Çukurova Ün İvers İtes İ fen b İlİmler İ enst İtÜsÜ...

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

Şebnem PARLAK GIDA KORUYUCU MADDESİ OLAN BİFENİL’İN İNSAN LENFOSİTLERİNDE KARDEŞ KROMATİD DEĞİŞİMİ, KROMOZOM ANORMALLİĞİ VE MİKRONÜKLEUS OLUŞUMU ÜZERİNE ETKİLERİ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ADANA, 2007

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

GIDA KORUYUCU MADDESİ OLAN BİFENİL’İN İNSAN LENFOSİTLERİNDE KARDEŞ KROMATİD DEĞİŞİMİ, KROMOZOM

ANORMALLİĞİ VE MİKRONÜKLEUS OLUŞUMU ÜZERİNE ETKİLERİ

Şebnem PARLAK



Bu tez 11/01/2007 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir.

İmza…………………. İmza…………………. İmza……………………

Doç.Dr.Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Prof.Dr.Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU

DANIŞMAN ÜYE ÜYE

Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır.

Kod No Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ

Enstitü Müdürü İmza ve Mühür

Bu Çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FEF2006YL22 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

I

ÖZ


GIDA KORUYUCU MADDESİ OLAN BİFENİL’İN İNSAN LENFOSİTLERİNDE KARDEŞ KROMATİD DEĞİŞİMİ, KROMOZOM

ANORMALLİĞİ VE MİKRONÜKLEUS OLUŞUMU ÜZERİNE ETKİLERİ

Şebnem PARLAK

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ


Danışman : Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI

İkinci Danışman : Doç. Dr. Hasan Basri İLA

Yıl : 2007, Sayfa: 72

Jüri : Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI

Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ

Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU

Bu çalışmanın amacı, besinlerde antimikrobiyal madde olarak kullanılan

Bifenil’in genotoksik etkisinin olup olmadığını insan periferal lenfositlerinde kardeş kromatid değişimi (KKD), kromozom anormalliği (KA) ve mikronükleus (MN) testleri ile araştırmaktır. Bu amaçla insan periferal lenfositleri bifenil’in 4 farklı konsantrasyonu (10, 30, 50 ve 70 µg/ml) ile 24 ve 48 saat boyunca muamele edilmişlerdir.

Bu çalışmada farklı konsantrasyonlardaki bifenil ile 24 ve 48 saatlik sürelerde muamele edilen insan periferal lenfositlerinde KKD, KA ve MN sayısı hem muamelesiz kontrole hem de çözücü kontrole (DMSO) göre istatistiksel olarak önemli derecede artmıştır. Bu artışın genellikle doza bağlı olduğu görülmüştür. Ancak bu artışlar pozitif kontrol olan MMC’deki kadar olmamıştır. Bifenil, sadece kromozom yapı anormalliğini artırmış, kromozom sayı anormalliğini ise artırmamıştır. Bu çalışmada bifenil, hem 24 saatlik hem de 48 saatlik muamele sürelerinde replikasyon indeksi (RI) ve nükleer bölünme indeksi (NBI)’ni her iki kontroldekine göre önemli ölçüde düşürmüş ve bu düşüş doza bağlı olarak gerçekleşmiştir. Fakat bifenil mitotik indeks (MI)’i etkilememiştir.

Anahtar Kelimeler:Bifenil, İnsan periferal lenfositleri, Kardeş kromatid değişimi,

Kromozom anormallikleri, Mikronükleus

II

ABSTRACT

MSc THESIS

THE EFFECTS OF FOOD PROTECTOR BIPHENYL ON SISTER CHROMATID EXCHANGE, CHROMOSOME ABERRATION AND

MICRONUCLEUS IN HUMAN LYMPHOCYTES

Şebnem PARLAK

DEPARTMENT OF BIOLOGY

INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES

UNIVERSITY OF ÇUKUROVA

Supervisor : Assoc. Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI

Co Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Hasan Basri İLA

Year : 2007, Pages: 72

Jury : Assoc. Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI

Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ

Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU

The aim of this study was to determine the possible genotoxic effects of

biphenyl, which is used as an antimicrobial agent in food, by using sister chromatid exchanges (SCEs), chromosome aberrations (CAs) and micronucleus (MN) tests in human peripheral lymphocytes. The human peripheral lymphocytes were treated with four concentrations of biphenyl (10, 30, 50 ve 70 µg/ml) for 24 and 48 hours treatment periods.

In the present study, biphenyl significantly increased the frequency of SCEs, CAs and the frequency of MN when compared with both untreated control and solvent (DMSO) control. The induction of these abnormalities were in a dose-dependent manner. However, the potency of biphenyl on induction of SCEs, CAs and MN were lower than that caused by the positive control MMC. Biphenyl was capable to induce the structural CAs instead of numerical CAs. Biphenyl also showed a cytotoxic effect by decreasing the replication index (RI) and nuclear division index (NDI) in a dose dependent manner for both 24 and 48 hours treatment periods. However, biphenyl did not affect the mitotic index (MI).

Key Words: Biphenyl, Human peripheral lymphocytes, Sister chromatid exchange,

Chromosome aberration, Micronucleus

III

TEŞEKKÜR

Tez konumun belirlenmesi, yürütülmesi ve bütün çalışmalarım boyunca

bana rehber olan, ilgi ve yardımlarını esirgemeyen, öğrencisi olmaktan onur ve

mutluluk duyduğum Sayın Hocam Doç. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI’ na

sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

Yardımlarından dolayı Biyoloji Bölüm Başkanı Sayın Hocam Prof. Dr.

Mehmet TOPAKTAŞ’ a ve ikinci danışmanım Doç. Dr. Hasan Basri İLA’ ya,

Arş.Grv. Ayşe YAVUZ, Biyolog Ümit ZAN ve Biyolog Semir CANIMOĞLU’ na

teşekkür ederim.

Ayrıca bütün çalışmalarım boyunca desteğini ve yardımlarını hiç

esirgemeyen değerli arkadaşım Uzman Biyolog Sebile AZIRAK’ a sonsuz

teşekkürlerimi sunarım.

Evlatları olmaktan büyük gurur ve mutluluk duyduğum sevgili annem ve

babama, yüksek lisans eğitimim süresince destek ve yardımlarını devamlı üzerimde

hissettiğim sevgili ablam ve enişteme sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

Projemizi maddi yönden destekleyen Ç.Ü. Araştırma Fonu yöneticilerine de

teşekkür ederim.

IV

İÇİNDEKİLER SAYFA

ÖZ………………………………………………………………………………. I

ABSTRACT.……………………………….…………………………………. II

TEŞEKKÜR……………………………………….…………………………… III

İÇİNDEKİLER ………………………………………………………………. IV

ÇİZELGELER DİZİNİ…….………………………………………………….VIII

ŞEKİLLER DİZİNİ…………………………………………………………. IX

SİMGELER VE KISALTMALAR.…………………………………………. XII

1.GİRİŞ………………………………………………………………………… 1

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR………………………………………………….. 7

2.1. Benzoik Asit ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları.............................. 7

2.2. Bifenil, sodyum-ortofenil-fenol ile Yapılan Genotoksisite

Çalışmaları................................................................................................. 7

2.3. Borik asit ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları..................................... 8

2.4. Lisozim ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları........................................ 9

2.5. Nisin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları............................................. 9

2.6. Propiyonik asit [(2-hydroxy-(1-N-nitrosoindole)] ile

Yapılan Genotoksisite Çalışmaları........................................................... 9

2.7. Sodyum benzoat ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları..................... 10

2.8. Sodyum nitrit ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları.............................. 11

2.9. Sorbatlar ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları...................................... 12

2.9.1. Sorbik asit ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları.......................... 12

2.9.2. Kalsiyum sorbat ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları................. 13

2.9.3. Potasyum sorbat ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları................. 13

2.9.4. Sodyum sorbat ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları................... 14

2.10. Sulfitler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları....................................... 14

2.11. Tiabendazol ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları............................... 15

3. MATERYAL VE METOD………………………………………………… 17

3.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları……………….. 17

V

3.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler………………………………….. 17

3.1.1.1. Bifenil……………………………………………………... 17

3.1.1.2. Dimethyl Sulfoxide (DMSO)................................................ 18

3.1.1.3. Kromozom Medyumu……………………………………... 18

3.1.1.4. Kolşisin (Kolkisin).………………………………………... 19

3.1.1.5. Hipotonik Eriyik…………………………………………… 19

3.1.1.6. Fiksatif…………………………………………………….. 19

3.1.1.7. 5’-Bromo-2’-deoxyuridine (BrdUrd)……………………. 20

3.1.1.8. Sorensen Tamponu (Sorensen Buffer)…………………….. 20

3.1.1.9. Standart Saline Citrate (SSC) Eriyiği……………………… 20

3.1.1.10. Giemsa…………………………………………………….. 21

3.1.1.11. Entellan…………………………………………………… 21

3.1.1.12. Nitrik Asit (HNO3)………………………………………. 21

3.1.1.13. Mitomycin C (MMC)…………………………………….. 21

3.1.2. Kullanılan Deney Ekipmanları………………………………….. 22

3.1.2.1. Hassas Terazi………………………………………………. 22

3.1.2.2. Santrifüj……………………………………………………. 22

3.1.2.3. Mikroskop…………………………………………………. 22

3.1.2.4. İnkübatör………………………………………………….... 22

3.1.2.5. pH Metre…………………………………………………… 22

3.2. Lamların Temizlenmesi………………………………………............... 23

3.3. Kardeş Kromatid Değişimini (KKD) (Sister Chromatid Exchange=

SCE) ve Kromozom Anormalliklerini (KA) (Chromosomal

Aberration=CA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması,

Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi, Preparatların

Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İncelemeler………………... 23

3.3.1. Kardeş Kromatid Değişimini (KKD) ve Kromozom

Anormalliklerini (KA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün

Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi ve

Preparatların Hazırlanması………………………………………….. 23

3.3.2. Preparatların Boyanması…………………………………………. 25

VI

3.3.3. Mikroskobik İnceleme…………………………………………… 26

3.3.3.1. KKD ve Replikasyon İndeksinin (RI) (Proliferasyon

İndeksi=PI) Saptanması………………………………………….. 26

3.3.3.1.(1). KKD Sayısının Saptanması …………………..... 26

3.3.3.1.(2). Replikasyon İndeksinin (RI) (Proliferasyon

İndeksi=PI) Saptanması………………………………………. 27

3.3.3.2. Kromozomal Anormallikler (KA) ve Mitotik İndeksin

(MI) Saptanması………………………………………………….. 32

3.3.3.2.(1). Kromozom Yapı ve Sayı Anormalliklerinin

Saptanması ……………………………………………………. 32

3.3.3.2.(2). Mitotik İndeksin (MI) Saptanması…………………… 33

3.4.. Mikronukleus (MN) Oluşumunu Saptamak Amacıyla Hücre

Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi,

Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İncelemeler… 33

3.4.1. Mikronukleus Sayısını Saptamak Amacıyla Hücre

Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave

Edilmesi ve Preparatların Hazırlanması……………………………. 33

3.4.2. Preparatların Boyanması…………………………………………. 35

3.4.3. Mikroskobik İnceleme…………………………………………… 35

3.5. Mikroskopta Fotoğraf Çekme…………………………………………. 36

3.6. İstatistik Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi……………………. 37

4.BULGULAR………………………………………………………………… 38

4.1. Bifenil’in KKD Üzerindeki Etkileri…………………………………... 38

4.2. Bifenil’in Kromozomal Anormalliklerin (KA) Oluşumu

Üzerindeki Etkileri……………………………………………………… 40

4.3. Bifenil’in Mikronükleus (MN) Oluşumu Üzerine Etkileri…………….. 46

4.4. Bifenil’in DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki

Etkileri…………………………………………………………………... 51

VII

5. TARTIŞMA…………………………………………………………………. 55

5.1. Bifenil’in KKD, KA ve MN Oluşumu Üzerindeki Etkileri…………..... 55

5.2. Bifenil’in DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki Etkileri. 58

6. SONUÇ VE ÖNERİLER………………………………………………….. 60

KAYNAKLAR………………………………………………………………… 61

ÖZGEÇMİŞ……………………………………………………………………. 72

VIII

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA

Çizelge 4.1. Değişik dozda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan

periferal lenfositlerinde ortalama KKD sayısı…..………………… 38

Çizelge.4.2. Değişik dozda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan

periferal lenfositlerinde yapısal kromozom anormallikleri………… 41

Çizelge 4.3. Değişik dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş

insan periferal lenfositlerinde mikronükleuslu binükleer hücre

yüzdesi ve nükleer bölünme indeksi……………………………... 47

Çizelge 4.4. Değişik dozda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan

periferal lenfositlerinde RI ve MI…..……………………………… 52

IX

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA

Şekil 3.1. Kardeş kromatid değişiminin olduğu ve olmadığı durumun şematik

olarak gösterilmesi…………………………………………………... 27

Şekil 3.2. Deoxytimidin (dT), Bromodeoxyuridin (BrdUrd) ve

Deoxyuridin (dU)’in kimyasal yapıları……………………………… 28

Şekil 3.3. BrdUrd’in DNA yapısına girmesi ile 1., 2. ve 3. mitoz bölünmeyi

geçiren hücrelerin ayırt edilmesinin şematik olarak açıklanması. …… 30

Şekil 3.4. Birinci mitoz bölünmeyi geçiren hücreye ait kromozomlar.x1000… 31

Şekil 3.5. İkinci mitoz bölünmeyi geçiren hücreye ait kromozomlar.x1000…… 31

Şekil 3.6. Üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücreye ait kromozomlar.x1000… 32

Şekil 3.7. Bir, iki, üç ve dört nükleus içeren hücreler........................................... 36

Şekil 4.1. Farklı dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan

periferal lenfositlerinde KKD/Hücre ……..…….……………………. 39

Şekil 4.2. Farklı dozlarda bifenil ile 24 saat muamele edilen insan

periferal lenfositlerinde KKD/Hücre’nin doza bağlı artışını

gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05)…... 39


periferal lenfositlerinde KKD/Hücre’nin doza bağlı artışını

gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05)……. 40

Şekil 4.4. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde

11 KKD içeren hücre (30 µg/ml, 48 saat, ♀). x1000………………. 40

Şekil 4.5. Farklı dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan

periferal lenfositlerinde yapısal KA yüzdesi……………………….. 42


periferal lenfositlerinde yapısal KA yüzdesinin doza bağlı artışını

gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05)… 42


kromatid kırığı (50 µg/ml, 24 saat, ♂).x1000………………………. 43


kromozom kırığı (30 µg/ml, 24 saat, ♂).x1000…………………….. 44

X


kardeş kromatid birleşmesi ve kromatid kırığı

(70 µg/ml, 24 saat, ♀).x1000…………………………………………. 44


kromatid değişimi (30 µg/ml, 24 saat, ♂).x1000…………………….. 45


poliploid hücre (30 µg/ml, 48 saat, ♀). x1000……………………….. 45


periferal lenfositlerinde mikronükleuslu iki nükleuslu hücre

yüzdesi..…………………………………………………………… 48


periferal lenfositlerinde mikronükleuslu iki nükleuslu hücre

yüzdesinin doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve

korelasyon katsayısı (* P<0.05)…………………………………… 48


periferal lenfositlerinde iki nükleuslu hücre başına düşen MN

sayısının doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve

korelasyon katsayısı (* P<0.05)……………………………………. 49

Şekil 4.15. Bifenil ile muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde

tek mikronükleus içeren iki nükleuslu hücre (30 µg/ml, 48 saat, ♀)… 49

Şekil 4.16. Bifenil ile muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde

iki mikronükleus içeren iki nükleuslu hücre (10 µg/ml, 48 saat, ♀)…. 50


periferal lenfositlerinde nükleer bölünme indeksi…………………… 51


periferal lenfositlerinde nükleer bölünme indeksinin doza bağlı

düşüşünü gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı

(* P<0.05)………………………………………………………….. 51


periferal lenfositlerinde RI…………………………………………. 53

XI


periferal lenfositlerinde MI…………………………..……………… 53


periferal lenfositlerinde MI’in doza bağlı düşüşünü gösteren

regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05)………….. 54


periferal lenfositlerinde MI’in doza bağlı düşüşünü gösteren

regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05)………… 54

XII

SİMGELER VE KISALTMALAR

ADI: Günlük Kullanılabilir Miktar (Acceptable Daily Intake)

B’: Kromatid Tipi Kırık

B’’: Kromozom Tipi Kırık

BrdUrd: 5’-Bromo-2’-Deoxyuridine

CA: Chromosome Aberration

CHO: Çin Hamster Ovaryum

CHL: Çin Hamster Lenfosit

DS: Disentrik Kromozom

dT: Deoxytimidin

dU: Deoxyuridine

DNA: Deoksiribonukleik Asit

i.p.: İntraperitonal

KA: Kromozomal Anormallikler

KCl: Potasyum klorür

KD: Kromatid Değişimi

KKD: Kardeş Kromatid Değişimi

MMC: Mitomycin C

MI: Mitotik indeks

NaCl: Sodyum klorür

P: Poliploidi

RI: Replikasyon indeksi

rpm: Round (Rotor) Per Minute (devir/dakika)

SCD: Kardeş kromatidlerin farklı boyanması

SCE: Sister Chromatid Exchange

SSC: Standart Saline Citrate

SU: Sister Union

UV: Ultraviole (Morötesi)

WHO: Dünya Sağlık Teşkilatı (World Health Organisation)

FAO: Gıda Tarım Örgütü (Food and Agriculture Organisation)

1. GİRİŞ Şebnem PARLAK

1

1.GİRİŞ

Tüketime sunulan veya sunulacak olan gıdaların görünüm ve lezzetlerini

tüketicinin arzu ettiği duruma getirmek, bozulmalarını önleyerek, gıdaların raf

ömrünü uzatmak amacıyla, tüketime sunulmadan önce bilinçli ve amaçlı olarak

gıdalara ilave edilen maddelere gıda katkı maddeleri denilmektedir. Gıda katkı

maddeleri, gıdalarda mikrobiyolojik bozulmayı önleme ve dayanıklılığı arttırma,

besleyici değeri koruma, teknolojik işlemlere yardımcı olma, renk, görünüş, lezzet,

koku gibi duyusal özellikleri düzeltme gibi pek çok amaçla katılan maddelerdir

(Altuğ, 1999).

Gıda katkı maddelerinin kullanılması ile ilgili tarihsel gelişmeler

incelendiğinde, M.Ö. 3000 yıllarında et ürünlerini kürlemede tuzdan yararlanıldığı,

M.Ö. 900 yıllarında ise tuz ve odun tütsüsünün gıda saklama yöntemleri olarak

kullanıldıkları görülmektedir. Ortaçağlarda etlere koruyucu amaçla tuz ve tütsünün

yanı sıra katılan nitratın etin rengini olumlu yönde değiştirmek ve bozulmayı

önlemek amacıyla kullanıldığı bilinmektedir. M.Ö. 50’li yıllarda baharatlardan lezzet

verici olarak yararlanılmış, gıda boyaları ise günümüzden yaklaşık 3500 yıl kadar

önce Mısırlılar tarafından renklendirici amaçla kullanılmışlardır. 19. yüzyıldaki hızlı

şehirleşmenin paralelinde katkı maddelerinin kullanımları, özellikle gıdaları

bozulmalara karşı koruma amacıyla yaygınlaşmış olup günümüzde ise bu maddeler

gelişen gıda teknolojisinin vazgeçilmez bir parçasını oluşturmuşlardır ( Altuğ, 1999).

