raziskave in razvoj

96revijaLes 57(2005) 4

Sistem za analizo slike Lucia G smo upo-

rabili za avtomatsko merjenje dimenzij

trahej na makroskopskih vzorcih hrasto-

vine (Quercus sp.). Predstavljen je prob-

lem priprave povr{ine lesa ter zajem in

urejanje slike za avtomatsko merjenje

premerov, povr{in in obsegov trahej ra-

nega lesa. Med razli~nimi na~ini priprave

vzorcev smo najbolj{e rezultate dobili,

ko smo jih zbrusili z brusnim papirjem

granulacije 320 in povr{ino obarvali s

~rnim alkoholnim flomastrom. V traheje

smo nato vtrli prah bele krede in sliko

posneli z digitalnim fotoaparatom, na-

me{~enim na stereomikroskop ter jo

shranili v formatu TIF. Sliko smo obdelali

z digitalnimi filtri, jo binarizirali in dolo~ili

referen~ni okvir za merjenje. Rezultati

ka‘ejo, da je s programom za analizo slike

Lucia G mogo~e pri ven~astoporoznih

vrstah na makroskopskem nivoju z zado-

voljivo natan~nostjo meriti dimenzije tra-

hej ranega lesa.

System for image analysis Lucia G was

used for measuring vessel dimensions

of oak wood (Quercus sp.) on macro-

scopic level. We present the problem

of sample preparation as well as captur-

ing and processing of images for auto-

matic measurements of diameters, ar-

eas and perimeters of early wood ves-

sels. After testing various methods of

sample preparation we found out that

the best results were obtained when

the samples were sanded with paper

of granulation 320 and the surface sta-

ined with black alcohol marker. Vessel

lumina were then filled with white chalk

dust, and finally the images were captu-

red by a digital camera attached to a

stereo microscope and saved in TIF for-

mat. We improved the images by using

digital filters, converted them to binary

images and defined measurement

frames. The results confirmed that the

image analysis system Lucia G enables

measurements of early wood vessel di-

mensions in ring porous species on

macroscopic samples with satisfying

accuracy.

Klju~ne besede: analiza slike, hrast,

Quercus sp., les, traheje

Key words: image analysis, oak,

Quercus sp, wood, vessels

UVOD

Analiza slike je ra~unalni{ko podprtatehnika, ki omogo~a pretvorbo slikov-ne (vidne) informacije v {tevilske po-datke (prim. Levani~, 1999). V ana-tomiji lesa jo lahko med drugim upo-rabljamo za merjenje razdalj, dimenzijcelic in ugotavljanje dele‘ev celi~nihlumnov ter sten na mikroskopskemnivoju. Analiza slike se ‘e ve~ let uspe{-no uporablja za raziskave lesa iglavcevin listavcev. Tako so npr. raziskovaliles vrst Pinus sylvestris (Reme in Helle,2002), Picea abies (Spiecker et al.,2000, Reme in Helle, 2002), Abies alba

(^ufar in Vilhar, 2004), Fagus sylvatica

(Sass in Eckstein, 1995), Quercus sp.

(Spiecker et al., 2000, Garcia-Gonza-lez in Eckstein, 2003) ter Castanea sa-

tiva (Fonti in Garcia Gonzalez, 2004).

Danes trg po dostopni ceni ponuja ve~komercialnih sistemov za analizo slike,vendar {e nobeden ni prirejen izklju~-no za specifi~ne potrebe anatomije le-sa. V Katedri za tehnologijo lesa upo-rabljamo sistem Lucia G, ki so garazvili za raziskave v biologiji, medi-

Merjenje dimenzij trahej hrasta(Quercus sp.) na makroskopskemnivoju s sistemom za analizo slike -LUCIA GMeasuring vessel dimensions in oak wood (Quercus sp.) on macroscopic level withimage analysis system - LUCIA G

avtorji: Maks MERELA, LIP Radomlje d.d., Pelechova 15, Radomlje in Biotehni{ka fakulteta, Oddelek zalesarstvo, Ro‘na dolina VIII/34, 1000 Ljubljana Primo‘ OVEN, Katarina ̂ UFAR, Biotehni{ka fakulteta, Oddelekza lesarstvo, Ro‘na dolina VIII/34, 1000 Ljubljana

izvle~ek/Abstract

originalni znanstveni ~lanek (Original Scientific Paper)UDK: 630*811.14:630*176.1 Quercus sp.

