uji aktivitas antibiofilm aspergillus oryzae

UJI AKTIVITAS ANTIBIOFILM Aspergillus oryzae

TERHADAP BIOFILM Klebsiella pneumoniae

SKRIPSI

Oleh:

WALIMATUS SYA’DIYAH

17910003

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU

KESEHATAN

UIN MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG

2021

II



SKRIPSI

Diajukan Kepada:

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim

Malang

Untuk Memenuhi Salah Satu Persyaratan dalam

Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran (S.Ked)

Oleh:


17910003

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU

KESEHATAN

UIN MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG

2021

III



SKRIPSI

Oleh:


17910003

Telah Diperiksa dan Disetujui untuk Diuji

Tanggal: 24 Juni 2021

Pembimbing I Pembimbing II

dr. Iwal Reza Ahdi, Sp.PD dr. Ana Rahmawati, M.Biomed

NIP. 198607202018011002 NIP. 197412032009122001

Mengetahui,

Ketua Program Studi Pendidikan Dokter

dr. Ana Rahmawati, M.Biomed

NIP. 197412032009122001

IV



SKRIPSI

Oleh:


17910003

Telah dipertahankan di Depan Dewan Penguji Skripsi dan Dinyatakan

Diterima Sebagai Salah Satu Persyaratan untuk Memperoleh Gelar

Sarjana Kedokteran (S.Ked)

Tanggal: 24 Juni 2021

Penguji Utama dr. Lailia Nur Rachma, M.Biomed

NIP. 198406232011012009

Ketua Penguji dr. Ana Rahmawati, M.Biomed

NIP. 197412032009122001

Sekretaris

Penguji

dr. Iwal Reza Ahdi, Sp.PD

NIP. 198607202018011002

Mengesahkan,

Ketua Program Studi Pendidikan Dokter

dr. Ana Rahmawati, M.Biomed

NIP. 197412032009122001

VI

KATA PENGANTAR

Assalamualaikum Wr. Wb

Puji syukur penulis haturkan kehadirat Allah Swt. yang telah

melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Aktivitas Antibiofilm

Aspergillus oryzae Terhadap Biofilm Klebsiella pneumoniae” dengan

baik dan sesuai dengan waktu yang direncanakan dalam rangka

memenuhi sebagian persyaratan dalam memperoleh gelar Sarjana

Kedokteran (S.Ked) pada Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Maulana

Malik Ibrahim Malang.

Selanjutnya penilis haturkan ucapan terima kasih seiring doa

kepada semua pihak yang telah membantu terselesaikannya skripsi ini.

Ucapan terima kasih ini penulis sampaikan kepada:

1. Prof. Dr. H. Abd. Haris, M.Ag, selaku rektor UIN Maulana Malik

Ibrahim Malang.

2. dr. Ana Rahmawati, M.Biomed. selaku Ketua Program Studi

Pendidikan Dokter FKIK UIN Maulana Malik Ibrahim Malang dan

selaku dosen pembimbing II yang telah banyak memberikan

pengarahan, bimbingan, dan pengalaman yang sangat berharga.

VII

3. dr. Iwal Ahdi Reza, Sp.PD selaku dosen pembimbing I yang telah

memberikan pengarahan, bimbingan, dan pengalaman yang sangat

berharga.

4. Segenap civitas akademika Program Studi Pendidikan Dokter,

terutama seluruh dosen dan laboran yang telah membantu penulis dalam

menyelesaikan tugas ini.

5. Bapak Safa’un dan Ibu Susilowati tercinta yang senantiasa

memberikan doa dan restunya kepada penulis dalam menuntut ilmu.

6. Saudara kandung saya yang bernama Zainal Azhar, Sendiko Ady

Putra, dan Ayu Intan Safitri yang senantiasa memberikan semangat dan

motivasinya selama proses pengerjaan skripsi ini.

7. Semua pihak yang ikut membantu dalam menyelesaikan laporan ini

baik berupa material maupun moral.

Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini masih

terdapat banyak kekurangan dan penulis berharap semoga skripsi ini

bisa memberikan manfaat kepada para pembaca khususnya bagi penulis

secara pribadi. Aamiin Yaa Rabbal Alamin.

Wassalamu’alaikum Wr. Wb.

Batu, 12 Juni 2021

Penulis

VIII

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL…………………………………...……………II

HALAMAN PERSETUJUAN……………………………………..III

HALAMAN PENGESAHAN………………………………………IV

HALAMAN PERNYATAAN……………………………………….V

KATA PENGANTAR………………………..………………..……VI

DAFTAR ISI ……………………………………………………..VIII

DAFTAR TABEL …………………………………………..…....XIV

DAFTAR GAMBAR ……………………………...………………XV

ABSTRAK………………………………………………………..XVII

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang ……………………………………………………1

1.2 Rumusan Masalah ………………………………………………...7

1.2.1 Rumusan Masalah Umum ……………………………………7

1.2.2 Rumusan masalah Khusus …………………………………...7

1.3 Tujuan Penelitian ………………………………………………….7

1.3.1 Tujuan Umum ………………………………………………..7

1.3.2 Tujuan Khusus ………………………………………………..8

1.4 Manfaat Penelitian ………………………………………………...8

1.4.1 Manfaat Akademik …………………………………………...8

1.4.2 Manfaat Aplikatif ……………………………………………8

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pneumonia ………………………………………...………………9

IX

2.1.1 Pneumonia Akibat Klebsiella pneumoniae ………………….12

2.2 Klebsiella pneumoniae …………………………………………...13

2.2.1 Taksonomi Klebsiella pneumoniae ……………………..…..13

2.2.2 Karakteristik Klebsiella pneumoniae ………………...……...13

2.2.3 Faktor virulensi Klebsiella pneumoniae …………………….15

2.2.4 Identifikasi Karakteristik Klebsiella pneumoniae …………...17

2.2.4.1 Uji pewarnaan Gram …………………………………….17

2.2.4.2 Uji Biokimia …………………………………………….19

2.2.4.3 Biakan Pada Medium Diferensial ……………………….22

2.3 Biofilm …………………………………………………………...22

2.3.1 Mekanisme Pembentukan Biofilm ……….…………………23

2.3.2 Quorum sensing ……………………………………………..25

2.3.3 Pembentukan Biofilm dan Quorum sensing K. pneumoniae ...25

2.3.4 Biofilm Sebagai Penyebab Resistensi Antibiotik …………...27

2.3.5 Uji Pembentukan Biofilm …………………………………...27

2.3.5.1 Metode Tabung …………………………………………27

2.3.5.2 Metode Congo Red Agar ………………………………..28

2.3.5.3 Metode Microtiter Plate ………………...........…………29

2.4 Aspergillus oryzae ……………………………………………….30

2.4.1 Taksonomi Aspergillus oryzae ……………………………...30

2.4.2 Karakteristik Aspergillus oryzae …………………….……...31

2.4.3 Kurva Pertumbuhan Aspergillus oryzae …………………….32

2.4.4 Identifikasi Karakteristik Aspergillus oryzae ………….……32

X

2.4.4.1 Uji Makroskopis ………………………………………...32

2.4.4.2 Uji Mikroskopis …………………………………………33

2.4.5 Mekanisme Inhibitor Quorum sensing (IQS) ………………..33

2.4.6 Aspergillus oryzae sebagai Antibiofilm ……………………..34

2.5 Kerangka Teori ………………………………………………......37

BAB III KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS

3.1 Kerangka Konsep ………………………………………………...40

3.2 Hipotesis Penelitian ……………………………………………...42

BAB IV METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian ……………………………………………43

4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian …………………………………….43

4.3 Populasi dan Sampel Penelitian …………………………………43

4.3.1 Populasi Penelitian ………………………………………….43

4.3.2 Sampel Penelitian …………………………………………..43

4.4 Variabel Penelitian ………………………………………………44

4.4.1 Variabel bebas ………………………………………………44

4.4.2 Variabel Terikat …………………………………………….44

4.5 Jumlah Pengulangan ……………………………………………..44

4.6 Definisi Operasional ……………………………………………..45

4.7 Kriteria Penelitian ……………………………………………….47

4.7.1 Kriteria Inklusi …………………………………………….47

4.7.2 Kriteria Eksklusi …………………………………………...47

4.8 Alat dan Bahan Penelitian ………………………………………..47

XI

4.8.1 Alat Penelitian ……………………………………………..47

4.8.2 Bahan Penelitian …………………………………………...48

4.8.2.1 Bahan Uji ………………………………………………48

4.8.2.2 Bakteri Uji ……………………………………………..48

4.8.2.3 Bahan lainnya ………………………………………….48

4.9 Prosedur Penelitian ………………………………………………48

4.9.1 Pembuatan Media Pertumbuhan Aspergillus oryzae ………48

4.9.2 Pembuatan Supernatan Aspergillus oryzae ………………...49

4.9.3 Pembuatan Seri Konsentrasi Supernatan A. oryzae ……...…49

4.9.4 Identifikasi Aspergillus oryzae ………………………...…..50

4.9.4.1 Uji Makroskopis ……………………………………….50

4.9.4.2 Uji Mikroskopis ………………………………………..50

4.9.5 Uji Kurva Pertumbuhan …………………………………..51

4.9.6 Pembuatan Media Pertumbuhan Klebsiella pneumoniae ….51

4.9.7 Pembuatan Suspensi Klebsiella pneumoniae ……………..52

4.9.8 Identifikasi Klebsiella pneumoniae ……………………….52

4.9.8.1 Uji Pewarnaan Gram …………………………………..52

4.9.8.2 Uji Mac Conkey ………………………………………..53

4.9.8.3 Uji Urease ……………………………………………...53

4.9.8.4 Uji Methyl Red ………………………………………...54

4.9.8.5 Uji Indol, Voges Preskauer, Simmon’s Citrate (IMViC) 54

4.9.9 Denah Uji Perlakuan Aktivitas Antibiofilm ………………55

XII

4.9.10 Uji Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh

Minimum (KBM) ………………………………………….56

4.9.11 Uji Pertumbuhan Biofilm ………………………………….57

4.9.12 Uji Aktivitas Antibiofilm Aspergillus oryzae terhadap

Klebsiella pneumoniae …………………………………….59

4.9.12.1 Uji Aktivitas Pencegahan Perlekatan Biofilm ……….59

4.9.12.2 Uji Aktivitas Penghambatan Pertumbuhan Biofilm ….61

4.9.12.3 Uji Aktivitas Penghancuran Biofilm …………………62

4.10 Alur Penelitian …………………………………………………65

4.11 Analisis Data …………………………………………………...66

BAB V HASIL

5.1 Uji Karakteristik Aspergillus oryzae……………………………...67

5.2 Uji Karakteristik Klebsiella pneumoniae…………………………68

5.3 Uji Kurva Pertumbuhan Aspergillus oryzae………………………69

5.4 Uji Kadar Hambat Minimum……………………………………..70

5.5 Uji Kadar Bunuh Minimum………………………………………70

5.6 Uji Pertumbuhan Biofilm Klebsiella pneumoniae ……………….70

5.7 Presentase Aktivitas Antibiofilm Aspergillus oryzae ……………71

5.7.1 Uji Pencegahan Perlekatan Biofilm Klebsiella pneumonia…..72

5.7.2 Uji Penghambatan Pembentukan Biofilm Klebsiella

pneumonia……………………………………………………..73

5.7.3 Uji Penghancuran Biofilm Klebsiella pneumoniae…………...73

5.8 Hasil Analisis Data……………………………………………….74

XIII

5.8.1 Uji Pencegahan Perlekatan Biofilm Klebsiella pneumoniae….74


pneumoniae……………………………………………………77

5.8.3 Uji Penghancuran Biofilm Klebsiella pneumoniae…………...80

BAB VI PEMBAHASAN

6.1 Identifikasi Karakteristik Aspergillus oryzae dan Klebsiella

pneumoniae…………………………………………………………..84

6.2 Pengukuran Kurva Aspergillus oryzae……………………………85

6.3 Pembuatan Supernatan Aspergillus oryzae……………………….85

6.4 Pembuatan Suspensi Klebsiella pneumoniae……………….…….86

6.5 Uji KHM dan KBM………………………………………….……87

6.6 Uji Pertumbuhan Biofilm…………………………………………88

6.7 Uji Aktivitas Antibiofilm Aspergillus oryzae…………………….90

6.8 Analisis Data……………………………………………….……..92

6.9 Integrasi Menurut Al-qur’an dan Hadist………………………….96

BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN

7.1 Kesimpulan……………………………………………………….99

7.2 Saran……………………………………………………………...99

DAFTAR PUSTAKA …………………………………….……......100

Lampiran……………………………………………………………111

XIV

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Interpretasi kekuatan bakteri pembentuk biofilm .................30

Tabel 4.1 Interpretasi kekuatan bakteri pembentuk biofilm .................59

Tabel 5.1 Hasil uji biokimia Klebsiella pneumoniae………………….69

Tabel 5.2 Hasil uji Post Hoc Tukey pencegahan perlekatan biofilm……76

Tabel 5.3 Hasil uji Post-Hoc Tukey penghambatan pembentukan biofilm….79

Tabel 5.4 Hasil uji Post-Hoc Tukey pada penghancuran biofilm……………82

XV

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Perbedaan alveoli …………………………………………9

Gambar 2.2 Patofisiologi pneumonia ………………………………...12

Gambar 2.3 Skema faktor virulensi dan pembentukan biofilm ……….17

Gambar 2.4 Pewarnaan Gram pada bakteri …………………………..19

Gambar 2.5 Uji IMViC pada Klebsiella pneumoiae ………………….21

Gambar 2.6 Koloni K. pneumoniae pada medium Mac conkey ……....22

Gambar 2.7 Metode Tabung .................................................................29

Gambar 2.8 Metode Congo Red Agar ..................................................30

Gambar 2.9 Metode microtiter plate ....................................................31

Gambar 2.10 Struktur Aspergillus oryzae dilihat dari mikroskop ……33

Gambar 2.11 Bentukan koloni Aspergillus oryzae …………………..33

Gambar 2.12 Struktur Aspergillus oryzae ……………………………37

Gambar 2.13 Asam lemak sebagai antibiofilm ……………………….38

Gambar 4.1 Metode Pewarnaan Gram ……………………………….53

Gambar 4.2 Denah perlakuan pada microplate 96 wells .......…………55

Gambar 5.1 Hasil pengamatan mikroskopis jamur…………………...67

Gambar 5.2 Hasil uji makroskopis pada jamur Aspergillus oryzae…...67

Gambar 5.3 Tampilan koloni pada media dan mikroskopis…….…….68

Gambar 5.4 Hasil uji kurva pertumbuhan jamur Aspergillus oryzae….69

Gambar 5.5 Hasil Uji Kadar Hambat Minimum (KHM)……………...70

Gambar 5.6 Hasil uji pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae.....70

Gambar 5.7 Presentase aktivitas antibiofilm………………………….71

XVI

Gambar 5.8 Hasil uji pencegahan perlekatan biofilm…………………72

Gambar 5.9 Hasil uji penghambatan pembentukan biofilm…………..73

Gambar 5.10 Hasil uji penghancuran biofilm………………………...74

XVII

ABSTRAK



Pneumonia masih menjadi masalah kesehatan di Indonesia dengan

peningkatan kasus tiap tahunnya. Salah satu penyebabnya adalah Klebsiella

pneumoniae. Bakteri ini memiliki kemampuan membentuk biofilm yang dapat

meningkatkan resistensi antibiotik. Aspergillus oryzae memiliki kandungan β-

glucosidase dan asam lemak (asam palmitate, asam strearat, asam oleic, dan

asam linoleic) yang dapat dijadikan sebagai antibiofilm alternativ. Penelitian

ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas Aspergillus oryzae sebagai pencegah

perlekatan, penghambat pembentukan, dan penghancuran biofilm Klebsiella

pneumoniae. Metode yang digunakan adalah tissue culture plate dengan serial

konsentrasi. Hasil penelitian ditentukan dari nilai OD (Optical Density) pada

Microplate-reader dan dilanjutkan analisis statistik dengan SPSS. Pada uji

pencegahan didapatkan aktivitas tertinggi pada konsentrasi 50% dengan

presentase 41,5%, uji penghambatan pembentukan pada konsentrasi 100%

sebesar 77%, dan uji penghancuran pada konsentrasi 100% sebesar 47%. Pada

uji pencegahan dan pembentukan menunjukan tidak adanya pengaruh besar

aktivitas terhadap nilai OD. Sedangkan pada uji penghancuran menunjukkan

adanya pengaruh besar aktivitas terhadap nilai OD.

Kata Kunci: Biofilm Klebsiella pneumoniae, Antibiofilm Aspergillus oryzae,

Quorum Sensing.

XVIII

ABSTRACT

ANTIBIOFILM ACTIVITY TEST OF Aspergillus oryzae

AGAINST BIOFILM OF Klebsiella pneumoniae

Pneumonia is still a health problem in Indonesia that increase every year. One

of the causes is Klebsiella pneumoniae. This bacterium has ability to form

biofilms that can increase antibiotic resistance. Aspergillus oryzae contains β-

glucosidase and fatty acids (palmitic acid, stearic acid, oleic acid, and linoleic

acid) which can be used as alternative antibiofilms. This study aims to

determine the activity of Aspergillus oryzae as a preventative attachment,

inhibition, and to determine the biofilm of Klebsiella pneumoniae. This research used plate tissue culture with serial concentrations methode. The

results were determined from the value of OD (Optical Density) on the

Microplate-reader and continued with statistical analysis by SPSS. In the

prevention test, the highest activity was found at a concentration of 50% with

a percentage of 41.5%, in formation inhibition test at a concentration of 100%

was 77%, and destruction test at a concentration of 100% was 47%. In the test

of prevention and value formation, there was no significant effect of activity

on OD. Meanwhile, the test shows that there is a large influence of activity on

OD.

Keywords: Biofilm Klebsiella pneumoniae, Antibiofilm Aspergillus oryzae,

Quorum Sensing.

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pneumoniae merupakan suatu penyakit saluran pernafasan akut

yang ditandai adanya infeksi pada alveoli paru (Dirjen P2PL Kemenkes

RI, 2012). Pneumoniae ini menyebabkan besarnya angka kematian pada

anak umur dibawah 5 tahun mencapai 70% di dunia. Kejadian

pneumoniae tiap tahunnya mengalami peningkatan hampir satu juta

penderita. Pada tahun 2017 angka kematian pada anak usia 5 tahun

sebanyak 878.829 jiwa. World Health Organization (WHO) melaporkan

banyaknya kematian yang disebabkan pneumoniae terutama di negara

berkembang. Klebsiella pneumoniae menjadi penyebab terbanyak

kedua setelah e.coli dalam hal menyerang orang yang berusia lanjut

(Samirah et al,2014). Negara yang paling banyak menyumbang angka

kematian adalah Negara India sejumlah 158.176, diikuti Nigeria

diurutan kedua dengan angka 140.520 dan Pakistan diurutan ketiga

sebanyak 62.782 kematian. Sementara Indonesia menduduki urutan

ketujuh dengan total kematian 20.084 jiwa (WHO,2018). Data

Riskesdas menyatakan bahwa prevalensi pneumoniae di Indonesia

mengalami peningkatan dari tahun 2017 ke tahun 2018 yaitu dari 3.55%

di tahun 2017 menjadi 4% di tahun 2018. Kemenkes RI juga

menyebutkan, bahwa Jawa Barat menduduki penderita terbanyak

pertama dalam temuan kasus pneumoniae kemudian disusul oleh Jawa

Timur dan juga Jawa Tengah. Presentase kasus pneumoniae pada balita

2

sebesar 46,34% sebanyak 447.431 kasus. Angka kematian balita akibat

pneumoniae berasal dari Jawa Timur, Sulawesi Tenggara dan Jawa

Barat (Kemenkes RI, 2018).

Klebsiella pneumoniae merupakan bakteri penyebab

pneumoniae. Klebsiella termasuk dalam opportunistic pathogen pada

pasien dengan penyakit pernafasan akut dan rhinoscleroma. Klebsiella

akan mudah menyerang orang dengan sistem pertahanan tubuh yang

terganggu, seperti penurunan kesadaran, diabetes mellitus, penyakit

jantung, kanker dan penyakit kronis lainnya. Selain itu, banyaknya

bakteri serta keganasan pathogen yang masuk ke tubuh dapat

menentukan terinfeksi atau tidaknya (Jawetz,2007). Sumber penularan

paling sering melalui feses, dan diikuti oleh alat terkontaminasi

Klesbiella pneumoniae (Podschun, 1998; Sarathabu, 2012). Klebsiella

pneumoniae merupakan patogen oportunistik gram negatif yang sering

ditularkan secara nosokomial. Terjadinya infeksi akan memicu

kolonisasi pertama kali di gastrointestinal. . (Damien Balestrino et al.,

2005)

Klebsiella pneumoniae memiliki kapsul yang dapat melindungi

dirinya dari fagositosis dan bakterisidal serum (Tarina dkk, 2017).

Berbeda dengan bakteri lainnya, Klebsiella pneumoniae memiliki faktor

kepatuhan untuk membentuk biofilm pada permukaan abiotik. Dalam

studi sebelumnya penginderaan kuorum basil gram negatif diketahui

terlibat dalam virulensi dan pembentukan biofilm (karakterisasi

penginderaan). Pembentukan biofilm Klebsiella pnemoniae diregulasi

3

oleh kepadatan sel melalui “Quorum sensing” dengan cara melepaskan

molekul pengatur autoinduser tipe-2 (AI-2) di kompartemen

ekstraseluler (Balestrino et al., 2005). AI-2 merupakan sinyal bakteri

nonspesifik pada bakteri gram negative dan gram positif yang disintesis

oleh S-ribosylhomocysteine lyase (LuxS) (Schauder et al., 2001 ).

Melalui matriks polisakarida, biofilm bertindak sebagai alat komunikasi

antar sel. Biofilm terbentuk dari beberapa mikroorganisme yang sel

selnya terikat satu sama lain. Mikroorganisme ini berdiferensiasi dan

berkembangbiak membentuk morfologi baru secara kompleks menjadi

biofilm (O’toole, Kaplan and Kolter, 2000). Biofilm berfungsi sebagai

sistem pertahanan bakteri dan dapat melindungi bakteri dari antibiotik

yang diberikan sehingga menyebabkan resistensi pada antibiotik

terutama pada infeksi kronis. Biofilm memiliki struktur alami yang

dapat melindungi selnya dari antimikroba serta dapat mempertahankan

sel hostnya. Tidak hanya itu, struktur biofilm dapat melindunginya dari

kondisi ekstrim seperti kekeringan, syok osmotik, radiasi sinar UV dan

paparan senyawa toksik (Paraje, 2011).

Beberapa jenis Klebsiella pneumoniae dapat diobati dengan

antibiotik yang mengandung cincin beta-laktam (Anderson,

K.F.,Patel,J.B. & Wong, B.,2009). Dalam penelitian menunjukkan

bahwa bakteri ini memiliki sensitivitas 98,4% terhadap meropenem,

98% terhadap imipenem, 92,5% terhadap kloramfenikol, 80% terhadap

siprofloksasin, dan 2% terhadap ampisilin. Selain itu Klebsiella

pneumoniae juga resisten terhadap antibiotik jenis penisilin,

4

sefalosporin, dan azetreonam dikarenakan bakteri ini juga dapat

memproduksi enzim urease dan enzim sitrat permiase serta enzim ESBL

(Extended Spektrum Beta Lactamase) (Katzung, 2002). Akan tetapi

dengan berjalannya waktu bakteri ini resisten terhadap beberapa

antibiotik (Beesley, T., Gascoyne, N.&KnottHunziker, V., 1983). Hal

itu disebabkan karena strain baru Klebsiella dapat memproduksi enzim

beta-laktamase sehingga dapat menghidrolisis cincin beta-laktam yang

terdapat pada antibiotik tersebut, apabila cincin tersebut lisis maka

resistensi bakteri akan meningkat (Muhajir at al., 2016). Oleh karena itu

bakteri semakin kebal dan sulit untuk dilumpuhkan (Keith,

Miller.Immunocytochemical Techniques, 2002).

Untuk mengatasi permasalahan biofilm ini perlu dilakukan

strategi yang dapat menghambat dan merusak lapisan biofilm. Salah satu

cara yang dapat dilakukan yaitu dengan menggunakan antimikroba yang

disertai zat kimia, sehingga antimikroba dapat mencapai target

membunuh bakteri (Cortés et al., 2011). Strategi alternatif terbaru

mengembangkan upaya untuk melawan infeksi bakteri dengan

mengidentifikasi senyawa baru yang menarget pada proses

pembentukan bakteri, termasuk Quorum sensing dan pembentukan

biofilm (Brackman G et al., 2014; Wang Y-M., 2019). Seperti telah

ditemukannya enzim “quorum quenching” yang dapat menonaktifkan

molekul AI-2 serta menghambat pembentukan biofilm dalam Klebsiella

pneumoniae (Weiland-Bräuer N et al., 2016). Berpendapat bahwa

pembentukan biofilm Klebsiella pneumoniae berkurang karena adanya

5

suplementasi karbohidrat. Dari hasil sintesis eksopolisakarida yang

ditingkatkan dapat berpotensi menghambat pemaparan dan perlekatan

faktor perekat seperti fimbriae. Kelebihan nutrisi juga dapat

menyebabkan perubahan regulasi dengan memicu pertumbuhan

planktonik dan menghambat pertumbuhan biofilm (Stanley NR.,

Lazazzera BA., 2004). Dari hasil penelitian yang telah dilakukan

menyatakan bahwa konsentrasi gula yang tinggi seperti glukosa dapat

menghambat pembentukan biofim (Jackson DW et al., 2002 ; Sutrina

SL et al., 2015). Adanya interferensi pembentukan kapsul bakteri

dengan adhesion akan mempengaruhi perlekatan bakteri sehingga

pembentukan biofilm akan berkurang (Schembri MA et al., 2004).

Aspergillus oryzae terbukti dapat memproduksi glukosa, hal tersebut

ditunjukkan dengan tingginya kadar glukosa Aspergillus oryzae pada

substrat pati ubi di hari ke 8 fermentasi sebesar 222,33 mg/ml

Rachmawaty (2010). Pembentukan glukosa ini atas peranan enzim β-

glucosidase. Enzim ini memotong ikatan β-D-glukosidik beberapa

senyawa yang melepaskan glukosa sebagai produk akhir (Bhatia Y.,

Mishra S., Bisaria V., 2002)

Berbeda dengan Aspergillus flavus, Jamur ini tidak dapat

menghasilkan aflatoksin (Varga dkk. 2011; Frisvad dkk. 2018).

