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TITULO:

-ECTO DEL

ALEURONA DE CEBADA

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INTRODUCCION

ESTRUCTURA DE LA SEMILLA DE CEREAL

La semilla de cereal está diferenciada en dos regiones de origen genético diferente: el embrión y el endospermo. El embrión está formado por el escutelo y el eje embriona-- rio, éste ultimo, es la planta en potencia y el escutelo -- sirve para conectar al eje embrionario con el endosperno.

El endosperno a su vez, almacena la mayor proporción - de reservas alimenticias de la semilla y consta de dos teji dos principales, el endospermo almidonoso y la capa de la e leurona; el primero consta de células muertas y la segunda es la capa mas externa de células viables que rodea al en-- dospermo almidonoso ( 7 ) .

I --1

EMBRION

ENDOSPERM0 ALMIDONOSO

CAPA DE ALEURONA

HILO

FIG 1: €SW€MA D€ L4 SEMILLA U€ CEBAD4 CUN SUS PARES PRINQPAALES

i

ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA PLASMATICA

i La aleurona consta de 3 a 4 capas de células circundando a

za por la presencia de prominentes paredes celulares grue-- sac y células no vacuoladas ( 7 ) .

La membrana plasmatica, encierra a cada célula difiniendo - sus límites y manteniendo las diferencias esenciales entre su contenido y el medio ambiente, tambien es un filtro se-- lectivo que mantiene diferentes concentraciones de iones -- dentro y fuera de la célula y provoca la entrada de nutrien tes y la salida de productos de desecho.

Se compone por ensambles de moléculas de lípidos que - están determinando la estructura básica de las membranas y proteinas que se mantienen juntas por interacciones no cova lentes.

Las moléculas de lípidos se encuentran arregladas como una doble capa de 4 a 5 nm de grosor, ésta capa es relativa mente impermeable a la mayoría de las moléculas solubles en agua (hidrosolubles), mientras que las proteinas están “di- sueltast1 en la bicapa lipidica y tienen varias funciones -- ( 1 ) .

Los iípidos constituyen cerca del 50% de la masa de -- las membranas celulares de la mayoría de las plantas y la - composición de estos en cada lado de la bicapalipídica de - la membrana plasmatica es diferente ( 1 ) .

Los dos mayores tipos de lípidos en la membrana celu-- lar son: los fosfolípidos (que son los mas abundantes), y - los glicolípidos; los dos son anfipáticos ( contienen un ex tremo polar y otro no polar), por ejemplo la fosfatidilcoli na, fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina que tienen un grupo como 11cabeza8t polar y dos llcolasll (cadenas hidrocarb2 nadas) no polares ( fig 2 ) .

I la región almidonosa del endospermo, el tejido se caracteri

U 6

Q

6 N W

Q O

o B

m

tn W U 6 d

2 o'

n O Z B

O

I O I

o=p-o- I O I

FH2 - OH I -HZ O I

;=O 72

CH

CH2- N'<Cyz'3 I y2

COLINA P.M. 790 g/mol

CH2- COOH I

ÍH2 SERINA P.M. 795 g/mol

"2 CH2- I

ETANOIAMINA P.M. 751 g/mol

7%

FIG 2: FORMULA DE LA MOL ECULA DE FOSFOL IPIDOS

COMPOSICION QUIMICA DE LA SEMILLA

LOS principales materiales aiimenticios que almacena - la semilla son carbohidratos, proteinas y lípidos ( 7 ) .

Los granulos de almidón estan formados por los carbohi dratos y corresponden al 70% - 8 0 % del peso seco de la semi lla ( 7 ) .

La proteina se almacena en cuerpos discretos, que cuan do se localizan en la capa de aleurona se denominan granu- los de aleurona y en cualquier otra parte de la semilla se denominan cuerpos proteicos.

Estos cuerpos varían en composición, que pueden care-- cer de inclusiones o pueden tener una o varias inclusiones de globoides, en los cuales se localizan sales insolubles - de ácido fitico; cristaloides de proteina; cuerpos de prots ina-carbohidrato; cristales de oxalato de calcio ( 2, 10 ) .

Los lípidos aparecen en forma de ttcuerpos aceitosost1 - en el citoplasma celular y se denominan esferosomas ( 7 ) .

La reserva de lípidos de la semilla, es un triglicéri- do, el cual se hidroliza "In Situtt por lipasa, a glicerol y acidos grasos ( 5 ) .

Los acidos grasos se utilizan para síntesis de fos fo l l pidos y glicolípidos, que son requeridos como constituyen-- tes de las membranas de los organelos pero la mayoría son - convertidos en azucares y transportados al cuerpo de la -- plántula para su crecimiento. Los microcuerpos del tipo -- glyoxysoma, están involucrados en la v í a de oxidadon de 12 pidos ( 5 ) .

GI BERELINAS

3 i Son las hormon’as encargadas del crecimiento de las --

plantas, se conocen mas de 60 tipos siendo la más importan- te la giberelina A3 (ácido giberélico).

Todas las giberelinas son diterpenoides ácidos basados en el esqueleto de giberelane conteniendo un núcleo gibano. Las mayores diferencias estructurales están en los substity yentes de las posiciones 4a, 7 , 8 (del nucleo gibano) y la presencia o ausencia de un anillo 8-lactona. (INDEX MERCK).

En nuestro estudio se utilizó el acido giberélico GA3

( fig 3 ) .

O

A 3 ‘a 4b

co

7

OH

8

COOH “CH,

i MOVILIZACION DE RESERVAS

Durante la germinación el embrión es el que se encarga de sintetizar ácido giberélico, que es un fitrorregulador - que se difunde a travez del endospermo almidonoso, hasta ah canzar la capa de aleurona, provocando en ésta la síntesis y secreción de enzimas hidroliticas ( 4 , 6 20,21,25,27), -- las cuales hidrolizan los materiales que se encuentran depo citados principalmente en el endospermo almidonoso. De lo - anterior se concluye que la movilización de reservas en el endospermo, está bajo control embrionario via giberelinas - ( 18, 22, 28 ) .

En algunas variedades de cebada y trigo es posible se- parar la capa de aleurona del endopermo almidonoso. Esto se hace mediante la disección del embrión de la semilla y des- pues poniendo a embeber las semillas desembrionadas en agua por tres dias.

Debido a que el ácido giberélico acelera procesos aso- ciados con la imbibición o con cambios bioquimicos que le - siguen y para evitar todos estos cambios asociados con la - imbibición, las medias semillas son preincubadas por tres - dias antes de efectuar estudios de efectos del ácido giber@ lico.

A s í la aleurona aislada responde a la adición de ácido giberélico exógeno de la misma forma que lo hace en la semi lla completa, por lo que éste tejido constituye un modelo - experimental adecuado para el estudio del mecanismo de ac-- ción de ácido giberélico.

i EFECTOS EN LA ALEURONA

Las únicas células "vivast8 en el endosperno de una se- milla de cereal, son las células de la capa de aleurona, és te tejido no se divide ni se diferencia posteriormente.

La aleurona responde a la presencia de ácido giberéli- co exógeno, sintetizando y secretando algunas enzimas hidro líticas incluyendo a-amilasa y proteasa despues de un perig do lag de 8 a 10 hrs. E l incremento de éstas enzimas se de- be a la síntesis "De Novot1 de las cadenas polipeptídicas -- ( 6 , 9, 11 I *

Durante el periodo lag que precede a la síntesis de la a-amilasa, hay varios eventos controlados por ácido giberé- lico, entre los que se encuentra el rearreglo de membranas.

Estudios al microscopio electrónico de células de aleg rona, demuestran que la cantidad de retículo endoplasmico - rugoso, es mayor en células tratadas con el fitorregulador que en células control ( 13, 14, 15 ) .

Mirbahar y Laidman observaron que despues de 24 hrs de germinacien cuando la cc-amilasa está siendo secretada acti- vamente, la acción de las giberelinas produce una declina-- ción en el nivel de fosfolípidos los cuales sufren una con- versión a triacilglicerol entre las 18 y 24 hrs de la esti- mulación con la hormona, ésta conversión fué observada en - fosfatidilinositol ( 17 ) .

También se ha estudiado la incorporación de colina "In Vivot1 en fraccion microsomal semipurificada. Los resultados demuestran que la incorporacion de colina a las membranas - de fraccion microsomal, se inicia 4 hrs depues del tratami- ento con ácido giberélico y se mantiene por las siguientes 12 h r s ( 8 ) .

Este aumento en la incorporación de colina, va precedL da por un aumento en la actividad de fosfatidilcolina-citi- dyl transferasa y fosforilcolina-glicerido transferasd, dos enzimas de la via de la CDP-colina para síntesis de leciti- na ( 12 ) .

Por otro lado el tratamiento de capas de aleurona con ácido giberélico induce la formación de sistemas membrana-- les citoplasmáticos ( 13, 14 y 15 ) , sin embargo, no se ha encontrado un aumento en la biosíntesis de fosfolípidos du- rante este mismo periodo, lo que sugiere que la organiza- ción de éstos sistemas membranales sea debido a un reacomo- do de los lípidos ya existenete y muy probablemente dispara do por un cambio en la relación de las concentraciones de - los mismos.

En este trabajo se intenta demostrar el efecto del áci do giberélico en el recambio de fosfolípidos de los sicte-- mas membranales, en las primeras horas de tratamiento con - AG3.

Se propone que el rearreglo membranal inducido por áci do giberélico (GA3) en éste sistema, sea debido a un cam-- bio en la composición de los fosfolípidos de la membrana -- producido por un aumento en la velocidad de recambio de los

mismos.

(I

OBJETIVOS

GENERAL

Determinar la contribucion del metabolismo de fosfol i - pidos en el mecanismo de acción de ácido giberélico en la - fase lag de la inducción de a-amilasa en capa de aleurona - de cebada.

PARTICULARES

Optimizar la metodología para extraer, identificar y - cuantificar fosfolipidos.

