

y = 1869,142e-0,038x

R2 = 0,984

y = -24,655x + 1575,835R2 = 0,892

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)




Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre R2 ve F değerleri daha

yüksek bulunmuş olup şekillerdeki (Şekil 4.7, 4.8, 4.9, 4.10, 4.11 ve 4.12) kinetik

modellere ait azalış eğrilerinden de görüldüğü üzere, kırmızı biber ortamında izlenen

F. aurantiacum NRRL B-184 suşu tarafından AFB1 azalışının birinci derece

reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır.

“k” değeri birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre yapılan

değerlendirmede istatistiksel olarak güvenli bulunmuş ve 500, 1000 ve 2000 ng g-1

AFB1 içeren öğütülmüş kırmızı biber kullanılan ortamlar için sırasıyla 0.062, 0.051

ve 0.044 saat-1; bütün kırmızı biber kullanılan ortamlar için ise 0.044, 0.043 ve 0.038

saat-1 olarak hesaplanmıştır.

72 saatlik inkübasyon sonunda yalnızca 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş

kırmızı biber örneğinde Türk Gıda Kodeksinde bu ürün için verilmiş olan limite

ulaşılmıştır. Bu süre sonunda, 500 ve 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kırmızı

biberler ile 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün haldeki kırmızı biber örneklerinin toksin

içerikleri Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkındaki Tebliğ’de (Resmi Gazete,

2008) hayvan yemleri için belirtilen sınırlara ulaşmıştır.


72

Birinci derece reaksiyon kinetiği modelinin parametrelerinden yararlanılarak

107 kob ml-1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda kırmızı

biberlerin AFB1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen Maddeler

Hakkındaki Tebliğ’de izin verilmiş olan değerlere düşürülebilmesi için gerekli olan

süreler hesaplanmış ve Çizelge 4.8’de verilmiştir.

Çizelge 4.8. Kırmızı Biberlerin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin Altına İnme Süreleri

Ürün Tüketim

Amacı

Kabul

Edilebilir

ng g-1

Süre (Saat)

500 ng g-1

AFB1 İçin)

1000 ng g-1

AFB1 İçin)

2000 ng g-1

AFB1 İçin)

Öğü

tülm

üş K

ırmız

ı

Bib

er

k=0.062 k=0.051 k=0.044

İnsan

Tüketimi İçin

2 87,60 120,42 155,09

5 72,82 102,45 134,27

Hayvan Yemi İçin

5 72,82 102,45 134,27

10 61,64 88,86 118,51

20 50,46 75,27 102,76

Büt

ün K

ırmız

ı Bib

er k=0.044 k=0.043 k=0.038

İnsan

Tüketimi İçin

2 123,73 142,81 180,00

5 102,90 121,50 155,88

Hayvan Yemi

İçin

5 102,90 121,50 155,88

10 87,15 105,38 137,64

20 71,40 89,26 119,40

Çizelge 4.8’de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren kırmızı

biberde aflatoksin seviyesinin 2 ng g-1’a düşebilmesi için gereken süre, öğütülmüş

kırmızı biberlerde 87.60 ile 155.09 saat; bütün kırmızı biber örneklerinde ise 123.73

ile 180.00 saat arasında değişmektedir.

Kırmızı biberlerin hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan

inkübasyon sürelerinin 50.46 ile 155.88 saat arasında olacağı hesaplanmıştır


73

4.5.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Mısırda Aflatoksini




Bakteri kültürü aşılanmayan kontrol örnekleri ile bakteri kültürü aşılanan

öğütülmüş ve bütün halde mısır içeren PFT çözeltilerine 500, 1000 ve 2000 ng g-1

düzeylerinde AFB1 ilave edilmiştir. Toksin içeriğinin inkübasyon sırasındaki

değişimi ve % azalma oranları Çizelge 4.9’da verilmiştir.

İnkübasyon süresince kontrol örneklerinin AFB1 düzeylerinde önemli bir

değişim olmazken, F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan gerek

öğütülmüş gerekse bütün haldeki mısır örneklerinin toksin içeriklerinde sürekli bir

azalma görülmüştür. 72 saat sonunda kontrol grubu dışındaki örneklerdeki azalma,

başlangıç aflatoksin miktarı artıkça oransal olarak azalmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng

g-1 aflatoksin içeren öğütülmüş mısır örneklerinde 72. saat sonunda sırasıyla %97.44,

%96.09 ve %95.96 düzeylerinde azalma olmuştur. Bütün olarak denemeye alınan

örneklerde ise sırasıyla %95.25, %94.01 ve 94.15 oranında azalma gerçekleşmiştir.


NRRL B-184 hücrelerinin mısırda AFB1 miktarının azalması üzerine etkisi




istatistiksel açıdan önemsiz (p>0.05) bulunmuştur.


74

Çizelge 4.9. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Mısır Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma Oranları

Konsantrasyon

(ng g-1)

Süre

(Saat)

Uygulama


Kontrol AFB1 %

Azalma Kontrol AFB1

%

Azalma

500

0 498.03 460.34 0.00 504.61 468.90 0.00

6 470.43 363.64 21.01 489.12 391.25 16.56

12 481.87 242.87 47.24 471.62 284.03 39.43

24 502.15 138.33 69.95 465.91 168.69 64.02

36 493.38 76.98 83.28 474.43 102.04 78.24

48 467.21 45.80 90.05 484.03 59.02 87.41

72 485.04 11.80 97.44 491.54 22.26 95.25

1000

0 917.67 920.30 0.00 935.67 925.52 0.00

6 945.29 736.08 20.02 912.32 783.70 15.32

12 915.98 463.60 49.63 937.82 522.99 43.49

24 947.56 278.46 69.74 948.04 326.60 64.71

36 938.04 150.55 83.64 917.23 185.92 79.91

48 972.19 87.83 90.46 928.19 126.54 86.33

72 928.39 36.02 96.09 948.61 55.41 94.01

2000

0 1914.28 1840.41 0.00 1895.78 1853.00 0.00

6 1894.24 1614.87 12.25 1917.46 1699.98 8.26

12 1828.78 1031.09 43.97 1873.05 1234.13 33.40

24 1882.37 678.82 63.12 1848.41 761.23 58.92

36 1872.04 318.40 82.70 1819.72 393.91 78.74

48 1903.03 195.85 89.36 1857.06 253.16 86.34

72 1893.36 74.34 95.96 1861.93 108.44 94.15

F. aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin, mısır örneklerinin AFB1

içeriklerini azaltma yeteneğine sahip olduğu görülmüştür. Ciegler ve ark. (1966)’da

F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun mısırdaki aflatoksinin uzaklaştırılmasında

etkili olduğunu bildirmişlerdir. Araştırıcılar, toksijenik bir A. flavus suşu geliştireerek

aflatoksin oluşumu sağlanan mısırda 1013 kob ml-1 canlı F. aurantiacum


75

NRRL B-184 hücresi ile 28oC’de 12 saatlik inkübasyon sonunda 16 ng g-1

düzeyindeki AFB1’in %100 oranında ortamdan uzaklaştığını belirtmişlerdir.



Öğütülmüş ve bütün haldeki mısırda AFB1’in azalmasıyla ilgili kinetiği

inceleyebilmek amacıyla regresyon analizleri yapılmıştır. Regresyon analizleri

sonucunda elde edilen sıfırıncı ve birinci derece reaksiyon kinetiğine ait regresyon

verileri (Co, k, k’nın güven aralığı, F ve R2) Çizelge 4.10’da verilmiştir.


76

Çizelge 4.10. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Mısırda AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları


(ng g-1) Reaksiyon

Derecesi C0

(ng g-1) k*

k için güven aralığı

F Değeri** R2 Değeri*** Ö

ğütü

lmüş

500 Sıfırıncı 361.281 6.006 7.279-4.733 22.274 0.817

Birinci 6.146 0.050 0.052-0.050 1565.949 0.997

1000 Sıfırıncı 717.229 11.857 14.508-9.206 20.003 0.800

Birinci 6.839 0.051 0.054-0.048 751.977 0.993

2000 Sıfırıncı 1526.917 24.922 29.899-19.945 25.081 0.834

Birinci 7.557 0.046 0.050-0.042 352.451 0.986

Büt

ün

500 Sıfırıncı 388.989 6.196 7.333-5.059 29.711 0.856

Birinci 6.173 0.043 0.045-0.041 1611.221 0.997

1000 Sıfırıncı 757.074 11.984 14.402-9.566 24.555 0.831

Birinci 6.852 0.044 0.047-0.041 630.023 0.992

2000 Sıfırıncı 1624.955 25.610 30.096-21.124 32.595 0.867

Birinci 7.583 0.040 0.043-0.037 340.862 0.986




77

Üç farklı konsantrasyonda AFB1 içeren öğütülmüş ve bütün haldeki

mısırların; sıfırıncı derece reaksiyon kinetiğine göre yapılan regresyon analizi sonucu

elde edilen R2 ve F değerleri, birinci derece reaksiyon kinetiğine göre daha düşük

bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon kinetiğine göre; hem öğütülmüş hem de bütün

haldeki mısırların R2 değerleri 0.986-0.997 arasında değişmiştir.

Şekil 4.13, 4.14, 4.15’de öğütülmüş mısırda, Şekil 4.16, 4.17 ve 4.18’de ise

bütün mısırdaki AFB1’in sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış

eğrileri görülmektedir.

y = 466,640e-0,050x

R2 = 0,997

y = -6,006x + 361,281R2 = 0,817

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.13. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci

derece kinetik modellere göre azalış eğrileri


78

y = 933,641e-0,051x

R2 = 0,993

y = -11,857x + 717,229R2 = 0,800

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.14. 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve


y = 1915,026e-0,046x

R2 = 0,986

y = -24,922x + 1526,917R2 = 0,834

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.15. 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve



79

y = 479,777e-0,043x

R2 = 0,997

y = -6,196x + 388,989R2 = 0,856

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.16. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün mısırda aflatoksinin sıfırıncı ve birinci


y = 945,673e-0,044x

R2 = 0,992

y = -11,984x + 757,074R2 = 0,831

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)





80

y = 1963,647e-0,040x

R2 = 0,986

y = -25,610x + 1624,955R2 = 0,867

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)





bulunması sonucu F. aurantiacum NRRL B-184 suşu tarafından mısır ortamındaki

AFB1 azalışının birinci derece reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu sonucuna

varılmıştır. Şekillerdeki (Şekil 4.13, 4.14, 4.15, 4.16, 4.17 ve 4.18) kinetik modellere

ait azalış eğrileri de incelendiğinde deneysel verilerin birinci derece reaksiyon

kinetiğine uyumu daha net görülebilmektedir.

500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş mısır kullanılan ortamlarda

“k”değeri sırasıyla 0.050, 0.051 ve 0.046 saat-1; bütün mısırlarda ise 0.043, 0.044 ve

0.040 saat-1 olarak hesaplanmıştır. Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre

yapılan değerlendirmede çalışılan tüm mısır örneklerine ait “k” değerleri istatistiksel

olarak güvenli (p<0.05) bulunmuştur.

Denemeye alınan mısır örneklerinin AFB1 düzeyleri, 72 saatlik inkübasyon

sonunda Türk Gıda Kodeksinde bu ürünün insan tüketimi için izin verilen sınır

değere ulaşamamıştır. Bu süre sonunda 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş mısır

örneklerninin toksin içerikleri Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkındaki Tebliğ’de

(Resmi gazete, 2008) hayvan yemleri için belirtilen sınırlara ulaşmıştır.


81


107 kob ml-1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda

mısırların AFB1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen Maddeler



Çizelge 4.11. Mısır Örneklerinin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin

Altına İnme Süreleri

Ürün Tüketim

Amacı

Kabul Edilebilir

Limit

(ng g-1)

Süre (Saat)

500 ng g-1

AFB1 İçin

1000 ng g-1

AFB1 İçin

2000 ng g-1

AFB1 İçin

Öğü

tülm

üş M

ısır

k=0.050 k=0.051 k=0.046

İnsan Tüketimi İçin

2 109,06 120,51 149,21

5 90,73 102,54 129,29

Hayvan Yemi

İçin

5 90,73 102,54 129,29

10 76,87 88,95 114,23

20 63,01 75,36 99,16

Büt

ün M

ısır

k=0.043 k=0.044 k=0.040

İnsan

Tüketimi İçin

2 127,44 139,97 172,25

5 106,13 119,15 149,34

Hayvan Yemi

İçin

5 106,13 119,15 149,34

10 90,01 103,40 132,01

20 73,89 87,64 114,68

Çizelge 4.11’de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren

mısırların aflatoksin içeriklerinin 2 ng g-1’a düşebilmesi için gereken süre, öğütülmüş

mısırlarda 109.06 ile 149.21 saat; bütün mısır örneklerinde ise 127.44 ile 172.25 saat

arasında değişmektedir.

