trabajo de expo amilasas

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE INGENIERÍAESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE

INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

“TECNOLOGIA DEL BIOPROCESAMIENTO DE AMILASAS”

CURSO: BIOINDUSTRIASDOCENTE: Ing. Augusto ,CASTILLO CALDERON.

CICLO: IX

Tecnología del bioprocesamiento de amilasas Página 1

“TECNOLOGIA DEL BIOPROCESAMIENTO DE

AMILASAS”

“TECNOLOGIA DEL BIOPROCESAMIENTO DE


AMILASAS”

I. INTRODUCCION:

Las Amilasas son una familia de enzimas que rompen el almidón (polisacárido),

primero en cadenas cortas y luego en glucosa libre. Las amilasas son utilizadas en

cervecería, en panificación e industria textil. La principal aplicación de las amilasas es

en la industria cervecera. El problema en la fabricación de la cerveza en que las

levaduras sólo son capaces de fermentar las hexosas (principalmente, glucosa). También

pueden utilizar como fuente de energía a los disacáridos, como la sacarosa y la maltosa,

los cuales son degradados a monosacáridos por enzimas hidrolíticos de la célula. La α-

amilasa (1,4, α-glucanohidrolasa) es una enzima extracelular que hidroliza los enlaces α

1-4 glicósidicos de polisacáridos, tales como el almidón, glicógeno o productos de

degradación de los mismos.

Tiene una actividad enzimática que oscila entre 53-129 U/L, su peso molecular va de

los 40 000 a 50 000 Da, su actividad requiere de la presencia de iones cloruro. Esta

enzima tiene importancia en la industria alimentaria como: dulcería, cereales y

panadería, y específicamente en la sacarificación maltogénica, sin embargo, su

producción es limitada y es un producto de exportación. La α-amilasa que es producida

de manera natural por Aspergillus oryzae tiene un peso molecular de 52 x 310. Las

enzimas de origen microbiano presentan ventajas técnico-económicas: poseen tiempos

de generación menores, tienen requerimientos de espacio menor por unidad de enzima

producida y una potencialidad ilimitada en cuanto a la disponibilidad de nuevas

enzimas. Los preparados industriales de enzimas, se caracterizan por la actividad

particular de la enzima deseada, por el efecto del pH, temperatura, tiempo de reacción,

concentraciones de la enzima y del sustrato, así como el efecto de los inhibidores o

activadores, que pueden presentarse en las aplicaciones industriales. La producción de

una enzima, incluye dos etapas principales: la fermentación, en la que se multiplica el

microorganismo productor de la enzima, y la de recuperación y purificación en la que se

aísla la enzima y se lleva al grado de pureza adecuado para su uso. En la industria se

utilizan más los preparados enzimáticos, pues la purificación de la enzima podría

representar costos adicionales en la producción de alimentos. La calidad de la enzima


está en función de la fermentación, pues esta influye directamente en la

coloración, olor y estabilidad de la enzima.

La β- amilasa o α- 1,4 glucan – maltohidrolasas es una exoenzima que ataca los

enlaces α- 1,4 glucosídicos en la parte externa de la cadena de almidón, la β- amilasa

separa unidades de maltosa a partir de extremos no reductores de esta por hidrolisis

alternas de enlaces glucosídicos (Pedroza, 1999). Las β amilasa atacan la amilosa solo

desde un extremo a la vez, y a causa de ello, son mucho menos afectivas que las α-

amilasas (Baker,1994 ).

Debido a que esta enzima está imposibilitada para hidrolizar los puntos ramificados α-

1,6 en la molécula de almidón, los productos finales de la acción sobre el sustrato son

maltosas y dextrinas. Formándose pocas cantidades de maltotriosas y glucosa.Las β-

amilasas contienen un grupo sulfhídrico esencial para la actividad enzimática, que se

lleva acabo de forma óptima en un rango de Ph entre 4 y 5.La actividad de la enzima se

analiza mediante métodos colorimétricos que miden la cantidad de azucares reductores,

liberados a partir del almidón. Estas enzimas están presentes en gran número de

bacterias Gram positivas formadoras de esporas, (Gonzales , 2002). Aunque el

rendimiento en las cepas silvestres es generalmente bajo, se han descubierto mutantes

que producen 200 veces más enzimas que la cepa silvestre (Crueger y Crueger, 1993).

II. OBJETIVOS:

- Conocer los microorganismos más utilizados en este campo y los sustratos mas característicos para la producción de amilasas.

- Conocer los productos comercializados en el mercado en base a microorganismos productores de amilasas.

- Conocer las aplicaciones de las amilasas en la industria alimentaria

- Dar a conocer investigaciones recientes en el campo de la producción de amilasas.


III. ANTECEDENTES:

La producción de enzimas para uso industrial tuvo sus orígenes en Dinamarca y

Japón, a finales del siglo XIX, cuando se produjeron las primeras preparaciones de

renina a partir del estómago de terneros y de amilasa de origen fúngico.

Las amilasas son enzimas las cuales hidrolizan moléculas de almidón dando como

productos dextrinas y polímeros compuestos progresivamente por unidades de glucosa

Esta familia de enzimas hidrolíticas está compuesta por a proteínas catalíticas: alfa-

amilasa, beta-amilasa; glucoamilasa; isoamilasa. Se encuentran ampliamente

distribuidas en tejidos vegetales, donde juegan un rol muy importante en la degradación

del almidón en la germinación de las semillas; en tejidos animales, cumpliendo una

misión digestiva; y en diversas especies de microorganismos como hongos y bacterias.

Como bien es conocido las cadenas de almidón están compuestas por dos grandes sub-

cadenas, amilosa y amilopectina. La alfa-amilasa se caracteriza por atacar los enlaces

1,4-alfa-glicosídicos en el centro de la cadena de los polisacáridos, por lo que se la

conoce como endoamilasa, produciendo glucosa, maltosa y oligosacáridos.

La enzima alfa-amilasa en su accionar degrada la amilosa en maltosa y pequeños

compuestos de glucosa. Sin embargo, esta enzima solo es capaz de degradar

parcialmente la amilopectina y el glucógeno debido a que no es capaz de desdoblar los

enlaces glicosidicos1-6 encontrados en los puntos de ramificación de la cadena del

polisacárido. Por otro lado, La beta-amilasa, presente en plantas y bacterias, también

cumple la función de degradar los enlaces 1,4-a-glucosídicos.