1

Determinar si el ácido giberelico tiene efecto a nivel de membrana modificando sus propiedades de permeabilidad.

Determinación de la cantidad y clase de fosfolipidos - que forman parte de las membranas celulares y si esta compq sición se ve modificada por la presencia del fitorregulador.

METODOLOGIA

i

IMBIBICION Y AISLAMIENTO DE ALEURONAS

Se tomó el número necesario de semillas de cebada (m JIEUM, Vulqare; var, Himalaya), para el experimento que se - fuera a realizar. Por medio de un corte transversal se elh minó tanto el embrión como el extremo distal de la semilla, obteniendo así medias semillas, las cuales se desinfectaron con 100 ml de una solución al 20% de hipóclorito de sodio - (Cloralex, comercial) agitándolas durante 20 minutos.

Despues de transcurrido ese tiempo, estando en ambien- te estéril, se decantó la solución de hipoclorito y las se- millas se enjuagaron 5 veces con agua destilada estéril. Las semillas se transfirieron a cajas de petri previamente esterilizadas conteniendo papel filtro humectado con 5ml de agua destilada estéril. Con el hilo hacia abajo se repartie ron esparcidamente en toda la supericie (aprox. 50 medias semillas por caja) se taparon las cajas y se guardaron a -- temperatura ambiente durante 3 días.

Transcurridos l o s 3 dias, se tomaron las semillas ( re blandecidas ) con una espátula y se abrieron a lo largo del hilo con ayuda de dos espatulas, para eliminarles el endos- permo almidonoso, la capa de la aleurona así obtenida se a- grupó en lotes (según con el numero de aleuronas con que se fuera a trabajar) y en condiciones estériles se enjuagaron 3 veces con 50 ml de agua destilada estéril cada vez, se -- transfirieron a matraces Erlenmeyer de 125 ml estériles con tap5n para ahí efectuar la inducción.

TRATAMIENTO DE ALEURONAS CON ACIDO GIBERELICO

%e preparó una solución de ácido giberélico 5 x 10A-6 !

M a partir de una solución stock de ácido giberélico 1 x 10

^-2 M efectuando las diluciones pertinentes. La solución se esterilizó por filtración a travez de -

un filtro de 0.45 um (p ej. Millipore) con ayuda de una je- ringa, esta manipulación se hizo en ambiente estéril y se - recolectó en un frasco estéril.

La solución así filtrada (estéril), se utilizó para iB ducir a los distintos lotes de aleuronas, según el volumen indicado para cada experimento.

La inducción se efectuó a 25'C en un agitador para fea mentaciones a 100 rpm y los tiempos se midieron cronometri- camente. A l transcurrir exactamente el tiempo deseado de inducción, las soluciones se decantaron, enjuagando inmedia tamente las aleuronas con agua destilada estéril.

Las siguientes determinaciones se llevan a cabo utili- zando los medios de inducción y las aleuronas tratadas, con testigos tratados con agua destilada estéril.

DETERMINACION DE CONDUCTIVIDAD

Para las determinaciones se utilizó un conductímetro - digital (Conductronic CL8), el cual registra en unidades de micromhos/cm cada uno de los medios utilizados en el trata- miento de aleuronas a diferentes tiempos, se introdujeron - dentro del electrodo del conductimetro (enjuagando con agua destilada entre cada medición) y en caso de volumenes peque ños se hicieron diluciones, registrando así las lecturas ob tenidas.

I.*

DETERMINACION DE AMINOACIDOS

Esta determinación se desarrolló por el metodo de Ro-- sen ( 2 4 ) .

REACTIVOS:

Solución amortiguadora de acetatos: Disolver 180 g de acetato de sodio trihidratado en un matraz aforado de 500 ml con 150 ml de agua destilada recientemente her- vida y enfriada, se agregan 3 3 . 3 3 ml de ácido acético glacial y se enraza el matraz con agua.

Solución amortiguadora acetato-cianuro: Se prepara una solución de cianuro de sodio 0.01 M con solución amor- tiguadora de acetatos ( almacenarla a 5'C ) .

Solución de ninhidrina al 3% (p/v) en etilenglicolmono metileter ( metilcellosolve ) .

Solución isopropanol-agua (1:1), mezclar en volumenes iguales.

DETERMINACION COLORIMETRICA:

A cada tubo se le agregó:

1 ml de solución problema

acetato-cianuro 0.5 ml de solución amortiguadora

0.5 ml de-solucion de ninhidrina

I

Una vez agregados los reactivos, se pusieron los tubos en baño maría en ebullición durante 15 minutos medidos exac tamente, deteniendose la reacción con 5 ml de solución de - isopropanol-agua (1:l) y agitando los tubos con un agitador tipo vortex, se dejan enfriar a temperatura ambientely se - leyó la absorbancia a 570 nm en un espectrofotómetro contra un blanco que contenía 1 ml de agua en lugar de la solución problema.

de inducción de las aleuronas (para determinación de grupos amino liberados al medio ) y un extracto de aleuronas (para grupos amino internos) preparados de la siguiente manera:

Cada lote de aleuronas se tomó por separado y se homo- genizaron con 2 ml de una solución de cloruro de sodio 0.2 M, se pusieron en tubos de centrífuga y se calentaron a -- 60°C durante 20 minutos en baño de agua, se enfriaron y cen trifugaron a 10°C y 1200 rpm durante 20 minutos para preci- pitar la proteina. El sobrenadante obtenido se utilizó como solución problema.

Las soluciones problema utilizadas, fueron los medios

OBTENCION Y SEPARACION DE FOSFOLIPIDOS MEMBRANALES

Primero se procedió a obtener la fracción microsomal - de las aleuronas, que es donde se encuentran los sistemas - membranales, para despues obtener por extracción y separa-- ción los fosfolípidos.

OBTENCION DE LA FRACCION MICROSOMAL

se siguió la metodología según F. Viso ( 30 ) . Se tomó - cada lote de aleuronas por separado y se homogenizó en un - mortero de porcelana enfriado previamente a 5”C, utilizando

como abrasivo arena purificada y 0.2 ml de una solución a-- mortiguadora de fosfatos (50mM de fosfato de potasio prima- rio y 0.88 M de sacarosa por litro a un pH,de 7.55 ajustado con ácido clorhídrico 0.1 N).

El homogenizado se virtió en un tubo de centrífuga en- juagando el mortero varias veces con la solución amortigua- dora hasta tener un volumen total de 5 ml. La suspensión oh tenida se centrifugó a 4 ° C y 13 500 rpm durante 30 minutos (22 O00 g) en una centrífuga Beckman modelo J2-21 cabezal - JA-20 obteniendose así el sobrenadante que constituyó la -- fracción microsomal.

I

EXTRACCION DE FOSFOLIPIDOS

El sobrenadante obtenido, se decantó sobre otros tubos de centrífuga (se desecha la pastilla) y se trató con 5 ml de una solución de cloroformo-metano1 (2:l v/v con solven-- tes recientemente destilados) agitando durante 5 minutos -- con un agitador de tubos tipo vortex, posteriormente se trifugó 5 minutos a 1000 rpm y temperatura ambiente para -- romper la emulsión formada (centrifuga IEC mod. HN-S cabe-- zal 215).

De las dos fases obtenidas se eliminó la superior y la interfase por succión con una pipeta Pasteur, tratandose 3

veces mas la fase inferior con 2 ml de una solución de clo- roformo-metanol-agua (3:48:47 v/v solución de lavado) la CLJ al también contiene 0.8% de cloruro de sodio y 0.2 % de c l ~ ruro de magnesio, las fases fueron separadas de la misma -- forma que la primera vez.

La fase inferior obtenida-czrresponde al extracto de - fosfolípidos.

r MICROSOMAL

PASTILLA 17

DECANTAR - TUBO CENTRIFUGADO A 22 OOOg

2 ml

1 sauam DE LAVADO

t

17 REPETIR PASOS 3 , 4 Y 5

( 3 VECES 1

EU M IN AR

SUPERIOR

FASE I

r5 ML

J

FASE ACUO-.4

+ INTEFFASE-

FASE ORGANICA

FASE SUPERIOR E I*.- POR SUCCIr'

AGITAR

5 min

V O R T E X

CENTRIFUGAR 5 min A 1000

ELIMINAR MOD: HN-S ABEZAL 21

!RFASE H

LA FASE INFERIOR OBTENIDA CORRESPONDE AL EXTRACTO

DE FOSFOLIPIDOS

FIG 4: METODOL OG/A DE EXTRACCION DE FOSFOUPIDOS U€ LA FRA CCION MIC'ffOSOMA L

SEPARACION DE FOSFOLIPIDOS

La separación se hizo por medio de cromatografía en -- capa fina (C.C.F.) según Koehler y Varner (16) o

El extracto de fosfolípidos obtenido, se concentró a - un volumen mínimo pasando una corriente de nitrógeno para g

vitar la descomposición de los fosfolípidos.

de sílice (Merck) que se activaron calentándolas a 120'C dg rante 1 hr. El extracto concentrado se aplicó a 3cm del boy de inferior de 'la placa dejando 1 cm de separación entre ca da muestra, la cual se aplicó con un capilar en volumenes - de 2 u1 cada vez y secando al aire hasta aplicarla toda.

Las placas se desarrollaron en una cámara cromatográfi ca con revestimiento de papel saturada durante 30 minutos - con una fase móvil de cloroformo-metanol-ácido acetico-agua (170:40:16:8 v/v) con una profundidad de 2 cm.

Como referencia se utilizaron estandares de fosfatidil, colina, fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina (unicos es

Se utilizaron placas de 20 x 20 cm recubiertas de gel

tandares disponibles). Las placas se metieron

ron desarrollar hasta 17 cm caron de la cámara, dejando tura ambiente.