Belirli görevleri olan çok çeşitli gıda katkı maddeleri [renklendiriciler,

antimikrobiyal maddeler, tatlandırıcılar, emülsifiyerler (yağlarla suyun karışımını

sağlayan maddeler), enzimler, pH’yı kontrol eden maddeler, koku vericiler gibi]

vardır.

İnsanların toplu halde yaşamaya başlamaları ile birlikte gıdaların korunması

amacıyla güvenilir yöntemlerin kullanılması gereksinimi ortaya çıkmıştır. Tarımsal

uygulamalardaki değişiklikler, dayanıksız gıdaların diyette fazlaca yer alması,

gelişmiş dağıtım sistemlerindeki kontaminasyon olasılığının artması, kolay ve pratik

gıdalara yönelme gibi nedenler gıdaları koruma tekniklerinin gelişmesini zorunlu

kılmıştır. Endüstride kullanılan koruma yöntemlerinin başlıcaları ısıtma, dondurma,


2

kurutma ve ışınlamadır. Ancak bunların uygulanamadığı ya da yetersiz kaldığı

durumlarda gıdalara koruyucu madde katılımı söz konusu olmaktadır. Koruyucu

maddeler, gıdayı mikroorganizmaların sebep olduğu bozulmalara karşı koruyarak,

gıdanın raf ömrünü uzatan kimyasal maddeler olarak tanımlanmaktadır. Tuz, şeker

ve sirke yüzyıllar boyunca gıdalardaki mikrobiyal bozulmaları önlemek amacıyla

kullanılan maddeler olmakla birlikte, günümüzde katkı maddesi olarak

nitelendirilmemektedirler.

Koruyucuların antimikrobiyal özellikleri; maddenin antimikrobiyal spektrumu,

kimyasal ve fiziksel özellikleri, konsantrasyonu, etki şekli, gıdanın bileşimi, işlem

şartları, pH’sı ve depolama sıcaklığı gibi faktörlere bağlıdır. Kimyasal koruyucular

mikroorganizmaları birçok mekanizma ile etkilemektedir. Bunlar; proteinlerin

denatürasyonu, enzimlerin inhibisyonu, DNA’nın, hücre çeperinin ya da sitoplazmik

membranın tahrip edilmesi veya değiştirilmesi, hücre duvarı sentezinin baskılanması

ya da esansiyel metabolitlerle rekabet şeklinde olabilmektedir.

Koruyucular meyve-sebze ürünlerinde, et ve et ürünlerinde, su ürünlerinde, süt

ürünlerinde, margarinlerde, hububat ürünlerinde ve alkollü içecekler gibi pek çok

alanda kullanılmaktadır. Bu alanlardan meyve sebze teknolojisi, reçel ve marmelat

üretiminden kurutulmuş meyve sebze üretimine uzanan geniş bir uygulama alanını

kapsamakta olup, kullanılan koruyucular da geniş spektrum göstermektedirler. Taze

meyvelerin korunmasında kullanılan fungisitler, meyvelerin çürümesini engellemek

amacıyla, genellikle ambalaj materyallerine uygulanarak kullanılmaktadır.

Son 30 yıldır gelişmiş ülkeler başta olmak üzere, yiyecek maddelerinde

kullanılan katkı maddelerinde tam bir patlama olmuştur. Örneğin sadece İngiltere'de

bir yıl içinde kullanılan katkı maddelerinin iki yüz bin tonu geçtiği sanılıyor. Çoğu

aroma/lezzetlendirici olmak üzere toplam altı bin civarında katkı maddesi bulunuyor.

Bu maddelerin tüketimi arttıkça, bazı rahatsızlıklarla olan bağlantılara yönelik

bulgular da ortaya çıkmıştır. Bunların içinde en sıkça görünenleri egzema, astım, baş

ağrısı, alerjik kaşıntılar, gastrik rahatsızlıklar, ishal (özellikle çocuklarda),

hiperaktiflik ve aşırı duyarlılık vb. Gıda katkı maddelerinin bu muhtemel etkileri

yanında çok ciddi olan ve gelecek nesillerin sağlıksız olmasına sebep olabilecek

diğer bir tehlike de mutasyon veya kanser oluşturma riskleridir.


3

Günümüzde birçok gıda katkı maddesinin çeşitli test sistemleriyle mutajen

oldukları hatta bazılarının kanser oluşumuna da sebep oldukları bildirilmiştir (Abe ve

Sasaki, 1977; Wolff ve Rodin, 1978; Leonard ve Leonard, 1979; Rao ve ark., 1979;

Suzuki ve Suzuki, 1988; Munzer ve ark., 1990; Akın ve Sümer, 1991; Chlopkiewicz

ve ark., 1995; Matsui ve ark., 1996; Mukherjee ve Chakrabarti, 1997; Rencüzoğulları

ve ark., 2001a; Rencüzoğulları ve ark., 2001b; Sasaki ve ark., 2002).

Bu gıda katkı maddelerin pek çok amaçla kullanılmalarının yanında, bunların

insan genomunda mutasyonlara sebep olup olmadıklarının ortaya çıkarılması da son

derece önemlidir. Bir kimyasal maddenin böyle bir etkisinin olup olmadığının

belirlenmesi, kısa süreli genotoksisite testleri ile mümkün olabilmektedir. Bugün kısa

süreli genotoksisite testleri olarak bilinen ve bir kimyasal maddenin genotoksik olup

olmadığının belirlenmesinde kullanılan metodlar; kardeş kromatid değişimi (KKD)

(Sister Chromatid Exchange=SCE), kromozom aberasyonu (KA) (Chromosome

Aberration=CA) ve mikronükleus (MN) testleridir. Perry ve Evans (1975)’in bilinen

mutajen ve kanserojenlerin Chinese hamster (Cricetulus griseus = Çin kemiricisi)

yumurta (CHO) hücrelerinde KKD ve KA’yı uyardığını saptamalarından sonra bu

testler mutajen ve kanserojenlerin belirlenmesinde kullanılmaya başlanmıştır. Daha

sonra Carrano ve ark. (1978) mutajen ve kanserojenlerin toksik dozlarının altında

meydana getirdikleri genetik hasarın süratle gösterilmesinin KKD ve KA analizleri

ile mümkün olabileceğini, ayrıca bir maddenin mutasyon meydana getirmesi ile

KKD oluşumunu artırması arasında doğrusal bir ilişkinin olduğunu da

belirtmişlerdir.

Kısa süreli genotoksisite testleri kullanılarak antimikrobiyal olarak kullanılan

maddelerin genotoksik etkilerinin olup olmadığını ortaya çıkarmaya çalışan pek çok

bilimsel çalışma mevcuttur. Abe ve Sasaki (1977), Potasyum ve sodyum sorbat’ın

Chinese hamster hücrelerinde yüksek konsantrasyonlarda KA ve KKD’ni artırdığını

saptamışlardır. Tohda ve ark. (1980), Benzoik asitin insan lenfoblastoid hücrelerinde

sitotoksik etkiye sahip olduğunu saptamışlardır. Hasegawa ve ark. (1984), Sorbik asit

ve onların sodyum ve potasyum tuzlarının kültür edilmiş Chinese hamster V79

hücrelerinde kardeş kromatid değişimini, kromozom anormalliğini ve gen

mutasyonlarını arttırdığını bulmuşlardır. Munzer ve ark. (1990), Potasyum sorbat ve


4

sodyum sorbat’ın genotoksisitesini Ames testi, Chinese hamster ovaryum

hücrelerinde HGPRT (hipoksantin guanin fosforibozil transferaz) ve sıçanlarda

kardeş kromatid değişim testi ve Chinese hamster kemik iliği hücrelerinde

mikronükleus testlerini kullanarak araştırmışlardır. Her iki kimyasal maddenin in

vitro testlerde bir genotoksisite göstermediğini, in vivo testlerde ise bu maddelerin

taze hazırlanmış eriyiklerinin hiçbir klastojenik etki göstermemesine rağmen,

bekletilmiş eriyiklerde böyle bir etkiye sahip olduklarını göstermişlerdir. Ishidate ve

Odashima (1977), kültür edilmiş Chinese hamster hücrelerinde içinde gıda katkı

maddelerinin de bulunduğu 134 çeşit kimyasal maddenin genotoksik etkisini

araştırmış ve bunlardan potasyum benzoat ve sodyum bezoat’ın kromozom

aberasyonu testinde pozitif sonuç verdiğini bulmuşlardır. Schlatter ve ark. (1992),

Potasyum sorbat’ın 2.5 mg/ml dozda Chinese hamster V79 hücrelerinde mitotik

indeksi (MI) düşürdüğünü saptamışlardır. Ishidate ve Odashima (1977), sodyum

nitrit ve sodyum nitrat’ın Chinese hamster fibroblast hücrelerinde kromozom testinde

pozitif sonuç verdiğini saptamışlardır. Meng ve Zhang (1992), sodyum

metabisülfit’in insan lenfosit hücrelerinde KA, KKD ve mikronükleus oluşumunu

artırdığını bulmuşlardır. Mukherjee ve ark. (1988), sorbik asitin ve sodyum nitritin,

fare kemik iliği hücrelerinde tek başlarına ve birbirleriyle karışım halindeyken

etkilerini araştırmışlar ve sorbik asitin yüksek dozlarda KKD’ni ve mikronükleusu

artırdığını, sodyum nitritin ise tüm dozlarda KKD’ni artırdığını, bu maddeler karışım

halinde verildiğinde ise KKD’nin ayrı ayrı verildiklerinden iki kat fazla olduğunu

saptamışlardır. Ferrand ve ark. (2000a), sorbik asitin ve potasyum sorbat’ın HeLa

hücreleri ve plazmid DNA’larında mutajenik ve genotoksik etkisinin olmadığını

bulmuşlardır. Rencüzoğulları ve ark. (2001a) ve (2001b), sodyum metabisülfit’in

Allium cepa L. kök ucu hücrelerinde mitotik anormallikleri artırdığını ve MI’i

düşürdüğünü, insan lenfosit hücrelerinde KA ve KKD’ni artırdığını, Replikasyon

indeksini (RI) ve MI’i düşürdüğünü saptamışlardır.

Şu anda piyasada satılan gıda katkı maddelerinde antimikrobiyal amaçlı olarak

kullanılan maddelerden biri de bifenil’dir. Bifenil, çok çabuk buharlaşabilen ve bu

nedenle etkisi azalan bir madde olup, ambalaja, kağıt ve kartonların her m2

yüzeyinde 1-5 g bifenil olacak şekilde uygulanmaktadır. Bifenil bir aromatik


5

hidrokarbondur ve çeşitli gıda maddelerinde koruyucu olarak kullanılmaktadır. En

çok taze meyve ve sebzelerde, özellikle turunçgillerin yüzey uygulamalarında

koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Ayrıca antifungal etkiye sahip olup,

fungisit olarak veya böceklere karşı kullanılan (pestisit olarak) bir bileşiktir. Bazı

ülkelerde kullanımı yasaklanmıştır.

Bifenil, daha çok narenciyelerin yüzey uygulamalarında koruyucu madde

olarak kullanılmaktadır. Sasaki ve ark. (2002), erkek farelerde ağız yoluyla bir

defada 2000 mg/kg bifenil verildiğinde gastrointestinal organlardaki DNA’da hasar

meydana gelmesini uyardığını bulmuşlardır. Bifenil’in farenin çeşitli organlarında

alkalin tek hücre jel elektroforez analizleriyle (SCG) (Comet testi) in vivo genotoksik

etkisi araştırılmıştır (Sasaki ve ark. 1997). Bu deneylerde farenin mide, karaciğer,

böbrek, mesane, akciğer, beyin ve kemik iliği ile çalışılmıştır. Sonuçta bifenil (2000

mg/kg), çalışılan birçok organda DNA zararlarını indüklemiştir. Ayrıca bifenil’in 7

farklı türevinin karşılaştırmalı mutajenik aktivitesi araştırılmıştır (Abilev ve ark.

1993). Bifenil türevlerinin Salmonella typhimurium’un TA1537, TA97, TA1538,

TA98 suşunda çerçeve kayması mutasyonlarını indüklediği gösterilmiştir. Bunun

dışında bifenil türevlerinin Salmonella typhimurium (TA98 ve TA100) ve Çin

sıçanlarının V79 hücrelerinde mutajenik etkileri araştırılmıştır (Glatt ve ark. 1992).

Bazı bifenil bileşikleri (Polybrominated biphenyls) in vitro mutajenite denemelerde

negatif sonuç verirken, bazıları da (3-Fluorobiphenyl) Salmonella typhimurium

TA100 suşunda kuvvetli mutajenik etki göstermiştir.

Yukarıdaki çalışmalardan da görüldüğü gibi bifenil’in insan lenfositlerinde in

vitro genotoksik etkisiyle ilgili herhangi bir çalışma yapılmamıştır. Bir kimyasal

maddenin mutajenik ya da kanserojenik etkiye sahip olup olmadığının

belirlenebilmesi için kısa süreli mutajenite ve kanserojenite testlerinden oluşan bir

test grubu ile kimyasalın test edilmesi ve ona göre karar verilmesi gerekmektedir.

İşte bu çalışmanın amacı, gıda koruyucu maddesi olarak kullanılan bifenil’in insan

periferal lenfositlerinde genotoksik etkiye sahip olup olmadığını kromozom

aberasyonu (KA), kardeş kromatid değişimi (KKD = SCE) ve mikronükleus (MN)


6

testleri ile araştırmak ve bu testler yardımı ile insanlar için herhangi bir genotoksik

risk oluşturup oluşturmadığını saptamaktır.

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şebnem PARLAK

7

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR

Bu araştırma ile ilgili olarak, bazı gıda koruyucu maddeler ile yapılan

genotoksisite çalışmaları aşağıdaki gibi özetlenebilir.

2.1. Benzoik Asit ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları

Ham karanfil, kuru erik, tarçın ve yoğurt gibi bazı gıdalarda doğal olarak da

bulunan benzoik asit (C6H5COOH) genellikle sodyum tuzu formunda, gıdalarda

koruyucu katkı maddesi olarak uzun süreden beri kullanılmaktadır.

Tohda ve ark. (1980), benzoik asitin sitotoksik etkisini araştırmış, insan

lymphoblastoid hücrelerinde 30 mmol/litre konsantrasyonda sitotoksik etkiye sahip

olduğunu bulmuşlardır. Ayrıca Zeiger ve ark. (1988), Salmonella typhimurium’un,

TA97, TA98, TA100, TA1535 ve TA1537 suşlarında benzoik asitin 5000 µg/petri

üzerinde sitotoksik etkisi olduğunu saptamışlardır. Nair (2001), benzoik asit, benzil

alkol ve sodyum benzoat ile yaptığı sıçan ve fare çalışmalarında, benzoik asit’in bazı

sıçanlarda kusurlu oluşumlara neden olduğu, sodyum benzoat’a maruz bırakılan fare

ve sıçan çalışmalarında üreme ve gelişme üzerine toksik etki yaratmadığı, aynı

biçimde benzoik asit’in iki sıçan çalışmasında da negatif sonuç verdiğini saptamıştır.

Sonuç olarak genotoksisite çalışmalarının büyük bir çoğunluğu ile kanserojenite

çalışmaları negatif sonuç vermiştir.

2.2. Bifenil, Sodyum-ortofenil-fenol ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları

Bifenil (C6H5C6H5) ve sodyum-ortofenil-fenol (C6H5C6H4ONa) daha çok

narenciyelerin yüzey uygulamalarında veya ambalaj kağıtlarına emdirilerek

kullanılan koruyucu katkı maddesidir.

Glatt ve ark. (1992), bifenil türevlerinin Salmonella typhimurium (TA98 ve

TA100) ve Çin sıçanlarının V79 hücrelerinde mutajenik etkilerini araştırmışlardır.

Bu araştırmalar sonucunda, bazı bifenil bileşikleri (Polybrominated biphenyls) in

vitro mutajenite denemelerinde negatif sonuç verirken, bazıları da (3-


8

Fluorobiphenyl) Salmonella typhimurium TA100 suşunda kuvvetli mutajenik etki

göstermiştir. Abilev ve ark. (1993), bifenil’in 7 farklı türevinin karşılaştırmalı

mutajenik aktivitesini araştırmışlar ve bu amaçla Salmonella typhimurium ile

çalışmışlardır. Bifenil türevlerinin Salmonella typhimurium’un TA1537, TA97,

TA1538, TA98 suşlarında çerçeve kayması mutasyonlarını indüklediğini

göstermişlerdir. Sasaki ve ark. (1997), birçok yaştaki farenin çeşitli organlarında,

alkalin tek hücre jel elektroforez analizlerini (SCG) (Comet testi) kullanarak,

bifenil’in in vivo genotoksik etkisini araştırmışlar ve bu deneyler için farelerin mide,

karaciğer, böbrek, mesane, akciğer, beyin ve kemik ilikleri ile çalışmışlardır. Bu

analizler sonucunda bifenil (2000 mg/kg), çalışılan birçok organda DNA zararlarını

indüklemiştir. Sasaki ve ark. (2002), erkek farelere ağız yoluyla bir defada 2000

mg/kg bifenil verildiğinde gastrointestinal organlardaki DNA’da hasar meydana

gelmesini uyardığını saptamışlardır.

2.3. Borik Asit ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları

Antimikrobiyal amaçla kullanılan gıda katkı maddelerinden biri de borik asittir

(H3BO3). Borik asit, et, havyar ve balık konservelerinin sterilizasyonu gibi amaçlarla

kullanılır. Ayrıca, turunçgillerin işlenmesinde de kullanılmaktadır. Buna göre

meyveler % 5-8 düzeyinde boraks içeren çözeltiyle yıkanarak küf mantarlarının

zararları önlenmektedir.

Borik asit’in Salmonella/mikrosom testinde mutajen olmadığı, Chinese hamster

yumurta hücrelerinde KA ve KKD’ni indüklemediği saptanmıştır (National

Toxicology Program, 1987). Mc Gregor ve ark. (1988), borik asit’in çalışılan tüm

konsantrasyonlarında, in vitro fare lenfotik hücrelerde kromozomal anormalliklere

sebep olduğunu bulmuşlardır. Ayrıca, borik asit varlığında nötronların mutajenik

etkilerinin daha fazla olduğu bulunmuştur (Nakano ve ark., 1995; Poller ve ark.,

1996; Kinashi ve ark., 1997). Hubbard (1998), borik asit’in yüksek dozlarının

fertiliteyi olumsuz etkilediğini saptamıştır. Odunola (1997), borik asit’in E. coli

PQ37’de B-galaktisidaz sentezini S9 varlığında ve yokluğunda artırdığını bulmuştur.

Dönbak ve ark. (2002), borik asit’in Allium cepa L. kök ucu hücrelerinde mitotik


9

indeks’i (MI) düşürdüğünü ve birçok mitotik anormalliğe sebep olduğunu

bulmuşlardır. Arslan (2004) borik asit’in insan periferal lenfositlerinde KA ve KKD

oluşumunu indüklediğini, ayrıca sitotoksik etkiye de sebep olduğunu bildirmiştir.

