TINGKAT KONSENTRASI PROTEIN

PADA PLATELET RICH PLASMA-1

YANG DIINDUKSI KALSIUM KLORIDA

Laporan penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA KEDOKTERAN

Oleh:

SARAH ATTAUHIDAH

NIM: 1112103000065

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI

SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

1436 H/2015 M

ii

iii

iv

v

KATA PENGANTAR

Segala puji bagi Allah SWT atas nikmat yang telah diberikan, baik nikmat

iman, Islam, dan nikmat sehat, penulis mampu menyelesaikan laporan penelitian

ini dengan baik. Shalawat serta salam penulis ucapkan kepada Baginda Rasulullah

SAW yang selalu menjadi tauladan bagi umat-Nya. Penulis menyadari bahwa

tanpa bimbingan dan bantuan dari berbagai pihak, maka penelitian ini tidak akan

pernah selesai. Oleh sebab itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Dr. H. Arif Sumantri, S.KM, M. Kes selaku Dekan FKIK UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

2. dr. Witri Ardini, M. Gizi, Sp. GK selaku Ketua Program Studi Pendidikan

Dokter FKIK UIN Jakarta.

3. dr. Achmad Zaki, M. Epid, Sp. OT selaku pembimbing 1. Terima kasih atas

waktu, tenaga, pikiran, dan semangatnya untuk membimbing penulis dari

nol hingga akhirnya penelitian ini dapat diselesaikan.

4. dr. Ahmad Azwar Habibi, M. Biomed selaku pembimbing 2. Terima kasih

sudah bersedia meluangkan waktu dan membimbing penulis sehingga dapat

menyelesaikan penelitian ini.

5. dr. Nouval Shahab, Sp.U, Ph.D, FICS, FACS selaku penanggung jawab

modul riset PSPD angkatan 2012, terima kasih atas bimbingannya pada

kami semua dalam menjalani penelitian ini.

6. Bu Nurlaely, M. Biomed dan Mbak Ai yang telah membimbing penulis

selama penelitian di laboratorium. Terima kasih telah sabar dan penuh

semangat membimbing penulis dari awal hingga selesai.

7. Rasa hormat dan terima kasih yang tak terhingga kepada kedua orangtua

penulis dan keluarga, Dr. Abdurrahman, SE, MM dan Faridah, S. Pd yang

selalu memberikan semangat, nasihat, dan doa restu selama penulis

menjalankan pendidikan.

8. Teman-teman sejawat seperjuangan kelompok riset, Alfa, Mohammed,

Khoiron, dan terutama Muthiah yang selalu memberi semangat untuk terus

berkomitmen pada penelitian ini.

vi

9. Keenam responden yang bersedia memberikan darahnya untuk sampel

penelitian. Semoga kebaikan kalian dibalas oleh Allah SWT dengan balasan

yang berlipat ganda.

10. Teman-teman Ikatan Senat Mahasiswa Kedokteran Indonesia (ISMKI)

Wilayah 2 yang sangat mengerti agenda penulis dalam penyusunan laporan

penelitian, serta tak hentinya semangat yang terus diberikan untuk penulis.

11. Teman-teman sejawat PSPD 2012, khususnya para wanita di Puri Laras II,

terima kasih kebersamaan, semangat, dan motivasinya selama ini.

Penulis menyadari laporan penelitian ini masih jauh dari bentuk yang

sempurna. Segala kritik dan saran yang membangun dari berbagai pihak sangat

penulis harapkan. Demikian laporan ini penulis susun, semoga bermanfaat untuk

ilmu pengetahuan, agama, dunia, dan setelahnya nanti. Aamiin.

Jakarta, 28 Mei 2015

vii

ABSTRACT

Sarah Attauhidah. Medical Education Study Program. Level of Protein

Concentration in Platelet Rich Plasma-1 Induced Calcium Chloride. 2015

Platelet rich plasma (PRP) is nowadays increasingly developed to produce

optimal healing therapy in various medical fields. The purpose of this study was

to determine the protocol manufacture of PRP-1 induced calcium chloride

(CaCl2), determine the effect of calcium chloride (CaCl2) in PRP-1, and to know

the changes of protein concentration in PRP-1 and it’s control. The sample in this

study amounted to 6 healthy people who are not currently taking medications

within a certain period, and did not have a history of infections in the last 1

month. The average value of the protein concentration in PRP-1 induced calcium

chloride (CaCl2) increased (1.17915) compared with the average of it’s control

(0.46549).

Keywords: platelet rich plasma-1, activation of calcium chloride (CaCl2).

ABSTRAK

Sarah Attauhidah. Program Studi Pendidikan Dokter. Tingkat Konsentrasi

Protein Pada Platelet Rich Plasma-1 yang Diinduksi Kalsium Klorida. 2015

Dewasa ini, platelet rich plasma semakin dikembangkan untuk menghasilkan

terapi penyembuhan yang optimal dalam berbagai bidang medis. Tujuan

penelitian ini adalah mengetahui protokol pembuatan PRP-1 yang diinduksi

kalsium klorida (CaCl2), mengetahui pengaruh kalsium klorida (CaCl2) tersebut

pada PRP-1, serta mengetahui perubahan konsentrasi protein pada PRP-1

terhadap kontrol negatifnya. Sampel dalam penelitian ini berjumlah 6 orang sehat

yang tidak sedang mengkonsumsi obat-obatan dalam jangka waktu tertentu, dan

tidak memiliki riwayat infeksi dalam 1 bulan terakhir. Nilai rerata konsentrasi

protein pada PRP-1 yang diinduksi kalsium klorida (CaCl2) mengalami

peningkatan (1,17915) bila dibandingkan dengan rerata konsentrasi protein

kontrolnya (0,46549).

Kata kunci: platelet rich plasma-1, aktivasi kalsium klorida (CaCl2).

viii

DAFTAR ISI

LEMBAR JUDUL ................................................................................................. i

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................ ii

LEMBAR PERSETUJUAN .............................................................................. iii

LEMBAR PENGESAHAN ............................................................................... iv

KATA PENGANTAR ........................................................................................... v

ABSTRAK ......................................................................................................... vii

DAFTAR ISI ..................................................................................................... viii

DAFTAR TABEL ................................................................................................ x

DAFTAR GRAFIK ............................................................................................ xi

DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xii

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xiii

DAFTAR SINGKATAN .................................................................................. xiv

BAB 1 PENDAHULUAN .................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ..................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ................................................................................ 2