El revelado se realizó mete la placa en una cámara do metálico y se dejó hasta despues con una solución de

dentro de la cámara y se deja-- de altura (aprox 2 hrs), se ca- evaporar el solvente a tempera-

primero con vapores de iodo (se cromatográfica que contiene io- la aparición de las manchas) y ninhidrina al 0.2% en etanol, -

se rocíó la placa con la solución y se metió a la estufa a 120°C durante 5 minutos para el desarrollo de color de los compuestos que contenían grupos amino, como la fosfatidil-- etanolamina y la fosfatidilserina. Este segundo revelador - sólo se utilizó para identificación, para experimentos de - cuantificación no se usó por formar un complejo coloreado i rrevercible. A l a c manchas. obtenidas se les caJcul6 el Rf

CONCENTRAR CON CORRIENTE DE NITROGEN0

20 Qn - c

p j j --- FASE

H W

LAS MUESTRAS SE APLICAN EN LA PLACA

DESARROLLAR A 17 cm DE ALTURA EN LA CAMARA SATURADA Y

CON REVESTIMIENTO DE PAPEL PREACTIVADA A 120AC / 1 hr

SACAR LA PLACA Y EVAPORAR AL AMBIENTE

ROCIAR LA PLACA Y PONERLA K ) M ) I J ~ A U ~ ) 2

REVELAR CON VAPORES DE IODO EN LA ESTUFA A 120aC / 1 hr CALCULAR LOS Rf's

FIG 6: SEPARACkJN DE FOSFOLIPIDOS POR CORMATi'OGRAF!4 EN CAPA FINA

(porciento de desplazamiento a lo largo de la placa) por mg dio de la fórmula: Rf= (OM)/(OF), donde OM es la distancia del origen al centro de la mancha y OF es la distanc&a del origen al frente del solvente; ambas mediciones dadas en -- centímetos.

1

1

El origen es el punto de aplicación de la muestra, el centro de la mancha se determinó midiendo de extremo a ex-- tremo de la mancha y detectando su punto medio. El frente - del solvente es el punto hasta donde llega la fase móvil dg sarrollada a travez de la placa, y hay que marcarla a l mo-- mento de sacar la placa de la cámara, antes de que el sol-- vente se evapore.

Las mediciones se hacen en linea recta en relación al punto de aplicación y la posición del centro de la mancha.

CUANTIFICACION DE FOSFOLIPIDOS

La cuantificación de fosfolípidos se hizo por el méto- do de Barttlet para cuantificación colorimetrica a partir - de fósforo inorgánico ( 3 ) , el cual consistió en la descoa posición del fósforo orgánico por una digestión ácida utili zando ácido sulfúrico 10 N y despues una reacción colorimé- trica para desarrollo de color.

Reactivo colorimétrico de Fiske-Subbarow: Poner 15 g - de bisulfito de sodio en 100 ml de agua destilada y a- gitando mecanicamente se agregan 250 mg de ácido 1,amA no-2,naftol-4,sulfónico y 500 mg de sulfito de sodio a nhidro dejándolo 10 minutos, se filtra la solución por papel y se almacena en un frasco ambar. Esta solución se prepara semanalemente (Resultado de estudio de esta bilidad hecho por nosotros. ver resul"k3os).

Para extraer l o s fosfolípidos separados por cromatogra

f í a , se utlizó la metodología de Raheja R.K., y colab. (23).

y se colocaron en tubos de ensaye agregandoles 3 ml de clo- roformo-metano1 recientemente destilados y 0.5 ml de agua - destilada. Se agitaron 3 minutos en un agitador tipo'vor- tex y despues se centrifugaron 5 minutos a 1000 rpm en la - centrífuga IEC: mod. HN-S, cabezal 215 para romper la emul- sión.

La fase superior (acuosa), se retiró junto con la sílL ca gel que quedó en la interfase por succión con una pipeta Pasteur y la fase inferior se decantó a otro tubo donde se evaporó a sequedad con nitrógeno.

También se pueden cuantificar los fosfolípidos totales extraidos de las aleuronas, evaporando a sequedad el extrac to obtenido previo a la separación cromatográfica.

Primeramente se rasparon las manchas yá identificadas

RACPAR LAS MANCHA3 AGREGAR 3 ml DE CLOROFO RMOMETANOL

( 2 : i ) Y 0.5 ml DE AGUA D E s l l W A

I CENTRIFWR 5 mln A u00 rpm

DECANTAR FASE

arJCENTRAR CON COFIRlENTE CE NFTROGEM3

FASE WPERIOR E INTERFACE POR WCClON

Los fosfolípidos evaporados en el tubo, se digirieron con 0.5 ml de ácido sulfúrico 10 N en un baño de arena a - 155'C durante 24 hrs (mínimo 3 hrs, pero no afecta el tien PO de digestión).

Despues de transcurrido el tiempo, se les agregó 4 0 u1 de agua oxigenada al 30% (Perhydrol de Merck al 30%) y se - dejaron 1.5 hrs más en el baño de arena, hasta que la solu- ción quedó límpida.

Los tubos se enfriaron y se les agregó 0.2 ml de molib dato de amonio al 15 % (en agua destilada), 4 . 4 ml de agua destilada y 0.2 ml de reactivo Fiske-Subbarow. Se pusieron en baño de agua en ebullición durante 7 minutos para el de- sarrollo de color (azul) y se dejaron enfriar.

A las soluciones coloreadas se les determinó la absor- bancia a 830 nm en un espectrofotómetro Karl-Zeiss, leyendg las contra un blanco tratado de la misma manera que los tu- bos con el extracto de fosfolípidos.

I

r--- - 40 p! H~ g2 ai 30 % AJbDIR , - O 5 m: DE H2S04 10 N

fl

EP:rRIAR - - LJ

- 0.2 rnl DE MOLIBDATO DE AMONIO AL 15%

- 4.4 rnl DE AGUA DEST. - 0.2 mi DE REACTIVO

fi B A b M ARENA

A6iADiR

Y -u DEJAR 1.5 h MAS A 155-¿

DEJAP EN EL BANS A 155°C

DURANTE 3 h r c

LEER LA ABSORBANC!: A 830 711 'VS UN BLAk-9

La curva patrón obtenida en los resultados se obtuvo - por regresión lineal con la ecuación de minimos cuadrados y

se comparó el coeficiente de correlación con el de la prue- ba de ilrll (para coeficiente de correlación), donde la itrtl - de tablas se calcula por la siguiente fórmula:

2 ) df =grados de libertad

t =valor de tablas para valor "t" de limite su- Derlor e inferior.

t 2 + 3 f i prueba Or'' =

Donde para 1 grado de libertad tendremos:

NIVEL DE CONFIANZA

90 % 95 % 99 % 99.9 %

Valor t 6.314 12.706 63.657 636.619

Valor r (calculado) 0.988 O. 997 1.000 1.000

para 7 grados de libertad tendremos:

Valor t 1.895 2.365 3.499 5.405

Valor r (calculado) O. 582 0.666 0.798 0.898

Para el coeficiente de correlación que calculemos expg rimentalmente, debe de ser mayor o igual al valor calcu lado para tener el nivel de confianza indicado.

OPTIMIZACION DE u METODOLOGIA

DETERMINACION DE CONDUCTIVIDAD

Para ver efectos del ácido giberélico en la permeabili dad de la membrana de las células de la capa de aleuronas, se procedió a cuantificar la salida de iones del citoplasma celular del tejido de la aleurona hacia el medio que lo cir cunda ( medio de inducción ) por medio de un conductimetro.

En un primer intento se utilizaron lotes de 5 aleuro- nas las cuales se trataron con 2 ml de ácido giberélico 5 x

10 “-6 M ( +AG ) preparado con solución amortiguadora SUCCL nico-calcio 20mM:20mM (2.36 g de ácido succinico y 2 . 9 4 g - de cloruro de calcio ajustado a un pH de 5 . 5 y aforados a - 1 It con agua destilada).

Las aleuronas se trataron a diferentes tiempos de in-- ducción junto con testigos tratados unicamente con solución amortiguadora succinico-calcio ( -AG ) .

