thuc pham chuc nang

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA KĨ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BKTP HCM

ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT VÀ CHẾ BIẾN

THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

GVHD : TS. Nguyễn Thúy Hương SVTH : Vũ Thị Ngọc An - MSSV: 60600031 Nguyễn Kiều Oanh - MSSV: 60601729 Nguyễn Thị Minh Tâm - MSSV: 60602122

TP. Hồ Chí Minh, tháng 06/2010

http://www.ebook.edu.vn - i -

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt 4 năm học tại trường Đại học Bách Khoa, ngành Công nghệ sinh học,

chúng em đã được trang bị một hành trang vào đời quý báu và một kiến thức chuyên

ngành mà chúng em yêu thích. Đồ án chuyên ngành này là thành quả làm việc nghiêm túc

của từng cá nhân trong nhóm thực hiện suốt một học kì, bước đầu định hướng cho Luận

văn tốt nghiệp, với đề tài : “Công nghệ sinh học ứng dụng trong sản xuất và chế biến thực

phẩm chức năng”.

Để hoàn thành tốt đồ án, ngoài công sức làm việc của mỗi cá nhân trong nhóm

không thể không kể đến công lao to lớn của các thầy cô đã luôn theo sát chúng em. Chúng

em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Quý thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học, đặc

biệt là cô Nguyễn Thúy Hương đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn chúng em trong suốt

thời gian thực hiện đồ án.

Mặc dù chúng em đã cố gắng hết sức nhưng đồ án chắc chắn không thể tránh khỏi

những thiếu sót, rất mong sự chỉ bảo góp ý từ Quý thầy cô và ý kiến xây dựng từ các bạn

để đồ án được hoàn thiện hơn nữa.

TP. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 06 năm 2010

Nhóm SVTH: VŨ THỊ NGỌC AN

NGUYỄN KIỀU OANH

NGUYỄN THỊ MINH TÂM

http://www.ebook.edu.vn - ii -

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................................ i

MỤC LỤC ............................................................................................................................ ii

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................... ix

DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................... xiii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................... xviii

LỜI NÓI ĐẦU ................................................................................................................... xix

PHẦN 1. TỔNG QUAN VỀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ........................................... 1

CHƯƠNG 1. KHÁI NIỆM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ............................................. 2

1.1. Khái niệm thực phẩm chức năng ....................................................................... 2

1.2. Phân biệt thực phẩm chức năng với một số thực phẩm khác .............................. 4

1.2.1 Thực phẩm thông thường (Ordinary food ingredients) ................................ 4

1.2.2 Thực phẩm chức năng (Functional Foods) ................................................... 4

1.2.3 Thực phẩm thuốc (Medical Foods) ............................................................... 4

1.2.4 Thuốc và dược liệu (Drug) ........................................................................... 5

1.3. Lịch sử nghiên cứu thực phẩm chức năng trong nước và trên thế giới ............... 6

1.3.1. Trên thế giới .................................................................................................. 6

1.3.2. Tình hình sử dụng thực phẩm chức năng ở Việt Nam .................................. 6

CHƯƠNG 2. PHÂN LOẠI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG - VAI TRÒ SINH HỌC ...... 8

2.1. Phân loại thực phẩm chức năng ........................................................................... 8

2.1.1. Các chất xơ chức năng trong dinh dưỡng ..................................................... 8

2.1.2. Các loại đường đa phân tử chức năng (Oligosaccharides) ........................... 9

http://www.ebook.edu.vn - iii -

2.1.3. Acid amin, peptide và protein chức năng ..................................................... 9

2.1.4. Vitamin và khoáng chất ................................................................................ 9

2.1.5. Vi khuẩn sinh acid lactic, acid butyric ........................................................ 10

2.1.6. Acid béo chưa no ........................................................................................ 10

2.1.7. Các loại sắc tố thực vật ............................................................................... 11

2.2. Phân loại dựa theo nguyên liệu thực phẩm chức năng ...................................... 11

2.2.1. Thực phẩm chức năng có nguồn gốc thực vật ............................................ 11

2.2.2. Thực phẩm chức năng có nguồn gốc động vật ........................................... 13

2.3. Vai trò sinh học của một số loại thực phẩm chức năng tới sức khỏe ................ 16

2.3.1. Thực phẩm chức năng nguồn gốc thực vật ................................................. 16

2.3.2. Thực phẩm chức năng từ nguồn nguyên liệu sinh vật biển và động vật .... 22

2.3.3. Thực phẩm chức năng từ nguồn nguyên liệu nấm ...................................... 27

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP LÀM GIÀU CÁC CHẤT DINH DƯỠNG CHỨC