1.3 Hipotesis ............................................................................................... 2

1.4 Tujuan .................................................................................................. 3

1.4.1 Tujuan Umum .................................................................... 3

1.4.2 Tujuan Khusus ................................................................... 3

1.5 Manfaat ................................................................................................ 3

1.5.1 Bagi Peneliti ....................................................................... 3

1.5.2 Bagi Institusi ...................................................................... 3

1.5.3 Bagi Masyarakat ................................................................. 4

ix

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................ 5

2.1 Landasan Teori ..................................................................................... 5

2.1.1 Platelet ................................................................................ 5

2.1.2 Platelet Rich Plasma ........................................................... 8

2.1.3 Kalsium Klorida (CaCl2) .................................................. 11

2.1.4 Absorbansi dan Konsentrasi Protein ................................. 11

2.2 Kerangka Teori .................................................................................. 15

2.3 Kerangka Konsep .............................................................................. 16

2.4 Definisi Operasional .......................................................................... 17

BAB 3 METODE PENELITIAN ....................................................................... 19

3.1 Definisi Penelitian ............................................................................. 19

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................... 19

3.3 Alat dan Bahan Penelitian ................................................................. 19

3.4 Kriteria Inklusi dan Eksklusi ............................................................. 20

3.5 Besar dan Cara Pengambilan Responden .......................................... 20

3.6 Alur Penelitian ................................................................................... 22

3.7 Cara Kerja Penelitian ........................................................................ 23

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 25

4.1 Karakteristik Responden ................................................................... 25

4.2 Penentuan Kadar Protein ................................................................... 26

4.3 Penentuan Absorbansi Larutan Standar Protein ................................ 26

4.4 Penentuan Persamaan Garis Regresi Linear Standar ........................ 26

4.5 Penentuan Absorbansi Larutan Sampel ............................................. 28

4.6 Penentuan Konsentrasi Sampel ......................................................... 28

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................... 33

5.1 Kesimpulan ......................................................................................... 33

5.2 Saran .................................................................................................... 33

x

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Variasi hasil relative centrifugal force pada whole blood cells ........... 9

Tabel 2.2 Variasi hasil pengaruh suhu pada sentrifugasi pertama PRP-1 ............ 9

Tabel 4.1 Data responden sampel....................................................................... 25

Tabel 4.2 Absorbansi larutan standar ................................................................. 26

Tabel 4.3 Absorbansi larutan sampel ................................................................. 28

Tabel 4.4 Konsentrasi protein larutan sampel .................................................... 29

xi

DAFTAR GRAFIK

Grafik 4.1 Perbandingan PRP-2 yang teraktivasi dengan konsentrasi growth

factor di dalamnya .............................................................................. 30

Grafik 4.2 Perbandingan konsentrasi protein pada kedua kontrol ....................... 31

xii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Ultrastruktur trombosit .................................................................... 6

Gambar 2.2 Proses hemostasis vessel injury ....................................................... 7

Gambar 2.3 Lapisan whole blood yang telah disentrifugasi ............................. 10

Gambar 2.4 Prinsip dasar spektrofotometri ....................................................... 12

Gambar 2.5 Transmitans spektrofotometer ....................................................... 13

Gambar 4.2 Kurva standar protein .................................................................... 27

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Lembar informed consent .............................................................. 37

Lampiran 2 Protokol pembuatan Platelet Rich Plasma-1 yang Diinduksi

Kalsium Klorida ............................................................................. 38

Lampiran 3 Surat permohonan ethical appearance penelitian ......................... 39

Lampiran 4 Dokumentasi penelitian ................................................................. 40

Lampiran 4 Daftar riwayat hidup peneliti ......................................................... 43

xiv

DAFTAR SINGKATAN

PRP Platelet rich plasma

PPP Platelet poor plasma

GP Glikoprotein

ACD Anticoagulant Citrate Dextrose

BSA Bovine Serum Albumine

WBC Whole blood cell

RCF Relative Centrifugal Force

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dewasa ini, platelet rich plasma (PRP) telah digunakan secara luas untuk

tata laksana klinis di berbagai cabang kedokteran, seperti ortopedi, oftalmologi,

dan terapi penyembuhan lainnya karena ditemukan adanya peningkatan fungsi

regenerasi jaringan. Namun, ada beberapa hal mengenai studi ini yang masih

meragukan dikarenakan perbedaan dari persiapan PRP yang digunakan. Hal ini

menimbulkan perbedaan respon yang tidak bisa disamakan1.

Platelet atau yang biasa disebut trombosit ialah fragmen sel darah terkecil

maupun teringan yang memiliki fungsi penting dalam recovery cells. Aktivasi

platelet terjadi dimulai dari cedera atau rusaknya pembuluh darah yang akan

mengaktivasi enzim proteolitik protrombin menjadi trombin dan fibrinogen

(sebagai platelet glue) menjadi fibrin. Hasilnya akan terjadi penguatan kembali

ikatan-ikatan fibrin untuk memperbaiki kerusakan2.

Platelet rich plasma (PRP) pertama kali ditemukan oleh Ferrari M pada

tahun 1987. Sejak saat itu, PRP berkembang sebagai sesuatu yang aman dan

merupakan alternatif alami dalam pengobatan. Platelet rich plasma dipromosikan

sebagai sebuah prosedur terapi yang organik dan memungkinkan dalam proses

penyembuhan karena natural growth factor yang ada di PRP itu sendiri. Beberapa

tahun setelahnya, PRP mulai diteliti lebih dalam. Sebuah studi mengatakan jika

platelet mengandung faktor pertumbuhan yang berlimpah dan sitokin yang dapat

mempengaruhi proses cedera, inflamasi, infeksi, osteogenesis, dan penyembuhan

jaringan lunak. Penelitian terakhir juga memperlihatkan bahwa platelet

mengeluarkan beberapa protein bioaktif yang bertanggungjawab untuk menarik

makrofag, mesenkimal stem sel, dan osteoblast. Fungsinya tidak hanya

menghentikan proses degenerasi dan nekrotik suatu jaringan, akan tetapi juga

mempertinggi kemungkinan jaringan beregenerasi melalui proses penyembuhan3.

2

Platelet rich plasma mengandung bermacam-macam sitokin, seperti

interleukin, tumor necrosis factor (TNF)α, interferon (IFN)g, anti-inflammatory

cytokines, chemokines (eotaxin, protein 10, monocyte chemoattractant protein 1,

dan growth factors), serta komponen lainnya yang keberadaannya dapat

dipresentasikan dalam konsentrasi protein4.

Di samping fungsi-fungsi yang sudah dibahas di atas, platelet-derived

products dapat digunakan dengan atau tanpa aktivasi platelet sebelumnya.

Beberapa penelitian menggunakan berbagai metode dalam mempersiapkan PRP,

dari cara konvensional sentrifugasi sampai dengan commercial system, yaitu

dengan menggunakan kolagen, kalsium, dan/atau trombin5. Menurut hasil

penelitian Amable et al (2013), aktivasi PRP-2 menggunakan CaCl2 akan

mengalami peningkatan jika dibandingkan dengan aktivasi PRP-2 dengan

trombin. Hal tersebut dapat dilihat berdasarkan kadar growth factor yang

meningkat1. Namun sampai saat ini belum ada yang menggali lebih dalam apakah

efektivitas kalsium klorida pada PRP-1 lebih baik dibandingkan PRP-1 tanpa

aktivasi, dengan melihat konsentrasi protein di dalamnya.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, bagaimana pengaruh induksi kalsium

klorida (CaCl2) terhadap tingkat konsentrasi protein pada Platelet Rich Plasma-1

(PRP-1)?

1.3 Hipotesis

Berdasarkan pertanyaan dari rumusan masalah mengenai pengaruh induksi

kalsium klorida (CaCl2) terhadap tingkat konsentrasi Platelet Rich Plasma-1

(PRP-1), maka terdapat peningkatan konsentrasi protein pada PRP-1 yang

diinduksi oleh kalsium klorida.

3

1.4 Tujuan

1.4.1 Tujuan Umum

Mengetahui pengaruh kalsium klorida (CaCl2) yang diinduksikan pada

Platelet Rich Plasma-1 (PRP-1).

1.4.2 Tujuan Khusus

- Mengetahui adanya perbedaan konsentrasi protein pada Platelet Rich

Plasma-1 (PRP-1) setelah diinduksi oleh kalsium klorida (CaCl2) dan kontrol

negatifnya.

