Uber Lipoide menschlicher Gewebe sowie maligner und benigner Tumoren

Von Dor. D r . H . v. E l m e n d o r f f und D r . J . S c h m i t z - H i l l e b r c c h t

Airs der Chirurgisden Uniuersitatsklinik Diisseldorf (Dirrktor Prof. Dr. Dr. h. c. E. D e r r a )

Unter Verwendung einer von den Verfassern modifizierten Methode der Saulen- und Dunnschicht-Chromatographie nach K. K. Carroll und E. Stahl wurden Lipoide von Tumoren und Vergleichsgewebe untersucht. In den Spektren lieBen sich bis zu 57 verschiedene Fledten beobachten. In Carcinomgeweben konn- ten krebsspezifische Lipoide in der Phosphatid-freien Fraktion nicht nachgewiesen werden. Allerdings lieBen sich Verschiebun- gen der einzelnen Lipoid-Anteile aus malignen Tumoren gegen- uber anderen Geweben beobachten.

The Lipids of the Human Tissues as well a s Malignant and Benign Tumours

The lipids from the tumours and the test tissues were investiga- ted by using a column and thin-layer chromatographic method of K. K. Carol1 and E. Stahl, which was modified by one of the present authors. Upto 5 f different spots were found in the spec- tra. In the phosphatide free fractions of the cancerous tissues, the lipids specific for the cancer could not be detected. However, changes could be observed in individual components of the lipids from malignant tumours as compared to other tissues.

In Fortsetzung der Untersuchungen von menschlichen Lipoiden wurden die Extrakte von normalen, entziind- lichen und tumorosen Geweben saulen- und dunnschicht- chromatographisch getrennt, urn mogliche charakteri- stische Unterschiede zu erkennen. Nur die Nichtphos- phatid-Fraktionen der Gewebe wurden untersucht. Wie bei Serumlipoiden konnten auch im Gewebe bis zu 57 verschiedene Flecken diinnschicht-chromatographisch be- obachtet werden.

M e t h o d i k l-s

Das durch Operation erhaltene menschliche Gewebe wurde sogleich nach dem Eingriff gewogen und verarbeitet. Eine Menge von 600 bis 800 mg Feuchtgewicht wurde zunachst zerkleinert und dann mit einem Morser mit wenigen cms See- sand zermahlen. Nach dem Aufschwemmen in 6 cm3 dest. Eis- wasser wurden 160 cm3 Athanol-Diathylather (3 : 1 ) hinzu- gefugt und filtriert. Der Ruckstand wurde weiterhin mit 60 cm3 Ather-Athanol-Chloroform ( 1 : 1 : 1 ) und dann erneut mit 160 cm3 Athanol-Ather nachgewaschen. Die gesammelten Eluate wurden zur Trodtene eingedampft und nach K. K. Carroll weiterverarbeitet. Jeweils 20 cms des aus der Flori- silsaule erhaltenen Eluates wurden nach dem Eindampfen dunnschicht-chromatographisch untersucht 4. Pro Gewebe resul- tierten 45 Dunnschicht-Chromatogramme. Fur Serienunter- suchungen wurden jeweils mehrere Fraktionen, die im Dunn- schicht-Chromatogramm gleichartige Flecken zeigten, vereinigt. Auf diese Weise konnten wir mit 9 Diinnschicht-Chromato- grammen auskommen. Hierbei handelte es sich um die folgen- den Fraktionen:

H . u. Elmendorff u. D. Humpf, Ober die Serumlipide von Gesunden und Krebskranken. Fette . Seifen . Anstrichmittel 68, 102 [1966]. K. K. Carroll, Separation of Lipid Classes by Chromato- graphy on Florisil, J. Lipid Res. 2, 135 [1961]. H. P. Kaufmann u. K . D. Mukherjee, Versuche zur zwei- dimensionalen quantitativen Analyse von Lipoiden auf photometrischem Wege, Fette . Seifen . Anstrichmittel 67, 183 [1965]; H . P . Kaufmann u. G . Schmidt, Ober Lipide aus normalen und pathologischen menschlichen Blutseren und xanthomatosem Gewebsmaterial, Fette ; Seifen . An- strichmittel 62. 164, 399 [1960]. E . Stahl, Dunnschicht-Chromatographie, Springer-Verlag. Heidelberg 1962.

