TUGAS KIMIA MEDISINAL

MAKALAH CYCLOPAMINE SEBAGAI OBAT KANKER

Disusun oleh:

Wenny Zuricha Z. 260110100106

Anggita Sekarsari 260110100107

Intan Mutiara Sari 260110100108

Hanifa Rozanah 260110100109

Prasetyo Hadi N. 260110100110

Raden Bayu Indradi 260110100112

Willi Tri Andika 260110100113

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

BANDUNG

2013

1. Sejarah Penemuan Obat Cyclopamine

Pada pertengahan abad ke-20, anak-anak kambing pada peternakan-

peternakan di negara bagian Idaho lahir dengan cacat kraniofacial yang parah. Anak-

anak kambing yang baru lahir di daerah Idaho terinfeksi hingga 25%. Tingkat

keparahan cacat ini disebut holoprosencephaly yang bervariasi dari ekstrim cyclopia

(hanya satu mata ditempatkan langsung di dahi, disertai dengan kelainan otak) hingga

rahang atas yang agak pendek. Cacat lebih parah lagi yaitu tidak lengkap atau benar-

benar tak terbagi belahan otak juga penciuman dan saraf optik. Pengembala domba

yang terinfeksi meminta Departemen Pertanian untuk membantu ketika penyakit

telah mencapai endemik dan kerugian ekonomi tidak lagi ditoleransi. Lynn F. James,

salah satu ilmuwan yang diutus, tinggal bersama domba selama tiga musim panas di

akhir 1950-an dan menemukan bahwa pada saat kekeringan domba pindah ke tempat

yang lebih tinggi dan merumput pada tempat dengan bunga veratrum californicum

yang tumbuh melimpah. Richard F. Keeler dari Laboratorium Penelitian Tanaman

Beracun kemudian tahu hubungan antara konsumsi veratrum californicum oleh

domba hamil dan kejadian cyclopia dalam keturunan mereka. Dengan makan

veratrum californicum, menunjukkan bahwa cacat domba hamil tersebut diinduksi

dari hari ke-14 kehamilan dan kehamilan itu diperpanjang hingga 87 hari (masa

kehamilan domba sehat adalah 147-152 hari)

Veratrum californicum, juga dikenal sebagai semacam tumbuhan California

yang salah satunya adalah tumbuhan lili dari family melanthiaceae yang asli dari

belahan bumi utara tetapi terutama berlimpah di daerah pegunungan barat Amerika

Serikat.

2. Identifikasi Target Obat & Target Penyakit

Cyclopamine mempunyai aktivitas baik sebagai antitumor maupun

teratogenik. Kemampuannya ini secara khusus menghambat respon seluler terhadap

jalur sinyal Hedgedog vertebrata. Jalur sinyal Hedgedog vertebrata memiliki peran

penting dalam mengontrol pertumbuhan, terutama selama proses perkembangan,

tetapi seringkali aktif berlebih dalam pembentukan tumor.

Penerimaan sinyal Hh, yang melibatkan transmembran multipass (TM),

protein Patched (PTCH) dan smoothened (Smo). Selama proses sinyal Hh normal,

protein Hh mengikat ke PTCH, sehingga menurunkan penekanan PTCH – mediasi

dari Smo, sebuah jarak relatif reseptor G-protein-coupled (GCPRs). Aktivasi Smo

kemudian memicu serangkaian peristiwa intraseluler, berpuncak pada aktivasi

transkripsi Gli – dependent.

Cyclopamine berperan mengganggu sinyal pada peristiwa tersebut dengan

mempengaruhi fungsi Smo, sebagai antagonizes Hh aktivitas jalur secara PTCH-

independen dan melemahkan potensi terjadinya onkogenik, dengan mengangakat

bentuk aktif dari Smo.

3. Membuat Prosedur Uji

Reaksi utama yang mendasari biosintesis senyawa Cyclopamine yang

merupakan senyawa alkaloid adalah reaksi mannich antara suatu aldehida dan suatu

amina primer dan sekunder, dan suatu senyawa enol atau fenol. Biosintesis alkaloid

juga melibatkan reaksi rangkap oksidatif fenol dan metilasi. Jalur poliketida dan jalur

mevalonat juga ditemukan dalam biosintesis alkaloid.

Kebanyakan alkaloid diendapkan dari larutan netral atau asam oleh sejumlah

reagen yang mengandung logam berat seperti merkuri (Hg) platina (Pt), bismuth (Bi)

dan emas (Au), dengan membentuk ikatan garam dengan mereka

Untuk memperoleh cyclopamine secara tepat dan banyak dilakukan dengan

mengisolasi cyclopamine dari tumbuhan Veratum californicum. Akar dari tumbuhan

dibasahi dengan 5% ammonia tersebut dikeringkan terlebih dahulu sampai benar-

benar kering. Kemudian cyclopamine dibiarkan pada suhu ruangan benzena.