Al final del tratamiento, se pasaron las soluciones a tubos de ensayo y se les agregó 4 ml de agua destilada ( pa ra poder llenar el electrodo ) y se midió la conductividad del medio obteniendose el siguiente resultado.

~~~

DETERMINACION DE CONDUCTlViDAD

ACIW B u m GI E E L IC0 S U E I NI M -CALC 10 _ _ _ _ _ _ _

O I I I

10 20 30

T I W O DE INCUBACION (hrs)

Debido a que éstos valores de conductividad fueron muy altos enmascarando el efecto del ácido giberélico, los expe rimentos realizados posteriormente se hicieron con agua des tilada, tanto para el testigo como para la preparación de - la solución de ácido giberélico obteniendoce así resultados mas confiables.

OPTIMIZACION DE LA EXTRACCION Y CUANTIFICACION DE FOSFOLIPIDOS

DESARROLLO DE CURVA PATRON DE FOSFORO INO~GANICO.

Primeramente, se procedió a probar el método colorime- trico para la cuantificación de fosfolípidos, desarrollando una curva patrón a partir de una solución de fosfato de pó- tasio 1 mM a diferentes concentraciones ( fósforo inorgáni- co ) el cual fué confiable para las condiciones de los reac tivos utilizados para detectar el fósforo inorgánico.

CURVA PATRON DE FOSFORO INORGANIC0

RECTA V U

A + AJUSTAM DcFERII.EMAL

E c

3 Y

t CONCENTRACIW DE KH Po (uMOLES)

2 4

PRUEBA DE ESTABILIDAD DEL REACTIVO FISKE-SUBBAROW.

Posteriormente se probó la estabilidad del reactivo FF ske-Subbarow ( que es el agente reductor que da la colora- ción azul ) en relación al tiempo de preparado, por lo que se efectuaron dos determinaciones por separado en las cua-- les se aplicó reactivo nuevo y reactivo preparado con vari- os dias de anticipación a 0.2 moles de fosfato de potasio desarrollandose color según la metodología obteniendose:

, . REACTIVO F-S UMOTiES DETECTADAS

Reciente 0.18

10 dias 0.19

12 dias 0.12

Estos resultados fueron obtenidos a partir de la gráfi ca de fósforo inorgánico ( fig 5 ) estableciendo una utili- zación máxima de 10 dias, en los cuales no pierde sensibili dad el reactivo de Fiske-Subbarow aunque Koehler y Varner - utilizan el reactivo preparado semanalmente

Una vez probada la utilización de reactivos para desa- rrollo de color, se realizaron pruebas de cuantificación de fósforo orgánico degradandolo por digestión ácida a inorga- nico.

( 16 ) .

I

TEMPERATURA OPTIMA PARA LA DIGESTION

Según la metod$logia descrita por Koehler y Varner (16 ) , diferentes concentraciones de fósforo inorgánico se colo caron en tubos de ensaye y se les adicionó 0 . 5 ml de ácido sulfúrico 10 N y 2.5 ml de agua destilada.

La digestión se realizó en una estufa de calor seco a 150'C durante 3 hrs, añadiendose despues algunas gotas de - agua oxigenada y calentando durante 1.5 hrs más para tener la digestión completa y proceder al desarrollo de color.

f

En nuestro caso, los tubos se pusieron en un calenta-- dor de tubos ( multiblok-heater) el cual sólo alcanzaba una temperatura de 13OoC, además en los primeros experimentos fectuados el agua agregada ( 2.5 ml ) se proyectaba fuera - de los tubos por efecto de la temperatura, por lo que se de jó de adicionar el agua destilada durante la digestión.

Se empezaron a hacer pruebas con fósforo orgánico, po- niendo dos extractos de fosfolípido de 25 aleuronas cada u- no con 0 . 5 ml de ácido sulfúrico 10 N a 130'C durante 3 hs posteriormente se les adicionó 40 u1 de agua oxigenada al - 3 0 % ( Tecnica Quimica ) y se dejaron calentando 1.5 hrs -- más, se dejaron enfriar y se les agregó 4 . 4 ml de agua oxi- genada y 0.2 ml de solución de molibdato de amonio para así desarrollarles color, pero al agregar el molibdato, la solu ción del tubo se puso amarilla provocada por el exceso de - agua oxigenada.

La coloración podría interferir en la cuantificación - espectrofotmétrica del fósforo.

Para probar el efecto del agua oxigenada y eliminar o- tros factores posibles, se siguió la metodología de la mis- ma forma anterior pero sin utilizar fosfatos, efectuando la digestión ácida, al finalizar se les agregaron los 4 . 4 ml - de agua deytilada y 0.2 ml de solución de molibdato de amo- nio con lo que la solución viró a amarillo, pero al agregar el reactivo de Fiske-Subbaraw la solución se coloreó de a--

. -&lld.ILy.blw--h7,' ,..--. .....- ' - ., __I -. I ._.. ...-_ -.. . .- . - . . . -. - . . _ _ _ .

. ~ - .. .

zul característico de la reacción de fósforo inorgánico, su giriendo con esto, una interferencia por el agua oxigenada presente.

Como el punto de ebullición del agua oxigenada es de - 151"C, se realizó otro experimento poniendo dos tubos con - 0.5 ml de ácido sulfúrico 10 N en un baño de arena a 155'C durante 3 hrs, se les agregó 40 u1 de agua oxigenada a cada uno y se dejaron 1.5 hrs más para completar la digestión, - al enfriarse se les agregó 4 . 4 ml de agua destilada y 0.2 - ml de solución de molibdato de amonio con lo que ya no se - desarrolló coloración alguna, viendo con esto que la tempe- ratura óptima para la digestión ácida debía de ser mayor a 15loC, por lo que se fijó una temperatura de 155'C para las digestiones.

PRUEBAS PARA LA CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA ( C.C.F. )

Tambien se realizaron experimentos para verificar l a - separación de los diferentes fosfolípidos por C.C.F. por lo que se tomaron dos lotes de 10 aleuronas cada uno tratados durante 60 min con 2 ml de ácido giberélico 5 x 10 *-6 M (

+AG ) y 2 ml de agua destilada ( -AG ) respectivamente, los fosfolipidos se extrajeron con solventes sin destilar y se separaron según la metodología. Los extractos se aplicaron en la placa junto con estandres de fosfatidilcolina, fosfa- tidilserina y fosfatidiletanolamina en cantidades de 10, 10 y 20 ug respectivamente. Se desarrolló la cromatografia y - la placa se reveló con vapores de iodo y posteriormente con un solución de ninhidrina al 0.2 % en etanol calculandose - los Rf's de las manchas.

ZONA FRENTE DEL- =m Pa

D

C

B

A Xpe

O R I W -

1 2 3 4 5

e 0.96 - 0.83 I) 0.83

t 0.46

8 0.27 8 0 . 2 5 00.25

O 0.11 0 0.11 - 0.07 - 0.07

0.16 - 0.06 O O O O O I

En el cromatograma se observaron siete zonas de man-- chas de los fosfolípidos extraidos y aplicados de las mues- tras de tejido de aleurona. Se identificaron como: Origen, zonas XPe, A, B, C, D, Pe, y frente del solvente '( fig 8 ) .

En el origen de la placa, aparecieron manchas redondas muy pequeñas que son probalemente lípidos neutros (no iden- tificados), la segunda zona de manchas identificada como -- XPe apareció con el revelado de ninhidrina unicamente al i- gual que el estandar, con un Rf aproximado de 0.05, siendo muy poco aparente y que corresponde a un compuesto derivado de la fosfatidiletanolamina que contiene el grupo amino por ser positivo a la ninhidrina, mientras que la otra porción derivada del mismo fosfolípido estandar ( que es mucho mas aparente) presentó un Rf de 0.96 siendo esta negativa a la reacción de la ninhidrina, además Viso, F y Cuthbert, A.W.

reportan un Rf alto para la fosfatidiletanolamina ( 30 ) .

Por lo que el estandar de la fosfatidiletanolamina al estar descompuesto no se utilizó.

La tercer zona identificada como A, aparecieron dos -- manchas semifusionadas por lo que se ven ligeramente alarga das, que por su Rf pueden ser fosfatidilinositol referido - solo por comparación con lo reportado por Viso y Cuthbert, pero por no tener estandar para comprobarlo, solo se identi fico como zona A.

En la cuarta zona B, aparecieron dos manchas redondas semifusionadas correspondientes a una mezcla de fosfatidil- colina y otro compuesto no identificado, que puede ser una mezcla de cadenas hidrocarbonadas que son negativas a la re acción de la ninhidrina, no pudiendo identificarlo por fal- ta de estandares, aunque Viso y Cuthbert reportan una sepa- ración bien definida entre la fosfatidilcolina y la fosfati dilserina sin la existenicia de un compuesto intermedio, -- hay que tomar en cuenta que esta separación fue realizada a partir de membrana epitelial de vejiga urinaria de sapo por lo que el compuesto obtenido por nosotros mezclado con la - fosfatidilcolina, sea diferente de la fosfatidilserina.

E l frente del solvente se reveló como una zona amorfa a todo lo ancho de la placa no considerada para nuestro es- tudio.

Debido al tamaño de las manchas solo se rasparon las - manchas B y C ( sin aplicar revelador de ninhidrina ) para su cuantificación por el método de Bartllet ( 3 ) , obtenien dose:

ZONA

B C

CONTENIDO DE FOSFORO INORGANIC0 1 en UQ 1

+AG -AG

0.17 0 . 1 8

0 . 1 7 O~..l?

I

1- - 3.

1 0.11

0 . N -

ZONA c

¿ + 13 %

1'

ACIW A W A OI%RL100 D E C T I W A

ORAFEA 3: WANnFaCIDN EFOSFClUPiíWS DELAS IONAS A, 8 CY D. LAS SOLCWNESSEffLTR4RON

ANTES DED€?ERMfNAR LA ASCORBAtVZA. í CAL WUDO A 2. SALEURONAS)

SUMA TOTAL DE FOSFOUPIDOS ( ZONAS A, B, C y D ) AClDO ffiUA

GIBEREUCO DESTILADA

* -I- - - - -

0.22

UJ

O z

0.20

I 1 1 1

\ \

- Y-

I 1 I I

1.0

0.9

O. 8

O. ?

0.6

. c

. . . . . . . . . . 1.0 - .

c

0.9 c - ~ 0

.+ O.? -

* 0.6 -

. . . . . . . . . . . .+

I TIEMPO DE INCUBACION hid ~~