Aflatoksin merupakan zat beracun yang terkandung pada jamur yang

biasa dikenal sebagai mikotoksin (Sutriswati, 2020). Sebaliknya, jamur

ini merupakan penghasil metabolit sekunder yang baik. Banyak industri

yang mengolahnya untuk dijadikan bahan pangan. BAUA (German

6

Federal Institute for Occupational Safety and Health) juga menyatakan

bahwa Aspergillus niger dan Aspergillus oryzae diklasifikasikan sebagai

agen biologis yang aman. Aspergillus oryzae diketahui dapat

menghasilkan beberapa senyawa yang dapat digunakan sebagai

antibiofilm. Asam lemak dapat berperan sebagai antibiofilm dengan

menghambat proses perlekatan, adhesi, EPS, fimbriae, pembentukan

biofilm, serta maturasi biofilm (Kumar P et al, 2020). Aspergillus oryzae

memiliki kandungan asam lemak yang dapat menghambat pembentukan

biofilm yaitu asam strearat, asam palmitate, asam linoleic dan asam

oleic. Aspergillus oryzae banyak ditemukan di Indonesia, jamur ini

dapat ditemukan di tanah dan tanaman terutama padi. Jamur ini juga

dapat tumbuh pada jagung (K Gomi, 2014). Dari hasil penelitian

menunjukan bahwa Aspergillus oryzae juga ditemukan di gaplek

singkong (H.A Oramahi. et al, 2006). Dimana ubi kayu termasuk

tanaman produksi terbanyak ketiga setelah padi dan jagung (Kementrian

pertanian, 2016). Hasil pertanian yang disimpan terlalu lama akan

menjadi tempat pertumbuhan jamur (H.A Oramahi. et al, 2006). Dari

sini diharapkan jamur tersebut dapat diambil manfaatnya sebagai obat

alternative penghambat dan perusak biofilm Klebsiella pneumoniae.

Oleh karena itu peneliti ingin mencari solusi dengan

mengidentifikasi antibiofilm yang dapat menghancurkan biofilm pada

Klebsiella pneumoniae. Dengan berpatokan pada hadist muslim yang

berbunyi :

لكل داء دواء، فإذا أصيب دواء الداء برأ بإذن الل

7

Yang memiliki arti "Semua penyakit ada obatnya. Apabila sesuai antara

obat dan penyakitnya, maka (penyakit) akan sembuh dengan izin Allah

SWT." Hadist itu membuat peneliti bersemangat untuk mencari

solusinya. Didukung dengan teori yang telah ada peneliti ingin

membuktikan apakah Aspergillus oryzae dapat dijadikan sebagai

antibiofilm Klebsiella pneumoniae dan harapannya dapat menurunkan

angka pneumonia khususnya di Indonesia.

1.2 Rumusan Masalah

1.2.1 Rumusan Masalah Umum

Bagaimana aktivitas antibiofim Aspergillus oryzae terhadap

biofilm Klebsiella pneumoniae?

1.2.2 Rumusan masalah Khusus

1. Bagaimanakah aktivitas antibiofim Aspergillus oryzae terhadap

perlekatan pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae?


penghambatan pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae?


penghancuran pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae?

1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan Umum

Mengetahui aktivitas antibiofim Aspergillus oryzae terhadap


1.3.2 Tujuan Khusus

8

1. Mengetahui aktivitas antibiofim Aspergillus oryzae terhadap

perlekatan pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae?




penghancuran pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae?

1.4 Manfaat Penelitian

1.4.1 Manfaat Akademik

Memberikan informasi tambahan guna pengembangan ilmu

kesehatan mengenai manfaat Aspergillus oryzae sebagai antibiofilm

pada Klebsiella pneumoniae.

1.4.2 Manfaat Aplikatif

1. Penelitian ini dapat digunakan sebagai pilihan obat alternatif

dalam pengobatan penyakit yang disebabkan oleh infeksi

Klebsiella pneumoniae.

2. Penelitian ini dapat digunakan sebagai sumber informasi tentang

pemanfaatan Aspergillus oryzae sebagai antibiofilm pada


3. Penelitian ini dapat digunakan sebagai pertimbangan penelitian

lebih lanjut.

9

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pneumonia

Pneumonia adalah infeksi akut pada organ pernapasan

khususnya alveoli, infeksi ini disebabkan oleh mikroorganisme seperti

virus, bakteri dan jamur (Kemenkes, 2020). Pada pemeriksaan fisik

biasanya di dapatkan penurunan suara napas, rales, fremitus taktil dan

crakles. Takipnea dan hipotensi juga dapat ditemukan pada pasien

dengan pneumonia, gejala tersebut memerlukan evaluasi segera (Jain. et

al, 2015). Diagnosis pneumonia perlu dicurigai pada pasien yang

menunjukan gejala demam dengan onset akut atau menggigil dan batuk.

Juga sering ditemukan adanya kelelahan, anoreksia, dan nyeri dada

pleuritik yang merupakan gejala tambahan pada pneumonia. Riwayat

perjalanan terakhir, riwayat penyakit paru-paru, dan riwayat merokok

juga perlu dievaluasi sebagai rangkaian diagnostik (Kaysin A & Viera

AJ, 2016)

Gambar 2.1 Perbedaan alveoli pada orang dengan pneumonia (kiri) dan

orang sehat (kanan)

(Sumber: Nurarif & Kusuma, 2016)

10

Bakteri yang masuk ke tubuh tidak akan menyebabkan infeksi

jika tidak ada reseptor yang mengenalinya. Bakteri pathogen dapat

menghasilkan produk berupa Pathogen Associated Molecular Pattern

(PAMP) yang akan dikenali oleh Toll Like Receptor (TLR). TLR berada

di permukaan makrofag alveolar, kemudian NFκβ akan aktif dan akan

melepaskan sitokin pro-inflamasi yang berupa interleukin IL-6, IL-8,

IL-1β, Tumor Necrosis Factor (TNF- α), dan IFN- α (Martinez, et al,

2011; Moldoveanu, et al, 2009). Sitokin pro-inflamasi akan meningkat

tajam seiring dengan terjadinya infeksi mikroba. Sitokin ini juga akan

memicu pelepasan procalcitonin (PCT) dan kemudian menyebabkan

terjadinya ekstravasasi neutrophil ke jaringan (Medzhitov R, 2010).

Pada saat tubuh mengalami penurunan sistem imun seperti adanya

pengaruh penyakit, usia tua, dan malnutrisi bakteri pneumonia akan

berkembang dengan cepat dan menginfeksi jaringan paru. Jaringan paru

yang rusak merupakan akibat dari respon imun dan peradangan oleh

pejamu. Zat toksin yang dihasilkan oleh bakteri dapat merusak sistem

pernafasan bawah secara langsung. Jika infeksi pada jaringan paru tidak

segera ditangani, akan memicu penyebaran infeksi ke seluruh tubuh

melalui darah (Corwin EJ, 2009). Pneumonia masih menjadi penyebab

utama komplikasi penyakit dan kematian meskipun penelitian tentang

antibiotik terus dilakukan hingga saat ini. Tingginya angka kematian

disebabkan oleh tingginya respon inflamasi. Respon inflamasi

ditunjukan sebagai proses perlawanan terhadap bakteri, namun

inflamasi yang berlebih akan menimbulkan kerusakan lokal sampai

11

kerusakan sitemik secara berulang (Meijvis SCA, et al, 2012). Inflamasi

yang berlebihan memicu terjadinya kerusakan paru. Oleh karena itu

diperlukan terapi antiinflamasi yang ideal dan dapat mengurangi

komplikasi dari respon inflamasi sistemik tanpa memicu proses

inflamasi lokal lain. Sel sel inflamasi akan terus diaktifkan selama

proses inflamasi berlangsung. Proses tersebut akan mendorong sitokin

dan mediator inflamasi untuk dikeluarkan (Reviono, 2017).

Antiinflamasi yang diberikan pertama kali adalah golongan

kortikosteroid. Kortikosteroid disebut sebagai inhibitor untuk inflamasi

yang cara kerjanya membunuh gen yang mengkode sitokin antiinflamasi

(Reviono, 2017). Terapi suportif juga perlu dilakukan disamping

pemberian terapi antibiotik. Terapi suportif ditujukan sebagai

penghilang dari gejala pneumonia, pemberian terapi suportif bisa

dengan menggunakan antipiretik, mukolitik, ekspektoran, terapi

oksigen, terapi cairan serta memberikan anjuran untuk istirahat yang

cukup (Reviono, 2017).

12

Gambar 2.2 Patofisiologi pneumonia

(Sumber: Nurarif & Kusuma, 2016)

2.1.1 Pneumonia Akibat Klebsiella pneumoniae

Bakteri patogen pneumonia sering tidak terdeteksi (Grief &

Loza, 2018). Oleh karena itu identifikasi bakteri patogen penyebab

pneumonia penting untuk dilakukan. Identifikasi ini merupakan upaya

yang sulit untuk dilakukan dan memakan waktu yang lama. Identifikasi

etiologi bertujuan untuk mengkonfirmasi patogen penyebab, sehingga

pemberian terapi dapat dilakukan secara tepat guna mengurangi

penggunaan antimikroba yang berlebihan (Irawan dkk, 2019).

Organisme patogen yang sering menjadi penyebab pneumonia antara

lain: Pseudomonas aeruginosa, spesies Klebsiella, Staphylococcus

aureus, Haemopbilus influenzae, Staphylococcus pneumoniae, serta

13

basilus Gram negatif, jamur, dan virus yang sering terjadi pada anak

anak (Brunner & Suddarth, 2011). Pneumonia karena Klebsiella dapat

ditandai dengan adanya demam tinggi, lesu dan batuk kering. Batuk

kering kemudian akan berlanjut menjadi batuk produktif yang disertai

dengan sputum darah dan purulent. Jika tidak segera ditangani akan

menyebabkan terjadinya abses, nekrosis dan fibriosis pada jaringan paru

(Wulandari & Asih, 2017).

2.2 Klebsiella pneumoniae

2.2.1 Taksonomi Klebsiella pneumoniae

Taksonomi K. pneumoniae menurut Jawetz (2005) adalah

sebagai berikut:

Kingdom : Bacteria

Phylum : Proteobacteria

Class : Gamma Proteobacteria

Order : Enterobacteriales

Family : Enterobacteriaceae

Genus : Klebsiella

Species : K. pneumonia

2.2.2 Karakteristik Klebsiella pneumoniae

Klebsiella pneumoniae adalah bakteri Gram-negatif, memiliki

bentuk batang pendek dengan ukuran 0,5-0,5 x 1,2 μL. Bakteri ini tidak

memiliki flagel dan tidak dapat membentuk spora. Klebsiella

pneumoniae tidak dapat bergerak namun dapat memfermentasikan

karbohidrat menjadi asam dan gas. Tidak hanya itu bakteri ini juga dapat

14

memfermentasikan laktosa. Bakteri ini termasuk bakteri fakultatif

anaerob yang dapat tumbuh baik pada lingkungan dengan oksigen atau

tanpa oksigen (Greenwood et al., 2012). Klebsiella pneumoniae

memiliki kapsul yang dapat melindungi dirinya dari fagositosis dan

bakterisidal serum. Klebsiella pneumoniae dapat ditemukan di sampel

darah, urin, cairan pleura (Tarina dkk, 2017). Bakteri spesies ini juga

ditemukan di permukaan mukosa hewan dan berada di lingkungan

seperti air, tanah dll (Wang G, 2020). Klebsiella pneumoniae banyak

terkonsentrasi di saluran pencernaan dan sedikit di nasofaring. Bakteri

ini bergabung dalam sirkulasi darah lalu ke jaringan dan kemudian

menyebabkan infeksi (Wang G, 2020).

Klebsiella pneumoniae termasuk bagian dari keluarga

Enterobacteriaceae. Secara klasik bakteri ini dianggap sebagai

pathogen opportunistic, karena menyebabkan infeksi pada orang yang

dirawat di rumah sakit dan atau dengan kekebalan tubuh yang menurun.

Bakteri ini juga menjadi penyebab utama pneumonia terkait ventilator

(VAP) di ruang perawatan intensive ( Kalanuria et al., 2014; Selina dkk.,

2014 ). K. pneumoniae mempunyai banyak genom aksesori, genom ini

berasal dari plasmid dan lokus gen kromosom. Dari genom aksesori ini

membagi K. pneumoniae menjadi tiga jenis strain, yaitu oportunistik,

hipervirulen dan multidrug-resisten (MDR) (Martin & Bachman, 2018).

Bakteri ini menjadi penyebab infeksi pada pernapasan, infeksi saluran

kemih, infeksi nosocomial, serta menyebabkan kematian pada manusia

hingga 10% (Tarina & Kusuma, 2017).

15

2.2.3 Faktor virulensi Klebsiella penumoniae

Setiap mikrooganisme patogen memiliki faktor virulensi. Faktor

virulensi berguna untuk meningkatkan kemampuan patogenitas suatu

bakteri. K. pneumoniae memiliki beberapa faktor virulensi antara lain,

yaitu lipopolisakarida (LPS), kapsul, pili (tipe 1 dan tipe 3), dan

pembawa zat besi atau dikenal sebagai siderofor (Shon. Et al, 2013).

Lipopolisakarida (LPS) merupakan komponen utama

pembentuk membran luar bakteri gram negatif. LPS juga disebut

sebagai mediator paling kuat dari penyebab syok septik karena bakteri

(Martin, 2018). LPS tersusun dari antigen lipid A, inti, dan O-

polisakarida yang berguna sebagai sistem pertahanan diri dari

komplemen. Dan CPS dikenal sebagai faktor virulensi K. pneumoniae

yang berada pada lapisan luar pathogen yang mengandung sel

polimorfonuklear yang berguna sebagai faktor resistensi terhadap

adanya fagositosis (Shakib. et al, 2018). Bakteri genus Klebsiella

memiliki struktur antigen yang kompleks, sehingga spesies K.

pneumoniae juga memiliki struktur antigen yang sama. Genus

Klebsiella terdiri dari 2 tipe struktur antigen di permukaannya, yaitu

antigen O dan antigen K. Antigen O berada di bagian paling luar dari

dinding sel lipopolisakarida yang terdiri dari unit polisakarida yang

berlapis. Antigen O dapat tahan pada lingkungan yang panas dan

alkohol,antigen ini dapat dideteksi dengan proses aglutinasi bakteri

(Rufaldi, 2016). Antigen O dilapisi lagi oleh Antigen K, antigen K

merupakan casular polysacharida (CPS). Klebsiella dilindungi oleh

16

kapsul besar yang berupa polisakarida yang menutupi antigen somatik

O dan H, antigen ini dapat dideteksi melalui tes pembengkakan kapsul

menggunakan antiserum khusus (Rufaldi, 2016).

Kapsul dan pili berperan penting dalam proses patogenitas dan

ketahanan hidup dan disebut sebagai komponen struktural yang

prominen dari bakteri Klebsiella pneumoniae (Rufaldi, 2016). Kapsul

K.pneumoniae bagian luar terbentuk dari susunan polisakarida dan

lipoprotein. Kapsul ini menghalangi proses bakterisidal dan mencegah

fagositosis, tidak hanya itu kapsul ini juga dapat menghambat

complement mediated lysis and opsonization dan mengurangi respon

inflamasi (Paczosa & Mecsas, 2016). Pili tipe 1 dan tipe 3 berfungsi

sebagai adhesi bakteri ke epitel, sel imun, dan permukaan abiotik (Wang

G. et al, 2020). Pili tipe 1 memiliki bentuk tipis dan mempunyai tonjolan

di permukaannya yang menyerupai benang. Pili ini di aktifkan oleh

bakteri melalui isyarat lingkungan. Pili ini aktif ketika berada di saluran

kemih, bukan di saluran GI atau paru paru, oleh karena itu pili ini sangat

berpengaruh terhadap terjadinya ISK. Pili tipe 3 memiliki bentukan

filamen menyerupai helix dan berfungsi dalam proses pengikatan pada

sel bukal, sel trakea, dan organ paru.

Besi berguna dalam proses pertumbuhan bakteri. K. pneumoniae

memiliki kemampuan untuk memperoleh zat besi. Terdapat 4 molekul

yang berfungsi untuk menyerap zat besi, yaitu : enterobactin,

yersiniabactin, salmochelin, dan aerobactin. Enteromycin merupakan

strain yang tipikal dan sangat virulen, strain ini memiliki kemampuan

tinggi dalam menyerap besi sehingga disebut sebagai penyerap besi

utama (Wang G. et al, 2020). Berbeda dengan enteromycin, gastrin dan

yersinide lebih banyak ditemukan pada hvKp daripada cKp (Defense,

2016 ; Happel. et al, 2005). Aerobaktin menjadi faktor virulensi paling

17

penting di hvKp, strain ini juga berperan sebagai pembawa zat besi dan

pertumbuhan (Wang G. et al, 2020). Salmochelin menjadi penyebab

infeksi komunitas yang berbahaya, strain ini menjadi pencetus abses hati

dan pneumonia (Lam. et al, 2018). Dibandingkan strain non-virulen,

strain hvKp menghasilkan molekul penyerap besi yang lebih besar dan

lebih aktif dalam hal menyebabkan virulensi dan patogenitas (Russo. et

al, 2011)

Gambar 2.3 Skema faktor virulensi dan pembentukan biofilm pada

Klebsiella pneumonia

(Sumber: Wang et al, 2020)

2.2.4 Identifikasi Karakteristik Klebsiella penumoniae

2.2.4.1 Uji pewarnaan Gram

Secara makroskopis identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan

pewarnan gram dan kapsul (Rahayu & Gumilar, 2017). Pewarnaan gram

dapat menunjukkan bentuk, ukuran dan susunan bakteri (Abidah, 2020).

Pewarnaan gram juga dapat menentukan bakteri berdasarkan sifat

gramnya, apakah termasuk dalam gram positif atau gram negatif. Saat

18

bakteri gram negatif diberikan decolorization agent (alkohol),

komponen kristal violet akan mudah terlepas dari ikatannya sehingga

bakteri akan kehilangan warna dari kristal violet. Dan kemudian bakteri

akan menyerap warna dari pewarna lain seperti safranin, sehingga sel

akan tampak berwarna kemerahan atau pink. Hal tersebut dikarenakan

lapisan peptidoglikan yang lebih tipis. Berbeda dengan bakteri gram

positif yang memiliki peptidoglikan yang lebih tebal, sehingga bakteri

dapat mempertahankan pewarna kristal violet dan sel akan berwarna

ungu (Post & Songer, 2005). Secara mikroskopis, identifikasi Klebsiella

pneumoniae memperlihatkan bakteri berwarna merah yang

menunjukkan bahwa bakteri ini masuk dalam golongan bakteri gram

negatif (Rahayu & Gumilar, 2017). Selain itu dari pewarnaan

menunjukkan bahwa K. pneumoniae berbentuk batang pendek dan tidak

berkoloni (Wulandari & Asih, 2017).

Metode pewarnaan gram merupakan metode yang dapat

dilakukan dengan cara sederhana dan murah serta dapat mendiagnosis

infeksi dengan cepat. Metode ini lebih cepat dibandingkan dengan kultur

bakteri, sehingga cara tersebut dapat digunakan sebagai pedoman awal

untuk memutuskan pemilihan terapi antibiotik sambil menunggu bukti

definitif bakteri pathogen secara spesifik. Metode ini memiliki

kekurangan yaitu hanya dapat mengetahui ukuran, bentuk dan struktur

bakteri dengan mengandalkan zat warna saja. Padahal kondisi

pewarnaan gram dapat berubah akibat penggunaan terapi antimikroba

(Bulele. et al, 2019). Bentuk batang pada gram negatif dapat berubah

19

menjadi filament dan pleomorfik sedangkan bakteri gram positif dapat

menjadi bervariasi (Nagata. et al, 2010).

Gambar 2.4 Pewarnaan Gram pada bakteri. Gram negative

menghasilkan warna pink (kiri) dan Gram positif berwarna violet (kanan).

Sumber: www.medicallabscientist.org

2.2.4.2 Uji Biokimia

Untuk mengidentifikasi dan mendeterminasi sifat fisiologi suatu

biakan murni dapat dilakukan dengan uji biokimia (Rahayu & Gumilar,

2017). Proses biokimia bakteri memperlihatkan cara kerja metabolisme

sel, proses tersebut menunjukkan reaksi kimiawi yang dilakukan sel

untuk menghasilkan energi maupun saat menggunakan energi untuk

sintesis dan kegiatan seluler lainnya. Uji biokimia dapat dilakukan

dengan beberapa metode, yakni Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Urea

test, dan Indol, Methyl red, Voges Preskauer, Simmon’s Citrate

(IMViC).

Triple Sugar Iron Agar (TSIA) bertujuan untuk mengidentifikasi

suatu bakteri sesuai dengan karakter spesifiknya. Media TSIA

mengandung zat zat seperti : laktosa 1%, sukrosa 1%, glukosa 0,1 %,

ekstrak jaringan (substrat pertumbuhan protein), ferosulfat (untuk

mengidentifikasi produksi H2S), dan indikator PH (fenol merah). Zat zat

http://www.medicallabscientist.org/

20

tersebut dapat menunjukkan kemampuan bakteri dalam

memfermentasikan glukosa, sukrosa, laktosa dan mereduksi sulfur

(Abidah, 2020). Kemudian media ini dimasukkan pada tabung dengan

posisi miring dan bakteri di tumbuhkan pada bagian dalam pangkal

(Khotimah, 2020). Pada Klebsiella sp. menunjukkan warna kuning pada

bagian dalam pangkal yang berarti bakteri ini menghasilkan reaksi asam,

tidak ditemukan H2S dan menunjukkan adanya produksi gas (Hart, 2004

; Kusuma, 2013 ; Brooks et al 2015).

Uji urease, bertujuan untuk mendeteksi kemampuan organisme

dalam menghasilkan enzim urease dengan cara menghidrolisis urea.

Warna merah muda mengiterpretasikan hasil positif yang ditunjukkan

bahwa bakteri mampu menghasilkan enzim urease, dan negatif ketika

tidak menunjukkan perubahan warna. Pada Klebsiella Pneumonia

menunjukkan hasil yang positif (Hart, 2004; Brooks et al, 2015).

Uji indol, bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri

dalam menggunakan enzim tryptophanase untuk menghasilkan indol.

Indol dapat terbentuk karena adanya tryptophan di dalam media.

Tryptophan merupakan hasil akhir dari oksidasi asam amino esensial

bakteri yang berguna untuk proses pembentukan indol, asam piruvat,

dan ammonia (Hemraj. V, 2013). Warna merah menujukkan adanya

pembentukkan indol dan warna kuning tidak. Pada Klebsiella

pneumoniae menghasilkan warna kuning, itu menunjukkan bahwa

bakteri tidak dapat menghasilkan indol (Hart, 2004).

21

Uji Voges Proskauer (VP), bertujuan untuk mengetahui

kemampuan bakteri dalam menghasilkan acetonin. Untuk menentukan

adanya acetonin diperlukan kultur cair bakteri. Kultur bakteri terbuat

dari kaldu voges proskauer yang diinokulasi dengan bakteri dan

kemudian ditambahkan alphanaftol dan kalium hidroksida. Hasil positif

akan berwarna merah, dan hasil negatif berwarna kuning coklat atau

tidak berwarna. Pada uji VP bakteri K. pneumoniae akan menghasilkan

warna merah (Hart, 2004).

Uji sitrat, bertujuan untuk mengidentifikasi sumber karbon dan

energi yang digunakan bakteri. Bakteri dapat mengubah medium dari

hijau menjadi biru apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber

karbonnya. K. pneumoniae mampu mengubah warna hijau menjadi biru,

hal itu menunjukkan bahwa bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber

karbonnya (Hart, 2004; Gray W, 2016)

Gambar 2.5 Uji IMViC pada Klebsiella pneumoiae. Urut dari kiri Indole,

Methyl Red, Voges Proskauer, dan Citrate acid.

(Sumber: www.researchgate.net )

22

2.2.4.3 Biakan Pada Medium Diferensial

Medium diferensial dapat menunjukkan tampilan khas suatu

koloni dari bakteri. Media Mac Conkey berbentuk seperti agar yang

mengandung Kristal violet dan garam empedu, media ini diketahui dapat

menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif (Waluyo, 2010). Hal ini

menunjukkan bahwa tidak semua bakteri dapat tumbuh, media ini hanya

dapat ditumbuhi oleh bakteri Gram negatif (Kambuono & Fanggidae,

2017). Uji Mac Conkey juga dapat digunakan untuk mengetahui

kemampuan bakteri dalam memfermentasikan laktosa. Bakteri yang

dapat memfermentasikan laktosa dapat merubah kultur bakteri menjadi

berwarna merah (Kambuono & Fanggidae, 2017). Pada K. pneumoniae

menunjukkan hasil kultur berwarna merah yang berarti positif

memfermentasikan laktosa dan menunjukkan koloni berukuran besar

mengkilap (Baban, 2017).

Gambar 2.6 Koloni Klebsiella pneumoniae pada medium Mac conkey.

(Sumber www.researchgate.net)

2.3 Biofilm

Biofilm merupakan sekumpulan mikroorganisme yang

terbungkus oleh glikokaliks. Dengan adanya glikokaliks

23

mikroorganisme dapat menempel diberbagai permukaan baik hidup atau

mati. Biofilm yang menempel pada lambung kapal dapat meningkatkan

hambatan pada kapal tersebut, sehingga menambah penggunaan bahan

bakar. Pada manusia, biofilm dapat melekat pada perangkat medis dan

dapat ditemukan pada permukaan mukosa. Mikroorganisme yang paling

umum membentuk biofilm adalah bakteri dan jamur, namun virus dan

parasite juga dapat membentuk biofilm ( Bisson et al., 2018 ; Pais-

Correia et al., 2010 ). EPS (Extracellular Polymeric Substances)

merupakan bahan organik utama yang membentuk matriks biofilm. EPS

terdiri dari eksopolisakarida, protein, DNA ekstraseluler, humic acids

dan lipid yang berguna untuk membentuk biofilm yang heterogen

(Chew & Yang, 2016)

2.3.1 Mekanisme Pembentukan Biofilm

Proses pembentukan biofilm dimulai dengan interaksi antar

bakteri untuk melakukan perlekatan pada permukaan. Interaksi

diperantai oleh sistem adhesi spesifik (flagela, fimbria, lipopolisakarida,

atau protein adhesi), interaksi ini dapat dilakukan secara hidrofilik

ataupun hidrofobik yang memyebabkan perlekatan menjadi irreversibel

(Gupta et al, 2015). Dalam pembentukan biofilm lingkungan yang padat

dan cair dapat mendukung pertumbuhan dan perlekatan biofilm (Jamal

et al, 2015).