NĂNG ............................................................................................................................. 33

3.1. Chọn giống cây trồng vật nuôi giàu chất dinh dưỡng chức năng ...................... 33

3.2. Làm giàu chất dinh dưỡng thông qua con đường chế biến thực phẩm ............. 34

3.3. Làm giàu chất dinh dưỡng thông qua kĩ thuật, chăn nuôi ................................. 35

CHƯƠNG 4. NHỮNG QUY ĐỊNH CHUNG VỀ QUẢN LÝ THỰC PHẨM CHỨC

NĂNG TRÊN THỊ TRƯỜNG ........................................................................................ 36

4.1. Qui định về sự công nhận tác dụng các chất dinh dưỡng chức năng ................ 36

4.1.1. Quản lý tiêu chuẩn về mặt khoa học các chất dinh dưỡng chức năng ........ 36

4.1.2. Yêu cầu chấp nhận của cơ quan quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm và

dược phẩm trước khi đưa ra thị trường tiêu thụ ...................................................... 37

4.2. Qui định về tên gọi và dán nhãn, lưu hành trên thị trường ................................ 37

4.1.1. Mục tiêu của dán nhãn thực phẩm thông thường và TPCN ....................... 37

http://www.ebook.edu.vn - iv -

4.1.2. Cơ quan quản lý dán nhãn thực phẩm ........................................................ 37

PHẦN 2. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN TRONG SẢN XUẤT THỰC

PHẨM CHỨC NĂNG ...................................................................................................... 39

CHƯƠNG 1.THÀNH TỰU PHÁT TRIỂN CỦA THỰC PHẨM CHUYỂN GEN ...... 40

1.1. Tình hình phát triển của thực phẩm chuyển gen trên thế giới và ở Việt Nam ..... 40

1.1.1. Trên thế giới .................................................................................................. 40

1.1.2. Tình hình phát triển thực phẩm chuyển gen ở Việt Nam .............................. 47

1.2. Những đặc tính mới của sinh vật chuyển gen được dùng trong thực phẩm chức

năng ............................................................................................................................. 48

1.2.1. Thực vật ......................................................................................................... 48

1.2.2. Động vật ........................................................................................................ 51

CHƯƠNG 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN .................................................. 57

2. 1.Thực vật................................................................................................................ 57

2. 1.1. Phương pháp chung ...................................................................................... 57

2.1.2. Kỹ thuật cơ bản ............................................................................................. 58

2.2. Động vật ............................................................................................................... 71

2.2.1. Nguyên tắc ..................................................................................................... 71

2.2.2. Các phương pháp ........................................................................................... 76

CHƯƠNG 3. TĂNG CƯỜNG FOLATE TRONG CÁC LOẠI CÂY THỰC PHẨM .. 81

3.1. Folate .................................................................................................................... 82

3.1.1. Giới thiệu về folate ........................................................................................ 82

3.1.2. Các dạng của folate ....................................................................................... 83

3.1.3. Sự thiếu hụt folate và sức khỏe ..................................................................... 84

3.1.4. Nhu cầu folate ............................................................................................... 85

http://www.ebook.edu.vn - v -

3.2. Cà chua tăng cường folate thế hệ 1 ...................................................................... 86

3.2.1. Nguyên lý ...................................................................................................... 86

3.2.2. Vật liệu và phương pháp ............................................................................... 88

3.2.3. Kết quả ........................................................................................................... 92

3.2.4. Bàn luận ....................................................................................................... 100

3.3. Cà chua tăng cường folate thế hệ 2 .................................................................... 102

3.3.1. Vật liệu và phương pháp ............................................................................. 102

3.3.2. Kết quả ......................................................................................................... 103

3.4. Gạo tăng cường folate ........................................................................................ 105

3.4.1. Vật liệu và phương pháp ............................................................................. 105

3.4.2. Kết quả ......................................................................................................... 106