Mısırların hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan inkübasyon

sürelerinin 63.01 ile 149.34 saat arasında olacağı belirlenmiştir.


82

4.5.3. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde Aflatoksini


4.5.3.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde Aflatoksini



öğütülmüş ve bütün halde siyah zeytin içeren PFT çözeltilerine 500, 1000 ve 2000 ng

g-1 düzeylerinde AFB1 ilave edilmiştir. Toksin içeriğinin inkübasyon sırasındaki

değişimi ve % azalma oranları Çizelge 4.12’de verilmiştir.

Kontrol örneklerinin AFB1 düzeylerinde inkübasyon süresince önemli bir

değişim görülmemiştir. F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan gerek

öğütülmüş gerekse bütün haldeki zeytin örneklerinin toksin içeriklerinde ise sürekli

bir azalma görülmüştür. 72 saat sonunda kontrol grubu dışındaki örneklerdeki azalma

oranı, başlangıç aflatoksin miktarının artmasıyla oransal olarak azalmıştır. 500, 1000

ve 2000 ng g-1 aflatoksin içeren öğütülmüş zeytin örneklerinde 72. saat sonunda

sırasıyla %98.69, %98.14 ve %99.14 düzeylerinde azalma olmuştur. Bütün olarak

denemeye alınan örneklerde ise sırasıyla %98.06, %95.63 ve %96.01 oranında

azalma gerçekleşmiştir.

AFB1 miktarının azalması üzerine aflatoksin konsantrasyonu ile inkübasyon

süresinin etkisi istatistiksel olarak önemli bulunurken (p<0.05), ürün boyutunun

etkisi önemli bulunmamıştır. Konsantrasyon ve sürenin birlikte ortak etkisi toksin

miktarının azalmasında önemli (p<0.05) olup konsantrasyon-boyut ve süre-boyut

ilişkisi istatistiksel açıdan önemsiz (p>0.05) bulunmuştur.


83

Çizelge 4.12. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Siyah Zeytin Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma Oranları

Konsantrasyon

(ng g-1)

Süre

(Saat)

Uygulama


Kontrol AFB1 %

Azalma Kontrol AFB1

%

Azalma

500

0 478.41 465.08 0.00 484.21 471.66 0.00

6 458.02 377.33 18.87 472.33 391.77 16.94

12 463.91 218.10 53.10 477.38 228.08 51.64

24 492.52 123.11 73.53 489.81 124.17 73.67

36 471.21 73.97 84.10 463.06 88.68 81.20

48 482.04 32.16 93.09 491.54 40.79 91.35

72 457.22 6.08 98.69 472.08 9.13 98.06

1000

0 938.76 930.25 0.00 956.81 937.82 0.00

6 945.92 771.51 17.06 961.42 791.62 15.59

12 921.51 437.19 53.00 928.19 451.53 51.85

24 942.89 270.61 70.91 951.21 308.54 67.10

36 967.31 184.87 80.13 948.03 206.50 77.98

48 929.58 71.69 92.29 939.12 106.06 88.69

72 928.54 17.31 98.14 943.05 41.02 95.63

2000

0 1893.89 1860.37 0.00 1954.17 1874.55 0.00

6 1867.42 1569.97 15.61 1871.37 1607.26 14.26

12 1902.03 911.61 51.00 1909.21 966.14 48.46

24 1851.34 558.44 69.98 1894.87 630.03 66.39

36 1866.47 356.63 80.83 1890.07 473.78 74.73

48 1913.21 144.94 92.21 1882.19 197.42 89.47

72 1873.67 15.97 99.14 1902.03 74.84 96.01

Zeytin üzerine yapılan çalışma sonucunda F. aurantiacum NRRL B-184

hücrelerinin ürüne aşılanan AFB1’in miktarını azaltma yeteneğine sahip olduğunu

göstermektedir. Zeytinle ilgili benzeri bir çalışma olmaması nedeniyle herhangi bir

karşılaştırma yapmak mümkün olmamıştır.


84

4.5.3.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Siyah Zeytinde Aflatoksini

Azaltma Kinetiği

Öğütülmüş ve bütün haldeki siyah zeytinlerde AFB1’in azalma kinetiğinin

sıfırıncı ve birinci derece reaksiyon kinetiklerine uygunluğunu belirleyebilmek için

regresyon analizleri yapılmıştır. Regresyon analizleri sonucu elde edilen Co, k, k’nın

güven aralığı, F ve R2 değeri Çizelge 4.13’te verilmiştir.

Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre, üç farklı konsantrasyonda

AFB1 içeren öğütülmüş ve bütün zeytinlere ait R2 değerleri, sıfırıncı derece reaksiyon

kinetiği verilerine göre daha yüksek bulunmuştur. Birinci derece reaksiyon

kinetiğinde R2 değerlerinin öğütülmüş zeytinlerde 0.983-0.988, bütün haldeki

zeytinlerde ise 0.979-0.985 arasında değiştiği görülmüştür. Regresyonun

tesadüfilikten uzaklığını gösteren ve kinetik modelinin deneysel verilere

uygunluğunun belirlenmesinde yararlanılan F değeri de birinci derece reaksiyon

kinetiği modelinde daha yüksek bulunmuştur.

Şekil 4.19, 4.20, 4.21’de öğütülmüş zeytinlerde, Şekil 4.22, 4.23 ve 4.24’te

ise bütün haldeki zeytinlerde AFB1’in sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere

göre azalış eğrileri görülmektedir.


85

Çizelge 4.13. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Siyah Zeytinde AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları


(ng g-1) Reaksiyon

Derecesi C0

(ng g-1) k*



ğütü

lmüş

500 Sıfırıncı 358.687 6.136 7.556-4.716 18.668 0.788

Birinci 6.157 0.055 0.060-0.050 417.345 0.988

1000 Sıfırıncı 729.359 12.233 14.959-9.507 20.134 0.801

Birinci 6.856 0.052 0.057-0.047 280.007 0.983

2000 Sıfırıncı 1481.542 25.015 30.341-19.689 22.060 0.815

Birinci 7.557 0.051 0.056-0.046 305.130 0.984

Büt

ün

500 Sıfırıncı 368.890 6.202 7.618-4.786 19.194 0.793

Birinci 6.182 0.053 0.058-0.048 319.965 0.985

1000 Sıfırıncı 746.262 12.024 14.657-9.391 20.857 0.807

Birinci 6.857 0.047 0.052-0.042 233.356 0.979

2000 Sıfırıncı 1524.586 24.485 29.469-19.501 24.138 0.828

Birinci 7.555 0.045 0.050-0.040 253.578 0.981




86

y = 476,678e-0,055x

R2 = 0,988

y = -6,136x + 358,687R2 = 0,788

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.19. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve


y = 949,854e-0,052x

R2 = 0,983

y = -12,233x + 729,359R2 = 0,801

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.20. 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı

ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri


87

y = 1913,998e-0,051x

R2 = 0,984

y = -25,015x + 1481,542R2 = 0,815

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.21. 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı


y = 484,068e-0,053x

R2 = 0,985

y = -6,202x + 368,890R2 = 0,793

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.22. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün siyah zeytinde aflatoksinin sıfırıncı ve



88

y = 950,532e-0,047x

R2 = 0,979

y = -12,024x + 746,262R2 = 0,807

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)




y = 1909,609e-0,045x

R2 = 0,981

y = -24,485x + 1524,586R2 = 0,828

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)





89


bulunmasının yanısıra şekillerdeki (Şekil 4.19, 4.20, 4.21, 4.22, 4.23 ve 4.24) kinetik

modellere ait azalış eğrilerinden de görüldüğü üzere zeytin örneklerinde AFB1

azalışının birinci derece reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu sonucuna

varılmıştır.


değerlendirmede istatistiksel olarak güvenli (p<0.05) bulunmuştur. 500, 1000 ve

2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş zeytin ortamında toksinin azalma hızı sırasıyla

0.055, 0.052 ve 0.051 saat-1; bütün haldeki zeytinlerde ise 0.053, 0.047 ve 0.045

saat-1 olarak hesaplanmıştır.

Denemeye alınan zeytin örneklerinin AFB1 düzeyleri 72 saatlik inkübasyon

sonunda Türk Gıda Kodeksinde bu ürünün insan tüketimi için izin verilen düzeye

ulaşmadığı belirlenmiştir. Bu süre sonunda, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün

haldeki zeytinler haricindeki diğer örneklerin toksin içerikleri Yemlerde İstenmeyen

Maddeler Hakkındaki Tebliğ’de (Resmi gazete, 2008) hayvan yemleri için belirtilen

sınırlara ulaşmıştır.



zeytinlerin AFB1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen Maddeler




90

Çizelge 4.14. Siyah Zeytin Örneklerinin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir

Limitlerin Altına İnme Süreleri

Ürün Tüketim

Amacı

Kabul

Edilebilir

Limit (ng g-1)

Süre (Saat)

500 ng g-1

AFB1 İçin

1000 ng g-1

AFB1 İçin

2000 ng g-1

AFB1 İçin

Öğü

tülm

üş Z

eytin

k=0.055 k=0.052 k=0.051

İnsan

Tüketimi İçin

2 99,34 118,52 134,59

5 82,68 100,90 116,62

Hayvan Yemi

İçin

5 82,68 100,90 116,62

10 70,08 87,57 103,03

20 57,48 74,24 89,44

Büt

ün Z

eytin

k=0.053 k=0.047 k=0.045


2 103,56 131,15 152,49

5 86,27 111,65 132,12

Hayvan Yemi

İçin

5 86,27 111,65 132,12

10 73,20 96,90 116,72

20 60,12 82,15 101,32

Çizelge 4.14’de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren siyah

zeytinlerin aflatoksin seviyelerinin 2 ng g-1’a düşebilmesi için gereken süre,

öğütülmüş zeytinlerde 99.34 ile 134.59 saat; bütün haldeki zeytin örneklerinde ise

103.56 ile 152.49 saat arasında değişmektedir.

Zeytinlerin hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan inkübasyon

sürelerinin 57.48 ile 132.12 saat arasında değiştiği tespit edilmiştir.

4.5.4. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Soya Fasulyesinde Aflatoksini



Aflatoksini Azaltmasının Belirlenmesi

Kontrol örnekleri ile bakteri kültürü aşılanan öğütülmüş ve bütün halde soya

fasulyesi içeren PFT çözeltilerine 500, 1000 ve 2000 ng g-1 düzeylerinde AFB1 ilave


91

edilmiştir. İnkübasyon sırasındaki aflatoksin içeriğindeki değişim ve % azalma

oranları Çizelge 4.15’de verilmiştir.