Importancia del bioproducto:

Mundialmente, la producción de enzimas está desarrollándose aún más, bajo el

principio de optimizar procesos y convertirlos en bioprocesos. La aplicación de esta

industria gira en torno a países industrializados que tienen la capacidad de investigar y

producir a gran escala lo cual margina a países menos desarrollados a causa de carencia

de recursos, infraestructura y desarrollo en el campo biotecnológico. Sin embargo, esta

afirmación no ha sido un impedimento para que en diversos lugares del mundo se

investigue en el área de la enzimología y el impacto que estas ocasionan en los procesos

y reacciones químicas. Las enzimas amilasas son las más estudiantes en este campo


debido a su influencia directa en la degradación del almidón, uno de los

productos alimentarios más explotados a nivel mundial.

Las enzimas son productos de las células y por lo tanto pueden obtenerse a partir

de tejidos animales, tejidos vegetales o mediante procesos de fermentación empleando

microorganismos seleccionados. Las plantas han sido la fuente tradicional de ciertas

enzimas. La cebada malteada también ha sido fuente importante de enzimas vegetales.

La industria cervecera ha empleado tradicionalmente este material crudo por su

actividad proteásica y amilásica. Debido a que las aplicaciones industriales de las

enzimas requieren que estas sean producidas a gran escala y bajo costo, el empleo de

algunas enzimas de origen vegetal y animal ha ido decayendo, a favor de las enzimas de

origen microbiano.

Países productores:

Unas 20 Compañías de Europa, Japón y Estados Unidos Realizan la Producción de

Enzimas, pero el mercado es dominado por 3 de Ellas:

Compañía Países (%)

Novo Nordisk Dinamarca Con El 50% de Las

Ventas a Nivel

Mundial

Gist

Brocade

s

Neatherlands Con El 35% de Las

Ventas a Nivel Mundial

Rhom

and

Haas

Alemania Con El 15% de Las

Ventas a Nivel Mundial

El mercado de las enzimas ha tenido gran crecimiento a partir de los Años 70. En la

Industria Alimentaría. En América latina existen empresas productoras de enzimas en:

México, Brasil, Argentina y Uruguay.

En Colombia hay una enorme producción de enzimas una escala industrial, siendo

Importadas de Diversos Países de Europa, de Japón, Estados Unidos, Canadá y México.


Usos y aplicación de las enzimas:

Reducir viscosidad (hidrólisis).

Mejorar extracciones (degradación de pectina).

Hacer bioconversiones (glucosa a fructosa).

Sustitución de ingredientes y coadyuvantes en procesos.

Algunas amilasas bacterianas se emplean como detergentes para

disolver almidones en determinados procesos industriales.

En la maduración de frutas la amilasa es sintetizada en la

maduración, degradando el almidón de las frutas en azúcar, y

volviéndolas más dulces.

Ahorro con procesos más eficientes obteniendo menos

subproductos indeseados y mayor capacidad de planta con un incremento

de rendimiento de producto.

Ganancia: mejora propiedades deseables obteniendo un producto

único (jarabe de alta concentración de fructosa)

APLICACIONES DE LA ALFA AMILASA EN PROCESOS

INDUSTRIALES:

INDUSTRIA USO


Las enzimas vuelven los procesos eficientes y menos costosos, en muchos casos, a que

tienen un alto grado de especificidad y adaptabilidad (suaves condiciones de trabajo).

Además, lograr más material procesado con el mismo equipo y menos consumo de energía

también ahorra costos. Al utilizar enzimas en la industria alimentaria nos ofrece la ventaja

de:

Glucosa y jarabes Hidrolisis parcial o total del almidón de maíz para obtener gran cantidad de edulcorantes.

Elaboración de papel Licuan el almidón que ocasiona problemas de viscosidad en la aplicación de fibras (pero variable del papel).

Textiles Licuar el almidón aumentando su solubilidad y mejorando la manufactura de textura.

Panificación Durante el esponjamiento y fermentación de la masa

aceleran la fermentación en la masa, un desprendimiento

gaseoso mayor y uniforme, aumenta el volumen y textura

del pan con una miga de porosidad más fina y de costra más

uniforme y coloreada.

Tabla 1.Aplicación de la alfa amilasa en procesos industriales


Las amilasas ocupan cerca de un 25% en el mercado enzimático llegando a

sustituir completamente procesos de hidrolisis química en la industria del

almidón. Esto se debe a una característica esencial dentro de esta familia de

proteínas. La termoestabilidad de esta enzima, industrialmente, ha hecho que

las amilasas tengan gran aplicabilidad en diversos procesos

Tabla 2. Acción que ejerce sobre el almidón de la fosforilasa, α-

glucosidasa, α- amilasa, β-amilasa y enzimas desrramificadoras.

IV. MATERIA PRIMA:

Las materias primas que sean de costo adecuado y que puedan utilizarse como medio de

cultivo varían naturalmente según la enzima por elaborar y pueden ser de los siguientes

orígenes:

a) Materias azucaradas o amiláceas, como melaza, jarabe de glucosa, almidones y

afrechos de trigo, arroz o maíz;

b) Materias proteicas, como hidrolizados proteicos, harina de pescado, caseína, gelatina

y afrechos de extracción de semillas oleaginosas;

c) Componentes nitrogenados, como sales de amonio, nitratos, urea;

d) Sustancias favorecedoras del crecimiento microbiano; como, extractos y autolizados


de levadura, sales minerales con inclusión de elementos trazas y eventualmente

vitaminas.

- El sustrato principalmente utilizado en la producción de cerveza es el almidón

de cebada, el cual es degradado por las amilasas.

Otro proceso industrial en que participan estos tipos de enzimas es en la obtención de un

edulcorante con alto contenido en fructosa a partir de almidón de maíz, para la

producción de amilasas.

- Fuente de energía: industrialmente predomina el empleo de almidones y

melazas.

- Fuente de carbono: melaza.

- Fuente de nitrógeno: genermente se emplean sales de amonio o amoniaco, pero

ciertos microorganismos y para ello se utilizan productos en las formas mas

económicas con mayor contenido de nitrógeno por ejemplo: derivados de

caseína, soya, levadura.

- Fuentes de minerales: K ,Mg, Fe, fosfatos y sulfatos a los medios de cultivo.


Fuentes Materia prima ,

sustratos , insumos.