- Mengetahui protokol pembuatan Platelet Rich Plasma (PRP-1) yang

diinduksi kalsium klorida (CaCl2).

1.5 Manfaat Penelitian

1.5.1 Bagi Peneliti

1. Mendapatkan ilmu dan pengalaman dalam hal meneliti di bidang

biomedik.

2. Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran

di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri

Syarif Hidayatullah Jakarta.

1.5.2 Bagi Institusi

1. Mendapatkan referensi hasil penelitian dari pengaruh induksi kalsium

klorida pada konsentrasi protein yang ada di PRP-1.

2. Referensi penelitian di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta bertambah.

4

3. Hasil dari penelitian tersebut dapat digunakan peneliti lain untuk

melanjutkan penelitian.

1.5.3 Bagi Masyarakat

1. Memberikan kontribusi dalam pengembangan ilmu kedokteran yang

dapat diterapkan untuk terapi penyembuhan yang lebih optimal pada

pasien di masa yang akan datang.

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Landasan Teori

2.1.1 Platelet

Platelet atau trombosit merupakan fragmen sel darah yang beredar di tubuh.

Platelet diproduksi di sumsum tulang (bone narrow) dengan hormon

trombopoietin sebagai regulator utama yang dihasilkan oleh organ hepar dan

ginjal. Di bawah pengaruh hormon tersebut, myeloid stem cells berkembang

menjadi megakaryocyte-colony-forming cells sebagai sel prekursor, atau yang

biasa disebut megakarioblas. Selanjutnya, megakarioblas akan bertransformasi

menjadi megakariosit. Megakariosit mengalami replikasi DNA tanpa pembelahan

nukleus atau sitoplasma yang apabila jumlah lobus nukleus bertambah, maka

volume sitoplasma menjadi dua kali lipatnya. Setelah nukleus berjumlah delapan,

sitoplasma berubah menjadi granular. Dari fragmentasi ujung-ujung perluasan

sitoplasma bergranul itulah terbentuknya 1.000-5.000 trombosit dalam satu

megakariosit. Proses diferensiasi ini membutuhkan waktu sekitar 10 hari6.

Platelet memiliki ukuran kecil berdiameter 2-4µm dengan banyak vesicles,

namun tidak memiliki nukleus. Volume rerata platelet ialah 7-11fL. Jumlah

platelet normal berkisar antara 150-400x109/L dengan usia normalnya 5-9 hari.

Platelet yang sudah apoptosis akan dibawa oleh makrofag dari limpa dan hepar.

Gambaran ultrastruktur platelet dapat dilihat pada gambar 2.1.

Struktur platelet yang mengandung protein di permukaannya berguna untuk

perlekatan platelet pada dinding pembuluh darah. Protein tersebut memiliki

kesamaan dengan protein yang ada di otot, yaitu dapat berubah bentuk jika

mengalami situasi tertentu yang cukup ‘sulit’. Platelet juga mengandung granula

yang dapat menyekresi protein-protein lain yang diperlukan untuk penguatan

pembuluh darah yang rusak.

6

Gambar 2.1 Ultrastruktur platelet

Sumber: Hoffbrand AV, Moss PAH, 2013

Fungsi utama platelet ialah membentuk sumbatan platelet dan mengeluarkan

faktor kimiawi pada respon hemostatik normal terhadap cedera vaskular (spasme

vaskular dan proses koagulasi). Respon hemostatik normal pada saat cedera ini

bergantung pada interaksi erat antara dinding pembuluh darah dan faktor

koagulasi. Mekanisme respon homeostatis normal saat cedera dapat dilihat pada

gambar 2.2.

Saat pembuluh darah rusak/cedera, paparan kolagen membuat sinyal

perlekatan antar platelet di lokasi kerusakan. Aktivasi dari platelet ditandai

dengan perubahan bentuk, sekresi granula, serta pengaktifan glikoprotein IIb/IIIa.

Glikoprotein selubung permukaan ini sangat penting dalam reaksi perlekatan dan

agregasi platelet. Serotonin dikeluarkan sebagai sinyal supaya pembuluh darah

melakukan vasokontriksi untuk menurunkan aliran darah. Sedangkan fosfolipid

platelet (yang dahulu disebut faktor trombosit 3) berperan dalam perubahan faktor

koagulasi X menjadi Xa dan protrombin (faktor II) menjadi thrombin (faktor IIa).

7

Keseluruhan proses hemostasis tersebut menyebabkan penyumbatan hemostatik

yang stabil6.

Gambar 2.2 Proses hemostasis antara pembuluh darah, platelet, dan proses

koagulasi ketika ada kerusakan pembuluh darah

Sumber: Hoffbrand AV, Moss PAH, 2013

Seperti yang telah dijelaskan di atas, reaksi pertama platelet setelah cedera

pembuluh darah ialah proses adhesi atau perlekatan. Berikut proses adhesi antar

platelet yang akan menutup perdarahan di lokasi cidera:

Platelet sebagai fragmen sel terkecil dan teringan

↓

Terdorong dari aliran darah menuju dinding pembuluh darah

↓

Platelet saling tergulung di sepanjang permukaan endothelium

↓

INJURY → Endothelium rusak

↓

Tough fibers terekspos ke aliran darah

8

↓

Reaksi pertama platelet ---- Tough fibers menyelubungi dinding pembuluh darah

↓

Menarik platelet (seperti magnet)

↓

Terstimulasi berubah bentuk secara situasional

↓

Menutup perdarahan2

2.1.2 Platelet Rich Plasma

Platelet yang merupakan fragmen sel darah dengan bentuk terkecil dan

teringan ini, normal beredar dalam darah dengan jumlah 150.000-450.000

platelet/ml darah.

Seperti definisinya, platelet rich plasma (PRP) harus mengandung platelet

dengan konsentrasi tinggi daripada baseline. Ada beberapa parameter yang

dibutuhkan untuk menentukan jumlah PRP, seperti konsentrasi platelet di atas

baseline, ada atau tidaknya leukosit, apakah PRP tidak menggumpal atau tidak,

dan apakah PRP membutuhkan aktivasi eksogen atau tidak. Beberapa parameter

itulah yang membedakan platelet poor plasma (PPP) dan PRP. Graziani et al

(2006) mengatakan bahwa konsentrasi optimal PRP adalah 2,5 x lebih tinggi dari

baseline7.

Sesuai metodenya, prosedur dasar pembuatan PRP ialah sentrifugasi.

Variasi relative centrifugal force (RCF), suhu, dan waktu merupakan indikator

yang cukup penting di dalam proses sentrifugasi tersebut. Variasi RCF dapat

dilihat pada tabel di bawah ini:

9

Tabel 2.1 Variasi hasil relative centrifugation force pada whole blood cells*

*satuan kecepatan RCF (g) akan dikalibrasikan ke satuan rpm

Sumber: Amable PR et al, 2013

Menurut Amable et al (2013), pada penelitiannya mengenai variasi hasil

RCF (tabel 2.1), hasil terbaik dalam sentrifugasi pertama whole blood cells ialah

dalam kondisi ke-11 (300 x g, 5 menit, 120C) yang merupakan satu-satunya

kondisi dengan waktu sentrifugasi terendah.