Çizelge 4.15. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Soya Fasulyesi Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma Oranları

Konsantrasyon (ng g-1)

Süre (Saat)


Kontrol AFB1 %

Azalma Kontrol AFB1

%

Azalma

500

0 482.18 470.41 0.00 486.60 477.23 0.00

6 494.64 392.22 16.62 492.20 407.80 14.55

12 477.08 301.24 35.96 473.00 329.30 31.00

24 468.31 225.91 51.98 468.20 245.57 48.54

36 487.34 167.30 64.44 486.10 180.08 62.27

48 461.90 113.81 75.81 494.20 133.12 72.11

72 467.80 45.56 90.31 488.10 68.47 85.65

1000

0 966.24 940.23 0.00 981.34 950.44 0.00

6 964.70 793.12 15.65 985.60 821.30 13.59

12 969.10 637.55 32.19 978.20 677.29 28.74

24 951.30 463.70 50.68 968.19 523.66 44.90

36 971.30 368.61 60.80 943.50 374.41 60.61

48 956.56 253.10 73.08 958.57 285.43 69.97

72 932.67 130.73 86.10 946.78 149.37 84.28

2000

0 1912.56 1880.05 0.00 1958.45 1893.65 0.00

6 1909.43 1615.59 14.07 1925.14 1715.31 9.42

12 1877.89 1241.82 33.95 1882.03 1441.82 23.86

24 1893.90 958.70 49.01 1911.93 948.40 49.92

36 1889.60 688.70 63.37 1904.67 698.10 63.13

48 1876.65 478.19 74.57 1876.72 505.83 73.29

72 1922.76 238.01 87.34 1882.14 285.80 84.91

İnkübasyon süresince, F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan

gerek öğütülmüş gerekse bütün haldeki soya fasulyesi örneklerinin AFB1

içeriklerinde sürekli bir azalma görülmüştür. Kontrol örneklerinin aflatoksin

düzeylerinde ise önemli bir değişim belirlenmemiştir. 72 saat sonunda kontrol grubu


92

dışındaki örneklerdeki azalma, başlangıç aflatoksin miktarı artıkça oransal olarak

azalmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng g-1 aflatoksin içeren öğütülmüş soya fasulyesi

örneklerinde 72. saat sonunda sırasıyla %90.31, %86.10 ve %87.34 düzeylerinde

azalma olmuştur. Bütün olarak denemeye alınan örneklerde ise sırasıyla %85.65,

%84.28 ve %84.91 oranında azalma gerçekleşmiştir.


NRRL B-184 hücrelerinin soya fasulyesinde AFB1 miktarının azalması üzerine etkisi


bulunmamıştır. AFB1 miktarının azalmasında konsantrasyon ve sürenin birlikteki

etkisi önemli (p<0.05), konsantrasyon-boyut ve süre-boyut ilişkileri ise istatistiksel

açıdan önemsiz bulunmuştur.

Bu çalışmada, soya fasulyesinin AFB1 miktarının azaltılması üzerine F.

aurantiacum NRRL B-184 hücrelerinin etkili olduğu görülmüştür. Ciegler ve ark.

(1966)’nın yaptıkları çalışmada da aynı bakterinin soya fasulyesindeki aflatoksini

azaltma yeteneğine sahip olduğu belirtilmiştir. Araştırıcı, toksijenik bir A. flavus suşu

geliştirilerek aflatoksin oluşumu sağlanan soya fasulyesinde; 1013 kob ml-1 canlı F.

aurantiacum NRRL B-184 hücresi ile 28oC de 12 saatlik inkübasyon sonunda 8 mg

g-1 düzeyindeki AFB1’in 2 mg g-1’a düştüğünü, inkübasyon süresi uzatıldığında soya

fasulyesinde kalan aflatoksinin de giderildiğini bildirmişlerdir.


Aflatoksini Azaltma Kinetiği

Öğütülmüş ve bütün haldeki soya fasulyesinin AFB1 içeriğindeki azalmanın

kaçıncı dereceden reaksiyon kinetiğine uyduğunu belirleyebilmek amacıyla

regresyon analizleri yapılmıştır. Yapılan regresyon analizleri ile Co, k, k’nın güven

aralığı, F ve R2 değeri hesaplanmış olup sonuçlar Çizelge 4.16’da verilmiştir.


93

Çizelge 4.16. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Soya Fasulyesinde AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları


(ng ml-1) Reaksiyon Derecesi

C0 (ng g-1)

k* k için güven


Öğü

tülm

üş

500 Sıfırıncı 406.007 5.685 6.457-4.913 54.299 0.916

Birinci 6.141 0.030 0.031-0.029 943.536 0.995

1000 Sıfırıncı 821.846 10.939 12.481-9.477 56.009 0.918

Birinci 6.832 0.028 0.029-0.027 1333.065 0.996

2000 Sıfırıncı 1648.957 22.433 25.453-19.413 55.191 0.917

Birinci 7.534 0.029 0.030-0.028 1108.662 0.996

Büt

ün

500 Sıfırıncı 421.013 5.583 6.307-4.859 59.406 0.922

Birinci 6.161 0.027 0.028-0.026 2911.651 0.998

1000 Sıfırıncı 852.009 11.021 12.316-9.726 72.439 0.935

Birinci 6.854 0.026 0.027-0.025 3893.854 0.999

2000 Sıfırıncı 1726.720 23.223 26.369-20.077 54.507 0.916

Birinci 7.576 0.028 0.029-0.027 884.581 0.994




94


AFB1 içeren öğütülmüş ve bütün soya fasulyelerine ait R2 ve F değerleri birinci

derece reaksiyon kinetiği modelinden oldukça düşük bulunmuştur. Birinci derece

reaksiyon kinetiği modelinde R2 değerleri öğütülmüş soya fasulyelerinde 0.995-

0.996, bütün soya fasulyelerinde ise 0.994-0.999 arasında değişmiştir.

Şekil 4.25, 4.26, 4.27’de öğütülmüş, Şekil 4.28, 4.29 ve 4.30’da ise bütün

halde bulunan soya fasulyelerindeki AFB1’in sıfırıncı ve birinci derece kinetik

modellere göre azalış eğrileri görülmektedir.

y = 464,427e-0,030x

R2 = 0,995

y = -5,685x + 406,007R2 = 0,916

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.25. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı



95

y = 927,412e-0,028x

R2 = 0,996

y = -10,939x + 821,846R2 = 0,918

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.26. 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş soya fasulyesinde aflatoksinin

sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri

y = 1870,481e-0,029x

R2 = 0,996

y = -22,433x + 1648,957R2 = 0,917

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.27. 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş soya fasulyesinde aflatoksinin

sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere göre azalış eğrileri


96

y = 473,922e-0,027x

R2 = 0,998

y = -5,583x + 421,013R2 = 0,922

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.28. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün soya fasulyesinde aflatoksinin sıfırıncı ve


y = 947,549e-0,026x

R2 = 0,999

y = -11,021x + 852,009R2 = 0,935

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)





97

y = 1950,109e-0,028x

R2 = 0,994

y = -23,223x + 1726,720R2 = 0,916

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)





bulunması AFB1 miktarındaki azalmanın bu kinetik modele daha uygun olduğunu

göstermektedir. Kinetik modellere ait azalış eğrilerinin birinci derece reaksiyon

kinetiğine daha uygun olduğu şekillerden de (Şekil 4.25, 4.26, 4.27, 4.28, 4.29 ve

4.30) görülebilmektedir.

Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre elde edilen “k” değerleri

istatistiksel olarak güvenli bulunmuştur. 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren

öğütülmüş soya fasulyesi ortamında toksinin degradasyon hızı sırasıyla 0.055, 0.052

ve 0.051 saat-1; bütün halde soya fasulyesi içeren ortamda ise 0.053, 0.047 ve 0.045

saat-1 olarak bulunmuştur.

Soya fasulyesi örneklerinin 72 saat sonunda içerdiği AFB1 düzeyleri Türk

Gıda Kodeksinde bu ürün için izin verilen sınır değerlere ulaşamamıştır. İnkübasyon

süresi, soya fasulyelerinin hayvan yemi olarak ta kullanımı için de yeterli olmamıştır.


107 kob ml-1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda soya

fasulyelerinin AFB1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen


98

Maddeler Hakkındaki Tebliğ’de izin verilmiş olan değerlere düşürülebilmesi için

gerekli olan süreler hesaplanmış ve Çizelge 4.17’de verilmiştir.

Çizelge 4.17. Soya Fasulyelerinin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin


Ürün Tüketim

Amacı

Kabul

Edilebilir

Limit (ng g-1)

Süre (Saat)

500 ng g-1

AFB1 İçin

1000 ng g-1

AFB1 İçin

2000 ng g-1

AFB1 İçin

Öğü

tülm

üş S

oya

Fasu

lyes

i

k=0.030 k=0.028 k=0.029

İnsan

Tüketimi İçin

2 181,60 219,24 235,89

5 151,05 186,52 204,30

Hayvan Yemi

İçin

5 151,05 186,52 204,30

10 127,95 161,76 180,39

20 104,84 137,01 156,49

Büt

ün S

oya

Fasu

lyes

i

k=0.027 k=0.026 k=0.028


2 202,51 236,96 210,10

5 168,58 201,71 177,38

Hayvan Yemi

İçin

5 168,58 201,71 177,38

10 142,90 175,05 152,62

20 117,23 148,39 127,87

Çizelge 4.17’de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren soya

fasulyesinin aflatoksin seviyesinin 2 ng g-1’a düşebilmesi için gereken süre,

öğütülmüş soya fasulyesi örneklerinde 181.60 ile 235.89 saat; bütün haldeki soya

fasulyesi örneklerinde ise 202.51 ile 210.10 saat arasında değişmektedir.

Soya fasulyelerinin hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan

inkübasyon sürelerinin 104.84 ile 204.30 saat arasında değiştiği tespit edilmiştir.


99

4.5.5. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde Aflatoksini


4.5.5.1. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde Aflatoksini



öğütülmüş ve bütün halde incir içeren PFT çözeltilerine 500, 1000 ve 2000 ng g-1

düzeylerinde AFB1 ilave edilmiştir. İnkübasyon sırasında aflatoksin içeriğindeki

değişim ve % azalma oranları Çizelge 4.18’de verilmiştir.

İnkübasyon süresince kontrol örneklerinin AFB1 düzeylerinde önemli bir

değişim olmazken, F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan gerek

öğütülmüş gerekse bütün haldeki incir örneklerinin toksin içeriklerinde sürekli bir

azalma görülmüştür. 72 saat sonunda kontrol grubu dışındaki örneklerdeki azalma,

başlangıç aflatoksin miktarı artıkça oransal olarak azalmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng

g-1 aflatoksin içeren öğütülmüş kuru incir örneklerinde 72. saat sonunda sırasıyla

%99.34, %98.30 ve %97.83 düzeylerinde azalma olmuştur. Bütün olarak denemeye

alınan örneklerde ise sırasıyla %98.17, %95.80 ve %95.25 oranında azalma

gerçekleşmiştir.


NRRL B-184 hücrelerinin incirde AFB1 miktarının azalması üzerine etkisi




istatistiksel açıdan önemsiz bulunmuştur.


100

Çizelge 4.18. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş ve Bütün Kuru İncir Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma Oranları

Konsantrasyon (ng g-1)

Süre (Saat)

Uygulama


Kontrol AFB1 %

Azalma Kontrol AFB1

%

Azalma

500

0 482.42 450.08 0.00 478.12 460.14 0.00

6 463.22 340.10 24.44 487.82 355.44 22.75

12 487.52 234.92 47.80 489.45 244.88 46.78

24 478.11 131.64 70.75 451.64 159.36 65.37

36 478.78 50.95 88.68 474.87 80.99 82.40

48 441.31 33.72 92.51 461.39 43.02 90.65

72 455.36 2.95 99.34 465.46 8.42 98.17

1000

0 954.82 900.03 0.00 987.41 912.58 0.00

6 925.45 688.87 23.46 996.29 728.21 20.20

12 927.75 471.39 47.63 984.67 564.80 38.11

24 986.79 278.04 69.11 908.78 317.33 65.23

36 932.89 82.06 90.88 975.16 149.11 83.66

48 935.49 64.28 92.86 926.51 76.60 91.61

72 921.36 15.28 98.30 934.41 38.37 95.80

2000

0 1978.17 1800.22 0.00 1981.56 1821.35 0.00

6 1984.32 1430.99 20.51 1992.54 1571.26 13.73

12 1969.69 909.72 49.47 2020.41 1256.69 31.00

24 1882.38 561.40 68.81 1962.71 684.80 62.40

36 1993.71 162.05 91.00 1879.23 347.62 80.91

48 1845.32 138.93 92.28 1928.18 188.28 89.66

72 1941.31 39.15 97.83 1935.08 86.57 95.25

Kuru incir üzerine yapılan çalışma sonucunda F. aurantiacum NRRL B-184

hücrelerinin ürüne aşılanan AFB1’in miktarını azaltma yeteneğine sahip olduğunu

göstermektedir. Kuru incir ile ilgili benzeri bir çalışma olmaması nedeniyle herhangi

bir karşılaştırma yapmak mümkün olamamıştır.