GRAFlCA 4: SUMA DE LA GR4fICA 3 CUANTIFICADA A PAR 77ff DE LA CURVA PA TRON DE FOSF ORO INORGANIC0 CALCULADA A 2.5 ALEURONAS).

Para complementar éstos datos se hizo una segunda de-- terminación con lotes de 5 aleuronas las cuales se trataron con 2 ml de ácido giberélico 5 x 10 *-6 M y 2 ml de agua -- destilada a tiempos de O, 15 y 30 minutos.

Del extracto fosfolipidico obtenido (de la rhisma forma que la determinación anterior), se tomó la mitad para cuan- tificación total de fosfolipidos y la otra mitad para sepa- ración cormatográfica ( gráfica 3 ) .

INTERFERENCIA POR LA SILICA GEL

Como se puede ver en las gráficas 4 y 5 la concentra-- ción de fosfolípidos fué mayor en las muestras extraidas de la placa, que en las muestras sin separar, sugiriendo con - esto una probable interferencia de partículas de silica gel en suspensión no retenidas por el filtro, por lo que se prg cedió a la siguiente prueba.

En un tubo se colocó silica gel y se digirió (260 mg - de silica gel equivalentes al tamaño de una mancha) con 0 . 5

ml de ácido sulfúrico 10 N durante 17 hrs, despues se agre- garon 40 u1 de agua oxigenada dejandose digerir por 1.5 hrs más, se enfriaron los tubos y se desarrolló color filtrando la solución a travez de papel Whatman # 42 y se leyó la ab- sorbancia a 8 3 0 nm contra un blanco sin silica calculando - despues la concentración de fósforo inorgánico presente que fué de 0.315 ug, siendo que no debería de presentar fósforo la muestra.

Este dato y la observación de que al desarrollar la -- placa cromatográfica se presentaba una zona amarilla al -- frente del solvente, sugil;sió una posible contaminación de - la silica por fosfatos por lo que se realizó una detennina- ción similar a la anterior utilizando silica gel de una plg ca prelavada (desarrollando la placa con fase movil utiliza da pero sin aplicar muestra) en estas condiciones también - en el resultado se detectaron fosfatos ( 0.12 ug ) .

Aunque el contenido fue menor se realizó una tercera - determinación utilizando tres muestras de silica gel de pla ca prelavada obtenidas en diferentes zonas de la placa'' - - (Rf's 0.16, 0.24, y 0.52 ) , una muestra de silica donde se aplicaron 10 ug de fosfatidilserina desarrollada en la pla- ca y revelada con iodo ( Rf 0.24 ) y otra muestra similar - de fosfatidilserina pero utilizando una placa prelavada. Es tas muestras se trataron de la misma forma que las dos de-- terminaciones anteriores obteniendose.

1

MUESTRA DE SILICq

Prelavada Rf 0.16 Prelavada Rf 0.24 Prelavada Rf 0.52 Prelavada c/10 ug de Ps * Normal c/10 ug de Ps *

CONCENTRACION FOSFORO (en

O. 130 0.433

O. 181

0.161 0.243

* Fosfatidilserina

La diferencia de lecturas entre los diferentes tubos - sugería una contaminación diferente a la de la silica por-- que los resultadnc además de variados no distinguen la pre- sencia de fosfatidilserina al quedar enmascarada por la con taminación.

Esta contaminación podría ser debida al material sucio o a la presencia de fosfatos en algunos de los reactivos u- tilizados, procediendoga explorar ambas posibilidades.

Primeramente se trató el material de vidrio a utilizar con mezcla crómica ( mezclar 200 g de dicromato de sodio -- con 1500 ml de ácido sulfúrico concentrado y 100 ml de agua destilada, hacerlo en recipiente de dos litros de borosili- cato resistente y en baño de hielo ) durante 24 hrs y des-- pues se lavó con jabón libre de fosfatos (Extran de Merck)- enjuagando con agua desionizada y secandolo en una estufa - de calor seco a 6OoC, quedando de ésta forma el material -- tratado.

Se tomaron dos tubos tratados y se les agregó 20 mg de silica gel 60G de Merck en polvo y otros dos se usaron como blancos, se les desarrolló la digestión ácida y la reacción de coloración y se filtraron leyendo la absorbancia a 830nm calculando la concentración de fosfatos. La determinación - se efectuó por duplicado.

CONCENTRACION DE TUBO FOSFORO len

Blanco * sin silica Con silica Con silica

o / o 0.027 / 0.042 -0.010 / 0.037 -0.033 / 0,037

* se usó el tubo sin silica de menor absorbancia

Debido a que hubo una gran diferencia de valores entre los tubos sin silica en relación con los otros tubos, aun-- que entre é S t q tubos con silica la diferencia fue menos -- significativa, se procedió a explorar la posibilidad de con taminación por algún reactivo.

Para probar ésto, se tomaron 4 tubos tratados y se les agregó 20 mg de silica en polvo junto con otros dos tubos - sin silica y se tratron con 0 . 5 ml de ácido sulfúrico 10 N digiriendose durante 17 hrs, despues a los primeros cuatro tubos se les agrego 4 0 u1 de agua oxigenada ( Tecnica Qui- ca ) dejandose digerir por 1.5 hrs más, se les desarrolló - color y se filtraron con papel Whatman # 4 2 al igual que los tubos que no se les agregó el agua oxigenada.

En los tubos a los que se les agregó el agua oxigenada presentaron una coloración azul intenso ( debido a la alta concentración de fosfatos ) mientras que los tubos sin agua oxigenada presentaron una coloración ténue, viendo con esto que el agua oxigenada provocaba la contaminación.

Se efectuó otro experimento similar al anterior utili- zando dos tubos con 20 mg de silica gel 60G de Merck en PO& vo y otro sin silica, tratandose de la misma forma que los anteriores, pero ésta vez se agregó agua oxigenada Perhy-- drol de Merck al 30 % y se les leyó la absorbancia a 830 nm utilizando como blanco agua destilada. Se calculó la canti- dad de fosfatos en relación a la curva patrón.

- TUBO

Con silica Sin silica

CONCENTRACION FOSFORO (en ua)

0.018

0.016

Con éstos resultados se puede observar que la contami- nación la producía el agua oxigenada ( Tecnica Quimica ) u- tilizada primero, viendo además que la silica no aportaba - fosf atos.

--

I Todos los experimentos posteriores se hicieron utili--

zando material tratado y perhydrol al 30 % de Merck, elimi- nando así la aportación de fosfatos por el material y l o s - reactivos. Por lo que se procedió a efectuar una curva pa-- trón de fósforo inorgánico de la misma forma que la primera pero con las correcciones encontradas para así ya no obte-- ner datos erroneos.

~-

CURVA PATRON DE FOSFOLIPIDOS PROMEDO DE DOS DETERMINACIONES 1

V U V U MPrnIMNTAL NlaTAW -

CONCENTRPCION E KKpO, ( uMOLES )

iRAFICA 6D€SARROLL4DA A PARTIR DE KfffO,POR

€L METODO DE BARTETT MODIFICADO.

I

!

Si se compara ésta curva con la de la gráfica 2, se ob serva en ésta ultima los valores de absorción menores que - en la primera y tiene una relación directa de 1 : 1 entre - la absorbancia y la concentración, mientras que en la otra curva la relación es de 1 : 3.6 que es mucho mayor y provo- cada por impurezas.

Se procedió a nuevas cuantificaciones con aleuronas. - Se tomaron lotes de 20 aleuronas y cada lote se trató con - 4 ml de ácido giberélico 5 x 10 *-6 M o con 4 ml de agua -- destilada a diferentes tiempos de inducción. Una vez trata- das las aleuronas, se homogenizaron en 4 ml de solución a- mortiguadora de fosfatos se tomaron 2 ml y se les extraje- ron l os fosfolipidos y los distintos extractos se evapora-- ron a sequedad con nitrógeno para evitar la descomposición de éstos, redisolviendo el residuo en 1 ml de cloroformo-mg tanol 2 : 1 , se tomó 0.5 ml para determinar fosfatos tota- les y l o s otros 0.5 ml se utilizaron para separar los fosfQ lípdios por cromatografia en capa fina.

El cromatograma obtenido se reveló con vapores de iodo y solo se cuantificaron las manchas B y C (Rf’s 0.25 y 0.51 respectivamente) .

Las manchas se rasparon y se pusieron a hacer digesti- ón en tubos de ensaye, junto con los tubos para la determi- nación de fosfolípidos totales y sus respectivos blancos (g no con silica tomada de la parte inferior de la placa utili zada y otro blanco sin silica para la determinación de fos- folípidos totales).

Despues de la obtención del fósforo inorgánico por la digestión, se desarrolló la coloración y las soluciones que contenían silica, se filtraron a travez de papel Whatman # 4 2 leyendo posteriormente la absorbancia a 830 nm contra -- sus respectivos blancos ( gráficas 7, 8 y 9 ) . Se calculó - la concentración de fosfatos en relación a la segunda curva patrón ( gráfica 6 ) .

I

CUANT1FK;ACION DE FOSFOLIPIDOS (ZONACI

GRAFiCA 7: C¿IAN77fCAC#N DELIS ZONAS 5 y C SEPAAMAS CR7MAJOGAAfC4MfNTE CORRESPONDIENFS A SALEUAONAS

SUMA TOTAL DE FOSFOUPIDOS tZONASByC)

TEMPO DENOBAO04 W

GRAFlCA 8: SUMA DE LA GRAfE.4 7 ( ZONAS 6 y C 1

CUANTIFICACION TOTAL M FOSFOUPIWS í NO SEPARMOS CWMNO@WiCMENTE 1

YlDO MWL aRRuiD 0 5 M M

4 - .-

I I

GRAF~CA Q cuwr~~mcxwm EXTRACTO DE FOS- F OLIPIDOS SIN $€PARAR POR C C L ( FOSFOL/P//DoS TOiAES €WIVAífNJ€S A 5 AífURONAS 1

A l comparar éstos resultados (gráficas 8 , 9 ) , se ob-- serva una mayor proporción en la concentración de fosfatos de las manchas B y C en relación 9.0" los fosfatos totales, probablemente debido a una interferencia de la silica gel - no retenida por el filtro ya que los otros factores yá se - controlaron.