Tabel 2.2 Variasi hasil pengaruh suhu pada sentrifugasi pertama

Sumber: Amable PR et al, 2013

10

Sedangkan menurut variasi hasil suhu (tabel 2.2), variasi suhu dianggap

tidak terlalu berpengaruh karena tidak ada perbedaan yang signifikan pada hasil

akhir PRP-1, baik pada suhu 120C dan 18

0C (suhu ruangan)

1, 2, 4.

Setelah menggunakan metode yang disepakati dalam pembuatan PRP-1,

whole blood (WB) akan menghasilkan 3 fraksi, yaitu lapisan bawah yang

mengandung eritrosit/sel darah merah dengan jumlah setengah dari volume,

lapisan tengah yang mengandung leukosit/sel darah putih (buffy coat), dan lapisan

paling atas yang mengandung plasma, platelet, dan sedikit sel darah putih.

Lapisan paling atas itulah yang disebut platelet rich plasma-1 (PRP-1). Tiap

lapisan dapat dilihat pada gambar 2.3 di bawah ini.

Gambar 2.3 Lapisan whole blood yang telah disentrifugasi.

Sumber: Sherwood, Lauralee, 2012.

Oleh karena perbedaan kandungan di tiap lapisan, cara pengambilan PRP-1

harus menggunakan pipet/mikropet untuk mencegah tercampurnya sel darah

merah dan buffy coat. Dengan masih adanya leukosit pada PRP-1, beberapa studi

mengatakan bahwa tingginya kadar konsentrasi leukosit pada PRP secara

langsung berhubungan dengan catabolic gene expression yang mengakibatkan

terganggunya proses penyembuhan jaringan13

.

Di sisi lain, jika PRP-1 dilakukan sentrifugasi lanjutan yang kedua, maka

dinamakan PRP-210

.

11

2.1.3 Kalsium Klorida (CaCl2)

Untuk mencapai efek yang diinginkan, platelet rich plasma (PRP) dapat

diaktivasi secara eksogen oleh trombin, kalsium klorida (CaCl2), atau mekanikal

trauma. Sekali PRP teraktivasi, fibrin mulai terbentuk menjadi bivalent, yaitu

jaringan yang unstable. Jika PRP diaktivasi dengan cara yang lebih fisiologis,

jaringan tetramolekular ini akan meningkatkan growth factors nya dalam tahap

recovery cells10

.

Selain itu, pengaktivasian oleh kalsium dibutuhkan untuk mengaktifkan

protrombin menjadi enzim trombin yang selanjutnya diubah menjadi fibrinogen

sebagai salah satu protein darah untuk proses penyembuhan jaringan. Proses

penyembuhan ini dimulai dengan pembentukan fibrin-fibrin untuk mengumpulkan

platelet dan menutup perdarahan14, 15

. Hal ini membuat PRP yang diaktivasi oleh

kalsium klorida akan memiliki efektivitas lebih tinggi dalam proses penyembuhan

dikarenakan akan meningkatkan kinerja faktor-faktor pembekuan darah, yang

dapat direpresentasikan sebagai protein.

2.1.4 Absorbansi dan Konsentrasi Protein

Protein berasal dari kata proteos pada bahasa Yunani yang artinya pertama

atau utama. Sebagai komponen terpenting penyusun tubuh manusia, protein

merupakan polimer dari berbagai monomer asam amino yang dihubungkan

dengan ikatan peptida. Protein juga bersifat amfoter atau dapat bereaksi dalam

larutan asam maupun basa. Untuk mengetahui adanya ikatan protein secara

kualitatif pada suatu larutan, umumnya menggunakan uji biuret yang tergolong

mudah. Campuran antara larutan CuSO4 dan NaOH pada uji biuret ini akan

menghasilkan warna lembayung ungu jika positif terdapat ikatan proteinnya20

.

Sedangkan untuk mengetahui tingkat absorbansi protein (secara kuantitatif)

pada suatu larutan, peneliti menggunakan alat spektrofotometer. Spektofotometer

adalah alat untuk mendispersikan dan menghasilkan cahaya dengan menghasilkan

range panjang gelombang cahaya. Spektofotometer secara umum mengandung 2

komponen, yaitu spektrometer dan fotometer. Spektrometer berfungsi untuk

mendispersikan dan menghasilkan cahaya dengan menghasilkan panjang

gelombang cahaya. Sedangkan fotometer berfungsi sebagai fotoelektrik detektor

12

yang mengukur intensitas cahaya16

. Penjelasan mengenai cara kerja

spektofotometer itu sendiri akan dijelaskan pada gambar di bawah ini:

Gambar 2.4 Prinsip dasar dari spektrofotometer

Sumber: Gore, Michael, 2000.

Pertama, kollimator (lens) mentransmisikan sorotan cahaya lurus (photons)

yang akan melewati monokromator (prism) untuk memisahkannya menjadi

beberapa komponen panjang gelombang (spectrum). Kemudian selektor panjang

gelombang (split) yang akan melanjutkan transmisi cahaya tersebut dengan

panjang gelombang tertentu. Setelah panjang gelombang cahaya tersebut dapat

melewati sampel di dalam cuvette, fotometer akan mendeteksi jumlah cahaya

yang diabsorbsi dan akan mengirimkan sinyal ke galvanometer atau digital

display.

Jumlah photons yang melewati cuvette dan menuju detektor bergantung

pada panjang cuvette itu sendiri dan konsentrasi dari sampel. Intensitas cahaya

setelah cahaya tersebut melewati cuvette dapat berhubungan dengan transmitans

(T). Transmitans adalah fraksi cahaya yang melewati sampel. Transmitans dapat

dikalkulasikan dengan persamaan:

13

It merupakan intensitas cahaya setelah photons melewati cuvette, sedangkan

Io merupakan intensitas cahaya sebelum photons melewati cuvette17

.

Selain itu, transmitans juga berhubungan dengan absorpsi dan memiliki

persamaan:

Absorbansi merupakan ukuran kuantitatif rasio logaritmik jumlah photons

yang dapat diabsorpsi. Dengan nilai absorbansi dari persamaan tersebut,

konsentrasi sampel yang tidak diketahui itu dapat ditentukan dengan

menggunakan prinsip Beer-Lambert Law seperti di bawah ini:

Gambar 2.5 Transmitans spektofotometer

Sumber: Gore, Michael, 2000

14

Gambar di atas merupakan ilustrasi transmitans cahaya yang melewati

sampel. Panjang dari l dapat digunakan pada Beer-Lambert Law atau yang bisa

disebut Beer’s Law. Menurut Beer’s Law, terdapat hubungan linear antara tingkat

absorbansi dan konsentrasi dari suatu sampel. Namun teori ini hanya dapat

diaplikasikan jika memang terdapat hubungan yang linier. Persamaan Beer’s Law:

A merupakan tingkat absorbansi, ϵ merupakan koefisien molar atau

koefisien absorpsi, sedangkan c merupakan konsentrasi. Koefisien molar

merupakan nilai konstan yang nilainya bervariasi, bergantung pada molekul yang

terkandung. Berikut persamaan linear tersebut16

:

Oleh karena persamaan tersebut, penentuan konsentrasi suatu sampel

memerlukan penentuan absorbansi dan konsentrasi standar yang akan

merumuskan suatu persamaan garis regresi linear standar.

