1

Tutor Hematologi I

HEMOSTASIS SEKUNDER( Jalur Ekstrinsik)

Oleh :Siti Hotimah,dr/Juli Soemarsono, dr, SpPK

2

HEMOSTASIS

Mekanisme untuk mencegah dan menghentikan

suatu perdarahan

Fungsi Mekanisme :

Mencegah keluarnya darah dari pembuluh darah

yang utuh

Menghentikan perdarahan dari pembuluh darah

yang terluka

3

Vaskuler

Trombosit

Pembekuan darah

Hemostasis

Pembuluh darah› Melalui vasokonstriksi, aktivasi trombosit,

aktivasi sistem pembekuan. Trombosit

› Melalui pembentukan dan stabilisasi sumbat trombosit (adesi, agregasi dan reaksi pelepasan)

Sistem pembekuan › Terbentuknya fibrin

4

5

6

Diambil dari Wintrobe’s Clinical Hematology edisi 11, halaman 681

7

8

HEMOSTASIS PRIMER Pembuluh darah & Trombosit

HEMOSTASIS

HEMOSTASIS SEKUNDER Faktor Koagulasi

9

Indikasi Pemeriksaan Jalur Ekstrinsik

1. Antikoagulan oral (antagonis vit. K),2. Penyakit hati, sebagian karena obstruksi,3. Def. vit. K,4. DIC,

10

Pemeriksaan Penyaring Koagulasi Jalur Ekstrinsik

Metode Plasma Protrombin Time

Metode Thrombotes

11

PEMERIKSAAN PPT

Pemeriksaan ini untuk menyaring adanya kelainan pembekuan melalui jalur ekstrinsik yaitu faktor pembekuan VII, X, V, protrombin dan fibrinogen.

Memantau efek antikoagulan oral karena golongan obat tersebut menghambat pembentukan faktor pembekuan VII, IX, X dan protrombin yang dibentuk di hati.

12

Semprit & Jarum

Penampungan Cara

pengambilan darah

KontrolText

PPT

Penyimpanan

Antikoagulan

13

Antikogulan

Menggunakan sodium sitrat 3.2 % ( 0,109M) Bila kadar hematokrit tinggi harus dikoreksi

100 – Hematokrit pasien Jumlah anti koagulan = X Vol Darah

595 – Hematokrit pasien atau

100 – hematokrit pasienjumlah anti koagulan = X vol. sitrat normal

100 – hematokrit normal Tidak dianjurkan memakai antikoagulan EDTA,

Heparin maupun oksalat.

14

Pengambilan sampel

Hindarkan masuknya tromboplastin jaringan kedalam sampel darah dengan cara memakai 2 spuit.

Jangan menggunakan torniket (<1 menit) Diambil pada daerah yang berlawanan dengan

tempat pemasangan infus dan memiliki perfusi yang baik.

15

Penyimpanan dan Pengiriman Bahan Sebaiknya pemeriksaan PPT dilakukan dalam

waktu < 4 jam. tabel penyimpanan sampel

Suhu ( C ) Lamanya penyimpanan

22 - 24 2 jam

2 - 4 4 jam

-20 2 minggu

-70 6 bulan

16

Untuk pedoman transportasi sampel

1. Hindari trauma/benturan pada sampel 2. Wadah harus tertutup rapat untuk

menghindari hilangnya CO2, dan dengan hilangnya CO2 akan meningkatkan pH .

pH yang tinggi faktor labil : F V, F VIII rusak.

17

3 . Jika tempat pemeriksaan jauh dari tempat pengambilan sebaiknya dikirim dalam

bentuk plasma sitrat dalam botol plastik tertutup dan diberikan pendingin ( es yang sedang mencair) namun tidak boleh dalam es karena dapat mengaktifkan F VII dan XII.4. Untuk mencairkan sampel yang telah disimpan dalam keadaan beku harus dilakukan pada suhu 37C . Sampel yang telah dicairkan tidak dapat dibekukan lagi.

18

Sentrifugasidigunakan platelet poor plasma untuk px Koagulasi yang umum/rutin Sentrifus sampel selama 10 – 15 menit pada kecepatan 2500 g

Kontrol Pada setiap pemeriksaan lakukan juga

pemeriksaan 1 kontrol normal dan 1 kontrol abnormal ,gunanya untuk menjaga keakuratan hasil pemeriksaan fungsi koagulasi.