C Melaza ,alfrechos de

trigo, almidon de maíz.

N Derivados de caseína,

soya.

Fuentes minerales K ,Mg, Fe, fosfatos y

sulfatos a los medios de

cultivo

Fuente de energía industrialmente

predomina el empleo de

almidones y melazas.

V. MICROORGANISMOS SOBREPRODUCTORES:

Tabla 3: de microorganismo productores de β-amilasas en la industria

alimentaria


Aunque el rendimiento en las cepas silvestres es generalmente bajo, se han descubierto mutantes que producen 200 veces más enzimas que la cepa silvestre (Crueger y Crueger, 1993).

microorganismos productores:

Bacillus polymyxa

B. cereus

Streptomyces sp.

Rhizopus japonicus.


Carbohidrasas:

Se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, son las enzimas

responsables de la degradación del almidón, hidrolizan los enlaces

glucosídicos a-1-4. Las amilasas se pueden dividir en tres grupos:

a amilasas las cuales rompen al azar los enlaces en el interior del

sustrato (endoamiladas).

b- amilasas las cuales hidrolizan ordenadamente unidades de maltosa

a partir de los extremos no reductores del sustrato (exoamilasas) y

glucoamilasas que liberan unidades de glucosa a partir de los

extremos no reductores del sustrato

VI. BIOPROCESAMIENTO TECNOLOGICO

Elaboración de enzimas de origen animal o vegetal: Si se trata de enzimas de

origen animal la simple trituración de algunos tejidos especializados, como el

páncreas o el hígado, permite formar una papilla, la cual se extrae a continuación

con un solvente adecuado como agua, acetona fría

(-20Â°C ), glicerina o una solución salina. En forma parecida se procede con los

tejidos vegetales, previamente sometidos a trituración o disrupción (rotura).

También puede partirse de los jugos de expresión de los respectivos tejidos, cuya

estructura celular se destruye por autolisis, plasmólisis o por congelación, la cual

revienta las paredes celulares.

Elaboración de enzimas de origen microbiano. Actualmente la tendencia

industrial es el reemplazo de muchas enzimas provenientes de tejidos por aquellas

que resultan de la aplicación de cultivos de microorganismos seleccionados, que

generan la enzima específica. La producción de enzimas por microorganismos

tiene la ventaja de su costo, generalmente menor, y por realizarse en un periodo

relativamente breve: Por ejemplo, 1 a 5 días en el caso de una fermentación

discontinua por lotes ("batch"). Además, se puede incrementar el rendimiento de

una enzima especifica por un determinado organismo, recurriendo a modificar sus

condiciones ambientales, o bien, a formar por vía genética cepas mutantes, en las

cuales la producción de la enzima puede ser varias veces superior que en la cepa

original. De este modo procesos de selección, adaptación y mutación han mejorado

considerablemente la producción de enzimas a partir de microorganismos.

Las enzimas elaboradas industrialmente son por lo general del tipo degradativo y

extracelular, es decir, que son excretadas al medio por el microorganismo que las

genera; pues entonces no precisan de la ruptura de las células microbianas para su

extracción como es necesario en las enzimas intracelulares de biosíntesis.

La elaboración de enzimas de origen microbiano comprende diferentes etapas:

1. Selección de microorganismos: Se empieza generalmente por un cultivo de

enriquecimiento de la cepa seleccionada. Cultivos originales pueden obtenerse de la


firma American Tipe Culture Collection (ATCC), del Northern Utilization

Research Branch o de otro organismo o instituto reconocido.

2. Cultivo: Las materias primas que sean de costo adecuado y que puedan utilizarse

como medio de cultivo varían naturalmente según la enzima por elaborar y pueden

ser de los siguientes orígenes:

a) Materias azucaradas o amiláceas: como melaza, jarabe de glucosa, almidones y

afrechos de trigo, arroz o maíz.

b) Materias proteicas, como hidrolizados proteicos, harina de pescado, caseína,

gelatina y afrechos de extracción de semillas oleaginosas.

c) Componentes nitrogenados, como sales de amonio, nitratos, urea;

d) Sustancias favorecedoras del crecimiento microbiano; como, extractos y

autorizados de levadura, sales minerales con inclusión de elementos trazas y

eventualmente vitaminas.

Fuera de la composición del medio constituyen parámetros importantes que

deben controlarse en el cultivo, las condiciones óptimas del caso, en cuanto a

temperatura, pH, aireación (para suministrar el oxígeno necesario y evitar

exceso de calor de reacción), y velocidad de agitación.

En lo que se refiere a los reactores para realizar la fermentación se distingue entre:

---- Los cultivos en superficie de medios líquidos o semisólidos, usándose ya sea

sartenes o tambores rotatorios, y cultivos en profundidad, actualmente más usados,

mediante tanques agitados, de lecho fijo o de lecho fluidizado (partículas

suspendidas y agitadas, lo que facilita su mezcla y circulación.

Terminada la incubación del proceso fermentativo se separa la biomasa junto con

el resto de las células y los componentes sólidos del medio de cultivo por filtración

o centrifugación. El liquido resultante, generalmente aún bastante heterogéneo,

puede utilizarse directamente como preparado enzimático; Pero, generalmente, se

somete a una purificación y/o aislamiento posteriores, que comprenden diferentes

fases y que pueden aplicarse igualmente en las enzimas de origen vegetal o animal.

Purificación y aislamiento de enzimas.


1. Sin perjuicio que un preparado enzimático puede consistir en el mismo

extracto o caldo fermentado que sólo se somete a una clarificación y

concentración (preparado líquido) o desecación (preparado sólido) se recurre

también a métodos de aislamiento y purificación de enzimas en gran escala, lo cual

se logra principalmente por los siguientes procesos:

2. Adsorción selectiva con hidróxidos de hierro o aluminio coloidales: a cierto pH,

pues no todas las proteínas son adsorbidas en iguales condiciones. Una vez adsorbida

se lava con agua o solución salina y luego sé eluye a pH diferente, generalmente

alcalino mediante otra solución salina, por ejemplo, de fosfato.

3. Por precipitación, en que las enzimas son fraccionadas al reducirse su solubilidad

hasta el punto en que precipitan. Esto se logra por adición de sales a cierto pH y a

elevada concentración iónica o por solventes orgánicos (alcohol, acetona,

isopropanol) a baja temperatura. La sal más usada es el sulfato de amonio por su alta

solubilidad, bajo costo, alta atoxicidad para la enzima y por no afectar mayormente la

viscosidad de la solución.