Para tratar de eliminar la interferencia por la silica primeramente se pusieron dos series de tubos con silica gel y con 0.2 ml de fosfato de potasio 1 mM ( 0.2 uM ) , desarrp llandoles la coloración.

1

i .

A una serie de tubos se les extrajo el color con buta- nol para tener la coloración en la fase orgánica y dejar la silica en la fase acuosa y así eliminar su interferencia, - se leyó la absorbancia a 790 nm ( que es la recomendada ) ,

mientras que la otra serie de tubos se filtró y se leyó la absorbancia a 830 nm, dando los valores en unidades de ab-- sorbancia por no tener ninguna relación contra concentra- ción de las muestras extraidas con butanol y poder obtener tentativamente una metodología donde elimine la interferen- cia dada por la silica, teniendose E itonces:

- la SERIE ( extracto de but mol )

CANTIDAD DE SILICA GEL ( mg )

11.1 13.2 18.1

19.1 27.7 (sin fosfatos) 13.1 (sin fZjafatos)

0.2 ml de fosfato de potasio 1 mpl~

ABSORBANCIA ( 790 NM )

0.58

0.75

0.58

0.63 0.20

0.24

0 . 6 3

I

-- 2a SERIE

( Filtrada y leida a 830 nm )

CANTIDAD DE SILICA GEL ( mg )

12.5 13.7 24.3 11.7 0.2 ml de fosfato

de potasio 1 mM

' ABSORBANCIA ( 790 NM )

0.31

0.31

0.32 0.34

0.58

Los datos entre éstos resultados no se pueden correla- cionar debido a que están leidos a diferentes longitudes de onda. En el extracto de butanol se observan diferencias en la absorbancia entre las muestras m e contenían silica con fosfatos y fosfatos solamente, ademas las muestras que solo contienen silica dieron un valor de absorbancia alto siendo que se esperaban valores muy cercanos a cero.

En la segunda serie de tubos, los valores de las mues- tras con silica y fosfatos ( constantes entre ellos), fué-- ron menores al resultado de la muestra de fosfato de pota-- si0 sin silica, lo cual no dá resultados confiables, tampo- co se observó relación entre la cantidad de silica agregada y el valor obtenido. Con lo que se piensa que al digerirse con todo y silica, ésta forma pequeñas partículas que que-- dan suspendidas en la solución coloreada e interfieren en - la lectura de la absorbancia.

Por lo que se procedió a probar la metodología de Rahe ja, R . K . y colab. ( 23 ) utilizando fosfolípidos estandares - < -

en el cual se efectúa una extracción de focfolípidos de la silica previamente a la digestión ácida. I

I

Para implementar el método, se aplicaron dos muetras - de 9 . 5 u1 de una solucion de fosfatidiletanolamina ( Pe ) - de 2 mg/ml ( correspandientes a 19 ug de cada una ) en una placa cromatográfica y otras dos muestras similares en tu-- bos de ensaye directamente.

Se rasparon las muestras aplicadas en la placa y se -- suspendieron en 5 ml de agua en un tubo de ensayo, extrayen dose con 5 ml de una mezcla de cloroformo-metano1 1 : 1 agi tando en un vortex ( agitador de tubos ) . La fase acuosa (

superior ) se eliminó por succión con ayuda de una pipeta - Pasteur pasando la fase orgánica a otro tubo ( quedandose a dherida la silica gel a la pared del primer tubo ) y junto con las muestras aplicadas directamente al tubo se pusieron a hacer digestión, se desarrolló color y se leyó la abcor-- bancia a 830 nm calculando la concentración de fosfato inor gánico en relación a la curva patrón ( gráfica 6 ) obteniea dose:

r

MUESTRA CONCENTRACION DE FOSFATOS

( uMoles de fosfato de potasio )

0.08 Pe Pe 0.28

0.00 Pe (extraidos de la placa) Pe (extraidos de la placa) 0.014

Estos resultados demuestran que la muestra de fosfoli- pido no fué extraida de la silica, por lo que se realizó u- na segunda determhacidn utilizando la mezcla de cloroformo -metano1 en una proporción de 2 : 1 llevada a cabo de la -- misma forma que la extracción anterior en estandares de fos fatidiletanolamina aplicados a diferentes concentraciones - en otra pl+-a con l os resultados que a continuación se muec tran.

I

I

PROPORCION FOSFATIDIL- FOSFATOS PORCENTAJE CLOROFORMO ETANOLAMINA RECUPERADOS DE METANOL AGREGADA (UMOLES) RECUPERACION

(UMOLES)

2 : l 0.28 0.12 43 %

2 : l 0.56 0.21 38 %

2 : l 0.84 0.19 22 %

2 : l 0.42 0.15 36 %

2 : l 0.70 0.17 24 %

En base a la cuantificación anterior donde se obtiene una concentración de 0.28 umoles de fosfato de potasio en - 19 ug de fosfatidiletanolamina ( Pe ) la cual se toma como el 100 % de cuantificación, se calculó el porciento de recy peración de la tabla anterior.

Lo que se puede observar es una extracción muy baja u- tilizando la mezcla de cloroformo-metano1 1 : 1 y en la mez cla 2 : 1 la extracción es mayor en proporción, aunque dis- minuye la eficiencia a medida que aumenta la concentración del fosfolípido, sugiriendo ya sea, una deficiencia en el - modo de extraer o una saturación del medio de extracción.

Por lo que se hizo una prueba en extractos de fosfoli- pidos de lotes de 10 aleuronas tratadas a diferentes tiem-- pos de inducción en presencia o ausencia de ácido giberéli- co, para probar la extracción directamente sobre las mues-- tras de interes.

Los extractos de aleuronas se obtuvieron según la meto dología, los cuales se separaron por cromatografía en capa fina, junto con estandares de fosfatidilcolina a diferentes concentraciones, realizandose dos determinaciones a diferen tes tiempos de inducción.

CUANTIFEACION M FOSFATIDILCWNA ( SEPARADO GROMATOOMRCAMENTE 1

1- B 8’

gr O.* t

\ \ \

O.

PONDfNES A 10 ALEUBONAS I

CUAHTIFK;ACK>N DE FOSFOUPIDOS

Se calcularon los Rf's y las manchas de las zonas B y (? C se rasparon y se extrajeron los fosfolipidos de la silica

con cloroformo-metano1 2 : 1 para su cuantificación, calcu- lando los ug's totales en relación a la curva patrón ( grá- ficas 10 y 11 ) .

Como se puede observar en los puntos de 19 umoles del estandar de fosfatidilcolina ( gráfica 10 ) , a las 2 hrs de la gráfica 10, zona B, a los tiempos de O y 2 hrs de la gráfica 10, zona C ( y una minima detección a las 4 hrs ) ,

y a los tiempos de 0.5 hrs y 1 hr de la gráfica 11, zonas B y C, no hay detección de fosfatos, debido a que no hubo

extracción de fosfatos, no pudiendose obtener resultados -- confiables.

Por lo que se realizó otra prueba de estracción utili- zando fosfatidilcolina desarrollada a travez de una placa - cromatográfica, aplicándola a diferentes concentraciones y

utilizando como agente de extracción una mezcla de clorofoz mo-metano1 recientemente destilado y comparándola con la -- mezcla hasta ahora utilizada, se desarrolló color y se obtu vieron los valores de la extinción graficándose contra la - concentración aplicada en la placa.

I

I CUANTIFEAUON DE FOSFATIDILCOUNA EX"W CON CLMIOFORMO-MET- ( 21 1

SEPüuM mu. - i

020

i

I

FIG 13: ESTANDAR DE FOSFATlDlL COUNA EXTRAIDO DE LA PLACA CROMATOGRAFICA CON SOLVENTES DESTILADOS RECIENTEMENTE

Con la utilización de cloroformo-metano1 sin destilar, la extracción de fosfolípidos no es uniforme ( gráfica 12 )

siendo que el resultado esperado fuera directamente propor- cional a la concentración, tal como se puede observar en el resultado del extracto utilizando la mezcla recien destila- da ( gráfica 13 ) y para confirmarlo se pusieron tubos de - ensayo a varias concentraciones de fosfatidilcolina, deter- minando la cuantificación por el método colorimetrico ya -- descrito en la metodología obteniendoce una relación direc- tamente proporcional entre la concentración del fosfolípido y la absorbancia obtenida( gráfica 14 ) .

I

CUANTIFICACION DE FOSFATIDILCOUNA ( Is0 8EPARAüüS CROYAlOaWICAYENl€ 1

GRAFICA 14: CUANTIFICACION DIRECTA DE FOSFATI- DlLCOLlNA UTILIZANDO EL METODO DE BARTTLET

MODIFICADO

Tomando en cuenta los fosfolípidos extraídos de la plq ca y los cuantificados directamente, se pueden comparar las gráficas 13 y 14, para calcular el porciento de recupera-- ción ( gráfica 15 ) .

I

Utilizando la pendiente de la recta ajustada de cada u na de las gráficas se obtiene la relación de 0.0092/0.0174= 0.529 que significa una difqrencia del 52.9% entre gráficas.

Ya con esto se puede así obtener una metodología opti- mizada necesaria para la extracción de fosfolípidos de la - placa cromatográfica, aunque con un 52.9 % de recuperación.

En resumen, las variaciones de la metodología utiliza- da quedaron optimizadas de la siguiente forma:

I

DETERMINACION DE CONDUCTIVIDAD.

Se utilizó el ácido giberélico 5 x 10 ^-6 M en soluci- ón acuosa, en lugar de solución amortiguadora succínico-cal cio de pH 5.5 al igual que en los testigos, para efectuar - las mediciones de conductividad de forma más sensible.

CUANTIFICACION DE FOSOFOLIPIDOS:

- Se probó una estabilidad de 10 días para el reactivo de Fiske-Subbarow.

- Se fijó una temperatura de 155°C para descomponer el agua oxigenada utilizada en la digestión.

- Se separaron los diferentes fosfolípidos por cromato grafía en capa fina, solo pudiendo obtener la fosfa- tidilicolina perfectamente identificada dejando los- demás compuestos sin indentificar por falta de estan dares.

- Se eliminó la interferencia que existía por la con- minación del material de vidrio con fosfatos, tratan dolo con mezcla crómica y jabón libre de fosfatos.

