Typy vyšetření a metod Typy vyšetření a metod používaných v naší molekulárně používaných v naší molekulárně

genetické laboratořigenetické laboratoři

RNDr. Hana KolaříkováRNDr. Hana Kolaříková20112011

Molekulárně genetická laboratořMolekulárně genetická laboratoř

MUDr. Jana Zvolskáklinický genetik

RNDr. Hana KolaříkováRNDr. Jiří FišerMgr. Lenka Hrdáodborní pracovníci laboratoře

ČSN EN ISO 9001: 2009SÚKLČSN EN ISO 15 189 (2011?)

Opavská 39Ostrava – Poruba

Tel.: 596 973 356

ŽádankaŽádankaPrůvodní doklad ke každémuPrůvodní doklad ke každémuvzorkuvzorku

Výčet všech vyšetřeníVýčet všech vyšetřenímutací nebo specifických mutací nebo specifických alel v humáním genomu alel v humáním genomu (jaderná DNA)(jaderná DNA)

Informovaný souhlasInformovaný souhlas

Výčet vyšetřeníVýčet vyšetření

Predispozice k žilní trombóze - PCR , reverzní hybridizacePredispozice k žilní trombóze - PCR , reverzní hybridizaceMorbus Wilson - PCR, přímé sekvenováníMorbus Wilson - PCR, přímé sekvenováníCystická fibróza - PCR, reverzní hybridizaceCystická fibróza - PCR, reverzní hybridizaceCeliakie - PCR, elektroforéza na agarózovém geluCeliakie - PCR, elektroforéza na agarózovém geluLaktózová intolerance - PCR , reverzní hybridizaceLaktózová intolerance - PCR , reverzní hybridizaceBechtěrevova nemoc - PCR, elektroforéza na agarózovém geluBechtěrevova nemoc - PCR, elektroforéza na agarózovém geluPrelinguální hluchota - PCR, přímé sekvenováníPrelinguální hluchota - PCR, přímé sekvenováníGilbertův syndrom - PCR, fragmentační analýzaGilbertův syndrom - PCR, fragmentační analýzaMikrodelece na Y chromozomu - PCR, fragmentační analýzaMikrodelece na Y chromozomu - PCR, fragmentační analýzaIdentifikaceIdentifikace (paternity, forenzní vzorky)(paternity, forenzní vzorky) - - PCR, fragmentační PCR, fragmentační analýzaanalýza

Výčet metodVýčet metod1) Chemické metody1) Chemické metody

Izolace (lýza, purifikace, srážení)Izolace (lýza, purifikace, srážení)Separace (elektroforéza)Separace (elektroforéza)Hybridizace / denaturaceHybridizace / denaturaceFragmentační analýza / sekvenováníFragmentační analýza / sekvenováníReal Time PCRReal Time PCR

2) Enzymatické metody2) Enzymatické metodyPCR syntéza úseků DNA (DNA polymerázy)PCR syntéza úseků DNA (DNA polymerázy)Štěpení (Štěpení (restrikční endonukleázyrestrikční endonukleázy))

Výčet metodVýčet metod

PCR PCR (ASO, SEKVENAČNÍ)(ASO, SEKVENAČNÍ)

ELEKTROFORÉZA V GELUELEKTROFORÉZA V GELUREVERZNÍ HYBRIDIZACEREVERZNÍ HYBRIDIZACEFRAGMENTAČNÍ ANALÝZAFRAGMENTAČNÍ ANALÝZAPŘÍMÉ SEKVENOVÁNÍPŘÍMÉ SEKVENOVÁNÍREAL TIMEREAL TIME

Průchod vzorku laboratoříPrůchod vzorku laboratoří

…………z čeho vycházíme při z čeho vycházíme při analýze?analýze?

