Mohammad ShihataUniversity of Alberta

IntroductionIntroduction

Transplant Immunobiology has established itself as a scientific discipline to study themechanisms by which recipient rejects or

    l  f     i llaccepts a transplant from a geneticallydifferent donor

Tx ImmunobiologyTx Immunobiology

In the early history of transplantation five separate disciplines of investigators separate disciplines of investigators approached the problem of graft rejection.these are Surgeons, Tumor specialists, g , p ,Mendelian geneticists, Biologists and Immunologists.

HistoryHistory 1958 ‐ First HLA antigen described  1959 ‐ Radiation attempted 1961 ‐ Azathioprine available 1962 ‐ Azathioprine & glucocorticoids combined  1966 ‐ Direct cross match b/w donor lymphocytes & recipient serum

HistoryHistory 1978 – cyclosporine trials 1981‐ successful use of monoclonal antibodies for acute 

j i  (OKT  )rejection (OKT 3) 1990s ‐MMF replaced AZT, Sirolimus,IL R  MAb IL‐2R  MAb 

TransplantationTransplantation Autotransplantation

Within one  individual Isotransplantation

Between genetically identical individualsll l Allotransplantation Between individuals from the same species

Xenotransplantation Xenotransplantation Between different species

Basic ImmunologyBasic Immunology The ability of the immune system to recognize non‐self peptides is the what initiates the body’s specific defense mechanisms against invading organismsdefense mechanisms against invading organisms.

The same mechanisms are responsible for post  The same mechanisms are responsible for post transplant rejection . 

Specific Specific ‐‐ NonspecificNonspecific Non ‐specific inflammatory mechanisms:

Macrophages, dendritic cells. NK cells Granulocytes Complement Complement

Antigen‐specific immune response: T‐lymphocytes: TH  TC T‐lymphocytes: TH, TC. B‐lymphocytes: Immunoglobulin, IG.

Basic ImmunologyBasic Immunology Cellular mediated immunity  cell to cell contact result of mature T cell activity

l di d i i   ib d   Humoral mediated immunity  antibody (immunoglobulin) production by mature B lymphocytes plasma cellslymphocytes plasma cells

The immune response to allograft usually involves both systemsy

TT‐‐ LymphocyteLymphocyte 70% of circulating lymphocyte. Mediators of cellular immunity Responsible for induction of humoral immunity Genetically programmed to bind specific cell bound 

i  b  TCR ( T  ll   )antigens by TCR ( T cell receptor )

T T –– lymphocyte  lymphocyte  cont.cont.

All T cells have CD3 molecules on their surface : Intracellular signal transduction.CD   % ( h l / I d  ) CD4 60% ( helper/ Inducer )‐ Th1   IL ‐2, TNF ‐ γ cell mediatedTh    IL   IL        h l  ‐ Th2   IL ‐ 4, IL ‐ 5      humoral  

CD8 30% ( Cytotoxic / Suppressor )

B B ‐‐ LymphocyteLymphocyte 20% of circulating Lymphocytes Can bind free antigens Activated   Plasma cells  Ab production BCR  Ag specific  ( IgM )

Antigen presenting cells (APC’s)Antigen presenting cells (APC’s) Natural Killer cells, PMNs, monocytes, macrophages All can pick up antigens & present them to T cells, stimulating an immune responsestimulating an immune response

Antigen presentationAntigen presentation Direct: Donor‐APC with donor‐MHC. Indirect: Recipient‐APC with donor‐MHC.

B‐CELL

T-CELLCD3

Ig Ig

TCR

Surface Ig

Complete Processed peptidep

molecule(conformational

epitope)

MHC11

2

peptide(linear epitope)

ANTIGEN PRESENTING CELL

MHC 2

2

Major Histocompatibility Complex (MHC)Major Histocompatibility Complex (MHC) Bind peptide fragments of foreign proteins and present them to T cellsG   l  f d    h     f  h   Gene clusters found on short arm of chromosome 6

Referred to as HLA (Human Leukocyte Antigen) antigensantigens

First discovered on human leukocytes 

MHC classesMHC classesMHC Class I molecules

HLA A, B & C Found on all nucleated cells & platelets Each person inherits two Class I antigens from each parentparent

MHC Class II molecules HLA DP, DQ & DR Found on B cells, monocytes, macrophages & other antigen presenting cells (APC)

Each person inherits one Class II antigen from each  Each person inherits one Class II antigen from each parent

GENETIC ORGANIZATION OF MHC

CD4 T-CELLCD3

CD8 T-CELLCD3

TCR

CD3

CD8

TCR

CD3

TCR CD4

AgAg

2 1

MHCCLASS II

11

2 2 CLASS IMHC 2m

3

ANTIGEN PRESENTING CELL ANTIGEN PRESENTING CELL

HistocompatibilityHistocompatibility ABO blood type Major Histocompatibility Complex (MHC) Determination of PRA  Prospective HLA Cross‐Matching

Blood TypingBlood Typing Donor & recipient must be ABO compatible ABO blood type antigens are expressed in all body 

i  i l di   d h li l  lltissues including endothelial cells Most people have antibodies to the antigens they lack

fAs immunosuppression strategies for Heart and Lung transplantation evolve,M   i   h     dMore aggressive approaches to expandthe donor pool are attempted, includingHi h PRA  i i t   d ABOHigh PRA recipients and ABOmismatched  ( incompatible ) allografts .