4. Diálisis por gradientes de concentración a través de membranas semipermeables.

5. Ultrafiltración por aspiración o presión a través de membranas de porosidad fina

como tamiz molecular. Presenta una alternativa interesante para separar enzimas,

pues no hay cambio de fases, ni altos gradientes de temperatura .

6. Electroforesis sobre soportes de papel, gel de almidón, agar o dextrano.

7. Fraccionamiento cromatografico Pico de tipo preparativo, tanto en cada fina,

como en columna con intercambiadores iónicos, geles o tamices moleculares.

El control de todas estas etapas en su forma más rigurosa, es necesario para

asegurar el máximo de rendimiento y reproducibilidad, seguridad y calidad de

los productos enzimáticos obtenidos.


VII. AVANCES TECNOLOGICOS Y CIENTIFICOS:

“PRODUCCIÓN DE AMILASA POR EL CULTIVO DE Aspergillus sección nigri”

OBJETIVO GENERAL:

Producción de amilasas en fermentación de cultivo sumergido de Aspergillus

Nigri.

ANTECEDENTES:

Son muchos y variados los antecedentes tanto del cultivo de Aspergillus y otros

hongos filamentosos, como en la producción de diferentes metabolitos, como las

enzimas. Sin embargo el estudio de los microorganismos como productores de

enzimas, es sumamente bajo, siendo de aproximadamente del 2%, y este porcentaje

no incluye solamente a los hongos, sino que también las incluye a las bacterias.

El trabajo de laboratorio llevado a cabo fue posible gracias a que los

microorganismos utilizados tienen un corto tiempo de crecimiento, su cultivo es

fácil, que sus exigencias nutritivas son sencillas y manejables y que los

procedimientos de screening para las características deseadas son más fáciles.

Existe una asociación de comerciantes de enzimas denominada “The Association of

Microbial Food Enzyme Producer”; en dicha asociación figuran empresas de

diversos países como USA, Alemania, Inglaterra, Países Bajos, Dinamarca, Japón,

Italia, etc., pero no figura la Argentina, ni como productor ni como comerciante.

Demostrando que no está desarrollada en la industria de los alimentos, el área de la

producción de metabolitos utilizando microorganismos productores de los mismos,

perdiendo una oportunidad de desarrollo muy importante.

MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS


Los medios utilizados fueron el Papas Dextrosa Agar (PDA), para el

aislamiento primario y como medio formulado y seleccionado previamente

para la fermentación se utilizó el medio 09 con la siguiente composición

Todos los medios ensayados anteriormente tienen como componente básico más

importante el almidón, ya que el mismo puede ser degradado hasta azúcares

sencillas. Pero el caldo 09 fue el que mejor resultado manifestó.

MICROORGANISMOS EMPLEADOS:

Cepas salvajes de Aspergillus Sección Nigri aisladas en PDA.

BIOPROCESAMIENTO TECNOLOGICO:

Preparación del Inoculo:

Cepas de Aspergillus Sección Nigri, aisladas del medio ambiente, e identificado su

género y sección, fueron sembradas en PDA hasta que el desarrollo de la colonia

alcanzo 4 cm de diámetro aproximadamente y con manifiesta esporulación. De la

colonia obtenida se extrajeron esporas, procediendo a su suspensión en solución

fisiológica estéril, para poder realizar siembras en placa con medio 09, realizando

diferentes repiques he incubando en estufa de cultivo, durante 10 días a temperatura

ambiente.

Fermentación

El proceso se realizó en un fermentador Cole Parmer , con un tanque reactor que

cuenta con una capacidad de 2 litros, el equipo cuenta con un sistema de aireación,

utilizando aire filtrado, posee un sistema de mezclado del sustrato para una óptima

transferencia de masa, el método utilizado para el ensayo es en cultivo sumergido,

utilizando una velocidad de agitación de 50 rpm , a una temperatura de incubación de

30°C y un pH=2. La preparación para la operación del fermentador fue realizada


teniendo en cuenta el cierre hermético de todas sus válvulas y su posterior

esterilización a 121°C durante 15 minutos; procediéndose a su inoculación.

Se tomaron muestra en forma diaria del sustrato fermentado para ensayar la

posible presencia de actividad amilolítica en el mismo.

Detección de la presencia de amilasas

La existencia de actividad amilolítica en las cepas ensayadas se determinó “in situ”

utilizando el procedimiento amiloclástico de la hidrolisis del almidón por la

disminución de la formación del complejo almidón-yodo. Observando la ausencia de

almidón detectable por este método.

Los ensayos de screening para comprobar la presencia de actividad amilolítica en el

sustrato fermentado se realizaron agregando 1 ml del mismo a 1 ml de lugol

detectando la presencia de actividad amilolítica por la ausencia de almidón

detectable.


Foto 2: Fotografía del fermentado utilizado

Foto 1: Microfotografía de Aspergillus Sección Nigri. (40X)

Resultados:

Las fermentaciones ensayadas utilizando el método de cultivo sumergido de Aspergillus

Sección Nigri. se llevo a cabo durante 10 días, en este tiempo el microhongo desarrollo

floculos, sin esporulación, con un tamaño promedio de los mismos de aprox. 2 cm

(Foto1). El tamaño de los mismos fue influenciado por la velocidad de mezclado

utilizado, si se aumenta la velocidad, disminuye el tamaño del mismo. Al finalizar los

ensayos de las fermentaciones, el almidón había sido degradado completamente. Al

utilizar un caldo que tiene un sustrato de almidón como única fuente de carbono indica

que la capacidad amilolítica desarrollada por el hongo es importante.

Conclusiones:

Teniendo presente que es factible la producción de amilasas en fermentación de cultivo

sumergido de AspergillusSección Nigri, y su amplia utilización tanto en las industrias

alimenticias, textiles y farmacéuticas es importantecontinuar con futuros ensayos y el

estudio de diversos parámetros.


BIO-PROCESAMIENTO DE LA CÁSCARA DEL PLÁTANO PARA LA PRODUCCIÓN DE AMILASA POR Penicillium sp.