19

PRINSIP KERJA

Prinsip pemeriksaan ini adalah mengukur lamanya terbentuk bekuan bila ke dalam plasma yang diinkubasi pada suhu 37°C, ditambahkan reagen tromboplastin jaringan dan ion kalsium.

Hasil pemeriksaan dipengaruhi okepekaan tromboplastin jaringan o tehnik pemeriksaan

Alat dan Reagen

o Sentrifus dan tabung sentrifuso Pipet 1 ml sebanyak 3 buaho Tabung 13 x 100 mmo Waterbath 37°C StopwatchNatrium sitrat 3,2% Tromboplastin jaringan.

› campuran tromboplastin jaringan dan CaCl2 0,025 mol terpisah

Plasma poor platelet plasma kontrol normal

20

21

Prosedur

1. 4,5 ml darah + 0,5 ml natrium sitrat 0,109 M 2. Sentrifus 2500 g 15’ plasma (PPP),

3. CaCl2 dalam tabung inkubasi 37°C,

4. Reagen Thromboplastin 0,1 ml dalam tabung tes waterbath 37°C 1-3’

5. + PPP normal 0,1 ml kocok waterbath 37°C 5’

6. + CaCl2 0,1 ml stopwatch,(bekuan)

7. Duplo rata-rata hasil.8. Ulangi dengan plasma pasien.

22

Metode Tilt tube tes

23

Hasil yang baik bila pada dua kali pemeriksan selisihnya ≤ 0,5 detik. Bila tidak pemeriksaan harus diulang.

Hasil PPT yang dilaporkan adalah rata-rata dari dua kali pemeriksaan pada masing-masing plasma ( sampel maupun

kontrol ).

24

Pelaporan hasil pemeriksaan PPT al :1. Dalam detik , plasma pasien dan

plasma kontrol dilaporkan dalam detik.

2. Dalam Ratio, membandingkanhasil PPT pasien dengan PPT kontrol.

3. Dalam International Normalized Ratio (INR).

INR = PPT Pasien ISI

PPT kontrol

4. Dalam bentuk persentase aktivitas. 5. Dalam bentuk indeks prothrombin

Pada bagian Patologi klinik RSU dr Soetomo digunakan pelaporan dalam detik dan INRNilai normal : 11 – 14 detik ( kontrol )

Berbeda jika hasil sampel > 2 detikBerbeda bermakna > 3 detik

25

Indeks protrombin = PPT kontrol

x 100 % PPT pasien

Nilai Normal

Nilai PPT normal menurut Barbara : 11 – 13 detik.

Nilai PPT normal menurut Dacie : 11 – 16 detik.

26

INTERPRETASI

Kekurangan faktor I, II, V, VII atau X, yang disebabkan karena kelainan yang diturunkan atau yang didapat, seperti pada DIC, penyakit hati ( kekurangan vitamin K atau gangguan sintesa ), dilusi ( transfusi masif ), antikoagulan ( derivat coumarin).

Adanya inhibitor spesifik pada faktor pembekuan, seperti antitrombin, antitromboplastin atau anti faktor V.

Pemberian heparin dosis tinggi. Kadar fibrinogen yang rendah.

27

28RINI R / PK / 4-06-04

hasil PPT memanjang,pasien tidak sedang dalam pengobatan dengan antikoagulan, dapat dilakukan pengulangan pemeriksaan PPT

mixing test yaitu dengan mencampur 0,2 ml plasma pasien dan 0,2 ml plasma kontrol, kemudian diambil sebanyak 0,1 ml plasma untuk diperiksa.

Untuk mengetahui pemanjangan disebabkan okekurangan faktor pembekuan oadanya inhibitor spesifik terhadap faktor

pembekuan.

THROMBOTEST Thrombotes reagen mengandung

bovine brain thromboplastin adsorbed bovine plasma yang mengandung faktor

V dalam jumlah banyak CaCl2.

Reagen ini mempunyai sensitivitas yang tinggi untuk faktor VII dan X serta efek inhibisi protein PIVKA.

Metode ini bisa digunakan pada whole blood, plasma atau darah kapiler.