A = ϵ lc

Y = ax + b

15

2.2 Kerangka Teori

Whole blood

Platelet

Trombosit Leukosit Eritrosit

Endogen

Dapat teraktivasi

Perubahan konsentrasi protein

Trombin Kolagen CaCl2

Injury

Eksogen

PRP-1

16

2.3 Kerangka Konsep

Whole blood

Menghasilkan 3 fraksi

Sentrifugasi

Lapisan bawah Lapisan tengah Lapisan atas

Leukosit Eritrosit Plasma&Platelet

Platelet Rich Plasma-1 (PRP-1)

Perbedaan tingkat konsentrasi

Baca di spektrofotometer

Uji biuret

Aktivasi CaCl2 (+) Aktivasi CaCl2 (-)

17

2.4 Definisi Operasional

No

.

Variabel Definisi Pengukur Alat

Ukur Cara Ukur

Skala

Ukur Hasil

1. Tingkat

absorban

si protein

Ukuran untuk

mengetahui

absorbsi

substansi

protein yang

terkandung

dengan cara

mengukur

intensitas

cahaya yang

dapat

melewati

sampel

Peneliti Spekt

ofoto

meter

Sampel

dimasukka

n ke dalam

cuvette,

lalu hasil

absorbansi

bisa

langsung

dibaca di

monitor

spektofoto

meter

setelah

ditentukan

panjang

gelombang

nya

A

(Absor

bansi)

Numerik

2. Inkubasi Upaya untuk

menstabilkan

suhu yang

diinginkan

pada waktu

yang telah

ditentukan

setelah

induksi

Peneliti Inkub

ator

Sampel

dimasukka

n ke dalam

inkubator

selama 1

jam pada

suhu 370C

yang stabil

- Sampel

yang

telah

stabil

18

3. Induksi

CaCl2

Cara untuk

mengetahui

efektivitas

dari CaCl2

pada sampel

Peneliti Mikro

pipet

dan

mikrot

ube

Ambil

270μl

sampel

PRP-1

dengan

menggunak

an

mikropipet

ke dalam

mikrotube

dan

tambahkan

30μl

larutan

CaCl2

μl 300 μl

larutan

sampel

yang

telah

diinduks

i CaCl2

19

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Desain Penelitian

Penelitian ini dilakukan secara eksperimental untuk mengetahui tingkat

konsentrasi Platelet Rich Plasma-1 (PRP-1) yang diinduksi oleh kalsium klorida

(CaCl2).

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Tempat penelitian di Laboratorium Biokimia FKIK UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta pada bulan Agustus 2014-Mei 2015.

3.3 Alat dan Bahan Penelitan

Alat

1. Centrifuge 5417R dengan merek Eppendorf

2. Spektofotometer dengan merek Genesys 20 beserta cuvette

3. Vertex dengan merek Heidolph Rotamax 120

4. Microtube

5. Tabung darah sitrat

6. Mikropipet

7. Tip kuning dan biru

8. Spuit

9. Neraca analitik

10. Tabung reaksi

11. Gelas ukur

12. Rak tabung

20

Bahan

1. Handscoon

2. Kapas alkohol

3. Tissue

4. Ammonium oksalat

5. Alkohol 70%

6. Larutan CaCl2 180μl

7. Bubuk CuSo4 17 gram

8. Bubuk NaOH 5 gram

9. Bubuk Bovine Serum Albumine (BSA) 0,2 gram

3.4 Kriteria Inklusi dan Eksklusi

3.4.1 Kriteria Inklusi

1. Responden dalam keadaan sehat dengan usia minimal 16 tahun.

2. Responden tidak menggunakan obat kortikosteroid dalam 2-3 minggu

sebelumnya.

3. Responden tidak menggunakan obat NSAIDS minimal 1 minggu

sebelumnya.

4. Responden tidak menggunakan obat antikoagulan minimal 5 hari

sebelumnya19

.

3.4.2 Kriteria Eksklusi

1. Memiliki gangguan/penyakit darah kronik (leukemia, gangguan

koagulasi, dan lainnya).

2. Memiliki riwayat infeksi dalam 1 bulan terakhir.

3.5 Besar dan Cara Pengambilan Sampel

Cara penghitungan sampel menggunakan rumus Mead’s Resource Equation

Formula24

, sebagai berikut:

21

E : Error Component (10-20)

N : Jumlah individu percobaan (sampel) dalam semua kelompok (dikurang 1)

B : Blocking Component (dikurang 1) B = 0

T : Jumlah kelompok terapi (dikurang 1)

Jika N = 12 – 22 dan masing-masing dibagi menjadi 2 kelompok, maka

tiap kelompok berjumlah 6 – 11 sampel. Setelah itu ditetapkan sampel terkecil,

yaitu 6 sampel.

Sampel diambil secara simple random sampling dengan jumlah 6 orang

dan dipastikan sesuai kriteria dengan anamnesis (identitas diri dan riwayat

penyakit). Responden yang memenuhi kriteria diminta untuk mengisi lembar

persetujuan informed consent.

E = N- B - T

E = N – 0 – T

≥ 10 = (N-1) – (2-1)

≥ 10 = (N-1) – 1

≥ 11 = N – 1

≥ 12 = N

E = N - 0 – T

≤ 20 = (N-1) – (2-1)

≤ 20 = (N-1) – 1

≤ 21 = N – 1

≤ 22 = N

3.6 Alur Penelitian

3.7 Cara Kerja Penelitian

A. Pembuatan Sediaan NaOH 10% dan CuSO4 0,1%

1. Siapkan NaOH dan CuSO4 bubuk, aquades, neraca analitik, dan botol

kosong

2. Ukur 5 gram NaOH dengan neraca analitik

3. Tambahkan 50 ml aquades

4. Tunggu hingga larut kemudian pindahkan ke botol kosong dan labeli NaOH

10%

5. Ukur 17 gram CuSO4 dengan neraca analitik

6. Tambahkan 100 ml aquades

7. Pindahkan ke botol kosong dan labeli CuSO4 0,1%

B. Pembuatan Standart

1. Siapkan BSA, aquades, tabung reaksi, gelas ukur, sendok, tip biru,

mikropipet, rak tabung, dan neraca analitik

2. Ukur BSA dengan neraca analitik sejumlah 0,2 gram

3. Larutkan dengan 10 ml aquades. Beri label sebagai stock BSA

4. Masukkan 2 ml stock ke dalam tabung reaksi. Beri label Std 1

5. Lakukan dilusi standart sebanyak empat kali sehingga konsentrasi standart

menjadi 0,125% dengan cara mengambil 1 ml stock dan 1 ml aquades, dan

seterusnya

6. Setiap hasil dilusi diberikan label Std 2 hingga Std 5

7. Letakkan di rak tabung

C. Pembuatan Platelet Rich Plasma-1 (PRP-1)

1. Siapkan alat dan bahan

2. Ambil darah vena sampel sebanyak 3ml ke dalam tabung darah

3. Bagi menjadi 2 tube dengan masing-masing 1,5ml sampel darah. Tandai

tube dengan simbol ‘A’ dan ‘B‘

24

4. Sentrifugasi keduanya dengan kecepatan 1.800rpm, 5 menit, dan 180C

5. Ambil 0,5-1ml lapisan paling atas dari keduanya dengan menggunakan

mikropipet, lalu masukkan ke tube dengan nama ‘(+)’ untuk kontrol positif,

dan ‘(-)’ untuk kontrol negatif

6. Ambil 270μl dari tube (+) ke tube lainnya, dan tambahkan 30μl CaCl2.

Namakan tube ‘CaCl2 (+)’