Typy vzorkůTypy vzorků

Nejčastěji:Nejčastěji:Periferní krevPeriferní krevPlodová vodaPlodová voda

Méně často:Méně často:Tkáně / i v parafinových bločcíchTkáně / i v parafinových bločcíchVlasyVlasy

Vzorek venózní krveVzorek venózní krve- - odběr minimálně 2,5 ml plné do Kodběr minimálně 2,5 ml plné do K33EDTA EDTA - - uchování v lednici (stabilita v řádu týdnů)uchování v lednici (stabilita v řádu týdnů)- - transport do laboratoře transport do laboratoře - - nezaměnitelné označení – dva identifikační údajenezaměnitelné označení – dva identifikační údaje

FTA kartaFTA karta - alternativní varianta- alternativní varianta - snadné skladování a transport- snadné skladování a transport

- pro některé typy vyšetření nevhodná- pro některé typy vyšetření nevhodná

1. Izolace DNA1. Izolace DNA

Detail laboratorního boxuDetail laboratorního boxuLaminární box třídy II-ochrana vzorku -ochrana personálu

Mikrokolona k izolaci DNA z plné krve, tkání apod.Mikrokolona k izolaci DNA z plné krve, tkání apod.

AutomatickýAutomatický izolátor DNAizolátor DNAIzolace DNAPromývací a lyzační pufryMikrokolony k zachycení DNAPřístroje nutné k provedení izolace

Izolát DNAIzolát DNA

- - DNA - ve vodě nebo pufruDNA - ve vodě nebo pufru- - za vhodných podmínek dlouhodobě skladovatelný a použitelnýza vhodných podmínek dlouhodobě skladovatelný a použitelný-- neznámá koncentraceneznámá koncentrace

2. Kvantifikace DNA2. Kvantifikace DNA

Kvantifikace DNA – proč?Kvantifikace DNA – proč?

Fakultativní krokFakultativní krok

Analýzy dle typu vyžadují od cca 0,5 ng až několik Analýzy dle typu vyžadují od cca 0,5 ng až několik desítek ng DNAdesítek ng DNA

Údaj o koncentraci eliminuje nutnost opakovat vyšetřeníÚdaj o koncentraci eliminuje nutnost opakovat vyšetření

Údaj o koncentraci zvyšuje kvalitu následně získaných Údaj o koncentraci zvyšuje kvalitu následně získaných výsledkůvýsledků

Kvantifikace DNA – jak?Kvantifikace DNA – jak?

ELFO na agarozovém geluELFO na agarozovém gelu

UV – spektrofometrieUV – spektrofometrie

Fluorescenční značky a fluorometrFluorescenční značky a fluorometr

RT-PCR se značenou specifickou sondouRT-PCR se značenou specifickou sondou

Elektroforetické vany a zdrojeElektroforetické vany a zdrojeFluorometr QubitInvitrogen, USA

-malý-rychlý-spolehlivý -dostatečně přesný

3. PCR3. PCR

Příprava MasterMixuPříprava MasterMixuAmplifikaceAmplifikace

PCR – základ všech vyšetřeníPCR – základ všech vyšetření

PCR - polymerázová řetězová reakcePCR - polymerázová řetězová reakceIn vitro enzymatické namnožení žádaného úseku DNAIn vitro enzymatické namnožení žádaného úseku DNA

MasterMixMasterMix- - PrimeryPrimery –oligonukleotidy, uměle syntetizované –oligonukleotidy, uměle syntetizované

nukleotidové řetězce max. 30 bazí, vymezuje nukleotidové řetězce max. 30 bazí, vymezuje kýženou oblast (mohou být značené fluorescenčními kýženou oblast (mohou být značené fluorescenčními

barvami)barvami)- - Enzym – polymerázaEnzym – polymeráza, „připojuje“ na 3´ konec primeru, „připojuje“ na 3´ konec primeru

k matrici komplementární bázek matrici komplementární báze- - Nukleotidy Nukleotidy dNTPs (deoxynukleosidtrifosfáty)dNTPs (deoxynukleosidtrifosfáty)- - PufryPufry pro zajištění optimálního prostředí pro zajištění optimálního prostředí

MatriceMatrice – DNA – DNA

Příprava MasterMixu

na kontaminaci nejnáchylnější krok

čisté prostředí

nejlépe oddělený prostor „ work place“

samostatná sada pipet a dalších potřebných pomůcek

PCR cykler

amplifikace DNA in vitro programovatelný dva na sobě nezávislé bloky objem 0,2 ml vyhřívané víko

Ověření amplifikaceOvěření amplifikace

ELFO sestavaELFO sestava- - zdroj stejnosměrného napětízdroj stejnosměrného napětí

- horizontální elfo vana- horizontální elfo vana

- primery- produkty PCR, amplikony- velikostní ladder

4. Analýza produktů PCR 4. Analýza produktů PCR

Celá řada možností jak amplikony Celá řada možností jak amplikony analyzovat.analyzovat.

