Trabajo Práctico

Observación de vectores.

Estudios Parasitológicos

Floridia Ricardo Ariel

2015

Objetivos

Reconocer los Hemípteros hematófagos basándose en la discriminación de características distintivas.

Conocer y aplicar adecuadamente las técnicas de diagnóstico parasitológico.

Reconocimiento de Vectores

Determinar que el insecto hallado es un posible vector de la enfermedad de Chagas – Mazza.

Analizar el vector para tomar medidas sanitarias:

Estudios parasitológicosEstudios seriadosBúsqueda de vectores en la viviendaVigilancia epidemiológica

Clasificación de vectores

Reino Animalia Phylum Arthropoda Clase Insecta Orden Hemiptera Familia Reduviidae Subfamilia Triatominae Género: Triatoma, Panstrongylus, Rhodnius Especie: aproximadamente 140

Orden: Hemiptera

Sus alas anteriores (o hemiélitros) están divididas en una mitad basal dura y una mitad distal membranosa.

Familia: Reduviidae

Es una familia grande y cosmopolita de hemípteros.

Comprende grupos de insectos hemipteros: fitófagos, depredadores, hematófagos

Se alimentan mediante una proboscide que dependerá del tipo de alimento.

Subfamilia: Triatominae

Son todas especies hematófagas Son grupo de insectos que se reconocen por poseer

un aparato bucal recto y con tres segmentos. Su comportamiento hematófago le confiere su

capacidad vectora y transmitir al parásito sanguíneo Trypanosoma cruzi.

Los Triatominos poseen un ciclo de vida que va desde huevo hasta adulto, pasando por cinco estadios ninfales inmaduros sexualmente y carentes de alas.

Carácter hematófago

Los vectores:

Son artrópodos hematófagos. Se distribuyen en América desde el paralelo 43° al Norte

(Sur E.U.), hasta el paralelo 49° de latitud sur (Argentina), hasta una altitud de 2000 msnm.

Aproximadamente 60 son infectantes, y 16 viven en Argentina.

Se conocen con distintos nombres: Colombia : Pitos Brasil: Barbeiros, Mexico: Chinche hocicona, Chinche de Compostela, Besucona. Venezuela: Chipos Argentina: Chinche gaucha Perú: Chirimaya Paragüay: Chichá Ecuador a la Argentina: Vinchucas

Mapa de Triatominos en América

Rhodnius prolixus Triatoma infestans

Panstrongylus megistus

Triatoma dimidiata

Triatoma pallidipennisTriatoma sordida

Triatoma patagónica

Panstrongylus geniculatus

Rhodnius pallescens

Descripción general

Cabeza: posee los órganos sensoriales

Torax: están insertados los órganos locomotores

Abdomen: están el aparato reproductor y las aberturas respiratorias.

Ciclo biológico

El ciclo desde el huevo al adulto puede tardar entre 8 meses a un año

Huevos 5 Estadíos ninfales Adulto

Huevos de triatominos

La hembra pone hasta 200 huevos. Los deposita en lugares ocultos. El período de incubación depende de la temperatura

ambiente, pero oscila entre 10 y 40 días. Miden de 2 a 3 mm, forma elíptica, operculados, de

color blanco, cambian a rosado cuando se completa la evolución del embrión. Pueden observarse los ojos de los insectos dentro.

Los estadíos ninfales

Antes de llegar a adulto debe pasar por los 5 estadios Las ninfas carecen de alas, ocelos y genitales. El primer estadio de ninfa puede medir 2mm. El insecto sufre metamorfosis periódicas dependiendo de la

alimentación, temperatura y humedad. Los estadios 1, 2 y 3 pueden realizar la muda con una ingesta

sanguínea completa, pero los estadios 4 y 5 normalmente requieren alimentarse más de una vez para mudar.

Forma de alimentación: coprofagia, canibalismo, y de animales

Muda del exoesqueleto: alimentación.

Insecto adulto

Viven unos quince meses. El tamaño varía entre 1,5 cm y 3 cm de longitud, y

entre 8 a 10 mm de ancho, según sexo, repleción y madurez ovular en la hembra.

El color es variable según la especie(pardo oscura) con un reborde de bandas transversales que se alternan en colores pardos y claros.

Su cuerpo es chato pero cuando se alimenta su abdomen se hincha

Insecto adulto

Cabeza: alargada, fusiforme y termina en una proboscis recta que en reposo se dobla centralmente sobre el cuerpo y se extiende en el momento de la picadura.

Ojos: un par compuestos que son globosos y prominentes por delante de los cuales emergen un par de antenas cuyo punto de implantación diferencia géneros. Un par de ojos menores, los óselos.

