Ubikvitinový systém pro degradaci proteinů a některé z jeho funkcí při kontrole BC

AVRAM HERSHKO

• 1937 Karcag, Maďarsko

• 1950 Izrael

• Faculty of Medicine at the Technion in Haifa

• 2004 Nobelova cena za chemii

• University of California, San Francisco• Mechanismus indukce syntésy tyrosin-

aminotransferasy (TAT) vlivem steroidních hormonů v kultivovaných jaterních buňkách

• Degradace TAT (1969-71)

Gordon Tomkins

• 1939 izotopové značení 15N-Leucin

• Méně než 1/3 izotopů nalezeno v moči => většina zabudována do proteinů tkání

• Stálá váha zvířat – dynamická výměna proteinů

• Degradace abnormálních a poškozených proteinů

Rudolf Schönheimer

(BRD, 1898-1941)

První pokus

• Výměna média – rychlý pokles

• Poločas rozpadu 2-3h

• Degradace zastavena inhibitory tvorby energie v buňce (KF a další)

• Potvrzovalo studii Simpsona o spotřebě En. při uvolňování AMK z proteinů v játrech

• Nepřímý důkaz, En. nutná pro udržení kyselého pH v lysozomu

• Pohlcení lysozomem ne, degradace TAT vyžaduje specifický enzym

• Spotřeba ATP ( neobvyklý proces – existence intracelulárního proteolytického systému)

• Hledání příčin potřeby energie v Izraeli• Využití klasické biochemie - Reakce buněčných lyzátů ve zkumavkách

věrohodně reprodukující procesy- Frakcionace a oddělování komponent- Čištění a charakterizace komponent- Rekonstrukce systému z izolovaných

přečištěných jednotek

Proerytroblast → Basofilní erytroblast → Polychromatofilní erytroblast → Ortochromatický erytroblast → Retikulocyt → Erytrocyt

Proteolytický systém z lyzovaných retikulocytů závislý na ATP

(1977)

Alfred Goldberg

Joseph Etlinger

• Rozdělení lyzátu do 2 frakcí na diethylaminoethyl (DEAE-) celulóze

• Frakce 1 obsahuje látky neadsorbované - hemoglobin (vyčištění)

• Frakce 2 uvolněná solným roztokem, obsahuje nehemoglobinové proteiny

• Samostatně frakce nejevily aktivitu, opětovnou kombinací počala ATP-dependentní degradace

• Aktivní složka ve frakci 1 byla malá, teplotně stabilní molekula

• Pojmenovaná APF-1 (ATP-dependent Proteolysis Factor 1)

• Identita APF-1 a ubikvitinu potvrzena 1980 Wilkinsnem

Aaron Ciechanover

Irvin Rose

Izolace a charakterizace komponent ATP-dependent proteolytic system from reticulocyt lysates

Ubikvitin – funkce a vazba• První izolace Goldsteinem při zkoumání

hormonů brzlíku• Postupně objeven ve všech tkáních a všech

eurkaryotických organismech (ubiqity = všudypřítomný)

• Funkce neznámá• Malá molekula z frakce 1 = domněnka regulační

podjednotky neznámého enzymu z frakce 2

• Radioaktivně označený ubikvitin byl přidán k frakci 2 za přítomnosti i nepřítomnosti ATP• Gelovou chromatografií bylo zjištěno spojení s velkou vysokomolekulární látkou • Navázán kovalentní peptidovou vazbou• Ubikvitin se váže na velké množství proteinů (SDS-page)

• Ubikvitin označený 125I byl inkubován s neoznačenými lysozomy a naopak a po rozdělení • Ubikvitin se váže na substrát, který má být rozložen ATP-dependentním proteolitickým systémem (např. lysozomem)

Původní předpoklad

Jak je ubikvitin navázán na proteiny?10 let práce, podstata návrhu správně

Sled 3 enzymů – E1: ubikvitin aktivující– E2: přepravce ubivitinu– E3: ubikvitin ligasa

Funkce enzymů

• E1 zajistí aktivaci karboxylového konce glycinového zbytku ubikvitinu pomocí ATP a následuje připojení aktivovaného ubikvitinu do thiolového vazebného místa enzymu E1 thioleserovou vazbou

• Transacylací je aktivovaný ubikvitin přesunut do SH místa enzymu E2, který přenese ubikvitin až k – NH2 skupině cílového proteinu

• Navázání na protein probíhá pomocí enzymu E3, který je substrátově specifický

• Velký počet E3 enzymů

• Proteiny s navázanými řetězci ubikvitinů jsou rozloženy v proteozomovém komplexu (26S)

• Ubikvitin je uvolněn ubikvitin-C-terminální hydrolasou nebo isopeptidasou

http://plantsubq.genomics.purdue.edu/plantsubq/images/26S_Proteasome.png

1990 Jak je degradace specifických buněčných proteinů obstarávána ubikvitinovým systémem v selektivních a

regulovaných dějích?