97revijaLes 57(2005) 4

raziskave in razvoj

cini, kristalografiji itd. Analiza slikevklju~uje izbiro in pripravo objekta,zajem in obdelavo slike ter merjenjeizbranih struktur, ki je lahko polavto-matsko ali avtomatsko. Polavtomatskomerjenje poteka tako, da izmerimovsak objekt (celico) posebej, za avto-matsko merjenje pa si izberemo dolo-~eno povr{ino na sliki in program sa-modejno izmeri vse objekte, ki so vizbranem obmo~ju. Metoda omogo~aenostavno in hitro merjenje objektov,kar je bistvena prednost pred zamud-nej{im ro~nim merjenjem z merilnimiplo{~icami. Rezultat analize slike jepreglednica s {tevilskimi podatki(prim. Levani~, 1999).

Celice obi~ajno merimo na anatom-skih preparatih, ki jih opazujemo ssvetlobnim mikroskopom (npr. Zorec,2004, ^ufar in Vilhar, 2004). V temprimeru praviloma pridobimo kvali-tetne slike tkiv, pomanjkljiva pa stazamudna priprava preparatov in rela-tivno majhna povr{ina tkiva za mer-jenje. Izjemno pomembna je tudi meto-dologija obdelave slike. Zorec (2004)je raziskoval uporabo digitalnih filtrovprograma Lucia G in njihov vpliv napotek in variabilnost meritev, torej narezultate analize slike. Predlagal jekombinacijo digitalnih filtrov, s kateri-

mi na mikronivoju lahko izbolj{amonatan~nost meritev.

V pri~ujo~i {tudiji smo ‘eleli sistemza analizo slike Lucia G uporabiti zamerjenje makroskopskih vzorcevhrastovine (Quercus sp.). Cilj nalogeje predstaviti problematiko pripravepovr{ine lesa ter zajema in urejanjaslike za avtomatsko merjenje preme-rov, povr{in, in obsegov trahej ranegalesa.

MATERIAL IN METODE

PRIPRAVA MATERIALA, ZAJEM

IN KALIBRACIJA SLIKE

Za raziskave smo uporabili zra~nosuhe vzorce hrastovine (Quercus sp.).Pre~ne povr{ine vzorcev smo zbrusilina tra~nem brusilnem stroju z brusil-nimi papirji granulacije 80, 120, 180,240 in 320. Na tako pripravljenih po-vr{inah je bilo mogo~e s stereomikro-skopom razlo~iti vse anatomske struk-ture: traheje ranega in kasnega lesa,trakove, vlakna, traheide ter aksialniparenhim (slika 1 a), ki jih navadnoopazujemo s svetlobnim mikrosko-pom (slika 1b).

Da bi dosegli ve~ji kontrast med tra-hejami in preostalim tkivom, smo glad-ko zbru{eno povr{ino lesa {e dodatnoobdelali. Obarvali smo jo z barvili, kijih sicer uporabljamo za barvanje ana-tomskih preparatov (astra modro, saf-ranin, fast green in toluidin modro).Poleg tega smo vzorce lesa obarvalitudi z rde~im in ~rnim flomastrom naalkoholni in vodni osnovi. Po barvanjusmo na povr{ino natresli prah belekrede in ga narahlo utrli v pore. Takosmo dosegli bolj{i kontrast med beli-mi, s kredo zapolnjenimi porami, inpreostalim temno obarvanim tkivom.Na sliki 2 so prikazani pre~ni prerezilesa hrasta, obarvanega z razli~nimibarvili. Velikost vidnega polja je bila10,8 x 8,1 mm.