Sur les lipides des tlssus humains e t des tumeurs malignes et b6nlgnes

Les lipides de tumeurs et de tissus comparatifs ont ete etudies par la methode, modifiee par les auteurs, de chromatographie sur colonne et sur couches minces suivant Carroll et Stahl. Les spectres ont permis d'observer jusqu'a 57 tacfies differentes.

1 ) 50 cm3 n-Hexan und 50 cms 5 "/o Ather in Hexan 2) 10 cm3 5 O / o Ather in Hexan und 30 cms 10 O/o Ather in

3) 50 cm3 10°/o Ather in Hexan 4) 30 cms 25 O/o Ather in Hexan 5) 50 cms 25 O/o Ather in Hexan 6) 60 cm3 50 O/o Ather in Hexan und 20 cms 4 O/o Methanol

7) 30 cms 4 0 l o Methanol in Ather 8) 100 cm3 4 O/o Eisessig in Ather 9) 100 cms Chloroform

Insgesamt wurden 100 Gewebe untersucht (Tab. 1 ) .

Die Dunnschicht-Chromatogramme wurden zumeist mit Phosphomolybdat-Perchlorsaure 5 angef arbt. In einzelnen Fi l - len wurde mit Bromkresolgrun bespruht, wobei der Farb- umschlag auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt wurde. Zur Analyse der Fledten wurde eine Halfte der Lipoide aus einem Carzinom katalytisch mit Nickel hydriert (Verbrauch von 13 cms H, bei 9.00 mg Lipoid). Die hydrierte und die nicht behandelte Lipoidprobe wurden sodann chromatogra- phisch getrennt analysiert.

Hexan

in Ather

Tab. 1 Untersudite Gewebe

Vergleichs- entzund- Tumoren gewebe liches gesundes

ohne Tumor Gewebe Gewebe _ _ _ _ ~ -~

Magen 7 > 1 4 Dickda-m 13 6 7 7 Bronchus I3 8 2 1 gutartige Tumoren 11 andere Sarkome 8 andere Gewebe 9

E r g e b n i s s e Abb. 1 zeigt das Lipoidspektrum aus normaler Darm-

schleimhaut, Abb. 2 ein solches aus einem Rektumcarzi- nom. Jeder Fleck mui3 nicht unbedingt einem besonderen

H. Wagner u. H. Horhammer, Dunnschicht-Chromatographie von Phosphatiden und Glykolipoiden, Biochem. Z. 334, 17.5 [ 19611.

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Lipoid zugeordnet werden, insbesondere nicht bei glei- chen Rf-Werten. Andererseits enthalten einige Flecke mehrere Lipoide, insbesondere diejenigen mit Rf-Werten

und l-0. Gewisse Flecken zeigen nach einem Maximum und Minimum ein erneutes Maximum. In zurii&zufiihren. einzelnen Fallen handelt es sich trotzdem um identische Verbindungen, und der beobachtete Effekt beruht auf der veranderten Zusammensetzung des Losungsmittels. In einigen Fallen wird es sich aber um veranderte Eigenschaften der Lipoidsubstanz handeln. Einige Flek- ken sind Artefakte, andere miissen als Aggregate ver- schiedener Verbindungen angesehen werden, wie z. B. Cholesterinester-Fettsauren usw., wie man sie bekannt- lich auch in der Zelloberflache findet.

einem anderen erst mit Methanol in Ather (Fraktion 7) eluiert. Dies ist vermutlich auf die unterschiedlichen Qualitaten des handelsiiblichen Florisils, moglicherweise auf den unterschiedlichen Hydratationsgrad desselben,

Abb. 3. Diinnschicht-Chromatogramm der Lipoide eines Bronchial-Carcinoms

Abb. 1. Dunnschicht-Chromatogramm der Lipoide von ge- sundem Jejunum (Pat. K. 0 2 Tg.)