Setelah melekat secara irreversibel bakteri akan akan melakukan

quorum sensing sebagai komunikasi untuk mengkoordinir pertumbuhan

mikro-koloni. Quorum sensing ini diperantai oleh sinyal peptida dan

24

molekul lainnya seperti competence stimulating peptide, 3,5- cyclic

diguanylic acids (c-di-GMP), rhamnolipid, farnesol, modulin yang larut

dalam fenol, dan lan sebagainya (Kumar et al., 2017). Dalam

pembentukan mikrokoloni, bakteri membutuhkan EPS yang berguna

untuk melekatkan bakteri satu dengan yang lain (Gunardi, 2014). Tidak

hanya itu, EPS juga mampu melindungi sel-sel bakteri dari perubahan

lingkungan yang disebabkan antimikroba, sistem imun inang, oksidasi

dan kation logam (Jamal et al, 2015). Mikrokoloni akan terus

berkembang menjadi makrokoloni yang memiliki fluid-filled channel

sebagai saluran pertukaran produk sisa dalam biofilm (Gupta et al.,

2015).

Proses pembentukan bofilm selanjutnya adalah maturasi.

Meningkatnya kepadatan dan kompleksitas biofilm menunjukkan awal

terjadinya proses maturasi. Ketika biofilm telah berada pada titik

keseimbangan dinamik yang stabil, persediaan nutrisi dan pH akan

berkurang serta akan menyebabkan terjadinya akumulasi tekanan O2

yang dapat menyebabkan toksik metabolik. Hal tersebut menyebabkan

bakteri mengalami dispersi.

Pada proses dispersi akan menyebabkan penurunan produksi

ekspopolisakarida atau pili, serta akan meningkatkan regulasi gen yang

mengode protein kamotaktik dan flagela guna kehidupan sel planktonik

yang baru (Kumar et al., 2017). Planktonik akan terlepas dari biofilm

dan membentuk biofilm dengan siklus yang baru (Toyofuku et al, 2015)

25

2.3.2 Quorum sensing

Mikroorganisme telah mengembangkan kemampuan

berkomunikasi di dalam sel agar mikroorganisme dapat bereproduksi

dan tetap bertahan hidup meskipun terdapat perbedaan lingkungan

(Barriuso, Hogan, Keshavarz, & Martínez, 2018). Komunikasi antar sel

ini biasa disebut dengan Quorum sensing. Quorum sensing (QS)

merupakan sistem komunikasi mikroorganisme yang bergantung pada

kepadatan sel, QS ini mampu memicu terjadinya pembentukan biofilm

dan faktor virulensi. QS berperan terhadap pembentukan biofilm dengan

mendegradasi material, fouling, kontaminasi dan dapat menyebabkan

infeksi (Elias & Banin, 2012 ; Mieszkin et al. al., 2013 ; Wu dkk., 2015).

Autoinduser memiliki peran penting dalam komunikasi antar sel

(quorum sensing). Akumulasi autoinduser intra dan ekstraseluler dapat

meningkatkan bakteri dalam mendeteksi kepadatan sel. Hal ini dapat

mempengaruhi regulasi gen dalam mengkoordinasi peningkatan

kepadatan sel untuk proses patogenitas dan formasi biofilm ( Barriuso,

Hogan, Keshavarz, & Martínez, 2018 ). Autoinduser pada bakteri gram

negative adalah asil-homoserin lakton (AHL), pada gram positif dengan

autoinduser autoinducing peptides (AIP), dan autoinduser-2 (AI-2) pada

kedua gram (Liu et al., 2012 ; Du et al., 2014 ; Brackman dan Coenye,

2015 ).

2.3.3 Pembentukan Biofilm dan Quorum sensing K. pneumonia

Pembentukan biofilm dan quorum sensing merupakan dua jenis

perilaku koloni mikroorganisme. Quorum sensing merupakan transmisi

26

sinyal penginduksi antar sel untuk mendeteksi kepadatan bakteri, dan

biofilm merupakan hasil agregasi sel (Passos da Silva, Schofield,

Parsek, & Tseng, 2017). Biofilm yang dibentuk K. pneumoniae dapat

menyebabkan kolonisasi bakteri di saluran pernapasan, gastrointestinal,

dan saluran kemih, serta dapat meningkatkan terjadinya infeksi invasif

pada orang dengan penurunan imun. Biofilm K.pneumoniae secara

klinis sering ditemukan pada kateter dan permukaan alat medis lainnya.

Biofilm K. pneumonia ini dapat menghambat antibodi, efek

komplemen, peptide antimikroba dan fagositosis (Fux et al, 2005).

Pembentukan biofilm K. pneumonia diawali oleh adhesi sel pada

permukaan benda keras dan membentuk suatu mikro-koloni matur yang

dapat memperbanyak sel dan akan dilepaskan secara bebas. K.

pneumoniae dapat membentuk biofilm karena adanya produksi EPS

yang mengakumulasi sel. EPS merupakan struktur kompleks yang

terdiri dari polisakarida, protein, dan DNA. Tidak hanya itu, pili tipe 3

dan kapsul polisakarida juga berperan penting terhadap pembentukan

biofilm K. pneumoniae (Hall-Stoodley et al, 2004). Pili berperan

membentuk adhesi yang stabil, dan kapsul polisakarida mempengaruhi

struktuktur biofilm dan komunikasi antar sel. Adanya perubahan

lingkungan yang progresif memicu bakteri untuk mengubah ekspresi

gen secara cepat dan ekstensif. Ekspresi gen tersebut diregulasi dan

dikontrol oleh quorum sensing. Fungsi biofilm dapat dipengaruhi oleh

adanya mutasi (Mostavi et al, 2018).

27

2.3.4 Biofilm Sebagai Penyebab Resistensi Antibiotik

Mikroorganisme yang terbungkus biofilm akan mengalami

peningkatan resistensi 1000 kali terhadap terapi antimikroba

dibandingkan dengan padanan planktonik lainnya (Ceri dkk). Penyebab

resistensi biofilm terhadap antimikroba bersifat multifaktorial,

kemungkinan dapat disebabkan oleh struktur pembentukan biofilm dan

kombinasi faktor lainnya. Mikroba yang terbungkus biofilm memiliki

kemampuan memblokir respon imun yang dapat menyebabkan

kerusakan sel inang (Dongari-Bagtzoglou, 2008). Resistensi antibiotik

diperantarai oleh beberapa mekanisme yaitu intrinsik, didapat, dan

adaptif (Moradali dkk, 2017). Mekanisme intrinsik atau mekanisme

melekat terjadi secara alami dengan mengkode mekanisme resistensi

tertentu. Resistensi yang didapat disebabkan oleh aktivitas mikroba

lainnya dengan melakukan mutasi gen atau transfer horizontal. Dan

resistensi adaptif disebabkan karena stressor antimikroba atau pengaruh

lingkungan. Oleh karena itu penggunaan antibiotik sebagai terapi pada

infeksi merupakan suatu tantangan.

2.3.5 Uji Pembentukan Biofilm

2.3.5.1 Metode Tabung

Metode tabung adalah metode kualitatif yang dapat dilakukan

untuk mendeteksi biofilm. Biofilm akan terlihat pada bagian dasar dan

dinding tabung membentuk garis yang menyerupai cincin. Pembentukan

biofilm dinyatakan positif ketika terdapat garis pada bagian dasar dan

dinding tabung. Pembentukan biofilm dapat dinilai berdasarkan

28

kekuatan pembentukannya. Skor 1 menunjukkan lemah / tidak terbentuk

biofilm, skor 2 berarti sedang, dan skor 3 menyatakan biofilm kuat

(Kirmusaoglu, 2019). Metode ini dapat memperlihatkan pertumbuhan

bakteri uji meskipun dengan kadar terendah larutan uji antibakteri

(Ruchi et al., 2015)

Gambar 2.7 Metode Tabung. Tabung kiri menunjukkan strong-biofilm

producer, tabung tengah menunjukkan weak-biofilm producer, tabung kanan

menunjukkan non-biofilm producer

(Sumber: Ruchi et al., 2015)

2.3.5.2 Metode Congo Red Agar

Metode Congo Red Agar (CRA) merupakan uji pembentukan

biofilm secara kualitatif yang dapat diamati melalui perubahan warna

yang dihasilkan. Metode ini menggunakan medium yang terdiri dari

brain heart infusion broth (37 g/L), sukrosa (50 g/L), agar no 1 (10 g/L)

dan Congo Red (8 g/L). Setelah bakteri ditanam pada plate CRA,

kemudian plate dimasukkan ke inkubator selama 24 jam dengan suhu

37oC. Selanjutnya diamati perubahan warna yang terjadi. Bakteri yang

dapat membentuk biofilm akan menunjukkan warna hitam (positif) dan

29

bakteri yang tidak dapat membentuk biofilm akan tetap berwarna merah

(negatif) (Kirmusaoglu, 2019).

Gambar 2.8 Metode Congo Red Agar. Koloni sebelah kanan menunjukan

CRA positif dan koloni sebelah kiri menunjukkan CRA negatif

(Sumber : www.researchgate.net)

2.3.5.3 Metode Microtiter Plate

Microtiter plate adalah alat yang digunakkan untuk mendeteksi

kemampuan mikroorganisme dalam membentuk biofilm. Metode ini

merupakan metode kuantitatif yang mudah dan efisien yang dapat

digunakan untuk menguji aktivitas antibiofilm terhadap biofilm suatu

bakteri. Diperlukan OD blank sebagai nilai ukur ada tidaknya

pembentukan biofilm. Nilai OD didapatkan dari pengukuran well-plate

dengan microplate reader. Adanya pembentukan biofilm ditunjukkan

dengan nilai OD isolat lebih tinggi dibandingkan OD blank

(Kirmusaoglu, 2019). Interpretasi nilai OD terhadap produksi biofilm

sesuai tabel 2.1 berikut.

30

Tabel 2.1 Interpretasi kekuatan bakteri pembentuk biofilm

Sumber: Ramadan et al., 2017

ODcut = Optical Density Cut-off value = rata-rata OD kontrol negatif +

3x standar deviasi (SD) kontrol negatif

Gambar 2.9 Metode microtiter plate

(Sumber: www.researchgate.net)

2.4 Aspergillus oryzae

2.4.1 Taksonomi Aspergillus oryzae

Aspergillus oryzae diklasifikasikan sebagai berikut (GBIF,

2019).

Domain : Eukaryota

Kerajaan : Fungi

Divisi : Ascomycota

Kelas : Eurotiomycetes

Ordo : Eurotiales

2Rata-rata nilai OD Kekuatan penghasil biofilm

ODisolat ≤ Odcut Non-biofilm producer

ODcut < ODisolat ≤ 2x Odcut Weak-biofilm producer

2x ODcut < ODisolat ≤ 4x Odcut Moderate- biofilm producer

4x ODcut < ODisolat Strong- biofilm producer

31

Famili : Trichocomaceae

Genus : Aspergillus

Spesies : A. oryzae

2.4.2 Karakteristik Aspergillus oryzae

Aspergillus oryzae merupakan jamur yang diisolasi dari tanah

dan tanaman. Jamur ini dapat tumbuh dengan optimal pada rentang suhu

32-36oC dan pada pH 2-8. Aspergillus oryzae tumbuh secara vegetatif

dengan membentuk filamen multinukleat haploid, hifa atau miselia.

Jamur ini memproduksi spora secara aseksual dan menghasilkan

konidiofor yang dikenal sebagai konidia. Stipes konidiofor tidak

memiliki warna dan memiliki tekstur yang didominasi kasar hingga

halus. Pada media agar, koloni yang awalnya berwarna putih akan

berubah menjadi hijau kekuningan yang menandakan banyaknya

pertumbuhan konidia. Konidia memiliki ukuran yang besar dan

membentuk oval dengan diameter 5-8 μm. Kepala konidia berbentuk

bulat dengan diameter 100-200 μm. Dinding konidia sebagian besar

memiliki tekstur halus hingga kasar. Dan pada vesikula dapat ditemukan

beberapa phialides dan metulae (Chang P et al, 2014).

Gambar 2.10 Struktur Aspergillus oryzae dilihat dari mikroskop.

32

(Sumber: Chang P et al, 2014)

2.4.3 Kurva Pertumbuhan Aspergillus oryzae

Kurva pertumbuhan merupakan tahapan yang menunjukkan

pertumbuhan mikroorganisme mulai dari fase awal sampai tidak dapat

tumbuh lagi. Fase pertumbuhan jamur dimulai dari fase lag yang

merupakan fase penyesuaian sel jamur dengan lingkungannya. Sel sel

tersebut akan membelah secara aktif pada fase akselerasi, dan akan

memperbanyak diri di fase eksponensial. Pada fase eksponensial juga

akan terjadi peningkatan aktivitas sel. Setelah pada fase deselerasi sel

akan mengurangi aktivitas pembelahan aktifnya dan akan meninggalkan

sisa senyawa yang tidak lagi diperlukan. Jumlah sel yang mati sama

dengan jumlah sel yang hidup menandakkan pertumbuhan jamur pada

fase stasioner dan ditandai dengan garis horizontal pada kurva. Pada fase

ini akan ditemukan banyak senyawa metabolit sekunder yang

dihasilkan. dan yang terakhir adalah fase kematian yang ditandai

penurunan kurva pertumbuhan semakin tajam. Kurva pertumbuhan

dapat diamati dengan menghitung tingkat kekeruhan pada media jamur.

Tingkat kekeruhan dihitung dengan nilai OD yang dihasilkan dari

spektrofotometer (Gandjar, 2006).

2.4.4 Identifikasi Karakteristik Aspergillus oryzae

2.4.4.1 Uji Makroskopis

Uji makroskopis pada Aspergilus oryzae dapat dilakukan dengan

menumbuhkan jamur pada suatu medium. Hal yang perlu diidentifikasi

antara lain: bentuk koloni, warna koloni, permukaan koloni dan bentuk

spora (Ade FY, 2013). Media yang dapat digunakan untuk identifikasi

33

jamur secara makroskopis adalah dengan medium PDA (Potato

Dextrose Agar) (Fathoni dkk, 2019).

Gambar 2.11 Bentukan koloni Aspergillus oryzae pada medium MEA

(kanan) dan ATB (kiri).

(Sumber: Ade FY, 2013)

2.4.4.2 Uji Mikroskopis

Uji mikroskopis Aspergillus oryzae dapat dilakukan dengan

menggunakan mikroskop. Pada uji ini yang perlu diperhatikan adalah

bentuk, warna, jumlah (tunggal atau tidak) dan posisi konidiofor atau

sporangiofor (Ade FY, 2013)

Gambar 2.12 Tampak struktur Aspergillus oryzae pada pengamatan

mikroskopis perbesaran 400X.

(Sumber: Ade FY, 2013)

2.4.5 Mekanisme Inhibitor Quorum sensing (IQS)

Quorum sensing merupakan hal terpenting dalam pembentukan

biofilm, oleh karena itu menganggu proses komunikasi sel merupakan

cara yang menarik untuk mencegah sekaligus menghambat

34

pembentukan biofilm. Untuk mengacaukan komunikasi sel dapat

dicapai dengan menargetkan sintesis, pengenalan atau pengangkutan

autoinduser. Selain itu juga dapat dilakukan dengan menurunkan atau

memodifikasi molekul persinyalan sehingga dapat mengacaukan system

komunikasi bakteri pathogen. Quorum sensing inhibitor memiliki peran

untuk menghambat biofilm dan menghancurkan patogenitas bakteri

pathogen tanpa membunuh bakteri normal atau menganggu fungsi

fisiologis bakteri dengan cara mengacaukan sistem komunikasi bakteri

pathogen (Borges et al, 2017; Nazzaro, Fratianni, & Coppola, 2013).

2.4.6 Aspergillus oryzae sebagai Antibiofilm

Penggunaan antibiotik secara tidak tepat dapat meningkatkan

potensi resistensi (Santhakumari, 2015; Defoirdt T, 2018). Sebuah studi

menunjukkan bahwa asam lemak memiliki potensi besar dalam

menghambat dan menganggu pembentukan biofilm pada berbagai

mikroba misalnya Staphylococcus aureus (Davies & Marques, 2009;

Kim Y et al, 2018). Asam lemak merupakan komponen penting dalam

proses sintesis triasilgliserida, ester,fosfolipid, dan kolesterol (Desbois

& Smith, 2010). Bakteri, alga, ragi, serangga, ikan, tumbuhan, dan

organisme lain dapat mensintesis asam lemak jenuh atau tak jenuh dan

memanfaatkannya sebagai pelindung dari bakteri patogen yang berada

disekitarnya (Santhakumari et al, 2017; Iglesias et al, 2019 ) Asam

lemak dapat menurunkan motilitas, adhesi, virulensi, flagellar serta

mengaktifkan regulasi stress yang memicu penghancuran biofilm,

sehingga bakteri rentan terhadap antimikroba (Nicol M et al, 2018;

35

Teper D et al, 2019). Berbagai asam lemak jenuh dan tak jenuh dapat

menghambat pertumbuhan biofilm dengan mempengaruhi proses

perlekatan, mengubah fluiditas membran sel, mengurangi EPS,

menganggu pembentukan fimbriae dan megacaukan system QS.

Dalam penelitian yang telah dilakukan oleh Tamano et al (2013)

menyatakan bahwa terdapat empat gen Aspergillus oryzae yang dapat

mensitesis asam lemak secara berlebih, sehingga dapat meningkatkan

produksi asam lemak. Asam lemak intraselular utama yang dihasilkan

adalah asam palmitate, asam strearat, asam oleic dan asam linoleic

(Tamano et al, 2015). Penggunaan senyawa alami memiliki beberapa

keunggulan dibandingkan obat antimikroba sebagai bahan penghambat

biofilm, seperti tingkat toksisitas yang rendah atau bahkan tidak

memiliki risiko resistensi terhadap mikroorganisme. Pada penelitian

yang dilakukan oleh Han-S. Kim, dkk menunjukkan bahwa asam

linoleic mampu menurunkan volume dan ketebalan biofilm

Pseudomonas aeruginosa sebesar 47% dan 33%. Asam linoleic juga

mampu menghambat pembentukan bakteri E. coli dengan aksi surfaktan

yang dapat meningkatkan permeabilitas membrane sehingga akan

mengakibatkan kematian sel (CLSI, 2010). Selain itu Namazi M (2004)

juga menyatakan bahwa asam linoleic memiliki aktivitas anti-biofilm

yang kuat pada Klebsiella pneumoniae. Asam linoleic memiliki potensi

menurunkan biofilm Klebsiella pneumoniae sebesar 80% pada dosis 31-

84 μ g / ml (Ramanathan et al, 2017).

36

Asam oleic yang berasal dari S. maltophilia diketahui dapat

menghambat motilitas perlekatan pada proses pembentukan biofilm dan

menghambat produksi pyocyanin pada bakteri P. aeruginosa, asam oleic

ini dapat berinteraksi dengan protein aktivator transkripsi LuxR yang

selanjutnya akan memblokir QS yang dimediasi AHL (Singh V.K. et al,

2013). Pada penelitian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa asam

palmitate yang di kultur pada Vibrio spp dapat menurunkan regulasi QS

pada luxS dan luxR, menghambat produksi EPS dan menganggu

pembentukan biofilm. Asam palmitate diketahui tidak menganggu

pertumbuhan planktonik, namun dapat mengacaukan proses adhesi

patogen (Santhakumari S et al, 2017). Secara khusus asam strearat dan

asam palmitate dapat menghambat ekspresi hemolisin, EPS, dan

produksi biofilm melalui RsbA (Liaw SJ et al, 2004). Pada proses

fermentasi, Aspergillus oryzae dapat memproduksi enzim ekstraseluler

seperti enzim α-amilase, β-glukosidase dan xilanase yang berfungsi

untuk mendegradasi bahan lignoselulosa dan dapat mensintesis senyawa

fenolik (Sa’nchez, 2009). Enzim β-glukosidase diketahui dapat

dijadikan sebagai antibiofilm (Oda et al, 2006). Dan fenolik memiliki

kemampuan sebagai Inhibitor Quorum sensing (IQS) (Damayanti,

2017).

37

Gambar 2.13 Asam lemak sebagai antibiofilm dengan menghambat proses

per, adhesi, EPS, fimbriae, pembentukan biofilm, serta maturasi biofilm.

(Sumber: Kumar P et al, 2020)

2.5 Kerangka Teori

Klebsiella pneumoniae merupakan bakteri penyebab

pneumonia. Pneumonia karena Klebsiella dapat ditandai dengan adanya

demam tinggi, lesu dan batuk kering. Batuk kering kemudian akan

berlanjut menjadi batuk produktif yang disertai dengan sputum darah

dan purulent. Jika tidak segera ditangani akan menyebabkan terjadinya

abses, nekrosis dan fibriosis pada jaringan paru (Wulandari & Asih,

2017. Untuk mengidentifikasi Klebsiella pneumoniae dapat dilakukan

dengan pewarnaan gram, pewarnaan kapsul, biakan di medium

38

diferensial dan uji biokim. Klebsiella pneumoniae termasuk bagian dari

keluarga Enterobacteriaceae. Klebsiella pneumoniae adalah bakteri

Gram-negatif, memiliki bentuk batang pendek dengan ukuran 0,5-0,5 x

1,2 μL. Bakteri ini tidak memiliki flagel dan tidak dapat membentuk

spora. Klebsiella pneumoniae tidak dapat bergerak namun dapat

memfermentasikan karbohidrat menjadi asam dan gas. Tidak hanya itu

bakteri ini juga dapat memfermentasikan laktosa.

Quorum sensing (QS) merupakan sistem komunikasi

mikroorganisme yang bergantung pada kepadatan sel, QS ini mampu

memicu terjadinya pembentukan biofilm dan faktor virulensi.K.

pneumoniae memiliki beberapa faktor virulensi antara lain, yaitu

lipopolisakarida (LPS), kapsul, pili (tipe 1 dan tipe 3), dan pembawa zat

besi atau dikenal sebagai siderofor (Shon. Et al, 2013). Faktor virulensi

berguna untuk meningkatkan kemampuan patogenitas suatu bakteri.

Lipopolisakarida (LPS) merupakan komponen utama pembentuk

membran luar bakteri gram negatif. LPS juga disebut sebagai mediator

paling kuat dari penyebab syok septik karena bakteri (Martin, 2018).

LPS tersusun dari antigen lipid A, inti, dan O-polisakarida yang berguna

sebagai sistem pertahanan diri dari komplemen. Dan CPS dikenal

sebagai faktor virulensi K. pneumoniae yang berada pada lapisan luar

pathogen yang mengandung sel polimorfonuklear yang berguna sebagai

faktor resistensi terhadap adanya fagositosis (Shakib. et al, 2018).

Kapsul K.pneumoniae bagian luar terbentuk dari susunan polisakarida

dan lipoprotein. Kapsul ini menghalangi proses bakterisidal dan

39

mencegah fagositosis, tidak hanya itu kapsul ini juga dapat menghambat

complement mediated lysis and opsonization dan mengurangi respon

inflamasi (Paczosa & Mecsas, 2016). Pili tipe 1 dan tipe 3 berfungsi

sebagai adhesi bakteri ke epitel, sel imun, dan permukaan abiotik (Wang

G. et al, 2020). Besi berguna dalam proses pertumbuhan bakteri. K.

pneumoniae memiliki kemampuan untuk memperoleh zat besi. Terdapat

4 molekul yang berfungsi untuk menyerap zat besi, yaitu : enterobactin,

yersiniabactin, salmochelin, dan aerobactin. Dalam pembentukan biof,

bakteri membutuhkan EPS yang berguna untuk melekatkan bakteri satu

dengan yang lain (Gunardi, 2014). Tidak hanya itu, EPS juga mampu

melindungi sel-sel bakteri dari perubahan lingkungan yang disebabkan

antimikroba, sistem imun inang, oksidasi dan kation logam (Jamal et al,

2015).

QS dapat dihambat dengan mengacaukan komunikasi sel yang

menargetkan sintesis, pengenalan atau pengangkutan autoinduser.

Quorum sensing inhibitor memiliki peran untuk menghambat biofilm

dan menghancurkan patogenitas bakteri pathogen tanpa membunuh

bakteri normal atau menganggu fungsi fisiologis bakteri. Aspergillus

oryzae diketahui memiliki enzim yang dapt menghambat pembentukan

biofilm yaitu Enzim β-glukosidase, enzim ini dapat mensintesis fenolik

yang dapat mengacaukan quorum sensing. Aspergillus oryzae juga dapat

memproduksi asam lemak berupa asam linoleic, asam oleic, asam

palmitate, dan asam strearat yang berpotensi menurunkan pembentukan

biofilm K. pneumoniae.

40

BAB III

KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS

3.1 Kerangka Konsep

Pembentukan biofilm K. pneumoniae diawali oleh adhesi sel,

yaitu proses perlekatan sel planktonik pada permukaan biotik atau

abiotik secara reversibel. Sel planktonik ini akan membentuk perlekatan

yang irreversible dengan bantuan sistem adhesi spesifik seperti flagela,

41

fimbriae, lipopolisakarida dan protein adhesi. Setelah terbentuk

perlekatan yang irreversible, bakteri akan mengirimkan sinyal sebagai

sistem komunikasi untuk mengkoordinir pembentukan mikrokoloni.