101

4.5.5.2. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Kuru İncirde Aflatoksini

Azaltma Kinetiği

Öğütülmüş ve bütün haldeki incirlerde AFB1’in azalma kinetiğini

inceleyebilmek amacıyla regresyon analizleri yapılmıştır. Her iki regresyon

analizinde de, Co, k, k’nın güven aralığı, F ve R2 değeri hesaplanmış olup sonuçlar

Çizelge 4.19’da verilmiştir.


AFB1 içeren öğütülmüş ve bütün incirlere ait R2 değerleri oldukça düşük


incirlerde 0.990-0.997 bütün haldeki incirlerde ise 0.988-0.996 arasında değişmiştir.

Regresyonun tesadüfilikten uzaklığını gösteren F değeri birinci derece reaksiyon

kinetiği modelinde daha yüksek bulunmuştur.

Şekil 4.31, 4.32, 4.33’te öğütülmüş incirlerdeki, Şekil 4.34, 4.35 ve 4.36’da

ise bütün haldeki incirlerdeki AFB1’in, sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere



102

Çizelge 4.19. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Kuru İncirde AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi Sonuçları


(ng g-1) Reaksiyon

Derecesi C0

(ng g-1) k*



ğütü

lmüş

500 Sıfırıncı 346.595 5.969 7.262-4.676 21.297 0.810

Birinci 6.123 0.054 0.056-0.052 1942.260 0.997

1000 Sıfırıncı 695.395 11.959 14.616-9.302 20.263 0.802

Birinci 6.821 0.054 0.057-0.051 832.739 0.994

2000 Sıfırıncı 1397.671 23.946 29.406-18.486 19.234 0.794

Birinci 7.521 0.054 0.058-0.050 503.765 0.990

Büt

ün

500 Sıfırıncı 363.827 6.033 7.210-4.856 26.262 0.840

Birinci 6.135 0.048 0.050-0.046 1597.683 0.997

1000 Sıfırıncı 744.672 12.251 14.630-9.872 26.519 0.841

Birinci 6.841 0.046 0.048-0.044 1102.971 0.996

2000 Sıfırıncı 1567.220 25.323 29.848-20.798 31.316 0.862

Birinci 7.559 0.042 0.045-0.039 403.667 0.988




103

y = 456,316e-0,054x

R2 = 0,997

y = -5,969x + 346,595R2 = 0,810

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.31. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve


y = 916,646e-0,054x

R2 = 0,994

y = -11,959x + 695,395R2 = 0,802

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)





104

y = 1846,475e-0,054x

R2 = 0,990

y = -23,946x + 1397,671R2 = 0,794

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)




y = 461,821e-0,048x

R2 = 0,997

y = -6,033x + 363,827R2 = 0,840

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.34. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve birinci



105

y = 935,878e-0,046x

R2 = 0,996

y = -12,251x + 744,672R2 = 0,841

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.35. 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve


y = 1916,987e-0,042x

R2 = 0,988

y = -25,323x + 1567,220R2 = 0,862

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.36. 2000 ng g-1 AFB1 içeren bütün kuru incirde aflatoksinin sıfırıncı ve



106


bulunmasının yanısıra şekillerdeki (Şekil 4.31, 4.32, 4.33 4.34, 4.35 ve 4.36) kinetik

modellere ait azalış eğrilerinden de görüldüğü üzere incir ortamındaki AFB1

azalışının birinci derece reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu sonucuna

varılmıştır.


değerlendirmede istatistiksel olarak güvenli bulunmuş ve 500, 1000 ve 2000 ng g-1

AFB1 içeren öğütülmüş incirlerde sırasıyla 0.054, 0.054 ve 0.054 saat-1; bütün

haldeki incirlerde ise 0.048, 0.046 ve 0.042 saat-1 olarak hesaplanmıştır.

72 saatlik inkübasyon sonunda yalnızca 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş

kuru incir örneğinde Türk Gıda Kodeksinde bu ürün için verilmiş olan limite

ulaşılmıştır. 500 ve 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş ve 500 ng g-1 AFB1 içeren

bütün haldeki kuru incirlerin toksin içerikleri Yemlerde İstenmeyen Maddeler

Hakkındaki Tebliğ’de (Resmi gazete, 2008) hayvan yemleri için belirtilen sınırlara

ulaşmıştır.


107 kob ml-1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması durumunda kuru

incirlerin AFB1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen Maddeler




107

Çizelge 4.20. Kuru İncirlerin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin Altına İnme Süreleri

Ürün Tüketim

Amacı

Kabul

Edilebilir

Limit (ng g-1)

Süre(Saat)

500 ng g-1

AFB1 İçin

1000 ng g-1

AFB1 İçin

2000 ng g-1

AFB1 İçin

Öğü

tülm

üş İn

cir

k=0.054 k=0.054 k=0.054

İnsan

Tüketimi İçin

2 100,55 113,48 126,44

5 83,58 96,51 109,47

Hayvan Yemi

İçin

5 83,58 96,51 109,47

10 70,75 83,67 96,64

20 57,91 70,84 83,80

Büt

ün İn

cir

k=0.048 k=0.046 k=0.042


2 113,37 133,65 163,47

5 94,28 113,73 141,66

Hayvan Yemi

İçin

5 94,28 113,73 141,66

10 79,84 98,66 125,15

20 65,40 83,59 108,65

Çizelge 4.20’de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren kuru

incirlerin aflatoksin seviyesinin 2 ng g-1’a düşebilmesi için gereken süre, öğütülmüş

kuru incirlerde 100.55 ile 126.44 saat; bütün haldeki kuru incirlerde ise 113.37 ile

163.47 saat arasında değişmektedir.

Kuru incirlerin hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan

inkübasyon sürelerinin 57.91 ile 141.66 saat arasında değiştiği belirlenmiştir.

4.5.6. F. aurantiacum NRRL B-184 Hücrelerinin Fındıkta Aflatoksini





öğütülmüş ve bütün halde fındık içeren PFT çözeltilerine 500, 1000 ve 2000 ng g-1

düzeylerinde AFB1 ilave edilmiştir. İnkübasyon sırasındaki aflatoksin içeriğindeki

değişim ve % azalma oranları Çizelge 4.21’de verilmiştir.


108

Çizelge 4.21. PFT Çözeltisinde Farklı Düzeylerde AFB1 İçeren Öğütülmüş Ve Bütün Fındık Örneklerinin Aflatoksin Konsantrasyonlarındaki (ng g-1) Değişim ve % Azalma Oranları

Konsantrasyon

(ng g-1)

Süre

(Saat)

Uygulama


Kontrol AFB1 %

Azalma Kontrol AFB1

%

Azalma

500

0 487.87 475.33 0.00 481.50 479.78 0.00

6 475.78 351.12 26.13 498.30 403.58 15.88

12 465.67 201.44 57.62 498.12 288.91 39.78

24 488.21 82.40 82.66 489.54 117.21 75.57

36 487.09 53.70 88.70 478.91 67.23 85.99

48 476.04 28.30 94.05 475.23 34.47 92.82

72 462.70 0.78 99.84 483.65 11.08 97.69

1000

0 974.56 950.34 0.00 981.51 963.74 0.00

6 975.78 842.28 11.37 975.67 876.31 9.07

12 963.70 505.89 46.77 987.57 609.07 36.80

24 965.79 290.08 69.48 967.43 351.60 63.52

36 957.21 116.20 87.77 991.17 178.42 81.49

48 986.14 59.10 93.78 983.31 112.30 88.35

72 982.74 5.04 99.47 956.94 18.19 98.11

2000

0 1986.12 1900.20 0.00 1958.05 1914.30 0.00

6 1997.34 1706.15 10.21 1967.43 1793.13 6.33

12 1928.04 1109.28 41.62 1932.56 1279.51 33.16

24 1913.37 658.01 65.37 1915.24 790.90 58.68

36 1895.09 289.61 84.76 1902.23 414.21 78.36

48 1904.33 134.28 92.93 1958.02 255.28 86.66

72 1921.00 18.19 99.04 1912.91 67.40 96.48

Kontrol örneklerinin AFB1 düzeylerinde inkübasyon süresince önemli bir

değişim gerçekleşmemiştir. F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan gerek

öğütülmüş gerekse bütün haldeki fındık örneklerinin toksin içeriklerinde sürekli bir

azalma görülmüştür. 72 saat sonunda kontrol grubu dışındaki örneklerdeki azalma

oranı, başlangıç aflatoksin miktarının artmasıyla oransal olarak azalmıştır. 500, 1000

ve 2000 ng g-1 aflatoksin içeren öğütülmüş fındık örneklerinde 72. saat sonunda


109

sırasıyla %99.84, %99.47 ve %99.04 düzeylerinde azalma olmuştur. Bütün olarak

denemeye alınan örneklerde ise sırasıyla %97.69, %98.11 ve %96.48 oranında

azalma gerçekleşmiştir.

F. aurantiacum NRRL B-184 hücreleri tarafından fındık örneklerinin AFB1

miktarının azaltılması üzerine aflatoksin konsantrasyonu ve inkübasyon süresinin

etkisi istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.05). Fındık boyutunun etkisi ise

istatistiksel olarak önemli bulunmamıştır. Konsantrasyon ve sürenin birlikte ortak

etkisi toksin miktarının azalmasında önemli (p<0.05) olup konsantrasyon-boyut ve

süre-boyut ilişkisi istatistiksel açıdan önemsiz bulunmuştur.

Fındıklarla yapılan çalışma sonucunda F. aurantiacum NRRL B-184

hücrelerinin ürüne aşılanan AFB1’in miktarını azaltma yeteneğine sahip olduğu

görülmüştür. Bu bakterinin fındıkta bulunan aflatoksin üzerine etkisinin araştırıldığı

başka bir çalışmanın olmaması; bu çalışmadan elde edilen verilerin

karşılaştırılmasını mümkün kılmamıştır.


Azaltma Kinetiği

Öğütülmüş ve bütün haldeki fındıklarda AFB1’in azalma kinetiğinin sıfırıncı

ve birinci derece reaksiyon kinetiklerine uygunluğunu belirleyebilmek amacıyla

regresyon analizleri yapılmıştır. Regresyon analizleri sonucu elde edilen Co, k, k’nın

güven aralığı, F ve R2 değeri Çizelge 4.22’de verilmiştir.


110

Çizelge 4.22. F. aurantiacum NRRL B-184 Suşu Tarafından Fındıkta AFB1’in Degradasyon Kinetiğine Ait Regresyon Analizi

Sonuçları.


(ng ml-1) Reaksiyon Derecesi

C0 (ng g-1)

k* k için güven


Öğü

tülm

üş

500 Sıfırıncı 342.026 6.066 7.690-4.442 13.949 0.736

Birinci 6.183 0.067 0.072-0.017 670.437 0.993

1000 Sıfırıncı 775.047 13.416 16.313-10.519 21.445 0.811

Birinci 6.914 0.053 0.059-0.047 240.890 0.980

2000 Sıfırıncı 1598.952 27.156 32.442-21.870 26.390 0.841

Birinci 7.610 0.048 0.053-0.043 266.875 0.982

Büt

ün

500 Sıfırıncı 387.652 6.623 8.090-5.156 20.370 0.803

Birinci 6.224 0.052 0.057-0.047 347.284 0.986

1000 Sıfırıncı 830.739 13.664 16.123-11.205 30.872 0.861

Birinci 6.931 0.044 0.048-0.040 311.231 0.984

2000 Sıfırıncı 1700.112 27.202 31.740-22.664 35.929 0.878

Birinci 7.624 0.040 0.044-0.036 269.297 0.982




111


AFB1 içeren öğütülmüş ve bütün fındıklara ait R2 değerleri oldukça düşük


fındıklarda 0.982-0.993, bütün haldeki fındıklarda ise 0.982-0.986 arasında

değişmiştir. Regresyonun tesadüfilikten uzaklığını gösteren ve kinetik modelin

deneysel verilere uygunluğunun belirlenmesinde yararlanılan F değeri de birinci

derece reaksiyon kinetiği modelinde daha yüksek bulunmuştur.