Panel anel Reactive eactive Antibody (PRA)ntibody (PRA) Combines recipient’s serum with Ag containing cells taken from 60 different individuals, representing the 

i l d   lpotential donor pool. Reflected as a percentage which relates to presence of antibodies (recipient’s) to HLA moleculesantibodies (recipient s) to HLA molecules

The higher the PRA, the more “sensitized” the recipient is (i.e. more likely to have a positive cross‐p ( y pmatch/rejection)

High PRAHigh PRA Pregnancy Blood transfusions Exposure to allograft material ( e.g. CHD )  Prior transplant Assist Devices, ( e.g. LVAD )  ?

High PRA = “high risk” for rejection

HLA TypingHLA Typing Donor & Recipient HLA alleles HLA A, B & DR are the most important Each person has two alleles for each, constituting 6 antigens to compareZ i   i h   Si i   h Zero antigen mismatch vs. Six antigen match

Impact on organ sharing

Types of RejectionTypes of RejectionHistologically and Immunologically categorized into three major types

Hyperacute – occurs within minutes to hours of release of clampp

Acute – usually occurs days to weeks after transplant

Chronic – occurs over months to years 

Hyperacute RejectionHyperacute Rejection Irreversible Result of preformed circulating antibodies Very rare if cross‐match is negative Results in activation of complement 

h b i / l  i jthrombosis/vascular injury( Hemorrhage / ischemia )  graft loss

Hyperacute RejectionHyperacute Rejection If PRA is > 10%, prospective HLA matching is recommended.R   i i  Pl h i  IVIG  C  (  Rx perioperative Plasmapheresis, IVIG, Cytoxan ( cyclophosphamide ).

Cobra venom factor to deplete Complements !! Cobra venom factor to deplete Complements !!

Acute RejectionAcute RejectionC ll  di t d (   % )   Ab  di t d Cell mediated ( 90 % ) or Ab mediated 

Weeks to months after transplantation

Change in balance between Immunosuppression and host immunitypp y

Constitutional symptoms often present  owed Constitutional symptoms often present, owed to cytokine release (TNF, IL‐1 & 2, etc.)

Morphologic grading of acute  Morphologic grading of acute  RejectionRejectionHeartGrade 1A: Focal aggregates of perivascular 

activated lymphocytes; rarely  interstitial foci

Grade 1B: Diffuse but sparse interstitialf d l hfoci;activated lymphocytes

Grade 2:   One focus of perimyocytic –i d l h   i h activated lymphocytes with 

myocyte damage

Morphologic grading of acute  Rejection Morphologic grading of acute  Rejection ( ( Heart cont. )Heart cont. )

Grade 3A: Multifocal areas of myocytedamage caused by activatedlymphocytes and eosinophils

Grade 3B: Borderline severe rejection

G d      Diff   i d ( i hil   fGrade 4:   Diffuse mixed (eosinophils, oftenneutrophils) infiltrate with

liti  h h   d  tvasculitis, hemorrhage, and myocytenecrosis

Morphologic grading of acute rejection (Morphologic grading of acute rejection (Morphologic grading of acute rejection ( Morphologic grading of acute rejection ( Lung )Lung )Grade 1: Minimal perivascular and interstitial

mononuclear infiltratesGrade 2: Mild perivascular and interstitial

mononuclear infiltratesGrade 3: Moderate perivascular and

interstitial mononuclear infiltratesGrade 4: Severe perivascular and interstitial

mononuclear infiltrates

Chronic RejectionChronic Rejection Occurs gradually over months to years with progressive GRAFT function loss

Etiology not clearly known, but probably multi‐f t i l (i  &  i   h i  d  factorial (immune & non‐immune mechanisms, drug toxicity, chronic ischemia, repeated bouts of acute rejection) j )

hhChronic RejectionChronic Rejection HEART:  Allograft vaculopsthy HEART:  Allograft vaculopsthy

LUNG  :  Bronchiolitis OblitransLUNG  :  Bronchiolitis Oblitrans

The lung is constantly exposed to the outerThe lung is constantly exposed to the outerenvironment which makes it sussiptable to immunomodulatory effects of Respiratoryy ff f p yviruses