- Pozitivně regulující jednotka Cdc2 (Cdk1)

- Komplex Cdk1-cyklin B = MPF, podporuje vstup do mitosy

- Inaktivace MPF = degradace cyklinu B, nutné pro opuštění mitosy

Jaký je systém degradace cyklinu B a proč pouze na konci mitosy?

Mechanismus degradace cyklinu B a objeveni APC/C komplexu

Cyklin B

Spisula solidissima (Surf clam)

• Produkce velkého počtu oocytů

• Luca a Ruderman vytvořili bezbuněčný systém z oplozených oocytů, který reprodukoval specifická stádia BC degradace mitotických cyklinů

• Pomoc Roberta Palazza, Leonarda Cohen, Joan Ruderman.

Joan Ruderman

(USA)

Frakcionace systému prokázala výskyt dvou komponent důležitých pro navázání ubikvitinu k cyklinu B (E2-C, E3-like activity)

E3-like activity: 1500 kDa komplex, který váže ubikvitin na mitotické cykliny, oscilující v BC, inaktivní v interfázi a aktivní na konci mitosy. K aktivitě potřebuje přítomnost MPF (Cdk1-cyclin B).

Název ubikvitnové ligasy cyklosom

Podobná zjištění:

• Kirschner team – Xenopus eggs

Anaphase-Promoting Complex

• Nasmyth team – Yeast

Anphase-Promoting Complex / cyclosome = APC/C

Degradace mnoha regulátorů BC

(securin – inhibitor počátku anafáze)

Kontrolní bod dělícího vřeténka

(dovoluje rozchod chromatid pouze po řádném připojení na vřeténko)

Degradace Cdk inhibitoru p27Kip1

p27 způsobuje zastavení buňky v G1-fázi,

zabraňuje vstupu do S (inhibuje Cdk2-cyklin A

a Cdk2-cyklin E)

p27Kip1 univerzální inhibitor pro všechny

cyklin-Cdk komplexy

Prokázána degradace p27 ubikvitinovým systémemPokusy pro identifikaci ubikvitin-ligasového systému označujícího p27 k degradaci, in vitro na HeLa buňkách

• p27 se vázal na uvikvitin v extraktu rostoucích buněk více než v buňkách „uzamčených“ v G1

• Prokázána nutnost fosforylace p27 na T187, komplexem Cdk2-cyklin E pro ligaci p27-ubikvitin in vitro => kompetentní systém in vitro se stejnými pochody jako in vivo

Identifikace enzymu E3 – ubikvitinové ligasy

Přepoklad nutné přítomnosti SCF (Skp1-Cullin1-F-box protein) kvůli fosforylaci p27 substrátu

Michele Pagano

SCF komplexy

- velká rodina ubikvitin-protein ligáz

- variabilní F-box podjednotka rozpoznává příslušný fosforylovaný proteinový substrát

Objev Skp2 proteinu (S-phase kinase-associated protein 2) = specifický F-boxu pro SCF, který připojuje ubikvitin k p27

Navázání ubikvitinu na p27• Vyvázání Skp2 protilátkou z extraktu proliferujících buněk = zrušení

vazné aktivity p27-ubikvitin

• Dodaná rekombinantní vyčištěná Skp2 kompletně obnovila navázání ubikvitinu na p27

• In vitro důkaz: vazba p27 na Skp2 závisí na fosforylaci p27 na T187 (In vivo popsal Pagano lab) => Skp2 je specifický a limitující faktor SCF komplexu, který předurčuje p27 k degradaci

• Oscilace Skp2 v BC: v G1 velmi nízký, roste před vstupem do S a dále jen klesá

• Pokus o sestavení komlexu z jednotlivých komponent (Cullin, Skp1,Skp2, Roc1, Cdk/cyclin E, E1 a E2)

• Chyběla Cks1 (cyklin kinase subjunit 1)• Patří do konzervativní rodiny proteinů Suc1/Cks, jako

jediný z rodiny váže Cdk k fosforylovanému proteinu• Pro regulaci BC nezbytná

Rodina Suc1/Cks a Cks1• Pouze Cks1 podmiňuje vazbu p27-ubikvitin v uměle

poskládaném systému přečištěných komponent• Ostatní Suc1/Cks proteiny mají vazebná místa pro Cdk a

aniontové vazebné místo• Cks1 se dokáže navázat na Skp2 a podporuje spojení Skp2 s

fosforylovaným p27 na T187• Cks1 má tři vazebná místa, všechna nutná k asociaci Skp2 na

T187-fosforylovaný p27

Apeluje na propojení genetiky s biochemií!