Délková variabilitaDélková variabilita elektroforéza v agarózovém / v polyakryl amidovém gelu elektroforéza v agarózovém / v polyakryl amidovém gelu

fragmentační analýza ektroforéza v tenké kapilářefragmentační analýza ektroforéza v tenké kapiláře

Sekvenční variabilitaSekvenční variabilitahybridizace se specifickou sondou na membráněhybridizace se specifickou sondou na membráněpřímé sekvenování přímé sekvenování

Elektroforéza v geluElektroforéza v geluCeliakie, HLA B27, DNA profilyCeliakie, HLA B27, DNA profily

Separační i analytická metodaSeparační i analytická metodaDělení produktů PCR:Dělení produktů PCR:Agarózový / polyakrylamidový gelAgarózový / polyakrylamidový gelStejnosměrné elektrické poleStejnosměrné elektrické polePohyblivost DNA fragmentů:Pohyblivost DNA fragmentů:

Délce amplikonuDélce amplikonu KonformaciKonformaci Koncentraci agarózyKoncentraci agarózy NapětíNapětí

Vizualizace:Vizualizace: Ethidium bromid, SYBRGreen / Iluminátor UVEthidium bromid, SYBRGreen / Iluminátor UV AgNOAgNO33

Elektroforéza ve agarózovém geluElektroforéza ve agarózovém gelu

vzorek PKblankdH2O

ladder

K

31 1/ 4

2 /3

K = kontrola amplifikace1 = HLA-DQA1*05 2 = HLA-DQB1*02 3 = HLA-DQB1*0302 4 = HLA-DQA1*03

Prostředí 1 x TBEKonstantní napětí 150 V

Čas 30 min.

Elektroforéza v polyakrylamidovém geluElektroforéza v polyakrylamidovém gelu

- Prostředí 0,5 x TBEProstředí 0,5 x TBE- Konstantní napětí 1 800 VKonstantní napětí 1 800 V- Čas 3 hod.Čas 3 hod.

1 – ladder1 – ladder2 - vzorky2 - vzorky

1 2

Elektroforéza v tenké kapilářeElektroforéza v tenké kapilářeFragmentační analýzaFragmentační analýza

Gilbertův sy, mikrodelece na chromozomu Y, Gilbertův sy, mikrodelece na chromozomu Y, DNA profil DNA profil

PCR s primery značenými různými fluorescenčními PCR s primery značenými různými fluorescenčními barvami barvami Před analýzou je potřeba PCR fragmenty denaturovat a Před analýzou je potřeba PCR fragmenty denaturovat a přidat k nim interní standardpřidat k nim interní standardPCR fragmenty jsou děleny na podobném principu jako PCR fragmenty jsou děleny na podobném principu jako u předešlých typů elektroforézu předešlých typů elektroforézKapilára může mít různou délku a je naplněna Kapilára může mít různou délku a je naplněna speciálním polymeremspeciálním polymeremPCR fragmenty jsou při výstupu z kapiláry detekovány PCR fragmenty jsou při výstupu z kapiláry detekovány systémem laser –CCD kamerasystémem laser –CCD kamera

SekvenátorSekvenátor3 100 AVANT, ABI3 100 AVANT, ABI

Výsledky fragmentační analýzyVýsledky fragmentační analýzy

Gilbertův syndromGilbertův syndrom

Stanovení mikrodelecí na Stanovení mikrodelecí na chromozomu Ychromozomu Y

Reverzní hybridizace Reverzní hybridizace Alelově specifické oligonukleotidy - sondy navázané na nosiči ve Alelově specifické oligonukleotidy - sondy navázané na nosiči ve tvaru proužku – striptvaru proužku – strip

Vždy dvě sondy, jedna pro wt a druhá pro mutVždy dvě sondy, jedna pro wt a druhá pro mut

V prvním kroku je PCR produkt denaturován – chemickyV prvním kroku je PCR produkt denaturován – chemicky

Následuje hybridizace, tedy konfrontace sony s PCR produktyNásleduje hybridizace, tedy konfrontace sony s PCR produkty