Slika 1. Pre~na prereza hrastovine: (a) gladko obdelana povr{inalesa, kot jo vidimo s stereomikroskopom, (b) posnetek 20 µmdebelega anatomskega preparata (Quercus robur L.), posnetega ssvetlobnim mikroskopom. Zaradi la‘je obdelave in analize je slika,zajeta s stereomikroskopom, (a) usmerjena tako, da je rani les nalevi strani.

Slika 2. Zbru{ena pre~napovr{ina lesa hrasta (Quercussp.) po obarvanju z: a)toluidin modrim barvilom, b)rde~im in c) ~rnim alkoholnimflomastrom

raziskave in razvoj

98revijaLes 57(2005) 4

Vzorce smo opazovali s stereomikro-skopom Olympus SZ-PT, ki omogo~azvezno spreminjanje pove~ave. Vna{em primeru se je izkazal kot najboljsmiseln zajem slike pri najmanj{i (6,8x) pove~avi, tako da je bil premer vid-nega polja 12 mm. Na ta na~in smodosegli dobro lo~ljivost trahej ranegalesa in dokaj veliko vidno polje. Slikesmo zajeli z digitalnim fotoaparatomNikon Coolpix 995, name{~enim nastereomikroskop.

Sliko smo umerili tako, da smo izme-rili znano razdaljo med dvema to~ka-ma na merilni plo{~ici, ki smo jo po-lo‘ili na opazovani objekt. Ta podateksmo uporabili za kalibracijo slike,preden smo jo obdelali v programuLucia G in na njej opravili meritve.

OBDELAVA SLIKE IN MERJENJE

Ker ra~unalni{ki paket Lucia G pod-pira ve~ino slikovnih formatov, smonadaljnje korake obdelave opravili navzporednih slikah, shranjenih v for-matih TIF in JPG. Sliko smo v nada-ljevanju obdelali z digitalnimi filtriprograma Lucia G. Najprej smo izbolj-{ali kontrast, svetlost in ostrino sliketer intenzivnost barv. Tako smo doseglinajve~ji kontrast ter izostrili meje medtrahejami in okoli{kim tkivom.

Pri zajemu slike s stereomikroskopomsmo opazili, da rob slike ni oster, karje posledica pomanjkljivosti optike inneravnosti objekta. Ostrina vpliva nanatan~nost meritev, zato smo za mer-jenje izbrali le osrednji del slike, ozna-~en z okvirom (slika 3b).

V naslednjem koraku smo opravili kla-sifikacijo oz. binarizacijo slike. To jepostopek, ki pretvori strukture na slikiv bele in ~rne piksle. Ta faza je v analizislike najpomembnej{a, saj dolo~i,kateri piksli nosijo informacijo (so delstruktur, ki jih merimo) in kateri ne(prim. Levani~, 1999). V na{em pri-meru so bili beli piksli nosilci infor-

macij (bele traheje), ~rni pa so del sli-ke, ki ni vklju~en v merjenje (slika 4).Pred meritvami, ki potekajo samo nabinarizirani sliki, smo preverili, ~e sokot nosilci informacij ozna~ene samostrukture, ki jih ‘elimo meriti (lumnitrahej ranega lesa). Ker so se belo obar-vale tudi razpoke in traheje kasnegalesa, smo opravili popravke z digital-nimi filtri.

Slika 4 prikazuje binarizirano sliko potem, ko smo jo obdelali z digitalnimifiltri iz menija programa Lucia G.

Meritve so potekale na binariziranisliki, kjer so bile kot nosilci informacijozna~ene samo strukture, ki smo jih‘eleli meriti. Podro~je merjenja smodolo~ili z okvirjem (slika 4). V ta na-

men smo uporabili ukaz View Frame.Okvir lahko nastavimo ro~no ali pa gadolo~imo z ukazom Measurement Fra-me, kjer vtipkamo natan~no pozicijoin dimenzijo podro~ja.

