metody separace proteinů
DESCRIPTION
Metody separace proteinů. Literatura. Anzenbacher , Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky. MŠ Praha, 1986. Ferenčík, Škárka : Biochemická laboratorní technika. Alfa Bratislava 1981. Literatura. Separace. kvalitativní Analytické - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/1.jpg)
Metody separace proteinůMetody separace proteinů
![Page 2: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/2.jpg)
LiteraturaLiteratura
Anzenbacher, KovářAnzenbacher, Kovář : Metody : Metody chemického výzkumu pro chemického výzkumu pro biochemiky. biochemiky. MŠ Praha, 1986.MŠ Praha, 1986.
Ferenčík, Škárka Ferenčík, Škárka : Biochemická : Biochemická laboratorní technika. laboratorní technika. Alfa Bratislava Alfa Bratislava 1981. 1981.
![Page 3: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/3.jpg)
LiteraturaLiteratura
![Page 4: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/4.jpg)
SeparaceSeparace
kvalitativní kvalitativní
Analytické Analytické
kvantitativníkvantitativní
PreparativníPreparativní
Charakterizace – pI, MW, spektra, AMK …Charakterizace – pI, MW, spektra, AMK …
![Page 5: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/5.jpg)
Separační metodySeparační metody
Vychází z klasických metod Vychází z klasických metod chemické analýzychemické analýzy
Uplatňují se zde i speciální Uplatňují se zde i speciální metodymetody
![Page 6: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/6.jpg)
Problémy se vzorkemProblémy se vzorkem
KomplexnostKomplexnost
Malá množstvíMalá množství
LabilitaLabilita
![Page 7: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/7.jpg)
Zásady pro práci s biologickým Zásady pro práci s biologickým materiálemmateriálem
1.1. TeplotaTeplota
2.2. pH + iontová sílapH + iontová síla
3.3. KoncentraceKoncentrace
4.4. PěněníPěnění
5.5. Lokální přebytkyLokální přebytky
6.6. Proteasy, RNAsy, Proteasy, RNAsy, DNAsyDNAsy
![Page 8: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/8.jpg)
Separace bílkovinSeparace bílkovin
![Page 9: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/9.jpg)
Plánování separacePlánování separace
![Page 10: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/10.jpg)
Cíl izolaceCíl izolace
Získání homogenní bílkovinyZískání homogenní bílkoviny Zachování biologické aktivityZachování biologické aktivity ČistotaČistota
ZávěrZávěr : získat vzorek o patřičné : získat vzorek o patřičné
čistotě s vynaložením čistotě s vynaložením
patřičného úsilípatřičného úsilí
![Page 11: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/11.jpg)
Volba vstupního materiáluVolba vstupního materiálu
Preparát z daného organismuPreparát z daného organismu
Preparát s největším obsahem Preparát s největším obsahem dané bílkovinydané bílkoviny
Preparát s nejmenším obsahem Preparát s nejmenším obsahem nečistotnečistot
![Page 12: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/12.jpg)
Volba a kombinace separačních Volba a kombinace separačních metodmetod
SelektivitaSelektivita Rozlišovací schopnostRozlišovací schopnost KapacitaKapacita Zpětný výtěžekZpětný výtěžek Náklady – materiál, přístroje, člověkNáklady – materiál, přístroje, člověk Stupeň zřeďování a koncentraceStupeň zřeďování a koncentrace Slučitelnost mezi metodamiSlučitelnost mezi metodami Znalosti o dané bílkovině (pI, MW)Znalosti o dané bílkovině (pI, MW)
![Page 13: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/13.jpg)
Základní zásadyZákladní zásady
Na začátek zařadit metody s vysokou Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením rozlišením velké množství levného velké množství levného vstupního materiáluvstupního materiálu
Později metody s vysokým rozlišením a Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná výtěžkem, kapacita méně významná
ve vzorku již investovaná práceve vzorku již investovaná práce
![Page 14: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/14.jpg)
Pořadí volit tak, aby metody na Pořadí volit tak, aby metody na sebe vhodně navazovalysebe vhodně navazovaly
Metody zřeďovací kombinovat s Metody zřeďovací kombinovat s metodami koncentrujícímimetodami koncentrujícími
Metody nepoužívat opakovaněMetody nepoužívat opakovaně