2.4. Lisozim ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları

Lisozim (N-asetil heksozaminidaz), İtalyan, Edam ve Gouda peynirleri gibi sert

peynirlerin üretiminde Clostridium tyrobutricum’un neden olduğu gaz çıkışını

engellemek için kullanılmaktadır. Japon firmaları lisozimi koruyucu olarak istiridye,

karides gibi deniz ürünlerinde, ayrıca suşi, sake, patates salatası ve kremalarda

kullanmaktadırlar.

Nagao ve ark. (1977), lisozimin Salmonella typhimurium TA98 ve TA100

suşlarında mutajen olduğunu bulmuşlardır.

2.5. Nisin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları

Gıdalarda antimikrobiyal koruyucu olarak kullanılan kimyasallardan diğer bir

grup da antibiyotiklerdir. Gıdalarda antibiyotik olarak kullanılan maddelerden biri de

nisin’dir. Nisin irmik, puding, krema ve peynirlerde koruyucu madde olarak

kullanılmaktadır. Ayrıca nisin, vücuda alındıktan sonra hızlı bir şekilde sindirim

enzimleri tarafından bağırsakta inaktive edilmektedir.

Murinda ve ark. (2003), nisin’in Simian virus 40 ile enfekte olmuş insanların

kalın bağırsağında ve Vero maymun böbreklerinde toksik olduğunu saptamışlardır.

2.6. Propiyonik Asit [(2-hydroxy-(1-N-nitrosoindole)] ile Yapılan Genotoksisite

Çalışmaları

Propiyonik asit (C2H5COOH) ambalajlanmış dilimli ekmeklerde koruyucu

katkı maddesi olarak kullanılmaktadır. Ayrıca İsviçre peynirinde %1’e kadar

çıkabilen oranlarda doğal olarak bulunmakta olup, memeli vücudunda diğer yağ

asitleri gibi metabolize edilmektedir.


10

Basler ve ark. (1987), propiyonik asitin genotoksik etkiye sahip olup

olmadığını araştırmışlar, bunun için de E.coli DNA tamir mekanizması, SOS

kromotest, Salmonella/mikrozom testi, KKD ve in vivo mikronükleus testlerini

uygulamışlardır. Bu testler sonucunda, DNA tamir mekanizması dışındaki testlerin

negatif sonuç verdiğini bulmuşlardır. Ohara ve ark. (1988), propiyonik asitin 160

µg/petri konsantrasyonunda Salmonella typhimurium’da mutasyon frekansını

uyardığını bulmuşlardır. Surjan (1989), propiyonik asit’in Drosophila’da mitotik

rekombinasyonlara sebep olduğunu saptamıştır. Philipose ve ark. (1997), propiyonik

asidin türevleri olan ibuprofen, ketoprofen ve naproxen’in mutajenitesini Salmonella

typhimurium’un TA97, TA98, TA100 ve TA102 suşlarında, Ames testi ve fare

kemik iliği hücrelerinde in vivo KKD testi ile test etmişlerdir. Sonuçta Ames testinde

her üç türevin mutajen olmadığını, fakat fare kemik iliği hücrelerinde KKD’ni zayıf

bir şekilde artırdığını ve Salmonella typhimurium’un TA98 suşlarında 160 µg/plate

konsantrasyonunda mutasyonu artırdığını bulmuşlardır.

2.7. Sodyum Benzoat ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları

Sodyum benzoat gıdalarda koruyucu madde olarak kullanılmaktadır. Sodyum

benzoat ticari olarak beyaz toz veya pulcuklar halinde bulunmakta olup, sıvılara toz

olarak karıştırılmakta ve çabuk çözünmektedir.

Abe ve Sasaki (1977), sodyum benzoat’ın yüksek konsantrasyonlarının Chinese

hamster hücrelerinde KA ve KKD’ni artırdığını bulmuşlardır. Ishidate ve Odashima

(1977), potasyum benzoat’ın Chinese hamster hücrelerinde MI’i artırdığını

saptamışlardır. Njagi ve Gopalan (1982), Vicia faba kök hücrelerinde sodyum

benzoat’ın doza bağlı olarak mitotik indekste azalmaya sebep olduğunu, ayrıca

anafaz safhasında köprü oluşumunu indüklediğini ve interfaz nükleusunda kromatin

erozyonuna neden olduğunu saptamışlardır. Nair (2001), sodyum benzoat’a maruz

bırakılan fare ve sıçan çalışmalarında üreme ve gelişme üzerine toksik etki

yaratmadığını, genoktoksidite çalışmalarının büyük bir çoğunluğu ile kanserojenite

çalışmalarında negatif sonuç verdiğini saptamıştır.


11

2.8. Sodyum Nitrit ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları

Sodyum nitrit (NaNO2) et, et ürünleri ve balıklarda karakteristik lezzet, renk

özelliklerini vermek ve mikrobiyal stabilitelerini sağlamak amacı ile kullanılan

kürleme ajanlarıdır. Ayrıca sodyum nitrit, fotoğrafçılıkta kükürt dioksit içeriği ile

indirgen madde olarak, boya, yıkama ve deri endüstrisinde renk giderici madde

olarak, tekstil endüstrisinde anti-klor olarak kullanılmaktadır.

Tsuda ve ark. (1976), sodyum nitrit’in 50 mM ve 100 mM’de in vitro hamster

embriyonik hücrelerinde hücresel morfolojik değişmelere neden olduğunu, ayrıca

KA ve endoreduplikasyonu da uyardığını bulmuşlardır. Ishidate ve Odashima (1977),

Chinese hamster hücrelerinde sodyum nitrit’in kromozom testinde pozitif sonuç

verdiğini saptamışlardır. Luca ve ark. (1987), sodyum nitrit’in mutajenitesini

yaptıkları in vivo ve in vitro deneylerde araştırmışlardır. In vivo deneylerde üçten

fazla hayvanla çalışılmış (erkek sıçan, fare ve tavşan) ve bunlara 1.72, 5.18, 15.55,

ve 46.66 mg/kg vücüt ağırlığı dozlarda sodyum nitrit verilmiş, sonuçta ne

kromozomal anormalliklerde ne de mikronükleus oluşumunda bir artış görülmüştür.

Aynı araştırıcıların yaptığı in vitro deneyler için BSC-1 ve HeLa hücreleri 0.265 ve

0.530 mg/ml dozlarda sodyum nitrit ile muamele edilmiş ve her iki dozda da

kromozom anormalliğinde kayda değer bir artış gözlenmemiştir. Mukherjee ve ark.

(1988), sodyum nitrit’in fare kemik iliği hücrelerinde çalışılan tüm dozlarında KKD

ve mikronükleus oluşumunu artırdığını bulmuşlardır. Akın ve Sümer (1991), sodyum

nitrit’in mutajenitesini Salmonella typhimurium’un TA100, TA1535 suşlarında

araştırmışlar, sonuçta S9’lu ve S9’suz ortamlarda TA1535 için test maddesinin

mutajen olduğunu ancak TA100 için zayıf mutajen olduğunu bulmuşlardır. Sushko

ve Malenchenko (1992), fare spermatositlerini sodyum nitrit, sodyum nitrat ve

radyasyona maruz bıraktıklarında, bu maddelerin farenin spermatositlerinde

kromozom aberasyonunu indüklediğini saptamışlardır.


12

2.9. Sorbatlar ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları

Sorbik asit (C5H7COOH) ve onun kalsiyum (CaC12H14O4), potasyum

(KC5H6COOH) ve sodyum (NaC5H6COOH) tuzları 1945 yılından beri

antimikrobiyal olarak kullanılmaktadır. Sorbik asit ve tuzları gıdalarda koruyucu

madde olarak kullanımına izin verilen tek doymamış organik asittir. Sorbik asit ve

onun Ca, K ve Na tuzları peynir yüzeyinde oluşabilecek küf gelişimini önlemekte, bu

nedenle 40 çeşide yakın peynir ve peynirli gıdada kullanılmasına izin verilmektedir.

2.9.1. Sorbik Asit ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları

Hasegawa ve ark. (1984), Chinese hamster V79 hücrelerinde sorbik asit’in

yüksek konsantrasyonlarının KA ve KKD’ni artırdığını ve çok düşük genotoksik

etkiye sahip olduğunu bulmuşlardır. Liewen ve Marth (1985), sorbik asit’in

Salmonella typhimurium’un TA97, TA98, TA100, TA1535, TA1537, TA 1538

suşlarında mutajen olduğunu saptamışlardır. Mukherjee ve ark. (1988), sorbik asit ve

sodyum nitrit’in, tek başlarına ve karışım halinde fare kemik iliği hücrelerinde

etkilerini araştırmışlar ve sorbik asitin yüksek konsantrasyonlarının KKD’ni ve

mikronükleus oluşumunu artırdığını, sodyum nitritin ise tüm dozlarının KKD’ni

artırdığını, bunlar karışım halinde verildiğinde KKD’nin ayrı ayrı

verildiklerindekinden iki kat fazla olduğunu bulmuşlardır. Walker (1990), sorbik

asit’in KA ve KKD testleri sonucunda klastojen olmadığını, Ames testi sonucunda

ise mutajen olmadığını bulmuşlardır. Jung ve ark. (1992), sorbik asit’in 5000 mg/kg

dozdan daha yüksek dozlarının fare kemik iliği hücrelerinde KKD’ni ve

mikronükleus oluşumunu artırmadığını bulmuşlardır. Aynı araştırıcılar in vivo insan

A549 hücrelerinde düzensiz DNA sentez testinde DNA tamirini artırmadığını ve

sonuç olarak sorbik asitin genotoksik olmadığını saptamışlardır. Ferrand ve ark.

(2000b), sorbik asit’in HeLa hücreleri ve plazmid DNA’ları için mutajen olmadığını

bulmuşlardır.


13

2.9.2. Kalsiyum Sorbat ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları

Ferrand ve ark. (2000c), HeLa hücreleri ve plazmid DNA’larla yaptıkları

genotoksisite çalışmaları ve Ames testi sonucunda Kalsiyum sorbat’ın mutajenik

etkiye sahip olmadığını bulmuşlardır.

2.9.3. Potasyum Sorbat ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları

Potasyum sorbat’ın yüksek dozlarının Chinese hamster V79 hücrelerinde KA

ve KKD’ni artırdığı saptanmıştır (Abe ve Sasaki, 1977; Hasegawa ve ark., 1984).

Munzer ve ark. (1990), potasyum sorbat’ın genotoksisitesini araştırmak amacıyla

Ames testi ile Chinese hamster ovaryum hücrelerinde HGPRT ve kardeş kromatid

değişim testini uygulamışlardır. Ayrıca, sıçan ve Chinese hamster kemik iliği

hücrelerinde mikronükleus testlerini kullanmışlar ve bu kimyasalın in vitro testlerde

bir genotoksisite göstermediğini, in vivo testlerde ise bu maddenin taze hazırlanmış

eriyiklerinde hiçbir klastojenik etki göstermediği halde, bekletilmiş eriyiklerinde

klastojenik bir etkiye sahip olduğunu saptamışlardır. Jung ve ark. (1992), potasyum

sorbat’ın 400-1200 mg/kg konsantrasyon aralığında DNA da tek iplik kırıklarına

neden olmadığını ve dolayısıyla genotoksik olmadığını bulmuşlardır. Schlatter ve

ark. (1992), potasyum sorbat’ın 2.5 mg/ml konsantrasyonunun Chinese hamster V79

hücrelerinde in vitro şartlarda MI düşürdüğünü fakat genotoksik olmadığını

bulmuşlardır. Ferrand ve ark. (2000a), potasyum sorbat’ın HeLa hücrelerinde ve

plazmid DNA’larında mutajenik ve genotoksik etkiye sahip olmadığını bulmuşlardır.

Kitano ve ark. (2002), potasyum sorbat’ın mutajenik etkiye sahip olup olmadığını

askorbik asit ve Fe tuzu varlığında Ames testini uygulayarak araştırmışlar ve bu üç

madde birlikte kullanıldığında Salmonella typhimurium’un TA98 (S9 mix varlığında

veya S9 mix yokluğunda) ve TA100 (S9 mix varlığında) suşlarında mutajenik etkili

olmadığını, buna karşın TA100 (S9 mix yokluğunda) suşunda doza bağlı bir

mutajenik etki gösterdiğini saptamışlardır. Ancak bu üç madde ayrı ayrı

kullanıldığında herhangi bir mutajenik etki görülmemiştir.


14

2.9.4. Sodyum Sorbat ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları

Hasegawa ve ark. (1984), Sodyum sorbat’ın yüksek Chinese hamster V79

hücrelerinde KA ve KKD’ ni artırdığını bulmuşlardır. Munzer ve ark. (1990),

sodyum sorbat’ın genotoksisitesini araştırmışlar, bu amaçla Ames testi, Chinese

hamster ovaryum hücrelerinde HGPRT ve kardeş kromatid değişim testlerini, sıçan

ve Chinese hamster kemik iliği hücrelerinde mikronükleus testlerini uygulamışlar ve

sonuçta bu kimyasal maddenin in vitro testlerde bir genotoksisite göstermediğini, in

vivo testlerde ise bu maddenin taze hazırlanmış eriyiklerinin hiçbir klastojenik etki

göstermemesine rağmen, bekletilmiş eriyiklerinde böyle bir etki yarattığını

bulmuşlardır. Schlatter ve ark. (1992), sodyum sorbat’ın 2.5 mg/ml dozunun Chinese

hamster V79 hücrelerinde mitoz bölünmeyi düşürdüğünü ancak genotoksik

olmadığını bulmuşlardır. Schiffmann ve Schlatter (1992), sodyum sorbat’ın taze

hazırlanmış eriyiğinin genotoksik olmadığını saptamışlardır.

2.10. Sulfitler ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları

Sülfitler kükürt dioksit kaynağı olarak yiyecek ve içecek endüstrisinde

koruyucu ve sterilizasyon amaçlarla ve ayrıca unda beyazlatıcı madde olarak da

kullanılmaktadır. Gıdalarda kükürt dioksit kaynağı olarak kullanılan sülfit bileşikleri

sodyum metabisülfit (Na2S2O5), potasyum metabisülfit (K2S2O5) ve sodyum sülfit

(Na2SO3)’tir.

Meng ve Zhang (1992), sodyum metabisülfit’in insan lenfosit hücrelerinde KA,

KKD ve mikronükleus oluşumunu artırdığını bulmuşlardır. Rencüzoğulları ve ark.

(2001a), sodyummetabisülfit’in Allium cepa L.’da mitotik anormallikleri artırdığını

ve mitotik indeksi düşürdüğünü saptamışlardır. Aynı araştırıcılar, insan lenfosit

hücrelerinde KA ve KKD’ni artırdığını, replikasyon indeksini (RI) ve mitotik indeksi

(MI) düşürdüğünü bulmuşlardır (Rencüzoğulları ve ark., 2001b) . Nair ve Elmor

(2003), sodyum ve potasyum metabisülfit’in 160 mg/kg’dan daha yüksek dozlarının

fare, sıçan, hamster ve tavşanlarda teratojenik etkiye sahip olmadığını, mutajenite

çalışmalarında ise negatif sonuç verdiğini saptamışlardır. Aynı araştırıcılar,


15

sıçanlarda yaptıkları çalışmalarda sodyum sülfit’in yüksek dozlarda (3.3 g/kg’dan

daha yüksek) sıçanlarda toksik olduğunu ancak teratojenik olmadığını saptamışlardır.

Kayraldız ve ark. (2006), potasyum metabisulfitin S.typhimurium TA98 ve TA100

suşlarında mutajen olmadığını bildirmişlerdir. Njagi ve Gopalan (1982), sodyum

sülfit’in doza bağlı olarak Vicia faba kök ucu hücrelerinde mitotik indekste azalmaya

neden olduğunu, anafazda köprü oluşumunu uyardığını ve interfaz nükleusunda

kromatin erozyonuna neden olduğunu saptamışlardır. Pagano ve ark. (1987) sodyum

bisulfit’in S.typhimurium TA97 ve TA1535 suşlarında zayıf mutajen olduğunu

bildirmişlerdir. Ayrıca Kayraldız (2005), sıçanlara hem intraperitonal (ip) hem de

gavage olarak verilen sodyum metabisulfit’in sıçan kemik iliğinde genotoksik ve

sitotoksik etkiye sahip olduğunu, ip olarak verildiğinde sodyum metabisulfit’in

genotoksik ve sitotoksik etkinin daha fazla olduğunu saptamıştır.

2.11. Tiabendazol ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları

Tiabendazol (C10H7N3S), çimen ve süs bitkilerinde küf, çürüme gibi

problemlere karşı kullanılan bir pestisit olup, bazı meyve ve sebzelerde oluşan yeşil,

mavi küf çürüklerini engellemek amacıyla depolama aşamasında dış yüzeyde

kullanılan bir koruyucudur. Bu amaçla en çok muz ve narenciyelerde koruyucu

madde olarak kullanılmaktadır.

Mudry ve Pargament (1987), tiabendazol’un 50, 100 ve 200 mg/kg dozlarını

farelerde denemişler ve sonuçta en yüksek dozda KKD’ni artırırken, mikronükleus

oluşumunu her üç doz da artırdığını bulmuşlardır. Ardito ve ark. (1996),

tiabendazol’un insan lenfotik hücrelerinde DNA replikasyonunu önemli derecede

azalttığını ve 48 saatlik muamelede KKD’ni çok az artırdığını bulmuşlardır. Mailhes

ve ark. (1997), tiabendazol’un fare oositlerinde sitogenetik anormallikleri uyardığını

saptamışlardır. Sasaki ve ark. (1997), birçok yaştaki farenin çeşitli organlarında

alkalin tek hücre jel elektroforez analizlerini (SCG) (Comet testi) kullanarak,

tiabendazol’un in vivo genotoksik etkisini araştırmışlar ve bu amaçla farelerin mide,

karaciğer, böbrek, mesane, akciğer, beyin ve kemik ilikleri ile çalışmışlardır. Bu

analizler sonucunda, tiabendazol (200 mg/kg) çalışılan birçok organda DNA


16

zararlarını indüklemiştir. Schmid ve ark. (1999), Multicolar fluorescence in situ

hybridization (FISH) testini kullanarak 300 mg/kg tiabendazol ile muamele edilmiş

erkek farelerin spermlerinde total diploidi sıklığının önemli derecede artığını

saptamışlardır. Otubanjo ve Mosuro (2001), farelerde tiabendazol’un sperm başı

anormalliklerini istatiksel olarak artırdığını ancak mutajen olmadığını bulmuşlardır.

Delescluse ve ark. (2001), tiabendazol’un insan lenfoblastoid hücrelerinde yüksek

DNA zararlarına neden olduğunu, ayrıca sitokrom P450 1A1 gen ekspresyonunu

başlattığını ve sonuçta tiabendazol’un genotoksik olduğunu bulmuşlardır. Sasaki ve

ark. (2002), tiabendazol’un gastrointestinal organlarda DNA zararlarını indüklediğini

saptamışlardır. Watanabe-Akanuma ve ark. (2003), tiabendazol’un bakteri

kültürlerindeki fotomutajenik etkisini araştırmışlar ve bu amaçla 320-400 nm dalga

boyundaki UV-A ışığını kullanmışlardır. Tiabendazol bulunmayan ortamda bakteri

suşlarında hiçbir mutajenik etki görülmemiş ancak tiabendazol varlığında

Escherichia coli’nin WP2uvrA ve WP2uvrA/pKM101 suşlarında kuvvetli

fotomutajenik etki, Salmonella typhimurium’un TA98 ve TA100 suşlarında zayıf

fotomutajenik etki görülmüş, Salmonella typhimurium’un TA1535 ve TA1538

suşlarında ise hiçbir fotomutajenik etki görülmemiştir. Watanabe-Akanuma ve ark.