Şekil 4.37, 4.38, 4.39’da öğütülmüş fındıklardaki, Şekil 4.40, 4.41 ve 4.42’de

ise bütün halindeki fındıklarda AFB1’in sıfırıncı ve birinci derece kinetik modellere


y = 484,527e-0,067x

R2 = 0,993

y = -6,066x + 342,026R2 = 0,736

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.37. 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci



112

y = 1006,536e-0,053x

R2 = 0,980

y = -13,416x + 775,047R2 = 0,811

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.38. 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve


y = 2017,716e-0,048x

R2 = 0,982

y = -27,156x + 1598,952R2 = 0,841

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.39. 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve



113

y = 504,967e-0,052x

R2 = 0,986

y = -6,623x + 387,652R2 = 0,803

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)


Şekil 4.40. 500 ng g-1 AFB1 içeren bütün fındıkta aflatoksinin sıfırıncı ve birinci


y = 1023,625e-0,044x

R2 = 0,984

y = -13,664x + 830,739R2 = 0,861

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)





114

y = 2046,973e-0,040x

R2 = 0,982

y = -27,202x + 1700,112R2 = 0,878

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Süre (Saat)

Afla

toks

in M

ikta

rı (n

g g-

1)





bulunması sonucu F. aurantiacum NRRL B-184 suşu tarafından fındık ortamındaki

AFB1 azalışının birinci derece reaksiyon kinetiğine daha uygun olduğu sonucuna

varılmıştır. Şekillerdeki (Şekil 4.37, 4.38, 4.39, 4.40, 4.41 ve 4.42) kinetik modellere

ait azalış eğrileri de incelendiğinde deneysel verilerin birinci derece reaksiyon

kinetiğine uyumu daha iyi görülebilmektedir.

Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre elde edilen “k” değerleri

istatistiksel olarak güvenli bulunmuştur. 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren

öğütülmüş fındık kullanılan ortamlar için toksinin azalma hızı sırasıyla 0.067, 0.053

ve 0.048 saat-1; bütün haldeki fındıklarda ise 0.052, 0.044 ve 0.040 saat-1 olarak

hesaplanmıştır.

72 saatlik inkübasyon sonunda yalnızca 500 ve 1000 ng g-1 AFB1 içeren

öğütülmüş fındık örneklerinde Türk Gıda Kodeksinde bu ürün için verilmiş olan

limite ulaşılmıştır. 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş ve 500 ile 1000

ng g-1 AFB1 içeren bütün haldeki fındıkların toksin içerikleri Yemlerde İstenmeyen


115

Maddeler Hakkındaki Tebliğ’de (Resmi gazete, 2008) hayvan yemleri için belirtilen

sınırlara ulaşmıştır.



fındıkların AFB1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksi ve Yemlerde İstenmeyen Maddeler



Çizelge 4.23. Fındık Örneklerinin AFB1 Düzeylerinin Kabul Edilebilir Limitlerin


Ürün Tüketim

Amacı

Kabul Edilebilir

Limit

(ng g-1)

Süre (Saat)

500 ng g-1

AFB1 İçin

1000 ng g-1

AFB1 İçin

2000 ng g-1

AFB1 İçin

Öğü

tülm

üş F

ındı

k

k=0.674 k=0.053 k=0.048


2 81,94 117,37 144,10

5 68,26 100,09 125,01

Hayvan Yemi

İçin

5 68,26 100,09 125,01

10 57,92 87,01 110,57

20 47,57 73,93 96,13

Büt

ün F

ındı

k

k=0.052 k=0.044 k=0.040

İnsan

Tüketimi İçin

2 106,36 141,77 173,27

5 88,74 120,94 150,36

Hayvan Yemi

İçin

5 88,74 120,94 150,36

10 75,41 105,19 133,04

20 62,08 89,44 115,71

Çizelge 4.23’de görüldüğü üzere 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren

fındıkların aflatoksin seviyesinin 2 ng g-1’a düşebilmesi için gereken süre, öğütülmüş

fındıklarda 81.94 ile 144.10 saat; bütün fındıklarda ise 106.36 ile 173.27 saat

arasında değişmektedir.

Fındıkların hayvan yemi olarak kullanılabilmesi için gerekli olan inkübasyon

sürelerinin 47.57 ile 150.36 saat arasında değiştiği tespit edilmiştir.

5. SONUÇ VE ÖNERİLER Bülent ZORLUGENÇ

116

5. SONUÇ VE ÖNERİLER

Küfler bir çok tarımsal üründe; hasat öncesinde ve sonrasında, depolama

süresince veya bu ürünlerin gıda ve hayvan yemi olarak işlenmeleri sırasında doğal

olarak gelişmektedirler.

Küflerin ikincil metabolitleri olan mikotoksinlerin yarattığı ekonomik ve

sağlık sorunlarının farkına varılarak çeşitli önlemlerin alınmasının önemi büyüktür.

Mikotoksin sorununun çözümünde ilk hedef bu toksinlerin oluşumunun önlenmesi

olmalıdır. Nevarki, mikotoksin oluşumunun hasat öncesinde, depolama ve işleme

sırasında önlenmesi her zaman mümkün olmamaktadır. Bu nedenle, mikotoksinlerin

degradasyon ve detoksifikasyon yöntemleri ile miktarlarının azalması veya daha az

tehlikeli ya da tehlikesiz ürünlere dönüşümünü sağlayacak yöntemlerin geliştirilmesi

büyük öneme sahiptir.

Bu amaçla çalışmada, F. aurantiacum NRRL B-184 bakteri suşunun PFT

ortamında ve çeşitli gıda ürünlerinde AFB1’in detoksifikasyonu üzerine etkisi

araştırılmıştır.

Çalışmadan elde edilen bulgulara göre;

F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun 30oC’de TSB besiyerindeki gelişme

eğrisi elde edilmiş ayrıca doğrusal olmayan regresyon analizi sonuçlarına göre

gelişme eğrisini tanımlamada Modifiye Gompertz modelinin daha uygun olduğu

sonucuna varılmıştır.

Modelden elde edilen verilere göre, F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun

maksimum spesifik gelişme hızının 0.073 saat -1, lag süresinin ise 5.244 saat olduğu

hesaplanmıştır. Ayrıca başlangıç hücre sayısı 1.32 x 107 kob ml-1 olan

F. aurantiacum NRRL B-184 suşunun bir saatlik periyotlar içerisinde bir önceki

popülasyonu %7.3 oranında aşacak şekilde gelişerek 45 saatte 2.7 log’luk bir artışla

durgun faza geçtiği ve 95. saat sonunda hala durgun fazda olduğu belirlenmiştir.

F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmamış kontrol örneklerinin

inkübasyon süresince aflatoksin miktarlarında önemli bir değişim belirlenmemiştir.

Ancak durgun fazda 107 kob ml-1 F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış olan

PFT çözeltisi ile kırmızı biber, mısır, siyah zeytin, soya fasulyesi, kuru incir ve fındık


117

ortamlarında, konsantrasyon ve boyut farkı olmaksızın aflatoksin miktarında sürekli

bir azalma gerçekleşmiştir. Bu durum meydana gelen azalmanın F. aurantiacum

NRRL B-184 hücrelerinin bir faaliyeti sonucu olduğunu göstermektedir.

F. aurantiacum NRRL B-184 suşu aşılanmış PFT ve gıda ortamlarındaki

azalmanın “Birinci Dereceden Reaksiyon Kinetiğine” uygun olduğu tespit edilmiştir.

Birinci derece reaksiyon kinetiği modeline göre, birim zamanda

konsantrasyonun oransal olarak azalış hızını gösteren “k” değeri en yüksek PFT

ortamlarında bulunmuş ve bunu öğütülmüş ürünlerde genel itibariyle incir, bütün

ürünlerde ise siyah zeytin izlemiştir. Öğütülmüş ve bütün haldeki ürünlerde çalışılan

tüm aflatoksin konsantrasyonlarında en düşük k değerlerine soya fasulyesi örnekleri

sahip olmuştur. Aflatoksin konsantrasyonunun artmasının ve ürünlerin bütün halde

olmalarının “k” değerlerinde genel olarak azalmaya neden olduğu görülmüştür.

72 saatlik inkübasyon sonunda 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kırmızı

biber, 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş kuru incir ile 500 ve 1000 ng g-1 AFB1

içeren öğütülmüş fındık örneklerinde Türk Gıda Kodeksinde bu ürünlerin insan

gıdası olarak kullanılması durumunda izin verilen AFB1 düzeylerine ulaşılabilmiştir.

Bu süre sonunda; 500 ile 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş ve 500

ng g-1 AFB1 içeren bütün kırmızı biber örnekleri, 500 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş

mısır örnekleri, 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş ve 500 ng g-1 AFB1

içeren bütün haldeki zeytin örnekleri, 500 ve 1000 ng g-1 AFB1 içeren öğütülmüş ve

500 ng g-1 AFB1 içeren bütün haldeki kuru incirler ile 500, 1000 ve 2000 ng g-1 AFB1

içeren öğütülmüş ve 500 ile 1000 ng g-1 AFB1 içeren bütün haldeki fındıkların AFB1

düzeyleri Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkındaki Tebliğ’de hayvan yemi için

belirtilen limitlerin altına düşmüştür.

Birinci dereceden reaksiyon kinetiğine ait model parametrelerinden

yararlanılarak 107 kob ml-1 F. aurantiacum NRRL B-184 kültürü kullanılması

durumunda örneklerin AFB1 içeriklerinin Türk Gıda Kodeksinde bu ürünler için

belirtilmiş olan 5 ng g-1’a düşürülebilmesi için ürün çeşidine bakılmaksızın

öğütülmüş örneklerde 68-204 saat, bütün haldeki örneklerde ise 86-177 saatin

gerekebileceği hesaplanmıştır. AFB1 içeriklerinin 2 ng g-1’a düşürülebilmesi için

öğütülmüş örneklerin 82-236 saat ve bütün haldeki örneklerin ise 104-210 saat


118

süreyle F. aurantiacum NRRL B-184 suşu ile inkübe edilmesinin gerekebileceği

belirlenmiştir.

Bu çalışmadan elde edilen sonuçlara göre;

Kırmızı biber, mısır, zeytin, soya fasulyesi, kuru incir ve fındıklarda bulunan

AFB1’i uzaklaştırmada F. aurantiacum NRRL B-184 suşundan yararlanılabileceğini

göstermektedir. Bu yöntemin ticari olarak uygulanabilir bir yöntem olarak kabul

edilebilmesi için öncelikle detoksifiye edilen ürünlerde yeni toksik bileşiklerin

oluşup oluşmadığının daha ileri analiz teknikleri veya hayvan deneyleri ile açıklığa

kavuşturulması gerekmektedir.

Bu bakteri ile yapılmış daha önceki çalışmalar dikkate alındığında,

detoksifikasyon süresinin kısaltılabilmesi için kullanılan bakteri sayısının artırılması

önerilebilir.

Aflatoksin içeren bir üründe; başka mikotoksinlerin de var olabileceği

düşünülerek, bu bakterinin diğer mikotoksinler üzerine etkileri de araştırılmalıdır.

Ayrıca, F. aurantiacum B-184 suşunun aflatoksini enzimatik olarak

detoksifiye ettiği düşünülürse, ileri genetik çalışmalar ile bu enzim veya enzimlerin

üretimi ile ilgili genlerin başka mikoorganizmalara (starter kültürler gibi) ya da

toksin sorunu yaşanan bitkilere aktarılması durumunda aflatoksin sorununa çözüm

olabileceği düşünülmektedir.

119

6. KAYNAKLAR

ADAMS, M.R., MOSS, M.O., 1997. Food Microbiology. The Royal Society of

Chemistry. Cambridge. p:230-234.

AHMED, M.A., SHAMSUDDING, Z.A., KHAN, B.A., 1996. Elimination of

Naturally Occurring Aflatoxins in Cottonseed Meal. Pak, J. Sci. Ind. Res., 39,

183–185.

AIKAWA K., KOMATSU Y., 1987. Antimutagenic Effects of Autoxidized

Linoleic and Oleic Acids on UV-induced Mutagenesis in Escherichia coli.

Agric. Biol. Chem., 51(10), 2717–2720.

AIKAWA K., 1988. Effect of s-9 Mmix on Antimutagenic Activity of Autoxidized

Linoleic Acid, Agric. Biol. Chem., 52(8), 2115–2116.