Penyimpanan dilakukan pada suhu 00C selama beberapa bulan sampai campuran

alkaloid mengkristal.

Pemurnian dilakukan dengan beberapa langkah rekristalisasi untuk

memberikan hasil sekitar 320 mg per kilogram kering akar. Oleh karena kebutuhan

kita untuk cyclopamine dibutuhkan jumlah yang signifikan, dibutuhkan skala besar

praktis skema isolasi. Untuk mengisolasinya digunakan ekstraktor sohxlet karena

dirasa lebih efisisen untuk menghasilkan jumlah cyclopamine yang cukup besar.

Analisis kromatografi cair - spektrometri massa (LC-MS) menunjukkan kemanjuran

metode ini. Metode baru ini menunjukkan bahwa sedikit cyclopamine yang tetap

berada didalam material tumbuhan setelah ekstraksi soxhlet mencapai sepuluh siklus.

Prosedur ekstraksi ini juga memungkinkan untuk penentuan kuantitatif cyclopamine

dari sumber alami. LC-MS secara kuantitatif menunjukkan bahwa akar dari Veratrum

californicum berisi 2,34 g cyclopamine per kg bahan tanaman kering. Ekstraksi yang

dilakukan menggunakan dua ekstraktor soxhlet dihubungkan dengan dengan mantel

pemanas, dengan benzena sebagai pelarut.

Teknik soxhlet digunakan karena teknik ini merupakan suatu teknik ekstraksi

berulang yang sangat efisien untuk digunakan. Hal ini dikarenakan pelarut yang telah

membawa zat yang terekstrak, diuapkan, kemudian didinginkan, sehingga dapat

digunakan lagi. Pelarut benzena digunakan dalam proses isolasi ini karena bila dilihat

dari strukturnya cyclopamine merupakan suatu senyawa organik yang dapat larut

dalam benzena.

Langkah berikutnya dalam proses adalah untuk mengisolasi cyclopamine dari

volume besar benzena. Ini dilakukan dengan melewatkan seluruh larutan benzena

melalui kolom gelas yang diisi dengan silika gel. Analisis silika gel kromatografi

lapisan tipis (TLC) menunjukkan bahwa benzena merupakan pelarut yang tidak

cukup kuat untuk memindahkan alkaloid dari titik asal. Ini secara efektif

memungkinkan untuk menjebak semua cyclopamine dari larutan benzena. Untuk

tujuan ini, benzena dari kedua soxhlet telah ditambahkan ke puncak kolom silika gel

dilengkapi dengan alat vakum untuk mempercepat pemisahan.

Di vakum penyaringan volume benzena melewati kolom selama 45 menit.

Proses ini menghasilkan alkaloid tanaman yang terkonsentrasi (termasuk

cyclopamine) di bagian atas kolom. Sebuah keuntungan luar biasa dari metode ini

adalah bahwa benzena yang mengalir berisi begitu sedikit bahan dan bisa digunakan

kembali berkali-kali sebelum langkah untuk pemurnian dengan redestilasi diperlukan.

Untuk mempercepat kromatografi, kolom ini terhubung ke sumber vakum untuk

menarik pelarut melalui kolom. Elusi dari alkaloid ini dilakukan dengan

menggunakan langkah gradient CH2Cl2-isopropanol (97:3), CH2Cl2 -isopropanol

(93:7), dan kemudian CH2Cl2-isopropanol (75:25). Penghilangan pelarut dari fraksi

semi-murni mengandung cyclopamine terkonsentrasi dengan pengurangan tekanan.

Rekromatografi ekstrak ini dimurnikan dengan menggunakan aliran silika gel dengan

etil asetat-iso-propanol-amonia (85:14:1) menghasilkan cyclopamine murni yang

cukup untuk dipadatkan oleh triturasi dengan aseton dingin.