(2005), bakterilerde fotomutajen olan tiabendazol’un insan lenfoblastoid WTK1

hücrelerinde yapılan umu-test ve tek hücre jel elektroforez (comet testi) analizleriyle

DNA zararlarına neden olduğunu ve sonuçta tiabendazol’un in vitro insan

hücrelerinde ve bakterilerde genotoksik olduğunu saptamışlardır.

3. MATERYAL VE METOT Şebnem PARLAK

17

3. MATERYAL VE METOD

Bu çalışmada materyal olarak sigara içmeyen yaşları bir birine yakın sağlıklı

iki erkek (20 ve 23 yaşlarında) ve iki bayandan (20 ve 23 yaşlarında) alınan periferik

kan kullanılmıştır.

3.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları

3.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler

3.1.1.1. Bifenil

Bu çalışmada test maddesi olan bifenil (E230) (difenil) çeşitli gıda

maddelerinde koruyucu olarak kullanılan aromatik hidrokarbondur. Bilindiği gibi

koruyucular, gıdaların mikroorganizmalarla bozulmalarını önleyerek raf ömürlerinin

uzatılmasını sağlayan maddelerdir. En çok taze meyve ve sebzelerde, özellikle

turunçgillerin yüzey uygulamalarında koruyucu madde olarak kullanılmaktadır.

Ayrıca, pestisitlerde, poliklorlu bifenillerin organik olarak sentezlerinde ısı transfer

maddesi olarak ve poliesterlerde boyama yardımcı maddesi olarak da

kullanılmaktadır. Bifenil, çok çabuk buharlaşabilen ve bu nedenle etkisi azalan bir

madde olup, ambalaja, kağıt ve kartonların her m2 yüzeyinde 1-5 g bifenil olacak

şekilde uygulanmaktadır. Ayrıca antifungal etkiye sahip olup, fungisit olarak veya

pestisid olarak da böceklere karşı kullanılan bir bileşiktir. Bazı ülkelerde kullanımı

yasaklanmıştır. Bifenil’in molekül yapısı, iki tane 6 kenarlı karbon halkasının

birleşmesinden meydana gelmiştir. Bifenil % 99,5 (min) saflıkta olup Merck

firmasından temin edilmiştir. Bifenil’in açık formülü ve diğer özellikleri aşağıdaki

gibidir:


18

Bilinen adları : Phenylbenzene; 1,1’-Biphenyl; 1,1’-Diphenyl;

bibenzene; lemonene; phenador-x; PHPH; xenene;

Diphenyl; Bifenilo (Spanish); Biphényle (French) ;

Kapalı formülü : C6H5C6H5

Molekül ağırlığı : 154,21

Erime sıcaklığı : 69-72°C

Kaynama sıcaklığı : 254-255°C

Yoğunluğu : 1,041

Çözünürlüğü : Suda çözünmez

Fiziksel durumu : Beyaz, kristal yapıda

CAS No : 92-52-4

3.1.1.2. Dimethyl Sulfoxide (DMSO)

Çözücü madde olarak kullanılan dimethyl sulfoxide (DMSO)’in (Sigma Cat.

No: 8418) genel yapısı ve diğer özellikleri aşağıda verilmiştir:

Kimyasal adı : Dimethyl sulfoxide (DMSO)

Saflık : % 99.9 Kapalı formülü: C2H6SO

Molekül ağırlığı: 78.13

Sigma no : 8418

CAS No : 67-68-5

3.1.1.3. Kromozom Medyumu

Bu çalışmada Biochrom firmasının ürettiği Chromosome Medium B (cat. no.

F5023), hücre kültürü için kullanılmıştır. Chromosome Medium B’nin her litresinde

aşağıdaki bileşikler verilen miktarlarda bulunmaktadır:


19

MEM JOKLIK with

Non essential Amino Acids........................................850 ml

Fetal Calf Serum ........................................................150 ml

Heparin.......................................................................25.000 E

Penicillin G, Sodium Salt...........................................75.000 E

Streptomycin Sulphate...............................................50 mg

Phytohemagglutinin M...............................................2.5 mg

Bu medyum her tüpe 2.5 ml olacak şekilde paylaştırılmış ve bu miktarlarda

kullanılmıştır. Kültür tüpleri steril olarak temin edilmiştir.

3.1.1.4. Kolşisin (Kolkisin)

Kromozom preparatlarının hazırlanmasında mitotik zehir olarak Colchicine

(kolşisin) (Sigma Cat. No. C9754) kullanılmıştır. Kolşisin eriyiği saf su içerisinde

hazırlanmış ve kromozom medyumunun her ml’sinde 0.06 µg olacak şekilde (0.06

µg/ml) 2.5 ml’lik kromozom medyumuna ilave edilmiştir.

3.1.1.5. Hipotonik Eriyik

Hipotonik eriyik olarak %0,4’lük KCl (Merck) kullanılmıştır. Eriyik bidestile

su içinde stok halinde hazırlanıp ağzı kapalı bir cam kapta buzdolabında (+4 ºC)

saklanmıştır. Her preparasyondan yaklaşık 2 saat önce yeteri kadar miktar alınıp

37ºC’deki inkübatörde ısıtılıp kullanılmıştır.

3.1.1.6. Fiksatif

KKD ve KA için kullanılan fiksatif, 1 kısım glasial asetik asit’in 3 kısım

metanol ile karıştırılması sonucu hazırlanmıştır. MN için ise iki farklı fiksatif

kullanılmıştır. İlk fiksatif 1 kısım glasial asetik asit’in 5 kısım metanol ile


20

karıştırıldıktan sonra 1/1 oranında %0.9 NaCl ile seyreltilmesiyle hazırlanmıştır.

Diğer fiksatifler ise NaCl ilave edilmeden kullanılmıştır.

Fiksatif kullanılmadan iki saat önce hazırlanmış ve buzdolabında saklanmıştır.

Her seferinde preparat yapım işleminden iki saat önce taze olarak hazırlanıp

kullanılmıştır.

3.1.1.7. 5’-Bromo-2’-deoxyuridine (BrdUrd)

BrdUrd Sigma firmasından (Cat. No. B 5002) temin edilmiştir. BrdUrd eriyiği

bidistile su içerisinde hazırlanmış, daha sonra 0.2 µm çapındaki membran filtre

(Sartorius marka) ile steril edilmiştir. Bu eriyikten kültür tüpleri içerisindeki

kromozom medyumuna 10 µg/ml olacak şekilde ilave edilmiştir.

3.1.1.8. Sorensen Tamponu (Sorensen Buffer)

KKD’ni incelemek amacıyla preparat yapımı sırasında preparatlar Sorensen

tamponu içerisinde UV lambası ile ışınlandırılmıştır. Ayrıca bu tampon %5’lik

Giemsa boyası hazırlanmasında da kullanılmıştır.

Bu tampon eriyik tampon A ve tampon B olmak üzere iki stok çözelti halinde

hazırlanmış olup bu çözeltiler çalışmanın amacına uygun olarak birbirleriyle değişik

miktarlarda karıştırılarak kullanılmıştır.

Hazırlanışı:

Tampon A:11.34 gr KH2PO4 250 ml saf su içinde eritilmiştir (pH=4.8).

Tampon B:14.83 gr Na2HPO4.12H2O 250 ml saf su içinde eritilmiştir (pH=9.3).

3.1.1.9. Standart Saline Citrate (SSC) Eriyiği

Bu eriyik ışınlamadan sonra kardeş kromatidler arasındaki kontrast farkını

artırmak amacıyla kullanılmıştır. SSC eriyiğini hazırlamak için 11.05 gr trisodyum

sitrat (C6H5Na3O7.2H2O) ve 21.9 gr NaCl kullanılmıştır. Bu iki madde ayrı ayrı


21

kaplarda bir miktar saf su içerisinde çözülmüş, daha sonra aynı kaba aktarılarak

birbirleriyle karıştırılmış ve üzerlerine 500 ml oluncaya kadar saf su ilave edilmiştir.

Hazırladığımız bu stok eriyik 5xSSC’dir ve bu eriyik buzdolabında saklanmıştır.

Deneyimizde, bu stoktan 20 ml alıp üzeri 100 ml oluncaya kadar saf su ile

tamamlanarak elde edilen 1x SSC kullanılmıştır.

3.1.1.10. Giemsa

Giemsa boyası Merck firmasından (Cat. No. 9204) temin edilmiş olup

deneylerimizde Sorensen tamponu içinde hazırlanmış olan %5’lik boya eriyiği

preparatların boyanmasında kullanılmıştır.

3.1.1.11. Entellan

Preparat kapatma solüsyonudur (Merck, Cat. No. 7961). Preparatlar daimi hale

getirilirken lam ve lamelin birbirlerine yapıştırılmasında kullanılmıştır.

3.1.1.12. Nitrik Asit (HNO3)

Lamları temizlemek amacıyla 1 N çözelti olarak hazırlanmıştır. Plastik şişede

saklanarak her defasında tekrar tekrar kullanılmıştır.

3.1.1.13. Mitomycin C (MMC)

Pozitif mutajen olarak kullanılmıştır. MMC steril saf suda 0.2 µg/ml olacak

şekilde hazırlanmış ve buzdolabında saklanmıştır.


22

3.1.2. Kullanılan Deney Ekipmanları

3.1.2.1. Hassas Terazi

Hava akımlarına karşı özel cam paravanlarla korunan ve 0,0001 gr

hassasiyetindeki GEC AVERY marka terazi kimyasalların tartılmasında

kullanılmıştır.

3.1.2.2. Santrifüj

Rotor çapı 21 cm olan ve 4000 rpm’e kadar yükselebilen devir hızı, 99 dk.’lık

zaman ayarlayıcı, açılabilir başlığa sahip ve 28 tüp kapasiteli HETTICH

UNIVERSAL marka santrifüj çalışmalarda kullanılmıştır.

3.1.2.3. Mikroskop

Koordinat cetveli ve immersiyon objektifi olan OLYMPUS marka binoküler

ışık mikroskobu preparat incelemeleri sırasında kullanılmıştır. Fotoğraflar ise yine

Olympus marka mikroskopta dijital olarak çekilmiştir.

3.1.2.4. İnkübatör

Hücrelerin 37ºC’de inkübe edilmesi için Dedeoğlu marka inkübatör

kullanılmıştır.

3.1.2.5. pH Metre

Kimyasalların pH değerlerini saptamak için WTW 315i (Germany) marka pH

metre kullanılmıştır.


23

3.2. Lamların Temizlenmesi

Kültür süresinin bitiminden iki gün önce etiketli olan lamlar şaleye dizilerek

üzerlerini iyice örtecek şekilde 1 N nitrik asit konmuştur. Şalenin ağzı kapatılarak bu

şekilde 24 saat bekletilmiştir. Süre bitiminde lamlar yarım saat akan çeşme suyunda

iyice yıkanmıştır. Lamlar 3-4 defa saf sudan geçirildikten sonra şale saf su ile

doldurularak buzdolabında saklanmıştır.

3.3. Kardeş Kromatid Değişimini (KKD) (Sister Chromatid Exchange=SCE) ve

Kromozom Anormalliklerini (KA) (Chromosomal Aberration=CA)

Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin

Kültüre İlave Edilmesi, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve

Mikroskobik İncelemeler

İnsanlarda genotoksik etkiye sahip olabilecek mutajenlerin ve kanserojenlerin

genotoksik etkilerinin saptanması başta KKD, KA ve MN testleri yardımıyla

olabilmektedir. Bu tür çalışmalar planlanırken, uygulanırken ve yorumlanırken

uluslararası yönergelere uygun hareket edilmesi zorunluluğu bulunmaktadır. Bundan

dolayı bifenil’in insan lenfositlerindeki genotoksik etkilerinin belirlendiği bu çalışma

Albertini ve ark. (2000)’ları tarafından yayınlanan IPCS (The International

Programme on Chemical Safety) yönergesine göre gerçekleştirilmiştir.

3.3.1. Kardeş Kromatid Değişimini (KKD) ve Kromozom Anormalliklerini (KA)

Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Test Maddelerinin

Kültüre İlave Edilmesi ve Preparatların Hazırlanması

Bu çalışmada KKD ve KA’ni saptamak amacıyla hücre kültürünün yapılması

ve preparatların hazırlanması Evans (1984), Perry ve Thompson (1984)’un

metodlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Sağlıklı ve sigara içmeyen yaşları

birbirine yakın iki erkek ve iki bayandan alınan 1/10 oranında heparinize edilmiş kan

örnekleri kromozom medyumlarına steril şartlarda 6 damla (0.2 ml) (Rencüzoğulları


24

ve Topaktaş, 1991) ekilmiştir. Yine steril şartlarda ve daha önce hazırladığımız

BrdUrd eriyiğinden her tüpe son konsantrasyonu 10 µg/ml olacak şekilde ilave

edilerek iyice karıştırılmış ve hücre kültürü inkübatörde 37±1°C’de 72 saat için

inkübe edilmiştir.

Bifenil’ in etkisini incelemek için kültür süresinin bitimine 24 ve 48 saat kala

bifenil’in daha önce belirlenmiş konsantrasyonları olan 10, 30, 50 ve 70 µg/ml’lik

miktarları, DMSO’da çözdürülüp kültür tüplerine ilave edilmiştir. 24 ve 48 saatlik

muamele sürelerinde çözücü kontrol olarak DMSO kullanılmıştır. DMSO tüplere 8

µl/ml olacak şekilde verilmiştir. Bifenil beyaz kristal yapıdadır ve suda çözünmez.

Bu amaçla bifenil’i çözmek için DMSO kullanılmıştır. Ayrıca 24 ve 48 saatlik

muamele sürelerinde pozitif kontrol olarak MMC kullanılmıştır. MMC tüplere 0.20

µg/ml olacak şekilde verilmiştir.

Kültür süresinin bitiminden 2 saat önce (yani kültürün 70. saatinde) her tüpe

hazırlanan kolşisin eriyiğinden ilave edilmiş (0.06 µg/ml) ve tüpler hafifçe sallanarak

iyice karıştırılmıştır. Hücreler 2 saat süresince (37°C’de) kolşisin ile ön muameleye

tabi tutulmuştur.

Kültür süresi olan 72. saatin bitiminde kültür tüpleri 1200 rpm’de 15 dk.

santrifüj edilmiş, süpernatant atılmıştır. Dipte kalan ve hücreleri ihtiva eden 0.5-0.7

ml’lik sıvı iyice karıştırıldıktan sonra tüplere, etüvde 37°C’de tutulan hipotonik

eriyik ilave edilmiştir. Bu eriyiğin ilavesi damla damla ve karıştırılarak yapılmıştır.

Aksi halde hücrelerde kümeleşme olmakta ve amaca uygun olmayan preparatlar

hazırlanmaktadır. Her tüpe 5 ml hipotonik eriyik ilave edildikten sonra tüpler, ağzı

kapatılarak inkübatöre konulmuştur. Hücreler 12 dk. hipotonik eriyikte 37°C’de

muamele edilmiştir. Sürenin sonunda tüpler 15 dk. 1200 rpm’de santrifüj edilmiş,

süpernatant atılmıştır.

Bu sefer hipotonik eriyik ilavesi gibi yavaş yavaş ve karıştırarak her tüpe 5 ml

olacak şekilde soğuk fiksatif ilave edilmiştir. Oda sıcaklığında 20 dk. fiksatif ile

muamele edilen hücreler 1200 rpm’de 15 dk. santrifüj edilmiş ve süpernatant

atıldıktan sonra tüplere tekrar fiksatif ilave edilmiştir. Bu işlem 3 kere

tekrarlanmıştır. 3. fiksatif muamelesinin sonunda tüpte kalan sıvının tamamen


25

berraklaştığı görülmüştür. Eğer sıvı berraklaşmamışsa tekrar fiksatif muamelesine

devam etmek gerekir. Her fiksatif ilavesinden sonra tüpler santrifüj edilerek üstteki

sıvı atılmıştır. Son santrifüjden sonra dipte 0.5-0.7 ml sıvı kalacak şekilde

süpernatant atıldıktan sonra preparat yapma işlemine geçilmiştir.

Tüpün dibinde toplanan hücreler pasteur pipeti ile karıştırılarak homojen hale

getirilmiştir. Pasteur pipetine 4-5 damla olacak şekilde bu hücre süspansiyonundan

çekilmiştir. Özel olarak hazırlanmış düzeneğe tutturulan pasteur pipetinden daha

önce temizlenmiş ve saf su içerisinde buzdolabında saklanmış lamların üzerine 75

cm yükseklikten farklı alanlara 1’er damla olmak üzere hücre süspansiyonu

damlatılarak (her lama 3-4 damla) hücrelerin ve dolayısıyla kromozomların lam

üzerinde yayılması sağlanmıştır. Hücre süspansiyonunun lamlara damlatılması

esnasında damlaların üst üste düşmemesine dikkat edilmiştir.

Bu şekilde hazırlanan preparatlar kurumak üzere 24 saat oda ısısında

bekletilmiştir.

3.3.2. Preparatların Boyanması

Bir kromozoma ait kardeş kromatidlerin farklı boyanmasını (sister chromatid

differentiation=SCD) sağlamak amacıyla Speit ve Haupter (1985)’in geliştirdikleri

metod modifiye edilerek kullanılmıştır. Bu amaçla bir günlük preparatlar ışınlama

kabına konarak üzeri bir film gibi örtünecek şeklide Sorensen tamponu ile

kapatılmıştır. Işınlama eriyiği, 5 ml tampon A, 5 ml tampon B’den alınıp bu

karışımın destile su ile 100 ml’ye tamamlanmasıyla hazırlanmıştır (pH=6.8).

Işınlama eriyiğinin fazla veya az olması kardeş kromatidler arasındaki kontrast

farkını önemli derecede etkilediği görülmüştür.

Bu şekilde ince bir tabaka halinde ışınlama eriyiği ile örtülen preparatlar,

karanlıkta 15 cm yükseklikten 30W’lık 254 nm dalga boyunda ışık yayabilen tek

ultraviyole lambası ile 30 dk. ışınlanmıştır.

Işınlama bittikten sonra preparatlar 1xSSC eriyiği içerisinde 58-60°C

arasındaki sıcaklıklarda 60 dk. inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi bitmeden 15 dk.

önce %5’lik Giemsa boya eriyiği hazırlanmıştır.


26

%5’lik Giemsa’nın Hazırlanması: 5 ml tampon A, 5 ml tampon B ve 5 ml Giemsa

karıştırılarak üzerleri 100 ml oluncaya kadar saf su ile tamamlanmıştır (pH=6.8).

Sonra bu boya dik bir şale içine filtre kâğıtları ile süzülmüştür. İnkübasyon süresinin

sonunda preparatlar 1xSSC solüsyonundan alınarak direkt olarak boya içerisine

konmuş ve yaklaşık olarak 20 dk. boya içerisinde bekletilmiştir (kardeş kromatidler

arasındaki en iyi kontrast farkı bu sürede sağlanmıştır). Bu sürenin sonunda

preparatlar boyadan çıkarılmış, üç ayrı kaptaki saf su içinden geçirilerek preparatlar

üzerindeki fazla boyanın akması sağlanmıştır. Bundan sonra preparatlar dik vaziyette

konularak kurumaya bırakılmıştır.