INTRODUCCIÓN

Las amilasas se utilizan en las industrias de procesamiento de almidón para la hidrólisis

de los polisacáridos tales como el almidón en azúcar constituyentes simples . Para

satisfacer la demanda de estas enzimas en las industrias, se requiere un medio de bajo

costo para la fermentación de la amilasa . El proceso de estado sólido de fermentación

(SSF) ofrece una mejor oportunidad para la biosíntesis de productos de alto costo con la

ayuda de un medio de bajo costo. Residuos agroindustriales son generalmente

considerados como el mejor sustrato ; y los usos de los desechos agrícolas hacen SSF un

método alternativo atractivo . En Asia, se ha estimado que alrededor de 20.000

toneladas de cáscara de plátano se descartan anualmente de sus plantas de

procesamiento; presenta serios problemas ambientales. Se estimó que las cáscaras de

plátano contienen 14.6% de glucosa y 56% de sacarosa . Que se realizó un aumento de

la atención a la utilización de diferentes desechos agroindustriales para la agregación de

valor mediante SSF por hongos filamentosos. Las especies de hongos tales como

Aspergillus, Rhizopus y Penicillium se considera que son los principales productores

de amilasa. El objetivo principal del presente estudio es el de utilizar la cáscara de

plátano para la producción de amilasa por Penicillium sp. y la reducción sustancial de la

contaminación agroindustrial para el medio ambiente.

MATERIALES Y METODOS

El aislamiento, la detección e identificación de Penicillium sp.

Pulpa de coco contaminado se recogió del campo de la agricultura y el crecimiento

filamentoso se evidenció la presencia de hongos. El organismo fue recogido

asépticamente y se cultivaron en agar de dextrosa de patata (PDA) y se incubó a 37 ° C

durante 4 días. Las colonias que aparecieron en las placas de agar PDA fueron

transferidos a Czapck levadura autolisado (CYA) placas de agar bajo condiciones


estériles para la purificación y la caracterización adicional de la cultura como se

recomienda por Singh et al. . El medio de agar CYA se compone de (g L)

NaNO3, 3,0, K2HPO4, 1,0, KCl, 0,5, MgSO4.7H2O, 0,5, FeSO4.7H2O, 0,01,

extracto de levadura, 5,0, sacarosa, 30,0, 15,0 agar y solución de metal traza , 1,0 ml. La

solución de metales traza se compone de ZnSO4.7H2O, 1,0 g; CuSO4.5H2O, 0,5 g en

100 ml de agua destilada. Las placas inoculadas se incubaron a 37 ° C durante 7 días.

Revisión preliminar de especies de hongos para la actividad de la amilasa se detectó en

almidón método de la placa de agar según lo descrito por Hols et al. [10]. Además, el

organismo se identificó tentativamente como Penicillium sp. basado en características

morfológicas y la observación microscópica.

Mantenimiento del cultivo e inóculo

Penicillium sp. se cultivó en cultivos inclinados PDA, cultivadas durante 6 - 8 días

para la esporulación y almacenados en un refrigerador a 4 º C para su posterior

inoculación. El inóculo se preparó añadiendo 10 ml de agua destilada estéril y se

transfiere a una cultura PDA inclinación esporulado. Las esporas fueron desalojados con

la aguja de inoculación en condiciones asépticas y la suspensión se utilizó con una

dilución adecuada como inóculo . Un ml de suspensión de esporas contenía

aproximadamente 5 x 106 esporas.

Sustrato

El plátano rojo se obtuvo de la mercado de la fruta local en Nagercoil y pelado. La

cáscara se lavó con agua del grifo, seguido de agua doble destilada para eliminar las

partículas de polvo. Se corta y se secó al aire seguido por el secado al sol durante 8 a 10

días. Las piezas secas se pulverizan, se tamizaron, y se almacenaron a temperatura

ambiente.

Agitar cultivos en matraz

En el presente estudio, Penicillium sp. se cultivó en un sistema de cultivo sumergido en

un medio que contiene polvo fino 2,5% cáscara de plátano y el pH se mantuvo a 7,0,

mediante la adición de NaOH 1 N / HCl. Matraz Erlenmeyer que contiene 150 ml de

medio líquido se inoculó con un ml de suspensión de esporas y se incubó a 37 º C y 150

rpm durante cinco días. Diez ml de medio de cultivo se retiró cada 24 h y la actividad de

la amilasa se ensayó. Este experimento se realizó principalmente para determinar el


período de incubación aproximado para la producción de amilasa, ya que, en

cultivos en matraz de agitación, los parámetros se pueden controlar mucho más

eficazmente que por la SSF.

Fermentación en estado sólido (SSF)

Pellicillium sp. se hizo crecer en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contiene 5,0 g de

la cáscara de plátano. El pH del medio de fermentación se ajustó a 7,0 con tampón

fosfato (0,1 M, pH 7,0) y el contenido de humedad se mantuvo a aproximadamente

75%. El contenido del matraz se mezcló a fondo y se esterilizó en un autoclave a 121 º

C y se enfrió a temperatura ambiente. El sustrato no se enriqueció con sales minerales

durante todo el experimento. Un ml de la suspensión de esporas se inoculó y se incubó a

37 º C. El matraz fermentado se hace girar suavemente cada 12 h para facilitar la mezcla

uniforme. Después de cuatro días de incubación, se añadió 40 ml de agua destilada

doble esterilizada al matraz de Erlenmeyer fermentado. La mezcla se agitó durante 30

min a temperatura ambiente (155 rpm / min) y la suspensión se apretó por tela de

muselina, seguido por centrifugación. Se obtuvo una solución clara y se utilizó como la

enzima en bruto.

Ensayo enzimático

La enzima amilasa se ensayó de acuerdo con el método descrito por knMiller . La

mezcla de reacción consistió en 0,5 ml de solución de enzima en bruto y 1 ml de

almidón soluble (1%, w / v) preparado en tampón de fosfato de sodio (0,1 M, pH 7,0).

La mezcla se incubó durante 30 min a 37 º C y un ml de ácido dinitrosalicílico se añadió

una solución (DNS) y se hirvió durante 10 min. El volumen se completó hasta 20 ml

con agua destilada. La absorbancia se leyó a 540 nm usando un espectrofotómetro UV-

Visible. Una unidad de actividad de la amilasa se define como la cantidad de enzima

que libera 1 μ mol de azúcar reductor como glucosa / min bajo condiciones ensayadas.