Dalam pembentukan mikrokoloni juga diperlukan EPS untuk perlekatan

antar bakteri (Gunardi, 2014). Pembentukan biofilm yang matur ditandai

oleh tingginya kepadatan dan kompleksitas struktur biofilm. Setelah

berada pada puncak pembentukan biofilm, akan terjadi penurunan

eksopolisakarida dan bakteri akan mengalami dispersi.

Aspergillus oryzae memiliki kandungan asam lemak yang dapat

menghambat pembentukan biofilm yaitu asam strearat, asam palmitate,

asam linoleic dan asam oleic. Asam linoleic secara khusus memiliki

potensi menurunkan biofilm Klebsiella pneumoniae sebesar 80% pada

dosis 31-84 μ g / ml. Selain itu asam linoleat memiliki aktivitas anti-

biofilm yang kuat pada Klebsiella pneumoniae (Namazi M, 2004).

Asam oleic diketahui dapat menghambat motilitas perlekatan pada

proses pembentukan biofilm, asam oleic ini juga dapat berinteraksi

dengan protein aktivator transkripsi LuxR yang selanjutnya akan

memblokir QS yang dimediasi AHL. Asam palmitate juga dapat

memiliki kemampuan untuk menurunkan regulasi QS pada luxS dan

luxR, serta menghambat produksi EPS dan menganggu pembentukan

biofilm. Asam palmitate tidak menganggu proses pertumbuhan

planktonik, namun asam ini dapat mengacaukan proses adhesi patogen.

Sedangkan asam strearat dan asam palmitate memiliki fungsi untuk

42

menghambat ekspresi hemolisin, EPS, dan produksi biofilm melalui

RsbA.

Pada proses fermentasi, Aspergillus oryzae dapat memproduksi

enzim ekstraseluler seperti enzim α-amilase, β-glukosidase dan xilanase

yang berfungsi untuk mendegradasi bahan lignoselulosa dan dapat

mensintesis senyawa fenolik. Enzim β-glukosidase diketahui dapat

dijadikan sebagai antibiofilm. Dan fenolik memiliki kemampuan

sebagai Inhibitor Quorum sensing (IQS).

Oleh karena itu dengan adanya kandungan Aspergillus oryzae

dapat dijadikan sebagai antibiofilm dengan menghambat faktor adhesi,

EPS, dan Quorum Sensing (QS). Sehingga akan menganggu proses

pembentukan biofilm.

3.2 Hipotesis Penelitian

H0: Aspergillus oryzae tidak memiliki aktivitas antibiofilm pada


H1: Aspergillus oryzae memiliki aktivitas antibiofilm pada Klebsiella

pneumoniae.

43

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Desain penelitian berupa penelitian eksperimental. Penelitian ini

menggunakan metode tissue culture plate/microtiter plate biofilm assay

yang nantinya akan di isi kelompok uji pada masing-masing well plate.

Kelompok pada uji ini adalah kontrol positif, kontrol negatif, kontrol

media dan supernatan Aspergillus oryzae dengan berbagai konsentrasi.

Metode ini untuk mempermudah mengukur nilai Optic Density (OD)

setiap kelompok uji dengan menggunakan Microplate reader.

4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian uji aktivitas antibiofilm Aspergillus oryzae terhadap

biofilm Klebsiella pneumoniae dilakukan di laboratorium Mikrobiologi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Maulana Malik Ibrahim

Malang. Penelitian ini akan dilakukan selama rentang waktu Januari -

Maret tahun 2021

4.3 Populasi dan Sampel Penelitian

4.3.1 Populasi Penelitian

Penelitian menggunakan biakan bakteri dari spesies Klebsiella

pneumonia sebagai populasi.

4.3.2 Sampel Penelitian

Sampel pada penelitian ini menggunakan koloni Klebsiella

pneumoniae yang diperoleh dari Laboratorium Wiyasa Mandiri

Malang.

44

4.4 Variabel Penelitian

4.4.1 Variabel bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah nilai konsentrasi

supernatan Aspergillus oryzae. Pada penelitian ini akan digunakkan 5

kelompok konsentrasi, yaitu 100%, 50%, 25%, 12,5% dan 6,25%.

4.4.2 Variabel Terikat

Variabel terikat pada penelitian ini adalah nilai optical density

(OD) antibiofilm yang diukur dengan Microplate reader. Nilai OD yang

diukur adalah OD pencegahan perlekatan biofilm, OD penghambatan

pertumbuhan biofilm,dan nilai OD penghancuran biofilm pada bakteri

K. pneumoniae.

4.5 Jumlah Pengulangan

Pada penelitian ini digunakan rumus Federer untuk menentukan

jumlah pengulangan. Pengulangan dilakukan untuk mendapatkan data

yang valid. Rumus Federer adalah sebagai berikut (Dewi et al,2013)

Keterangan :

r = banyaknya pengulangan

t = banyaknya perlakuan

(t – 1) (r – 1) ≥ 15

(8 – 1) (r – 1) ≥ 15

7 (r – 1) ≥ 15

7r – 7 ≥ 15

7r ≥ 22

R ≥ 3,14

45

Dari perhitungan Rumus Federer diatas maka dapat disimpulkan

bahwa pengulangan pada setiap perlakuan penelitian dilakukan

sebanyak 3 kali.

4.6 Definisi Operasional

1. Jamur Aspergillus oryzae yang digunakan adalah jamur telah

diinokulasi pada media PBD yang diinkubasi selama 3 hari dengan

suhu 28oC.

2. Klebsiella pneumoniae yang digunakan adalah Klebsiella

pneumoniae yang dapat membentuk biofilm. Bakteri yang

menunjukkan karakteristik Klebsiella pneumoniae pada uji

pewarnaan gram, uji biokimia, dan uji biofilm. Bakteri Klebsiella

pneumoniae yang diperoleh dari Laboratorium Fakultas Kedokteran

UIN Maulana Malik Ibrahim Malang.

3. Supernatan Aspergillus oryzae adalah substansi hasil sentrifugasi

Aspergillus oryzae yang memiliki berat jenis yang lebih rendah.

4. Optical Density (OD) adalah nilai yang dihasilkan dari pengukuran

Microplate reader untuk mengetahui nilai kuantitatif dari

pembentukan biofilm dari Klebsiella pneumoniae.

5. Microtiter plate biofilm assay merupakan metode yang digunakan

untuk mendeteksi pembentukan biofilm. Metode ini dilakukan

dengan mikrodilusi cair pada microplate dan kemudian diukur nilai

OD dari aktivitas antibiofilm Aspergilus oryzae terhadap biofilm


6. Kelompok uji adalah kelompok yang mendapatkan perlakuan

46

dengan penambahan supernatan Aspergillus oryzae dengan

konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, dan 6,25%.

7. Kelompok kontrol merupakan kelompok uji yang tidak mendapat

perlakuan pemberian supernatan Aspergillus oryzae. Kelompok

kontrol terdiri dari control positif yang berisi gentamisin +

Klebsiella pneumoniae, kontrol negatif yang berisi TSB + Klebsiella

pneumoniae, dan kelompok kontrol media yang berisi PDB + TSB.

8. Uji pertumbuhan biofilm adalah uji yang bertujuan untuk

mendeteksi kemampuan Klebsiella pneumoniae dalam membentuk

biofilm. Apakah termasuk non-biofilm producer, weak-biofilm

producer, moderate-biofilm producer, atau sebagai strong-biofilm

producer.

9. Uji pencegahan perlekatan biofilm merupakan uji yang digunakan

untuk mengetahui kemampuan Aspergillus oryzae dalam mencegah

perlekatan biofilm dari Klebsiella pneumoniae.

10. Uji penghambatan pembentukan biofilm adalah upaya untuk

mengetahui kemampuan Aspergillus oryzae dalam menghambat

pembentukan biofilm dari Klebsiella pneumoniae.

11. Uji penghancuran biofilm merupakan uji yang digunakan untuk

mengetahui kemampuan Aspergillus oryzae dalam menghancurkan

perlekatan biofilm dari Klebsiella pneumoniae.

12. Kadar Hambat Minimum (KHM) adalah konsentrasi terendah yang

mampu menghambat pertumbuhan bakteri.

13. Kadar Bunuh Minimum (KBM) adalah konsentrasi terendah yang

47

mampu membunuh 99% atau 100% bakteri.

4.7 Kriteria Penelitian

4.7.1 Kriteria Inklusi

1. Jamur Aspergillus oryzae yang diisolasi dari tanah atau tanaman.

2. Klebsiella pneumoniae yang diperoleh dari Laboratorium Wiyasa

Mandiri Malang.

3. Klebsiella pneumoniae yang diisolasi dari pasien dengan

pneumonia.

4. Koloni Klebsiella pneumoniae yang dapat membentuk biofilm kuat

pada tissue culture plate.

4.7.2 Kriteria Eksklusi

1. Jamur Aspergillus oryzae yang terkontaminasi mikroorganisme lain.

2. Koloni Klebsiella pneumoniae yang terkontaminasi koloni bakteri

lain.

3. Koloni Klebsiella pneumonia yang tidak dapat membentuk biofilm

kuat.

4.8 Alat dan Bahan Penelitian

4.8.1 Alat Penelitian

Alat alat yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah autoklaf,

microplate reader, mikroskop, object glass, elenmeyer, tabung reaksi,

gelas beaker, falcon, kertas saring whatman nomer 42, filter paper 0,22

μm, mikropipet, vortex, sentrifugasi, incubator shaker, inkubator,

Eppendorf, spektrofotometer, mikrotip kuning, colony-counter,

mikrotip biru, rak tabung, baskom, cawan petri steril, cotton swab,

48

mikroplate merk biologix, ice-pack, kuvet, spektrofotometer, ose,

bunsen, kain lap, timbangan analitik, vortex, sentrifugasi, gunting,

kertas alumunium foil, plastik wrap.

4.8.2 Bahan Penelitian

4.8.2.1 Bahan Uji

Dari penelitian ini bahan yang akan diujikan adalah jamur

Aspergillus oryzae. Jamur yang digunakan adalah jamur yang telah

diinokulasi dan diinkubasi sesuai dengan masa stasioner pertumbuhan

jamur.

4.8.2.2 Bakteri Uji

Bakteri yang diujikan adalah koloni bakteri Klebsiella

pneumoniae yang berasal dari Laboratorium Fakultas Kedokteran dan

Ilmu kesehatan UIN Maulana Malik Ibrahim Malang.

4.8.2.3 Bahan lainnya

Bahan yang digunakan sebagai penunjang perlakuan lainnya

adalah medium agar Mac Conkey, larutan glukosa, alkohol, aquades,

Phosphate-Buffered Saline (PBS), Tryticase Soy Broth (TSB), Potato

Dextrose Broth (PDB), Triple Sugar Iron Agar (TSIA), safranin,

gentamisin, Kristal violet, dan asam asetat.

4.9 Prosedur Penelitian

4.9.1 Pembuatan Media Pertumbuhan Aspergillus oryzae (Safitri,

Fauzana, Fauziah. 2011)

Pembuatan media pertumbuhan Aspergillus oryzae digunakan

media Potato Dextrose Broth (PDB) yang ditambahkan glukosa 2%.

49

Sebelum ditambahkan larutan glukosa, media PDB disterilkan dengan

autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121oC. Media PDB dibuat dari

campuran PDB bubuk yang ditambahkan dengan aquades dengan

perbandingan 24 gr : 1000 mL.

4.9.2 Pembuatan Supernatan Aspergillus oryzae (Modifikasi

Prateeksha et al, 2019; Hasiani, Ahmad, Rijai. 2015)

Untuk membuat supernatan diperlukan pembuatan inokulum

jamur terlebih dahulu. Inokulum jamur dibuat dari 5 mL suspensi

Aspergillus oryzae yang ditambahkan 45 mL PDB steril dan 1 mL

larutan glukosa dengan konsentrasi 2%. Setelah itu dimasukkan ke

dalam inkubator shaker selama 3 hari dengan suhu 28oC. Langkah

selanjutnya dengan menyaring hasil inokulum jamur dengan kertas

Whatman no. 2 dan ditampung pada falcon. Kemudian hasil saringan

dimasukkan pada tabung eppendorf dan di frezzer beberapa saat sampai

muncul kristal es untuk menghindari kerusakan protein jamur. Setelah

itu dilakukan sentrifugasi untuk memisahkan supernatan dengan

peletnya. Langkah berikutnya dengan melakukan penyaringan

supernatan dengan menggunakan filter paper 0,22 μm dan supernatan

siap digunakan.Supernatan harus selalu dalam kondisi dingin untuk

mencegah terjadinya kerusakan protein.

4.9.3 Pembuatan Seri Konsentrasi Supernatan Aspergillus oryzae

Pembuatan seri konsentrasi supernatan dilakukan dengan

menggunakan metode mikrodelusi. Mikrodelusi merupakan metode

yang sering digunakan dalam penentuan efektivitas antimikroba.

50

Metode ini dibuat dengan menginokulasikan bakteri uji dengan volume

yang rendah ke dalam wadah yang disebut microplate 96-well dan

dihasilkan konsentrasi dengan tingkatan menurun (Balouri dkk, 2016).

Seri konsentrasi dibuat menggunakan metode mikrodelusi

dengan memasukkan supernatan jamur sebanyak 100 μL dan media

PDB 100 μL kemudian dilakukan pengenceran bertingkat sampai

didapatkan seri konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, dan 6,25%.

Setelah itu diambil 100 μL larutan dari well-plate konsentrasi 6,25%,

sehingga didapatkan total volume sebanyak 100 μL pada setiap well-

plate. (Modifikasi Rollando dkk, 2019).

4.9.4 Identifikasi Aspergillus oryzae

4.9.4.1 Uji Makroskopis

Pengamatan secara makroskopis dilakukan dengan inokulasi

pada media PDA yang telah dipadatkan pada cawan petri. Pengestreakan

dilakukan menggunakan swab steril. Langkah selanjutnya adalah

dengan memasukkan cawan petri dalam inkubator selama 5-7 hari dan

dilakukan pengamatan terhadap koloni yang tumbuh (Fathoni R dkk,

2017)

4.9.4.2 Uji Mikroskopis

Uji mikroskopis dilakukan dengan menggunakan alat

mikroskop. Hal pertama yang dilakukan adalah dengan membuat

preparat. Preparat dibuat dengan menyiapkan object glass, lalu ditetesi

aquades dengan pipet. Setelah itu meletakkan koloni jamur di atas

object glass yang telah ditetesi aquades dan ditutup dengan cover glass.

51

Dan yang terakhir meletakkan preparat pada mikroskop lalu dilakukan

pengamatan (Shofiana dkk, 2015)

4.9.5 Uji Kurva Pertumbuhan

Untuk menentukan kurva pertumbuhan pada Aspergillus oryzae

langkah pertama yang dilakukan adalah dengan menyiapkan tabung

reaksi yang berisi 3 ml PBD steril. Setelah itu memasukkan koloni

jamur pada tabung dengan menggunakan ose, lalu dihomogenkan dan

dimasukkan pada incubator shaker selama 24 jam. Langkah selanjutnya

yaitu melakukan pengenceran sampai dihasilkan OD ≤ 0,05. Kemudian

diambil 1,5 ml jamur dan dimasukkan ke dalam kuvet. Setelah itu

diletakkan ke inkubator shaker dan dilakukan pengukuran OD setiap 5

jam (Modifkasi Safitri, Fauzana, Fauziah. 2011).

4.9.6 Pembuatan Media Pertumbuhan Klebsiella pneumoniae

Media yang digunakan untuk menumbuhkan Klebsiella

pneumonia adalah media Trypticase Soy Broth (TSB) yang telah

dicampurkan glukosa dengan konsentrasi 5%. Sebelum ditambahkan

larutan glukosa, TSB disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121oC

selama 15 menit. Media TSB dibuat dari campuran TSB bubuk yang

ditambahkan dengan aquades dengan perbandingan 30 gr : 1000 mL.

Di penelitian ini juga diperlukan media padat untuk

menumbuhkan bakteri yaitu dengan media Trypticase Soy Agar (TSA).

Media ini terbuat dari campuran TSB dan agar dengan perbandingan

40gr : 10gr yang kemudian dilarutkan dengan mengunakan aquades

sebanyak 1 liter. Setelah itu dihomogenkan dan dipanaskan di atas hot

52

plate, lalu disterilisasi dengan autoklaf (Purwanti NU & Susanti R.

2016)..

4.9.7 Pembuatan Suspensi Klebsiella pneumoniae

Pada pembuatan suspensi bakteri diperlukan 1 ose Klebsiella

pneumoniae yang diinokulasikan pada tabung reaksi yang berisi

campuran media TSB 3 mL dan larutan glukosa 5% sebanyak 60 μL.

Setelah itu dihomogenkan dan di masukkan ke inkubator selama 18 jam

dengan suhu 37oC. Selanjutnya ditambahkan lagi TSB 2 mL dan

glukosa 5% sebanyak 40 uL, kemudian dihomogenkan dan di inkubasi

selama 18 jam dengan suhu 37oC. Langkah selanjutnya yaitu dengan

mengukur kepadatan suspensi bakteri sampai menunjukkan nilai OD

0,4-0,6.

4.9.8 Identifikasi Klebsiella pneumoniae

4.9.8.1 Uji Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram dilakukan dengan menyiapkan preparat pada

object glass pada permulaan pengujian. Cara membuat preparat dimulai

dengan meneteskan aquades steril pada object glass, kemudian

diberikan 1 ose koloni bakteri Klebsiella pneumoniae pada object glass

yang telah diberi aquades dan disebar secara merata. Kemudian

ditunggu sampai benar benar kering. Setelah itu object glass di ayunkan

di atas bunsen sampai terasa hangat. Setelah itu preparat di tetesi dengan

larutan Kristal violet (Gram A), lalu tunggu selama 2 menit, kemudian

dicuci menggunakan aquades dan dikeringkan. Langkah selanjutnya

preparat ditetesi dengan larutan iodium (Gram B) lalu diamkan selama

53

2 menit, kemudian dicuci menggunakan aquades dan dikeringkan.

Setelah itu preparat ditetesi dengan larutan ethanol 96% (Gram C),

biarkan selama 30 detik kemudian dibilas dengan aquades dan

dikeringkan. Dan yang terakhir preparat ditetesi dengan larutan safranin

(Gram D), tunggu 30 detik dan dibilas menggunakan aquades lalu

keringkan. Setelah proses pewarnaan dilakukan pengamatan dengan

menggunakan mikroskop (Khotimah, 2020).

Gambar 4.1 Uji Pewarnaan Gram. 1) Pewarnaan dengan kristal violet, 2)

Pemberian larutan iodin, 3) Pembilasan dengan decolorizing agent, 4)

Pemberian Safranin

(Sumber: www.medicallabscientist.org)

4.9.8.2 Uji Mac Conkey

Pada uji Mac Conkey yang pertama dilakukan adalah dengan

menyiapkan media agar Mac Conkey, setelah itu dilakukan inokulasi

Klebsiella pneumoniae pada agar tersebut dan kemudian di inkubasi

pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Setelah diinkubasi dilakukan

identifikasi pada pada media agar untuk mengetahui perubahan warna

(Khusnul, 2020)

4.9.8.3 Uji Urease

Pada uji urease yang pertama dilakukan adalah dengan

menyiapkan media agar urea, media agar dibuat dengan posisi miring

54

setelah itu dilakukan inokulasi Klebsiella pneumoniae pada agar

tersebut dan kemudian di inkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam.

Setelah diinkubasi dilakukan identifikasi pada pada media agar untuk

mengetahui perubahan warna (Khusnul, 2020)

4.9.8.4 Uji Methyl Red

Pada uji Methyl Red yang harus dilakukan pertama adalah

dengan menyiapkan medium MRVP broth pada tabung reaksi sebanyak

4 mL. Setelah itu ditambahkan 1 ose koloni Klebsiella pneumoniae dan

diinkubasi dengan suhu 37oC selama 24 jam. Selanjutnya diberikan

reagen Methyl Red sebanyak 3-4 tetes (Al-Baer et al, 2017).

4.9.8.5 Uji Indol, Voges Preskauer, Simmon’s Citrate (IMViC)

a. Uji Indol

Langkah pertama pada uji indole adalah dengan menyiapkan

medium tryptone broth pada tabung reaksi sebanyak 5 ml. Setelah

itu ditambahkan 1 ose koloni Klebsiella pneumoniae dan diinkubasi

dengan suhu 37oC selama 24 jam. Setelah keluar dari inkubator

kemudian diberikan reagen Kovac’s sebanyak 5 tetes untuk

mendeteksi produksi indole.

b. Uji Voges Proskauer (VP)

Langkah pertama pada uji Voges Proskauer adalah dengan

menyiapkan medium MRVP broth pada tabung reaksi sebanyak 4

mL. Setelah itu ditambahkan 1 ose koloni Klebsiella pneumoniae

dan diinkubasi dengan suhu 37oC selama 24 jam. Setelah keluar dari

inkubator kemudian diberikan reagen VP A yang berisi napthol

55

sebanyak 5 tetes dan diberikan reagen VP B yang berisi KOH, lalu

dihomogenkan. Kemudian ditunggu selama 15 menit dan diamati

perubahan warna yang terjadi (Arifin, 2013)

c. Uji Simmon’s Citrate

Langkah pertama pada uji Simmon’s Citrate adalah dengan

menyiapkan medium Simmon sitrat agar. Setelah itu digoreskan 1

ose koloni Klebsiella pneumoniae pada media agar dan diinkubasi

dengan suhu 37oC selama 24-48 jam. Selanjutnya amati perubahan

warna yang terjadi (Al-Baer et al, 2017).

4.9.9 Denah Uji Perlakuan Aktivitas Antibiofilm

Gambar denah penggunaan well-plate untuk uji aktivitas antibiofilm

pada microplate 96 wells sebagai berikut:

Gambar 4.2 Denah perlakuan pada microplate 96 wells

Keterangan:

56

4.9.10 Uji Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh

Minimum (KBM)

Nilai Kadar Hambat Minimum (KBM) dapat digunakan sebagai

acuan dalam pengujian antibiofilm dan time-kill assay. Aktivitas

pembentukan biofilm juga dapat ditentukan melalui nilai konsentrasi

dibawah nilai KHM. Hal itu dapat menunjukkan adanya bakteri yang

masih tumbuh dan mampu membentuk biofilm. Sehingga dapat

ditentukan nilai penghambatan biofilm dan dapat diamati efek

pemberian ekstrak (Fitria dkk, 2018).

Pada uji KHM diperlukan kelompok uji dengan berbagai macam

konsentrasi, yaitu dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, dan

6,25%. Kemudian memasukan PDB dan supernatan jamur dengan

berbagai konsentrasi pada well plate, lalu ditambahkan juga 100 μL

suspensi Klebsiella pneumoniae pada well-plate kelompok uji.

Antibiotik gentamisin 25 μL/mL dan suspensi K. pneumoniae

57

ditambahkan pada well plate kelompok kontrol positif masing masing

sebanyak 100μL. Media TSB 100 μL dan suspensi K. pneumoniae

sebanyak 100 μL dimasukkan pada well plate kelompok kontrol negatif.

Dan memasukkan 100 μL PDB dan 100 μL TSB pada kelompok kontrol

media. Setelah semua dimasukkan pada Microplate, kemudian tutup

microplate dan lapisi menggunakan alumunium foil dan plastik wrap.

Microplate dimasukkan pada inkubator selama 24 jam dengan suhu

37oC.

Setelah diinkubasi selama 24 jam mikroplate diukur OD-nya

dengan microplate-reader untuk menentukkan nilai KHM. Nilai KHM

diperoleh dari konsentrasi antimikroba terendah yang mampu

menghambat pertumbuhan mikroba. Untuk menentukan konsentrasi

yang digunakan dalam KBM, didapatkan dari media cair yang memiliki

tingkat kekeruhan terendah setelah diinkubasi. Penentuan nilai KBM

dapat menggunakan nilai KHM yang telah diamati sebelumnya. Larutan

KHM diambil sebanyak 3 μL dan digores pada cawan petri yang berisi

media TSA. Langkah selanjutnya yaitu memasukkan cawan petri

kedalam inkubator selama 24 jam dan amati pertumbuhan koloni bakteri

pada media TSA. Hasil KBM diambil dari pengamatan visual secara

langsung dengan bantuan colony counter. (Modifikasi Rollando dkk,

2019)

4.9.11 Uji Pertumbuhan Biofilm (Modifikasi Abidah, 2020;

Cadavid et al, 2018)

Pada uji pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae dilakukan

58

untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam membentuk biofilm.

Langkah pertama dengan memasukkan 200 μL suspensi Klebsiella

pneumoniae pada well-plate sebagai kelompok uji. Dan memasukkan

200 μL TSB yang telah diberi larutan glukosa dengan konsentrasi 5%

pada kelompok kontrol media. Setelah semua dimasukkan pada

Microplate, kemudian tutup microplate dan lapisi menggunakan

alumunium foil dan plastik wrap. Microplate dimasukkan pada

inkubator selama 24 jam dengan suhu 37oC. Sesudah diinkubasi, isi

yang ada di microplate di buang dan dicuci dengan PBS steril 3x.

Setelah kering microplate diberi larutan kristal violet 0,1% sebanyak

200 μL dan kemudian diinkubasi dengan suhu ruang selama 15 menit.

Kemudian keluarkan kristal violet dan dicuci dengan aquades sebanyak

3x pengulangan untuk menghilangkan sel yang menyerap warna namun

tidak menempel pada microplate. Ketika microplate sudah kering

langkah selanjutnya adalah memasukkan 200 μL asam asetat 30% pada

semua well-plate dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit dan

langkah terakhir adalah dengan mengukur nilai OD dengan

menggunakan microplate reader dengan panjang gelombang 595 nm.