7. Homogenkan dengan alat vortex

8. Ambil 300μl dari tube (-) ke tube lainnya. Beri nama tube ‘CaCl2 (-)’

9. Inkubasi kontrol (+) dan kontrol (-) selama 1 jam dalam suhu ruangan 370C

ke dalam inkubator

D. Uji Biuret

1. Ambil 100μl masing-masing kontrol, masukkan ke tabung reaksi

2. Tambahkan 7 tetes NaOH 10% pada tabung reaksi CaCl2 (+) maupun (-),

lalu homogenkan dengan alat vortex

3. Tambahkan 7 tetes CuSO4 0,1% pada kedua kontrol sampai terlihat warna

ungu lembayung, lalu homogenkan dengan alat vortex

4. Letakkan di rak tabung

5. Lakukan hal yang sama pada larutan Standar 1-5

E. Pembacaan Absorbansi protein

1. Siapkan alat spektrofotometer, cuvette, aquades, dan tissue

2. Masukkan nilai panjang gelombangnya menjadi 540λ

3. Baca nilai blanko (aquades), lalu dikalibrasikan menjadi 0

4. Baca nilai absorbansi protein kelima Standar dengan mencuci cuvette

dengan aquades secara bergantian

5. Catat nilai Standard dan olah data Standar

6. Baca nilai absorbansi protein keenam sampel dengan mencuci cuvette

dengan aquades secara bergantian, catat hasil

7. Olah data Standar maupun sampel

25

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Karakteristik Responden

Responden berjumlah 6 orang, terdiri dari 2 orang laki-laki dan 4 orang

perempuan dengan rerata usia 21 tahun. Data responden dalam penelitian ini

tersaji dalam tabel 4.1.

Tabel 4.1 Data responden sampel penelitian

Sampel Jenis Kelamin (L/P) Usia

1 L 23 tahun

2 P 20 tahun

3 P 21 tahun

4 P 20 tahun

5 P 21 tahun

6 L 19 tahun

Keenam responden telah memenuhi kriteria inklusi dan menyetujui menjadi

responden dalam form informed consent yang ada di lampiran 1.

4.2 Penentuan Kadar Protein

Penentuan kadar protein pada penelitian kali ini menggunakan analisis

kuantitatif untuk menentukan konsentrasi protein pada sampel. Analisis kuantitatif

ini menggunakan alat spektrofotometer yang mampu mendispersikan dan

menghasilkan cahaya dengan menghasilkan range panjang gelombang cahaya.

26

Seperti yang telah dijelaskan di tinjauan pustaka, nilai absorbansi merupakan

jumlah photons (cahaya) yang dapat diabsorpsi. Sedangkan untuk mencari nilai

konsentrasinya memerlukan rumus dari standar yang telah ditentukan.

4.3 Penentuan Absorbansi Larutan Standar Protein

Setelah panjang gelombang maksimum ditentukan (540λ), maka selanjutnya

menentukan absorbansi larutan standar yang telah dibuat untuk menentukan

persamaan garis regresi linear standar. Data yang diperoleh ialah sebagai berikut:

Tabel 4.2 Absorbansi larutan standar

4.4 Penentuan Persamaan Garis Regresi Linear Standar

Analisis regresi (regression analysis) merupakan cara untuk membentuk

persamaan dan menggunakan persamaan tersebut sebagai perkiraan atau prediksi.

Analisis regresi diperlukan untuk mendapatkan hubungan fungsional antara dua

variabel atau lebih. Hubungan fungsional antara satu variabel prediktor dengan

satu variabel kriteriumnya, seperti pada penelitian ini, disebut analisis regresi

sederhana (tunggal). Penentukan persamaan garis regresi linear standar dapat

menggunakan rumus:

NO. DILUSI STANDAR ABSORBANSI

1 0.125 0.112

2 0.25 0.111

3 0.5 0.119

4 1 0.13

5 2 0.153

Y = ax + b

27

Y = variabel tak bebas (dependent variable)

a = kemiringan kurva linier (slope)

x = variabel bebas (independent variable)

b = titik potong kurva terhadap sumbu Y (intercept)

Setelah memasukkan data absorbansi larutan standar ke dalam kurva dan

diolah dengan rumus tersebut, maka penentuan kurva standar yang diperoleh,

yaitu:

Gambar 4.2 Kurva standar protein

Dari pengolahan kurva standar protein tersebut dapat disimpulkan bahwa

persamaan garis regresi linear standar :

Penentuan signifikansi korelasi X terhadap Y dapat dilihat melalui hasil

yang mendekati angka +1, yang artinya terdapat korelasi positif. Adapun hasil

signifikansi standar tersebut ialah:

y = 0.0227x + 0.1074 R² = 0.9938

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0 0.5 1 1.5 2 2.5

Ab

sorb

an

si

Dilusi Standar

Y = 0,0227x + 0,1074

28

Hasilnya mendekati angka 1 atau dapat di interpretasikan sebagai korelasi

positif. Korelasi positif bermakna apabila terdapat perubahan pada variabel yang

satu, maka akan diikuti dengan perubahan variabel lain dengan arah yang sama

atau berbanding lurus.

4.5 Penentuan Absorbansi Larutan Sampel

Penentuan absorbansi larutan sampel diperoleh dengan menggunakan

larutan sampel PRP-1, baik kontrol positif maupun negatif. Larutan tersebut

dibaca absorbansinya melalui alat spektrofotometer dengan panjang gelombang

540λ (sama seperti penilaian absorbansi pada larutan standar). Data absobansi

larutan sampel disajikan pada tabel 4.3 berikut.

Tabel 4.3 Absorbansi larutan sampel

Responden PRP 1 ABSORBANSI

Ca (-)

Sampel 1 0.144 0.139

Sampel 2 0.134 0.118

Sampel 3 0.139 0.103

Sampel 4 0.137 0.119

Sampel 5 0.119 0.107

Sampel 6 0.132 0.082

Rata-Rata 0.134 0.111

4.6 Penentuan Konsentrasi Sampel

Berdasarkan data absorbansi larutan sampel yang telah dituliskan pada tabel

4.3, maka konsentrasi sampel dapat ditentukan dengan memasukkan data

absorbansi tersebut ke dalam persamaan garis regresi linear larutan standarnya.

R2 = 0,99378

29

Jika persamaan garis regresi linearnya adalah :

y = 0,0227x + 0,1074

dan y = absorbansi sampel

maka, x = y-b

a

Contoh perhitungan pada sampel 1 Ca:

x = 0,144 – 0,1074

0,0227

x = 1,61233

Setelah semua data dihitung menggunakan persamaan garis regresi linear di

atas, maka hasil dari konsentrasi sampel disajikan pada tabel 4.4 berikut.

Tabel 4.4 Konsentrasi protein larutan sampel

Responden PRP 1 KONSENTRASI

Ca (-)

Sampel 1 1.61233 1.39207

Sampel 2 1.17181 0.46696

Sampel 3 1.39207 0.19383

Sampel 4 1.30396 0.51101

Sampel 5 0.51101 0.02643

Sampel 6 1.0837 0.20264

Rata-Rata 1.17915 0.46549

Hasil penelitian ini telah berhasil membuktikan hipotesis di awal mengenai

konsentrasi protein pada PRP-1 yang diinduksi kalsium klorida (CaCl2). Hasilnya

menunjukkan bahwa nilai rerata konsentrasi protein pada PRP-1 yang diinduksi

kalsium klorida (CaCl2) mengalami peningkatan (1,17915) bila dibandingkan

dengan rerata konsentrasi protein kontrol negatifnya (0,46549). Peningkatan

konsentrasi protein ini merupakan salah satu indikasi bahwa di dalamnya terdapat

peningkatan kadar growth factors dalam proses recovery cells21

.