Sampel cyclopamine dianalisis melalui LC-electrospray ionisasi (ESI) yang

dihubungkan dengan spektrometri massa (MS / MS) pada sebuah perangkap ion

quadrupole spektrometer massa (LCQ Classic, Thermo-Finnigan, San Jose, CA)

digabungkan ke Hewlett - 1100 Packard sistem HPLC. Sebuah kolom fasa terbalik

1,2 × 100 mm xterra MS C-18 3,5 μm C-18 LC (Waters Corporation, Milford, MA)

juga digunakan. Cyclopamine mengalir selama 30 menit, gradien dimulai dengan

10% asetonitril, 0,2% asam format sampai 70% acetonitril, 0,2% asam format

mengalir dengan laju 100 μL / menit dan pasca-kolom 1:10 split. Larutan blanko

dianalisis antara sampel untuk membatasi carryover. Beberapa massa spektra juga

diperoleh baik di Waters Micromass Misa ZQ dilengkapi dengan detektor Waters 600

HPLC fotodioda pompa dan detektor array atau pada Thermo Quantum TSQ

Finnegan dilengkapi dengan Agilent 1100 seri sistem HPLC. Sistem HPLC ini

digunakan untuk menganalisis apakah benar senyawa yang telah diisolasi tersebut

merupakan cyclopamine yang benar-benar murni.

4. Mencari Lead Compound

Beberapa penelitian telah dilakukan untuk memperoleh “lead compound” dari

cyclopamine. Pertama, sintesis 17-asetil-5α - etiojerva-12 ,14,16-trien-13β-ol dari

bahan kimia sederhana telah dilaporkan oleh Johnson dkk. Kemudian Masamune,

dkk, melaporkan mengkonversi cyclopamine relatif jervine, di mana karbon-11

metilena di cyclopamine dioksidasi menjadi keton dalam jervine. Wolff-Kishner, juga

telah melaporkan suatu cara yaitu mereduksi jervine menghasilkan cyclopamine.

Namun menghasilkan hasil yang relatif rendah.

Oleh karena kebutuhan senyawa yang cukup besar untuk penelitian hewan

dan mamalia sehingga perlu dipikirkan suatu metode yang lebih efisien untuk

mengekstrak dan memurnikan senyawa cyclopamine dari akar Veratrum

californicum. Serta suatu cara untuk menganalisis karbon dan resonansi proton dari

cyclopamine.

5. Hubungan Aktivitas Struktur (SAR)

Dalam strukturnya, ternyata cyclopamine ini memiliki kelemahan antara lain

ketidakstabilan cyclopamine sendiri dari struktur C12-C13 double bond.

Sehingga dilakukan penelitian untuk mendapatkan struktur yang lebih baik

lagi yakni derivate dari cyclopamine. Derivate pertama yaitu KAAD-cyclopamine

dimana memiliki kelebihan yaitu memiliki kelarutan yang lebih baik dan

meningkatkan aktivitas biologi sekitar 10-20 lebih baik. Sampai sejauh mana ikatan

ganda nonconjugated di posisi C5-C6 ditransformasikan ke enon sesuai dalam

kondisi fisiologis masih belum diselidiki

Ada juga derivate lain yaitu D-homocyclopamine. Infinity Pharmaceuticals

menerbitkan pendekatan tahapan untuk derivatif D-homocyclopamine, yaitu derivatif

dengan tujuh cincin D. Derivatif ini tidak mewarisi ketidakstabilan cyclopamine,

karena aromatisasi oleh pembelahan sistem eter alil tidak dapat terjadi. Beberapa

turunan dari jenis ini telah disintesis dan dipatenkan, dan profil biologis mereka telah

ditentukan.

6. Identifikasi Farmakofor

Fitur Pharmacophoric adalah kode warna: hijau untuk kelompok akseptor ikatan

hidrogen (HBA1-3) dan biru untuk daerah hidrofobik (Hy1-3). Atom-atom dengan

kode warna: abu-abu: karbon, putih: hidrogen, merah: oksigen, biru: nitrogen dan

kuning: sulfur.

HBA1 dan HBA3 diisi oleh hidroksil dan atom oksigen heterosiklik, masing-

masing, sementara HY2 dan HY3 ditampung cincin jenuh beranggota enam pusat dan

kelompok metil pada inti piperazine, masing-masing. Baik Hy1 maupun HbA2 yang

dipasang oleh pharmacophore tersebut.

7. Desain Obat Untuk Pengoptimalan Interaksi Reseptor

Pada penelitian Hamon Florian tahun 2010. Prodrug glukuronida pertama dari

inhibitor sinyal Hedgedog cyclopamine telah disintesis. Derivatisasi karbamoil dari

cyclopamine secara signifikan menurunkan toksisitas terhadap U87 sel line

glioblastoma manusia. Ketika prodrug yang diinkubasi dengan β-glukuronidase

dalam media kultur, obat aktif secara efisien dirilis sehingga memulihkan aktivitas

antiproliferasinya.