![Page 15: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/15.jpg)
Sledování průběhu separaceSledování průběhu separace
Metoda Celková bílkovina
Celková aktivita
Specifická aktivita
Přečištění Výtěžek
extrakt 100 100 1 - 100 %
HIC 50 99 1.99 1.99 99 %
IEX 25 75 3 1.5 75 %
![Page 16: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/16.jpg)
Sledování průběhu separaceSledování průběhu separaceSDS PAGESDS PAGE
![Page 17: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/17.jpg)
Stanovení koncentrace Stanovení koncentrace bílkovinybílkoviny
na stanoveníkoncetrace dusíku
na základěoptických vlastností
na základěelektrochem ických vlastností
Metoda založená
![Page 18: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/18.jpg)
Kjeldahlova metoda – stanovení Kjeldahlova metoda – stanovení NN22
Mineralizace vzorku – převedení Mineralizace vzorku – převedení
organického N na organického N na NH NH44
++
Stanovení NHStanovení NH44
+ + - titrace, fotometrie, - titrace, fotometrie,
selektivní elektrodyselektivní elektrody
![Page 19: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/19.jpg)
Kjeldahlova metoda – stanovení Kjeldahlova metoda – stanovení NN22
![Page 20: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/20.jpg)
UV spektrofotometrieUV spektrofotometrie
280 nm – aromatické AMK280 nm – aromatické AMK
interference nukleotidůinterference nukleotidů
180 - 230 nm – peptidická vazba180 - 230 nm – peptidická vazba
Výhody - nedestruktivní metodaVýhody - nedestruktivní metoda
- není třeba kalibrace- není třeba kalibrace
![Page 21: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/21.jpg)
UV spektrofotometrieUV spektrofotometrie
![Page 22: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/22.jpg)
UV spektrofotometrieUV spektrofotometrie
![Page 23: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/23.jpg)
UV spektrofotometrieUV spektrofotometrie
Vzorce pro přímé UV stanovení:
c (mg/mL) = 1.55 A280 - 0.76 A260c (mg/mL) = 1.55 A280 - 0.76 A260
c (mg/mL) = (A235 - A280)/2.51c (mg/mL) = (A235 - A280)/2.51
c (mg/mL) = (A224 - A233)/5.01c (mg/mL) = (A224 - A233)/5.01
c (mg/mL) = A205 [27 + 120 (A280/A205)]c (mg/mL) = A205 [27 + 120 (A280/A205)]
![Page 24: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/24.jpg)
UV spektrofotometrieUV spektrofotometrie
Edelhochova metoda
při znalosti aminokyselinového složenípři znalosti aminokyselinového složení je možné spočíst extinkční koeficient proteinu e280. Podmínkou je přítomnost tryptofanu nebo tyrosinu v molekule.
ee280280 = nTrp.5500 + nTyr.1490 + nCys.125 (M = nTrp.5500 + nTyr.1490 + nCys.125 (M-1-1.cm.cm-1-1))
![Page 25: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/25.jpg)
VIS spektrofotometrie VIS spektrofotometrie
Přídavek činidla Přídavek činidla barevný derivát barevný derivát
Destruktivní metodaDestruktivní metoda
Nutná kalibrační závislost Nutná kalibrační závislost
![Page 26: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/26.jpg)
Biuretová metodaBiuretová metoda
Princip : CuPrincip : Cu2+2+ vytváří v alkalickém vytváří v alkalickém prostředí komplex se 4 N prostředí komplex se 4 N
peptidické vazbypeptidické vazby
CuCu2+2+
Měření : 540 – 560 nmMěření : 540 – 560 nm
310 nm310 nm
![Page 27: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/27.jpg)
Folinova metodaFolinova metoda
Princip : hydroxyfenolová skupina Princip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje tyrosinu redukuje fosfomolybdenany (Folin fosfomolybdenany (Folin Ciocalteovo reagens) na Ciocalteovo reagens) na molybdenovou modřmolybdenovou modř
Měření : 725 nmMěření : 725 nm
![Page 28: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/28.jpg)
Lowryho metodaLowryho metoda
Princip : kombinace Folinovy a Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metodyBiuretové metody
Měření : 600 nmMěření : 600 nm
![Page 29: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/29.jpg)
Lowryho metodaLowryho metoda
•biuret
•Lowry
![Page 30: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/30.jpg)
Metoda dle BradfordovéMetoda dle Bradfordové
Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm.maxima z 465 na 595 nm.