30

Grafik 4.1 Perbandingan PRP-2 yang teraktivasi

dengan konsentrasi growth factor di dalamnya

Sumber : Amable PR et al, 2013

Pada penelitian Amable et al (2013) dikatakan bahwa tingkat konsentrasi

growth factors pada PRP-2 yang diaktivasi oleh kalsium klorida (CaCl2) lebih

tinggi jika dibandingkan dengan PRP-2 yang diaktivasi oleh trombin, atau

kombinasi keduanya1. Hasil penelitian Amable et al tersebut semakin menguatkan

hipotesis penelitian di awal mengenai efektivitas kalsium klorida (CaCl2) terhadap

Platelet Rich Plasma (PRP). Hasil penelitian ini dapat menyatakan bahwa tidak

hanya PRP-2 saja yang dapat mengalami peningkatan kadar growth factors nya,

tetapi kini terbukti bahwa PRP-1 pun jika diaktivasikan dengan kalsium klorida

(CaCl2) maka akan terjadi peningkatan konsentrasi protein di dalamnya.

31

Grafik tingkat konsentrasi protein pada PRP-1 yang diinduksi kalsium

klorida (CaCl2) dan kontrolnya dapat dilihat di bawah ini:

Grafik 4.2 Perbandingan konsentrasi protein pada kedua kontrol

Berdasarkan grafik tersebut, rerata perbedaan tingkat konsentrasi protein

antara PRP-1 yang diinduksi kalsium klorida (CaCl2) dan kontrolnya ialah

0,02283. Perbedaan tingkat konsentrasi protein keduanya yang tidak terlalu jauh

ini (bila dibandingkan dengan jurnal rujukan) kemungkinan dikarenakan

kesalahan dalam pengambilan sampel PRP-1, perbedaan tipe alat sentrifugasi

yang digunakan, alat spektrofotometer yang belum pernah dikalibrasikan, dan

perbedaan letak geografis darah sampel jika dibandingkan dengan sampel jurnal

rujukan. Namun setelah di uji statistik dengan SPSS, hasil p value dari perbedaan

konsentrasi antara kontrol positif dan kontrol negatif tersebut ialah 0,001, yang

menandakan nilai tersebut cukup bermakna (p < 0,005).

Dalam mekanisme kerja PRP, platelet mengeluarkan banyak alpha granules

setelah proses koagulasi pada lokasi cedera. Alpha granules tersebut mengandung

berbagai macam growth factors yang dimana akan meningkatkan proliferasi dan

kemotaksisnya pada sel-sel yang berbeda25

. Hal ini makin menegaskan jika

dengan menginduksikan CaCl2 pada PRP dapat meningkatkan kerja alpha

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

1 2 3 4 5 6

Ko

nse

ntr

asi

Pro

tein

Sampel

(+) CaCl2

(-)

32

granules dalam menghasilkan growth factors, seperti platelet-derived growth

factor (PDGF), transforming growth-factor beta (TGF-b), vascular endothelial

growth factors (VEGF), insulin-like growth factor (IGF), epidermal growth factor

(EGF), dan epithelial cell growth factor (ECGF). Pengaruh utama PRP ialah

diperoleh dari PDGF yang telah diidentifikasi sebagai protein penting dalam hard

and soft-tissue healing26

.

Terlepas dari efektivitas PRP sebagai terapi penyembuhan, menurut

Sundman et al (2011) disebutkan bahwa adanya sedikit leukosit pada PRP-1

sebaiknya dipikirkan kembali karena akan berpengaruh pada pro-inflammatory

cytokines. Hasil penelitiannya menyimpulkan bahwa secara in vitro leukosit akan

meningkatkan katabolik PRP, dimana proses katabolik tersebut dan konsentrasi

sitokin di dalamnya sudah terbukti berhubungan dengan konsentrasi leukosit.

Akan tetapi, belum ada bukti secara in vivo mengenai hubungan antara jumlah

leukosit dengan efek klinisnya13, 22

. Untuk mengurangi resiko leukosit, variasi

kecepatan dan waktu sentrifugasi, serta pemakaian Arthrex ACP kit dapat

membantu mengurangi keberadaan leukosit pada PRP1, 13

.

33

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa terdapat peningkatan konsentrasi

protein pada Platelet Rich Plasma-1 (PRP-1) yang diinduksi kalsium

klorida (CaCl2).

2. Tingkat konsentrasi protein Platelet Rich Plasma-1 (PRP-1) yang diinduksi

kalsium klorida (CaCl2) memiliki nilai lebih tinggi (1,17915) dibandingkan

dengan kontrol negatifnya (0,46549).

3. Protokol pembuatan Platelet Rich Plasma-1 (PRP-1) yang diinduksi

kalsium klorida (CaCl2) telah tersusun untuk mendapatkan hasil yang

optimal (lampiran 2).

5.2 Saran

1. Dibutuhkan penelitian lebih lanjut mengenai perbandingan efektifitas

kalsium klorida pada PRP-1 dan PRP-2 sebagai tata laksana medis yang

optimal.

2. Dibutuhkan penelitian lebih lanjut mengenai jenis protein yang terkandung

dalam PRP-1.

3. Dibutuhkan penelitian lebih lanjut mengenai pengaruh adanya leukosit dan

sitokin pada PRP-1.

34

DAFTAR PUSTAKA

1. Amable PR et al. Platelet-rich plasma preparation for regenerative

medicine: optimization and quantification of cytokines and growth factors.

Stem Cell Res. 2013: p. 1-13.

2. Cassie D. Platelets. Departement of Biostatistic & Epidemiology College

of Public Health OUHSC. 2011.

3. Ferrari M, et al. A new technique for hemodilution, preparation of

autologous platelet-rich plasma, and intraoperative blood salvage in

cardiac surgery. Int J Artif Organs. 1987 Jan: p. 47-50.

4. Mueller TD, et al. Biochim biophys acts. 2002: p. 237-50.

5. Mazzucco L, Balbo V, Cattana E, Guaschino R, Borzini P. Not every

PRP-gel is born equal. Evaluation of growth factor availability for tissues

through four PRP-gel preparations: Fibrinet, RegenPRP-kit, Plateltex, and

one manual procedure. Vox Sang; 2009. p. 110-18.

6. Hoffbrand AV, Moss PAH. Kapita Selekta Hematologi, edisi 6. EGC;

2013. p. 294-304.

7. Graziani, et al. The in vitro effect of different PRP concentration on

osteoblasts and fibroblasts. Clin Oral Implants Res. 2006 Apr 17: p. 212.

8. Smith C, et al. The inflammatory response to skeletal muscle injury:

illuminating complexities. Am J Sports Med. 2008: p. 947.

9. Tidball JG, Wehling HM. Machropages promote muscle membrane repair

and muscle fibre growth and regeneration during modified muscle loading

in mice in vivo. J Physiol. 2007 Jan 1: p. 327.

10. Dohan et al. Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich

plasma (P-PRP) to leucoyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends in

Biotechnology. 2009: p. 158-167.