ALTUG, T., YOUSEF, A.E., MARTIN, E.H., 1990. Degradation of Aflatoxin B1

in Dried Figs by Sodium Bisulfite with or without Heat, Ultraviolet Energy or

Hydrogen Peroxide. J. Food Prot., 53, 581–582, 628.

ALTUĞ, G., 1991. Laboratuar Ortamında Aflatoksin Üretimi ve Aspergillus spp’nin

Plasmid Transferine Etkisinin Araştırılması. Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü

Yüksek Lisans Tezi. Adana. 39s.

ANONİM, 1998. Laboratuvar Analiz Föyü. Tarım Orman ve Köyişleri Bakanlığı. İl

Kontrol Laboratuvarı. Adana.

ANONİM, 2002. Discussion Paper on Aflatoxins in Pistachios. Codex Alimentarius

Commission. CX/FAC 02/22. Joint FAO/WHO Food Standards Programme

Rotterdam, Netherlands.

AOAC, 2000. AOAC Official Method 999.07. Aflatoxin B1 and Total Aflatoxins in

Peanut Butter, Pistachio Paste, Fig Paste, and Paprika Powder.

Immunoaffinity Column Liquid Chromatography with Post-Column

Derivatization First Action 1999.

120

ARRIOLA, M.C., PORRES, E de, CABRERA, S de, ZEPEDA, M de, ROLZ,

C., 1988. Aflatoxin Fate During Alkaline Cooking of Corn for Tortilla

Preparation. J. Agr. Food Chem., 36:530-533.

BAHAR, M.B., ALTUĞ, T., 1997. Kontamine Kuru İncirlerden İki Farklı Teknikle

Elde Edilen İncir Pekmezlerine Aflatoksin Geçiş Düzeylerinin İncelenmesi.

Gıda Mühendisliği III. Ulusal Sempozyumu. 1995-1996 Araştırmaları,

s:53-58. Ankara.

BANDARA, J.M.R.S., VİTHANEGE, A.K., BEAN, G.A., 1991. Effect of

Parboiling and Bran Removal on Aflatoxin Levels in Sri Lankan Rice,

Mycopathologia, 115, 31–35.

BANWART, G.J., 1989. Basic Food Microbiology. Second Edition, Published by

Van Nostiond Reinhold, New York-Tokyo, 399-320.

BATA, A., LASZTITY, R., 1999. Detoxification of Mycotoxin-Contaminated Food

and Feed By Microorganisms. Trends in Food Sci. & Tech. 10: 223-228.

BURGOS-HERNANDEZ, A., JORGENSEN KORNMAN, K., PRICE, R.L.,

1996. Detoxification of Aflatoxin-Contaminated Corn by Ammonium

Persulfate and The Effect of Three Peroxides on The Ethanol Production in a

Fermentation Process. 1996 IFT Annual Meeting, Book of Abstracts, p.27,

ISSN 1082-1236.

BURGOS-HERNANDEZ, A., PRICE, R.L., JORGENSEN-KORNMAN, K.,

LOPEZ-GARCIA, R., NJAPAU, H., PARK, D.L., 2002. Decontamination

of Aflatoxin B1 Contaminated Corn by Ammoniation Persulphate During

Fermentation. J. Sci. Food Agric., 82, 546–552.

CHATTERJEE, D., MUKHERJEE, S.K., 1993. Destruction of Phagocytosis-

suppressing Activity of Aflatoxin B1 by Ozone. Lett. Appl. Microbiol., 17:52-

54.

CIEGLER, A., LILLEHOJ, E.B., PETERSON, R.E., HALL, H.H., 1966.

Microbial Detoxification of Aflatoxin. Applied Microbiology. 4 (6):934-939.

121

ÇOKSÖYLER, N., 1994. Türkiye’de Mikotoksin Problemi. II. Gıda Mühendisligi

Kongresi. 21-23 Eylül 1994 Gaziantep. s: 234-239.

D’SOUZA, D.H., BRACKETT, R.E., 1998. The Role of Metal Ions in Aflatoxin B1

Degradation by Flavobacterium aurantiacum. J. of Food Prot. 61 (12) 1666-

1669.

D’SOUZA, D.H., BRACKETT, R.E., 2000. The Influence of Divalent Cations and

Chelators on Aflatoxin B1 Degradation by Flavobacterium aurantiacum. J. of

Food Prot. 63 (1) 102-105.

D’SOUZA, D.H., BRACKKETT, R.E., 2001. Aflatoxin B1 degradation by F.

aurantiacum in the Presence of Reducing Conditions and Seryl and

Sulfhydryl Group Inhibitors. J. of Food Prot. 64(2), 268-271.

DAS, C., MISHRA, H.N., 2000. Effect of Aflatoxin B1 Detoxification on

Physicochemical Properties and Quality of Ground Nut Meal. Food

Chemistry. (70):483-487.

DEACON, J. W., 1997. Modern Mycology. Third Edition, Blackwell Science Ltd.

303 p.

DETROY, R. W., LILLEHOJ, E. B., CIEGLER, A., 1971. Aflatoxin and Related

Compounds. In: A. Ciegler, S. Kadis & S. J. Ajl, eds. Microbial Toxins 8, 4

178. Academic Press, New York.

DOLLEAR, F.B., MANN, G.E., CODIFER, L.P., GARDNER, Jr.H.K.,

KOLTUN, Jr.S.P., VIX, H.L.E, 1968. Elimination of Aflatoxins from

Peanut Meal. J. Am. Oil Chem. Soc. 45:862-865.

DOYLE, M.P., APPLEBAUM, R.S., BRACKETT, R.E., MARTH, E.M., 1982.

Physical, Chemical and Biological Degradation of Mycotoxins in Foods and

Agricultural Commodities. J. Food Prot., 45:964-971.

DOYLE, M.P., BEUCHAT, L.R., MONTVILLE, T.J., 1997. Food Microbiology

Fundementals and Frontiers. 768p.

122

DOYLE, M.P., MARTH, E.H., 1978. Bisulfite Degrades Aflatoxin: Effect of

Temperature and Concentration of Bisulfite. J. Food Prot. 41:774-780.

DRAUGHON, F.A., CHILDS, E.A., 1982. Chemical and Biological Evaluation of

Aflatoxin After Treatment with Sodium Hypochlorite, Sodium Hydroxide

and Ammonium Hydroxide. J.Food Prot. 45:703-706.

DVORACKOVA, I., 1986. Aflatoxin Inhalation and Alveolar Cell Carcinoma. Br.

Med. J., 1:691.

DWARAKANTTH, C.T., RAYNER, E.T., MANN, G.E., DOLLER, F.G., 1968.

Reduction of Aflatoxin Level in Cottonseed and Peanut Meals by Ozonation.

J. Am. Oil. Chem. Soc. 45:93-95.

EC, 2008. Commission Regulation (EC) No 2006R1881 of 23.07.2008 Setting

Maximum Levels for Certain Contaminants in Foodstuffs.

ELEY, R.A., 1996. Microbial Food Poising. Chapmen & Hall London. 211p.

EL-NEZAMI, H., KANKAANPAA, P., SALMINEN, S., AHOKAS, J., 1998a.

Physicochemical Alterations Enhance the Ability of Dairy Strains of Lactic

Acid Bacteria to Remove Aflatoxin from Contaminated Media, J. Food Prot.,

61(4), 466–468.

EL-NEZAMI, H., KANKAANPAA, P., SALMINEN, S., AHOKAS, J., 1998b.

Ability of Lactic Acid Bacteria to Bind a Common Food Carcinogen,

Aflatoxin B1, Food Chem. Toxicol., 36(4), 321–6.

EL-NEZAMI, H., MYKKANEN, H., KANKAANPAA, P., SALMINEN, S.,

AHOKAS, J., 2000. Ability of Lactobacillus and Propionibacterium Strains

to Remove Aflatoxin B1 from the Chicken Duodenum. J. Food Prot.., 63(4),

549–552.

EPSOY, H.M., 1972. Detoxification of Corn Containing Aflatoxin by Teratment

with Calcium Hydroxide (Alınmıştır, Özay,1988. Gıdalarda Mikotoksinler ve

Detoksifikasyonu. Gıda (13) 137-141.). U.S. Patent, 3, 689, 275.

123

FAO, 1993. Sampling Plans for Aflatoxin Analysis in Peanut and Corn. Food and

Agriculture Organization of The United Nations.Report of an FAO Technical

Consultation Rome, 3,6 May 1993.77p.

GALVANO, F., PIVA, A., GALVANO, G., 2001. Dietary Strategies to Counteract

the Effects of Mycotoxins: A Review. J.Food Prot., 64:120-131.

GARDNER, H.K. JR., KOLTUN, S.P., DOLLEAR, F.G., RAYNER, E.T., 1971.

Inactivation of Aflatoxins in Peanut and Cottonseed Meals by Ammoniation

J. Am. Oil Chem. Soc. 48, 70-73.

GARDNER, H.K. JR., KOLTUN, S.P., H.L.E. VIX, 1968. Solvent Extraction of

Aflatoxins from Oilseed Meals. J. Agric. Food Chem., 990-993.

GHOSH, M.K., CHHABRA, A., 1995. Aflatoxin Detoxification in Naturally

Contaminated Groundnut Cake. Indian J. Animal Nutr., 12, 105–107.

GIANNUZZI, L., PINOTTI, A., ZARITZKY, N., 1997. Modelling of Microbial

Growth in Potato Homogenate. J.Sci.Food.Agric. 73, 425-431.

GOLDBLATT, L.A., DOLLEAR, F.G., 1977. Detoxification of Contaminated

Crops: Mycotoxins in Human and Animal Health. Rodricks, J.V., Hesseltine,

C.W., Mehlman, M.A. (Eds.), Pathotox Publishers, Inc., Park Forest South,

Ilinois. p:139-150.

GÖZÜKARA, E.M., 1997. Biyokimya, 2. Cilt, 3.Baskı, Nobel Tıp Kitapevleri,

1225s.

GROOPMAN, J.D., CAIN, L.G., KENSLER, T.W., 1988. Aflatoxin Exposure in

Human Populations: Measurements and Relationship to Cancer. Crit. Rev.

Toxicol., 19:113-146.

GÜRGÜN, V., HALKMAN, A.K., 1990. Mikrobiyolojide Sayım yöntemleri, Gıda

Teknolojisi Derneği Yayın No:7. 2. Baskı. Basım&Grafik. 146s. Ankara.

HAGLER, W.N., HUTCHINS, Jr.J.E., HAMILTON, P.B., 1983. Destruction of

Aflatoxin B1 with Sodium Bisulfite: Isolation of the Major Product Aflatoxin

B1S. J.Food Prot. 46:295-300.

124

HAO, Y.Y., BRACKETT, R.E., 1988. Removal of Aflatoxin B1 from Peanut Milk

Inoculated with F. aurantiacum. J. Food Prot., 53(5), 1384-1386.

HAO, Y.Y., BRACKETT, R.E., 1989. Growth and Survival of F. aurantiacum in

Peanut Milk. J. Food Prot. 52(3) 165-168.

HASAN, H.A.H., 1996. Destruction of Aflatoxin B1 on Sorghum Grain with Acids,

Salts and Ammonia Derivatives, Crypogamie Mycol., 17, 129–134.

HASKARD, C.A., EL-NAZEMI, H., KANKAANPAA, P., SALMINEN, S.,

AHOKAS, J.T., 2001. Surface Binding of Aflatoxin B1 by Lactic Acid

Bacteria, Appl. Environ. Microbiol., 67(7), 3086–91.

HAWORTH, S.R., LAWLOR, T.E., ZEIGER, E., PARK, D.L., 1989. Mutagenic

Potential of Ammonia-related Aflatoxin Reaction Products in a Model

System. J.Am.Oil Chem.Soc., 66:102-104.

HAYES, R.B., 1984. Aflatoxin Exposures in the Industrial Setting: an

Epidemiological Study of Mortality. Food Chem. Toxicol., 22:39–43.

HEATHCOTE, J.G., HIBBERT, J.R., 1978. Aflatoxin Chemical and Biological

Aspects. Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, Netherlands,

212p.

HO, K.I., SOOK, C.H., WHA, M.T., 1995. Constituents of Antimutagenic Factor

from Brown Rice. Agric. Chem. Biotechnol., 38(5), 478–483.