Torax: es quitinoso y su segmento anterior tiene forma de escudo.

Alas: son dobles y permanecen dobladas sobre el dorso. Las alas posteriores que se doblan debajo de las primeras son delgadas y membranosas, las anteriores tiene una parte dura y otra membranosa.

Aparato bucal

Llamado proboscide o rostro, facilita la tarea de chupar sangre en los triatóminos.

Posee tres segmentos y en el momento de picar se dobla y extiende.

El rostro es una característica común y ancestral entre los hemípteros y puede ayudar a distinguir un hemiptero triatómino de uno no hematófago. – Es largo en los hemípteros fitófagos – Corto y curvo en los depredadores (entomófagos).– En los hematófagos triatóminos es recto.

Fitófago

Predador

Hematófago

Triatoma sanguisugar

Predador

Triatoma spinolai

Predador

Chinche del algarrobo

Segmentos de la antena de un triatomino

Los triatóminos poseen antenas de cuatro segmentos en ambos lados de la cabeza y frente a los ojos.

La distancia relativa entre las antenas y los ojos permite determinar los géneros: Rhodnius, Triatoma y Panstrongylus.

   

Torax

El pronoto, está dividido en un lóbulo anterior y otro posterior.

Puede tener espinas y/o tubérculos de interés taxonómico.

También es notorio que el mesonoto de los adultos esta reducido a un escutelo.

Abdomen

El abdomen de los adultos esta compuesto de 11 segmentos.

Los últimos segmentos conforman el sexo. El conectivo, es decir, la parte que bordea el

abdomen, muestra un patrón de manchas que varia en color y formas según la especie.

Las alas no siempre estan presentes (Ausente en Triatoma espinolai).

Se pueden diferenciar machos y hembras en su último segmento:– En los machos la terminación es redondeada – En las hembras es triangular y sobresale del

abdomen.

Triatoma boliviana

Hembra Macho

Aparato digestivo

Los triatóminos succionan sangre a través de la proboscide.

La sangre ingerida pasa a la faringe, luego al esófago y se almacena en el estómago (95% simbiontes).

La ingesta pasa al intestino delgado. En la parte anterior sufre un proceso de digestión, y en la posterior, un proceso de absorción.

Finalmente, los restos de la ingesta, así como algunas bacterias simbiontes y parásitos tripanosómidos, son evacuados a través del recto.

Patógenos para los triatominos

T. rangeli Blastocrithidia triatominae

Glándulas exocrinas

Los triatóminos tienen cinco diferentes pares de glándulas que al igual que en otros reduvideos se encuentran en el tórax o en el abdomen: – Glándulas metasternales– Glándulas de Brindley– Glándulas dérmicas– Glándulas ventrales– Glándulas abdominales.

Las más estudiadas son las dos primeras, las cuales producen olores y sabores de beneficio para el insecto.

Glándulas de Brindley: Segregan ácido isobutírico y otros ácidos carboxílicos, así como, alcoholes y esteres.

Glándulas metasternales: en las hembras de R. prolixus, T. infestans y T. brasiliensis producen una feromona que atráe a los machos.

Homeostasis y excreción

La excesiva ingesta de líquido implica un eventual desequilibrio fisiológico y vulnerabilidad frente a sus depredadores.

El órgano esencial del sistema de homeostasis y excretor de los triatóminos lo constituyen los tubos de Malpighi.

Los triatóminos convierten el amoníaco en ácido úrico.

El ácido úrico es relativamente insoluble e inerte, por lo cual puede ser retenido en forma de cristales por largos períodos de tiempo. Los triatóminos utilizan menos agua para su síntesis, y lo excretan por el recto en forma de discos blanco amarillentos.

Alimentación

Se alimenta, desde que nace hasta que muere, exclusivamente con sangre humana o de animal de sangre caliente.

Se alimenta de noche, cuando su presa esta inmóvil por el sueño, despliega su trompa e inserta los estiletes bucales en la piel de la víctima. Como la picadura es indolora, el insecto dispone de tranquilidad para sorber la cantidad de sangre hasta llenarse.

Como absorbe hasta que está repleta, es incapaz de volar. Por eso regresa caminando lenta y torpemente hasta su refugio habitual.

Resistencia al ayuno

Tanto machos como hembras se alimentan de sangre en una cantidad que puede ser de 10 veces el peso de su cuerpo en ninfas 1, 2 y 3. En ninfas 4 - 5 y adulto toman de 4 a 5 veces el peso de su cuerpo.