Kuruyan preparatlar entellan ile kapatılarak daimi hale getirilmiştir. Entellan

kuruduktan sonra bu daimi preparatlarda mikroskobik incelemeler yapılmıştır.

3.3.3. Mikroskobik İnceleme

Hazırlanmış olan daimi preparatlar Olympus marka binoküler ışık

mikroskobunda immersiyon objektifi ile incelenmiştir (10x100=1000 büyütmede).

3.3.3.1. KKD ve Replikasyon İndeksinin (RI) (Proliferasyon İndeksi=PI)

Saptanması

3.3.3.1.(1). KKD Sayısının Saptanması

KKD sayısı, her kişinin kan kültürüne ait preparatlardan iyi dağılmış ve ikinci

mitozu geçiren 25 hücrede (4 kişiden toplam 100 hücrede) saptanmıştır. KKD sayısı

bir kromozomun açık boyanmış kromatidindeki koyu boyanmış parçaların veya koyu

boyanmış kromatidindeki açık boyanmış parçaların sayılmasıyla belirlenmiştir

(Topaktaş ve Speit, 1990). Ortadan bir parça değişimi olmuş ise bu iki KKD olarak

değerlendirilmiş (Şekil 3.1.a), uçtan parça değişimi olmuş ise bu da bir KKD olarak

sayılmıştır (Şekil 3.1.b). Ancak bu incelemeler esnasında kromatidlerin primer

boğum bölgelerinden dönüm yapıp yapmadıklarına dikkat etmek gerekir. Bu

durumdaki kromozomlarda KKD yoktur (Şekil 3.1.c).


27

Şekil 3.1. Kardeş kromatid değişiminin olduğu ve olmadığı durumun şematik olarak

gösterilmesi (Topaktaş ve Speit, 1990).

3.3.3.1.(2). Replikasyon İndeksinin (RI) (Proliferasyon İndeksi=PI) Saptanması

Bifenil’in DNA replikasyonu üzerindeki etkilerini saptamak amacı ile RI

bulunmuştur. Bunun için tesadüfi seçilmiş 100 hücre incelenmiştir. Bu incelemeler

sırasında gözlenen birinci, ikinci ve üçüncü metafaz devresindeki hücreler

sayılmıştır. Bu verilerden yola çıkarak RI şu şekilde hesaplanmıştır:

RI= 1xM1+2xM2+3xM3/100

M1: 1. Mitozdaki hücre sayısı



Birinci, ikinci ve üçüncü metafazlar şu şekilde ayırt edilmiştir (Topaktaş ve

Speit, 1990): BrdUrd, deoxytimidin (dT) ve deoxyuridin (dU) birbirlerinin analoğu

olan bileşiklerdir (Şekil 3.2). BrdUrd, dT ve dU arasındaki tek fark taşıdıkları benzen

halkasındaki 5.C atomuna dT’de CH3, BrdUrd’de Br ve dU’da H atomunun bağlı

olmasından kaynaklanmaktadır.


28

Şekil 3.2. Deoxytimidin (dT), Bromodeoxyuridin (BrdUrd) ve Deoxyuridin (dU)’in

kimyasal yapıları.

BrdUrd, DNA’nın yapısında bulunan timin bazlarının analoğu olduğundan

dolayı kültür ortamına BrdUrd koyduğumuzda hücre DNA’sını replike ettiği sırada

(1.S fazında) yeni sentezlenen polinükleotid ipliği içine timinin yerine ortamda

bulunan BrdUrd’ni alacaktır. Böyle hücrelerinin kromozomları boyandığında bir

kromozomun her iki kromatidi de (dT/BrdUrd:dT/BrdUrd) homojen koyu renkte

boyanacaktır. Bu hücreler 1. mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerdir (Şekil 3.3.A ve

Şekil 3.4). Birinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerden meydana gelen yavru

hücreler tekrar S fazına girdiğinde (BrdUrd'li ortamda 2.S fazı) timin ihtiva eden

polinükleotid ipliğine komplementer olarak sentezlenen yeni DNA ipliğinde BrdUrd

yer alacaktır. Bu iki polinükleotid ipliği bir kromozomun koyu boyanan kromatidini

(dT/BrdUrd) oluşturacaktır. BrdUrd'li ipliğe komplementer olarak sentezlenen yeni

ipliğe de BrdUrd girecektir ve bir kromatidi oluşturan iki polinükleotid ipliği de

BrdUrd ihtiva ettiklerinden (BrdUrd/BrdUrd) bu kromatid aynı kromozomun açık

boyanan kromatidini oluşturacaktır. İşte bu hücrenin metafaz devresinde preparat

yapıldığında hücrenin tüm kromozomlarının (dT/BrdUrd:BrdUrd/BrdUrd)

kromatidlerinden biri koyu diğeri ise açık renkte boyanacaktır. Bunlar da ikinci

mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerdir. (Şekil 3.3.B ve Şekil 3.5). Bu hücreler tekrar S

Deoxytimidin (dT) Bromodeoxyuridin (BrdUrd) Deoxyuridin (dU)

O O

HN

N

H

O

O

OH

CH2HO

HN

N

Br

O

O

OH

CH2HOHOO

OH

CH2

CH3

O

HN

NO


29

fazına girdiğinde (BrdUrd'li ortamda 3.S fazı) ikinci mitozda açık boyanan

kromatidden tüm polinükleotid ipliklerine BrdUrd girmiş olan bir kromozom

meydana gelecektir ve bu kromozomun her iki kromatidi de açık renkte boyanacaktır

(BrdUrd/BrdUrd:BrdUrd/BrdUrd). İkinci mitozda koyu boyanan kromatidden ise, bir

kromatidin her iki ipliği BrdUrd'li ve diğer kromatidin bir ipliği BrdUrd'li diğer ipliği

timinli olan bir kromozom oluşacaktır. Bu kromozom da boyandığında bir kromatidi

koyu renkte, bir kromatidi de açık renkte boyanacaktır (dT/BrdUrd:BrdUrd/BrdUrd).

İşte böyle hücrelerin metafaz devresinde preparat yapıldığında bazı kromozomların

her iki kromatidi açık renkte, bazı kromozomların bir kromatidi açık, diğer kromatidi

de koyu renkte boyanacaktır. Bu hücrelerde 3. mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerdir

(Şekil 3.3.C ve Şekil 3.6). İşte bu şekilde 1., 2. ve 3. mitoz bölünmeyi geçiren

hücreler ayırt edilmiş, bu hücrelerin 100 hücre içindeki sayısı saptanmış, bundan da

yukarıda belirtilen formüle göre replikasyon indeksi (RI) hesaplanmıştır.


30

Şekil 3.3. BrdUrd’in DNA yapısına girmesi ile 1., 2. ve 3. mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerin ayırt edilmesinin şematik olarak açıklanması (During 1985’e göre Topaktaş ve Speit 1990’den).


31

Şekil 3.4. Birinci mitoz bölünmeyi geçiren hücreye ait kromozomlar.x1000

Şekil 3.5. İkinci mitoz bölünmeyi geçiren hücreye ait kromozomlar.x1000

10 µm

10 µm


32

Şekil 3.6. Üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücreye ait kromozomlar.x1000

3.3.3.2. Kromozomal Anormallikler (KA) ve Mitotik İndeksin (MI) Saptanması

3.3.3.2.(1). Kromozom Yapı ve Sayı Anormalliklerinin Saptanması

Her bir kişiden hazırlanan preparatlardan iyi dağılmış kromozomlara sahip

toplam 100 hücre (4 kişiden toplam 400 hücre) KA’ni saptamak amacıyla

incelenmiştir. Bu hücreler içinde gözlediğimiz kromozom yapı ve sayı anormallikleri

Uluslararası İnsan Sitogenetik Adlandırma Sistemine (ISCN= International System

for Human Cytogenetic Nomenclature) uygun olarak değerlendirilmiş ve

adlandırılmıştır (Mitelman, 1995’a göre Paz-y-Mino et al., 2002’dan). İncelenen bu

100 hücre içinde yapısal ve total kromozom anormalliklerinin yüzdesi bulunmuştur.

Bu çalışmada sayısal kromozom anormallikleri oluşmadığı için

değerlendirilmemiştir.

Bu çalışmada gap’lar anormallik olarak değerlendirilmemiştir. Gaplar ile

kromatid ve kromozom tipi kırıklar arasındaki farklar, Kauderer ve ark. (1991)’nın

10 µm


33

bildirdiğine şu şekilde ayırt edilmiştir: Gap’larda, kromatidin birinde (kromatid tipi

gap) veya kromatidin her ikisinde (kromozom tipi gap) görülen boyanmamış bölge

bir kromatidin genişliğinden daha azdır. Kırıklarda bir kromatiddeki (kromatid tipi

kırık) veya her iki kromatiddeki (kromozom tipi kırık) boyanmamış bölge bir

kromatidin genişliğinden daha fazladır. İşte bu ölçülere göre gap ve kromatid

kırıkları ayrı ayrı saptanmıştır. Mace ve ark. (1978) ise gap bölgesinde DNA

ipliğinde kırık olmadığını elektron mikroskobu fotoğraflarında göstermişlerdir. Bu

çalışmada kromatid kırığı ve tek kol birleşmesi gibi anormallikler kromatid tipi

anormallik olarak değerlendirilmiştir. Ayrıca kromozom kırığı, sister union, kromatid

değişimi, halka kromozom ve disentrik kromozom oluşumu gibi anormallikler de

kromozom tipi anormallikler olarak değerlendirilmiştir.

3.3.3.2.(2). Mitotik İndeksin (MI) Saptanması

Bifenil’in mitoz bölünme üzerindeki etkilerini saptamak amacı ile mitotik

indeks bulunmuştur. Bunun için her kişiye ait preparatlardan toplam 3 bin hücre

incelenmiş ve bunlar arasındaki metafaz devresinde olan hücreler saptanarak

kaydedilmiştir. 3 bin hücre içerisinde metafazların oranı yüzde cinsinden

hesaplanarak mitotik indeks saptanmıştır.

3.4. Mikronukleus (MN) Oluşumunu Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün

Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi, Preparatların

Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İncelemeler

3.4.1. Mikronukleus Oluşumunu Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün

Yapılması, Test Maddelerinin Kültüre İlave Edilmesi ve Preparatların

Hazırlanması

Mikronükleus sayısını saptamak için Fenech (2000) ve Kirsch-Volders ve ark.

(2003) tarafından geliştirilen metod modifiye edilerek kullanılmıştır. Sağlıklı ve

sigara içmeyen yaşları birbirine yakın iki erkek ve iki bayandan alınan 1/10 oranında


34

heparinize edilmiş kan örnekleri kromozom medyumlarına steril şartlarda 6 damla

(0.2 ml) ekilmiştir (Rencüzoğulları ve Topaktaş, 1991). Hücre kültürü inkübatörde

37±1°C’de 68 saat için inkübe edilmiştir.

Bifenil’in etkisini incelemek için, daha önce belirlenmiş olan

konsantrasyonlardaki (10, 30, 50 ve 70 µg/ml) bifenil, kültür tüplerine ilave edilerek

hücrelerin 24 ve 48 saat boyunca bifenil ile muamele edilmeleri sağlanmıştır. İki

nukleuslu hücre oluşumunu sağlamak için de kültür bitimine 24 saat kala bütün

tüplere 6 µg/ml olacak şekilde sitokalasin B (Cytochalasin B, Sigma Cat. No. C6762)

ilave edilmiştir. Ayrıca 24 ve 48 saatlik muamele sürelerinde pozitif kontrol olarak

MMC kullanılmıştır. MMC tüplere 0.20 µg/ml olacak şekilde verilmiştir.

Kültür süresi olan 68. saatin bitiminde kültür tüpleri 1200 rpm’de 15 dk.

santrifüj edilmiş, süpernatant atılmıştır. Dipte kalan ve hücreleri ihtiva eden 0.5-0.7

ml’lik sıvı iyice karıştırıldıktan sonra tüplere, etüvde 37°C’de tutulan hipotonik

eriyik ilave edilmiştir. Bu eriyiğin ilavesi damla damla ve karıştırılarak yapılmıştır.

Aksi halde hücrelerde kümeleşme olmakta ve amaca uygun preparatlar

hazırlanamamaktadır. Her tüpe 5 ml hipotonik eriyik ilave edildikten sonra tüpler,

ağzı kapatılarak inkübatöre konmuştur. Hücreler 5 dk. hipotonik eriyikte 37°C’de

muamele edilmiştir. Sürenin sonunda tüpler 15 dk. 1200 rpm’de santrifüj edilmiş,

süpernatant atılmıştır.

Bu sefer hipotonik eriyik ilavesi gibi yavaş yavaş ve karıştırarak her tüpe 5 ml

olacak şekilde soğuk fiksatif ilave edilmiştir. İlk fiksatif 1 kısım asetik asit 5 kısım

metil alkol karışımının 1/1 oranında %0.9 NaCl ile seyreltilmesiyle hazırlanmıştır.

Oda sıcaklığında 20 dk. fiksatif ile muamele edilen hücreler 1200 rpm’de 15 dk.

santrifüj edilmiş ve süpernatant atıldıktan sonra tüplere tekrar fiksatif ilave edilmiştir.

Bu işlem 2 kere tekrarlanmış ve ilk fiksatiften farklı karışımlar kullanılmıştır (1

kısım asetik asit 5 kısım metil alkol). 3. fiksatifle muamelenin sonunda tüpte kalan

sıvının tamamen berraklaştığı görülmüştür. Eğer sıvı berraklaşmamışsa tekrar fiksatif

muamelesine devam etmek gerekir. Her fiksatif ilavesinden sonra santrifüj edilerek

üstteki sıvı atılmıştır. Son santrifüjden sonra dipte 0.5-0.7 ml sıvı kalacak şekilde

süpernatant atıldıktan sonra preparat yapma işlemine geçilmiştir.


35

Tüpün dibinde toplanan hücreler pasteur pipeti ile karıştırılarak homojen hale

getirilmiştir. Pasteur pipetine 4-5 damla olacak şekilde bu hücre süspansiyonundan

çekilmiştir. Daha önce temizlenmiş ve saf su içerisinde buzdolabında saklanan lamın

üzerine farklı alanlara 1’er damla olmak üzere hücre süspansiyonu damlatılarak (her

lama 4-5 damla) hücrelerin lam üzerinde yayılması sağlanmıştır. Hücre

süspansiyonunun lamlara damlatılması esnasında damlaların üst üste düşmemesine

dikkat edilmiştir. Bu şekilde hazırlanan preparatlar kurumak üzere 24 saat oda

ısısında bekletilmiştir.

3.4.2. Preparatların Boyanması

Hazırlanan preparatlar Sorensen tamponu ile hazırlanmış %5’lik giemsa boyası

ile boyanmıştır.

%5’lik Giemsa’nın Hazırlanması: 5 ml tampon A, 5 ml tampon B ve 5 ml Giemsa

karıştırılarak üzerleri 100 ml oluncaya kadar saf su ile tamamlanmıştır (pH=6.8).

Sonra bu boya dik bir şale içine filtre kâğıtları ile süzülmüştür. Kuruduğundan emin

olunan preparatlar direkt olarak boya içerisine konmuş ve yaklaşık olarak 13 dk.

boya içerisinde bekletilmiştir. Bu sürenin sonunda preparatlar boyadan çıkarılmış, üç

ayrı kaptaki saf su içinden geçirilerek preparatlar üzerindeki fazla boyanın akması

sağlanmıştır. Bundan sonra preparatlar dik vaziyette konularak kurumaya

bırakılmıştır.

Kuruyan preparatlar entellan ile kapatılarak daimi hale getirilmiştir. Entellan

kuruduktan sonra bu daimi preparatlarda mikroskobik incelemeler yapılmıştır.

3.4.3. Mikroskobik İnceleme

Hazırlanmış olan daimi preparatlar Olympus marka binoküler ışık

mikroskobunda 40’lık objektif ile incelenmiştir (10x40=400 büyütmede). Bu

incelemeler sırasında her bir kişiden hazırlanan preparatlardan 2000 iki nukleuslu

(binükleer) hücre sayılmış, bu iki nukleuslu hücreler içerisinden mikronukleuslu

olanlar saptanmıştır. Ayrıca aynı kişiden hazırlanan preparatlardan 1000 tane hücre


36

sayılmış, bu hücreler arasından bir, iki, üç ve dört nukleuslu olanların oranı

saptanmıştır (Şekil 3.7). Bu orandan yola çıkarak Nukleer Bölünme Indeksi (NBİ)

(Nuclear Division Index = NDI) hesaplanmıştır (Fenech, 2000). Hesaplama aşağıdaki

formüle göre yapılmıştır.

NDI= 1xN1+2xN2+3xN3+4xN4/2000 N1: 1 nukleuslu hücre sayısı

N2: 2 nukleuslu hücre sayısı



Şekil 3.7. Bir (a), iki (b), üç (c) ve dört (d) nükleus içeren hücreler.

3.5. Mikroskopta Fotoğraf Çekme

Fotoğraflar Olympus marka mikroskopta trinoküler mikroskoba bağlı dijital

fotoğraf makinesinde 1000 büyütmede çekilmiştir. Daha önce 1., 2., ve 3. mitozu

geçiren hücrelerin kromozomlarının, bazı ilginç KA’lerine ait örneklerin, iki

10 µm


37

nukleuslu hücrelerden mikronukleusa sahip olanların ve bir, iki, üç ve dört nukleuslu

hücrelerin birkaç örneğinin fotoğrafları çekilmiştir. (Olympus CX31RTSF ; 7,1

Megapixel).

3.6. İstatistik Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi

Mikroskobik inceleme sonucunda muameleli gruplardan elde edilen KKD, KA,

MN, NBI, RI ve MI t-test metoduna göre muamelesiz, çözücü (DMSO) ve pozitif

(MMC) kontrolleri ile karşılaştırılmıştır.

Doz-etki ilişkisini ortaya koymak amacıyla regresyon ve korelasyon analizleri

yapılmış, regresyon denklemi ve korelasyon katsayısı (r) bulunmuş ve regresyon

doğrusu çizilmiştir.

Ayrıca mikroskobik incelemelerden elde edilen sonuçlar çizelge ve grafikler

halinde verilmiştir.

4. BULGULAR Şebnem PARLAK

38

4.BULGULAR

4.1. Bifenil’ in KKD Üzerindeki Etkileri

Bifenil, 24 saatlik muamele süresinde 10 ve 30 µg/ml’lik konsantrasyonlarda

KKD sayısını her iki kontrole (kontrol ve çözücü kontrol) nazaran artırmasına

rağmen bu artış istatistiksel olarak önemli bulunamamıştır (Çizelge 4.1 ve Şekil 4.1).