Prodrug Glucuronide Cyclopamine

Pemecahan Cyclopamine-glucoronide menjadi Cyclopamine

Pada penelitian Martin et. al tahun 2008 melaporkan sintesis antagonis

Hedgedog dari cyclopamine, yang mana senyawa tersebut disebut herein. Asam

sensitif D-cincin cyclopamine tersebut homolog dengan berdasarkan penataan ulang

urutan cyclopropanasi kemoselektif dan stereoselektif asam-katalis. Modifikasi

lanjutan dari alkohol A / B-cincin homoalilik ke keton terkonjugasi menyebabkan

penemuan analog cyclopamine baru dengan sifat pengobatan ditingkatkan dan

potensi vitro (EC50) berkisar antara 10 sampai 1000 nM.

8. Drug Design-Optimizing Pharmacokinetic Properties

IPI-269.609 merupakan turunan pertama dari cylopamine yang kemudian

dikembangkan. Hal ini disebabkan karena cyclopamine menunjukkan afinitas yang

rendah dari Smo (Smoothened), biovailibilitas oral yang buruk , farmakokinetik

suboptimal , dan stabilitas metabolisme yang rendah.

IPI-926 merupakan analog semisintetik dari cyclopamine,yang secara

substansial meningkatkan potensi dan profil farmakokinetik terhadap cyclopamine,

kemudian dirancang dan disintesis. Dengan menggunakan model rekayasa genetika

yang dapat bekerja untuk mematikan kanker pankreas.

IPI-269609 menghambat metastasis sistemik di orthotopic xenografts yang

dibentuk dari jalur sel kanker pankreas manusia.

9. Toxicologycal & Safety Test

Pada beberapa penelitian cyclopamine pada domba, pengamatan efek

teratogenik diperlukan pada pemberian oral perhari 2-3 g / hewan (rata-rata berat

badan pada hewan 50 kg; 40-60 mg/kg). kebutuhan akan dosis tinggi yang

disebabkan karena sifat farmakokinetik atau potensi yang buruk, beberapa penelitian

terbaru menunjukkan beberapa pencerahan pada kedua aspek tersebut. Pada domba,

eliminasi waktu paruh pendek (1,1 ± 1 jam) diukur ketika garam tartrat cyclopamine

(1,6 mg / kg) diberikan secara intravena (iv). Sedangkan pada tikus, bioavailabilitas

oral cyclopamine (memberikan respon sebanyak 33% relatif terhadap intraperitonieal

untuk pengamatan ini). Hal ini menunjukkan kemungkinan buruknya pengamatan ini

terhadap sifat farmasetika.

Banyak tes seluler yang telah dikembangkan untuk mengevaluasi potensi

inhibitor jalur Hh. Cyclopamine menghambat proses Hh-dependent termasuk :

(a) Induksi HNF3B pada embrio ayam dengan pengujian lempeng saraf (IC50 pada

10 nM)

(b) Pengujian Gli-reporter

(c) diferensiasi c3H10T1/2 (IC50 pada 300-400 nM)

Sedangkan efek teratogenik dari cyclopamine dikaitkan dengan aktivitas on-

target pada Smo dan jalur Hh, adanya bukti bahwa cyclopamine mungkin tidak

sepenuhnya selektif. Konsentrasi tinggi pada cyclopamine (10 M) menunjukkan

adanya efek sitotoksik pada sel kanker yang tidak mengekspresikan Smo, hal ini

memperlihatkan bahwa efek yang diamati yaitu off- target.

10. Chemical Development & Production

Meningkatnya kebutuhan atas cyclopamine telah mengakibatkan peningkatan

jumlah derivat cyclopamine semisintetik. Semua struktur cyclopamine-like sampai

saat ini disintesis dari cyclopamine natural dengan modifikasi kimia dari produk

naturalnya. Karena belum ada jalur sintesis total untuk mendapatkan cyclopamine,

maka hingga saat ini belum ada cyclopamine dari hasil sintesis sintesis .

a. KAAD Cyclopamin

KAAD-Cyclopamine adalah derivate cyclopamine pertama yang menunjukkan

kelarutan yang lebih baik dan meningkatkan potensi biologis pada faktor 10 – 20,

didapatkan dalam lima langkah dari cyclopamine natural.

b. D-homocyclopamine

Infinity Pharmaceutical memublikasikan pendekatan tahapan-tahapan untuk

mendapatkan derivat D-homocyclopamine. Derivat ini tidak mewarisi sifat

ketidakstabilan cyclopamine, karena aromatisasi dengan pemotongan pada sistem alil

eter tidak dapat terjadi. Beberapa derivat dari sistem ini telah disintesis dan

dipatenkan., dan profil biologinya telah dideterminasi.

c. Analaog dari Turunan Estrone

Analog cyclopamine yang disederhanakan telah dipreparasi dari estrone

melalui empat tahapan oleh Winkler et al (2009). Struktur C-nor-D-homosteroid

dihilangkan, piridin digunakan pada tempat cincin piperidin, dan fenol digunakan

untuk menggantikan homoalil alkohol. Meskipun modifikasi ini mempunyai

pengaruh yang besar terhadap struktur, polaritas, dan keasaman, aktivitas biologi

masih tetap nyata.