HOCKING, A.D., 1997. Toxigenic Aspergillus Species. (Edited by Doyle,

L.R.;Beuchat, T.J.) Montuille Food Microbiology Fundamentals and

Frontiers. Chapter21. p:393-405.

HOLMES, B., OWEN, R.J., Mc MEEKIN, T.A., 1984. Bergey’s Manuel

Systematic Bacteriology, Vol.1, Krieg, N.r.; Holt, J.G. (Eds), The Williams &

Wilkins Company, Baltimore, p:351-361.

HUFF, W.E., HAGLER, Jr.W.M., 1982. Evaluation of Density Segregation as a

Means to Estimate the Degree of Aflatoxin Contamination of Corn. Cereal

Chem., 59:152-153.

125

HUSSEIN, H.S., BRASEL, J.M., 2001. Toxicity, Metabolism and Impact of

Mycotoxins on Humans and Animals. Toxicol., 167:101-134.

İÇ, E., YAVAŞ, İ., 1993. Şaraplarda Aflatoksin Miktarı Üzerine Bir Araştırma. Gıda

(5) 283-287.

JAIMEZ, J., FENTE, C.A., VAZQUEZ, B.I., FRANCO, C.M., CEPEDA, A.,

MAHUZIER, G., PROGNON, P., 2000. Application of the Assay of

Aflatoxins by Liquid Chromatography with Floroscence Detection in Food

Analysis. Journal of Chromatography a. 882:1-10.

JAY, J.M., 1992. Modern Food Microbiology. Chapmen and Hall. London. 675p.

JOHNSON, A.H., PETERSON, M.S., 1974. Encyclopedia of Food Technology.

Vol. 2. The Avi Publishing Company Westport-Connecticut. p:12-15.

KALAYCIOĞLU, L., SERPEK, B., NİZAMLIOĞLU, M., BAŞPINAR, N.,

TİFTİK, A.M., 1998. Biyokimya. Selçuk Üniversitesi, Veteriner Fakültesi

Yayınevi, ISBN:975-448-135-0, Konya, 781s.

KARADENİZ, F., EKŞİ, A. 2002. Gıdalarda Mikotoksin Oluşumu ve Azaltılması.

Dünya Gıda. 7-8: 104-110.

KING, J.M., PRUDENTE, Jr.A.D., 2005. Chemical Detoxification of Aflatoxins in

Food and Feeds (Edited by Hamed K. Abbas). Aflatoxin and Food Safety

CRC Press, ISBN 0-8247-2303-1, p:543-554.

LAWLOR, T.E., HAWORT, S.R., ZEIGLER,E., PARK, D.L., LEE, L.S., 1985.

Mutagenic Potential of Ammonia-related Aflatoxin Reaction Products in

Cottonseed Meal. J. Am. Oil Chem. Soc., 62:1136-1138.

LEE, L.S. KOLTUN, S.P., STANLEY, J.B., 1984. Ammoniation of Aflatoxin B1

in a Pressure “Chamber Used to Decontaminate Toxin Containing Cottonseed

Meal”, J. AOCS, 61, 1607–1608.

LILLEHOJ, E.B., CIEGLER, A., HALL, H.H., 1967. Aflatoxin B1 Uptake by F.

aurantiacum. J. Bacteriology. 93(1), 464-471.

126

LILLEHOJ, E. B., STUBBLEFIELD, R. D., SHANNON, G. M., SHOTWELL,

O. L., 1971. Aflatoxin M1 from aqueous solutions by Flavobacterium

aurantiacum. Mycopathologia and Mycologia Applicata, 45, 259–264.

LIN, L., ZHANG, J., WANG, P., WANG, Y., CHEN, J., 1998. Thin-Layer

Chromatography of Mycotoxins and Comparison with Other

Chromatographic Methods. Journal of Chromatography A, 815 (1998) 3-20.

LINE, J. E., BRACKETT, R. E., 1995a. Factors Affecting Aflatoxin B1 Removal

by Flavobacterium aurantiacum. J. Food Prot. Vol:58, No:1 p:91-94.

LINE, J. E., BRACKETT, R. E., 1995b. Role of Toxin Concentration and Second

Carbon Source in Microbial Transformation of Aflatoxin B1 by

Flavobacterium aurantiacum. J. Food Prot. Vol:58, No:9 p:1042-1044.

LINE, J.E., BRACKETT, R.E., WILKINSON R.E., 1994. Evidence for

Degradation of Aflatoxin B1 by F. aurantiacum, J. Food Prot., 57(1), 788-

791.

LURIE, J., 1975. Handbook of Ansalytical Chemistry (translated from Russian by

Nicholas Bobrow), MIR Publishers, Moscow, USSR, 488p.

MACE, K., 1997. Aflatoxin B1-induced DNA Adduct Formation and p53 Mutations

in CYP-450-expressing Human Liver Cell Lines. Carcinogenesis, 18:1291–

1297.

MAEBA, H., TAKAMOTO, Y., KAMIMURA, M., MIURA, T., 1988.

Destruction and Detoxification of Aflatoxins with Ozone, J. Food Sci., 53,

667–668.

MANN, R., REHM, H.J., 1976. Degradation Products from Aflatoxin B1 by

Corynebacterium rubrum, Aspergillus niger, Trichoderma viride and Mucor

ambiguous, Eur. J. Appl.Microbiol., 2, 297–306.

MARTINS, M.L., MARTINS, H.M., 1999. Naturel and In Vitro Co-pruduction of

Cyclopiazionic Acid and Aflatoxins. J.Food Prot. Volume 62 No:3, p:292-

294.

127

McKENZIE, K.S., SARR, A.B., MAYURA, K., BAILEY, R.H., MILLER, D.R.,

ROGERS, T.D., NORRED, W.P., VOSS, K.A., PLATTNER, R.D.,

KUBENA, L.F., PHILIPS, T.D., 1997. Oxidative Degradation and

Detoxification Using a Novel Source of Ozone. Food Chem.Toxicol., 35:807-

820.

McKENZIE, K.S., KUBENA, L.F., DENVIR, A.J., ROGERS, T.D.,

HITCHENS, G.D., BAILEY, R.H., HARVEY, R.B., BUCKLEY, S.A.,

PHILLIPS, T.D., 1998. Aflatoxicosis in Turkey Poults is Prevented by

Treatment of Naturally Contaminated Corn with Ozone Generated by

Electrolysis, Poultry Sci., 77, 1094–1102.

McLEAN, M., DUTTON, M.F., 1995. Cellular Interactions and Metabolism of

Aflatoxin: an Update. Pharmac Ther. Vol.65, p:163-192.

MERCADO, C.J., REAL, M.P.N., ROSARIO, R.R. DEL, 1991. Chemical

Detoxification of Aflatoxin Containing Copra. J. Food Science, 56 (3) 733-

735.

MILLER, N., PRETORIOUS, H.E., TRINDER, D.W., 1985. Determination of

Aflatoxins in Vegetable Oils. J. Assoc. Off. Ana. Chem. 68: 136–139.

MOERCK, K.E., McELFRESH, P.A., WOHLMAN, HILTON, B.W., 1980.

Aflatoxin Destruction in Corn Using Sodium Bisulfite, Sodium Hydroxide

and Aqueous Ammonia. J. Food Prot. 43:571-574.

MOSS, M.O., 1992. Secondory Metabolism and Food Intoxification, Moulds.

J.Applied Bact. Symposium Supplement. 73:80-88.

NELSON, D.B., 1980. Aflatoxins and Reye’s Syndrome: a Case Control Study.

Pediatrics, 66:865–869.

NOUT, M.J.R., 1989. Effect of Rhizopus and Neurospora spp. on Growth of

Aspergillus flavus and A. parasiticus and Accumulation of Aflatoxin B1 in

Groundnut. Mycol. Res. 93, 518–23.

128

OATLEY, J.T., RARICK, M.D., JI, G.E., LINZ, J. E., 2000. Binding of Aflatoxin

B1 to Bifidobacteria in Vitro, J. Food Prot. 63(8), 1133–6.

OMAYE, S.T., 2004. Food and Nutritional Toxicology. CRC Press, ISBN 1-58716-

071-4, 308p.

ÖZAY, G. 1988. Gıdalarda Mikotoksinler ve Detoksifikasyonu. Gıda (13) 137-141.

ÖZKARSLI, M., 2003. Yer Fıstıklarında AFB1 Üzerine Geleneksel Kavurma ve

Mikrodalgada Kavurmanın Etkisi. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri

Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı. Yüksek Lisans Tezi. 81s.

ÖZKAYA, Ş., 2001. Ülkemizde Aflatoksin Sorunu Yaşanan Bazı Gıdalarda

AFB1’in Azaltılması veya Giderilmesinde Flavobacterium aurantiacum’un

Etkinliğinin Araştırılması. Hacettepe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü

Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı. Doktora Tezi. Ankara. 86s.

ÖZKAYA, Ş., TAYDAŞ, E. E., BAŞARAN, A., AVCI, B., HIZLI, S., 1999.

Mikotoksin Kurs Notları. Tarım Orman ve Köy İşleri Bakanlığı, Ankara İl

Kontrol Labaratuvarı 7-14 Ağustos 1999. Mikotoksin Analiz Kursu. Ankara.

PAPP, E., H-OTTA, K., ZAROY, G., MINSOVICS, E., 2002. Liquid

Chromotografic Determination of Aflatoxins. Microchemical Journal.

(73):39-46.

PARK, D.L., 1993. Controlling Aflatoxin in Food and Feed. Food Tech.. 47:92-96.

PARK, D.L., JEMMALI, M., FRAYSSINET, C., LA-FARGE- FRAYSSINET,

C., YVON, M., 1981. Decontamination of Aflatoxin-contaminated Peanut

Meal Using Monomethylamine-calcium Hydroxide. J. Am. Oil Chem. Soc.

58:995-1002.

PARK, D.L., LEE, L.S., KOLTUN, S.P., 1984. Distribution of Ammonia Treated

Aflatoxin Reaction Products in Cottonseed Meal. J. Am. Oil Chem. Soc.

61:1071-1074.

PARK, D.L., NJAPAU, H., 1989. Contamination Issues and Padding. J. Am. Oil

Chem. Soc., 66:1402-1405.

129

PARKER, W.A., MELNICK, D., 1966. Absence of Aflatoxin from Refined

Vegetable Oils. J. Am. Oil Chem. Soc., 43, 635-638.

PELTONEN, K., EL NEZAMI, H., SALMINEN, S., AHOKAS, J., 2000.

Binding of Aflatoxin B1 by Probiotic Bacteria. J.Food and Agric., 80: 1942-

1945.

PITT, J.I., 2000. Toxigenic fungi: Which are Important? Medical Mycology,

38: 17-22.

PIVA, G., GALVANO, F., PIETRI, A., PIVA, A., 1995. Detoxification Methods

of Aflatoxin. A Review. Nutr. Res., 15(5):767-776.

PLACINTA, C.M., D’MELLO, J.P.F., Mac DONALDS, A.M.C., 1999. A

Review of Worldwide Contamination of Cereal Grains and Animal Feed with

Fusarium Mycotoxins. Anim. Feed Sci. Technol., 78:21-37.

PONS, Jr.W.A., CUCULLU, A.F., LEE, L.S., JANSSEN, H.J., GOLDBLATT,

L.A., 1972. Kinetic Study of Acid Catalyzed Conversion of Aflatoxin B1 and

G1 to B2a and G2a. J.Am.Oil Chem.Soc. 49:124-128.

PREIDES, M., EL NEZAMI, H., PELTANEN, K., SALMINEN, S., AHOKAS,

J., 2000. Ability of Dairy Strains of Lactic Acid Bacteria to Bind AFM1 in a

Food Model. J.Food Prot.. Vol. 63, No.65, p:645-650.

PRICE, R.L., JORGERSEN, K.V., 1985. Effects of Processing on Aflatoxin

Levels and on Mutagenic Potential of Tortillas Made from Naturaly

Contamined Corn. J.Food Sci., 50:347-349.

PRUDENTE, A.D., KING, J.M., 2002. Efficacy and Safety Evaluation of

Ozonation to Degrade Aflatoxin in Corn. J. Food Sci., 67(8), 2866–2872.