3.5. Những thành tựu và hướng phát triển ................................................................ 112

3.5.1. Thành tựu ..................................................................................................... 112

3.5.2. Hướng phát triển .......................................................................................... 114

3.6. Kết luận về các loại cây trồng chuyển gen được làm giàu folate ...................... 117

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VỀ CÁC LOẠI CÂY CHUYỂN GEN GIÀU CHẤT DINH

DƯỠNG CHỨC NĂNG ............................................................................................... 118

PHẦN 3. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ VI SINH TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM

CHỨC NĂNG ................................................................................................................. 120

CHƯƠNG 1. TẢO SPIRULINA ................................................................................... 121

1.1. Giới thiệu chung .............................................................................................. 121

1.2. Tổng quan về tảo Spirulina ............................................................................. 123

1.2.1. Lịch sử phát hiện ....................................................................................... 123

1.2.2. Phân loại ................................................................................................... 123

1.2.3. Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina ........................................................ 123

http://www.ebook.edu.vn - vi -

1.2.4. Thành phần hóa học của Spirulina ........................................................... 126

1.2.5. Tình hình nuôi trồng và phát triển Spirulina ............................................ 129

1.2.6. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng Spirulina ........................................... 130

1.2.7. Công nghệ nuôi trồng tảo Spirulina .......................................................... 136

1.2.8. Các phương pháp phá vỡ tế bào S.platensis ............................................. 140

1.3. Nghiên cứu tình huống .................................................................................... 142

1.3.1. Nghiên cứu xử lý tảo Spirulina ................................................................. 142

1.3.2. Nghiên cứu chiết suất các hợp chất chống oxy hóa từ S.platensis ........... 154

1.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của sinh khối Spirulina platensis lên hệ vi khuẩn

của sữa lên men ABT trong suốt thời gian bảo quản ............................................ 167

1.4. Giới thiệu một số sản phẩm Spirulina hiện nay .............................................. 180

1.5. Kết luận ............................................................................................................ 182

CHƯƠNG 2. FRUCTOOLIGOSACCHARIDE (FOS) ............................................... 184

2.1. Tổng quan về FOS ........................................................................................... 184

2.1.1. Khái niệm FOS ......................................................................................... 184

2.1.2. Nguồn gốc FOS – Cấu tạo ........................................................................ 185

2.1.3. Tính chất của FOS: ................................................................................... 189

2.1.4. Ảnh hưởng của FOS lên cơ thể và sức khỏe con người ........................... 191

2.1.5. Tính an toàn và ứng dụng của FOS .......................................................... 195

2.1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất FOS trên thế giới ................................ 197

2.1.7. Giới thiệu các enzyme trong sản xuất FOS .............................................. 204

2.1.8. Tiềm năng cho sản xuất FOS tại Việt Nam .............................................. 209

2.2. Thu nhận và tinh sạch enzyme β-fructofuranosidase từ chủng nấm mốc

Aspergillus niger IMI303386 .................................................................................... 211

2.2.1. Tóm tắt nghiên cứu ................................................................................... 211

2.2.2. Nguyên liệu và phương pháp .................................................................... 211

http://www.ebook.edu.vn - vii -

2.2.3. Kết quả và bàn luận .................................................................................. 215

2.3. Lên men tái sử dụng nhiều chu kì chủng Aspergillus oryzae CFR 202 thu nhận

enzyme fructosyltransferase và ứng dụng sản xuất đường FOS ............................... 222




2.4. Cố định tế bào nấm mốc Aspergillus japonicus vào chất mang gluten và ứng

dụng sản xuất đường fructooligosaccharide ............................................................. 226



2.4.3. Kết quả ...................................................................................................... 228

2.5. Sản xuất FOS cao độ từ sucrose sử dụng hệ enzyme β-fructofuranosidase và

glucose oxidase ......................................................................................................... 233




2.6. Ứng dụng công nghệ enzyme để thu nhận đường chức năng FOS từ dịch mía ở

Việt Nam ................................................................................................................... 244


2.6.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ........................................................ 244

2.6.3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận: ............................................................. 245

2.7. Nghiên cứu sử dụng đường FOS trong sản xuất một số thực phẩm chức năng ở

Việt Nam ................................................................................................................... 252