Aynı muamele süresinde 50 µg/ml konsantrasyonda bifenil KKD sayısını sadece

kontrole göre, 70 µg/ml’lik konsantrasyonda ise, KKD sayısını kontrole ve çözücü

kontrole göre istatistiksel olarak önemli derecede artırmıştır (Çizelge 4.1 ve Şekil

4.1). Bifenil, 48 saatlik muamele süresinde KKD sayısını kontrole göre en düşük doz

hariç önemli ölçüde arttırmış, en yüksek iki konsantrasyonda da bu artış çözücü

kontrole nazaran da önemli bulunmuştur (Çizelge 4.1 ve Şekil 4.1). Bifenil hem 24

hem de 48 saatlik muamele sürelerinde KKD sayısını doza bağlı olarak artırmış

(Şekil 4.2 ve Şekil 4.3), fakat KKD sayısındaki bu artış pozitif kontrol olan MMC

kadar olamamıştır (Şekil 4.4).

Çizelge 4.1. Değişik dozda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal

lenfositlerinde ortalama KKD sayısı. Test maddesi

Süre (saat)

Konsantrasyon µg/ml

Min-Max KKD KKD/Hücre±SE

Kontrol - - 2-15 5.81±0.60 DMSO 24 8 µl/ml 2-16 6.21±0.40 MMC 24 0.2 6-57 27.96±2.95 Bifenil 24 10 2-25 6.33±0.18 c3

“ 24 30 2-17 7.40±0.68 c3

“ 24 50 2-24 8.40±0.77 a1c3

“ 24 70 3-28 9.55±0.89 a1b1c3

DMSO 48 8 µl/ml 2-16 6.57±0.45 MMC 48 0.2 4-66 31.18±0.45 Bifenil 48 10 2-17 6.68±0.47 c3

“ 48 30 2-21 7.85±0.58 a1c3

“ 48 50 2-23 9.07±0.48 a2b1c3 “ 48 70 3-23 9.49±0.58 a2b1c3

a: Kontrol ile karşılaştırmada fark önemli b: Çözücü kontrol ile karşılaştırmada fark önemli c: Pozitif kontrol ile karşılaştırmada fark önemli 1: P≤0.05; 2: P≤0.01; 3: P≤0.001


39

0

5

10

15

20

25

30

35

Kontrol DMSO

8 µl

MMC

0.2

10 30 50 70

Konsantrasyon (µg/ml)

KK

D/H

ücre

KKD 24 Saat

KKD 48 Saat

Şekil 4.1. Farklı dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde KKD/Hücre sayısı.

Şekil 4.2. Farklı dozlarda bifenil ile 24 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde KKD/Hücre’nin doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05).

y = 0.0533x + 5.788

r = 0.9993*

0

2

4

6

8

10

12

0 20 40 60 80


KK

D/H

ücre


40

Şekil 4.3. Farklı dozlarda bifenil ile 48 saat muamele edilen insan periferal

lenfositlerinde KKD/Hücre’nin doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05).

Şekil 4.4. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde 11 KKD içeren

hücre (x1000) (30µg/ml, 48 saat, ♀).

4.2. Bifenil’in Kromozomal Anormalliklerin (KA) Oluşumu Üzerindeki Etkileri

Bifenil, 24 saatlik muamele süresinde 10 ve 30 µg/ml dozlarda yapısal

kromozom anormalliği sayısını muamelesiz kontrole nazaran artırmazken, aynı

y = 0.0482x + 6.3425

r = 0.9634*

0

2

4

6

8

10

12

0 10 20 30 40 50 60 70 80


KK

D/H

ücre

10 µm


41

muamele süresinde 50 ve 70 µg/ml’lik konsantrasyonlarda bifenil yapısal kromozom

anormalliği sayısını hem muamelesiz hem de çözücü kontrole göre önemli ölçüde

arttırmıştır(Çizelge 4.2 ve Şekil 4.5). Bifenil, 48 saatlik muamele süresinde yapısal

kromozom anormalliği sayısını tüm konsantrasyonlarda kontrole göre arttırmazken,

50 ve 70 µg/ml’lik dozlarda ise yapısal kromozom anormalliği sayısını çözücü

kontrole göre arttırmıştır. Bifenil yapısal kromozom anormalliği sayısını 24 saatlik

muamele süresinde doza bağlı olarak artırmıştır (Şekil 4.6). Bifenil yapısal

kromozom anormalliğini her iki muamele süresinde de MMC kadar uyarmamıştır.

Çizelge.4.2. Değişik dozda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal

lenfositlerinde yapısal kromozom anormallikleri

Anormallik çeşitleri Test maddesi

Süre (saat)

Kons. µg/ml Kromatid Kromozom

Tipi Tipi

Yapısal KA±SE (%)

Kontrol - - 14 3 4.25±0.25

DMSO 24 8 µl/ml 7 3 2.50±0.95

MMC 24 0.2 62 29 22.75±4.71

Bifenil 24 10 5 5 2.50±0.50 c3

“ 24 30 9 9 4.50±0.64 c3

“ 24 50 20 10 7.50±0.86 a1b2c3

“ 24 70 29 12 10.25±0.62 a2b3c3

DMSO 48 8 µl/ml 4 6 2.50±0.50

MMC 48 0.2 78 21 24.75±3.81

Bifenil 48 10 7 5 3.00±0.70 c3

“ 48 30 7 7 3.50±0.86 c3

“ 48 50 12 7 4.75±0.62 b1c3

“ 48 70 17 14 7.75±1.54 b1c2



42

0

5

10

15

20

25

30

Kontrol DMSO

8 µl

MMC

0.2

10 30 50 70


Yapıs

al K

A Y

üzdesi

KA 24 Saat

KA 48 Saat

Şekil 4.5. Farklı dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde yapısal KA yüzdesi.


lenfositlerinde yapısal KA’nın doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05).

Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde en fazla kromatid tipi

anormalliklerden özellikle kromatid kırığı (Şekil 4.7 ve Şekil 4.9) gözlenmiştir. Daha

y = 0.1313x + 0.9375

r = 0.9937*

0

2

4

6

8

10

12

0 20 40 60 80


Ya

pıs

al K

A Y

üzd

esi


43

az oranda olmak üzere kromozom tipi anormalliklerden özellikle kromozom kırığı

(Şekil 4.8), kardeş kromatid birleşmesi (sister union) (Şekil 4.9) kromatid değişimi

ve halka kromozom (Şekil 4.10) gibi yapısal kromozom anormalliklerine

rastlanmıştır. Bu çalışmada bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde

sadece iki hücrede poliploidi (Şekil 4.11) gözlenmiş ve dolayısıyla bifenil’in

kromozom sayı anormalliğini artırmadığı saptanmıştır.

Şekil 4.7. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kromatid kırığı (50 µg/ml, 24 saat, ♂).x1000.

10 µm


44

Şekil 4.8. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kromozom kırığı (x1000) (30 µg/ml, 24 saat, ♂).

Şekil 4.9. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kardeş kromatid birleşmesi (a) ve kromatid kırığı (b) (x1000) (70 µg/ml, 24 saat, ♀).

10 µm

10 µm


45

Şekil 4.10. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kromatid

değişimi (a) ve halka kromozom (b) (x1000) (30 µg/ml, 24 saat, ♂).

Şekil 4.11. Bifenil ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde poliploid hücre (x1000) (30 µg/ml, 48 saat, ♀).

10 µm

10 µm


46

4.3. Bifenil’in Mikronükleus (MN) Oluşumu Üzerine Etkileri

Bifenil, 24 saatlik muamele süresinde 10 µg/ml’lik konsantrasyonda, insan

periferal lenfositlerinde MN’lu binükleer hücre yüzdesini kontrole ve çözücü

kontrole nazaran arttırmamıştır (Çizelge 4.3 ve Şekil 4.12). Aynı muamele süresinde

30, 50 ve 70 µg/ml’lik konsantrasyonlarda bifenil, MN’lu binükleer hücre yüzdesini

her iki kontrole göre istatistiksel olarak önemli bir şekilde arttırmıştır. 48 saatlik

muamele süresinde ve özellikle en yüksek iki konsantrasyonda bifenil’in MN’lu

binükleer hücre yüzdesini her iki kontrole nazaran önemli derecede arttırdığı

saptanmıştır. Ayrıca her iki muamele sürelerinde bifenil mikronükleuslu binükleer

hücre sayısını doza bağlı olarak artırmıştır (Şekil 4.13 ve Şekil 4.14). Ancak hem 24

hem de 48 saatlik muamele sürelerinde mikronükleus sayısındaki bu artışın pozitif

kontrol kadar olmadığı saptanmıştır (Çizelge 4.3). Yapılan mikroskobik

incelemelerde bir mikronükleuslu binükleer hücrelerden (Şekil 4.15) başka iki

mikronükleuslu binükleer hücrelere de (Şekil 4.16) rastlanmıştır.


47

Çizelge 4.3. Değişik dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde mikronükleuslu binükleer hücre yüzdesi ve nükleer bölünme indeksi.

Test maddesi

Süre (saat)

Konsantrasyon µg/ml

Mikronükleus’lu binükleer hücre (%) ±SE

Nükleer bölünme indeksi ±SE

Kontrol - - 0.162±0.089 1.766±0.032

DMSO 24 8 µl/ml 0.162±0.037 1.616±0.051

MMC 24 0.2 1.475±0.154 1.365±0.074

Bifenil 24 10 0.137±0.037 c3 1.502±0.062 a1

“ 24 30 0.225±0.014 a1b1c3 1.513±0.099

“ 24 50 0.337±0.047 a1b1c3 1.307±0.062 a2b1

“ 24 70 0.425±0.043 a2b2c3 1.330±0.058 a2b1

DMSO 48 8 µl/ml 0.262±0.051 1.766±0.030

MMC 48 0.2 2.412±0.165 1.377±0.052

Bifenil 48 10 0.325±0.101 c3 1.722±0.096 c1

“ 48 30 0.425±0.136 c3 1.635±0.102

“ 48 50 0.500±0.079 a1c3 1.435±0.088 a1b1

“ 48 70 0.662±0.124 a1b1c3 1.306±0.055 a2b2



48

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Kontrol DMSO

8 µl

MMC

0.2

10 30 50 70


MN

'li b

inükle

er

hücre

(%) MN 24 Saat

MN 48 Saat

Şekil 4.12. Farklı dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde mikronükleuslu iki nükleuslu hücre yüzdesi.

Şekil 4.13. Farklı dozlarda bifenil ile 24 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde mikronükleuslu iki nükleuslu hücre yüzdesinin doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05).

y = 0.0049x + 0.0858

r = 0.9976*

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 20 40 60 80


MN

'li b

inükle

er

hücre

(%)


49


lenfositlerinde mikronükleuslu iki nükleuslu hücre yüzdesinin doza bağlı artışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05).

Şekil 4.15. Bifenil ile muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde tek mikronükleus içeren iki nükleuslu hücre (x400) (30 µg/ml, 48 saat, ♀).

y = 0.0054x + 0.2608

r = 0.9738*

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 20 40 60 80


MN

'li b

inükle

er

hücre

(%)

10 µm


50

Şekil 4.16. Bifenil ile muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde iki

mikronükleus içeren iki nükleuslu hücre (x400) (10 µg/ml, 48 saat, ♀).

Hem 24 hem de 48 saatlik muamele sürelerinde bifenil’in nükleer bölünme

indeksini (NBI) her iki kontrol grubuna göre özellikle son iki dozda (50 ve 70 µg/ml)

önemli ölçüde düşürdüğü ve bu düşüşün pozitif kontrol seviyesine indiği

saptanmıştır (Çizelge 4.3 ve Şekil 4.17). Özellikle 48 saatlik muamele süresinde

NBI’ndeki düşüşün doza bağlı bir durum gösterdiği saptanmıştır (Şekil 4.18).

10 µm


51

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

Kontrol DMSO

8 µl

MMC

0.2

10 30 50 70


Nükle

er

Bölü

nm

e İ

ndeksi

NBI 24 Saat

NBI 48 Saat

Şekil 4.17. Farklı dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde nükleer bölünme indeksi.


lenfositlerinde nükleer bölünme indeksinin doza bağlı düşüşünü gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05).

4.4. Bifenil’in DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki Etkileri

Bifenil’in DNA replikasyonu üzerindeki etkisi RI’nin, mitoz bölünme

üzerindeki etkisi ise MI’in bulunması yoluyla saptanmıştır. Bifenil, 24 saatlik

y = -0.0072x + 1.8141

r = 0.9801*

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 10 20 30 40 50 60 70 80


NB

I


52

muamele süresinde RI’ni kontrole ve çözücü kontrole göre genel olarak düşürmüş,

fakat bu düşüş istatistiksel olarak önemli bulunamamıştır (Çizelge 4.4 ve Şekil 4.19).

48 saatlik muamele süresinde ise bifenil’in, RI’ini özellikle en yüksek dozda her iki

kontrol grubuna nazaran önemli derecede düşürmüş, bu düşüşün pozitif kontrol

seviyesinde olduğu saptanmıştır.

Bifenil, her iki muamele süresinde MI’i kontrole ve çözücü kontrole göre

önemli derecede düşürmemiştir. Bifenil, 24 saatlik muamele süresinde ve sadece 70

µg/ml konsantrasyonunda MI çözücü kontrole nazaran önemeli derecede

düşürmüştür (Çizelge 4.4 ve Şekil 4.20). 24 ve 48 saatlik muamelede MI’te görülen

düşüşün doza bağlı olduğu saptanmıştır (Şekil 4.21 ve Şekil 4.22).

Çizelge 4.4. Değişik dozda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilmiş insan periferal lenfositlerinde RI ve MI.

Test maddesi

Süre (saat)

Konsant. µg/ml

M1 M2 M3 RI±SE MI±SE

Kontrol - - 56 98 250 2.50±0.11 4.35±0.55

DMSO 24 8 µl/ml 43 109 248 2.51±0.05 4.98±0.41

MMC 24 0.2 79 137 184 2.26±0.08 4.41±0.77

Bifenil 24 10 53 128 221 2.43±0.11 4.97±0.23

“ 24 30 62 119 219 2.39±0.09 4.70±0.31

“ 24 50 83 127 191 2.27±0.17 4.01±0.39

“ 24 70 70 147 182 2.27±0.08 3.64±0.31 b1

DMSO 48 8 µl/ml 37 114 249 2.53±0.01 4.85±0.35

MMC 48 0.2 88 145 167 2.19±0.08 4.54±0.41

Bifenil 48 10 47 119 234 2.46±0.03 c2 5.03±0.21

“ 48 30 55 118 227 2.43±0.03 c1 4.59±0.25

“ 48 50 47 143 209 2.40±0.03 b1c1 4.38±0.42

“ 48 70 66 156 179 2.28±0.05 a1b1 4.14±0.44



53

2

2,1

2,2

2,3

2,4

2,5

2,6

Kontrol DMSO

8 µl

MMC

0.2

10 30 50 70


RI RI 24 Saat

RI 48 Saat

Şekil 4.19. Farklı dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal

lenfositlerinde RI.

0

1

2

3

4

5

6

Kontrol DMSO

8 µl

MMC

0.2

10 30 50 70


MI MI 24 Saat

MI 48 Saat

Şekil 4.20. Farklı dozlarda bifenil ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal

lenfositlerinde MI.


54


lenfositlerinde MI’in doza bağlı düşüşünü gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05).


lenfositlerinde MI’in doza bağlı düşüşünü gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (* P<0.05).

y = -0.0234x + 5.266

r = 0.9734*

0

1

2

3

4

5

6

0 10 20 30 40 50 60 70 80


MI

y = -0.0144x + 5.111

r = 0.9687*

0

1

2

3

4

5

6

0 10 20 30 40 50 60 70 80


MI

5. TARTIŞMA Şebnem PARLAK

55

5.TARTIŞMA

Bu çalışma, gıdalarda koruyucu madde olarak kullanılan ve aynı zamanda

fungisit olarak veya böceklere karşı pestisit olarak kullanılan bifenil’in insan

periferal lenfositlerinde kardeş kromatid değişimini (KKD=SCE), kromozom

anormalliklerini (KA=CA) ve mikronükleus (MN) oluşumunu artırıp artırmadığını

araştırmak ve bu testler yardımı ile insanlarda herhangi bir genotoksik etkiye sahip

olup olmadığını saptamak amacıyla yapılmıştır. Bu çalışmada, insan periferal

lenfositleri in vitro olarak 10, 30, 50 ve 70 µg/ml konsantrasyonlardaki bifenil ile 24

ve 48 saat muamele edilmiş ve çalışmadan elde edilen sonuçlar diğer araştırıcıların

sonuçlarıyla tartışılmıştır.

5.1. Bifenil’in KKD, KA ve MN Oluşumu Üzerindeki Etkileri

Bu çalışmada özellikle yüksek konsantrasyonlarda bifenil’in insan periferal

lenfositlerinde KKD oluşumunu hem 24 saat hem de 48 saat muamele edilen

kültürlerde her iki kontrole (muamelesiz kontrol ve çözücü kontrol) göre arttırdığı

bulunmuştur. Bu artışlar doza bağlı olarak gerçekleşmiştir. Özellikle yüksek

dozlardaki bifenil’in, 24 saatlik muamele süresinde KA sayısını her iki kontrole

(kontrol ve çözücü kontrol) nazaran önemli ölçüde artırdığı ve bu muamele süresinde

KA’nın doza bağlı olarak uyarıldığı fakat, bu artışın pozitif kontrol kadar olmadığı

saptanmıştır. Buna karşın, 48 saatlik muamele süresinde KA sayısını en yüksek iki

dozda arttırdığı ve KA sayısındaki artışın doza bağlı bir durum gösterdiği

saptanmıştır. Bifenil’in, 24 ve 48 saatlik muamele sürelerinde MN sayısını her iki

kontrol grubu ile karşılaştırıldığında özellikle yüksek dozlarda önemli derecede

arttırdığı saptanmıştır. Bu artış doza bağlı olarak gerçekleşmiştir.

Glatt ve ark. (1992), bifenil türevlerinin Salmonella typhimurium (TA98 ve

TA100) ve Çin sıçanlarının V79 hücrelerinde mutajenik etkilerini araştırmışlardır.

Bu araştırmalar sonucunda, bazı bifenil bileşikleri (Polybrominated biphenyls) in

vitro mutajenik denemelerde negatif sonuç verirken, bazıları da (3-Fluorobiphenyl)

Salmonella typhimurium TA100 suşunda kuvvetli mutajenik etki göstermiştir. Abilev


56

ve ark. (1993), bifenil’in 7 farklı türevinin karşılaştırmalı mutajenik aktivitesini

araştırmışlar ve bu amaçla Salmonella typhimurium ile çalışmışlardır. Bifenil

türevlerinin Salmonella typhimurium’un TA1537, TA97, TA1538, TA98 suşunda

çerçeve kayması mutasyonlarını indüklediğini göstermişlerdir. Sasaki ve ark. (1997),

birçok yaştaki farenin çeşitli organlarında, alkalin tek hücre jel elektroforez

analizlerini (SCG) (Comet testi) kullanarak, bifenil’in in vivo genotoksik etkisini

araştırmışlar ve bu deneyler için farenin mide, karaciğer, böbrek, mesane, akciğer,

beyin ve kemik iliği ile çalışmışlardır. Bu analizler sonucunda bifenil’in (2000

mg/kg), çalışılan birçok organda DNA zararlarını uyardığı saptanmıştır. Sasaki ve

ark. (2002), erkek farelerde ağız yoluyla bir defada 2000 mg/kg bifenil verildiğinde

gastrointestinal organlardaki DNA’da hasar meydana gelmesini uyardığını

saptamışlardır.