11. Scott A, Khan KM, Roberts CR, et al. What Do We Mean by the Term

Inflammation?. Br J Sports Med, vol. 38 no. 3. 2004: p. 372-380.

12. Toumi H & Best TM. The Inflammatory Response: Friend or Enemy for

Muscle Injury. Br J Sports Med, vol. 37 no. 4. 2003: p. 284-286.

35

13. Sundman EA, Cole BJ, & Fartier LA. Growth Factor and Catabolic

Cytokine Concentrations are Influenced by the Cellular Composition of

Platelet Rich Plasma. Am J Sports Med, vol. 39 no. 10. 2011: p. 2135-

2140.

14. Han B, Woodell-May J, Ponticiello M, Yang Z, Nimm M. The Effect of

Thrombin Activation of Platelet Rich Plasma on Demineralized Bone

Matrix Osteoinductivity. J Bone Joint Surg Am 2009: p. 1459-1470.

15. Atkins, et al. Physical Chemistry for the Life Sciences. New York: Oxford

University Press, 2006.

16. Gore, Michael. Spectrophotometry & Spectrofluorimetry. New York:

Oxford University Press; 2000.

17. Bradford, MM. A Rapid and Sensitive for the Quantitation of Microgram

Quantitites of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye

Binding. Analytical Biochemistry 2006: p. 248-254.

18. Foster TE, Puskas BL, Mandelbaum BR, Gerhardt MB, & Rodeo SA.

Platelet Rich Plasma: From Basic Science to Clinical Applications. Am J

Sports Med 2009: p. 2259-2272.

19. Santos F, Martinez MD. Practical Guidelines for Using PRP in the

Orthopaedic Office, American Academy of Orthopaedic Surgeons. US:

2010.

20. Poedjadi A. Biokimia. Jakarta: UI-Press; 2005.

21. El-Sharkawy H, Kantarci A, et al. Platelet-Rich Plasma: Growth Factors

and Pro- and Anti-Inflammatory Properties. J Periodontal 2007: p. 661-

669.

22. McCarrel TM, Minas T, Fortier LA. Optimization of Leukocyte

Concentration in Platelet-Rich Plasma for the Treatment of Tendinopathy.

J Bone Joint Surg Am 2012: p. 1–8.

23. Sherwood, Lauralee. Fisiologi Manusia: Dari Sel ke Sistem. Jakarta: EGC;

2012.

24. Mead R. The Design of Experiments. New York: Cambridge University

Press 1988: p. 620.

36

25. Nikolidakis D, Jansen JA. The Biology of Platelet-Rich Plasma and It’s

Application in Oral Surgery: Literature Review. Tissue Engineering Part

B 2008: p. 249-258.

26. Yang D, Cheng J, Jing Z, Jin D. Platelet-Derived Growth Factor (PDGF)-

AA: A Self-Imposed Cytokine in the Proliferation of Human Fetal

Osteoblasts. Cytokine 2000. P.1271-1274.

27. Murray RK et al. Harper’s Illustrated Biochemistry 26 edition. USA:

McGraw-Hill Companies Inc; 2003.

37

Lampiran 1

Lembar Informed Consent

Formulir Informed Consent

TINGKAT KONSENTRASI PROTEIN PADA PLATELET RICH PLASMA-1

(PRP-1) YANG DIINDUKSI KALSIUM KLORIDA

Setelah memperoleh kejelasan mengenai tujuan, manfaat, prosedur dan

kemungkinan resiko, serta jawaban atas pertanyaan yang diberikan oleh peneliti

dalam penelitian TINGKAT KONSENTRASI PROTEIN PADA PLATELET

RICH PLASMA-1 (PRP-1) YANG DIINDUKSI KALSIUM KLORIDA, maka

saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama :

Alamat :

Jurusan :

Semester :

Dengan ini menyatakan dengan penuh kesadaran bersedia berpartisipasi dalam

penelitian tersebut dan bersedia diambil darah vena sebanyak 3 ml sesuai dengan

prosedur yang telah ditetapkan dalam penelitian TINGKAT KONSENTRASI

PROTEIN PADA PLATELET RICH PLASMA-1 (PRP-1) YANG DIINDUKSI

KALSIUM KLORIDA. Selanjutnya, bila suatu ketika, dalam masa penelitian,

saya merasa dirugikan karena penelitian ini, saya berhak mengundurkan diri dari

keterlibatan saya, serta membatalkan persetujuan ini, tanpa sanksi apapun dan dari

pihak manapun.

Jakarta, …………….. 2015

Responden Peneliti

(Yang membuat pernyataan) (Sarah Attauhidah)

38

Lampiran 2

Protokol Pembuatan Platelet Rich Plasma-1 yang Diinduksi Kalsium Klorida

Mengambil darah vena sampel

sebanyak 3 ml

Memasukkannya ke

tabung darah sitrat

Membagi darah sampel

menjadi 2 (masing-

masing 1,5ml ke tube)

Sentrifugasi tube dengan

kecepatan 1.800rpm, 5

menit, dan 180C

Ambil 0,5-1ml lapisan paling

atas (PRP-1) dari keduanya

dengan menggunakan

mikropipet

Ambil 270μl PRP-1 dari tube 1

ke tube lainnya, tambahkan

30μl larutan CaCl2.

Inkubasi tube ke inkubator dengan

suhu 370C selama 1 jam

39

Lampiran 3

Surat Permohonan Ethical Approval Penelitian

40

Lampiran 4

Dokumentasi Penelitian

1. Persiapan

pengambilan darah

sampel dengan spuit 3cc,

tourniquet, handscoon,

dan kapas alkohol.

2. Sampel darah vena 3cc sampel

dimasukkan ke tabung darah

sitrat supaya darah tidak

menggumpal.

3. Sampel darah mulai dimasukkan ke

microtube dengan menggunakan mikropipet

sebelum disentrifugasi.

41

4. Sampel disentrifugasi dengan

alat Centrifuge 5417R merek

Eppendorf.

6. Pembuatan Standar dengan

menggunakan Bovine Serum

Albumin (BSA)

5. PRP-1 yang telah diinduksi CaCl2 diinkubasi

selama 1 jam dalam suhu 370C.

42

8. Kelima standar yang sudah di uji biuret segera di

homogenkan dengan menggunakan alat vortex sehingga

menghasilkan warna ungu lembayung.

9. Standar dan sampel PRP-1 yang diinduksi kalsium klorida

dan kontrol negatifnya dibaca absorbansi proteinnya dengan

menggunakan alat spektrofotometer.

7. Pembuatan larutan

NaOH 10% dan CuSO4

0,1% sebagai bahan

utama uji biuret

43

Lampiran 5

Riwayat Peneliti

DAFTAR RIWAYAT HIDUP

Nama : Sarah Attauhidah

Usia : 21 tahun

Tempat, Tanggal Lahir : Jakarta, 3 Desember 1993

Alamat : Jalan Baung IV No.43 RT/RW 05/02, Kebagusan,

Pasar Minggu, Jakarta Selatan 12520

No. Hp : 081282920461

Email : Sarasattau@gmail.com

Riwayat Pendidikan :

1. SDIT Al-Ihsan Jakarta 2000-2006

2. SMPN 41 Jakarta 2006-2009

3. SMAN 49 Jakarta 2009-2012

4. PSPD FKIK UIN Jakarta 2012-sekarang