Meření : 595 nmMeření : 595 nm
![Page 31: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/31.jpg)
Metoda dle BradfordovéMetoda dle Bradfordové
![Page 32: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/32.jpg)
BCA metodaBCA metoda
Princip : NaPrincip : Na++ sůl k. bicinchoninové (BCA), sůl k. bicinchoninové (BCA), komplexuje Cukomplexuje Cu+ + tvořené reakcí peptidové tvořené reakcí peptidové vazby s Cuvazby s Cu2+2+
Měření : 562 nmMěření : 562 nm
![Page 33: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/33.jpg)
BCA metodaBCA metoda
![Page 34: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/34.jpg)
FluorescenceFluorescence
Princip : - vazba fluoroforu na Princip : - vazba fluoroforu na
bílkovinu bílkovinu měření vzniklé měření vzniklé
fluorescence (OPA)fluorescence (OPA)
Měření : exc.340 nmMěření : exc.340 nm
em.440 nmem.440 nm
- zhášení fluorescence přídavkem - zhášení fluorescence přídavkem
bílkovinybílkoviny
![Page 35: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/35.jpg)
PolarografiePolarografie
Princip : Brdičkova reakce – SH skupiny Princip : Brdičkova reakce – SH skupiny bílkoviny vstupují v přítomnosti bílkoviny vstupují v přítomnosti CoCo2+ 2+ katalytické reakce na Hg katalytické reakce na Hg elektrodě elektrodě proud proud
![Page 36: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/36.jpg)
Nejčastěji používané metodyNejčastěji používané metody
Metoda Rozsah (ng) Poznámka
Biuretová 0.5 - 5 okamžitý vývoj
Lowryho 0.05 - 0.5 pomalý vývoj
UV - 280 nm 0.05 - 2 interference
UV – 205 nm 0.01 - 0.05 interference
Bradfordové 0.01 - 0.05 sorpce barviva
![Page 37: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/37.jpg)
Nejčastěji používané metodyNejčastěji používané metody
![Page 38: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/38.jpg)
Stanovení biologické Stanovení biologické aktivityaktivity
Enzymatické,imunologické, Enzymatické,imunologické, toxické, hormonální toxické, hormonální
receptorové atd.receptorové atd.
![Page 39: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/39.jpg)
Vlastní separaceVlastní separace
![Page 40: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/40.jpg)
Obecné schémaObecné schéma
Získání vstupního materiálu
Rozrušení buněk
Separace
![Page 41: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/41.jpg)
Vstupní materiálVstupní materiál
![Page 42: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/42.jpg)
MikroorganismyMikroorganismy
Bakterie, kvasinky, plísně, řasyBakterie, kvasinky, plísně, řasy
Výhody - lze jej snadno získat v dostatečné Výhody - lze jej snadno získat v dostatečné množstvímnožství
- selekce mutantů o požadovaných - selekce mutantů o požadovaných vlastnostechvlastnostech
- genetické inženýrství- genetické inženýrství
- termofilní organismy- termofilní organismy
- psychrofilní organismy- psychrofilní organismy
![Page 43: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/43.jpg)
•CCM uchovává více než 3 000 kmenů bakterií (asi 1 400 druhů) a 800 kmenů vláknitých hub (přibližně 550 druhů), které nabízí ve svém Katalogu kultur.
•Specializovaná sbírka vodních hyfomycetů obsahuje asi 500 kmenů (60 rodů se 130 druhy).