Kekuatan biofilm bakteri dapat ditentukan dengan

membandingkan nilai ODisolat dengan ODcut. Nilai OD dihasilkan dari

rata-rata ODisolat dikurangi nilai ODcut (OD = rata-rata nilai ODisolat –

ODcut). ODcut didapat dari rumus sebagai berikut:

Keterangan:

ODcut = Optical Density cut-off

59

ODc = Optical Density control

Interpretasi nilai kekuatan bakteri pembentuk biofilm

Rata-rata nilai OD Kekuatan penghasil biofilm

ODisolat ≤ ODcut Non-biofilm producer

ODcut <ODisolat ≤ 2x ODcut Weak-biofilm producer

2x ODcut <ODisolat ≤ 4x ODcut Moderate- biofilm producer

4x ODcut <ODisolate Strong- biofilm producer

Tabel 4.1 Interpretasi kekuatan bakteri pembentuk biofilm

Sumber: (Ramadan et al., 2017)

ODcut = Optical Densitycut,

ODisolat = Optical Density isolat

4.9.12 Uji Aktivitas Antibiofilm Aspergillus oryzae terhadap

Klebsiella pneumoniae

4.9.12.1 Uji Aktivitas Pencegahan Perlekatan Biofilm (Modifikasi

Abidah, 2020; Cadavid, 2018; Paula-Ramos, 2016; Pratiwi et

al, 2015)

Pada uji pencegahan perlekatan biofilm Klebsiella pneumoniae

diperlukan kelompok uji dengan berbagai macam konsentrasi

supernatan jamur, yaitu dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%,

dan 6,25%. Kemudian memasukan 200 μL supernatan jamur dengan

berbagai konsentrasi pada well plate kelompok uji. Antibiotik

gentamisin 25 μL/mL dimasukkan pada well plate kelompok kontrol

positif sebanyak 200 μL dan diinkubasi selama 60 menit dengan suhu

37oC. Langkah selanjutnya yaitu membuang isi mikroplate, kemudian

dicuci dengan larutan PBS sebanyak 3 kali pengulangan dan tunggu

60

hingga kering. Setelah itu suspensi Klebsiella pneumoniae dimasukkan

pada well-plate kelompok uji, kelompok kontrol pisitif dan kelompok

kontrol negatif masing-masing 200 μL. Tambahkan PDB dan TSB yang

dicampurkan dengan larutan glukosa 5% dimasukkan pada kelompok

kontrol media. Kemudian tutup microplate dan lapisi menggunakan

alumunium foil dan plastik wrap. Microplate dimasukkan pada

inkubator selama 72 jam dengan suhu 37oC.

Sesudah diinkubasi, isi yang ada di microplate di buang dan

dicuci dengan PBS steril 3x. Setelah microplate kering, ditambahkan

200 μL kristal violet 0,1% pada semua well-plate dan diamkan selama

15 menit pada suhu ruang dan gelap. Kemudian keluarkan kristal violet

dan dicuci dengan aquades sebanyak 3x pengulangan untuk

menghilangkan sel yang menyerap warna namun tidak menempel pada

microplate. Ketika microplate sudah kering langkah selanjutnya adalah

memasukkan 200 μL asam asetat 30% pada semua well-plate dan

diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit dan langkah terakhir adalah

dengan mengukur nilai OD dengan menggunakan microplate reader

dengan panjang gelombang 595 nm (Modifikasi Abidah, 2020). Dan

dihitung dengan menggunakan rumus pencegahan perlekatan biofilm

sebagai berikut:

% 𝐏𝐏𝐁𝐚 =𝑶𝑫𝒌𝒏−𝑶𝑫𝒔𝒆

𝑶𝑫𝒌𝒏 X 100%

Keterangan :

PPBa = Persentase pencegahan perlekatan biofilm

ODkn = Nilai OD kontrol negatif

61

ODse = Nilai OD sampel eksperimen

4.9.12.2 Uji Aktivitas Penghambatan Pertumbuhan Biofilm

(Modifikasi Abidah, 2020; Cadavid et al, 2018; Paula-

Ramos, 2016; Pratiwi et al, 2015)

Pada uji penghambatan pertumbuhan biofilm Klebsiella

pneumoniae diperlukan kelompok uji dengan berbagai macam

konsentrasi, yaitu dengan konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, dan

6,25%. Kemudian memasukan PDB dan supernatan jamur dengan

berbagai konsentrasi pada well plate, lalu ditambahkan juga 100 μL

suspensi Klebsiella pneumoniae pada well-plate kelompok uji.

Antibiotik gentamisin 25 μL/mL dan suspensi K. pneumoniae

ditambahkan pada well plate kelompok kontrol positif masing masing

sebanyak 100μL. Media TSB 100 μL dan suspensi K. pneumoniae

sebanyak 100 μL dimasukkan pada well plate kelompok kontrol negatif.

Dan memasukkan 100 μL PDB dan 100 μL TSB pada kelompok kontrol

media. Setelah semua dimasukkan pada Microplate, kemudian tutup

microplate dan lapisi menggunakan alumunium foil dan plastik wrap.

Microplate dimasukkan pada inkubator selama 72 jam dengan suhu

37oC.






62






dengan panjang gelombang 595 nm. Dan dihitung dengan menggunakan

rumus penghambatan pertumbuhan biofilm sebagai berikut :

% 𝐏𝐏𝐁𝐛 =𝑶𝑫𝒌𝒏 − 𝑶𝑫𝒔𝒆


Keterangan :

PPBb = Persentase penghambatan pertumbuhan biofilm



4.9.12.3 Uji Aktivitas Penghancuran Biofilm (Modifikasi Abidah,

2020; Cadavid et al, 2018; Paula-Ramos, 2016; Pratiwi et al,

2015)

Pada uji penghancuran biofilm Klebsiella pneumoniae yang

pertama dilakukan adalah memasukkan suspensi Klebsiella pneumoniae

sebanyak 200 μL kedalam well-plate kelompok uji, kelompok kontrol

positif dan kelompok kontrol negatif. Dan memasukkan 100 μL PBD

dan 100 μL TSB yang telah dicampur dengan larutan glukosa 5% pada

well-plate kelompok kontrol media dan diinkubasi selama 72 jam

dengan suhu 37oC. Langkah selanjutnya yaitu membuang isi mikroplate,

kemudian dicuci dengan larutan PBS sebanyak 3 kali pengulangan dan

63

tunggu hingga kering. Setelah itu memasukkan supernatan jamur

dengan berbagai konsentrasi (100%, 50%, 25%, 12,5%, dan 6,25%)

sebanyak 200 μL pada well-plate kelompok uji. Antibiotik gentamisin

25 μL/mL dimasukkan pada well-plate kelompok kontrol positif

sebanyak 200 μL dan memasukkan suspensi Klebsiella pneumoniae

pada well-plate kelompok kontrol negatif. Dan yang terakhir

memasukkan 100 μL PDB dan 100 μL TSB yang telah dicampur dengan

larutan glukosa 5% pada well-plate kelompok kontrol media. Setelah

semua dimasukkan pada Microplate, kemudian tutup microplate dan

lapisi menggunakan alumunium foil dan plastik wrap. Microplate

dimasukkan pada inkubator selama 60 menit dengan suhu 37oC.











dengan panjang gelombang 595 nm. Dan dihitung dengan menggunakan

rumus penghancuran biofilm sebagai berikut:

64

% 𝐏𝐏𝐁𝐜 =𝑶𝑫𝒌𝒏 − 𝑶𝑫𝒔𝒆


Keterangan :

PPBc = Presentase penghancuran biofilm



65

4.10 Alur Penelitian

66

4.11 Analisis Data

Analisis data yang digunakan pada penelitian ini yaitu

dengan aplikasi IBM SPSS Stastistic analisis pertama yaitu menentukan

jenis analisis statistik data termasuk parametrik atau non parametrik.

Data parametrik adalah data yang terdistribusi secara normal dengan

skala interval atau rasio, sedangkan data non-parametrik adalah data

yang tidak terdistribusi normal yang ditunjukkan dengan skala data

nominal atau ordinal (Santoso, 2019). Apabila data memenuhi syarat

parametrik maka dilanjutkan dengan analisis menggunakan uji oneway

ANOVA. Namun apabila data tidak memenuhi syarat parametrik, maka

dilakukan analisis statistik non parametrik dengan Kruskal Wallis Test.

Hasil data dengan nilai p-value < 0,05 menunjukkan terdapat

perbedaaan yang signifikan antar konsentrasi. Setelah dihasilkan

perbedaan yang sisgnifikan, maka dilanjutkan analisis dengan Post-Hoc

Tukey HSD untuk mengetahui perbedaan signifikan antar masing

masing data kelompok. Analisa terakhir dengan uji korelasi Pearson

untuk mengetahui hubungan antar konsentrasi supernatan jamur dalam

mencegah perlekatan biofilm, penghambatan pertumbuhan biofilm, dan

penghancuran biofilm dengan menggunakan nilai OD (Abidah, 2020)

67

BAB V

HASIL

5.1 Uji Karakteristik Aspergillus oryzae

5.1.1 Uji Mikroskopis

Gambar 5.1 Hasil pengamatan mikroskopis perbesaran 100X

Pada pengamatan karakteristik Aspergillus oryzae secara

mikroskopis pada perbesaran 100X dapat ditemukan gambaran antara

lain : conidiophore, konidia, vesikula. Sesuai dengan ciri ciri yang

disebutkan oleh Chang P et al (2014) maka jamur ini dapat dikatakan

sebagai jamur Aspergillus oryzae.

5.1.2 Uji Makroskopis

Gambar 5.2 Hasil uji makroskopis pada jamur Aspergillus oryzae

Pengamatan secara makroskopis yang dilakukan dengan

inokulasi pada media PDA yang telah dipadatkan pada cawan petri.

a

a

68

Pada pengamatan ini dapat ditemukan bahwa jamur membentuk hifa

yang berupa miselium. Seperti yang ditunjuk pada panah, jamur ini

berwarna kuning yang menunjukkan banyaknya pertumbuhan konidia

yang dihasilkan.

5.2 Uji Karakteristik Klebsiella pneumoniae

Gambar 5.3 Tampilan koloni K. pneumoniae pada media Mac Conkey Agar

(Kiri) dan Hasil uji mikroskopis K. pneumoniae (Kanan).

Uji karakteristik pada Klebsiella pneumoniae juga dilakukan

secara makroskopis dan mikroskopis. Pada uji makroskopis koloni

bakteri ditanam pada media Mac Conkey Agar (MCA), pada media ini

menunjukkan bahwa koloni Klebsiella pneumoniae memiliki bentuk

bulat dengan elevansi cembung, berwarna merah muda dan

berkonsistensi mucoid.

Pengamatan secara mikroskopis, bakteri harus diberikan

pewarnaan gram terlebih dahulu sebelum diamati di mikroskop. Dalam

uji pewarnaan gram diperoleh hasil bakteri yang berbentuk basil dan

berwarna merah. Hal tersebut menunjukkan bahwa Klebsiella

pneumoniae merupakan bakteri gram negatif.

69

Sedangkan pada uji biokimia didapatkan hasil seperti pada tabel

dibawah ini :

No Uji Biokimia Hasil

1. TSIA Glukosa + (Positif)

H2S – (Negatif)

2. Indole - (Negatif)

4. VP + (Positif)

5. Sitrat + (Positif)

6. Urease + (Positif)

Tabel 5.1 Hasil uji biokimia Klebsiella pneumoniae

5.3 Uji Kurva Pertumbuhan Aspergillus oryzae

Gambar 5.4 Hasil uji kurva pertumbuhan jamur Aspergillus oryzae

Hasil uji kurva pertumbuhan dapat dilihat pada grafik diatas.

Dari grafik tersebut menunjukkan bahwa fase stasioner jamur ada di jam

ke 35 atau dihari ke 3.

0

15

20

35

40

5560

7580

951000

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0 20 40 60 80 100 120

Op

tica

l De

nsi

ty

Jam Pertumbuhan

OD Pertumbuhan Jamur

70

5.4 Uji Kadar Hambat Minimum

Gambar 5.5 Hasil Uji Kadar Hambat Minimum (KHM)

Pada uji KHM yang dilakukan dengan menggunakan Microplate

v button menunjukkan bahwa semua kelompok sampel memiliki titik

pada dasar microplate. Hal ini menunjukkan bahwa jamur tidak

memiliki kemampuan untuk menghambat bakteri Klebsiella

pneumoniae.

5.5 Uji Kadar Bunuh Minimum

Uji Kadar Bunuh Minimum merupakan konsentrasi terendah

yang mampu membunuh 99% atau 100% bakteri. Uji ini dilakukan

setelah mendapatkan hasil dari Uji Kadar Hambat Minimum. Dan

dikarenakan pada uji KHM menyatakan bahwa jamur ini tidak memiliki

KHM, maka penulis tidak melakukan uji KBM.

5.6 Uji Pertumbuhan Biofilm Klebsiella pneumoniae

0.197

0.6260.752

1.287

0

0.5

1

1.5

Kekuatan Biofilm

km 24 48 72

71

Gambar 5.6 Hasil uji pertumbuhan biofilm Klebsiella pneumoniae

Uji pertumbuhan biofilm digunakan campuran PDB dan TSB +

glukosa 5% sebagai kontrol negatif. Pada uji ini dilakukan dengan

pengukuran OD pada jam ke 24, 48, dan 72. Selanjutnya dipilih jam

pertumbuhan biofilm dengan nilai OD yang paling tinggi. Untuk

menentukan kekuatan biofilm dapat diukur dengan membandingkan

nilai ODcut dengan nilai ODsuspensi. Diketahui nilai ODsuspensi sebesar

1.287 dan untuk mencari nilai ODcut dapat dicari dengan memasukkan

nilai OD pada rumus ODcut = ODkontrol negatif + 3(standar deviasi ODkontrol

negatif).

ODcut = 0.197+ 3(0.038)

= 0.197+ 0.114

= 0.331

Setelah itu dapat disimpulkan bahwa uji pertumbuhan biofilm memenuhi

persamaan 4x ODcut ≤ ODsuspense hal ini berarti Klebsiella pneumoniae merupakan

bakteri yang mampu membentuk biofilm yang kuat.

5.7 Presentase Aktivitas Antibiofilm Aspergillus oryzae

29

87

51

14.7

77

4741.5

70

31.4

0

65.3

24

0

65

28.725.7

70.4

25.9

0

20

40

60

80

100

Aktivitas Antibiofilm

k+ 100% 50% 25% 12.50% 6.25%

72

Gambar 5.7 Presentase aktivitas antibiofilm Aspergillus oryzae terhadap

biofilm Klebsiella pneumoniae. Dari kiri pencegahan perlekatan,

penghambatan pembentukan dan penghancuran biofilm.

Dari hasil ketiga uji didapatkan masing – masing presentase

besarnya aktivitas antibiofilm pada konsentrasi 100%, 50%, 25.5%,

12.5%, 6.25% dan kontrol positif seperti yang tertera di grafik tersebut.

Untuk menentukan besarnya aktivitas antibiofilm diperlukan nilai OD

kontrol negatif dan OD kelima konsentrasi. Selanjutnya nilai OD

dimasukkan pada rumus :

ODkontrol negatif − ODkonsentrasi

ODkontrol negatif! X 100%

5.7.1 Uji Pencegahan Perlekatan Biofilm Klebsiella pneumonia

Hasil perbandingan nilai OD kelompok uji, kontrol negatif,

kontrol media, dan kontrol positif pada uji aktivitas antibiofilm

Aspergilus oryzae terhadap pencegahan perlekatan biofilm Klebsiella

pneumoniae sebagai berikut.

Gambar 5.8 Hasil uji pencegahan perlekatan biofilm Klebsiella pneumoniae

0.194 0.192

0.232

0.159

0.294

0.337

0.202

0.272

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

km k+ 100% 50% 25% 12.50% 6.25% k-

Optical Density

±0.018±0.042 ±0.022

±0.032

±0.05

±0.095

±0.008

±0.066

73


pneumonia



Aspergilus oryzae terhadap penghambatan pembentukan biofilm

Klebsiella pneumoniae sebagai berikut.

Gambar 5.9 Hasil uji penghambatan pembentukan biofilm Klebsiella

pneumoniae

5.7.3 Uji Penghancuran Biofilm Klebsiella pneumoniae



Aspergilus oryzae terhadap penghancuran biofilm Klebsiella

pneumoniae sebagai berikut.

0.153 0.1650.295

0.3740.446 0.448

0.38

1.287

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

km k+ 100% 50% 25% 12.50% 6.25% k-

Optical Density

0.033 0.001

0.0660.048

0.054 0.0720.072

0.113

74

Gambar 5.10 Hasil uji penghancuran biofilm Klebsiella pneumoniae

5.8 Hasil Analisis Data

5.8.1 Uji Pencegahan Perlekatan Biofilm Klebsiella pneumoniae

5.8.1.1 Uji Normalitas

Uji normalitas pada penelitian ini menggunakan uji normalitas

Shapiro-wilk. Hal ini dikarenakan jumlah sampel kurang dari 50. Data

dianggap normal ketika nilai p-value (sig) > 0.05. Uji normalitas

digunakan untuk menentukan analisis statistik yang akan digunakan.

Data dengan distribusi normal dapat dianalisis dengan uji parametrik

dan data dengan distribusi yang tidak normal dapat dilakukan dengan

analisis non-parametrik.

Dari hasil uji normalitas yang tertera pada lampiran 7

menunjukkan bahwa nilai signifikan > 0.05. Hal ini dapat disimpulkan

bahwa data terdistribusi normal.

0.119

0.3050.335

0.4340.481

0.451 0.469

0.633

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

km k+ 100% 50% 25% 12.50% 6.25% k-

Optical Density

0.024

0.0090.01

0.0650.051 0.086

0.009

0.132

75

5.8.1.2 Uji Homogenitas

Uji homogenitas pada penelitian ini menggunakan uji

homogenitas Lavene. Hal ini dikarenakan jumlah sampel kurang dari

50. Data dianggap homogen ketika nilai p-value (sig) > 0.05. Uji

homogenitas juga digunakan untuk menentukan analisis statistik yang

akan digunakan. Data yang homogen dapat dianalisis dengan uji

parametrik dan data yang tidak homogen dilakukan dengan analisis non-

parametrik.

Dari hasil uji homogenitas menunjukkan bahwa nilai signifikan

< 0.05. Hal ini dapat disimpulkan bahwa data tidak homogen. Oleh

karena itu perlu dilakukan transformasi data terlebih dahulu.

5.8.1.3 Uji One Way Anova

Uji One Way Anova merupakan uji analisis parametrik yang

digunakan untuk mengetahui adanya perbedaan data secara signifikan.

Nilai p-value (sig) < 0.05 menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang

signifikan, sedangkan p-value (sig) > 0.05 menunjukkan bahwa data

tidak memiliki perbedaan yang signifikan.

Dari hasil uji yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa data

memiliki perbedaan secara signifikan. Hal ini ditunjukkan dengan nilai

sig sebesar 0.006 (p-value < 0.05 ).

5.8.1.4 Uji Post Hoc Tukey

Uji Post Hoc Tukey digunakan untuk mengetahui perbedaan

masing masing kelompok data satu dengan yang lain. Nilai p-value (sig)

< 0.05 menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan,

76

sedangkan p-value (sig) > 0.05 menunjukkan bahwa data tidak memiliki

perbedaan yang signifikan.

K+ K- 100% 50% 25% 12.5

%

6.25

%

KM

K+ .597 .944 .976 .326 .032 1.000 1.000

K- .597 .994 .162 1.000 .605 .821 .704

100% .944 .994 .475 .909 .232 .995 .978

50% .976 .162 .475 .068 .005 .865 .940

25% .326 1.000 .909 .068 .869 .541 .417

12.5% .032 .605 .232 .005 .869 .069 .046

6.25% 1.000 .821 .995 .865 .541 .069 1.000

KM 1.000 .704 .978 .940 .417 .046 1.000

Tabel 5.2 Hasil uji Post Hoc Tukey pada aktivitas pencegahan

perlekatan biofilm klebsiella pneumonia


memiliki perbedaan secara signifikan antar kelompok. Hal ini

ditunjukkan dengan nilai p-value (sig) < 0.05. Terdapat perbedaan yang

signifikan pada konsentrasi 12.5% terhadap kontrol positif dan kontrol

media.

5.8.1.5 Uji Korelasi Pearson

Uji korelasi memiliki tujuan untuk mengukur derajat hubungan

antar variabel, arah hubungan antar konsentrasi dan besar nilai OD

(Optical Density). Nilai p-value (sig) < 0.05 menunjukkan bahwa data

memiliki korelasi bermakna secara statistik, sedangkan p-value (sig) >

77

0.05 menunjukkan bahwa data tidak memiliki korelasi yang bermakna

secara statistik. Untuk menentukan derajat hubungan uji korelasi dapat

dikelompokan Sarwono (2006) sebagai berikut :

0 : Tidak ada korelasi antara dua variabel

>0 – 0,25: Korelasi sangat lemah

>0,25 – 0,5: Korelasi cukup

>0,5 – 0,75: Korelasi kuat

>0,75 – 0,99: Korelasi sangat kuat

1: Korelasi sempurna

Kekuatan dan arah hubungan dapat berupa hasil yang positif atau

negatif. Korelasi positif yang berarti memiliki arah yang sama atau

berbanding lurus dengan variabel dan korelasi negatif memiliki arah

yang berlawanan atau berbanding terbalik antar variabel.

Dari hasil uji korelasi dapat diambil kesimpulan bahwa

hubungan korelasi antar konsentrasi dengan OD memiliki korelasi yang

tidak signifikan karena nilai p > 0.05. Nilai Pearson correlation = 0.244

menunjukkan bahwa antar konsentrasi dengan OD memiliki derajat

korelasi yang sangat lemah. Arah korelasi bertanda positif yang

menunjukkan semakin besar nilai tingkat konsentrasi CFS maka

semakin besar pula nilai OD-nya.


pneumoniae


78








Dari hasil yang tertera pada tabel menunjukkan bahwa nilai

signifikan > 0.05. Hal ini dapat disimpulkan bahwa data terdistribusi

normal.











parametrik.

Dari hasil uji homogenitas yang tertera pada lampiran 8


bahwa data homogen.

79

5.8.2.3 Uji One-way ANOVA

Uji One Way Anova merupakan uji analisis parametrik yang



signifikan, sedangkan p-value (sig) > 0.05 menunjukkan bahwa data

tidak memiliki perbedaan yang signifikan.


memiliki perbedaan secara signifikan. Hal ini ditunjukkan dengan nilai

sig sebesar 0.00 (p-value < 0.05 ).

5.8.2.4 Uji Post-hoc Tukey

Uji post-hoc tukey digunakan untuk mengetahui perbedaan





K+ K- 100% 50% 25% 12.5

%

6.25

%

KM

K+ .000 .502 .076 .009 .008 .063 1.000

K- .000 .000 .000 .000 .000 .000 .000

100% .502 .000 .913 .326 .315 .875 .405

50% .076 .000 .913 .941 .934 1.000 .055

25% .009 .000 .326 .941 1.000 .964 .006

12.5% .008 .000 .315 .934 1.000 .959 .006

6.25% .063 .000 .875 1.000 .964 .959 .045

80

KM 1.000 .000 .405 .055 .006 .006 .045

Tabel 5.3 Hasil uji Post-Hoc Tukey pada aktivitas penghambatan

pembentukan biofilm Klebsiella pneumoniae

Pada tabel hasil uji post-hoc diatas menunjukkan bahwa terdapat

perbedaan nilai yang signifikan pada ke lima kelompok konsentrasi

(100%, 50%, 25%, 12.5%, dan 6.25%), kelompok kontrol media dan

kelompok kontrol positif terhadap kelompok kontrol negatif. Pada

kontrol positif terdapat perbedaan nilai yang signifikan pada kontrol

negatif, konsentrasi 25% dan konsentrasi 12.5%. Pada kontrol media

juga ditemukan adanya terdapat perbedaan nilai yang signifikan

terhadap konsentrasi 25%, 12.5%, dan 6.25%.

5.8.2.5 Uji Korelasi



tidak signifikan karena nilai p > 0.05. Nilai pearson correlation = 0.413

menunjukkan bahwa antar konsentrasi dengan OD memiliki derajat

korelasi yang cukup. Arah korelasi bertanda positif yang menunjukkan

semakin besar nilai tingkat konsentrasi CFS maka semakin besar pula

nilai OD-nya.

5.8.3 Uji Penghancuran Biofilm Klebsiella pneumoniae






81














parametrik.

Dari hasil uji homogenitas menunjukkan bahwa nilai

signifikansi < 0.05. Hal ini dapat disimpulkan bahwa data tidak

homogen. Sehingga harus dilakukan transformasi data terlebih dahulu.

Ketika data sudah memenuhi syarat parametrik, kemudian dilanjutkan

dengan uji ANOVA.

5.8.3.3 Uji One Way ANOVA

Uji One Way ANOVA merupakan uji analisis parametrik yang



82

signifikan, sedangkan p-value (sig) < 0.05 menunjukkan bahwa data

memiliki perbedaan yang signifikan.

Pada uji ini menyatakan bahwa terdapat perbedaan yang

signifikan. Hal ini ditunjukkan dengan nilai p-value < 0.05

5.8.3.4 Uji Post-Hoc Tukkey

Uji post-hoc tukey digunakan untuk mengetahui perbedaan





K+ K- 100% 50% 25% 12.5

%

6.25

%

KM

K+ .002 .999 .349 .099 .239 .131 .006

K- .002 .005 .124 .415 .192 .335 .000

100% .999 .005 .681 .263 .527 .332 .002

50% .349 .124 .681 .992 1.000 .998 .000

25% .099 .415 .263 .992 .999 1.000 .000

12.5% .239 .192 .527 1.000 .999 1.000 .000

6.25% .131 .335 .332 .998 1.000 1.000 .000

KM .006 .000 .002 .000 .000 .000 .000

Tabel 5.4 Hasil uji Post-Hoc Tukey pada aktivitas penghancuran biofilm

Klebsiella pneumoniae

83

Pada tabel hasi uji post hoc ini menunjukkan bahwa terdapat

perbedaan nilai yang signifikan pada kelompok kontrol negatif terhadap

kontrol positif, kontrol media dan konsentrasi 100%. Tidak hanya itu

kontrol media juga memiliki perbedaan nilai yang signifikan terhadap

kontrol positif, kontrol negatif dan semua konsentrasi.

5.8.3.5 Uji Korelasi



signifikan karena nilai p < 0.05. Nilai correlation = 0.553 menunjukkan

bahwa antar konsentrasi dengan OD memiliki derajat korelasi yang

sangat kuat. Arah korelasi bertanda positif yang menunjukkan semakin

besar nilai tingkat konsentrasi CFS maka semakin besar pula nilai OD-

nya.

