Transformacin gentica en animales

FICAYAINGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA INGENIERIA GENETICA

Transformacin gentica en animales

UNIVERSIDAD TECNICA DEL NORTE RODRIGO CHIRIBOGA Introduccin Transferencia de ADN a Clulas Animales Incorporacin de un gen exgeno en el genoma de un animal.Mediante tecnologas de ingeniera gentica.Objetivo tener importante expresin y heredada por la descendencia.En su mayora Animales de granja.

Mtodos de transformacin El establecimiento de animales transgnicos estables implica que el ADN extrao est presente en gametos o embriones de una clula para permitir su transmisin a la progenie.

Para alcanzar este objetivo, el gen extrao se puede transferir el uso de diferentes mtodos de transformacin de acuerdo a las especies animales.Transferencia gnica(TG) por microinyeccin.La primera tcnica que dio lugar al xito regular y relativamente fcil de TG en los mamferos.

Este mtodo se aplic en ratones, ratas, conejos, cerdos, ovejas, cabras y vacas

Eficiencia del 0.1-5%4Microinyeccin pronuclearPequeas cantidades del ADN de inters (transgen) eran inyectadas en el proncleo de un embrin.

Proncleo antes que se fusionen los ncleos de los dos gametos5Metodologa Recombinacin y clonacin del transgen, se elige el vector apropiado.Se aslan un nmero grande de ovocitos fertilizadosLos ovocitos fertilizados se manipulan uno a uno, y con una micro pipeta para sujetarlos.Con un micropipeta a manera de aguja (micromanipulador)se inyecta el ADN directamente en el proncleo masculino.Finalmente estos ovocitos son reimplantados en hembras que actan como nodrizas permitiendo el termino de la reaccin.

Puede ser un gen o una combinacin de genes.Lo que se consigue sometiendo a la hembra a un tratamiento hormonal para provocar una mayor ovulacin.Micropipeta presin negativa para sujetar.Micropipeta presin positiva para inyectar el ADN, proncleo masculino porque es mas grandePara identificar los transgnicos se lo hace mediante anlisis de PCR o Southernblots demostrar que el gen se expresa y es correctamente regulado en el organismo del husped.

6Problemas potenciales:a. Sobreviven pocos huevos inyectadosb. El gen se inserta al azar en los cromosomasc. No todas las clulas del animal reciben el gend. El gen no se expresa lo suficienteComo resultado se obtienen animales fundadores mosaicos. Transferencia del gen menor al 50%

Microinyeccin cuando ya a ocurrido la primera divisin del cigoto.

Mosaico: en un mismo individuo, coexisten dos o ms poblaciones declulascon distinto genotipo (dos o ms lneas celulares), supuestamente originadas a partir de un mismocigoto.8Microinyeccin de ADN en clulas embrionariasLa manipulacin de clulas embrionarias de ratn (ES cell)Solucin a los problemas de la microinyeccin pronuclear.Las clulas madre embrionarias se obtienen desde el macizo celular interno de blastocitos. Se realiza la inyeccin con la micropipeta Estas clulas mediante recombinacin homologa permiten alterar la funcin de genes endgenos.

Heterocigotos: cunado los dos alelos codifican para distinto carcter Aa aAHomocigotos: cuando los dos alelos codifican para un solo carcter AA aaQuimeras: dos cigotos tras la fecundacin se combina, el individuo tendr dos tipos de clulas diferentes cada una con distinta combinacin gentica.Clulas Madre se pueden mantener en cultivos sin perder su estado indiferenciado gracias a la presencia en el medio de cultivo de factores inhibitorios de la diferenciacin. Recombinacin homologa es dirigida

9Microinyeccin de ADN en clulas embrionariasLas clulas as modificadas pueden ser entonces reintroducidas en blastocitos receptores contribuyendo eficientemente a la formacin de todos los tejidos en un animal quimrico incluyendo la lnea germinal.

Heterocigotos: cunado los dos alelos codifican para distinto carcter Aa aAHomocigotos: cuando los dos alelos codifican para un solo carcter AA aaQuimeras: dos cigotos tras la fecundacin se combina, el individuo tendr dos tipos de clulas diferentes cada una con distinta combinacin gentica.Clulas Madre se pueden mantener en cultivos sin perder su estado indiferenciado gracias a la presencia en el medio de cultivo de factores inhibitorios de la diferenciacin.