MikroorganismyMikroorganismy
![Page 44: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/44.jpg)
Selekce optimálních producentůSelekce optimálních producentů
snadné získání producentasnadné získání producenta snadnost purifikačního postupusnadnost purifikačního postupu maximální produkce enzymumaximální produkce enzymu
![Page 45: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/45.jpg)
MikroorganismyMikroorganismy
![Page 46: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/46.jpg)
BezobratlíBezobratlí
Hmyz, plži, mlžiHmyz, plži, mlži
Nevýhody - málo se používá, nesnadno se Nevýhody - málo se používá, nesnadno se
získávázískává
![Page 47: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/47.jpg)
Živočišné tkáněŽivočišné tkáně
Laboratorní zvířata – myši, krysy, Laboratorní zvířata – myši, krysy, králícikrálíci
Jateční zvířata – orgány, krevJateční zvířata – orgány, krev
Člověk – tělní tekutiny Člověk – tělní tekutiny
![Page 48: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/48.jpg)
Rostlinné tkáněRostlinné tkáně
Špenát, řepa, hrách, tabák, Špenát, řepa, hrách, tabák, Arabidopsis Arabidopsis thalianathaliana
Nevýhoda – problematický růst za Nevýhoda – problematický růst za
definovaných podmínekdefinovaných podmínek
![Page 49: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/49.jpg)
Manipulace s biologickým Manipulace s biologickým materiálemmateriálem
Pokud možno zpracovat co nejdřívePokud možno zpracovat co nejdříve
Zmražení - při – 60 - 80 Zmražení - při – 60 - 80 ooCC
Rozmrazování - co nejrychlejiRozmrazování - co nejrychleji
![Page 50: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/50.jpg)
Rozbití a extrakceRozbití a extrakce
![Page 51: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/51.jpg)
BakterieBakterie
![Page 52: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/52.jpg)
BakterieBakterie Záleží na lokalizaciZáleží na lokalizaci
• ExtracelulárníExtracelulární• IntracelulárníIntracelulární
CytoplasmaCytoplasma PeriplazmaPeriplazma
cytoplasma
periplasma
![Page 53: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/53.jpg)
BalotinaBalotina
Princip – jemné skleněné kuličky Princip – jemné skleněné kuličky přidány do bakteriální přidány do bakteriální suspenze a rychle třepány suspenze a rychle třepány nebo míchámy – nutno chladitnebo míchámy – nutno chladit
![Page 54: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/54.jpg)
French (X) pressFrench (X) pressPrincip – zmražená bakteriální Princip – zmražená bakteriální
suspenze protlačována malým suspenze protlačována malým otvorem, přičemž dochází k otvorem, přičemž dochází k rekrystalizaci a rozrušení rekrystalizaci a rozrušení buněkbuněk
![Page 55: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/55.jpg)
French (X) pressFrench (X) press
![Page 56: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/56.jpg)
UltrazvukUltrazvuk
Princip – ultrazvuk (Princip – ultrazvuk (> 20 kHz> 20 kHz) v ) v roztoku vyvolává střižní síly – nutno roztoku vyvolává střižní síly – nutno chladitchladit
![Page 57: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/57.jpg)
Lysozym + osmotický šokLysozym + osmotický šok(mírný osmotický šok)(mírný osmotický šok)
Princip – lysozym rozruší buněčnou Princip – lysozym rozruší buněčnou stěnu, následně je bakteriální stěnu, následně je bakteriální suspenze zředěna destilovanou Hsuspenze zředěna destilovanou H22O – O – bakterie popraskajíbakterie popraskají
![Page 58: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/58.jpg)
DalšíDalší
Alumina AlAlumina Al22OO3 3 – roztírání v třecí misce– roztírání v třecí misce
Opakované zmrazování a Opakované zmrazování a rozmrazovánírozmrazování
![Page 59: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/59.jpg)
KvasinkyKvasinky
![Page 60: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/60.jpg)
KvasinkyKvasinky