29

Reagen Dan Alat

Thrombotes reagenCaCl2 3,2 mmol/l untuk metode yang menggunakan darah vena dan plasma.Tabung tesStopwatchwaterbath

30

Persiapan Reagen

Tambahkan 11ml CaCl2 3,2 mmol/l pada

tabung besar Thrombotes reagen atau 2,2 ml

CaCl2 3,2 mmol/l pada tabung kecil

Thrombotes reagen.

Biarkan selama beberapa menit dan dikocok.

31

32

Pipet 0,25 ml ke dalam tabung tes, ditutup dan disimpan pada suhu -20oC, jika akan digunakan dicairkan dulu. Pada suhu -20oC tahan selama 2 bulan.

Pada capillary method tambahkan 11 ml Aquadestilata steril pada tabung besar Thrombotes reagen atau 2,2 ml Aquadestilata steril pada tabung kecil Thrombotes reagen. Campur dan buat sediaan seperti diatas.

METODE PEMERIKSAAN

Plasma

tambahkan 30 μl plasma ke dalam 0,25 ml

reagen yang sudah disiapkan, pada suhu

37 °C.

Campur dan catat waktu pembekuan

seperti pada pemeriksaan PPT.

33

34

Darah venatambahkan 50 μl darah dengan antikoagulan natrium citrate ke dalam 0,25 ml reagen yang sudah disiapkan, pada suhu 37 ºC.Campur dan catat waktu pembekuan seperti pada pemeriksaan PPT.

Darah kapilerkeluarkan 50 μl darah dari capillary pipette dalam 0,25 ml reagen yang sudah disiapkan, pada suhu 37 oC.Campur dan catat waktu pembekuan seperti pada pemeriksaan PPT.

Perhitungannya : Perhitungan persentase thrombotest aktivitas koagulasi menggunakan waktu pembekuan dan kurva kalibrasi. Bagian atas kurva untuk darah dan plasma sitrat, yang dibawah kurva untuk darah kapiler. Nilai yang didapat disesuaikan dengan INR sebagai referensi dan ISI sesuai dengan batch dari reagen thrombotest.

35

Thrombotest dinyatakan dalam bentuk Aktivitas protrombin yang ditentukan dengan menggunakan kurva standart dan dinyatakan dalam %. Harga normal > 70%.

Nilai yang didapat disesuaikan dengan INR

36

PEMERIKSAAN PPT di Lab. P.K. RSU Dr.Soetomo

1. ACL Elite Pro Prinsip : Photo optical Reagen : Tromboplastin

Pemeriksaan secara optik

Prinsip pengukuran: Mengukur waktu terjadinya perubahan intensitas scater light yang dihasilkan dari LED yang dilewatkan pada serat optik dengan panjang gelombang 660nm pada sudut 90˚akibat adanya pembekuan pada plasma

37

Pemeriksaan secara optik

38

Sentrifus 2500g, 10 mnt

Ambil serum 0,5 ml

Masukkan dalam alat

Inkubasi slm 2 menit pd suhu 37˚C

0.1 ml

Tambahkan reagen 0.2 ml

λ 660 nm

39

2. STACompact dari STAGO Prinsip : Elektromekanikal dengan metode

Impendan Reagen : Tromboplastin

40

Pemeriksaan PTT elektromekanik

Prinsip : peningkatan viskositas plasma akibat penambahan reageno Tromboplastin ( dari jaringan otak kelinci )o Kalsium klorida

Bahan Pemeriksaano Platelet Poor Plasma darah + 0.109 M (3,2%)

trisodium citrate disentrifus dengan kecepatan 2500 g selama 10 - 15 menit

Pemeriksaan PTT elektromekanik

41

clottingTime

Prinsip : peningkatan viskositas plasma akibat penambahan reagen

www.themegallery.com 42

43

JALUR INTRINSIK JALUR EKSTRINSIK Trauma HMWK

kalikrein HMWK XII XII a prekalikrein VII kalikrein XI XI a ca2+ TF

IX IX a VII a

VIII VIIIa PF3 ca2+

X Xa

V Va ca2+

XIII PF3

Prothrom- Thrombin bin XIII a

fibrinolisis

Fibrinogen Fibrin FDP

Fibrin Stabil•

Ekstrinsik Inhibitor Intrinsik bersama

anti trombinProt.C aktif

Prot.S

Prot.C

TFPI

Fibrinogen Fibrin FDP

Pemeriksaan PPT

1.Electromechanical dengan metode impedance 2. Photo Optical

2.1. Scattered Light Detection for Clotting Assay. 2.2. Transmitted Light detection for Chromomeric Assay 2.3. Transmitted Light detection for immunoassays. 2.4. Waveform Analysis 2.5. Nephelometry

3.Electrochemical

Metode Pemeriksaan Fungsi Koagulasi PPT

Photo Optical 2.1. Scattered Light Detection for Clotting Assay.