- Se utiliz6r2gua oxigenada Perhydrol de Merck al 30 % porque el reactivo de Tecnica Quimica, también conte nía fosfatos.

I

I

I

- Para la extracción de fosfolípidos se concluyó utili zar una mezlca de cloroformo-metano1 ( 2:l v/v ) con reactivos recién destilados, la cual también se uti- lizó para separar los fosfolípidos de la silica gel de las placas cromatograficas y así eliminar la in-- terferencia de ésta.

Para terminar de afinar la metodología para cuantifica ción de fosfolípidos, se buscó la cantidad óptima de detec- ción en las aleuronas, por lo que se tomaron lotes de 10, - 20 y 50 aleuronas obteniendo su fracción microsomal y sepa- rando los fosfolípidos por cromatografía en capa fina y cu- antificando las manchas B y C en relación a la curva patrón obtenida de la fosfatidilcolina extraida de la placa con -- cloroformo-metano1 destilado ( gráfica 15 ) obteniendose:

NUMERO DE ALEURONAS ABSORBANCIA J830 nm) ZONA B ZONA

10 20

50

O. 008 o. 002 0.086 0.036

O. 084/0.074 O. 012/0.044

RESULTADOS

EFECTO DEL ACIDO$GIBERELICO EN LA PERMEABILIDAD MEMBRANAL

DE LAS'CELULAS DEL TEJIDO DE ALEURONA

La semilla se divide en dos partes el embrión y el en- dosperno, el primero es el encargado entre otras funciones de sintetizar la hormona que desencadena el proceso de la - movilización de reservas el Itácido giberélicott y el endos-- permo que se subdivide en endosperm0 almidonoso que es en - sí los nutrientes de reserva y el tejido de aleurona que -- son células encargadas de secretar la enzima hidrolítica -- del almidón, la a-amilasa.

Para determinar si el ácido giberélico tenía efecto en la permeabilidad membranal de las células de la capa de a-- leurona, se procedió a cuantificar la salida de iones y ami noacidos del citoplasma celular hacia el medio que baña el tejido ( medio de incubación ) los iones fueron cuantifica- dos por conductividad y los aminoacidos por espectrofotome- tría del derivado densilado ( Rocen 24 ) .

En las figuras siguientes se muestran los resultados - de tales experimentos.

En l o s primeros experimentos de conductividad lo que - se muestra en las gráfica 16 ( A , B y C ) , es el cociente - que resulta de la conductividad a diferentes tiempos de in- cubación entre la conductividad del medio de incubación ya sea agua detilada o ácido giberélico 5 x 10 ^-6 M. Siendo - este resultado adimensional pues representa el cambio que xiste en la conductividad en relación al tiempo de incuba-- ción y se observa que el eflujo de iones es mayor en ausen- cia de ácido giberelico que en su presencia durante los pri meros 60 minutos de incubacion ( gráfica 16 A y C ) . Aunque el efecl-9 es menor cuando la hormona se retira y se renueva ( gráfica 16 B ) .

EFECTO DEL ACID0 GIBEREUCO EN EL EFLUJO DE IONES DE CAPAS M ALEURONA

A

~

I

C

GRAFlCA 16: í CALCULADO A IO ALEURONAS ) A: L O TES DE 25 ALEURONAS INCUBADAS CON 6 ml

DE MEDIO DE INDUCCION LA CONDUC TIVIDAD SE DETEPMNO C4DA 5 mh P# UN TO TAL DE 60 mh i2 LO 7 . 3 DE IO ALELASONAS INCUBADAS CON 2 mf

DE tMEDI0 DE INDUCC#N SE RENO VO EL MEDIO CAGA 5 mh POR UN TOTAL DE 60 mh. SE TOMO 0.7 ml LE MEDIO AGREGANDOLE 4 m f DE AGUA DESTI- LAC4 PARA MEDIR LA CONDUCT/VIDAD C: . O TES DE 10 AELh90NAS INCUBADOS CON

2 m i DE M€DIO DE INDUCCION A TIEMPOS DE 5 m:, POR UN TO TAL DE 60 mh UTILIZANDO UN LOTE PAF 3 CADA TEMP O. SE TOMO I ml DE MEDIO AGRE- GA I Jü OL E 4 ml DE AGUA DES TILA DA PARA DE TERMI - NAR L4 CONDUCTIVIDAD.

c I

En un primer intento por determinar si hay efecto en - la permeabilidad membranal de las células de la capa de a-- leurona utilizando el metodo de Rosen ( 24 ) , se observó un comportamiento similar entre las aleuronas tratadas con la hormona y sin ésta a partir de los 20 minutos de incubación . En los primeros minutos se observa una salida muy rápida en el eflujo de aminoacidos la cual se estabilizó al igual que las aleuronas tratadas para mantenerse prácticamente i- guales durante los 60 minutos del experimento (gráfica 17A).

Al efectuar un segundo expermiento por éste método, -- las observaciones obtenidas fueron que durante los primeros cuarenta minutos de incubación la cantidad de aminoacidos - presentes en el medio circundante es muy similar tanto para el tejido tratado con ácido giberélico como el control, des pues de éste tiempo cuando menos la salida de aminoacidos - del tejido tratado se mantiene constante mientras que el no tratado continua aumentando ( gráfica 17 B ) .

For otro lado, también se determinó la poza interna de grupos amino primarios en función del tiempo, los resutados ( gráfica 17 C ) , indican que la concentración de aminoaci- dos en las aleuronas tratadas con ácido giberélico tiende a ser mayor que en las aleuronas sin tratar, pero debido a la gran concentración existente el efecto de la estabilidad en la salida de aminoacidos en las aleuronas tratadas con la - hormona y el incremento de las aleuronas sin tratar no se - observa claramente.

Dichos resultados para la determinación de aminoacidos se reportan en tiempos de incubación contra absorbancia, de bido a que no se efectuó curva patrón de leucina para poder tomar l o s cálculos relacionandolos a conmlltración de leuci na.

I

I

EFECTO DEL ACID0 QIBEREUCO EN EL EFLüJO DE AMINOACIDOS DE CAPA DE ALEURONA

I 1

t * + * *

TEMPO DE NQlBMON (

* + * I

C

TEWO DE u#iBMoN ( mrl) B

GRAFKA 17: íG4LCUL4DOA 10 ALEUROU4SI A: LOTES DE 10 AEURONAS iK iBAa4S CON 2 ml E MEDIO E INOUCOOM A TIlempoS DE 5 min POR UN TOTAL DE 60 m h UTLIZANDO UN SOLO LOTE EN CADA 77EMPO. SE TOMO 1 mi PARA LA DTERMINA - CION DE AMINOACIOQS LIBERALOS AL MEDIIO. Br L O E S DE 10 ALEMONAS INCU9AüAS CON 2 mi E MEDIO E INDUCí7OM SE RENOVO EL MEDIO CXDA

5 m h POR UN TOTAL DE 60 mh SE TOMO IMl PARA LA DETERMINACION DE AMlNOACiDOS LIBERA mS AL MEDIO.

C: LOES DE 24 AL EURONAS INCUBADOS CON 6 mi DE

DA 5 mifl POR UN TOTAL DE 60 mh SE WMOSENI!RON CON 2 mi E Nao 0.2 M Y SE TOMO i m l PARA LA W E R - MINACION E AMINOACIDOS EN LA PO24 INTERNA DE LAS

AL EURONAS

MEDYO DE INOUGCION. SE TOMARON 2 ALEURONAS 0-

I

i

EFECTO DEL ACID0 GIBERELICO EN LOS NFVELES DE FOSFOLIPIDOS DEL SISTEMA MEMBRANAL DE LA ALEURONA

Los resultados del apartado anterior sugieren que las caracteristicas membranales del tejido de aleurona son difg rentes cuando en el medio se encuentra presente o nÓ el áci do giberélico.

Para explorar si éste cambio en caracteristicas induci do por ácido giberélico era debido a su composición de fos- folípidos, se determinó el nivel de la mezcla de fosfatidil colina y un compuesto de cadenas hidrocarbonadas ( no iden- tificado ) en la fracción microsomal obtenida del tejido -- control o tratado con la hormona que se separaron cromato- gráficamente ( se identificó como zona B ) y que presentó - un Rf de 0.42 .

También se cuantificó el componente C ( el cual nó se identificó por falta de estandares de referencia ) cuya a- parición en las placas era muy prominente teniendo un Rf - de 0.68 .

Al observar el valor de éstos Rf's con l o s reportados en la optimización de la metodología, los Rf's presentan - variación con respecto a la separación mostrada anterior-- mente, porque al utilizar una misma fáse móvil ( en forma alternada ) para correr 2 ó 3 placas, la composición de és ta varia. Aunque las zonas de manchas siguieron aparecien- do en el mismo orden.

En las figuras siguientes se pueden resumir los resu& tados de las cuantificaciones.

Se realizaron varios experimentos utilizando lotes de 25 aleuronas inducidas con ácido giberéiico 5 x 10 ̂ -6 M Ó

con 1 0 ml de agua destilada,rstéril a tiempos de O, 0.5 y 2 hrs de incubación, se juntaron en lotes de 50 aleuronas pa- r a poder cuantificar los fosfolípidos extraidos de la frac-

-

ción microsomal, los cuales se separaron por C.C.F. junto - con estandares de fosfatidilcolina a concentraciones de 2,- 4 y 10 ug.

0.13

0.05

0.00

ESTANDAR DE FOSATIDILCOLINA

í APUCADO EN LA MISMA PLPCA QUE LAS MUESTRAS PROBLEMA 1

0.ü r 1

+ 0.135: 0.126 8

-

-

- - O(3) r

-0.05 I I I I I I i O 2 4 6 8 10

CONCENTRACION DE FOCFATIDILCOUNA { ug 1

G R W A 18: CURVA PATRaYffEfc;oFAffiIWifff! AWC4üA EffiA RAC4 CRXATcxiRAAFEcjl A Wf.R€NT..S G7K€NT./?ArAWúvES f FW?M€DO DE TRES ffETERhffffAC~ES W f f UNA WRREUUON ffE 0.8743 Y UNA ENDENTE í?.. O.Mü5R

Como se puede observar en la gráfica 18 del estandar, su cuantificación fué adecuada, esto quiere decir que la ex tracción en la placa fué lineal con un 99% de confiabilidad , pues el coeficiente de correlación de la curva, es mayor al valor calculado ( que está en la tabla al final de - la metodología considerando 7 grados de libertad y 99 % de confiabilidad ) aunque la variabilidad de estos datos es de 26.3 % en promedio que para fines de cuantificación nos da- rían errores muy considerables,

CUANTIFICACION DE FOSFOLIPIDOS EXTRAIDOS DE LA FRACCION MICROSOMAL DE ALEURONAS

ZONA B ZONA C EWERNEHTO ESERNENTO EPERYENTO

O 1 o2 o 3 + X D

- +DATOS 2 3 3 SDEV. O0025 0.0412 2 0335

$ ,,S.REL. 23.8% 115.7%

EWERNENTO EWERYENTO EWERNENTO O 1 o 2 O 1 + X