Estimación total de proteínas

El contenido de proteína total de la muestra de enzima se determinó como se ha descrito

por Lowry et al. Usando albúmina sérica bovina como estándar (1mg/ml).Impacto de

los parámetros del proceso de producción de amilasa durante la fermentación en estado

sólido y sus propiedades Los parámetros de proceso importantes que influyen en la

síntesis de la amilasa por Penicillium sp. en las propiedades de fermentación y enzimas


de estado sólido fueron estudiados. La estrategia seguida fue, para optimizar

cada parámetro, independiente de los otros y se emplearon condiciones óptimas

posteriormente en todos los experimentos.

Optimización de la producción de amilasa de Penicillium sp.

Parámetros de proceso importantes que afectan a las producciones de amilasa durante la

fermentación en estado sólido (SSF) se han optimizado, a saber, el período de

fermentación, el contenido de humedad y pH. Para la optimización del período de

fermentación, el organismo se cultivó a 37 º C en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que

contiene 5 g de cáscara de plátano. El pH del medio se ajustó a 7,0 con un tampón

fosfato (pH 7,0, 0,1 M). La producción de amilasa se estudió mediante la recolección

del cultivo después de cada 24 h durante cinco días. El contenido de humedad aplicado

fue 30, 40, 50, 60, 70 y 80% (masa / volumen). El pH del medio de fermentación (3.0,

4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0) se ajustó con una solución de tampón adecuado antes de la

inoculación, y se estudió la producción de amilasa. Los experimentos se llevaron a cabo

a 37 ° C, a 150 rpm / min en un agitador rotatorio y la producción de la enzima se

determinó a partir de la enzima en bruto.

Propiedades de las enzimas

Se estudiaron las propiedades importantes de Penicillium amilasa. El efecto del pH

sobre la actividad de la enzima fue encontrado por la incubación de la amilasa en bruto

con un tampón 0,1 M que varió desde 3,0 hasta 8,0 (tampón de citrato, pH 3,0, tampón

de succinato, pH 4,0 y 5,0, tampón fosfato, pH 6,0 y 7,0, tampón Tris , pH 8,0) durante

30 min a 37 ° C y la actividad enzimática se ensayó como se describió anteriormente. El

efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática se determinó mediante la

incubación de la muestra de enzima en bruto a temperaturas que varían de 30 a 70 º C

durante 30 min y la actividad de la enzima se ensayó. La estabilidad térmica de una

amilasa se determinó mediante la incubación de la enzima sin sustrato a 50 ° C durante

1 h y el porcentaje de actividad enzimática residual se ensayó.

La purificación parcial de Penicillium amilasa

Enzima amilasa se purificó parcialmente mediante la aplicación de 3 pasos diferentes.

Todas las etapas de purificación se llevaron a cabo a 2-8 º C hasta que se indique lo

contrario.


Paso 1: fraccionamiento de sulfato de amonio

Amilasa crudo se fraccionó mediante la aplicación de sulfato de amonio sólido que

oscila entre 27 y 33% (g/100 ml). La solución se mantuvo a 2-8 ° C durante 4 h y se

centrifugó a 10000x g durante 10 min. El precipitado se disolvió en un volumen mínimo

de tampón de fosfato de sodio (0,05 M, pH 7,0) y la actividad de la amilasa se ensayó.

Paso 2: cromatografía en columna de Sephadex G-75

La muestra obtenida desde el paso 1 se dializó durante la noche contra el tampón (pH

7,0) y se aplicó en Sephadex G 75 (Amersham Biosciences, Suecia) en columna (1,5 ×

40 cm). Se pre-equilibrada con tampón de fosfato de sodio (pH 7,0, 0,05 M) y se diluyó

con el mismo tampón. La tasa de flujo se ajustó a 1,0 ml min-1 y veinte fracciones (2,5

mL cada uno) fueron recogidas. El perfil de proteínas se representó mediante la

observación de su absorbancia a 280 nm. Las fracciones activas se sometieron para la

actividad amilolítica.

Paso 3: Diálisis

Las fracciones activas obtenidas de la columna de filtración en gel se reunieron y se

concentraron por diálisis contra una solución de sacarosa al 50% durante la noche a 4 °

C. La muestra concentrada se sometió a ensayo de amilasa.

Cimografía amilasa

La muestra se dializó de paso 3 se cargó en una electroforesis en gel de poliacrilamida

no desnaturalizante (8,0%). Para identificar la ubicación de la actividad de la amilasa

(zona clara sobre un fondo azul), el gel se incubó durante 1 h a 37 ° C en 1% de almidón

soluble (w / v) en tampón fosfato (pH 7,0, 0,1 M). El gel se tiñó con una solución ácida

de yodo (0,2% I2 y 2% de KI en HCl 0,2 N)


Tabla No.1: Resumen de Purificación de la amilasa de Penicillium sp. en la

cultura de estado sólido. La muestra de enzima cruda se preparó por

agitación del medio de fermentación (cultivo de 4 días de edad) con 40 ml de

agua doblemente destilada durante 30 min, a 37 ° C en un agitador orbital a 150

rpm.

DISCUSIÓN RESULTADO

Sustrato

El uso de sustrato sólido para la producción de amilasa tiene muchas ventajas sobre la

fermentación sumergida. En este estudio, la cáscara de plátano se utilizó como sustrato

para la producción de amilasa por Penicillium sp. Aunque los estudios revelaron que los

residuos del plátano, principalmente pila plátano fue considerado como el medio de

fermentación para la cultura de estado sólido, muy pocos estudios tratan sobre la cáscara

de plátano. El uso de residuos de plátano en producción de amilasa fue descrito por

Pandey . Residuos del plátano como pila plátano y la cáscara de plátano picado en

Bacillus subtilis se utilizaron para la producción de α-amilasa en SSF.

Evaluación e identificación de Penicillium sp. para la actividad de la amilasa

El organismo fue aislado del coco y se tamiza para la actividad de la amilasa. Almidón

placa de hidrólisis dio como resultado amilasa positivo y 13 mm zona incoloro se formó

alrededor del pocillo de muestra (Fig. 1). El microorganismo aislado en color, el aislar

en Glucosa en placas de agar de Sabouraud fueron de 5 a 6 cm de ancho en la 7 días de

incubación, el reverso era negro parduzco, estípites eran cortos y suaves, la penicilina

tenia forma de ampolla esférica o elíptica y la collula se corta. Los conidios eran lisas y


tenía una reflexión color marrón en la masa. Sobre la base de la observación

morfológica y microscópica, el organismo aislado se identificó tentativamente

como Penicillium sp.