RESMI GAZETE, 2008. Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkında Tebliğ. Tebliğ

No: 2008/34. Resmi Gazete 11.06.2008 – 26903.

RICHARD, J. L., 2007. Some Major Mycotoxins and their Mycotoxicoses-An

Overview. International J.Food Microbiology, 119:3–10.

130

RUSTOM, I. Y. S., 1997. Aflatoxin in Food and Feed: Occurrence, Legislation and

Inactivation by Physical methods. Food Chem., Vol. 59 No. 1, p:57-67.

SAMARAJEEWA, U., GAMAGE, T.V., 1988. Combination of Solvent and

Radiation Effects on Degradation of Aflatoxin B1. Mircen J. Appll.

Microbiol. Biotechnol. 4:203-208.

SAMARAJEEWA, U., SEN, A.C., COHEN, M.D., WEI, C.I., 1990.

Detoxification of Aflatoxins in Foods and Feeds by Physical and Chemical

Methods. J.Food Prot., 53(6):489-501.

SCOTT, P.M., 1998. Industrial and Farm Detoxification Methods of Aflatoxins. A

Review. Nutr. Res., 15:767-776

SHANK, R.C., 1971. Aflatoxins in Autopsy of Specimens from Thai Children with

an Acute Disease of Unknown Etiology. Food Cosmet. Toxicol., 9:501–507.

SHANK, R.C., 1977. Epidemiology of Aflatoxin Carcino Genesis, in Environmental

Cancer (Kraybill, H.F. and Mehlman, M.A., Eds.). John Wiley & Sons, New

York, p:291–318.

SHANK, R.C.,1981. Mycotoxins and N-Nitroso Compounds: Environmental Risks.

Vol. I, Shank, R.C., Ed., CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 107–140.

SHANTHA, T., 1999. Fungal Degradation of Aflatoxin B1, Nat. Toxins, 7(5), 175–

178.

SHAPIRA, R.; PASTER, P., 2004. Control of Mycotoxins in Storage and

Techniques for Their Decontamination (Edited by N. Magan and M. Olsen),

Mycotoxins in Food: Detection and Control, CRC Press Boca Raton Boston

New York Washington, DC, p:190-213.

SMILEY, R.D., DRAUGHON, F.A., 2000. Preliminary Evidence that Degradation

of Aflatoxin B1 by Flavobacterium is Enzymatic. J.Food Prot. 63(3), 415-

418.

SMITH, J.E., 2001. Mycotoxins, (Edited by David H. Watson) Food Chemical

Safety, CRC Press ISBN 0-8493-1210-8, p:234-255.

131

SORENSON, W.G., 1981. Aflatoxin in Respirable Corn Dust Particles. J. Toxicol.

Environ. Health, 7:669–672, 1981.

STARK, A.A., 2001. Mechanisms of Action of Aflatoxin B1 at the Biochemical and

Molecular Levels. (Edited by Charles L. Wilson and Samir Droby.),

Microbial Food Contamination. CRC Press. ISBN 0-8493-2229-4, p:81-94.

SUZUKI, T., NORO, T., KAWAMURA, Y., FUKUNAGA, K., WATANABE,

M., OHTA, M., SUGIUE, H., SATO, Y., KOHNO, M., HOTTA, K.,

2002. Decontamination of Aflatoxin Forming Fungus and Elimination of

Aflatoxin Mutagenicity with Electrolyzed NaCl Anode Solution. J. Agric.

Food Chem., 50, 633–641.

SWEENEY, M.J., DOBSON, A.D.W., 1999. Molecular Biology of Mycotoxin

Biosynthesis. FEMS Microbiology Letters. 175:149-163.

ŞAHİN, İ., 1990. Mikrobiyolojiye Giriş. Eser Matbaası. 237s

TAKASHI, T., 1993. Aflatoxin Contamination in Nutmeg: Analysis of Interfering

TLC Spots. J.Food Sci.Vol. 58 No:1 p:197.

TEBBUTT, P., 1995. Basic Mathematics For Chemists. John Willey&Songs,

Chichester, England, 244p.

TEMİZ, A., 1994. Genel Mikrobiyoloji Uygulama Teknikleri. Şafak Matbaacılık

Ltd. Şti. Birinci Baskı.266s. Ankara.

TENIOLA, O.D., ADDO, P.A., BROST, I.M., FÄRBER, P., JANY, K.D.,

ALBERTS, J.F., VAN ZYL, W.H., STEYN, P.S., HOLZAPFEL, W.H.,

2005. Degradation of Aflatoxin B1 by Cell-Free Extracts of Rhodococcus

erythropolis and Mycobacterium fluoranthenivorans sp. nov. DSM44556T.

International Journal of Food Microbiology, 105:111 – 117.

TGK, 2009. Türk Gıda Kodeksi Gıda Maddelerindeki Bulaşanların Maksimum Limitleri

Hakkında Tebliğ (TEBLİĞ NO: 2008/26) Resmi Gazete Tarihi: 16 Şubat

2009 - Sayı : 27143.

132

TORRES, P., GOMEZ-ORTIZ, M., RAMIREZ-WENG, B., 2001. Revising the

Role of pH and Thermal Treatments in Aflatoxin Content Reduction During

the Tortilla and Deep Frying Processes. J. Agric. Food Chem., 49, 2825–

2829.

TUNAİL, N., 2000. Mikrobiyel Enfeksiyonlar ve İntoksikasyonlar. (Editör:

A.Ü.Z.F. Gıda Müh. Öğretim Üyeleri) Gıda Mikrobiyolojisi ve

Uygulamaları. Geliştirilmiş 2. Baskı. Sim Matbaacılık Ltd. Şti. Ankara s:81-

185.

UENO, Y. 1985. The Toxicology of Mycotoxins. Critical Reviews in Toxicology.

14(2):99-132.

VAN GENDEREN, H. 1997. Adverse Effects of Naturally Occurring Nonnutritive

Substances (Edited by John De Vries). Food Safety and Toxicity, CRC Press,

ISBN 0-8493-9488-0, p:153-168.

VAN IMPE, J.F., NICOLAI, B.M, MARTENS, T., DE BAERDEMAEKER, J.,

VANDEWALLE, J., 1992. Dynamic Mathematical Model to Predict

Microbial Growth and Inactivation during Food Processing, Appl. Environ.

Microbiol., 58(9):2901-2909.

VAN NIEUWENHUIZE, J.P., 1973. Aflatoxinen: Epidemiologish Onderzoek Naar

Carcino Geniteit bij Langdurige “Low Level” Exposite van eon

Fabriekspopulatie. T. Soc. Geneesk, 51:754–760.

VAN RENSBURG, S.J., 1977. Role of Epidemiology in Causation of Mycotoxin

Health Risk, in Mycotoxins in Human and Animal Health, Rodricks (J.V.,

Hesseltine, C.W., and Mehlman, M.A., Eds.) Pathotox, Park Forest South, IL,

pp. 699–711.

WANG, J.S., GROOPMAN, J.D., 1999. DNA Damage by Mycotoxins. Mutation

Researh. 424:167-181.

WATANABE, C.M.H., TOWNSEND, C.A., 2002. Initial Characterization of a

tType I Fatty Acid Synthase and Polyketide Synthase Multienzyme Complex

NorS in the Biosynthesis of Aflatoxin B1. Chem Biol. ;9 (9):981-988.

http://lib.bioinfo.pl/auth:Watanabe,CMH�

http://lib.bioinfo.pl/auth:Townsend,CA�

133

WATTANAPAT, R., NAKAYAMA, T., BEUCHAT, L.R., 1995. Characteristics

of Acid Hydrolysate from Defatted Peanut Flour. J. Food Sci., 60, 443–445.

WATTS, B.M., YLIMAKI, G.L., JEFFERY, L.E., ELIAS, L.G., 1989. Basic

Sensory Methods for Food Evaluation. The International Development

Research Center Ottowa, Canada, 160p.

WEEKS, O.B., 1974. Flavobacterium: Bergey’s Manuel of Determinative

Bacteriology, Vol:1, (Edited by Buchanan, R.E. and Gibbons, N.E.) The

Williams & Wilkins Company, Baltimore, p:357-364.

WEI, C.I., COOK, D.L., KIRK, J.R., 1985. Use of Chlorine Compounds in the

Food Industry. Food Technol. 39:107-115.

WENG, C.Y., MARTINEZ, A.J., PARK, D.L., 1994. Efficacy and Permanency of

Ammonia Treatment in Reducing Aflatoxin Levels in Corn. Food Addit.

Contamin. 11, 649–658.

WILLIAMS, K.R., DUTTON, M.F., 1988. Destruction of Aflatoxin During the

Production of Hydrolysed Vegetable Protein, J. Food Prot., 51, 887–891.

YAGEN, B., HUTCHINS, J.E., COX, R.H., HAGLER, W.M., HAMILTON,

P.B., 1989. Aflatoxin B1S: revised Structure for the Sodium Sulfanate

Formed by Destruction of Aflatoxin B1 with Sodium Bisulfite. J. Food Prot.

52:574-577.

YASSIN, A.F., SCHAAL, K.P., 2005. Reclassification of Nocardia

corynebacterioides Serrano et al. 1972 (Approved Lists 1980) as

Rhodococcus corynebacterioides comb. nov. International Journal of

Systematic and Evolutionary Microbiology (2005), 55, 1345–1348.

YILMAZ, A., ÖZAY, G., 2001. Gıda ve Yemlerde Mikotoksin Detoksifikasyonu.

Gıda Dergisi, 7:80-84.

ZORLUGENÇ, B., KIROĞLU ZORLUGENÇ, F., ÖZTEKİN, S., EVLİYA,

İ.B., 2008. The Influence of Gaseous Ozone and Ozonated Water on

134

Microbial Flora and Degradation of Aflatoxin B1 in Dried Figs. Food and

Chem. Toxicology. 46, 3593-3597. DOI: 10.1016/j.fct.2008.09.003

ZWIETERING, M.H., JONGENBUGER, I., ROMBOUTS, F.M., VAN’T

RIET, K., 1990. Modelling of the Bacterial Growth Curve. Appl. Environ.

Microbiol. 56:1875-1881.

135

ÖZGEÇMİŞ

1971 yılında Adana’da doğdum. İlk ve orta öğrenimimi aynı şehirde

tamamladım. 1990 yılında Çukurova Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümünü

kazandım ve 1994 yılında bu bölümden mezun oldum. Aynı yıl Çukurova

Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında yüksek

lisans öğrenimime başladım. 1996 yılında Ç.Ü. F.B.E. Gıda Müh. Anabilim Dalında

araştırma görevlisi olarak göreve başladım. 1999 yılında yüksek lisans öğrenimi

tamamladım ve aynı yıl Ç.Ü. F.B.E. Gıda Müh. Anabilim Dalında Doktora

öğrenimine hak kazandım. 2005 yılında doktora öğrenimime ara vererek askerlik

görevimi tamamladım. 2009 yılında, Ç.Ü. Ziraat Fakültesine mühendis olarak

atandım. Halen Ç.Ü. Biyoteknoloji Merkezinde, Gıda Yüksek Mühendisi olarak

çalışmaktayım.

EK-1

136

EKLER

2000 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 0. saat kontrol (öğütülmüş fındık) örneğine ait

kromatogram

500 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 6. saat PFT örneğine ait kromatogram

EK-1

137

500 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 24.saat bütün kırmızı biber örneğine ait kromatogram

1000 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 24. saat öğütülmüş kırmızı biber örneğine ait

kromatogram

EK-1

138

2000 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 48. saat bütün mısır örneklerine ait kromatogram

500 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 6. saat bütün siyah zeytin örneğine ait kromatogram

EK-1

139

500 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 12. saat bütün soya fasulyesine ait kromatogram

1000 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 12. saat öğütülmüş soya fasulyesine ait kromatogram

EK-1

140

500 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 0. saat öğütülmüş kuru incir örneğine ait

kromatogram

1000 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 12. saat bütün kuru incir örneğine ait kromatogram

EK-1

141

2000 ng g-1 aflatoksin B1 içeren 48. saat öğütülmüş fındık örneğine ait kromatogram

Çukurova Ünİversİtesİ fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ doktora...

Documents