Adanya pembentukan fibrin maka turbiditas plasma , Jk dilewati sinar dng 660 nm maka akan terjadi peningkatan scatter light . Waktu perubahan ini

akan ditangkap dan dicatat oleh detektor 2.2. Transmitted Light detection for Chromomeric Assay

Adanya perubahan warna akibat koagulasi shg merubah

absorban panjang gelombang sinar 405/575/800 nm. Perubahan transmisi dari sinar ini dicatat

2.3. Transmitted Light detection for Immunoassays. Adanya rx ag-ab akan menyebabkan perubahan

absorban sinar (405/575/800 nm). Perubahan transmisi ini yang dicatat dan disetarakan dlm menit 45

2.4. Waveform AnalysisPd keadaan normal lampu tungsten

halogen akan memberikan banyak panjang gelombang, apabila terjadi gangguan pembekuan drh spt sepsis, DIC maka akan terlihat adanya gel.bifasik jumlah gel. Bifasik ini akan dicatat dan diukur.

2.5. Nephelometry

46

47

Metode Elektromekanikal

Bola yang ada dalam kuvet digerakkan oleh dua buah

kumparan yang bila dialiri arus listrik akan

mengeluarkan gaya magnetik yang menarik bola dalam

kuvet. Apabila tombol start dinyalakan maka kedua

kumparan mendapat aliran listrik secara bergantian

sehingga timbul gaya magnetik secara bergantian.

48

Gaya magenetik akan menyebabkan bola

terayun kekiri dan kekanan membentuk

amplitudo gelombang tertentu. Amplitudo

ayunan akan dimonitor selama proses

pemeriksaan berlangsung.

49

Ayunan akan konstan selama belum terjadi perubahan viskositas dari plasma akibat proses pembekuan. Begitu terbentuk bekuan, viskositas plasma akan meningkat sehingga menyebabkan ayunan bola akan memendek sehingga terjadi perubahan amplitudo gelombang yang dibentuk oleh ayunan bola, waktu yang tercatat oleh alat adalah waktu mulai reagen ditambahkan kedalam plasma sampai terjadi perubahan ampitudo gelombang yang dibentuk oleh ayunan bola.

Metode Electrochemical Digunakan u/ memantau terapi antikoagulan,

dan penilaian berdasarkan INR, alat ini menggunakan stik yang dilapisi bahan kimia. Darah diteteskan pd testing area & bercampur dng reagen pd stik koagulasi menghambat perubahan elektrik pd stik. Perubahan elektrik ini yg dicatat & dihitung oleh alat tersebut.

50

51

Pemeriksaan PTT elektromekanikPrinsip : peningkatan viskositas plasma

akibat penambahan reagen Tromboplastin ( dari jaringan otak kelinci ) Kalsium klorida Bahan Pemeriksaan Platelet Poor Plasma darah + 0.109 M

(3,2%) trisodium citrate disentrifus dengan kecepatan 2500 g selama 10 - 15 menit

Pemeriksaan PPT otomatik

• Plasma prothrombin time (PPT) : menilai fungsi koagulasi darah jalur ekstrinsik dan bersama ( faktor II, V, VII, X, protrombin dan fibrinogen)

• Prinsip : Jika ada tromboplastin jaringan dan Ca2+ masuk kedalam sirkulasi darah maka akan mengaktivasi faktor koagulasi melalui jalur ekstrinsik sehingga terbentuk fibrin.