Figura 1: Ensayo de placa de yodo para la

actividad de la amilasa penicilina (la zona de

la degradación del almidón). El caldo de 48

h SSF se incubó en el agujero de placas de

agar de almidón durante 12 h, a 37 º C.

Optimización de la producción de enzimas:

Dada este estudio, la producción de enzimas máxima (36 ± 3U / g de sustrato) se obtuvo

(fig. 2) después de la 4 días de incubación como se describe por Kathiresan y

Manivannan en P. fellutanum; P. janthinellum (NCIM 4960). Se observó que en el

presente estudio, inicialmente, la producción de la enzima aumentó al aumentar periodo

de fermentación hasta 96 h, y disminuyó a partir de entonces. En el cultivo en matraz de

agitación, el período de fermentación óptima para la producción de la enzima se

encontró que era 96 h, similar a la SSF y la producción de enzimas fue de 19 ± 3,5 U /

ml, que era comparativamente menos de SSF. El efecto del nivel de humedad en los

procesos de SSF varían entre 30 y 80%. La producción de la enzima fue alta (24 ± 4 U /

g) a 70% de contenido de humedad (fig. 3). Balkan y Ertan, [20] informaron de que el

contenido de humedad óptimo para el crecimiento y la utilización de sustrato depende

del organismo y el sustrato utilizado para el cultivo. En P. janthinellum (NCIM 4960),

producción de amilasa α se encontró que era alta a 60% de humedad que era casi

comparable con el presente estudio. El efecto del pH sobre la producción de amilasa se

estudió mediante la incubación de Penicillium sp. en el medio de fermentación mediante

la variación del pH de 3,0 a 8,0 a 37 º C durante 96 h. Se obtuvo la máxima actividad de

la amilasa (31 ± 1 U g de sustrato /) a pH 7,0 (Fig. 4) que era comparable con el

resultado de P. rugulosum.


Figura 2: Efecto del tiempo de fermentación en la producción de amilasa. Condiciones

de proceso: temperatura 37 ° C, tiempo de incubación de 5 días, 5 g de cáscara de

plátano, de pH 7,0.

Figura 3: Efecto del nivel de humedad del sustrato inicial (%) en la producción de

amilasa en el sistema SSF. Condiciones de proceso: temperatura 37 ° C, pH 7,0, tiempo

de incubación de 4 días.


Figura 4: Producción de la amilasa por Penicillium sp. a diferentes valores de pH del

sustrato sólido. Condiciones de proceso: temperatura 37 ° C, humedad 70%, tiempo de

incubación 96 h.

Propiedades de las enzimas

El efecto del pH sobre la actividad de la enzima se estudió mediante la incubación de la

solución de enzima con tampones a pH variable (3,0 a 8,0). La actividad de la amilasa

fue de 0,5 ± 0,1, 1,2 ± 0,3, 1,5 ± 0,2, 2,6 ± 0,5 y 2,5 ± 0,5 U / ml para los pH 3,0, 4,0,

5,0, 6,0 y 8,0 respectivamente. El pH óptimo para la actividad de la amilasa se encontró

a pH 7,0 (3,4 ± 0,15 U / ml), que era comparable con Rugulosum penicillium donde se

encontró el pH óptimo en 7,0. El efecto de la temperatura sobre la actividad de la

enzima se ensayó a diferentes temperaturas y la was7.0 pH. La actividad enzimática fue

de 2,3 ± 0,2, 3,8 ± 0,5, 4,0 ± 0,1 y 2,5 ± 0,2 U / ml para las temperaturas de 30, 40, 60 y

70 ° C. La actividad enzimática se encontró que era alta a 50 ° C (4,5 ± 0,1 U / ml) que

se encontró que era 57 ° C en P. rugulosum . La actividad de la enzima se encontró que

era estable a 50 ° C durante 20 min, que correspondía a un 100 ± 2% la actividad

enzimática residual que perdió 13 ± 2,5% después de 30 min de incubación a esta

temperatura. La actividad enzimática fue de 4 ± 1% después de 1 h de incubación a 50 °

C. Estos resultados fueron mejores que el obtenido por otros autores que informó de

que α-amilasa a partir de P. chrysogenum era estable a 30 ° C durante 20 min y perdió

alrededor de 8% a 40 ° C después del mismo tiempo.


Estimación de proteínas

La concentración de proteína de Penicillium sp. se midió por el método de Lowry. Se

encontró que la concentración de proteína extracelular era 13 ± 4 mg ml-1 en la cultura

de estado sólido después de 96 h de incubación a 37 ° C.La purificación parcial de la

amilasa de Penicillium sp.

La amilasa bruto obtenido a partir de la SSF de Penicillium sp. Mostró 0.346 U / mg de

proteína. Fracción de sulfato amónico dio 0.664 U / mg de proteína. Fracciones de

cromatografía de filtración en gel mostraron 15,8 U / mg de proteína con una pureza de

pliegue 45.

La fracción se dializó frente a 50% de sacarosa proporcionó 36,9% de actividad de la

amilasa. El resumen de purificación se representa en la Tabla 1 para Penicillium sp. A

este respecto, Haska y Ohta [23], almidón crudo purificado digestión de amilasa a partir

de P. brunneum N º 24 por la combinación de fraccionamiento con sulfato de amonio,

filtración en gel Toyopearl HW-55F,de DEAE Sephadex A-50 y DEAE etapas de

cromatografía de celulosa. La muestra concentrada obtenida de la diálisis se aplicó el

8% electroforesis en gel de poliacrilamida nativo (como se describe en materiales y

métodos) y la banda incoloro indicó la hidrólisis del almidón (Figura 5).

Figura 5: tinción actividad amilasa. Actividad amilasa visto como una banda incoloro

mientras que el resto de la muestra de gel de fondo azul.

CONCLUSIÓN


El hongo, Penicillium sp. segrega eficazmente amilasa mediante la

utilización de la cáscara del plátano. En Asia, especialmente India más de

20 variedades de plátano y cáscaras de plátano no se utiliza plenamente.

El presente estudio reveló que la cáscara del plátano es el buen medio para la

producción de amilasa por Penicillium sp. Este sustrato se puede utilizar como

el medio sin la adición de otros metales minerales / oligoelementos para la

secreción de amilasa.