Allograft Vasculopathy ( AV )Allograft Vasculopathy ( AV )Neointimal hyperplasia

BronchiolitisOblitrans

ImmunosuppressantsImmunosuppressants Steroids Calcineurin inhibitors Sirolimus Anti‐lymphocyte antibodies Anti‐IL‐2 receptor antibodies Anti‐proliferative agents Allo‐antibody modulation

According to SHLT registry 3‐ year survival after Heart Tx increased from 40% ( 1975 – 1981 ) to 70% (  8    )( 1982 – 1994 )

In many regestries 10 year survival is only around 50% ( i.e. Current immunosuppressive therapy is far from ideal )far from ideal )

SteroidsSteroids Prevent all phases of T cell activation Block cytokine gene expression (IL‐1,2,3, 6, 15, IFN‐ & IFN IFN‐

Commonly used at high doses on induction Taper to 5‐10mg/day for maintenanceape to 5 0 g/day o a te a ce Commonly used as high dose (pulse) therapy for acute rejection

Side effectsSide effectsISHLT/UNOS thoracic registry ( in 1st year )

HTN  61% DM    16% Hyperlipidemia 26% Symptomatic OP 5% Cataract 2%

“ There is increasing evidence that steroidscan be weaned during the first year aftertransplantation in the majority of patientsp j y pwithout any impact on long term graft andpatient outcome “p

Calcineurin InhibitorsCalcineurin InhibitorsBinding of allo‐antigen to cell surface receptor  signal transduction  elevated cytosolic Ca++

activation of Calcineurin  (a phosphatase)  dephosphorylates nuclear regulatory proteins (NF‐AT) passage through nuclear membrane  IL‐2, IL‐4, IFN‐, etc. transcription  cytokine production

Must follow drug levels closely (12 hour trough) Must follow drug levels closely (12 hour trough)

Are inherently nephrotoxic due to vasoconstrictive  Are inherently nephrotoxic due to vasoconstrictive properties

Tacrolimus is more potent than Cyclosporin ( 100 time greater in vitro inhibition of lymphocytes prolifration ) 

Side effectsSide effectscyclosporine        tacrolimuscyc ospo e tac o us

hyperkalemia +++ +++ hyperlipidemia        +++ +hyperlipidemia        +++ +tremor +diabetogenesis          + ++gingival hyperplasia   +g g yp prenal insufficiency   +++                 ++    HTN                         ++                     +hirsutism                   ++                    +

PP‐‐450450 Inhibitors (increase levels)                 dil i il

Inducers (decrease levels)

if i‐ diltiazem>verapamil‐ ketoconazole > 

fluconazole

‐ rifampin‐ isoniazid

h t i  (Dil ti )fluconazole‐ erythromycin or 

clarithromycin

‐ phenytoin (Dilantin)‐ carbamazepine 

(Tegretol)y‐ cimetidine

(Tegretol)‐ phenobarbital

TOR inhibitor (sirolimus or “Rapamycin”TOR inhibitor (sirolimus or “Rapamycin”TOR inhibitor (sirolimus or “Rapamycin” TOR inhibitor (sirolimus or “Rapamycin” (Rapamune))(Rapamune))Macrolide antibiotic similar to tacrolimus Binds to FKBP like tacrolimus, but sirolimus/FKBP complex does not block calcineurin

Sirolimus/FKBP complex engages a regulatory protein called target of rapamycin (TOR)

TOR inhibition reduces cytokine dependent ll l   lif i     h  G  S  h   f  ll cellular proliferation at the G1 to S phase of cell 

division cycle

AntiAnti‐‐Lymphocyte antibodiesLymphocyte antibodies OKT3 ( anti CD3 MAb )  Thymoglobulin ( ATGAM / RATG ) Used only for induction or treatment of rejection, not for maintenance immunosuppression

OKT3 side effectsOKT3 side effects Cytokine release syndrome, life threatening“Fevers, chills/rigors, pulmonary edema,hypotention, bronchospasm “

nephrotoxicity, aseptic meningitis with  encephalopathy 

infections (esp. CMV), lymphoma

ATGAM side effectsATGAM side effects Thrombocytopenia Leukopenia Infection (esp. CMV) Unprededictability and variable efficacy

AntiAnti‐‐ILIL‐‐2 Receptor Antibodies2 Receptor Antibodies Daclizumab Basiliximab

In clinical trials

AntiAnti‐‐proliferative agentsproliferative agents mycophenolate mofetil (Cellcept) azathioprine (Imuran)

Mycophenolate Mofetil (Cellcept)Mycophenolate Mofetil (Cellcept) Reversible inhibitor of inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH)IMDPH i     i i l   i   h  d   h i   f  IMDPH is a critical enzyme in the de novo synthesis of purines & guanosine nucleotides

Lymphocytes rely on de novo pathway more than other  Lymphocytes rely on de novo pathway more than other cells