La resistencia al ayuno de este insecto es muy grande. – Ninfas de estadios 1 al 4: de 2 a 3 meses de

ayuno– Ninfa de quinto estadío: hasta 6 meses de ayuno.– Adulto: mas de 6 meses

Hábitos

Durante el día están en el refugios y en la noche salen a alimentarse.

Refugios domésticos y silvestres. El clima influye en la distribución y reproducción . Es común que se desprendan de los techos,

haciendo al caer un ruido notorio que puede alertar sobre su presencia.

Necesita aproximadamente 20 minutos para succionar la cantidad necesaria de sangre.

Agregación

Los triatóminos, de hábitos nocturnos, se agregan especialmente al final de la noche; generalmente regresan a su refugio luego de chupar sangre y guiados por olores que ellos mismos han depositado allí.

En el refugio consiguen aparearse, protección y condiciones de humedad y temperatura más favorables que en el exterior, de modo que allí permanecen durante el día; la mayor parte del tiempo en un estado de inmovilidad. Se ha observado que si bien el comportamiento de agregación es cíclico, este no parece estar regulado de manera endógena por un reloj circadiano.

Búsqueda de Triatominos

En el peri-domicilio En el interior de la vivienda, cercana a la cama. Presencia de deyecciones en las paredes Identificación del insecto.

Estudios Parasitológicos

Búsqueda de Tripanosoma cruzi en insecto vector

Identificar si se trata de un insecto de la subfamilia Triatominae (posible transmisor de la enfermedad de Chagas – Mazza

Tomar el insecto con la pinza

Búsqueda de Tripanosoma cruzi en insecto vector

Liberar el contenido intestinal.Con dos pinzas

Precauciones. Guardapolvo, guantes, gafas y vidrio protector.

Observar al microscopio a 40x

Búsqueda de Tripanosoma cruzi en insecto vector

Xenodiagnóstico

Considerado el método de referencia Sensibilidad: formas agudas 85 al 100%, 80% en las congénitas y

entre 20 al 50% en las crónicas. Las cajas están compuestas por ninfas de 3o a 4o estadio, con algunas

semanas de ayuno y ávidas de alimentarse. Se colocan alrededor de 10 a 12 ninfas dentro de una caja, con una boca libre, cubierta con gasa; se utilizan 4 de estas cajas sobre la piel de los antebrazos.

Xenodiagnóstico

Observar contenido intestinal entre los 30 a 60 o 90 días de la succión de sangre.

Se busca tripomastigotes o epimastigotes en el contenido intestinal.

Método Strout

Es el método de preferencia en la etapa aguda (hasta los 40 – 60 días post infección)

Reconocer la movilidad de los parásitos entre los hematíes

Se debe repetir en forma seriada (3 veces)

También se utiliza para control de tratamiento Para informar un Strout como positivo debemos observar

la movilidad del parásito. IMPORTANTE: observar recorriendo todos los campos

(no menos de 45 minutos) y varios preparados

Sensibilidad 95%

5-10 mL

Tº amb

Coag.

600 rpm 2 min.

2500 rpm 10 min.

Suero

Sedimento

Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)

Micrométodo de Strout

Se utiliza un tubo Eppendorf de 1,5 ml de capacidad al que se le agrega una gota de heparina más 0,5 ml de sangre venosa, se mezcla por inversión

Centrifugar durante un minuto a 3000 rpm. Tomar una gota de la interfase, rica en glóbulos

blancos, y se observa entre porta y cubreobjeto al microscopio con 400 aumentos. Deben observarse como mínimo 4 preparados.

Sensibilidad similar al Strout Reducción de cantidad de sangre a extraer.

Medicina Vol 59 Supl III – 1999De Rissio, AM; Maidana,CG; Martín García, MC y Ruiz, AMINP”Dr. Mario Fatala Chabén” 

Microhematocrito

Para diagnóstico durante la etapa aguda o en los casos congénitos.

Es importante extraer 6 tubos capilares (50 ul c/u) Sensibilidad semejante a strout Observar varios preparados con las consideraciones

del strout Inconveniente:

Bioseguridad

J Clin Microbiol. 1983 August; 18(2): 327-330

H Feilij, L Muller and S M Gonzalez Cappa

Sensibilidad 90 a 95%

45 segundos a 5000 rpm

6 a 9 microhematocrito heparinizado

Cerrar extremo con plastilina

Cortar

BIOSEGURIDAD

Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)

Gota fresca

Método que se puede efectuar en la etapa aguda

De fácil realización De baja sensibilidad Observar movilidad de los parásitos.