84

BAB VI

PEMBAHASAN

6.1 Identifikasi Karakteristik Aspergillus oryzae dan Klebsiella

pneumoniae

Identifikasi jamur dan bakteri sangat diperlukan sebelum

melakukan penelitian. Jamur yang digunakan dalam penelitian ini

adalah jamur yang berspesies Aspergillus oryzae. Hal tersebut

ditunjukkan dari hasil uji makroskopis dan mikroskopis yang telah

disesuaikan dengan ciri ciri Aspergillus oryzae yang disebutkan oleh

Chang P et al., (2014) dan Ade FY (2013). Bakteri yang digunakan

adalah Klebsiella pneumoniae. Pada pengamatan secara makroskopis

didapatkan koloni Klebsiella pneumoniae yang memiliki bentuk bulat

dengan elevansi cembung, berwarna merah muda dan berkonsistensi

mucoid. Sedangkan pada pengamatan secara mikroskopis diperoleh

hasil bakteri yang berbentuk basil dan berwarna merah yang

menunjukkan bahwa Klebsiella pneumoniae merupakan bakteri gram

negatif. Dan pada uji biokimia TSIA dihasilkan bahwa bakteri ini dapat

menghasilkan gula dan tidak ditemukan adanya H2S. Pada uji indole

menghasilkan warna kuning yang berarti negatif. Dan memberikan hasil

positif pada uji Voges Praskauer yang ditandai dengan warna merah.

Pada uji sitrat bakteri ini mengubah medium dari hijau menjadi biru

yang berarti bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya.

Pada uji urease Klebsiella pneumoniae menghasilkan warna merah

85

muda yang mengiterpretasikan hasil positif yang berarti bakteri mampu

menghasilkan enzim urease.

6.2 Pengukuran Kurva Aspergillus oryzae

Setelah sudah dilakukan uji identifikasi karakteristik bakteri dan

jamur. Langkah selanjutnya yaitu dilakukan pengukuran kurva jamur

untuk menentukan waktu inkubasi saat pembuatan inokulum jamur.

Pengukuran kurva dilakukan setiap 5 jam. Dikarenakan keterbatasan

waktu maka pengukuran dilakukan dua kali dalam sehari namun tetap

dalam rentang per lima jam. Pada jam pertama merupakan fase lag, yaitu

fase dimana jamur menyesuaikan dengan lingkungannya. Pada hari

kedua jamur mulai membelah secara aktif dan mulai memperbanyak diri

hal itu ditunjukkan dengan kurva yang semakin meningkat tajam. Di

hari ketiga kurva mulai mengalami penurunan perlahan yang dapat

dipastikan jamur berada pada fase stasioner. Dan fase selanjutnya adalah

fase kematian yang ditandai penurunan kurva pertumbuhan yang

semakin tajam.

6.3 Pembuatan Supernatan Aspergillus oryzae

Selanjutnya yaitu pembuatan supernatan jamur. Supernatan

Aspergillus oryzae dibuat melalui penyaringan inokulum jamur yang

telah diinkubasi selama 3 hari. Diinkubasi selama 3 hari karena

bertepatan dengan fase stasioner pertumbuhan jamur. Hal ini bertujuan

untuk mengambil senyawa metabolit sekunder yang ada pada fase

stasioner jamur. Pada fase ini ditandai dengan bentuk kurva yang mulai

86

mendatar dan selanjutnya akan semakin menurun pada fase kematian

(Gandjar, 2006).

Konsentrasi supernatan dibuat menggunakan metode

mikrodelusi dengan melakukan pengenceran bertingkat sampai

didapatkan seri konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, dan 6,25%.

Pemilihan konsentrasi ini didasarkan pada studi pendahuluan yang telah

dilakukan untuk menentukan besarnya konsentrasi yang akan digunakan

dalam penelitian. Digunakan kelima konsentrasi tersebut dikarenakan

pada konsentrasi terendah setelahnya supernatan tidak menunjukkan

adanya efek yang dihasilkan.

Pada kontrol media digunakan campuran PDB dan TSB yang

telah ditambahkan glukosa 2%. Perpaduan kedua media tersebut atas

dasar media PDB yang digunakan sebagai media jamur dan TSB sebagai

media Klebsiella pneumoniae. Pada kontrol negatif menggunakan

suspensi Klebsiella pneumoniae dan TSB sebagai media

pertumbuhannya. Dan untuk kontrol positif digunakan gentamisin

sebagai antibiotik.

6.4 Pembuatan Suspensi Klebsiella pneumoniae

Pada pembuatan suspensi bakteri diperlukan koloni bakteri

Klebsiella pneumoniae, media TSB dan larutan glukosa 5%. Media TSB

biasa digunakan sebagai media isolasi bakteri patogen, media ini

mengandung beberapa zat yang baik untuk pertumbuhan

mikroorganisme. TSB juga mengandung glukosa dengan konsentrasi

0,25% yang dapat mendukung pertumbuhan biofilm (Mladenovic et al.,,

87

2019). Hasil penelitian menyebutkan berbagai konsentrasi glukosa

dapat merangsang pembentukan biofilm pada Klebsiella pneumoniae

(Mladenovic et al.,, 2019). Pada penelitian ini digunakan penambahan

konsentrasi glukosa sebesar 5% merujuk pada penelitian yang dilakukan

oleh Aileen (2018). Penambahan konsentrasi glukosa 5% juga dilakukan

untuk menginduksi pembentukan biofilm Pseudomonas aeruginosa

(Wahyudi D & Silviani Y, 2015). Dengan penambahan konsentrasi

glukosa ini diharapkan dapat merangsang pembentukan biofilm yang

lebih besar. Setelah diinkubasi suspensi selanjutnya diukur dengan

Spectrofotometer untuk mendapatkan nilai OD sebesar 0.5 sesuai

dengan standar Mc Farland. Mc Farland 0,5 merupakan standar yang

paling sering digunakan untuk pengujian antimikroba di laboratorium

mikrobiologi klinik dalam kinerja media kultur (DALYNN Biological,

2014)

6.5 Uji KHM dan KBM

Aktivitas pembentukan biofilm dapat ditentukan melalui nilai

konsentrasi dibawah nilai KHM (Fitria dkk, 2018). Oleh karena itu

sebelum melakukan beberapa uji biofilm, peneliti melakukan uji kadar

hambat minimum terlebih dahulu. Pada hasil Uji KHM Aspergillus

oryzae terhadap Klebsiella pneumoniae menyatakan bahwa jamur ini

tidak memiliki efektivitas menghambat bakteri. Hal itu dikarenakan

senyawa antibiofilm menghambat pembentukan biofilm tanpa

menganggu proses pertumbuhan planktonik. Sehingga dapat dipastikan

bahwa bakteri masih dapat tumbuh dan membentuk biofilm.

88

Dikarenakan pada uji KHM menyatakan jamur ini tidak memiliki KHM,

maka penulis tidak melakukan uji KBM.

6.6 Uji Pertumbuhan Biofilm

Setelah memastikan bahwa bakteri masih dapat tumbuh dan

dapat membentuk biofilm, selanjutnya dilakukan uji pertumbuhan

biofilm. Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam

membentuk biofilm dan menilai kekuatan biofilm Klebsiella

pneumoniae. Pada uji ini dilakukan pengukuran pada jam ke- 24, 48 dan

72. Dengan hasil pada jam ke-24 rata – rata nilai OD biofilm sebesar

0.626, jam ke-48 dengan nilai OD 0.752 dan pada jam ke-72 didapatkan

nilai OD sebesar 1.287. Kemudian dipilih waktu yang menunjukkan

kemampuan pembentukan biofilm paling kuat. Dan hasil yang didapat

menunjukan bahwa pertumbuhan biofilm terbesar pada jam ke 72. Hal

ini bertujuan untuk mengamati efektivitas pemberian supernatan

Aspergillus oryzae pada biofilm Klebsiella pneumoniae paling kuat

sekalipun. Untuk menentukan kekuatan biofilm dapat diukur dengan

membandingkan nilai ODcut dengan nilai ODsuspensi lalu dimasukkan

dalam persamaan seperti yang ada pada tabel 4.1. Dan hasil dari uji

pertumbuhan biofilm ini memenuhi persamaan 4x ODcut ≤ ODsuspensi

yang berarti Klebsiella pneumoniae merupakan bakteri yang mampu

membentuk biofilm yang kuat. Seperti halnya hasil penelitian yang

dilakukan oleh Galdiero et al.,., (2020), menyatakan bahwa Klebsiella

pneumoniae merupakan bakteri pembentuk biofilm kuat.

89

Untuk mengetahui adanya biofilm maka diperlukan proses

pencucian dan pewarnaan. Proses pencucian dilakukan sebelum dan

sesudah pewarnaan dengan menggunakan cairan PBS dan juga aquades.

Pencucian sebelum pewarnaan dilakukan dengan tujuan menghilangkan

planktonik dan sel sel yang yang tidak menempel pada well-plate.

Pencucian ini dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan dengan larutan

PBS. Penggunaan PBS dipilih karena cairan ini bersifat isotonic dan

non-toxic sehingga mencegah sel bakteri pecah. PBS juga mengandung

sel sel air dan ion anorganik yang penting untuk metabolisme sel normal

sehingga biofilm tidak rusak (Rosdiana, 2016). Sedangkan pada

pencucian sesudah pewarnaan bertujuan untuk menghilangkan sel yang

terwarnai oleh kristal violet namun tidak menempel pada well-plate

(Azeredo,2016). Pencucian ini juga dilakukan sebanyak 3 kali

pengulangan dengan menggunakan cairan aquades. Penggunaan

aquades dipilih karena memiliki harga yang terjangkau, mudah didapat,

serta sangat efisien.

Penggunaan kristal violet sebagai pewarna sudah menjadi hal

yang umum dilakukan dalam pengujian biofilm. Hal itu dikarenakan

pewarna ini memiliki kemampuan mengikat komponen seluler bakteri

melalui interaksi ionic (Coffey & Anderson, 2014). Pengikatan ini

terjadi pada permukaan molekul yang bermuatan negative non spesifik

seperti polisakarida dan eDNA dalam matriks seluler (Shukla & Rao,

2017). Kristal violet akan menempel pada komponen penyusun matriks

biofilm serta mewarnai sel yang hidup dan sel yang mati, sehingga

90

pewarna ini sangat cocok untuk mewarnai biomassa biofilm (Azeredo,

2016). Seperti halnya pada penelitian yang telah dilakukan Kining et al.,

(2016), pada penelitian ini juga dilakukan pewarnaan menggunakan

kristal violet dengan konsentrasi 0,1% dan didiamkan selama 15 menit.

Sebelum pembacaan nilai OD dengan Microplate reader, penggunaan

asam asetat 30% bertujuan untuk melarutkan biofilm yang terwarnai

kristal violet sebelum dilakukan pembacaan dengan Microplate reader.

Penggunaan asam asetat sebagai zat pelarut juga dilakukan pada

penelitian Paula-Ramos (2016) dan zaba (2016).

6.7 Uji Aktivitas Antibiofilm Aspergillus oryzae terhadap Klebsiella

pneumoniae

Selanjutnya dilakukan pengujian terhadap tiga aktivitas

antibiofilm yaitu uji pencegahan perlekatan, uji penghambatan

pembentukan biofilm, dan uji penghancuran biofilm. Pembentukan

biofilm terdiri dari beberapa tahap yaitu perlekatan pada permukaan,

pembentukan mikro-koloni, maturasi dan dispersi (Jamal et al.,, 2015).

Hal yang berperan penting dalam pembentukan biofilm adalah Quorum

Sensing (QS). Autoinduser memiliki peran penting dalam komunikasi

antar sel (quorum sensing). Bakteri gram negatif menggunakan asil-

homoserin lakton (AHL) sebagai autoinduser. Sedangkan bakteri gram

positif menggunakan autoinduser autoinducing peptides (AIP). Dan

autoinduser-2 (AI-2) ada pada kedua gram (Liu et al.,., 2012 ; Du et al.,.,

2014 ; Brackman dan Coenye, 2015 ).

91

Menurut Tamano et al.,., (2015), Aspergillus oryzae memiliki

kandungan asam lemak, antara lain asam palmitate, asam strearat, asam

oleic, dan asam linoleic. Asam lemak ini dapat dijadikan sebagai

antibiofilm dengan menghambat proses adhesi, fimbriae, EPS,

pembentukan dan maturasi biofilm (Kumar P et al.,., 2020). Asam

linoleic dapat menurunkan biofilm Klebsiella pneumoniae sebesar 80%

pada dosis 31-84 μg / ml (Ramanathan et al.,, 2017). Asam palmitate

yang di kultur pada Vibrio spp dapat menurunkan regulasi QS pada luxS

dan luxR, menghambat produksi EPS dan menganggu pembentukan

biofilm. S-ribosylhomocysteine lyase (LuxS) dapat mensintesiskan

Autoinduser tipe 2 (AI-2) sebagai autoinduser pada bakteri gram positif

dan negatif (Schauder et al.,., 2001). Asam palmitate diketahui tidak

menganggu pertumbuhan planktonik, namun dapat mengacaukan proses

adhesi patogen (Santhakumari S et al.,, 2017). Hal itu menyebabkan

adanya perbedaan pengaruh aktivitas antibiofilm dan kadar hambat

minimum. Aspergillus oryzae juga mengandung enzim ekstraseluler

seperti β-glukosidase yang dapat mensintesis senyawa fenolik

(Sa’nchez, 2009). Senyawa ini juga dapat berperan sebagai Inhibitor

Quorum sensing (IQS) (Damayanti, 2017).

Pada uji pencegahan perlekatan, dihasilkan data presentase yang

tercantum pada gambar 5.7. Hasil paling tinggi terletak pada konsentrasi

50% dengan presentase 41,5% dan hasil terendah pada konsentrasi 25%

dan 12,5% dengan presentase 0%. Kemudian pada uji aktivitas

penghambatan didapatkan hasil seperti yang ada pada gambar 5.7. Pada

92

gambar ini menunjukkan kontrol positif memiliki aktivitas

penghambatan pembentukan biofilm tertinggi dengan presentase

sebesar 87% dan konsentrasi terendah pada konsentrasi 12,5% dengan

presentase sebesar 65%. Dan hasil uji penghancuran biofilm juga pada

gambar 5.7 yang menyatakan bahwa konsentrasi tertinggi pada kontrol

positif dengan presentase 51% dan konsentrasi 25% menunjukkan

konsentrasi paling rendah dengan nilai presentase sebesar 24%.

6.8 Analisis Data

6.8.1 Analisis Data Uji Aktivitas Pencegahan Perlekatan Biofilm

Analisis data yang digunakan pada penelitian ini yaitu dengan

aplikasi IBM SPSS Stastistic. Analisis pertama yaitu menentukan jenis

analisis statistik data termasuk parametrik atau non parametrik dengan

uji normalitas dan homogenitas. Pada uji pencegahan perlekatan

menunjukkan bahwa data terdistribusi normal dan tidak homogen. Oleh

karena itu diperlukan transformasi data untuk mengubah skala

pengukuran data asli menjadi bentuk lain yang memenuhi asumsi

analisis ragam. Setelah data homogen kemudian dilanjutkkan dengan uji

One Way ANOVA. Dari hasil uji ini menunjukkan terdapat perbedaan

signifikan yang ditandai dengan nilai p-value < 0.05. Kemudian

dilanjutkan dengan uji Post Hoc Tukey. Dari hasil uji yang dilakukan

dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan pada

konsentrasi 12.5% terhadap kontrol positif dan kontrol media. Dan yang

terakhir dilakukan uji korelasi dengan Pearson. Dari hasil uji korelasi

menunjukkan korelasi antar konsentrasi dengan OD memiliki korelasi

93

yang tidak signifikan karena nilai p > 0.05. Hal ini dapat disebabkan

oleh faktor adhesi yaitu hidrofobisitas planktonik terhadap permukaan

well-plate yang terbuat dari polystyrene (Berlanga et al,. 2018).

Hidrofobisitas yang tinggi dapat meningkatkan kemampuan molekul

untuk melekat pada polystyrene. Sedangkan dalam pengukuran OD

hanya berpacu pada tingkat kekeruhan suspensi tanpa mengetahui

penyebab kekeruhan. Dengan demikian dimungkinkan dapat

menganggu proses pengukuran OD (Optical Density) biofilm. Nilai

Pearson correlation = 0.244 menunjukkan bahwa antar konsentrasi

dengan OD memiliki derajat korelasi yang cukup. Arah korelasi

bertanda positif yang menunjukkan semakin besar nilai tingkat

konsentrasi CFS maka semakin besar pula nilai OD-nya.

6.8.2 Analisis Data Uji Aktivitas Penghambatan Pembentukan

Biofilm

Hasil analisis uji penghambatan pembentukan biofilm

menunjukan bahwa data terdistribusi normal dengan nilai p-value >

0.05. Dan uji homogenitas menunjukan data bersifat homogen dengan

nilai p-value > 0.05. Setelah memenuhi syarat parametrik maka

dilanjutkan dengan analisis menggunakan uji oneway ANOVA. Pada uji

oneway ANOVA menunjukkkan nilai p-value < 0.05 yang berarti data

memiliki perbedaan yang signifikan. Kemudian dilanjutkan dengan uji

Post-Hoc Tukey. Dari uji ini terdapat perbedaan nilai yang signifikan

pada ke lima kelompok konsentrasi (100%, 50%, 25%, 12.5%, dan

6.25%), kelompok kontrol media dan kelompok kontrol positif terhadap

94

kelompok kontrol negatif. Pada kontrol positif terdapat perbedaan nilai

yang signifikan pada kontrol negatif, konsentrasi 25% dan konsentrasi

12.5%. Pada kontrol media juga ditemukan adanya terdapat perbedaan

nilai yang signifikan terhadap konsentrasi 25%, 12.5%, dan 6.25%. Dan

kemudian dilanjutkan dengan uji korelasi pearson untuk mengetahui

tingkat kekuatan hubungan dan arah hubungan. Hasil uji korelasi

menunjukkan tidak adanya hubungan korelasi antar konsentrasi dengan

OD karena nilai p > 0.05. Hasil serupa juga terjadi pada penelitian yang

dilakukan Khotimah (2020), menunjukkan tidak adanya hubungan

korelasi antara tingkat konsentrasi dengan nilai OD pada uji

penghambatan aktivitas antibiofilm ekstrak daun mulberi hitam (Morus

nigra L.) terhadap biofilm Klebsiella pneumoniae. Hal ini dapat

dipengaruhi oleh beberapa faktor. Salah satunya dimungkinkan karena

pengunaan Spectrofotometer dalam pengukuran OD yang tidak melihat

penyebab dari kekeruhan. Hasil tersebut juga dimungkinkan

dipengaruhi oleh permeabilitas membran luar Klebsiella pneumoniae.

Membran luar bakteri negatif yang kaya akan molekul lipopolisakarida

memiliki fungsi sebagai penghalang permeabilitas yang hanya dapat

dilewati oleh molekul hidrofilik ukuran kecil (Witkowska et al, 2013).

Sehingga konsentrasi yang kecil dapat berpenetrasi dengan baik ke

dalam bakteri. Selain itu membran luar juga membatasi laju molekul

antimikroba tertentu. Bakteri ini memiliki pompa resisten multi-obat

untuk menyeleksi senyawa antimikroba melewati penghalang membran.

Hal tersebut yang membuat bakteri gram negatif lebih resisten terhadap

95

antimikroba (Lambert, 2002 & Ramli et al., 2017). Nilai pearson

correlation = 0.413 menunjukkan bahwa antar konsentrasi dengan OD

memiliki derajat korelasi yang cukup. Arah korelasi bertanda positif

yang menunjukkan semakin besar nilai tingkat konsentrasi CFS maka

semakin besar pula nilai OD-nya.

6.8.3 Analisis Data Aktivitas Penghancuran Biofilm

Hasil analisis uji penghancuran biofilm menunjukan bahwa data

terdistribusi normal dengan nilai p-value > 0.05. Dan uji homogenitas

menunjukan data tidak homogen dengan nilai p-value < 0.05. Oleh

karena itu diperlukan transformasi data untuk mengubah skala

pengukuran data asli menjadi bentuk lain yang memenuhi asumsi

analisis ragam. Setelah data homogen kemudian dilanjutkkan dengan uji

One Way ANOVA. Dari hasil uji ini menunjukkan terdapat perbedaan

signifikan yang ditandai dengan nilai p-value < 0.05. Selanjutnya

dilakukan uji Post-Hoc Tukey. Dari hasil analisis ini menunjukkan

terdapat perbedaan nilai yang signifikan pada kelompok kontrol negatif

terhadap kontrol positif, kontrol media dan konsentrasi 100%. Tidak

hanya itu kontrol media juga memiliki perbedaan nilai yang signifikan

terhadap kontrol positif, kontrol negatif dan semua konsentrasi. Dan

yang terakhir dilakukan uji korelasi pearson untuk mengetahui tingkat

kekuatan hubungan dan arah hubungan Dari hasil uji korelasi

menunjukkan adanya hubungan korelasi antar konsentrasi dengan OD

memiliki korelasi yang signifikan karena nilai p < 0.05. Nilai pearson

correlation = 0.553 menunjukkan bahwa antar konsentrasi dengan OD

96

memiliki derajat korelasi yang sangat kuat. Arah korelasi bertanda

positif yang menunjukkan semakin besar nilai tingkat konsentrasi CFS

maka semakin besar pula nilai OD-nya.

Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa

Aspergillus oryzae memiliki aktivitas antibiofilm terhadap bakteri

Klebsiella pneumoniae dalam mencegah perlekatan, pembentukan dan

penghancuran biofilm. Oleh karena itu diharapkan dengan adanya

peningkatan pengembangan penelitian Aspergillus oryzae dapat

dijadikan sebagai antibiotik alami yang dapat membunuh bakteri dengan

baik seperti antibiotik kimia. Sehingga Aspergillus oryzae dapat

dijadikan sebagai antibiofilm alternative untuk mengurangi tingkat

resistensi penggunaan antibiotik kimia.

Pada penelitian ini terdapat beberapa keterbatasan yaitu

identifikasi kandungan Aspergillus oryzae secara spesifik. Oleh karena

itu penulis berharap pada penelitian selanjutnya dapat menguraikan

kandungan spesifik Aspergillus oryzae. Penulis juga berharap penelitian

ini dapat memberikan dorongan kepada peneliti lainnya untuk

meningkatkan minat dalam melakukan penelitian dengan

memanfaatkan kekayaan alam di Indonesia khususnya jamur

Aspergillus oryzae. Peneliti juga berharap masyarakat mengetahui

bahwa jamur dapat memberikan manfaat jika dikelola dengan tepat.

6.9 Integrasi Menurut Al-qur’an dan Hadist

Sebagai manusia diharapkan dapat mensyukuri atas nikmat yang

telah diberikan dan dapat memanfaatkan kekayaan alam dengan

97

sebaiknya. Semua itu merupakan salah satu bukti kebesaran dan kasih

sayang Allah yang menciptakan alam semesta beserta isinya

sebagaimana Allah menciptakan tumbuhan dengan berbagai manfaat

yang terkandung didalamnya. Pernyataan ini sesuai dengan firman Allah

dalam surat Thahaa ayat 53 yang berbunyi :

ماء ماء فأخرجنا به أزواجا الذي جعل لكم الأرض مهدا وسلك لكم فيها سبلا وأنزل من الس

من نبات شتى

Artinya : “(Allah SWT) yang telah menjadikan bagimu bumi

sebagai hamparan dan yang telah menjadikan bagimu di bumi itu jalan-

jalan, dan menurunkan dari langit air hujan. Maka Kami tumbuhkan

dengan air hujan itu berjenis-jenis dari tumbuh-tumbuhan yang

bermacam-macam”.

Berdasarkan ayat tersebut dapat diketahui banyaknya jenis

tanaman yang dapat diambil manfaatnya khususnya di Indonesia.

Banyaknya tanaman yang tumbuh berpotensi tinggi dalam pemanfaatan

bahan alam sebagai obat tradisional dan salah satunya adalah

Aspergillus oryzae. Peneliti juga percaya bahwa setiap penyakit selalu

ada obatnya. Hal itu sesuai dengan hadis yang diriwayatkan oleh Abu

Daud (An-Najjar, 2006) yang berbunyi : “Sesungguhnya Allah

menurunkan penyakit beserta obatnya, dan menciptakan obat untuk

setiap penyakit, maka berobatlah kalian namun jangan berobat dengan

yang haram”. Hadis tersebut memberikan dorongan untuk terus

berusaha mencari obat dengan memanfaatkan bahan alam yang

berpotensi sebagai obat seperti Aspergillus oryzae. Tidak hanya itu,

98

Allah juga menjanjikan surga bagi orang yang bersungguh – sungguh

dalam mencari ilmu (HR. Muslim, no. 2699). Oleh karenanya peneliti

semakin bersemangat dalam meningkatkan ilmu pengetahuannya guna

mencari ridho dari Allah SWT.

99

BAB VII

KESIMPULAN DAN SARAN

7.1 Kesimpulan

1. Aspergillus oryzae memiliki aktivitas pencegahan perlekatan

terhadap biofilm Klebsiella pneumoniae dengan presentase aktivitas

tertinggi pada konsentrasi 50 % sebesar 41,5%.

2. Aspergillus oryzae memiliki aktivitas terhadap penghambatan

pembentukan biofilm Klebsiella pneumoniae dengan presentase

aktivitas tertinggi pada konsentrasi 100 % sebesar 77 %.

3. Aspergillus oryzae memiliki aktivitas terhadap penghancuran

biofilm Klebsiella pneumoniae dengan presentase aktivitas tertinggi

pada konsentrasi 100 % sebesar 47%.

4. Aspergillus oryzae tidak memiliki Kadar Hambat Minimum (KHM)

dan Kadar Bunuh Minimum (KBM) terhadap Klebsiella pneumoniae.

7.2 Saran

1. Perlu dilakukan penelitian perihal kandungan Aspergillus oryzae

yang lebih spesifik.

2. Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk menentukan besarnya

dosis yang mampu menghambat aktivitas biofilm dengan efektif.

100

DAFTAR PUSTAKA

Abidah, Hafshah Yasmina 2020. Uji aktivitas antibiofilm ekstrak daun

murbei hitam (Morus nigra L.)terhadap biofilm Escherichia coli.