Toluenová autolýzaToluenová autolýza
Princip – toluen extrahuje při 35 –40 Princip – toluen extrahuje při 35 –40 ooC C fosfolipidy buněčné stěny fosfolipidy buněčné stěny osmotický šok osmotický šok enzymová enzymová autolýzaautolýza
Balotina, French press,Balotina, French press,
![Page 61: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/61.jpg)
Živočišné tkáněŽivočišné tkáně
Bez buněčné stěnyBez buněčné stěny Velmi křehkéVelmi křehké Tkáňové kulturyTkáňové kultury
![Page 62: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/62.jpg)
Živočišné tkáněŽivočišné tkáně
Třecí miska s pískemTřecí miska s pískem
Ruční homogenizatory – Potter –Ruční homogenizatory – Potter –
ElvehjemůvElvehjemův
![Page 63: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/63.jpg)
Živočišné tkáněŽivočišné tkáně
MixeryMixery
Osmotická lyse - erytrocytyOsmotická lyse - erytrocyty
![Page 64: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/64.jpg)
Rostlinné tkáněRostlinné tkáně
Silná buněčná stěna - celulosaSilná buněčná stěna - celulosa Tkáňové kultury křehkéTkáňové kultury křehké
![Page 65: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/65.jpg)
Rostlinné tkáněRostlinné tkáně
Rozrušení buněčné stěny pomocí Rozrušení buněčné stěny pomocí celulas,celulas,
Obsahují hodně fenolických látek, Obsahují hodně fenolických látek,
které mohou být oxidovány na které mohou být oxidovány na chinony – melaniny, které mohou chinony – melaniny, které mohou modifikovat bílkovinymodifikovat bílkoviny
![Page 66: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/66.jpg)
Optimalizace extrakceOptimalizace extrakce
Teplota – 4 - 6 Teplota – 4 - 6 ooC chlazeníC chlazení pH – optimální pro danou bílkovinu – pH – optimální pro danou bílkovinu –
práce v pufrechpráce v pufrech I – v prostředí o definované iontové síleI – v prostředí o definované iontové síle Přídavky látek – EDTA, Přídavky látek – EDTA, --
merkaptoethanol, kovové ionty, merkaptoethanol, kovové ionty, inhibitory proteasinhibitory proteas
![Page 67: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/67.jpg)
Inhibitory proteasInhibitory proteas
![Page 68: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/68.jpg)
Separace subcelulárních Separace subcelulárních organelorganel
Organela Tíhové zrychlení Čas
Eukar.buňky 1 000 g 5´
Jádra, chloroplasty 4 000 g 10´
Mitochondrie, bakterie 15 000 g 20´
Lysozomy, membrány 30 000 g 30´
Ribozomy, fragmenty end.retikula a Gold.systém
100 000 g 60´
![Page 69: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/69.jpg)
Enzymy - markeryEnzymy - markery
Organela Enzym
Cytoplasma LDH
Endoplazmatické retikulum Glukosa-6-fosfatasa
Goldiho systém galaktosyltransferasa
Peroxisom katalasa
Lysozom Kyselá fosfatasa
Mitochondrie in cytochromoxidasa
Mitochondrie out monoaminoxidasa
![Page 70: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/70.jpg)
Membránově vázané bílkovinyMembránově vázané bílkoviny
e lek tros ta ticky h yd ro fob n ě
in te rag u jíc í
zan ořen é tran sm em b rá n ové
in teg rá ln í
M em b rá n ové b ílkovin y
![Page 71: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/71.jpg)
Izolace membránových bílkovinIzolace membránových bílkovin
ChemickyChemicky – detergenty, chaotropní – detergenty, chaotropní soli, organická rozpouštědla, nízká soli, organická rozpouštědla, nízká iontová síla,iontová síla,
FyzikálněFyzikálně - homogenizace, sonikace - homogenizace, sonikace
EnzymatickyEnzymaticky – fosfolipasy, lipasy, – fosfolipasy, lipasy, proteasyproteasy
![Page 72: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/72.jpg)
DetergentyDetergenty
![Page 73: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/73.jpg)
DetergentyDetergenty
![Page 74: Metody separace proteinů](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062322/568144fc550346895db1c7d0/html5/thumbnails/74.jpg)
DetergentyDetergenty