Abb. 4. Diinnschicht-Chromatogramm der Lipoide aus dem Bronchus

Insgesamt haben wir auch bei diesen Lipoidspektren bis zu 57 verschiedene Flecken (unter den bereits ge- genannten Vorbehalten) beobachten konnen. Die Ver- schiedenheit der in Abb. 5 bisweilen identisch erschei- nenden Substanzen (weil sie mit gleichem Rf-Wert laufen) ergibt sich haufig erst durch unterschiedliche

Abb. 2. Dunnschicht-Chromatogramm der Lipoide eines Rectum-Carcinoms (Pat. S. 8 53 J.)

Im vereinfachten 9 Fraktionen-Chromatogramm treten die gleichen Flecken auf (Abb. 3 und 4). Allerdings kann beim Vergleich verschiedener Versuche beobachtet wer- den, dai3 sich die Triglyceridfraktionen nicht selten un- gleichmafiig aus der Saule losen. In einem Falle wurden sie bereits mit 10°/u Ather in Hexan (Fraktion 3), in

4 3 4

0 370

Farbungen im Dunnschicht-Chromatogramm bzw. dem Ausfall einer mit einer besonderen Nummer versehenen Substanz mit gleichem Rf-Wert in der benachbarten Eluatfraktion. So mussen fur die Substanzen 48 und 49 verschiedene chemische Verbindungen angenommen wer- den, wenn man in einigen Chromatogrammen in der Eluatfraktion 5 einen Fleck 48 findet, in den Fraktionen 6 und 7 nicht mehr, und erst in Fraktion 8 einen Fleck mit gleichem Rf-Wrrt Substanz 41 und 43 sind wahr- scheinlich Carotinoide (hellrot gefarbt). Zur weiteren Analyse der Flecken wurden gesattigte Fettsauren mit steigender Kettenlange chromatographiert. Sie erscheinen auf dem Dunnschicht-Chromatogramm im Gebiete von Fleck 57.

Abb. 6 (links) zeigt das Lipoidspektrum eines Colon- Carcinoms bei Anfarbung mit Saureindikator (Brom- kresolgrun), Abb. 6 (rechts) bei Anfarbung rnit Phos- phomolybdat-Perchlorsaure.

Abb. 6. links: Lipoid-Spektrum eines Colon-Carcinoms; An- farbung mit Bromkresolgrun; rechts: Das gleiche Lipoid- Spektrum; Anfarbung mit Phosphomolybdat-Perchlorsaure

Sauregruppen lassen sich im Gebiete von Fleck 2 dicht oberhalb von Fleck 4, der als Cholesterinester identi- fiziert werden konnte, erkennen. Eine weitere Saure- gruppe findet sich im Gebiete von Fleck 34 und 36, in dem normalerweise Triglyceride erscheinen. Schliedlich zeigt das Gebiet der Flecke 48, 50, 52, 54, 56, 49, 51, 53, 55 und 57 erwartungsgemad eine saure Reaktion, da sich hier die gesattigten und ungesattigten Fettsauren befinden. In 54 ladt sich freies Cholesterin nachweisen. Entweder handelt es sich bei den angefarbten Substanzen in 2, 34 bis 36 um bisher unbekannte Substanzen, oder aber wir finden hier Anlagerungen von Cholesterinestern und Triglyceriden mit Fettsauren. Es ladt sich rnit un- serer Versuchsanordnung nicht feststellen, ob es sich hier um im lebenden Gewebe vorkommende Gruppen oder Artefakte handelt.

Zur weiteren Klarung der Identitat der beobachteten Flecken wurden die Lipoide hydriert und dann chro- matographisch getrennt (Abb. 7).

Abb. 7 . links: Diinnschicht-Chromatogramm der Lipoide eines Sigma-Carcinoms; rechts: Diinnschicht-Chromatogramm der

gleichen Lipoide nach Hydrierung

Es mui3te ausgeschlossen werden, dad einzelne Flecken sich nur durch den vershiedenen Sattigungsgrad der beteiligten Fettsaure unterschieden. Die Probe zeigte nach Hydrierung im Dunnschicht-Chromatogramm neue Flecken, wahrend Fleck 8 bis 20 verschwanden. Die vorhandenen bekannten Lipoide wiesen eine langsamere Elutionsgeschwindigkeit sowie eine verringerte Wander- geschwindigkeit im Dunnschicht-Chromatogramm auf.