Undergraduate thesis, Universitas Islam Negeri Maulana Malik

Ibrahim.

Ade FY. 2013. Isolasi Dan Identifikasi Jamur-Jamur Pendegradasi

Amilosa Pada Empelur Tanaman Sagu (Metroxylon sagu

Rottb.). Jurnal Ilmiah Edu Research Vol.2 No.1 Juni 2013

Aileen Prisca Suciadi, 021511133113 (2018) deteksi protein biofilm

candida albicans yang diinduksi glukosa, laktosa, protein

kedelai, dan zat besi serta analisis densitas protein. Skripsi thesis,

Universitas Airlangga.

Al-Baer, Ali saadi and Hussein, Asmaa A. 2017. Isolation and

Identification of Escherichia coli Producing Cytosine

Deaminase from Iraqi patients, Int. J. Adv. Res. Biol. Sci, 4(11):

1-6.

Anderson, K.F., Patel, J.B. & Wong, B., 2009. Characterization of

Enterobacteriaceae with a false positive modified Hodge test,

Abstracts of the Forty-ninthInter science Conference on

Antimicrobial Agents and Chemotherapy. AmericanSociety for

Microbiology, pp.719-41.Beesley, T., Gascoyne, N. &

KnottHunziker, V., 1983. The Inhibition of class C ß-lactamases

by boronic acids. Biochem J , 209, pp.229-33.

Ayuningtyas, F. 2016. Identifikasi Klebsiella pneumoniae sebagai

penyebab pneumonia.

Azeredo, J., Azevedo, N.F., Briandet, R., Cerca, N., Coenye, T., Costa,

A.R., Desvaux, M., Bonaventura, G.D., Hebraud, M., Jaglic, Z.,

Kacanovia, M., Knochel, S., Lourenco, A., Mergulhao, F.,

Meyer, R.L, Nuchas, G., Simoes, M., Tresse, O., Sternberg, C.,

2016. Critical Review on Biofilm Methods. Critical Reviews in

Microbiology., 43 (3), 313-351.

Baban, Soza. 2017. Prevalence and Antimicrobial Susceptibility of

Extended Spectrum Beta-Lactamase-Producing Klebsiella

pneumoniae isolated from Urinary Tract Infection.

Balestrino D, Haagensen JAJ, Rich C, Forestier C. 2005.

Characterization of type 2 quorum sensing in Klebsiella

pneumoniae and relationship with biofilm formation. J

Bacteriol. 187:2870–2880.

Balouiri, M. 2016. Methods for in Vitro Evaluating Antimicrobial

Activity: A Review. Elsevier. Journal of Pharmaceutical

Analysis (6): 71-79.

Barriuso, J., Hogan, D. A., Keshavarz, T., & Martínez, M. J. (2018).

Role of quorum sensing and chemical communication in fungal

biotechnology and pathogenesis. FEMS microbiology reviews,

42(5), 627–638.

Berlanga, M., Domenech, O., Guerrero, R., 2014, Biofilm Formation on

polystyrene in detached vs planktonik cells of

101

polyhydroxyalkanoate accumulating Halomonas venusta,

International Microbiology, 17(4), 205-212

Bhatia, Y., Mishra, S. and Bisaria, V.S. (2002) Microbial beta-

glucosidases: Cloning, properties, and applications. Crit. Rev.

Biotechnol. 22, 375–407.

Borges, A., Sousa, P., Gaspar, A., Vilar, S., Borges, F., & Simoes, ˜ M.

(2017). Furvina inhibits the 3-oxo-C12-HSL-based quorum

sensing system of Pseudomonas aeruginosa and QS-dependent

phenotypes. Biofouling, 33(2), 156–168.

Brackman G, Coenye T. 2014. Quorum sensing inhibitors as Anti-

Biofilm agents. Curr Pharm. 21:5–11.

Brackman G., Coenye T. (2015). Quorum sensing inhibitors as anti-

biofilm agents. Curr. Pharm. Des. 21, 5–11.

10.2174/1381612820666140905114627

Brooks, G.F., Butel, J.S, and S.A. Morse. 2008. Jawetz, Melnich JL,

Adelberg,sEA. Mikrobiologi Kedokteran. 20th Ed. Jakarta:

Salemba Medika.528 hlm.

Brunner & Suddarth. 2011. Keperawatan Medikal-Bedah. Jakarta : EGC

Bulele T, Rares F E S, Porotu’o J. 2019. Identifikasi Bakteri dengan

Pewarnaan Gram pada Penderita Infeksi Mata Luar di Rumah

Sakit Mata Kota Manado. Jurnal e-Biomedik (eBm), Volume 7,

Nomor 1, Januari-Juni 2019

Cadavid, E., Robledo, S., Quiñones, W., & Echeverri, F.

(2018). Induction of Biofilm Formation in Klebsiella

pneumoniae ATCC 13884 by Several Drugs: The Possible Role

of Quorum Sensing Modulation. Antibiotics, 7(4),

103. doi:10.3390/antibiotics7040103

Chang, P-K., Horn, B.W., Abe, K., Gomi, K. 2014. Aspergillus:

introduction. In: Batt, C.A., Tortorello, M.L. (Eds.).

Encyclopedia of Food Microbiology. Volume 1. Elsevier Ltd,

Academic Press. p. 77-82.

Chew, S. C., & Yang, L. 2016. Biofilms. Encyclopedia of Food and

Health, 407–415. doi:10.1016/b978-0-12-384947-2.00069-6

Coffey, B. M., & Anderson, G. G. (2014). Biofilm Formation in the 96-

Well Microtiter Plate. Pseudomonas Methods and Protocols,

631–641. doi:10.1007/978-1-4939-0473-0_48

Cortes ME, Consuegra J, Sinisterra RD (2011) Bioflm formation,

control, and novel strategies for eradication. Sci Against

Microbial Pathog Commun Curr Res Technol Adv 2:896–905

Corwin EJ. 2009. Buku Saku Patofisiologi. Edisi 3. EGC. Jakarta.

Dalynn. 2014. McF Standard. Dalynn Biological Catalogue No. TM50

– TM60: Canada.

Damayanti E., Istiqomah L., Saragih J. E., Purwoko T. and Sardjono.

(2017). Characterization of lactic acid bacteria as poultry

probiotic candidates with aflatoxin B1 binding activities. IOP

Conf. Ser. Earth Environ. Sci. 101:012030 10.1088/1755-1315/

102

Davies, D.G. and Marques, C.N.H. (2009) A fatty acid messenger is

responsible for inducing dispersion in microbial biofilms. J.

Bacteriol. 191, 1393 – 1403

Defoirdt, T. (2018). Quorum-Sensing Systems as Targets for

Antivirulence Therapy. Trends in Microbiology, 26(4), 313–

328. doi:10.1016/j.tim.2017.10.005

Desbois, A.P. and Smith, V.J. (2010) Antibacterial free fatty acids:

activities, mechanisms of action and biotechnological potential.

Appl. Microbiol. Biotechnol. 85, 1629 – 1642

Dongari-Bagtzoglou, A. (2008). Pathogenesis of mucosal biofilm

infections: challenges and progress. Expert Review of Anti-

Infective Therapy, 6(2), 201–208.

doi:10.1586/14787210.6.2.201

Du Y., Li T., Wan Y., Liao P. (2014). Signal molecule-dependent

quorum-sensing and quorum-quenching enzymes in

bacteria. Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 24, 117–132.

10.1615/CritRevEukaryotGeneExpr.2014008034

Fathoni R, Radiastuti N, Wijayanti F. 2017 – Identifikasi Jenis

Cendawan pada Kelelawar (Ordo Chiroptera) di Kota Tangerang

Selatan. Jurnal Mikologi Indonesia 1(1), 28-37.

Fitria A, Nugraha AT, Meliani Y, Choiriah A. 2018. The Bactericidal

and Antibiofilm Activity of Stem Bark of Jatropha multifida L.

Against Staphylococcus aureus and MRSA. Eksakta: Jurnal

Ilmu-ilmu MIPA. Vol. 8. p. ISSN: 1411-1047 e. ISSN: 2503-

2364. doi: 10.20885/eksakta.vol18.iss1.art5

Frisvad JC, Hubka V, Ezekiel CN, Hong S-B, Nováková A, Chen AL,

Arzanlou M, Larsen TO, Sklenár F, Mahakarnchanakul W,

Samson RA, Houbraken J. 2019. Taxonomy of Aspergillus

section Flavi and their production of aflatoxins, ochratoxins and

other mycotoxins. Stud Mycol ;93:1–63. doi:

10.1016/j.simyco.2018.06.001.

Fux CA, Costerton JW, Stewart PS, Stoodley P. 2005. Survival

strategies of infectious biofilms. Trends Microbiol; 13: 34-40.

Galdiero, E., Di Onofrio, V. D., Maione, A., Gambino, E., Gesuele, R.,

Menale, B., … Guida, M. (2020). Allium ursinum and Allium

oschaninii against Klebsiella pneumoniae and Candida albicans

Mono- and Polymicrobic Biofilms in In Vitro Static and

Dynamic Models. Microorganisms, 8(3), 336.

doi:10.3390/microorganisms8030336

Gandjar, I & Sjamsuridzal, W. 2006. Mikologi: Dasar dan Terapan.

Jakarta: EGC.

GBIF Secretariat (2019). Aspergillus oryzae (Ahlb.) E.Cohn . GBIF

Backbone Taxonomy. Diakses via GBIF.org pada 2020-11-29

https://doi.org/10.15468/39omei

Greenwood, D., Barer, M., Slack, R., & Irving, W. (2012). Medical

Microbiology (Eighteenth).

103

Grief, S. N., & Loza, J. K. (2018). Guidelines for the Evaluation and

Treatment of Pneumonia. Primary Care: Clinics in Office

Practice, 45(3), 485–503. doi:10.1016/j.pop.2018.04.001

Gunardi, W. (2014). Peranan Biofilm dalam Kaitannya dengan Penyakit

Infeksi. Jurnal Kedokteran Meditek, 15(39A).

https://doi.org/10.36452/jkdoktmeditek.

Gupta, Ankit. 2015. Biofilm Quantification and Comparative Analysis

of MIC (Minimum Inhibitory Concentration) & MBIC

(Minimum Biofilm Inhibitory Concentration) Value for

Different Antibiotics against E. coli.

Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci 4(2): 198-224

Happel, K.I.; Dubin, P.J.; Zheng, M.; Ghilardi, N.; Lockhart, C.;

Quinton, L.J.; Odden, A.R.; Shellito, J.E.; Bagby, G.J.; Nelson,

S.; et al. Divergent roles of IL-23 and IL-12 in host defense

against Klebsiella pneumoniae. J. Exp. Med. 2005, 202, 761–

769.

Hart, T. 2004. Color Atlas of Medical Microbiology Second Edition.

London : Licensing Agency. pp. 83.

Hasiani VV, Ahmad I, Rijai L. 2015. Isolasi Jamur Endofit dan Produksi

Metabolit Sekunder Antioksidan dari Daun Pacar (Lawsonia

inermis L.). Jurnal Sains dan Kesehatan. Vol 1.No 4. 146p-

ISSN:2303-0267, e-ISSN:2407-6082

Hemraj, V., 2013. A review on Commonly Used Biochemical Test For

Bacteria. India: Departement of Pharmacy, L R Intitute of

Pharmacy, Solan (H.P).

Iglesias, M. J., Soengas, R., Probert, I., Guilloud, E., Gourvil, P., Mehiri,

M., … Ortiz, F. L. (2019). NMR characterization and evaluation

of antibacterial and antiobiofilm activity of organic extracts from

stationary phase batch cultures of five marine microalgae

(Dunaliella sp., D. salina, Chaetoceros calcitrans, C. gracilis and

Tisochrysis lutea). Phytochemistry, 164, 192–205.

doi:10.1016/j.phytochem.2019.05.001

Irawan R, Reviono, Harsini. 2019. Korelasi Kadar Copeptin dan Skor

PSI dengan Waktu Terapi Sulih Antibiotik Intravena ke Oral dan

Lama Rawat Pneumonia Komunitas. J Respir Indo, 39(1): 44-

53.

Jackson DW, Simecka JW, Romeo T. 2002. Catabolite repression of

Escherichia coli biofilm formation. J Bacteriol 184:3406 –3410.

http://dx .doi.org/10.1128/JB.184.12.3406-3410.2002.

Jain S, Self WH, Wunderink RG, et al. Community-acquired pneumonia

requiring hospitalization among U.S. adults. N Engl J Med

2015;373(5):415–27.

Jamal M, Tasneem U, Husssain T, Andleeb S. 2015. Bacterial Biofilm:

Its Composition, Formation and Role in Human

Infections.National University of Sciences and Technology

(NUST). vol 4. e-ISSN:2320-3528p-ISSN:2347-2286

Jawetz E., J.L. Melnick, E.A. Adelberg.

2007. Mikrobiologi Kedokteran. EGC

104

Press.Jakarta. 513 hlm.Keith, Miller. Immunocytochemical

Techniques. Theory and Practice of HistologicalTechniques. 5

edition. Toronto; 2002; 421-458

Jawetz, Melnick, dan Adelberg’s. 2005. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi

23. Alih Bahasa: Huriwati Hartanto et al. Jakarta: Penerbit Buku

Kedokteran EGC.

K. Gomi. 2014. Aspergillus oryzae. Encyclopedia of Food Microbiology

(Second Edition),

Kalanuria, A., Zai, W., & Mirski, M. (2014). Ventilator-associated

pneumonia in the ICU. Critical Care, 18(2), 208.

doi:10.1186/cc13775

Kambuno, T dan Fanggidae, D. 2017. Identifikasi Bakteri Gram Negatif

Galur Extended Spectrum Beta Lactamase Pada Ruang NICU

RSUD Prof. DR. W. Z. Johannes Kupang Norma. Jurnal Info

Kesehatan Vol 15, No.2, Desember 2017, pp. 333-345 P-ISSN

0216-504X, E-ISSN 2620-536X

Katzung, B. G. (2002). Farmakologi dasar dan klinik. Jakarta: EGC.

Kaysin A, Viera AJ. Community- acquired pneumonia in adults:

diagnosis and management. Am Fam Physician 2016;94(9):698–

706.

Kementerian Kesehatan RI. (2020). Profil Kesehatan Indonesia Tahun

2019. Jakarta : Kementerian Kesehatan

Kementrian Kesehatan RI. (2018). Profil Kesehatan Indonesia Tahun

2017. Jakarta.

Kementrian Pertanian. 2016. Statistik Produksi Hortikultura. Jakarta

Khanifah, F. 2015. Efek Pemberian Air Perasan Jeruk Nipis terhadap

Pencegahan Pembentukan, Penghambatan Pertumbuhan, dan

Penghancuran Biofilm Staphylococcus aureus Secara In Vitro.

Skripsi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif

Hidayatullah, Jakarta.

Khotimah, Alif RH. 2020. Uji aktivitas ekstrak daun murtbei hitam

(Morus nigra L.) sebagai antibiofilm Klebsiella pneumoniae.

Undergraduate thesis, Universitas Islam Negeri Maulana Malik

Ibrahim.

Kim, Y., Kraft, P., & Asgari, M. M. (2018). Using a Mendelian

randomization approach to explore a causal relationship between

vitamin D and nonmelanoma skin cancer. British Journal of

Dermatology, 178(6), 1241–1242. doi:10.1111/bjd.16599

Kinning, E., Falah, S., Nurhidayat, N., 2016. The In Vitro Antibiofilm

Activity of Water Leaf Extract of Papaya (Carica papaya L.)

against Pseudomonas aeruginosa. Current Biochemistry., 2 (3),

150-163.

Kirmusaoglu, Sahra. 2019. The Method for Detection of Biofilm and

Screening Antibiofilm Agents. Antimicrobial, Antibiotic

Resistance, Antibiofilm Strategies and Activity Methods,

IntechOpen, p. 1-17.

105

Koresy, Dennis (2018) Efek Ekstrak Etanol Teh Hijau (Camellia sinensis var. assamica) Sebagai Penghambat Pembentukan Biofilm Klebsiella pneumoniae Secara In Vitro. Sarjana thesis, Universitas Brawijaya

Kumar, P., Lee, J.-H., Beyenal, H., & Lee, J. (2020). Fatty Acids as

Antibiofilm and Antivirulence Agents. Trends in Microbiology.

doi:10.1016/j.tim.2020.03.014

Lam, M.M.C.; Wyres, K.L.; Judd, L.M.; Wick, R.R.; Jenney, A.; Brisse,

S.; Holt, K.E. Tracking key virulence loci encoding aerobactin

and salmochelin siderophore synthesis in Klebsiella

pneumoniae. Genome Med. 2018, 10, 77.

Lambert PA. 2002. Cellular impermeability and uptake of biocides and

antibiotics in Gram-positive bacteria and mycobacteria. J Appl

Microbiol. 92 Suppl():46S-54S.

Li, B., Zhao, Y., Liu, C., Chen, Z., & Zhou, D. (2014). Molecular

pathogenesis ofKlebsiella pneumoniae. Future Microbiology,

9(9), 1071–1081. doi:10.2217/fmb.14.48

Liaw, S.-J., Lai, H.-C., & Wang, W.-B. (2004). Modulation of

Swarming and Virulence by Fatty Acids through the RsbA

Protein in Proteus mirabilis. Infection and Immunity, 72(12),

6836–6845. doi:10.1128/iai.72.12.6836-6845.2004

Liu L., Tan X., Jia A. (2012). Relationship between bacterial quorum

sensing and biofilm formation–a review. Wei Sheng Wu Xue

Bao 52, 271–278.

Martin, R.M.; Bachman, M.A. Colonization, Infection, and the

Accessory Genome of Klebsiella pneumoniae. Front. Cell.

Infect. Microbiol. 2018, 8, 4.

Martinez R, Menedez R, Reyes S, Polverino E, Cilloniz C, Martinez A,

et al. 2011. Factors associated with inflammatory cytokine

patterns in communityacquired pneumonia. Eur Respir J. vol. 37.

hlm. 393-9.

Medzhitov R. 2010. Inflammation 2010: new adventures of an old

flame. Cell. vol. 140. hlm. 771-6.

Meijvis SCA, Van de Garde EMW, Rijkers GT, Bos WJW. 2012.

Treatment with anti-inflammatory drugs in community acquired

Pneumonia. J Intern Med. vol. 272. hlm. 25–35.

Mladenovć, K. G. ; Muruzović, M. ; Vasić, S. M. ; Čomić, L. R. 2019.

The symbiotic effect of temperature and sugars on the planktonic

growth and biofilm formation of Klebsiella spp. isolated from

traditionally made cheese. Romanian Biotechnological Letters.

Vol.24 No.3 pp.400-406 ref.24. 10.25083/rbl/24.3/400.406

Moldoveanu B, Otmishi P, Jani P, Walker J, Sarmiento X, Guardiola J,

et al. 2009. Inflammatory mechanisms in the lung. Journal of

inflammation research. vol.2. hlm. 1-11.

Moradali, M. F., Ghods, S., & Rehm, B. H. A. (2017). Pseudomonas

aeruginosa Lifestyle: A Paradigm for Adaptation, Survival, and

Persistence. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 7.

doi:10.3389/fcimb.2017.00039

106

Mostafavi, M.; Wang, L.; Xie, L.; Takeoka, K.T.; Richie, D.L.; Casey,

F.; Ruzin, A.; Sawyer, W.S.; Rath, C.M.; Wei, J.R.; et al. 2018.

Interplay of Klebsiella pneumoniae fabZ and lpxC Mutations

Leads to LpxC InhibitorDependent Growth Resulting from

Loss of Membrane Homeostasis. mSphere, 3.

Muhajir, A. S., Purwono, P. B., & Handayani, S. (2016). Gambaran

terapi dan luaran infeksi saluran kemih oleh bakteri penghasil

Extended Spectrum Beta Lactamase pada anak di RSUD Dr.

Soetomo Surabaya. Sari Pediatri, 18(2), 111-116.

Nagata K, Mino H, Yoshida S. 2010. Usefulness and limit of Gram

staining smear examination. Rinsho Byori. 58(5):490-7.

Nazzaro, F., Fratianni, F., & Coppola, R. (2013). Quorum sensing and

phytochemicals. International journal of molecular sciences,

14(6), 12607–12619.

Nicol, M., Alexandre, S., Luizet, J.-B., Skogman, M., Jouenne, T.,

Salcedo, S., & Dé, E. (2018). Unsaturated Fatty Acids Affect

Quorum Sensing Communication System and Inhibit Motility

and Biofilm Formation of Acinetobacter baumannii.

International Journal of Molecular Sciences, 19(1), 214.

doi:10.3390/ijms19010214

Nurarif & Kusuma, 2016. Aplikasi Asuhan Keperawatan Berdasarkan

Daignosa Medis &.Nanda Nic-Noc. Yogyakatra : MediAction

Oda K., et al. 2006. Proteomic analysis of extracellular proteins from

Aspergillus oryzae grown under submerged and solid-state

culture conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72:3448–3457

Oramahi H.A, Sumardiyono C, Pusposendjojo N, Haryadi. 2006.

Identifikasi Jamur Aspergillus Pada Gaplek di Kabupaten

Gunung Kidul. Jurnal Tanaman Indonesia. Vol 12. No 1. 25-23

O'Toole, G. A., 2011. Microtiter dish biofilm formation assay. Journal

of visualized experiments: JoVE., 47 (1).

Paraje, M. G., 2011. Antimicrobial Resistance in Biofilms.

FORMATEX, 736-744.

Passos da Silva, D., Schofield, M., Parsek, M., & Tseng, B. (2017). An

update on the sociomicrobiology of quorum sensing in Gram-

negative biofilm development. Pathogens, 6(4), 51.

Paula-Ramos, L., da Rocha Santos, C. E., Camargo Reis Mello, D.,

Nishiama Theodoro, L., De Oliveira, F. E., Back Brito, G. N., …

de Oliveira, L. D. (2016). Klebsiella pneumoniae Planktonic and

Biofilm Reduction by Different Plant Extracts: In Vitro Study.

The Scientific World Journal, 2016, 1–

5. doi:10.1155/2016/3521413

Podschun, R., and Ullmann, U. 1998. Klebsiella spp. as nosocomial

pathogens: epidemiology, taxonomy, typing methods, and

pathogenicity factors. Clin. Microbiol. Rev. 11, 589–603.

Post, K W. And Songer, GJ. 2005. MICROBIOLOGY Bacterial and

Fungal Agent of Animal Disease. Elsevier Saunders:

Philadelphia

107

Prateeksha, Bajpai, R., Yusuf, M. A., Upreti, D. K., Gupta, V. K., &

Singh, B. N. (2019). Endolichenic fungus, Aspergillus

quandricinctus of Usnea longissima inhibits quorum sensing and

biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa PAO1. Microbial

Pathogenesis, 103933. doi:10.1016/j.micpath.2019.103933

Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: EGC.

Purwanti NU, Susanti R. 2016. Uji Aktivitas Antibakteri dan Antifungal

Ekstrak Etanol Rimpang Acorus sp. Jurnal Kesehatan

Khatulistiwa. Volume 2. Nomor 1. Januari 2016

Rachmawaty. 2010. Produksi Glukosa Jamur Tanah Aspergillus oryzae

Dan Aspergillus niger Pada Beberapa Jenis Substrat

Pati. Working Paper. Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam.

Rahayu SA & Gumilar MH. 2017. Uji Cemaran Air Minum Masyarakat

Sekitar Margahayu Raya Bandung Dengan Identifikasi Bakteri

Escherichia coli. IJPST Volume 4, Nomor 2

Rahayu, S. A., Gumilar. 2017. Uji Cemaran Air Minum Masyarakat

Sekitar Margahayu Raya Bandung Dengan Identifikasi Bakteri

Escherichia coli. JPST, Volume 4, Nomor 2

Ramanathan, S., Ravindran, D., Arunachalam, K., & Arumugam, V. R.

(2017). Inhibition of quorum sensing-dependent biofilm and

virulence genes expression in environmental pathogen Serratia

marcescens by petroselinic acid. Antonie van Leeuwenhoek,

111(4), 501–515. doi:10.1007/s10482-017-0971-y

Reviono. 2017. PNEUMONIA : Adakah tempat untuk pemberian

antiinflamasi ?. Surakarta. UNS Press

Ristiari NPN, Julyasih KSM, Suryanti IAP. 2018. Isolasi Dan

Identifikasi Jamur Mikroskopis Pada Rizosfer Tanaman Jeruk

Siam (Citrus nobilis Lour.) DI KECAMATAN KINTAMANI,

BALI. Jurnal Pendidikan Biologi Undiksha. Volume 6 Nomor 1.

p-ISSN : 2599-1450 e-ISSN : 2599-1485

Rollando R, Prasetyo YSA, Sitepu R. 2019. Uji Antimikroba Minyak

Atsiri Masoyi (Massoia aromatica) terhadap Bakteri

Streptococcus mutans. Majalah Farmasi dan Farmakologi.

Vol 23(2):52-57. DOI: https://doi.org/10.20956/mff.v23i2.6585

Rosdiana, N. & Nasution, A.I. 2016. Hubungan Biofilm Streptococcus

Mutans Terhadap Resiko Terjadinya Karies Gigi .Rosdiana N et

al/J Syiah Kuala Dent Soc, Vol. 1, No. 1, Hal. 43 – 50.

Ruchi T., Sutaja B., Anuradha D. 2015. Comparison of Phenotypic

Methods for The Detection Of Biofilm Production in Uro-

Pathogens in a Tertiary Care Hospital in India, International

Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 4 (9):

840-849.

Rufaldi, C. D. 2016. Klebsiellla pneumoniae.

Russo, T.A.; Shon, A.S.; Beanan, J.M.; Olson, R.; MacDonald, U.;

Pomakov, A.O.; Visitacion, M.P. Hypervirulent K. pneumoniae

secretes more and more active iron-acquisition molecules than

https://www.researchgate.net/journal/Majalah-Farmasi-dan-Farmakologi-1410-7031

https://doi.org/10.20956/mff.v23i2.6585

108

“classical” K. pneumoniae thereby enhancing its virulence.

PLoS ONE 2011, 6, e26734.