Ko smo na dokon~no obdelani slikidolo~ili okvir za merjenje, smo izbraliparametre merjenja na nosilcih infor-macij (trahejah ranega lesa). ProgramLucia G omogo~a merjenje kar 44razli~nih parametrov. V na{i raziskavismo merili samo premere, obsege inpovr{ine lumnov trahej ranega lesa.Poleg merjenih parametrov smo dobilitudi podatek o {tevilu izmerjenih trahejin o povr{inskem dele‘u trahej namerjeni povr{ini. Merjenje je potekalopopolnoma avtomatsko. Rezultati so

Slika 3. Zbru{ena pre~na povr{ina lesa hrasta (Quercus sp.) a)neobdelana slika po zajemu in b) slika, obdelana z digitalnimi filtri.Slika je najbolj ostra znotraj okvira.

Slika 4. Binarizirana slika pre~nega prereza hrasta (Quercus sp.).Okvir na sliki prikazuje obmo~je merjenja (rani les dveh branik).

99revijaLes 57(2005) 4

raziskave in razvoj

se izpisali v preglednici, ki smo jo pre-nesli v program Microsoft Excel zanadaljnjo obdelavo.

Vse uporabljene korake obdelave slikein merjenja smo si na koncu poenosta-vili s pisanjem “makrov”, ki so namomogo~ili avtomatsko izvajanje sosled-ja ukazov z dolo~enimi nastavitvami.

REZULTATI IN

DISKUSIJA

Pri uporabi razli~nih na~inov za obde-lavo povr{ine lesa smo ugotovili, danajbolj{e rezultate dobimo, ~e les zbru-simo z brusnim papirjem granulacijevsaj 320. Na ta na~in smo dobili gladkopovr{ino in ostro sliko z razlo~nimicelicami v lesu. Pregled slik je pokazal,da najbolj{i kontrast med celi~nimistenami in porami dose‘emo z uporabo~rnega alkoholnega flomastra, zado-voljiv kontrast pa dobimo tudi z upo-rabo rde~ega flomastra. Barvila, ki seuporabljajo za barvanje anatomskihpreparatov, so se izkazala kot manj pri-merna. Za dosego kontrasta smo mo-rali uporabiti prah bele krede in ga vtre-ti v pore. @al je kreda zapolnila tudirazpoke v lesu, kar je motilo nadaljnjoobdelavo slike in merjenje.

Zajem slike smo v na{em primeru opra-vili s stereomikroskopom in digitalnimfotoaparatom ter dobili kvalitetne “sta-ti~ne” slike, ki smo jih pred obdelavoin merjenjem shranili na trdi disk.

Sliko smo zajeli tudi z digitalno kame-ro in dobili t.i. “‘ivo” sliko. Objekt smopomikali skozi vidno polje mikrosko-pa in sproti spremljali sliko povr{inena monitorju ra~unalnika, pri ~emerslike ni bilo treba shraniti. Takoj kosliko za~nemo obdelovati z digitalnimifiltri, postane stati~na (zamrznjena), dalahko na njej opravimo meritve. Poopravljeni meritvi se lahko vrnemo na-zaj na ‘ivo sliko in se zopet prestavimona novo podro~je merjenja. Metoda“‘ive” slike s kamero se je izkazala kot

zelo primerna za merjenje ve~je povr-{ine oz. ve~jega {tevila branik na istemvzorcu.

Preverili smo tudi mo‘nost zajema slikz opti~nimi ~italci (skenerji). Izkazalose je, da na ta na~in lahko zajamemove~jo povr{ino lesa. Skeniranje mora-mo izvesti pri visoki resoluciji (nad 600dpi). Slika zadovoljive kvalitete je bilazelo velika (ve~ MB), zato sta bila obde-lava in merjenje objektov po~asnej{a.

Med vsemi preverjenimi metodami seje za merjenje dimenzij celic (trahej prihrastu) izkazala za najprimernej{ometoda zajema slike s stereomikro-skopom in digitalnim fotoaparatom,ker so bile tako meje med lumni in ce-li~nimi stenami najbolj jasne in tudikalibracija slike je bila najbolj na-tan~na.

Med razli~nimi formati slik, ki smojih preverili, se je kot najprimernej{iizkazal format TIF, ki je na sliki ohranilvse informacije, pomembne za analizo.Preverili smo tudi uporabo formataJPG, kjer se je izkazalo, da je pri shra-njevanju slike pri{lo do izgube dolo-~enih informacij, pomembnih za merje-nje oz. nadaljnjo obdelavo slike.