Beim Vergleich von Lipoid-Chromatogrammen gleicher Gewebe lieden sich einige bemerkenswerte Einzelheiten feststellen. Selbst unter unveranderten Versuchsbedin- gungen konnten nur dann identische Chromatogramme erzielt werden, wenn aus zwei Anteilen desselben Organs eine Lipoidanalyse durchgefuhrt wurde. In keinem der untersuchten Gewebe konnten alle 57 Lipoide dunn- schicht-chromatographisch nachgewiesen werden. In jedem der Chromatogramme fehlten 5 bis 10 der Substanzen. Auch die Lipoide gleicher Gewebe verschiedener Ver- suchspersonen hatten nicht die gleiche Zusammensetzung. Daraus ist zu entnehmen, dai3 in diesen Fallen mit groder Wahrscheinlichkeit keine Artefakt-Bildung vorliegt, da die Flecken sonst in allen Chromatogrammen zu sehen sein miidten. Quantitative Vergleiche sind bei der ange- wandten Arbeitstechnik nur durch Schatzung der Flecken- grode moglich. Ein absoluter Wert kann nicht angegeben werden. Es ist anzunehmen, dad ein Teil der in geringer Menge vorkommenden Lipoide in vielen Chromatogram- men nur deshalb nicht sichtbar geworden ist, weil die Menge zur Anfarbung zu gering war.

Beim Vergleich der Lipoide bosartiger Tumoren rnit denen der entsprechenden gesunden Gewebe beobachtet man eine Vergrokrung von 1 1 Flecken der Tumorlipoide (3, 11 , 12, 15, 16, 23, 29, 31, 41, 50, 55) und eine Ver- minderung bei 3 Flecken (2, 10, 22). Dieser Befund ist jedoch keineswegs konstant, sondern je nach Fleck nur in 60 bis 8Oo/o der Analysen zu finden. Es besteht keine Beziehung zwischen dem Vorhandensein der Flecken einerseits und dem Alter der Patienten, der Tumor- ausdehnung oder dem histologischen Befunde anderer- seits. Stellt man die Lipoide bosartiger Tumoren den- jenigen aus den nichttumortragenden Anteilen der glei- chen Organe gegenuber, so ladt sich eine Vermehrung bzw. das ausschliedliche Vorhandensein von 14 Flecken beobachten (5, 10, 1 1 , 12, 13, 16, 18, 22, 23, 24, 31, 32, 41, 43), wahrend nur Fleck 2 gegenuber dem nicht- erkrankten Gewebe vermindert ist. Im Gegensatz zu entzundetem Gewebe treten 18 Lipoidsubstanzen bei Malignomen in groderer Menge auf, namlich 3, 4, 5, 10, 1 1 . 12, 13, 14, 16, 21, 23, 31, 32, 33, 34, 38, 43, 50 und 55. Bei einer Gegenuberstellung der Lipoide benig- ner und maligner Tumoren lied sich eine Vermehrung der Lipoide in gutartigen Geschwulsten nachweisen. Bei benignen Tumoren uberwiegen 1, 2, 4, 22, 42, 50, 51, 53. bei malignen 13, 16, 32 und 43.

D i s k u s s i o n Bei den durchgefuhrten Untersuchungen, die verstand-

licherweise nur unter Vorbehalt als quantitativ gelten konnen, liedcn sich in der Phosphatid-freien Fraktion keine fur Carcinom typische Lipoidverbindungen beob- achten. Es traten keine Flecken im Lipoidspektrum auf, die nur in bosartigen Tumoren vorkommen. Einige Flecken sind allerdings in der Regel vergrodert, die im Normal-Chrornatogramm wenig oder nicht zur Anfar- bung kommen. Dieser Befund ist aber nicht ausreichend

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sicher, um als krebstypisch verwertet werden zu konnen. Die angewandte Methode hat den Nachteil, dal3 die untersuchten Gewebe unterschiedliche Anteile von ge- sundem, Krebs- und Bindegewebe enthielten. Selbst ein makroskopisch homogenes Sigma-Carcinom kann bis zu 80 % an normalem Binde- und Epithelgewebe enthalten. Dies erschwert die Aussage erheblich, ob im T u m o r Lipoide enthalten sind, die d a s Vergleichsgewebe nicht enthalt. Allerdings sollten auch trotz solcher Verunreini- gungen ltrebsspezifische Lipoide nachweisbar sein.