MMFMMF Differs radically from activity of calcineurin inhibitors or sirolimusT  i  “d ” f   i   i i     Target is “down‐stream” from antigen recognition or signal transduction

Essentially blocks the proliferation of lymphocytes Essentially blocks the proliferation of lymphocytes

AlloAllo‐‐antibody modulationantibody modulation Intravenous Immunoglobulin (IV Ig) Plasmapheresis

IV IgIV Ig Down‐regulates antibody production (anti‐HLA Ab) by plasma cellsI d   i   f B  ll Induces apoptosis of B cells

Effective treatment for acute humoral rejection U d i   l  i  d i i i   Used in pre‐transplant immune desensitization protocols

PlasmapheresisPlasmapheresis Removes circulating antibodies non‐specifically Effective in treatment of acute humoral rejection Effective in pre‐transplant immune desensitization protocols

Alloantigen

OKT3 / Thymoglobulin

T Cell Receptor

A ti t d l i i

Cyclosporin / FK506

Activated calcinurin

Dephos. NFATp

IL-2 gene promotion

Glucocorticoids

IL-2 / IL-2 R

Daclizumab / BasiliximabDaclizumab / Basiliximab

Cell Cycle

Sirolimus

MMF

DNA syn / Prolifration

Non PharmacologicalNon PharmacologicalNon PharmacologicalNon Pharmacological Total Lymphoid Irradiation Photopheresis Apheresis ( plasma exchange )

Future DirectionsFuture DirectionsFuture DirectionsFuture Directions Selective immunoabsorption filtration Co receptors ( CD 154  CD 28  CTLA 4 ) Co‐receptors ( CD 154, CD 28, CTLA 4 )Ab

Our Protocol ( 1996Our Protocol ( 1996 ))Our Protocol ( 1996 Our Protocol ( 1996 ‐‐ )) Intra‐Operative‐methylprednisolone sodium p y psuccinate(Solumedrol), 10mg/kg just prior to release of aortic cross‐clamp.

Post‐Transplant‐ Solumedrol 2mg/kg IVq12h x 3 doses then 1mg/kg tapering by 2mg/day until 

d b b dprednisone can be substituted.MMF 1000‐1500 mg bid PO. ATGAM (or equivalent RATG/OKT 3)10‐20mg/kg/day over 24 hours by continuos infusion until 

l i  l l    i  t t cyclosporine levels are in target range.

Following the discontinuation of ATGAM Solumedrol 2mg/kg/day Iv for threeATGAM,Solumedrol 2mg/kg/day Iv for threedoses.

P d i /k /d   t ti   8 h   t Prednisone 1mg/kg/day starting 48 hours postopand tapered by 2mg/day until at 0.3 mg/kg/day for heart transplant patient and 0 3mg/kg/day for heart transplant patient and 0.3mg/kg/day starting 48 hours postop for heart‐lung and lung transplant patients.p p

Cyclosporine 8‐10mg/kg/day in 2 divided doses PO/NG starting on the 2‐4 postop day depending on renal function‐trough level 350‐500 ng/ml in the first 3 function trough level 350 500 ng/ml in the first 3 months and then 200‐500 ng/ml depending on the renal function.

After 3 mth postop: MMF,Prednisone and Cyclosporine/Tacrolimus continue.I   h     f    j i   l i  d   In the event of no rejection cyclosporine dose maybe reduced to achieve trough level 200‐500ng/ml.500ng/ml.

StartUniversity of Alberta

Transplant Process for Heart Recipients

Is potentialrecipient *high risk ?No Yes

Potential donor identified

Obtain donor HLA typing(F HOPE if di t t d f

Potential donor identified

Proceed(No prospective XM

required. T-AHG XM on

Hi h  i k   

(From HOPE if distant donor, fromHLA lab if local donor)

required. T AHG XM onnext working day)

End Is the patientclinically stable

(Discussion betweensurgeon and

Yes

Yes

High risk = positive PRA (>15%) or regraftor recent transfusion

Does potentialrecipient have DSA? (If unsurecheck with Dr. Campbell (cell

940 7358) or HLA Lab(Pager 445 6708))?

surgeon andcardiologist)?

Recommend waitfor better match

No

transfusion Protocol A – 1 

volume plasmapheresisfollowed by 2g/kg 

Is DSAClass I?

Is Class IDSA detected

by AHG?

Yes

Yes No

No

End

Noy g/ g

IVIG pre transplant.

DSA = Donor specific 

ib di

Proceed

Prospective flowXM required ASAP

(Transplant mayproceed before

Class II DSAIncreased

immunological riskProceed withProtocol A**

Very high riskDo NOT proceed

Proceed withProtocol A

Set up T-AHG andflow XM ASAP

(discuss timing with antibodiespXM results are

ready)Set up flow XM ASAP

(discuss timing withDr. Campbell)

End

THANK YOU