Za avtomatsko merjenje dimenzij jenujna binarizacija slike, kjer dolo~imodelce na sliki, ki so nosilci informacije,in jih ‘elimo izmeriti. V na{em prime-ru je binarizirana slika vsebovala veliko“{umov”. To so bili objekti na sliki, kiniso bili nosilci relevantne informacije,a jih je ra~unalni{ki sistem prepoznalkot tak{ne (traheje kasnega lesa, aksi-alni parenhim, razpoke). Ve~ino {umovsmo lahko odpravili avtomatsko z digi-talnimi filtri. V na{em primeru smonajbolj{e rezultate dobili po uporabidigitalnih filtrov iz menija programaLucia G: Erode Binary (1,2), DilateBinary (1,2), Clean Binary (2,2), CloseHoles Binary (4,2), Fill Holes, Mor-pfho Separate Objects (15,100). Zuporabo teh filtrov smo s slike pre~ne

povr{ine hrastovine odstranili trahejekasnega lesa in druge manj{e strukture,ve~je razpoke pa smo odstranili “ro~–no” z orodjem Image Edit. Slednjiomogo~a popravljanje slike na podo-ben na~in kot programi za risanje, kjerlahko dori{emo in izbri{emo strukturena sliki.

Ko smo sliko dokon~no obdelali, smoizmerili premere, obsege in povr{inelumnov trahej ranega lesa. Po zamudnipripravi objekta, zajemu in binari-ziranju slike je bilo merjenje opravljenoizredno hitro.

Na sliki 5 prikazujemo primer rezul-tatov meritev, ki so se izpisali v poseb-nem okvir~ku ob sliki. Ukaz ObjectData je odprl pogovorno okno, v ka-terem so izpisani podatki meritev inosnovna statistika (povpre~na vred-nost, standardni odklon ter minimalnain maksimalna vrednost). ProgramLucia G omogo~a tudi izpis grafa fre-kven~ne porazdelitve, v na{em pri-meru frekven~ne porazdelitve povr{inlumnov trahej ranega lesa (slika 5). Vsepodatke smo za nadaljnjo obdelavoizvozili v program Excel, mo‘en pa jetudi izvoz v druge programe.

Slika 4 prikazuje rani les dveh branik,kjer smo merili lumne trahej ranegalesa. V preglednici 1 je prikazanaosnovna statistika meritev, kjer lahkovidimo, da smo na povr{ini 25 mm2izmerili 92 trahej s povpre~nim preme-rom 233 µm, povpre~no povr{ino 50 x103 µm2 in povpre~nim obsegom 798µm. Dele‘ trahej na povr{ini je bil 0,18.

Iz preglednice 1 je razvidno, da smoizmerili traheje ranega lesa premeraod 34 do 499 µm. Minimalne dimen-zije merjenih objektov nastavljamo sfiltrom Clean Noise in o~itno smo vna{em primeru merili tudi nekaj trahejkasnega lesa. Da bi preverili natan~-nost meritev, smo svoje rezultate pri-merjali s podatki iz literature. Wagen-

raziskave in razvoj

100revijaLes 57(2005) 4

führ (1996) za dob (Quercus robur L.)navaja tangencialni premer trahej ra-nega lesa od 150 do 350 µm in kasnegalesa od 30 do140 µm. Grosser (1977)za rani les navaja premere trahej do 400µm, za kasni les pa med 20 in 30 µm. V{tudiji, opravljeni na velikem {tevilubranik doba (Quercus robur L.), staGarcia-Gonzales in Eckstein (2003)pri analizi trahej ranega lesa izmerilatraheje premera od 80 do 565 µm.^eprav je bila na{a raziskava metodo-lo{ke narave in meritev nismo ponovilina velikem {tevilu vzorcev, so na{e me-ritve primerljive z navedenimi.