Stringentní odmytí nespecificky navázaných PCR produktůStringentní odmytí nespecificky navázaných PCR produktů

Barvení typu biotin avidinBarvení typu biotin avidin

Hybridizační stripy

Pomůcky pro hybridizaci

Mutace v genech pro trombofilní faktoryMutace v genech pro trombofilní faktory

SekvenováníSekvenování 1. PCR klasická s oběma primery Forward i Reverse1. PCR klasická s oběma primery Forward i Reverse 2. sekvenační PCR vždy jen s jedním primerem a se značenými 2. sekvenační PCR vždy jen s jedním primerem a se značenými dd nukleosidtrifosfáty dd nukleosidtrifosfáty G C G G A T G C G G A T AAC G C C T A T T A G G C G C G …….C G C C T A T T A G G C G C G …….

G C G G A T A G C G G A T A AAC G C C T A T T A G G C G C G …….C G C C T A T T A G G C G C G …….

G C G G A T A A G C G G A T A A TTC G C C T A T T A G G C G C G …….C G C C T A T T A G G C G C G …….

G C G G A T A A T G C G G A T A A T CCC G C C T A T T A G G C G C G …….C G C C T A T T A G G C G C G …….

ddATPddATPddTPPddTPPddCTPddCTPddGTPddGTP

Princip sekvenováníPrincip sekvenování

G C G G A T AC G C C T A T T A G G C G C G ……. ddATPddATP ddGTP / ddGTP / dGTPdGTP

ddATP / ddATP / dATPdATPG C G G A T A A ddTPP / ddTPP / dTPPdTPPC G C C T A T T A G G C G C G ……. ddATP ddATP ddCTPddCTP / dCTPG C G G A T A A TC G C C T A T T A G G C G C G ……. ddTPP ddTPP

G C G G A T A A T CC G C C T A T T A G G C G C G ……. ddCTP ddCTP

Elektroforetogram sekvenaceElektroforetogram sekvenace

Real Time PCRReal Time PCR1) Absolutní kvantifikace 1) Absolutní kvantifikace množství DNA ve vzorkumnožství DNA ve vzorku především detekce virální či bakteriální DNA, forenzní chemiepředevším detekce virální či bakteriální DNA, forenzní chemie

2)2) Koncová detekce Koncová detekce SNP genotypizace, detekce mutací a polymorfismůSNP genotypizace, detekce mutací a polymorfismů

3) 3) Relativní kvantifikace Relativní kvantifikace srovnání úrovně exprese mRNA nebo mikroRNAsrovnání úrovně exprese mRNA nebo mikroRNA mezi různými tkáněmi či biologickými podmínkamimezi různými tkáněmi či biologickými podmínkami

7 300 RealTime PCR System7 300 RealTime PCR SystemABIABI

RT PCRRT PCRMěření vznikající fluorescence po každémMěření vznikající fluorescence po každémcyklu PCR, stanovení křivek tánícyklu PCR, stanovení křivek tání

Interkalační barviva Interkalační barviva (levnější)(levnější) (např. SYBR green I, Ethidium bromid) (např. SYBR green I, Ethidium bromid)

Fluorescenčně značené sondyFluorescenčně značené sondy ( (přesnější)přesnější)Hybridizační próby (hybridising probes)Hybridizační próby (hybridising probes)Hydrolyzační próby (hydrolysis probes) Hydrolyzační próby (hydrolysis probes)

Vazba SYBR Green na dsDNA

Sondy značené fluoresceinem (3´)-donor a LC Red(5´) FRET systém (fluorescence resonance energy transfer akceptor)

Specifická sonda - TaqMan fluorescence vzniká po hydrolýze sondy

Využití RT PCR v naší laboratořiVyužití RT PCR v naší laboratoři

Především mutace v genech pro Především mutace v genech pro koagulační faktorykoagulační faktoryFaktor V (Leidenská mutace, R2)Faktor V (Leidenská mutace, R2)Faktor II (protrombinová mutace)Faktor II (protrombinová mutace)MTHFR, F XIII, PAI, EPCR MTHFR, F XIII, PAI, EPCR Mutace v genu pro laktázuMutace v genu pro laktázu- 13910 T to C, -22018 A to G- 13910 T to C, -22018 A to G

……..děkuji za pozornost..děkuji za pozornost