52

53

Pemeriksaan secara optik Prinsip pengukuran:

Mengukur waktu terjadinya perubahan intensitas scater light yang dihasilkan dari LED yang dilewatkan pada serat optik dengan panjang gelombang 660nm pada sudut 90˚akibat adanya pembekuan pada plasma

Bahan pengambilan sampel

Gunakan butterfly needle dan tabung darah yang menggunakan sistem vakum atau sistem aspirasi. Gunakan jarum Ø 0,7 – 1 mm ( no 19 – 22 )

Cara Pengambilan Darah- Sebaiknya gunakan vena kubiti- Pasien hrs rileks

Tusuk vena dengan menggunakan wing needle/ butterfly needle dan gunakan tabung darah yang menggunakan sistem vakum agar tromboplastin jaringan tidak kedalam sampel darah.

54

SAMPEL PPT INTERPRETASI

Plasma kontrol 14 detik Normal

Plasma Pasien 30 detik AbnormalPl. kontrol : Pl.pasien = 1:1

15 detik Kekurangan faktorpembekuan

Pl. kontrol : Pl.pasien = 1:1

40 detik Adanya inhibitorspesifik

55

Quality control Lakukan kontrol tiap hari Bahan kontrol : pool plasma atau kontrol komersial Lakukan kontrol pd kadar normal dan abnormal.

Untuk kadar normal bandingkan dengan nilai normal ± 2 SD

Ada beberapa alat yang dapat diatur agar melakukan kontrol secara otomatis terhadap hasil pemeriksaan. Jk hasil sampel >>> ataupun <<< secara bermakna, maka alat dengan sendirinya akan mengulang pemeriksaan dan hasil yang dikeluarkan merupakan rerata dari kedua pemeriksaan terhadap sampel.

56

57

TROMBOPLASTIN :- Dapat dibuat dari beberapa sumber bahan :

jaringan kelinci, jaringan sapi- Metode tehnik pembuatannya bervariatif

distandardisasi terhadap bahan referensi

Internasional (standard human thromboplastin)

I S I( INTERNATIONAL SENSITIVITY INDEX)

KALIBRASI THROMBOPLASTIN Reagen thromboplastin harus dikalibrasi dengan

tromboplastin rujukan (IRP =International reference preparation) untuk mendapatkan ISI (International sensitivity Index)

Awalnya dipakai Manchester Comparative Reagent (MCR) yang kemudian dikenal sebagai British Comparative Thromboplastin (BCT)

58

59

Reagen› Plasma sitrat normal dari 20 donor sehat› Plasma sitrat abnormal dari 60 penderita dengan

antikoagulan oral yang telah stabil selama 6 minggu dengan ratio 1,3-3,0 tromboplastin komersial 2,0-5,0 BCTStabil bila perbedaan hasil pemeriksaan PPT

dengan selisih waktu 2 minggu tidak lebih dari 20 %

› Thromboplastin reference› Thromboplastin tes› CaCl2 0,025 mol/l

ThrPl reference ThrPl tes

Plasma 1 tes 1 tes 2tes 4 tes 3

Plasma 2 tes 5 tes 6tes 8 tes 7

dstCatat rata-rata hasil pemeriksaan, bila perbedaan

lebih dari 10 % harus diulang

60

Hasil pemeriksaan PPT dimasukkan dalam grafik log-log.

Sumbu Y untuk hasil PPT reference Sumbu X untuk hasil PPT tes Hubungan dinyatakan dari slope

61

Perhitungan ISI › Hasil pengukuran dirubah dlam bentuk log› X untuk log PPT tes› Y untuk log PPT reference› ∑ x = A: ∑ x2 = B: ∑ y = C : ∑ Y2 = D

∑ xy = E› F = D – C2 , G = B – A2 , H = E – AC

n n n n = jumlah pemeriksaan PPT › m = F – G / 2H› Slope (b) = m + m2 + 1› ISI Thromboplastin tes = ISI reference x slope

62

63

•Titik a dan b ditentukan dari PPt yang paling rendah dan yang paling tinggi

•Dibuat garis sehingga bertemu di titik c

•Ukur jarak a-c dan b-c dalam mm

•b = b –c / a - c

64

ISI(International Sensitivity Index) : Ukuran sensitivitas tromboplastin dalam mendeteksi berkurangnya faktor koagulasi dibandingkan dengan IRP(International Reference Preparation) WHO 67/40.

ISI digunakan untuk mengkoreksi tromboplastin ke nilai yang sebanding dengan IRP.

Makin sensitif suatu tromboplastin maka nilai ISI makin rendah.