Los resultados indicaron un excelente ámbito para la utilización de los residuos

de banano para la producción comercial de la amilasa por Penicillium sp. en

SSF y por lo tanto puede ayudar a reducir la contaminación ambiental.

OBTENCIÓN DE AMILASAS FÚNGICAS A PARTIR DE Aspergillus sp.,

AISLADO DE SEMILLAS DE LENTEJAS.

Este proyecto se llevó a cabo en Bogotá - Colombia y su objetivo fue aislar

microorganismos productores de amilasas para producir enzimas hidrológicas

del almidón. El agente productor detectado fue una cepa del genero Aspergillus

sp. Quien fue aislado de granos de lentejas. Este microorganismo fue llevado a

medio de cultivo en agar YPD bajo parámetros específicos de incubación. Luego

de 18 días se realizó cambio de sustrato a salvado de trigo y se llevó a cabo

pruebas de Lugol, medición de actividad enzimática y extracción del complejo

enzimático. Los resultados indican que las amilasas presentes en el complejo

enzimático obtenido del cultivo de Aspergillus sp., sobre salvado de trigo,

fueron activas en el desdoblamiento de la molécula de almidón a pH 5.0 y

temperatura de 37ºC demostrando su carácter débilmente ácido y su

proveniencia mesófila. El equivalente de dextrosa como medida cuantitativa de

la hidrólisis del polisacárido fue de 6.5, evidenciando la capacidad enzimática

amilolítica del complejo enzimático obtenido. En este trabajo se confirmó teoría

antes mencionada y la capacidad de hongos del género Aspergillus sp., para la

producción de amilasas.

Producción de amilasas por medio de Aspergillus niger sumergidos en cultivos

de aguas de lavado de dos empresas alimentarias.

El objeto de este proyecto fue de analizar la producción de enzimas amilasas por

cepas de Aspergillus niger en aguas de lavado de industrias cerveceras y cárnicas


para determinar la capacidad de producción de proteasas, amilasa y de

depuración de medio donde crecen. La metodología aplicada se basó en la

creación de un medio de cultivo de aguas de lavado con aplicación de

nutrientes que mejoren la adaptación del agente. Se implementó pruebas de

azucares, niveles de nitrógeno y fosforo y demanda química de oxigeno (DQO). Se

analizaron los parámetros de producción de enzima, pH, temperatura y

concentración de iones. Los resultaron indican que los niveles de amilasa y proteasa

obtenidos son marcadamente dependientes de la concentración inicial de almidón en

el medio de cultivo. Las fuentes de nitrógeno (peptona, aminoácidos y extracto de

levadura) fueron totalmente influyentes en la producción de enzimas. El pH óptimo

encontrado fue de 4.95 en las amilasas y la temperatura fue de 50ºC.

Producción de amilasas de levaduras floculantes. Este proyecto desarrollado

en Pakistán se destinó en la consecución de seis especies de levaduras

productoras de amilasas. Para analizar sus niveles de producción bajo el medio

de cultivo agar almidón y como fuente de carbono se agregó extracto de

levadura, almidón y una muestra se suplemento con amilasa salival. El medio

estuvo contenido de los nutrientes ideales para el crecimiento y adaptación del

microorganismo incubado a una temperatura de 25ºC., se realizaron pruebas de

producción de enzima, degradación de sustrato, turbidimetría y velocidad de

crecimiento. Del la metodología ejecutada se aislaron 3 cepas de levadura

correctamente. El mejor resultado se obtuvo en la cepa que trabajó con saliva

humana, produciendo 28 U/ml, la cual presentó una estabilidad en el rango de

25-60ºC. Los niveles de las demás cepas fueron muy inferiores al registrado

anteriormente.

DETERGENTE CON FORMULACIÓN ENZIMÁTICA DE AMILASA

OBTENIDA DE Aspergillus niger. UN ESTUDIO COMPARATIVO EN

DETERGENTES COMERCIALES

El proyecto manifiesta una problemática de la necesidad de compuestos

naturales y eficaces para la industria de detergentes. El presente artículo describe

la producción, purificación y parcial caracterización de un complejo de amilasa

producido por A. niger y uso potencial en formulación de detergentes. Se diseñó

un cultivo con distintos microorganismos a la espera de conocer el agente que


mejor resultados otorgará en cuanto a producción de amilasa se refiere.

Se trabajó con medio APM usando residuos industriales de proteína de

soya y almidón como fuente de carbono además de minerales. Se

realizaron ensayos analíticos con pruebas de DNS, iodometría y control de los

parámetros de pH y temperatura. El extracto obtenido del complejo enzimático

fue comparado en tres formulaciones comerciales de detergentes para determinar

su actividad de limpieza en equipos de hospitales, cirugía y endoscopia. Los

resultados indicaron que el microorganismos con mejor performance en la

producción de amilasa fue el Aspergillus niger con una producción de 3.9 U/ml

en medio sumergido y una actividad excelente de degradación de en el rango de

50-55ºC y un pH de 4.0.

VIII. CONCLUSIONES:

La tecnología enzimática tiene múltiples aplicaciones, como fabricación

de alimentos, los progresos que están realizando actualmente la

ingeniería genética y la biotecnología permiten augurar el desarrollo

cada vez mayor del uso de las enzimas.

La producción de enzimas a gran escala tiene su principal aplicación en

la industria de la fermentación.

La utilización de enzimas en los alimentos presentan una serie de

ventajas, además de las de índole económico y tecnológico.

Las enzimas utilizadas dependen de la industria y del tipo de acción

que se desee obtener.

Se puede manipular genéticamente, la biosíntesis de enzimas para

optimizar los procesos, pero se debe tener en cuenta, las respectivas

normas.

La producción de enzimas a gran escala tiene su principal aplicación en

la industria de la fermentación.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS :

ABU, E.A. 1. ADO, S.A. JAMES, D. B.; Raw starch degrading amylase

production by mixed culture of Aspergillus niger and Saccharomyces


cerevisae grown on sorghum pomace. En: African Journal of

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Food Engineering.

CAMPBELL Sarah L.; The continuous brewering of beer [en línea]

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de 2007.

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Acribia. Traducido por LIRAS PADÍN, P.Zaragoza (España). Biblioteca

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Acribia. Zaragoza (España). Biblioteca de fai.

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análisis microbiológico. Ed. Acribia. Traducido por MORENO

GARCIA, B. España. pp 431. Biblioteca fai


X. ANEXOS:


trabajo de expo amilasas

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