Na osnovi tovrstnih meritev sta Gar-cia-Gonzales in Eckstein (2003) ugo-tovila tesno zvezo med koli~ino pa-davin in povr{inami trahej ranega lesav posameznem letu. Podobno sta Fontiin Garcia-Gonzalez (2004) pokazala,da sta {tevilo in povr{ina trahej ranegalesa pri doma~em kostanju (Castanea

sativa) v tesni zvezi s temperaturamiin padavinami v letu nastanka lesa.Obe {tudiji sta pripomogli k bolj{emrazumevanju povezave med anatomskozgradbo lesa in ekolo{kimi razmerami,v katerih je drevo raslo, ter nakazujeta,da bo v prihodnje analiza slike {e boljnepogre{ljiva v raziskavah lesa.

Na{i rezultati ka‘ejo, da je z analizoslike na makroskopskem nivoju, vsajpri ven~astoporoznih vrstah, mogo~edovolj natan~no meriti dimenzije tra-hej ranega lesa. To pravzaprav pomeni,da se za nekatere histometri~ne analizelesa z opisano pripravo povr{ine lesalahko izognemo zamudni pripravi ana-tomskih preparatov. S tem je omogo-~eno hitro merjenje ve~jega {tevila vzor-cev pri obse‘nej{ih analizah. Delo sprogramom Lucia G je mogo~e poe-nostaviti tudi s pisanjem “makrov”, kiomogo~ajo avtomatsko izvajanje so-sledja ukazov z dolo~enimi nastavit-vami.

Literatura

Slika 5. Izpis rezultatov meritev in graf frekven~ne porazdelitve

Preglednica 1. Rezultati merjenja lumnov trahej ranega lesa dvehzaporednih branik (Quercus sp.) - podatki so podani v µm

Number of Fields 1

Number of Objects 92

Objects per Field 92

Measured Area 2,5524e+007 [µm2]Objects per Area 3,6078e-006 /[µm2]Area Fraction 0,180643

Feature Mean St.Dev Minimum Maximum

MinFeret 190,5 78,4 34,4 344,4

MaxFeret 300,8 127,1 52,9 498,9

EqDiameter 232,9 98,4 43,0 416,0

Area 50.116,4 34.955,2 1.450,1 135.911,0

Perimeter 797,9 336,6 133,3 1396,9

literatura

1. ^ufar K., Vilhar B. 2004. Quantitative evaluation of

wood anatomy in silver fir (Abies alba Mill.) withimage analysis. Phyton Horn, (In print).

2. Fonti P., Garcia Gonzales I. 2004. Suitability ofchestnut earlywood vessel chronologies for ecologi-cal studies. New Phytologist, 163:77 - 86.

3. Garcia Gonzales I., Eckstein D. 2003. Climaticsignal of earlywood vessels of oak on a maritime site.Tree Physiology, 23:497 - 504.

4. Grosser D. 1977. Die Hölzer Mitteleuropas. Ein mikro-photographischer Lehratlas. Springer-Verlag Berlin,Heidelberg, New York, 208 s.

5. Levani~ T. 1999. Ra~unalni{ko podprta analiza slike

mikro - in makro objektov. Zbornik gozdarstva inlesarstva, 59: 141 - 167.

6. Reme P.A., Helle T. 2002. Assessment of transversedimensions of wood tracheids using SEM and imageanalysis. Holz als Roh - und Werkstoff, 60: 277-282.

7. Sass U., Eckstein D. 1995. The variability of vesselsize in beech (Fagus sylvatica L.) and its ecophysi-ological interpretation. Trees - Structure and Func-tion. 9: 247-252.

8. Spiecker H., Schinker M.G., Hansen J., Park Y.I.,Ebding T., Döll W. 2000. Cell structure in treerings: novel methods for preparation and imageanalysis of large cross sections. IAWA Journal. 21:361-373.

9. Wagenführ R. 1996. Holzatlas, Fachbuchverlag,Leipzig, 688 s.

10. Zorec A. 2004. Merjenje dimenzij celic lesa s pro-gramom za analizo slike. Diplomska naloga. Ljubljana,Biotehni{ka fakulteta, Oddelek za lesarstvo: 59 s.