Transformación

Ingreso a la célula de DNA presente en el medio

Bacterias

Levaduras

Células de animales (mamíferos)

Células vegetales

Bacterias (Escherichia coli)

Plásmidos → elementos extracromosómicos de replicación autónoma

Plásmidos manipulados por ingeniería genética: vectores de clonamiento

►Origen de replicación

►Gen de resistencia a antibiótico (marcador de transformación)

►Sitio de clonamiento (“polylinker”)

Transformación (transfección) llevada a cabo por:

1. Permeabilización con CaCl2, choque de temperatura

2. Electroporación

Utilidad

►Biblioteca de cDNA - sitio de clonamiento asociado a gen de -galactosidasa

►Expresión de proteínas recombinantes - sitio de clonamiento asociado a operón

lac (expresión inducible por IPTG) y elemento que facilite purificación (ej. His-tag)

H

HO

X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)

-galactosidasa

galactosa

Colonias azules : fragmento clonadoColonias blancas : sin fragmento

Productoazúl

- IPTG → expresión bloqueada+ IPTG → expresión

Levaduras (Saccharomyces cerevisiae)

Plásmidos → del tipo lanzadera (“shuttle”)► Origen de replicación en E. coli► Gen de resistencia a antibiótico (selección en E.coli)► Origen de replicación en levadura

● 2 ● ARS (secuencia de replicación autónoma)

► Marcador de selección metabólico

YACs → Cromosomas artificiales de levadura► Secuencias teloméricas► Secuencias centroméricas► Marcador de selección metabólico► ARS (secuencia de replicación autónoma)

(YAC)

Vectores y marcadores de selección en levaduras

Transformación llevada a cabo por:

1. Generación de esferoplastos, permeabilización con CaCl2, choque de temperatura

2. Tratamiento con acetato de litio y PEG, choque de temperatura

Utilidad

► Expresión de proteínas recombinantes que no se pliegan correctamente en E. coli

► Clonamiento de fragmentos muy grandes para el estudio de genomas complejos

(YACs)

► Genes de levadura → similitud con genes de animales y plantas superiores

Levadura útil como modelo para probar función de genes de

otros organismos

Manipulación de genes por recombinación homóloga

Eliminación (KO) de genes cromosómicos

“Plasmid shuffle”

Estudio de función de genesmutantes o genes foráneos

KO TPK1, TPK2, TPK3

Interacción de proteínas por ensayo de doble híbrido

Animales

Genes en:

► Fragmentos de DNA

► Vectores tipo plásmido con elementos virales

► Virus

Fragmentos y vectores que no se replican → Transitoria Permanente (integración)

Vectores que se replican y virus → Genomas extracromosómicos independientesPartículas virales

Transformación llevada a cabo por:

Microinyección

DNA precipitado con fosfato de calcio (endocitosis)

Electroporación

Liposomas

Infección viral

Utilidad

► Expresión de proteínas recombinantes

► Estudio de la expresión de genes en entorno natural (promotor + gen reportero)

► Estudio de la función de los genes en entorno natural● Expresión● Silenciamiento (antisentido)

Marcadores de selección

Ejemplo 1: Transformación con

fragmentos de DNA

Ejemplo 2: Transformación con

vectores

Localización de HBZ-GFP y HBZ-SI-GFP en células COS7

Murata et al. J. Virol. 80(5): 2495-2505 (2006)

Vector: pcDNA3/HBZ-GFP pcDNA3/HBX-SI-GFP

Ejemplo 3: Transformación combinada

fragmentos de DNA y virus

Ejemplo 4: Transformación combinada

fragmentos de DNA y virus

Ejemplo 5: Transformación con virus (retrovirus)