wwNwr0 EWEWENTO UQERNEWTO o1 o 2 t X

O >

#DATOS 2 3 3 - S.MV. O 0.0123 0.0083 f S.REL O 160.2% 47.2 X o 0.03 3 0 . 0.025 I 0.025

m 0.022

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8 ’ - 9 om-

3 .

O I 2

nEum CE INCL~AQCN i ws I

EBERNENTO EPZRNBITO ESERNEMTO O1 o2 o3

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#GAT-S 2 2 1 - S E V o 000% O

SREL o 3 3 3 % o . 3 004- x 0.038 ; .

5 0 0 3 -

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& om 8 ’

5 . 0 0 2 -

-

O f 2

nEwo LE INCUBMON i I

GRAFlCA 19: EFECTO DEL ACID0 GIBEREiCO EN L A CONCfNTFACION DE FOSFOUFiDOS EXTRAIDOS DE LOTES DE 50 ALEURONAS QLF FUERON TRA TADAS A DIFERENTES TIEMPOS DE INDUCG’ON EN PRESENCIA O AUSEVCJA DE i A HORMONA. SEFRESENTAN DA TOS INDIVIDUALES AS/ CQMO LOS DA TOS DE DECL’IACIGI/ ESTANDAR Y REL 4 TIM fS.CEK Y S. REL.

Ademas, en los resultados obtenidos en los experimen-- tos de inducción ( grafica 19 ) , se presentan los datos in- dividuales de cada experimento, graficando unicamente la 14 nea promedio de dichos datos.

En ésta misma gráfica se pueden observar l a s desviacip nes estandar ( S ) a cada uno de los tiempos de incubacibn y la desviación relativa de dichos datos ( C.Rel. ) .

Por lo que podemos observar desviaciones muy grandes, no existiendo reproducibilidad de resultados, siendo los rg sultados obtenidos debidos completamente al azar, por lo -- que las causas de estos resultados pueden ser debidas a va- rios factores:

r

- La extracción de fosfolípidos de la fracción microso- mal pudo haber sido incompleta y por eso se presente la variabilidad de resultados.

- Se comprobó que la extracción de fosfolípidos de las placas cromatogragficas fué deficiente, con una va-- riabilidad del 26.3 % ( grafica 18 ) y con un porcen taje de extracción del 52 .9 % ( grafica 15 ) .

- Puede existir cierta descomposición de los fosfo- lípidos en las placas cromatográficas, por lo que se presenta menor extracción en algunos casos y - por consiguiente la variación de resultados.

- El metodo de detección de Bartlett ( para fósforo inorgánico ) probablemente no sea lo suficiente-- mente sensible para detectar las pequeñas cantida des de fosfolípido extraidas en nuestro estudio - sin tener una variación considerable.

i

I

En base a éstos resultados obtenidos podemos decir que no es posible cuantificar los fosfolipidos de la fracción - microsomal con las condiciones utilizadas en este estudio, estableciendo así las posibles causas por las cuales no fué posible cuantificarlos.

. .

DISCUSIONES

Se há demostrado que desde el momento de la imbibición las aleuronas empiezan a tener cambios en sus niveles de -- concentración de fosfolípdos en semillas de trigo ( 29 ) .

Aunque nuestro estudio nó se enfoca a ésta parte, sino despues de la imbibición es importante saber que yá se pre- senta actividad celular, la cual, dentro de las primeras -- dos horas de incubación se observa un incremento en la sali da de iones al medio que circunda a las celulas de la aleu- rona, efecto que se va a ver regulado por el ácido giberéli co .

Este mismo efecto se observa, aunque poco mas tardío, en la salida de aminoacidos. Con ésto podemos ver que el 8-

cido giberélico tiene efectos a nivel membranal, modifican- do su permeabilidad dentro de las dos primeras horas de in- cubación.

Una vez demostrada la viabilidad celular de las aleurq nas, se pretendió medir l os niveles de fosfolipidos membra- nales.

ácido giberélico desencadena la incorporacion de ( 14C) coli na dentro de la fracción microsomal parcialmente purificada ( 8 ) y también de ( 32P) ortofosfato dentro de fosfolipi-- dos de varias fracciones celulares, incluyendo la fracción microsomal ( 16 ) , y que ocurren dentro de las 4 hrs a la a plicación de la hormona.

Kende en 1971, demuestran que en la vía de la CTP-colina -- fosfatocitidiltransferasa y la CDP-colina 1,2 diglicerido-- fosfocolinatransferasa que son enzimas de la via de la CDP- colina que es uno de los pasos intermedios en la biosínte-- sic de fosfolipidos, se incrementa dentro de l a s dos prime- ras horas de aplicada l a hormona.

Referencias bibliográficas nos dicen que en cebada el

Otras actividades "IN VITROt1 realizadas por Johnson y

En nuestro presente estudio se pretendía encontrar e-- fectos provocados por el ácido giberélico en el nivel de -- fosfolípidos c$e la fracción microsomal, pero "no fué posible medir los niveles de fosfolípidos adecuadamente debido a - que se presentó una gran variabilidad de resultados, la cu- al puede ser principalmente debida a los métodos de extrac- ción utilizados para obtener los fosfolípidos tanto de la - fracción microsomal, como de los fosfolípidos separados crq matográficamente, además de obtener un porciento de recupe- ración en placa sumamente bajo ( 52.9 % ) .

Es posible que el mismo problema en la recuperación se haya presentado en la extracción de los fosfolípidos de la fracción microsomal y que tales hechos hayan repercutido en los resultados de cuantificación finales.

‘3 I

CONCLUSIONES

Por un lado podemos ver que el ácido giberélico es una hormona importante en la regulación del metabolismo de fos- folípidos, su efecto vá a tener una regulación en la perme- abilidad de la membrana, la cual queda de manifiesto por no observarse un flujo de salida de iones al medio circundante en forma continua, efecto demostrado por experimentos de -- conductividad.

Ademas, existen varios tipos de fosfolipidos dentro de los cuales los principales son la fofatidilcolina, la fos-- fatidilserina y la fosfatidiletanolamina.

de cadenas hidrocarbonadas, se pudo identificar con ayuda - de estandares, al igual que la fasfatidiletanolamina que -- tambien se pudo identificar, aunque no se intentó su cuanti ficación por observarse en pequeña concentración dentro de la placa cromatográfica. En cuanto a la fosfatidílserina no fue posible precisar su identidad.

No fué factible obtener cuantificaciones de fosfolipi- dos porque se obtuvo una gran dispersión de datos, debida - posiblemente al método de extracción, el cual al parecer no extrajo los fosfolipidos de las placas cromatográficas en - forma uniforme y el método de detección posiblemente no sea lo suficientemente sensible.

Por lo que se puede concluir que el ácido giberélico - regula la permeabilidad de la membrana de la capa de aleurg na de cebada.

Tambien es importante tener una metodología perfecta-- -? mente probada, antes de proceder a experimentar con élla, -

tratan do de abarcar las variables que puedan afectar el dg sarrollo del experimento.

Aunque la fosfatidilcolina se mezcló con un compuesto

;\ I

RESUMEN

La sebilla se divide en dos regiones: el embrión y el endospermo, el cual se compone del endospermo almidonoso y la capa de aleurona.

En éste estudio se pretende determinar la contribución del metabolismo de fosfolípidos en el mecanismo de acción - de ácido giberélico en la fase lag de inducción de a-amila- sa, dentro de las primeras 2 horas, utilizando aleuronas de semilla de cebada ( HORDEUM Vulaare. var. Himalaya ) .

Con determinaciones de conductividad y cuantificación espectrofotométrica del derivado densilado de aminoacidos, se comprobó el efecto que tiene el ácido giberélico en la - permeabilidad membranal de las células de la capa de aleurQ na, mostrando un eflujo de componentes mayor en ausencia de la hormona que en su presencia.

Para cuantificar los fosfolípidos membranales se efec- tuaron determinaciones de separación por cormatografía en - capa fina ( C.C.F. ) , degradación de fósforo inorgánico por digestión ácida y cuantificación espectrofotométrica, efec- tuando experimentos previos para obtener condiciones opti-- mas, en las cuales se comprobó y eliminó la contaminación - de fosfatos usando material tratado con mezcla crómica, re- activos de grado analitico y solventes destilados.

Se fijó una temperatura de 155°C para la digestión áci da.

Se estableció una estabilidad de 10 días para el reac- tivo reductor de la reacción colorimétrica del fósforo inor gánico ( Fiske-Subbarow ) .

no1 recientemente destilados de 2 :1 q c son los solventes de extracción de fosfolípidos.

Se determinó una proporción optima de cloroformo-meta-

Por último se fijó un numero de 5 0 aleuronas para te-- ner una adecuada extracción y cuantificación de fosfolipi-- dos.

Se separaron los fosfolípidos por C.C.F. identificando la fosfatidilcolina y la fosfatidiletanolamina unicamente, dejando las demas zonas de manchas sin identificar por fal- ta de estandares.

Se encontró que el ácido giberélico regula la permeabi lidad de la membrana de la capa de aleurona de cebada, pero no es posible cuantificar los fosfolípidos extraidos de la fracción microsomal debido a un porcentaje de recuperación en placa del 52.9 % en la técnica de extracción y a que no se probó la sensibilidad del método espectrofotométrico de cuantificación el cual mostró una gran dispersión de resul- tados.

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