Ein Vergleich zwischen Serum und Gewebslipoidspek- t ren’ zeigt, dai3 die Serumlipoidfraktion 12 kaum im

Gewebe (sie entspricht dort Nr. 6 und 7 ) vorkommt. Im Serum beobachten wir auch sehr vie1 mehr Trigly- ceride als in den Geweben, abgesehen von Lipomen und Fettgewebe. Andererseits sind die Fraktionen 33 bis 50 im Gewebe in groi3erer Menge als im Serum vorhanden.

Die vorliegenden Befunde bestatigen im iibrigen die Untersuchungen von F. LindlarO, nach denen es eine harakteristische Lipoidverbindung bei Tumoren nicht gibt. :..I

Lysophosphatide und menschliche Neoplasmen, Klin. Wschr. 40, 1217 [1962].

Zeitschriftenberichte I. Allgemeine Chemie und Tedmologie der Fette,

Analyse R. J. Horvat, W. H. McFadden, H. Ng, D. R. Bladc, W. G. Lane und R. M. Teeter: Die fliichtigen Reaktionsprodukte bei der milden Oxydation von Linolsaure-methylester. Die Ana- lyse durch kombinierte Massenspektrometrie und Gas-Chro- matographie. - Die bei der Autoxydation von Linolsaure- methylester gebildeten fluchtigen Reaktionsprodukte wurden massenspektrometrisch und gas-chromatographisch untersucht. Als wichtigste Komponenten wurden Pentanal, Hexanal, Ameisensaure-amylester, Octansaure-methylester und substi- tuierte Dioxolane nachgewiesen. In kleineren Mengen kamen Ester, Alkohole, Ketone, Aldehyde, Kohlenwasserstoffe und Acetale vor. Bestimmte, in der Literatur angegebene ungesat- tigte Carbonylverbindungen waren nicht nachweisbar (J. Amer. Oil Chemists’ SOC. 42, 1112 [1965]). Schm.

F. D. Hill und E. G. Hammond: Studien iiber den Geruch von autoxydiertem Sojaiil. - Bei der Isolierung der Ge- ruchskomponenten aus einem Sojaiil zu Beginn der Autoxy- dation durch Molekulardestillation fie1 ein Destillat an, das aus einer wagrigen Schicht und einem oligen Film bestand. Der olige Film rief keinen Autoxydationsgeruch hervor, wenn er einem frisch desodorisierten Ul zugesetzt wurde. Durch gas-chromatographishe Analyse des Films konnten Hexanal. Vinylamylketon und trans,cis-2,6-Nonadienal nachgewiesen werden. Die walrige Phase bewirkte in einem desodorisierter. Ul das Auftreten des Autoxydationsgeruchs, der auch in ahn- liher Weise durch Zusatz eines Gemisches aus Vinylathyl- keton und Pentanal hervorgerufen werden konnte. In dem Destillat aus autoxydiertem Sojaol wurde Vinylathylketon als 2,4-Dinitrophenylhydrazon identifiziert (J. Amer. Oil Chemists’ SOC. 42. 1148 r19651). Shm.

H. W. Sprecher, R. Maier, M. Barber und R. T. Holman: Die Struktur eines optisch aktiven Allen-haltigen Tetraester- Triglycerids, das aus dem Samenol von Sapium sebiferum isoliert wurde. - Bei dem optisch aktiven Lipoid aus dem Samenol von S. sebiferum, das bisher als ein Triglycerid mit einer 2,4-Decadiensaure an einer primaren Hydroxylgruppe angesehen wurde, handelt es sich um ein Tetraester-Trigly- cerid. Nach vollstandiger Hydrierung ist eine primare und die sekundare Hydroxylgruppe des Glycerins mit Stearin- saure verestert. An der anderen primaren Hydroxylgruppe befindet sich 8-Hydroxyoctansaure, die wiederum an der w-Hydroxylgruppe mit Decansaure verestert ist. Das Tetra- ester-Triglycerid enthalt als wichtigste Fettsauren Linol- und Linolensaure. Die C,-Hydroxysaure wurde als 8-Hydroxy- 5,6-octadiensaure identifiziert (Biochemistry 4, 1856 119651 ; J. Amer. Oil Chemists’ SOC. 42, 680A [1965]). Schm.