Yapılan bu çalışmada bifenil’in KA, KKD ve MN oluşumunu uyardığı

saptanmıştır. İncelenen kromozom anormallikleri içerisinde çok sayıda kromatid

kırığı görülmüştür. Buradan da bifenil’in DNA molekülünün şeker fosfat

omurgasındaki fosfodiester bağlarını kopardığı anlaşılmaktadır. Bu sebeplerden

dolayı bifenil’in genotoksik risk taşıyabileceği söylenebilir. Bu çalışmada bifenil’in

sadece yapısal kromozom anormalliklerine sebep olduğu fakat, sayısal kromozom

anormalliklerini artırmadığı saptanmıştır. Dolayısıyla bu sonuçlar bifenil’in

klastojenik etkisinin olduğunu fakat aneujenik etkisinin olmadığını göstermektedir.

Bu çalışmada saptanan KKD ve mikronükleus sayısındaki artış da bifenil’in

klastojenik etkisinden kaynaklanmış olabilir. Bifenil’in DNA’daki fosfodiester

bağlarını kırmasının mekanizması bilinmemektedir. Bazı araştırıcılar klastojenik

etkilerin ortaya çıkmasında hücrede bulunan topoisomeraz II (giraz) enziminin

önemli rol oynadığını belirtmişlerdir (Lynch ve ark. 2003, Müler ve Kasper, 2000;

Burden ve Osheroff, 1998). Burden ve Osheroff (1998), bazı kimyasal maddelerin

memeli topoisomeraz II enziminin DNA kırılma ve yeniden birleştirme siklusunu

bozduğunu, bu maddelerin ya enzimin katalitik etkisini yok ettiklerini veya DNA-

enzim arasındaki normal olan geçici ayrılmaları devamlı kılarak DNA’da çift iplik

kırıklarına sebep olduklarını (topoisomeraz zehirleri) bildirmişlerdir. Bu çalışmada

kullanılan bifenil’in de buna benzer topoizomeraz zehiri etkisi göstererek DNA


57

kırıklarına sebep olduğunu söyleyebiliriz. Nitekim Bender ve ark. (2006) kanserojen

olan poliklorinli bifenil bileşiğinin topoizomeraz zehiri gibi davranarak klastojenik

etki gösterdiğini saptamışlardır.

Bifenil türevlerinin Ames testinde mutajenik etki göstermesi ve özellikle

çerçeve kayması mutasyonlarını indüklemesi, ayrıca Comet testinde de DNA

kırıklarını artırması yönünde daha önce yapılan çalışmalardan elde edilen sonuçlar

bifenil’in klastojenik etkiye sahip olduğu şeklindeki sonuçlarımızı desteklemektedir.

Bu çalışmada farklı dozlarda bifenil’e maruz bırakılan insan periferal lenfositlerinde

KKD, KA ve MN sayısında doza bağlı olarak artış görülmüştür. Bu artış özellikle

son iki konsantrasyonda (50 ve 70 µg/ml) daha fazla göze çarpmaktadır. Ayrıca

başka araştırıcılar da çeşitli gıda koruyucu maddelerle yapmış oldukları

çalışmalarında, koruyucu maddelerin bazılarının KA ve KKD’yi uyardığını,

bazılarının da uyarmadığını saptamışlardır. Örneğin Basler ve ark. (1987),

Propiyonik asit’in genotoksik aktivitesini araştırmak üzere, SOS kromotesti,

Salmonella/mikrosom testi, E.coli tamir denemeleri, in vitro KKD testi ve in vivo

mikronükleus testlerini uygulamışlardır. Bu çalışmalarda E.coli tamir testi dışında

yapılan tüm testler negatif sonuç vermiştir. Bu sonuçlara göre araştırıcılar propiyonik

asitin mutajenik olmadığına karar vermişlerdir. Vernole ve ark. (1988), Benzoik

asit’in potasyum tuzlarının insan periferal lenfositlerinde KKD ve KA üzerine

etkilerini araştırmışlar ve sonuçta benzoik asitin KKD ve KA’yı arttırmadığını

bulmuşlardır. Meng ve Zhang (1992) in vitro koşullarda 5×10−5 M’dan 2×10−3 M’a

kadar çeşitli konsantrasyonlarda sodyum bisülfit’e maruz bırakılan insan periferal

lenfositlerinde kromozomal aberasyon frekansı, KKD ve mikronükleus incelemeleri

yapmışlardır. Bu çalışmalar sonucunda insan periferal lenfositlerinde sodyum

bisülfit’in KKD ve mikronükleus sayısında doza bağlı olarak artışa, mitotik indekste

ise doza bağlı olarak düşüşe neden olduğunu saptamışlardır. Meng ve Zhang (1994),

insan periferal lenfositlerinin farklı dozlarda sodyum bisülfit ile muamele edilmesi

sonucunda kromozomal aberasyon frekansının, kardeş kromatid değişimi sayısının

ve mikronükleus sayısının arttığını bulmuşlardır. Bu çalışmaya göre sodyum bisülfit

doza bağlı olarak KKD ve mikronükleus oluşumunu arttırmış, mitotik indeksi

düşürmüş ve dolayısıyla mitotik gecikmeye neden olmuştur. Ardito ve ark. (1996),


58

kültüre edilmiş insan periferal lenfositlerini tiabendazol ve diphenylamine’nin farklı

konsantrasyonlarıyla muamele etmişler, sonuçta bu fungisitlerin kardeş kromatid

değişimi sayısını zayıf bir şekilde arttırdığını bulmuşlardır. Buna karşın, replikasyon

indeksini tiabendazol’ün düşürdüğünü, fakat diphenylamine’nin bir etki yapmadığını

saptamışlardır. Philipose ve ark. (1997), Propiyonik asidin türevleri olan ibuprofen,

ketoprofen ve naproxen’in mutajenitesini Salmonella typhimurium’un TA97, TA98,

TA100 ve TA102 suşlarında, Ames testi ve fare kemik iliği hücrelerinde in vivo

KKD testi ile test etmişlerdir. Sonuçta Ames testinde her üç türevin mutajen

olmadığını, fakat fare kemik iliği hücrelerinde KKD’ni zayıf bir şekilde artırdığını ve

Salmonella typhimurium’un TA98 suşlarında 160 µg/plate dozda mutasyonu

artırdığını bulmuşlardır. Rencüzoğulları ve ark. (2001b), Sodyum metabisülfit’in

insan periferal lenfositlerinde KA ve KKD’yi artırdığını, replikasyon indeksini (RI)

ve mitotik indeksi (MI) düşürdüğünü bulmuşlardır. Ayrıca bifenil’in dahil olduğu

poliklorinli hidrokarbonların hepsinin değişik canlılarda ve değişik test sistemleriyle

hem mutajenik hem de çoğunun kanserojenik etkiye sahip oldukları belirtilmiştir

(Knerr ve Schrenk, 2006; Ptak ve ark., 2006; Cachot ve ark., 2006; Song ve ark.,

2006; Masuda ve ark., 2004).Yukarıdaki sonuçlar göz önünde bulundurulacak olursa,

gıda koruyucu maddelerinin bazılarının KKD, KA ve MN oluşumunu uyardıkları ve

ayrıca poliklorinli hidrokarbonlu bileşiklerin de genotoksik risk taşıyabilecekleri göz

önüne alınmalıdır. Aynı şekilde bifenil de klastojenik etkisinden dolayı genotoksik

bir risk oluşturabileceği söylenebilir. Fakat bu görüşü kuvvetlendirmek için bifenil’in

muhtemel genotoksik etkisinin in vivo test sistemleriyle de saptanması

gerekmektedir.

5.2. Bifenil’in DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki Etkileri

Bu çalışmada bifenil’in DNA replikasyonu üzerindeki etkisi replikasyon

indeksinin (RI), mitoz bölünme üzerindeki etkisi ise mitotik indeksin (MI) ve nükleer

bölünme indeksinin (NDI) saptanması yoluyla bulunmuştur. Bu çalışmada bifenil 24

ve 48 saatlik muamele sürelerinde RI’ni hem kontrole hem de çözücü kontrole

nazaran önemli ölçüde düşürmüş ve bu düşüş doza bağlı olarak gerçekleşmiştir. Bu


59

nedenle bifenil’in DNA replikasyonunu olumsuz yönde etkilediğini söyleyebiliriz.

Bifenil her iki muamele süresinde MI’i etkilememiş fakat, NDI’ni her iki muamele

süresinde ve her iki kontrole göre düşürdüğü saptanmıştır. Bu sonuçlardan da

bifenil’in mitoz bölünmeyi olumsuz etkileyerek hücre bölünmesini baskı altına aldığı

söylenebilir.

Bifenil DNA replikasyonunu ve mitoz bölünmeyi olumsuz etkileyerek in vitro

insan lenfositlerinde sitotoksik etki gösterdiği açıktır. Epel (1963) ve ayrıca Jain ve

Andsorbhoy (1988) kimyasalların hücre enerji üretim merkezlerinin fonksiyonlarını

baskı altında tutmaları ve dolayısıyla ATP sentezinin azaltılması sonucu hücre

bölünmesinin yavaşlatıldığını ve sitotoksik etkinin ortaya çıktığını bildirmişlerdir.

Bazı araştırıcılar da kimyasal maddelerin KA’yı uyarma yoluyla sitotoksik etkiye

sahip olabileceğini ileri sürmüşlerdir (Armstrong ve ark. 1992; Hilliard ve ark. 1998;

Galloway ve ark. 1998). Vock ve ark. (1998) ve Kirkland ve Müller (2000) bazı

kimyasalların in vitro sitotoksik etkilerinin DNA çift iplik kırıklarının oluşmasına

bağlı olarak ortaya çıktığını bildirmişlerdir. Bu çalışmada bifenil DNA çift iplik

kırıklarına sebep olarak kromozom yapı anormalliklerini artırdığı saptanmıştır.

Muhtemelen bifenil sitotoksik etkisini bu yolla göstermiş olabilir.

Ayrıca Madle ve ark. (1993), KA içeren hücrelerin mitotik seleksiyon yoluyla

döngüden çıkartılacağını ve dolayısıyla MI’in düşürüleceğini bildirmişlerdir. Mitotik

seleksiyon, bölünme yönünden aktif olan hücrelerde kromozom aberasyonlu

hücrelerin eleminasyonu olarak tanımlanabilir. Yani mitotik seleksiyon tamir

edilemeyecek kromozom aberasyonu içeren hücrelerin hücre döngüsünden

uzaklaştırılması ve öldürülmesi olayıdır. Bu araştırıcılara göre mitotik seleksiyona,

DNA fragmentasyonu ve bunun sonucunda oluşan köprü oluşumu, asentrik

(kinetokorsuz) fragmentlerin kaybolması ile oluşan gen kaybı veya bunların

sonucunda mikronükleus oluşumu dolayısıyla genetik materyalin kaybı gibi

anormallikler sebep olmaktadır.

Dolayısıyla, bifenil in vitro insan lenfositlerinde ya ATP üretimini baskı altında

tutmasından ya da klastojenik etkisinden dolayı hücre bölünmesini azalttığı ve

sitotoksik etki gösterdiği söylenebilir.

6. SONUÇ VE ÖNERİLER Şebnem PARLAK

60

6. SONUÇ VE ÖNERİLER

Bu çalışmada farklı konsantrasyonlardaki bifenil ile 24 ve 48 saatlik sürelerde

muamele edilen insan periferal lenfositlerinde özellikle yüksek dozlarda KKD, KA

ve MN sayısı her iki kontroldekine (kontrol ve çözücü kontrol) nazaran artmıştır.

KKD, KA ve MN sayısındaki artış genellikle doza bağlı olarak gerçekleşmiş fakat,

pozitif kontrol olan MMC’nin etkisi kadar olamamıştır. Bu çalışmada bifenil, hem 24

saatlik hem de 48 saatlik muamele sürelerinde RI ve NBI’ni her iki kontroldekine

nazaran önemli ölçüde düşürmüş ve bu düşüş doza bağlı olarak gerçekleşmiştir.

Ayrıca bifenil gen mutasyon testlerinde mutajenik etki göstermiş, Comet deneyinde

de DNA kırılmasını uyardığı bildirilmiştir.

Sonuç olarak bifenil’in genotoksik ve sitotoksik risk taşıması ihtimali

yüksektir. Ancak kesin sonuca varılabilmesi için in vivo testler ile bifenil’in

genotoksisitesinin araştırılması gerekmektedir. Ayrıca gıda katkı maddeleri

kullanılmadan önce bunların taze hazırlanmış ve bekletilmiş çözeltileri ile

genotoksisite çalışmalarının mutlaka yapılması gerekir. Bu çalışmalardan elde

edilecek sonuçlara göre söz konusu maddenin gıda katkı maddesi olarak kullanılıp

kullanılmayacağına karar verilmelidir.

61

KAYNAKLAR ABE, S. ve SASAKI, M., 1977. Chromosome aberrations and sister chromatid

exchanges in Chinese hamster cells exposed to various chemicals. J. Natl.

Cancer Inst. 58, 1635-1643.

ABILEV, S.K., LIUBIMOVA, I.K. ve MIGACHEV, G.I., 1993. Effect of structural

features of nitro-derivatives of fluorenone and biphenyl on frameshift

mutagenesis in tester strains of Salmonella typhimurium. 29(10):1640-5.

AKIN, A. ve SÜMER, S., 1991. The mutagenic effects of sodium nitrite and

monosodium glutamate used as food additives demonstrated by the Salmonella

microsome test system. Microbiol. Bul. 25: 94-107.

ALBERTINI, R. J., ANDERSON, D., DOUGLAS, G. R., HAGMAR, L.,

HEMMINKI, K., MERLO, F., NATARAJAN, A. T., NORPPA, H., SHUKER,

D. E., TICE, R., WATERS, M. D. ve AITIO, A., 2000. IPCS guidelines for the

monitoring of genotoxic effects of carcinogens in humans. International

Programme on Chemical Safety. 463(2): 111-72.

ALTUĞ, T., 1999. Gıda katkı maddeleri. Hekim ve Yaşam. Sayı: Haziran 99. Sy:

29-31.

ARDITO, G., BRAMANTI, B., BIGATTI, P., LAMBERTI, L. ve DOLARA, P.,

1996. Cytogenetic effect of thiabendazole and diphenylamine on cultured human

lymphocytes: Sister chromatid exchanges and cell cycle delay. Ball Soc Ital Biol

Sper. 72(5-6), 171-178.

ARMSTRONG, M. J., BEAN, C. L. ve GALLOWAY, S.M., 1992. A quantitative

assessment of cytotoxicity associated with chromosomal aberration detection in

Chinese hamster ovary cells. Mutat. Res. 265, pp. 45–60.

ARSLAN, M., 2004. Borik Asit’in insan periferal lenfositlerinde in vitro kromozom

aberasyonu ve kardeş kromatid değişimi üzerindeki etkileri. Yüksek Lisans Tezi.

Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı, Adana.

BASLER, A., VON DER HUDE, W. ve SCHEUTWINKEL, M., 1987. Screening of

the food additive propionic acid for genotoxic properties. Food Chem Toxicol.

25(4), 287-290.

62

BENDER, R.P., LEHMLER, H.J., ROBERTSON, L.W., LUDEWIG, G. ve

OSHEROFF, N., 2006. Polychlorinated biphenyl quinone metabolites poison

human topoisomerase IIalpha: altering enzyme function by blocking the N-

terminal protein gate. Biochemistry 45(33):10140-10152.

BURDEN, D.A. ve OSHEROFF, N., 1998. Mechanism of action of eukaryotic

topoisomerase II and drugs targeted to the enzyme. Biochim. Biophys. Acta.

1400(1-3):139-54

CACHOT, J., GEFFARD, O., AUGAGNEUR, S., LACROİX, S., LE MENACH, K.,

PELUHET, L., COUTEAU, J., DENIER, X., DEVIER, M.H., POTTIER, D. ve

BUDZINSKI, H. 2006. Evidence of genotoxicity related to high PAH content of

sediments in the upper part of the Seine estuary (Normandy, France). Aquat.

Toxicol. 79(3), 257-67.

CARRANO, A.V., THOMPSON, L.H., LINDI, P.A. ve MINKLER, J.L., 1978.

Sister Chromatid Exchanges As An Indicator Of Mutagenesis. Nature. 271, 551-

553.

CHLOPKIEWICZ, B., EJCHART, A. ve MARCZEWSKA, J., 1995. Studies on the

mechanism of mutagenicity and genotoxicity induced by dihydralazine. Acta

Biochim. Pol.; 42(3):291-5.

DELESCLUSE, C., LEDIRAC, N, LI, R., PIECHOCKI, M.P., HINES, R. N.,

GIDROL, X. ve RAHMANI, R., 2001. Induction of cytochrome P450 1A1 gene

expression, oxidative stres, and genotoxicity by carbaryl and thiabendazole in

transfected human HepG2 and lymphoblastoid cells. Biochem Pharmacol. 2001

Feb 15;61(4):399-407.

DÖNBAK, L., RENCÜZOĞULLARI, E. ve TOPAKTAŞ, M., 2002. The

cytogenetic effects of the food additive boric acid in Allium cepa L. Cytologia.

67, 153-157.

EPEL, D., 1963. The effects of carbonmonoxide inhibition of ATP level and the date

of mitosis in Sea Urchin egg. J. Cell. Biol. 17: 315-319.

EVANS, H.J., 1984. Handbook of Mutagenicity Test Procedures. In: Kilbey, B.J.,

Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C. (Eds.), Human peripheral blood

63

lymphocytes for the analysis of chromosome aberrations in mutagen tests.

Second edition, Elsevier Science Publishers, BV, pp. 405-427.

FENECH, M., 2000. The in vitro micronucleus technique. Mutat. Res. 455, 81–95.

FERRAND, C., MARC, F., FRITSCH, P., COSSAND, P. ve DE SAINT

BLANGUAT, G., 2000a. Mutagenicity and genotoxicity of sorbic acid. Toxicol

In Vitro. 14(5), 423-428.


BLANGUAT, G., 2000b. Chemical and toxicologial studies of products resulting

from sorbic acid and methylamine interaction in food condition. Amino Acids.

18(3), 251-263.


BLANGUAT, G., 2000c. Genotoxicity study of reaction products of sorbic acid

J. AGRIC FOOD CHEM. 48(8), 3605-3610.

GALLOWAY, S.M., MILLER, J.E., ARMSTRONG, M.J., BEAN, C.L., SKOPEK,

T.R. ve NICHOLS, W.W., 1998. DNA synthesis inhibition as an indirect

mechanism of chromosome aberrations: comparison of DNA-reactive and non-

DNA-reactive clastogens. Mutat. Res. 400, pp. 169–186.

GLATT, H., ANKLAM, E. ve ROBERTSON, L.W., 1992. Biphenyl and fluorinated

derivatives: liver enzyme-mediated mutagenicity detected in Salmonella

typhimurium and Chinese hamster V79 cells. 281(3):151-6.

HASEGAWA, M. M., NISHI, Y., OHKAWA, Y. ve INUI N., 1984. Effects of

sorbic acid and its salts on chromosome aberrations, sister chromatid exchanges

and gene mutations in cultured Chinese hamster cells. Food Chem Toxicol.

22(7), 501-507.