S´ anchez, C. (2009). Lignocellulosic residues: Biodegradation and

bioconversion by fungi. Biotechnology Advances, 27(2), 185–

194. https://doi.org/10.1016/j. biotechadv.2008.11.001

Safitri, Fauzana, Fauziah. 2011. Pembuatan Starter Inokulum Jamur

Aspergillus oryzae, Rhizopus oligosporus dan Trichoderma

viridae untuk Bibit Fermentasi Kulit Pisang Kepok (Musa

balbisiana Colla). Program Studi Pemuliaan Tanaman Fakultas

Pertanian Universitas Padjajaran. ISBN 978-602-18209-0-2

Samirah., Darwati., Windarwati., & Hardjoeno. (2014). Pola dan

sensitifitas kuman di penderita infeksi saluran kemih. Indonesian

Journal of Clinical Pathology and Medical Laboratory, 12(3),

110-113.

Santhakumari, S., Kannappan, A., Pandian, S. K., Thajuddin, N.,

Rajendran, R. B., & Ravi, A. V. (2015). Inhibitory effect of

marine cyanobacterial extract on biofilm formation and

virulence factor production of bacterial pathogens causing

vibriosis in aquaculture. Journal of Applied Phycology, 28(1),

313–324. doi:10.1007/s10811-015-0554-0

Santhakumari, S., Nilofernisha, N. M., Ponraj, J. G., Pandian, S. K., &

Ravi, A. V. (2017). In vitro and in vivo exploration of palmitic

acid from Synechococcus elongatus as an antibiofilm agent on

the survival of Artemia franciscana against virulent vibrios.

Journal of Invertebrate Pathology, 150, 21–31.

doi:10.1016/j.jip.2017.09.001

Sarathbabu, R.,V.T. Ramani, B.K. Rao, and S. Panda. 2012. Antibiotic

susceptibilitypattern of Klebsiella pneumoniae isolated

from sputum, urine and pussamples. IOSRJPBS.1(2) : 04-09.

Sarwono J, 2006. Metode Penelitian Kuantitatif dan Kualitatif, Graha

Ilmu,Yogyakarta, hal. 129

Schauder, S., Shokat, K., Surette, M. G., & Bassler, B. L. (2001). The

LuxS family of bacterial autoinducers: Biosynthesis of a novel

quorum-sensing signal molecule. Molecular microbiology,

41(2), 463–476.

Schembri MA, Dalsgaard D, Klemm P. 2004. Capsule shields the

function of short bacterial adhesins. J Bacteriol ;186:1249–1257.

Shakib, P., Kalani, M., Ramazanzadeh, R., Ahmadi, A., Rouhi, S. 2018.

Molecular detection of virulence genes in Klebsiella

pneumoniae clinical isolates from Kurdistan Province, Iran.

Biomedical Research and Therapy. 5(8), 2581-2589.

doi.org/10.15419/bmrat.v5i8.467

Shofiana RS, Sulistyowati L, Muhibuddin A. 2015. Eksplorasi Jamur

Endofit Dan Khamir Pada Tanaman Cengkeh (Syzygium

Aromaticum) Serta Uji Potensi Antagonismenya Terhadap

Jamur Akar Putih (Rigidoporus microporus). Jurnal HPT

Volume 3 Nomor 1

https://doi.org/10.1016/j.%20biotechadv.2008.11.001

109

Shon, A.S.; Bajwa, R.P.; Russo, T.A. Hypervirulent

(hypermucoviscous) Klebsiella pneumoniae: A new and

dangerous breed. Virulence 2013, 4, 107–118.

Shukla SK, Rao T S. Staphylococcus aureus biofilm removal by

targeting biofilm-associated extracellular proteins. Indian J Med

Res 2017;146, Suppl S1:1-8

Singh, V. K., Kavita, K., Prabhakaran, R., & Jha, B. (2013). Cis-9-

octadecenoic acid from the rhizospheric

bacteriumStenotrophomonas maltophiliaBJ01 shows quorum

quenching and anti-biofilm activities. Biofouling, 29(7), 855–

867. doi:10.1080/08927014.2013.807914

Stanley NR, Lazazzera BA. 2004. Environmental signals and regulatory

pathways that influence biofilm formation. Mol Microbiol.

52:917–924.

Sutrina SL, Daniel K, Lewis M, Charles NT, Anselm CKE, Thomas N,

Holder N. 2015. Biofilm growth of Escherichia coli is subject to

cAMPdependent and cAMP-independent inhibition. J Mol

Microbiol Biotechnol 25:209 –225.

http://dx.doi.org/10.1159/000375498.

Sutriswati rahayu endang. 2020. Aspergillus flavus dan Para Saudara

Dekatnya. Pusat Studi Pangan dan gizi Universitas Gajah Mada.

Yogyakarta

Tamano K, Bruno KS, Karagiosis SA, Culley DE, Deng S, Collett JR,

Umemura M, Koike H, Baker SE, Machida M (2013) Increased

production of fatty acids and triglycerides in Aspergillus oryzae

by enhancing expressions of fatty acid synthesis-related genes.

Appl Microbiol Biotechnol 97(1):269 – 281

Tamano, K., Bruno, K. S., Koike, H., Ishii, T., Miura, A., Umemura, M.,

… Machida, M. (2015). Increased production of free fatty acids

in Aspergillus oryzae by disruption of a predicted acyl-CoA

synthetase gene. Applied Microbiology and Biotechnology,

99(7), 3103–3113. doi:10.1007/s00253-014-6336-9

Tarina, N.T.I., Kusuma, S.A.F. 2017. Deteksi Bakteri Klebsiella

pneumoniae. Farmaka. Suplemen Vol 15 no 2

Teper, D., Zhang, Y., & Wang, N. (2019). TfmR, a novel TetR‐family

transcriptional regulator, modulates the virulence of

Xanthomonas citri in response to fatty acids. Molecular Plant

Pathology. doi:10.1111/mpp.12786

Varga J, Frisvad JC, Samson RA. 2011. Two new aflatoxin producing

species and an overview of Aspergillus section Flavi. Stud

Mycol. 2011;69:57–80. doi: 10.3114/sim.69.05

Wahyudi D, Silviani Y-. 2015. Jurnal Kesehatan Kusuma Husada, 2015.

penghambatan produksi eksoprotease dan biofilm pada

pseudomonas aeruginosa oleh ekstrak apium graveolens l. Jurnal

Kesehatan Kusuma Husada

Waluyo Lud. 2010. Teknik metode dasar dalam Mikrobiologi.

Universitas Muhamadiayah Malang

http://dx.doi.org/10.1159/000375498

110

Wang Y-M, Dong W-L, Odah KA, Kong L-C, Ma H-X et al. 2019.

Transcriptome analysis reveals AI-2 relevant genes of multi-

drug resistant Klebsiella pneumoniae in response to eugenol at

Sub-MIC. Front Microbiol ;10:1159.

Wang, G., Zhao, G., Chao, X., Xie, L., & Wang, H. 2020. The

Characteristic of Virulence, Biofilm and Antibiotic Resistance

of Klebsiella pneumoniae. International Journal of

Environmental Research and Public Health, 17(17), 6278.

doi:10.3390/ijerph17176278

Wang, H. S., Ren, P. F., Mang, L., Shen, N., Chen, J. R., & Zhang, Y.

W. (2019). In vitro fermentation of novel microwave-

synthesized non-digestible oligosaccharides and their impact on

the composition and metabolites of human gut microbiota.

Journal of Functional Foods, 55, 156–166.

https://doi.org/10.1016/j.jff.2019.02.030

Wang, J., Yang, X., Yang, Y., Liu, Y., Piao, X., & Cao, Y. (2020).

Characterization of a protease-resistant α-galactosidase from

Aspergillus oryzae YZ1 and its application in hydrolysis of

raffinose family oligosaccharides from soymilk. International

Journal of Biological Macromolecules.

doi:10.1016/j.ijbiomac.2020.04.256

Weiland-Bräuer N, Kisch MJ, Pinnow N, Liese A, Schmitz RA. 2016.

Highly effective inhibition of biofilm formation by the first

metagenome-derived AI-2 quenching enzyme. Front Microbiol.

7:1098.

WHO 2019. Pneumonia. https://www.who.int/news-room/ fact-

sheets/detail/pneumonia - diaksespada Oktober 2020.

Witkowska A. M., Hickey D. K., Alonso-Gomez M., Wilkinson M.

2013. Evaluation of antimicrobial activities of commercial herb

and spice extracts against selected food-borne bacteria. Journal

of Food Research (JFR);2(4):P. 37. doi: 10.5539/jfr.v2n4p37.

Wulandari D, dan Asih IJ. 2017. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun

Suruhan (Peperomia pellucida L. Kunth) terhadap Klebsiella

pneumonia. Jurnal Farmasi Indonesia, Maret 2017, hal 33 - 39

Vol. 15 No. 1 ISSN: 1693-8615 EISSN : 2302-4291

111

Lampiran 1. Etik Penelitian

112

Lampiran 2. Identifikasi Bakteri

113

Lampiran 3. Pembuatan Supernatan Aspergillus oryzae

Inokulum jamur dibuat

dari 5 mL suspensi

Aspergillus oryzae yang

ditambahkan 45 mL PDB

steril dan 1 mL larutan

glukosa dengan

konsentrasi 2%

114

Setelah itu dimasukkan

ke dalam inkubator

shaker selama 3 hari

dengan suhu 28oC

Langkah selanjutnya

dengan menyaring hasil

inokulum jamur dengan

kertas Whatman no. 2

dan ditampung pada

falcon. Dan diberikan es

batu disekitar falcon.

Kemudian hasil saringan

dimasukkan pada tabung

eppendorf dan di frezzer

beberapa saat sampai

muncul kristal es untuk

menghindari kerusakan

protein jamur. Setelah itu

dilakukan sentrifugasi

untuk memisahkan

115

supernatan dengan

peletnya.

Supernatan siap

digunakan.

Lampiran 4. Prosedur Uji Aktivitas Antibiofilm

Siapkan berbagai macam

konsentrasi supernatan,

yaitu dengan konsentrasi

100%, 50%, 25%, 12,5%,

dan 6,25%. Siapkan juga

kontrol positif, kontrol

negatif, dan kontrol media

116

Masukkan masing masing

kelompok kedalam

microplate dan diinkubasi

selama 72 jam.

Setelah itu dilakukan

pencucian dengan PBS

sebanyak 3x. kemudian

diberikan kristal violet

0,1% dan dibilas dengan

aquades 3x pengulangan.

Selanjutnya microplate

dikeringkan dan

ditambahkan asam asetat

30%.

Ukur microplate

menggunakan microplate

reader dengan panjang

gelombang 595 nm.

117

Lampiran 5. Uji Pertumbuhan Biofilm

Lampiran 6. Hasil Uji Aktivitas Antibiofilm

1. Uji Pencegahan Perlekatan Biofilm

km k+ 100% 50% 25% 12.50% 6.25% k-

0.176 0.235 0.257 0.143 0.334 0.571 0.196 0.216

0.218 0.135 0.202 0.13 0.31 0.351 0.214 0.236

0.188 0.205 0.236 0.204 0.239 0.265 0.195 0.366

Rata - rata

0.194 0.192 0.232 0.159 0.245 0.245 0.202 0.272

Standar Deviasi

0.018 0.042 0.022 0.032 0.05 0.095 0.008 0.066

Aktivitas Pencegahan Perlekatan Biofilm

29% 14.7% 41.5% 0% 0% 25.7%

Km 24 Jam 48 Jam 72 Jam

0.203 0.624 0.842 1.141

0.242 0.631 0.747 1.303

0.147 0.625 0.668 1.417

Standar Deviasi

0.038 0.003 0.071 0.113

Rata - rata

0.197 0.626 0.752 1.287

118

2. Uji Penghambatan Pembentukan Biofilm

km K+ 100% 50% 25% 12.50% 6.25% k-

0.121 0.167 0.218 0.307 0.429 0.388 0.458 1.141

0.14 0.165 0.286 0.395 0.391 0.551 0.298 1.303

0.2 0.163 0.381 0.42 0.52 0.406 0.386 1.417

Rata - rata

0.153 0.165 0.295 0.374 0.446 0.448 0.38 1.287

Standar Deviasi

0.033 0.001 0.066 0.048 0.054 0.072 0.065 0.113

Aktivitas Penghambatan Pembentukan

87%

77% 70% 65.3% 65% 70.4%

3. Uji Penghancuran Biofilm

km K+ 100% 50% 25% 12.50% 6.25% k-

0.086 0.299 0.333 0.497 0.411 0.425 0.459 0.476

0.144 0.318 0.349 0.462 0.499 0.567 0.482 0.799

0.128 0.298 0.324 0.343 0.533 0.361 0.468 0.624

Rata - rata

0.119 0.305 0.335 0.434 0.481 0.451 0.469 0.633

Standar Deviasi

0.024 0.009 0.01 0.065 0.051 0.086 0.009 0.132

Aktivitas Penghancuran Biofilm

51% 47% 31.4% 24% 28.7% 25.9%

119

Lampiran 7. Analisis Pencegahan Perlekatan Biofilm

1. Uji Normalitas

Tests of Normality

Perlakuan

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

OD Pencegahan

perlekatan

k+ .269 3 . .949 3 .567

k- .340 3 . .848 3 .235

100% .229 3 . .982 3 .741

50% .324 3 . .877 3 .316

25% .291 3 . .925 3 .469

12.5% .234 3 . .979 3 .720

6.25% .369 3 . .789 3 .089

km .276 3 . .942 3 .537

a. Lilliefors Significance Correction

2. Uji Homogenitas

Test of Homogeneity of Variances

transform_OD

Levene

Statistic df1 df2 Sig.

2.084 7 16 .106

120

3. Uji One Way ANOVA

ANOVA

transform_OD

Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

Between

Groups .317 7 .045 4.455 .006

Within Groups .163 16 .010

Total .479 23

4. Uji Post Hoc Tukey

121

Multiple Comparisons

transform_OD

Tukey HSD

(I)

Perlaku

an

(J)

Perlaku

an

Mean

Difference (I-

J) Std. Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower

Bound Upper Bound

k+ k- -.15256 .08230 .597 -.4375 .1324

100% -.09168 .08230 .944 -.3766 .1932

50% .07808 .08230 .976 -.2068 .3630

25% -.19345 .08230 .326 -.4784 .0915

12.5% -.30401* .08230 .032 -.5889 -.0191

6.25% -.03318 .08230 1.000 -.3181 .2517

km -.01499 .08230 1.000 -.2999 .2699

k- k+ .15256 .08230 .597 -.1324 .4375

100% .06088 .08230 .994 -.2240 .3458

50% .23065 .08230 .162 -.0543 .5156

25% -.04089 .08230 1.000 -.3258 .2440

12.5% -.15145 .08230 .605 -.4364 .1335

6.25% .11938 .08230 .821 -.1655 .4043

km .13757 .08230 .704 -.1474 .4225

100% k+ .09168 .08230 .944 -.1932 .3766

k- -.06088 .08230 .994 -.3458 .2240

50% .16976 .08230 .475 -.1152 .4547

25% -.10177 .08230 .909 -.3867 .1832

12.5% -.21233 .08230 .232 -.4973 .0726

6.25% .05850 .08230 .995 -.2264 .3434

km .07669 .08230 .978 -.2082 .3616

50% k+ -.07808 .08230 .976 -.3630 .2068

k- -.23065 .08230 .162 -.5156 .0543

100% -.16976 .08230 .475 -.4547 .1152

25% -.27153 .08230 .068 -.5565 .0134

12.5% -.38209* .08230 .005 -.6670 -.0972

6.25% -.11126 .08230 .865 -.3962 .1737

122

km -.09307 .08230 .940 -.3780 .1919

25% k+ .19345 .08230 .326 -.0915 .4784

k- .04089 .08230 1.000 -.2440 .3258

100% .10177 .08230 .909 -.1832 .3867

50% .27153 .08230 .068 -.0134 .5565

12.5% -.11056 .08230 .869 -.3955 .1744

6.25% .16027 .08230 .541 -.1247 .4452

km .17846 .08230 .417 -.1065 .4634

12.5% k+ .30401* .08230 .032 .0191 .5889

k- .15145 .08230 .605 -.1335 .4364

100% .21233 .08230 .232 -.0726 .4973

50% .38209* .08230 .005 .0972 .6670

25% .11056 .08230 .869 -.1744 .3955

6.25% .27083 .08230 .069 -.0141 .5558

km .28902* .08230 .046 .0041 .5739

6.25% k+ .03318 .08230 1.000 -.2517 .3181

k- -.11938 .08230 .821 -.4043 .1655

100% -.05850 .08230 .995 -.3434 .2264

50% .11126 .08230 .865 -.1737 .3962

25% -.16027 .08230 .541 -.4452 .1247

12.5% -.27083 .08230 .069 -.5558 .0141

km .01819 .08230 1.000 -.2667 .3031

km k+ .01499 .08230 1.000 -.2699 .2999

k- -.13757 .08230 .704 -.4225 .1474

100% -.07669 .08230 .978 -.3616 .2082

50% .09307 .08230 .940 -.1919 .3780

25% -.17846 .08230 .417 -.4634 .1065

12.5% -.28902* .08230 .046 -.5739 -.0041

6.25% -.01819 .08230 1.000 -.3031 .2667

*. The mean difference is significant at the 0.05

level.

123

5. Uji Korelasi Pearson

Correlations

penghancuran

Biofilm

konsentrasi

CFS

Pencegahan

Perlekatan Biofilm

Pearson

Correlation 1 .244

Sig. (2-tailed) .381

N 15 15

konsentrasi CFS Pearson

Correlation .244 1


N 15 15

124

Lampiran 8. Analisis Penghambatan Pembentukan Biofilm

1. Uji Normalitas

2. Uji Homogenitas


penghambatan pembentukan

Levene


1.655 7 16 .191

Tests of Normality

Perlak

uan



penghambatan

pembentukan

k+ .175 3 . 1.000 3 1.000

k- .213 3 . .990 3 .809

100% .210 3 . .991 3 .818

50% .305 3 . .906 3 .405

25% .272 3 . .947 3 .555

12.5% .349 3 . .832 3 .193

6.25% .193 3 . .997 3 .890

km .297 3 . .918 3 .444


125

3. Uji OneWay ANOVA

ANOVA


Sum of


Between

Groups

2.712 7 .387 62.022 .000


Total 2.812 23


126



Tukey HSD

(I)

Perlaku

an

(J)

Perlaku

an

Mean

Difference (I-

J) Std. Error Sig.


Lower

Bound Upper Bound

k+ k- -1.122000* .064529 .000 -1.34541 -.89859

100% -.130000 .064529 .502 -.35341 .09341

50% -.209000 .064529 .076 -.43241 .01441

25% -.281667* .064529 .009 -.50508 -.05826

12.5% -.283333* .064529 .008 -.50674 -.05992

6.25% -.215667 .064529 .063 -.43908 .00774

km .011333 .064529 1.000 -.21208 .23474

k- k+ 1.122000* .064529 .000 .89859 1.34541

100% .992000* .064529 .000 .76859 1.21541

50% .913000* .064529 .000 .68959 1.13641

25% .840333* .064529 .000 .61692 1.06374

12.5% .838667* .064529 .000 .61526 1.06208

6.25% .906333* .064529 .000 .68292 1.12974

km 1.133333* .064529 .000 .90992 1.35674

100% k+ .130000 .064529 .502 -.09341 .35341

127

k- -.992000* .064529 .000 -1.21541 -.76859

50% -.079000 .064529 .913 -.30241 .14441

25% -.151667 .064529 .326 -.37508 .07174

12.5% -.153333 .064529 .315 -.37674 .07008

6.25% -.085667 .064529 .875 -.30908 .13774

km .141333 .064529 .405 -.08208 .36474

50% k+ .209000 .064529 .076 -.01441 .43241

k- -.913000* .064529 .000 -1.13641 -.68959

100% .079000 .064529 .913 -.14441 .30241

25% -.072667 .064529 .941 -.29608 .15074

12.5% -.074333 .064529 .934 -.29774 .14908

6.25% -.006667 .064529 1.000 -.23008 .21674

km .220333 .064529 .055 -.00308 .44374

25% k+ .281667* .064529 .009 .05826 .50508

k- -.840333* .064529 .000 -1.06374 -.61692

100% .151667 .064529 .326 -.07174 .37508

50% .072667 .064529 .941 -.15074 .29608

12.5% -.001667 .064529 1.000 -.22508 .22174

6.25% .066000 .064529 .964 -.15741 .28941

km .293000* .064529 .006 .06959 .51641

12.5% k+ .283333* .064529 .008 .05992 .50674

128

k- -.838667* .064529 .000 -1.06208 -.61526

100% .153333 .064529 .315 -.07008 .37674

50% .074333 .064529 .934 -.14908 .29774

25% .001667 .064529 1.000 -.22174 .22508

6.25% .067667 .064529 .959 -.15574 .29108

km .294667* .064529 .006 .07126 .51808

6.25% k+ .215667 .064529 .063 -.00774 .43908

k- -.906333* .064529 .000 -1.12974 -.68292

100% .085667 .064529 .875 -.13774 .30908

50% .006667 .064529 1.000 -.21674 .23008

25% -.066000 .064529 .964 -.28941 .15741

12.5% -.067667 .064529 .959 -.29108 .15574

km .227000* .064529 .045 .00359 .45041

km k+ -.011333 .064529 1.000 -.23474 .21208

k- -1.133333* .064529 .000 -1.35674 -.90992

100% -.141333 .064529 .405 -.36474 .08208

50% -.220333 .064529 .055 -.44374 .00308

25% -.293000* .064529 .006 -.51641 -.06959

12.5% -.294667* .064529 .006 -.51808 -.07126

6.25% -.227000* .064529 .045 -.45041 -.00359

129


Correlations

penghambatan

pembentukan

biofilm konsentrasi CFS

penghambatan

pembentukan biofilm

Pearson Correlation 1 .413


N 15 15

konsentrasi CFS Pearson Correlation .413 1


N 15 15

130

Lampiran 9. Analisis Penghancuran Biofilm

1. Uji Normalitas

2. Uji Homogenitas


penghancuran biofilm

Levene


2.306 7 16 .079

Tests of Normality

Perlakuan



OD

Penghancuran

biofilm

k+ .369 3 . .787 3 .085

k- .189 3 . .998 3 .908

100% .240 3 . .975 3 .694

50% .302 3 . .910 3 .417

25% .279 3 . .939 3 .522

12.5% .264 3 . .954 3 .589

6.25% .224 3 . .984 3 .762

km .280 3 . .937 3 .516


131

3. Uji One Way ANOVA

ANOVA


Sum of


Between

Groups .376 7 .054 17.335 .000


Total .425 23


132



Tukey HSD

(I)

Perlaku

an

(J)

Perlaku

an

Mean

Difference (I-

J) Std. Error Sig.


Lower

Bound Upper Bound

k+ k- -.239038* .045440 .002 -.39636 -.08172

100% -.026805 .045440 .999 -.18412 .13051

50% -.104578 .045440 .349 -.26190 .05274

25% -.140314 .045440 .099 -.29763 .01700

12.5% -.116376 .045440 .239 -.27370 .04094

6.25% -.133082 .045440 .131 -.29040 .02424

km .208705* .045440 .006 .05139 .36602

k- k+ .239038* .045440 .002 .08172 .39636

100% .212233* .045440 .005 .05491 .36955

50% .134461 .045440 .124 -.02286 .29178

25% .098724 .045440 .415 -.05859 .25604

12.5% .122662 .045440 .192 -.03466 .27998

6.25% .105956 .045440 .335 -.05136 .26328

km .447743* .045440 .000 .29042 .60506

100% k+ .026805 .045440 .999 -.13051 .18412

k- -.212233* .045440 .005 -.36955 -.05491

50% -.077772 .045440 .681 -.23509 .07955

25% -.113509 .045440 .263 -.27083 .04381

12.5% -.089571 .045440 .527 -.24689 .06775

6.25% -.106276 .045440 .332 -.26360 .05104

km .235511* .045440 .002 .07819 .39283

50% k+ .104578 .045440 .349 -.05274 .26190

k- -.134461 .045440 .124 -.29178 .02286

100% .077772 .045440 .681 -.07955 .23509

25% -.035737 .045440 .992 -.19306 .12158

12.5% -.011799 .045440 1.000 -.16912 .14552

133

6.25% -.028504 .045440 .998 -.18582 .12881

km .313283* .045440 .000 .15596 .47060

25% k+ .140314 .045440 .099 -.01700 .29763

k- -.098724 .045440 .415 -.25604 .05859

100% .113509 .045440 .263 -.04381 .27083

50% .035737 .045440 .992 -.12158 .19306

12.5% .023938 .045440 .999 -.13338 .18126

6.25% .007233 .045440 1.000 -.15009 .16455

km .349020* .045440 .000 .19170 .50634

12.5% k+ .116376 .045440 .239 -.04094 .27370

k- -.122662 .045440 .192 -.27998 .03466

100% .089571 .045440 .527 -.06775 .24689

50% .011799 .045440 1.000 -.14552 .16912

25% -.023938 .045440 .999 -.18126 .13338

6.25% -.016705 .045440 1.000 -.17402 .14061

km .325082* .045440 .000 .16776 .48240

6.25% k+ .133082 .045440 .131 -.02424 .29040

k- -.105956 .045440 .335 -.26328 .05136

100% .106276 .045440 .332 -.05104 .26360

50% .028504 .045440 .998 -.12881 .18582

25% -.007233 .045440 1.000 -.16455 .15009

12.5% .016705 .045440 1.000 -.14061 .17402

km .341787* .045440 .000 .18447 .49911

km k+ -.208705* .045440 .006 -.36602 -.05139

k- -.447743* .045440 .000 -.60506 -.29042

100% -.235511* .045440 .002 -.39283 -.07819

50% -.313283* .045440 .000 -.47060 -.15596

25% -.349020* .045440 .000 -.50634 -.19170

12.5% -.325082* .045440 .000 -.48240 -.16776

6.25% -.341787* .045440 .000 -.49911 -.18447

*. The mean difference is significant at the 0.05

level.

134


Correlations

penghancuran

Biofilm

konsentrasi

CFS

penghancuran

Biofilm

Pearson

Correlation 1 .553*


N 15 15

konsentrasi CFS Pearson

Correlation .553* 1


N 15 15

*. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed).

uji aktivitas antibiofilm aspergillus oryzae

Documents