11. Parenting and Regulatory Affairs Clinical Trials

Cyclopamine saat ini sedang diteliti sebagai agen pengobatan pada sel basal

carcinoma, medulloblastoma, rhabdomyosarcoma (tumor yang dihasilkan dari

aktivitas Hh berlebihan), glioblastoma , dan sebagai agen pengobatan untuk multiple

myeloma .

Studi menunjukkan bahwa cyclopamine berperan sebagai inhibitor utama

hedgehog signaling pathway dalam sel . Jalur ini di beri nama berdasarkan ligan

untuk protein sinyal yang digunakan oleh sel untuk membantu sel tersebut bereaksi

terhadap sinyal kimia eksternal . Jalur ini memiliki peranan penting dalam

perkembangan embrio, yang mana ketika jalur ini tidak berjalan dengan semestinya

dapat mengakibatkan cacat pada embrio. Aktivasi tidak semestinya dari jalur ini

dapat memicu kanker pada orang dewasa, yang dapat menyebabkan sel basal

carcinoma, kanker medulloblastoma, rhabdomyosarcoma, kanker prostat, pankreas,

dan payudara. Cyclopamine bekerja dengan mengendalikan jalur ini dalam mengobati

kanker.

Uji klinik cyclopamine dilakukan kepada pasien kanker, dengan melihat

aktivitas inhibisi terhadap hedgehog pathway. Dilihat juga efek farmakologi dari

cyclopamine, termasuk farmakodinamik, farmakokinetik, efek terhadap reseptor, efek

terapi dan efek samping dari cyclopamine tersebut. Selanjutnya dilihat metabolisme

dari cyclopamine dan organ-organ yang terlibat didalamnya, serta clearence dari

cyclopamine tersebut.

Derivatif cyclopamine IPI - 926 (juga dikenal sebagai saridegib) sedang

dalam tahap evaluasi uji klinis oleh Infinity Pharmaceuticals untuk pengobatan

berbagai jenis kanker. Infinity Pharmaceuticals melakukan uji IPI - 926 dengan

menggunakan gemcitabine (analog nucleoside yang digunakan dalam chemotherapy),

dibandingkan dengan plasebo gemcitabine. Infinity Pharmaceuticals Inc

menghentikan Tahap 2 studi dari target obat untuk mengobati kanker pankreas

metastatik, setelah hasil awal pengujian menunjukkan titik akhir tujuan kelangsungan

hidup secara keseluruhan tidak akan terpenuhi. Kombinasi IPI - 926 menunjukkan

tingkat penyakit lebih tinggi daripada kombinasi plasebo, sedangkan kombinasi

Infinity menunjukkan tingkat kelangsungan hidup rata-rata kurang dari enam bulan

jika dibandingkan dengan gemcitabine saja. Sehingga hasilnya di anggap tidak

efektif.

DAFTAR PUSTAKA

Hampn et al. 2010. Study of a cyclopamine glucuronide prodrug for the selective

chemotherapy of glioblastoma. European Journal of Medicinal Chemistry 45 :

1678-1682

Martin et al. 2008. Semisynthetic Cyclopamine Analogues as Potent and Orally

Bioavailable Hedgehog Pathway Antagonists. J. Med. Chem 51 (21): 6646–

6649.

Matthew , Herper . 2005 . The Curious Case of The One-Eyed Sheep. Available

online at http://www.forbes.com/global/2005/1128/066A.html [diakses

tanggal 9 November 2013].

Oatis, Jhon E. Jr, dkk. (2008). Isolation, Purification, and Full NMR Assignments of

cyclopamine from Veratrum californicum. Chemistry Central Journal,

[Online], Vol 2 (1), 12 halaman Tersedia :

http://journal.chemistrycentral.com/content/2/1/12 [11 November 2013]

Philipp, H , Lito ,T, and Athanassions , G. 2010. Cyclopamine and Hedgehog

signaling :Chemistry, Biology, Medical Perspectives. Angewandte Chemie

Int. Ed. 49. 2-12.

Underwood, A.L dan Day, R.A. (2002). Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta :

Erlangga