10Transferencia gnica con transposonesSe los puede agregar en plsmidos Lo que le confieren la capacidad de ser transferidos exitosamente en clulas y genomas extraos.Dos tipos de transposonesTransferencia horizontal de genes Ventaja sobre los retrovirus

Transposones ? Saltar fuera y dentro del genoma ,,,, se autoreplican e integran aleatoriamente en nuevos sitios dentro del genomaLa transferencia horizontal de genes es la transferencia de material gentico entre clulas y genomas que pertenecen a especies no relacionadasCLASE I ADN a ARN Y de ARN con transcriptasa ADN y se pegaCLASE II Cortar y pegar transposasa 11Ejemplos de transposones SB(1639)Tc1/marina (1612 bp)Mermaid DANATdr2Bari1 (1639 bp)Pogo (2417 bp)Tc3(2335 bp)Himar 1PiggyBacTol2

Los transposones varan entre si en la longitud de los genes de la transposasa y las repeticiones terminales invertidas (tir)

Caractersticas de los transposones para ser usados como vectores.Capaces de incorporar segmentos de ADN de varias Kb para poder contener genes enterosCapacidad de ser movilizados por la transposasaFacilidad de usoAmplio rango de huspedesIntegracin eficiente en los cromosomasYa insertado, estabilidad a travs de varias generaciones.Uso de transposon SB (Sleeping Beauty)Requiriere al menos dos sitios de ligamiento de las tir para la transposasa para luego cortar el elemento mvil (transgen) y pegar en otro lugar del genoma.

Los sitios de integracin varan mucho segn el tipo y especie celular del 17,4 al 89,7 % especfica.Metodologa

Gen insertado (flanqueado por la secuencia tir)

Gen transposasa

Dos plsmidos 123Se insertan los dos plsmidos a la clula.Se expresa la transposasa mediada por un promotor (CMV)Corta las tir del otro plsmidoLuego se integran las tir +gen en los nuevos sitios del genoma4Electroformacinpromotor de citomegalovirus CMV Mecanismos de seleccin resistencia a antibiticos, GFP.Amplio rango de aplicacin en clulas de peces hasta humanas15Transferencia gnica con vectores viralesVectores virales obtenidos a partir de virus.

Se eliminan sus caractersticas patolgicas

Usados como transportadores de material gentico heterologo.

16Ventajas

Eficacia de transferencia

Desventajas

Falta de especificidad celularLimitacin del tamao del transgenInmunogenidad Riesgo biolgico Oncogenidad inducida por integracin inespecfica.

Transferencia gnica mediada por espermatozoides Consiste en la introduccin de ADN forneo en gametos masculinos antes de proceso de fertilizacin.

En 1989 Lavitrano describi el mtodo para producir ratones transgnicos.El semen fue incubado con ADN exgeno

La generacin F1 contena el ADN exgeno.

Tcnicas para la incorporacin del ADN forneo al ADN de los espermatozoidesUso de detergentes no polares: tritn y tween que desestabilizan la membrana espermtica podran ser usados.Congelamiento y descongelamientoIntegracin mediada por restriccin enzimtica (REMI)La incubacin de las clulas espermticas con el ADN forneo y anticuerpos monoclonales (mAb C)(REMI) el ADN forneo es introducido conjuntamente con la enzima de restriccin mediante electroporacion, se corta el ADN diana y el plsmido con bordes cohesivos, permitiendo la integracin del transgen en el genoma. 20

Ventajas Eficiente y barato

Usado en especies resistentes a microinyeccin.

Frente a la microinyeccin permite la transformacin de un alto numero de embriones en un solo paso. (peces)

Es altamente regulada y es muy especifica

La incorporacin de ADN en clulas espermticas mediada por complejos ADN-lisosomasEjemplos de animales transgnicos La oveja Tracy en 1992, la primera oveja que produjo una protena humana, la alfa-antitripsina bajo la direccin del promotor ovino de la beta-lactoglobulina.

La cerda Genie, que fabrica en su leche la protena C humana que controla la coagulacin sangunea y es necesaria para los hemoflicos.

23Bibliografa Miao, X. (n.d.). Recent Advances and Applications of Transgenic Animal Technology.Houdebine, L. M. (2002). The methods to generate transgenic animals and to control transgene expression. Journal of Biotechnology, 98(2-3), 145160. http://doi.org/10.1016/S0168-1656(02)00129-3Coll, J. M. (2001). El Transposn SB de salmnidos como vector para transferencia de genes en vertebrados. Prod. Sanid. Anim, 16(2), 237244.Falco, A., Rocha, A., Tafalla, C., Estepa, A., & Morales, J. C. (2006). Posibles aplicaciones Acuicultura de peces a la Transposones ( Tns ) de peces basados en ADN-ARN-ADN y ADN-ADN. Revista AquaTIC, 24, 6171.Narbn, P. (2008). Transferencia gnica en animales, 153.Zulia, U., Alberto, F., Alberto, L., Ondiz, D., & Cientfica, R. (2010). ESPECIE PORCINA: EFECTO DE LA PRESENCIA DE ADN EXGENO SOBRE LA CALIDAD SEMINAL Y EVALUACIN DE LA PRODUCCIN in vivo DE EMBRIONES TRANSGNICOS Sperm Mediated Gene Transfer in Pigs: Effect of Exogenous DNA Presence.