Aumentar irrigación

Sensibilidad 50%

100x / 400x

gota de citrato al 2%)

Tripanosoma cruzi

45 minutos

Gota gruesa

Método sencillo Baja sensibilidad Observar morfología del parásito

Sensibilidad 50%

Colocar 1 a 3 gotas

Desfibrinar

1-2min

Dejar secar

Colorear con Giemsa diluido (1/20) 30 minutos.Lavar y secar

objetivo de 100x aceite

Tripanosoma cruzi

Hemocultivo

Consiste en sembrar una muestra de sangre en un medio de cultivo artificial y amplificar el número de parásitos. Como producto del cultivo se obtienen epimatigotes de T. cruzi.

Es aplicable a la etapa aguda pero también en la crónica, en la cual disminuye en gran medida la sensibilidad.

Requiere de un tiempo prolongado para obtener resultados. Se puede realizar una coloración (Giemsa) para visualizar el

tripanosoma con mayor definición.

Sensibilidad: Agudo: 80 – 100%Crónica:40 – 60%

PCR para Chagas

No está validad (solo para seguimiento de tratamiento)

Tiene elevada sensibilidad (aún en etapa crónica) Falsos positivos y algunos falsos negativos. Selectivo para T. cruzi y T. rangeli Amplifica un fragmento de 330 pb del ADN k

Mix p/1x30: 30ul

H2O: 12,7 ul Buffer (10x) Taq: 3 ul MgCl2 (25mM): 3,6 ul dNTPs (5mM): 1,5 ul Primer 121 (50pmol/ml): 1,5 ul Primer 122 (50pmol/ml): 1,5 ul Taq (0,8ul/20ul): 1,2 ul TOTAL: 25 ul

(1x25ul)  25ul mix + 5 ul

(muestra)

PCR para Chagas

Temperature Time

4ºC 3 minutos

94 ºC 3 minutes

94 ºC 1 minute

68 ºC 1 minute

72 ºC 1 minute

94 ºC 45 second

64 ºC 45 second

72 ºC 45 second

72 ºC 10 minutes

4 ºC Hold

35 cycles

5 cycles

Bibliografía

Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de la Trypanosomiosis americana (enfermedad de Chagas). Serie de Normas Técnicas Nº 00. Lima, 2005

Fortalecimiento en la Enseñanza de la Enfermedad de Chagas Diagnóstico de Laboratorio Dra. Beatriz Basso* * Profesora, Servicio de Neonatologia, Cátedra de Pediatría y Neonatología. Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba Universidad Nacional de Córdoba

Parasitosis regionales. Un estudio referido a las principales parasitosis de Bahía Blanca, Provincia de Buenos Aires, Argentina. Sixto Raúl Costamagna, Elena C. Visciarelli.

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Diciembre, 2009 Aspectos exocoriales de huevos de Triatoma patagonica Del Ponte, 1929 por microscopía electrónica de barrido Elena VisciarelliI; Adriana FerreroII; Sixto

Raúl CostamagnaI. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur, San Juan 670, 8000 Bahía Blanca, Prov. de Buenos Aires, Argentina. E-mail: evisciar@criba.edu.ar ICátedra de Parasitología Clínica. IICátedra de Zoología de Invertebrados II

Las especies de Triatominae de mayor adaptación al hombre, tratadas en este trabajo. Hipotesis sobre el desarrollo de la Trypanosomiasis Americana - Carpintero, D. J. y Viana, E.J. Buenos Aires, Argentina

Alimentación y defecación en triatominos del género Rhodnius (Hemiptera: Reduviidae) alimentados con sangre humana. E. Aldana     E.Lizano     M.Rodríguez     A. Valderrama. Recibido  28-IV-2000.  Corregido  20-XI-2000.  Aceptado   20-XI-2000 

Ecología de la enfermedad de Chagas, y su prevención y control en la Amazonia. Un enfoque de ecosalud. Roberto Bazzani, IDRC/CRDI; Roberto Salvatella, OPS/OMS

La aerotermia como alternativa para el control de Triatoma infestans (Hemiptera, Reduviidae) resistentes a deltametrina. Alberto G. GentileI; José L. SartiniII; María C. CamposIII; Juan F. SánchezIV. ICoordinación de Gestión Epidemiológica, Ministerio de Salud Pública, Salta, Argentina

Diagnóstico Molecular de la enfermedad de Chagas. Constança Britto. Laboratorio de Biología Molecular y Enfermedades Endémicas, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, 21040-900, Río de Janeiro, RJ, Brasil. Correo electrónico: cbritto@ioc.fiocruz.br

Utilidad de la técnica de PCR. en el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Brusés, Bettina L. - Lucero, Horacio - Gorodner, Jorge O. Departamento de Biología Molecular - Instituto de Medicina Regional - UNNE.