HILLIARD, C.A., ARMSTRONG, M.L., BRADT, C.I., HILL, R.B.,

GREENWOOD, S.K. ve GALLOWAY, S.M., 1998. Chromosome aberrations in

vitro related to cytotoxicity of non-mutagenic chemicals and metabolic poisons.

Environ. Mol. Mutagen. 31(4):316-26.

HUBBARD, S.A., 1998. Comporative toxicology of borates. Biol Trace Elem Res.

66(1-3), 343-357.

64

ISHIDATE, M. Jr. ve ODASHIMA, S., 1977. Chromosome test with 134

compounds on Chinese hamster cells in vitro a screaning for chemical

carcinoges. Mutat. Res. 48, 337-353.

JAIN, A. K. ve ANDSORBHOY, R. K. 1988. Cytogenetical studies on the effects of

some chlorinated pesticides III. Concluding remarks. Cytologia 53: 427-436.

JUNG, R., COJOCEL, C., MULLER, W., BATTGER, D. ve LUCK, E., 1992.

Evaluation of the genotoxic potential of sorbic acid and potassium sorbate. Food

Chem. Toxicol. 30(1), 1-7.

KAUDERER, B., ZAMITH, H., PAUMGARTTEN, F. J. ve SPEIT, G., 1991.

Evaluation of the mutagenicity of beta-myrcene in mammalian cells in vitro.

Environ. Mol. Mutagen. 18(1), 28-34.

KAYRALDIZ, A., 2005. Sodyum Metabisülfit’in sıçan kemik iliği hücrelerinde in

vivo genotoksik etkileri. Doktora Tezi. Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji

Anabilim Dalı, Adana.

KAYRALDIZ, A., KAYA, F.F., CANIMOĞLU, S. ve RENCÜZOĞULLARI, E.,

2006. Mutagenicity of five food additives in Ames/Salmonella/Microsome test.

Annals of Microbiology. 56, 129-133.

KINASHI, Y., MASUNAGA, S., TAKAGAKI, M. ve ONO, K., 1997. Mutagenic

effects at HPGRT locus induced in Chinese hamster ovary cells by thermal

neutrons with or without boron compound. Mutat. Res. 377, 211-215.

KIRKLAND, D.J.ve MULLER, L., 2000. Interpretation of the biological relevance

of genotoxicity test results: the importance of thresholds. Mutat. Res. 464 (2000),

pp. 137-147.

KIRSCH-VOLDERS, M., SOFUNI, T., AARDEMAC, M., ALBERTINI, S.,

EASTMOND, D., FENECH, M., ISHIDATE, JR.M., KIRCHNER, S., LORGE,

E., MORITA, T., NORPPA, H., SURRALLΕS, J., VANHAUWAERT, A. ve

WAKATA, A., 2003 Report from the in vitro micronucleus assay working

group. Mutat. Res. 540, 153–163.

65

KITANO, K., FUKUKAWA, T., OHTSUJI, Y., MASUDE, T. ve YAMAGUCHI,

H., 2002. Mutagenicity and DNA-damaging activity caused by decomposed

products of potassium sorbate reacting with ascorbic acid in the presence of Fe

salt. Food. Chem. Toxicol. 40(11):1589-94.

KNERR, S. ve SCHRENK, D., 2006. Carcinogenicity of "non-dioxinlike"

polychlorinated biphenyls. Crit. Rev.Toxicol. 36(9), 663-94.

LEONARD A. ve LEONARD E.D., 1979. Mutagenicity test with saccharin in the

male mouse. J. Environ. Pathol. Toxicol. 2(4):1047-1053.

LIEWEN, M. B. ve MARTH, E.H., 1985. Evaluation of 1,3-pentadiene for

mutagenicity by the salmonella/mammalian microsome asay. Mutat. Res.

157(1),49-52.

LUCA, D., LUCA, V., COTOR, F. ve RAILEANU, L., 1987. In vivo and in vitro

cytogenetic damage induced by sodium nitrite. Mutat. Res. 189(3):333-9.

LYNCH, A., HARVEY, J., AYLOTT, M., NICHOLAS, E., BURMAN, M.,

SIDDIQUI, A., WALKER, S. ve REES, R., 2003. Investigations into the concept

of a threshold for topoisomerase inhibitor-induced clastogenicity. Mutagenesis

vol. 18 no. 4 pp. 345-353.

MACE, M.L.JR., DASKAL, Y. ve WRAY, W., 1978. Scanning electron microscopy

of chromosome aberrations. Mutat. Res. 52, 199–206.

MADLE, S., BEEK, B. ve NOWAK, C., 1993. Zum Verständnis von

Chromosomenmutationstests an Somazellen. Mutationsforschung und Genetische

Toxikologie. In: Fahrig R. (ed), Wissenschaftliche Buchgesellschaft Publishers,

pp 224-242.

MAILHES, J.B., YOUNG, D., AARDEMA, M. J. ve LONDON, S. N., 1997.

Thiabendazole induced cytogenetic abnormalities in mouse oocytes. Environ.

Mol. Mutagen. 29(4), 367-371.

MASUDA, S., DEGUCHI, Y., MASUDA, Y., WATANABE, T., NUKAYA, H.,

TERAO, Y., TAKAMURA, T., WAKABAYASHI, K. ve KINAE, N. 2004.

Genotoxicity of 2-[2-(acetylamino)-4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-5-

methoxyphenyl]-5-amino-7-bromo-4-chloro-2H-benzotriazole (PBTA-6) and 4-

66

amino-3,3'-dichloro-5,4'-dinitro-biphenyl (ADDB) in goldfish (Carassius auratus)

using the micronucleus test and the comet assay. Mutat. Res. 560(1), 33-40.

MATSUI, M., MATSUI, K., KAWASAKI, Y., ODA, Y., NOGUCHI, T.,

KITAGAWA, Y., SAWADA, M., HAYASHI, M., NOHMI, T., YOSHIHIRA,

K., ISHIDATE, M. ve SOFUNI, T., 1996. Evoluation of the genotoxicity of

stevioside and steviol using six in vitro and in vivo mutagenicity assay.

Mutagenesis. 11(6), 573-579.

MC GREGOR, D. B., BRAWN, A., CATTONACH, P., EDWARDS, I., MC

BRIDE, D., RIACH, C. ve COSPARY, W. J., 1988. Responses of the L5178Y

tk+/tk-mause lymphoma cell forward mutation assay: III. 72 coded chemicals.

Environ. Mol. Mutagen. 12(1), 85-154.

MENG, Z. ve ZHANG, B. 1992. Cytogenetic damage induced in human

lymphocytes by sodium bisulfite, Mutat. Res. 298 (1992) 63-69.

MENG, Z. ve ZHANG, B. 1994. Chromosomal aberrations, sister chromatid

exchanges and micronuclei induced in human lymphocytes by sodium bisulfite

(sulfur dioxide). I Chuan Hsueh Pao., 21(1), 1-6.

MUDRY, D.E. ve PARGAMENT, M.D., 1987. Mutagenic bioassay of certain

pharmacological drugs. I. Thiabendazole(TBZ). Mutat Res. 188(1), 1-6.

MUKHERJEE, A. ve CHAKRABARTI, J., 1997. In vivo cytogenetic studies on

mice exposed to acesulfame-K a non-nutritive sweetener. Food Chem Toxicol.;

35(12): 1177-1179.

MUKHERJEE, A., GIRI, A. K., TALUKDER, G. ve SHARMA, A., 1988. Sister

chromatid exchanges and micronuclei formations induced by sorbic acid and

sorbic acid-nitrite in vivo in mice. Toxicol. Let. 42, 47-53.

MULLER, L. ve KASPER, P., 2000. Human biological relevance and the use of

threshold-arguments in regulatory genotoxicity assessment: experience with

pharmaceuticals. Mutat. Research/Genetic Toxicology and Environmental

Mutagenesis Volume 464, Issue 1, Pages 19-34.

MUNZER, R., GUIGAS, C. ve RENNER, H.W., 1990. Re-examination of potassium

sorbate and sodium sorbate for possible genotoxic potential, Food. Chem.

Toxicol.; 28(6), 397-401.

67

MURINDA, S. E., RASHID, K. A. ve ROBERTS, R., 2003. In vitro assessment of

the cytotoxicity of nisin, pediocin and selected colicins on simian virus 40

transfected human colon and vero monkey kidney cells with trypan blue staining

viability assays. J. Food Prot. 66(5), 847-853.

NAGAO, M., HONDA, M., SEINO, Y., YAHAGI, T. ve KAWACHI, T., 1977.

Mutagenicities of protein pyrolysates. Cancer Lett. 2(6), 335-339.

NAIR, B., 2001. Final report on the safety assessment of Benzyl Alcohol, Benzoic

Acid and Sodium Benzoate. Int. J. Toxicol. 3:23-50.

NAIR, B. ve ELMORE, A.R., 2003. Final report on the safety assessment of sodium

sulfite, potassium sulfite, ammonium sulfite, sodium bisulfite, ammonium

bisulfite, sodium metabisulfite and potassium metabisulfite. Int. J. Toxicol. 2:63-

88.

NAKANO, T., OKAICHI, K., MATSUMOTO, H., KIMURA, R., YAMAMOTO,

K., AKASAKA, S. ve OHNISHI, T., 1995. Mutations of a shuttle vector plasmid,

p2189 in Esherichia coli induced by boron neutron captured beam (BNCB)

containing alpha particles. Mutat. Res. 336(2), 153-159.

NATIONAL TOXICOLOGY PROGRAM., 1987. Toxicology and carcinogenesis

studies of Boric Acid. Natl. Toxicol. Program Tech. Rep. Ser. 324, 1-126.

NJAGI, G. D. ve GOPALAN, H.N., 1982. Cytogenetic effects of the food

preservatives sodium benzoate and sodium sulphite on vicia faba root meristems.

Mutat. Res. 102(3), 213-219.

ODUNOLA, O.A., 1997. Individual and combined genotoxic response of boric acid

B1 in Escherichia coli PQ37. East Afr. Med. J. 74(8) 499-502.

OHARA, A., MIZUNO, M., DANNO, G., KANAZAWA, K., YOSHIOKA, T. ve

NATAKE, M., 1988. Mutagen formed from tryptophan reacted with sodium

nitrite in acidic solution. Mutat. Res. 206(1), 65-71.

OTUBANJO, O. A. ve MOSURO, A. A., 2001. An in vivo evaluation of induction

of abnormal sperm morphology by some anthelmintic drugs in mice. Mutat. Res.

499(1-2), 131-138.

PAGANO, D.A. ve ZEIGER, E., 1987. Conditions affecting the mutagenicity of

sodium bisulfite in Salmonella typhimurium. Mutat. Res. 179: 159-166.

68

PAZ-Y-MINO, C., BUSTAMANTE, G., SANCHEZ, M.E. ve LEONE, P.E., 2002.

Cytogenetic monitoring in a population occupationally exposed to pesticides in

Ecuador. Environ. Health Perspective. 110, 1077-1080.

PERRY, P. ve EVANS, H.J., 1975. Cytological Detection Of Mutagen-Carcinogen

Exposure By Sister Chromatid Exchange. Nature. 258, 121-125.

PERRY, P.E. ve THOMSON, E.J., 1984. The methodology of sister chromatid

exchanges, in: B.J. Kilbey, M. Legator, W. Nichols and C. Ramel (Eds.),

Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, Elsevier, Amsterdam,

pp. 459–529.

PHILIPOSE, B., SINGH, R., KHAN, K. A. ve GIRI, A.K., 1997. Comparative

mutagenic and genotoxic effects of three propionic acid derivatives ibuprofen,

ketoprofen and naproxen. Mutat. Res. 393(1-2), 123-131.

POLLER, F., BAUCH, T., SAVERWEIN, W., BOCKER, W., WITTING, A. ve

STREFFER, C., 1996. Comet assay study of DNA damage and repair of tumour

cells following boron neutron capture irradiation with fast d(14)+Be neutrons. Int

J Radiat Biol. 70(50), 593-602.

PTAK, A., LUDEWIG, ı., KAPISZEWSKA, M., MAGNOWSKA, Z., LEHMLER,

H.J., ROBERTSON, L.W. ve GREGORASZCZUK, E.L. 2006. Induction of

cytochromes P450, caspase-3 and DNA damage by PCB3 and its hydroxylated

metabolites in porcine ovary. Toxicol. Lett. 166(3), 200-11.

RAO, T.K., STOLTZ, D.R. ve EPLER, J.L., 1979. Lack of enhancement of

chemical mutagenesis by saccharin in the Salmonella assay. Arch Toxicol.;

43(2):141-145.

RENCÜZOĞULLARI, E. ve TOPAKTAŞ, M., 1991. The Relationship between

Quantities of Bromodeoxyuridine and Human Peripheral Blood with

Determination of the Best Differential Staining of Sister Chromatids Using

Chromosome Medium-B. Fen ve Mühendislik Bilimleri Dergisi, 5(3), 19-24.

RENCÜZOĞULLARI, E., İLA, HB., KAYRALDIZ, A. ve TOPAKTAŞ, M.,

2001b.Chromosome aberrations and sister chromatid exchanges in cultured

human lymphocytes treated with sodium metabisulfite, a food preservative,

Mutation Res. 490, 107-112.

69

RENCÜZOĞULLARI, E., KAYRALDIZ, A., İLA, H.B., ÇAKMAK, T. ve

TOPAKTAŞ, M., 2001a. The cytogenetic effects of sodium metabisulfite, a food

preservative in root tip cells of Allium cepa L, Turkish J. of Biology 25, 361-370.

SASAKI, Y.F., KAWAGUCHI, S., KAMAYA, A., OHSHITA, M., KABASAWA,

K., IWAMA, K., TANIGUCHI, K. ve TSUDA, S., 2002. The comet assay with

8mouse organs: results with 39 currently used food additives. Mutat Res.; 519(1-

2):103-119.

SASAKI, Y.F., SAGA, A., AKASAKA, M., YOSHIDA, K., NISHIDATE, E., S.U,

Y.Q., MATSUSAKA, N. and TSUDA, S., 1997. In vivo genotoxicity of ortho-

phenylphenol, biphenyl, and thiabendazole detected in multiple mouse organs by

the alkaline single cell gel electrophoresis assay. Mutat. Res. 395(2-3), 189-98.

SCHIFFMANN, D. ve SCHLATTER, J., 1992. Genotoxicity and cell transformation

studies with sorbates in Syrian hamster embryo fibroblasts. Food Chem.

Toxicol. 30(8), 669-672.

SCHLATTER, J., WURGLER, F. E., KRANZLIN, R., MAIER, P., HALLIGER, E.

ve GRAF, U., 1992. The potential genotoxicity of sorbates: effects on cell cycle

in vitro in V79 cells and somatic mutations in Drosophila. Food. Chem.

Toxicol.30(10), 843-851.

SCHMID, T. E., XU, W. ve ADLER, I. D., 1999. Detection of aneuploidy by

multicolor FISH in mouse sperm after in vivo treatment with acrylamide,

diazepam or thiabendazole. Mutagenesis. 14(2), 173-179.

SONG, Y.F., WILKE, B.M., SONG, X.Y., GONG, P., ZHOU, Q.X. ve YANG, G.F.

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs)

and heavy metals (HMs) as well as their genotoxicity in soil after long-term

wastewater irrigation. Chemosphere. 65(10), 1859-68.

SPEIT, G. ve HAUPTER, S., 1985. On the Mechanism of Differential Giemsa

Staining of Bromodeoxyuridine Substituted Chromosomes. II. Differences

Between the Demostration of Sister Chromatid Differentiation and Replication

Patterns. Hum. Gen., 70, 126-129.

70

SURJAN, A., 1989. Analysis of genotoxic activity of 16 compounds and mixtures by

the Drosophila mosaic test. Ann Ist Super Sanita. 25(4), 569-572.

SUSHKO, S.N. ve MALENCHENKO, A.F., 1992. Chromosome aberration

induction in murine spermatocytes in joint exposure to radiation and sodium

nitrite and nitrate. 32(4):500-5.

SUZUKI, H. ve SUZUKI, N., 1988. Mutagenicity of saccharin in a human cell

strain. Mutat. Res. 209(1-2), 13-16.

TOHDA, H., HORAGUCHI, K., TAKAHASHI, K., OIKAWA, A. ve

MATSUSHIMA, T., 1980. Epstein-Barr virus-transformed human

lymphoblastoid cells for study of sister chromatid exchange and their

evaluationas a test system. Cancer Res. Dec; 40(12): 4775-4780.

TOPAKTAŞ, M. ve SPEIT, G., 1990. Sister Chromatid Exchange (SCE) Testinin

Mutajenite ve Kanserojenitenin Belirlenmesinde Kullanılması. Ç.Ü. Sağlık Bil.

Der., 5(1,2,3), 73-84.

TSUDA, H., INUI, N., ve TAKAYAMA, S., 1976. In vitro transformation of

newborn hamster cells induced by sodium nitrite. Gann. 67(2), 165-173.

VERNOLE, P., CAPOROSSI, D., TEDESCHI, B., MELINO, G., PORFIRIO, B.,

BONMASSAR, E. ve NICOLETTI, B., 1988. Sister chromatid exchanges in

human lymphoctes exposed to 1-p-(3-methyltriazeno) benzoic acid potassium

salt. Mutat. Res., 208(3-4), 233-236.

VOCK, E.H., LUTZ, W.K., HORMES, P., HOFFMANN, H.D. ve VAMVAKAS,

S., 1998. Discrimination between genotoxicity and cytotoxicity in the induction

of DNA double-strand breaks in cells treated with etoposide, melphalan,

cisplatin, potassium cyanide, Triton X-100 and γ-irradiation. Mutat. Res. 413 pp.

83–94.

WALKER, R., 1990. Toxicology of sorbic acid and sorbates. Food. Addit. Contam.

7, 671-676.

71

WATANABE-AKANUMA, M., OHTA, T. ve SASAKI, Y.F., 2005. A novel

genotoxic aspect of thiabendazole as a photomutagen in bacteria and cultured

human cells. 15;158(3):213-9.

WATANABE-AKANUMA, M., OHTA, T. ve YAMAGATA, H., 2003.

Photomutagenicity of thiabendazole, a postharvest fungicide, in bacterial assays.

Environ Mol Mutagen.41(2):92-8.

WOLFF, S. ve RODIN, B., 1978. Saccharin-induced sister chromatid exchanges in

Chinese hamster and human cells, Science. 200(4341), 543-545.

ZEIGER, E., ANDERSON, B., HAWORTH, S., LAWLOR, T. ve MORTELMANS,

K., 1988. Salmonella mutagenicity tests: IV. Results from the testing of 300

chemicals. Environ. Mol. Mutagen. 11, 1-157.

72

ÖZGEÇMİŞ

1982 yılında Hatay’ın İskenderun ilçesinde doğdum. İlk, Orta ve Lise

öğrenimimi burada tamamladıktan sonra 1999 yılında Çukurova Üniversitesi Fen

Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Lisans Programını kazandım. 2003 yılında bu

bölümden Biyolog ünvanı ile mezun oldum. Aynı yıl yüksek lisans sınavlarını

kazanarak Çukurova Üniversitesi Yabancı Diller Eğitim Merkezinde İngilizce

hazırlık sınıfına gittim. Daha sonra 2004 yılında Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri

Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalında Yüksek Lisans öğrenimime başladım.

Çukurova Ün İvers İtes İ fen b İlİmler İ enst İtÜsÜ...

Documents