F E T T E * S E I F E N * A N S T R I C H M I T T E L 69. Jahrgang Nr. 10 196)

S. Koritala und H. J. Dutton: Die Hydrierung von Linolen- saurecster XII. Der EinfluS von Losungsmitteln auf die Selektivitat. - Die Selektivitat heterogener Katalysatoren fur die Hydrierung von Linolensaureester wird durch die Anwesenheit bestimmter polarer Losungsmittel erhoht. Bei Verwendung von Dimethylformamid als Losungsmittel und 5 O/o Pd/Al,O,-Katalysator erreicht das Verhaltnis der spezi- fischen Reaktionsgeschwindigkeits-Konstanten fur die Um- wandlung von Linolensaureester in Linolsaureester einen Wert von 4. Die hohe Selektivitat des Dimethylformamids war von der Temperatur und von der Katalysator-Konzen- tration unabhangig. Auch Furfurol, Acetonitril, Tetramethyl- harnstoff und Trimethylphosphat verbessern die Selektivitat (J. Amer. Oil Chemists’ SOC. 42, 1150 [1965]). Schm.

J. M. Lederkremer und R. M. Johnson: Die Reinigung neu- traler Lipoid-Fraktionen dureh Diinnschicht-Chromatographie auf Aluminiumoxyd. - Durch zweistufige Dunnschicht-Chro- matographie auf Aluminiumoxyd G konnen von Triglyceri- den, Cholesterin, Cholesterinestern und Diglyceriden die als Verunreinigung vorhandenen Fettsauren abgetrennt werden. In sehr geringem Umfang findet dabei eine Hydrolyse der Glycerinester statt. Die Methode eignet sich besonders fur Stoffwechselversuche in vitro, bei denen radioaktive Fett- sauren verwendet werden (J. Lipid Res. 6, 572 [1965]; J. Amer. Oil Chemists’ SOC. 42, 680A [1965]). Schm.

C. Y. Bowers, J. G. Hamilton, J. E. Muldrey, W. T. Miya- masu, G. A. Reynolds und A. V. Schally: Die gleichzeitige Bestimmung der Menge und der Zusammensetzung der Tri- glycerid-Fettsauren in 3 bis 10 pl Plasma. - Durch Kombi- nation dunnschicht- und gas-chromatographischer Methoden ist die Isolierung der Triglyceride, die Bestimmung der Tri- glyceride und der Zusammensetzung der Fettsauren sowie die quantitative Analyse der Triglyceride moglih. Die Werte fur die Gesamtmenge der Triglyceride stimmen mit den Daten gut uberein, die man bei der Hydroxamat-Methode fur die Triglycerid-Eluate aus Kieselsaure-Saulen erhalt. Weiter- hin wird eine densitometrische Methode fur die Triglycerid- Bestimmung durch Photometrie der verkohlten Flecke mit- geteilt (J. Amer. Oil Chemists’ SOC. 43, 2 [1966]). Schm.

G. A. E. Arvidson: Die Fraktionierung natiirlich vorkommen- der Lezithine entsprechend ihrem Sattigungsgrad durch Diinnschieht-Chromatographie. - Die Trennung intakter, naturlich vorkommender Lezithine entsprechend ihrem Satti- gungsgrad ist dunnschicht-chromatographisch auf Silikagel- Platten moglich, die mit Silbernitrat impragniert und mehrere Stunden auf 175O bis 180°C erhitzt wurden (J. Lipid RKS. 6, 574 [1965]; J. Amer. Oil Chemists’ SOC. 42, 690A [1965]).

Schm.

7 n!)