65

ISI suatu tromboplastin didefinisikan dengan kemiringan garis kalibrasi yang diperoleh pada kertas log-log

ISI suatu tromboplastin didefinisikan dengan kemiringan garis kalibrasi yang diperoleh pada kertas log-log bila hasil PT yang didapat memakai tromboplastin dimasukkan pada absis, PT memakai IRP 67/40 diletakkan ordinat.

Hati merupakan tempat sistesis faktor – faktor pembekuan darah, kecuali F III, IV dan VIII.

Teori Cascade atau waterfall

Vitamin K merupakan proenzim atau Zimogen yang larut dalam lemak, dan berguna untuk sintesa Faktor II, VII, IX, X di sel hati. Absorbsinya memerlukan bantuan garam empedu.

66

PERANAN PEMBULUH DARAH PADA PROSES HEMOSTASIS :

1. Mempertahankan darah tetap cair2. Sel2 endotel pertahankan aliran darah tetap

stabil3. Sel2 endotel menghasilkan bahan :

a. Prostasiklin hambat aktivitas platelet & merangsang vasodilatasi

b. ATP, ADPc. Protein C Plasma Regulator untuk

koagulasid. Anti Trombin IIIe. Plasminogen Aktivator

67

4. Tissue Thromboplastin/Tromboplastin jaringan dikeluarkan oleh jaringan pemb.darah bila ada trauma merangsang sistim Ekstrinsik

5. Kolagen yang akan terpapar bila ada luka merangsang sistim Intrinsik

6. Peranan pembuluh darah dalam vasodilatasi & vasokonstriksi.

68

Koagulasi

Mekanisme pembekuan darah melibatkan rangkaian reaksi enzimatik protein plasma (faktor pembekuan), fosfolipid, dan Ca2+

Faktor - faktor pembekuan : - protein plasma nonaktif ( zymogen) kecuali F. III dan F. IV (Ca2+ )

- disintesis pada hati kecuali F III, IV dan VIII

69

Antikoagulan

Oksalat akan mengakibatkan faktor yang labil seperti

F V dan VIII akan rusak

Heparin akan mengganggu proses koagulasi melalui kerja anti trombin

EDTA akan menyebabkan pemanjangan hasil pemeriksaan PPT dan APTT serta menyebabkan interferensi

70

kalikrein

FVII VIIa

Fibrinolisis : plasminogen

plasmin

kininogen

kinin

FXII XIIa

HMWK

71

HWMK

InhibitorAda beberapa macam inhibitor dalam proses hemostasis :

1. Anti trombin ( AT III / kofaktor heparin)

2. TFPI (tissue factor pathway inhibitor)3.Protein C ( diaktifkan oleh protein S )4. Alfa 2 makroglobulin

72

73

PENYEBAB KELUARNYA TROMBOPLASTIN JARINGAN

1. Kelainan Obstetri : Kerusakan plasenta , Emboli cairan ketuban, Intra uterine foetal death

2. Neoplasma/keganasan

3. Kasus-2 hemolitik : Malaria, Reaksi transfusi, Autoimun Hemolysis

4. Trauma, luka bakar, operasi

5. Emboli lemak

Hal diatas akan menyebabkan aktivasi F VII

74

PPT test APTT test Interpretasi

Memanjang Normal - Defisiensi F VII - Defisiensi II, V, X

Normal memanjang - Defisiensi F VIII, IX, XI, XII, HMWK, prekalikrein - Defisiensi F II, V, X - Von Willebrands disease1

Memanjang Memanjang - Defisiensi vitamin K - Oral antikoagulan - Defisiensi F V,X atau II/ multipel faktor koagulasi - Penyakit hati berat - DIC

Arti Klinis

75

ANTICOAGULANSIA :

I. HEPARIN :Bekerjasama dengan AT III untuk menginaktivasi Faktor IXa, Xa, XIIa dan trombin.

INDIKASI :- Operasi jantung terbuka- Dialisis ginjal- Dosis rendah diberikan pada venous

tromboemboli

76

II. DERIVAT COUMARIN :Contoh : Warfarin

PRINSIP KERJA :Sebagai antagonis Vit. K mempengaruhi faktor2 koagulasi : II, VII, IX, X.

INDIKASI :- Deep venous trombosis- Pulmonary emboli- Tx prevensi pada katub jantung buatan