2.7.1. Sản xuất bột dinh dưỡng trẻ em ................................................................ 252

2.7.2. Sản xuất bánh bích quy ............................................................................. 254

http://www.ebook.edu.vn - viii -

2.7.3. Sản xuất kẹo .............................................................................................. 257

2.8. Kết luận chung về sản xuất FOS và ứng dụng cho đến nay ............................ 259

KẾT LUẬN CHUNG ĐỀ TÀI ....................................................................................... 261

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 262

http://www.ebook.edu.vn - ix -

DANH MỤC BẢNG

PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Bảng 1.1: Phạm trù giữa thực phẩm và thuốc ...................................................................... 5

Bảng 2.1: Hệ thống phân loại FOSHU ............................................................................... 15

Bảng 2.2: Hàm lượng lycopene trong một số sản phẩm cà chua ....................................... 19

Bảng 2.3: Khả năng ức chế các gốc tự do của các hợp chất trong trà xanh ....................... 21

PHẦN 2: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN TRONG SẢN XUẤT THỰC

PHẨM CHỨC NĂNG

Bảng 1.1: Diện tích cây trồng CNSH năm 2007 trên thế giới ............................................ 41

Bảng 1.2: Trang trại nuôi giống động vật sản xuất protein dược phẩm ............................. 51

Bảng 1.3: Những protein có tác dụng chữa bệnh trong sữa được sản xuất ra bởi thú cho

sữa chuyển gen ................................................................................................................... 53

Bảng 1.4 : Một vài thông số liên quan đến việc tiết sữa ở động vật có vú......................... 53

Bảng 1.5 : Ước tính sản lượng protein sinh phẩm trong sữa và qui mô đàn thú chuyển gen

trên thế giới ......................................................................................................................... 54

Bảng 1.6: Một số thay đổi các thành phần của sữa được đề xuất ...................................... 56

Bảng 2.1: Các phương pháp chuyển gen không sử dụng các yếu tố virus ......................... 77

Bảng 3.1: Những cây lương thực có folate ......................................................................... 83

Bảng 3.2: Nhu cầu folate đề nghị cho trẻ em và người lớn ................................................ 85

http://www.ebook.edu.vn - x -

PHẦN 3: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ VI SINH TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM

CHỨC NĂNG

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của Spirulina .................................................................. 126

Bảng 1.2: Thành phần vitamin của Spirulina ................................................................... 127

Bảng 1.3: Thành phần khoáng của tảo Spirulina ............................................................. 127

Bảng 1.4: Thành phần acid amin của tảo Spirulina ......................................................... 128

Bảng 1.5: Các chất màu trong Spirulina .......................................................................... 128

Bảng 1.6: Các loại thực phẩm được chế biến từ tảo Spirulina ......................................... 131

Bảng 1.7: Môi trường cơ bản( môi trường Zarrouk) ........................................................ 137

Bảng 1.8: Môi trường bổ sung 1 ....................................................................................... 138

Bảng 1.9: Môi trường bổ sung 2 ....................................................................................... 138

Bảng 1.10: So sánh mẫu thử nghiệm từ 1 đến 10 với mẫu chuẩn .................................... 151

Bảng 1.11: Các mẫu so sánh không bổ sung đường được so sánh với mẫu chuẩn .......... 152

Bảng1.12: So sánh hàm lượng phycocyanin giữa các mẫu .............................................. 153

Bảng 1.13: Mức độ mã hóa thử nghiệm của các yếu tố dùng trong thiết kế Box-Behnken

.......................................................................................................................................... 160

Bảng 1.14: Ma trận thiết kế bởi Box-Behnken cùng với thí nghiệm và dự đoán giá trị hiệu

suất của dịch chiết. ........................................................................................................... 163

Bảng 1.15: Thành phần và hàm lượng tương đối của acid béo trong dịch chiết từ ......... 166

Bảng 1.16: Những thành phần có thể đóng góp trong chất hoạt động chống oxy hóa từ

S.platensis ......................................................................................................................... 166

Bảng 1.17: Số lượng tồn tại (log CFU/ml) của Streptococcus thermophilus, Lactobacillus

acidophilus, và Bifidobacterium spp. trong sữa lên men bổ sung Spirulina và lên men

thông thường trong thời gian bảo quản ở 15°C. ............................................................... 174

http://www.ebook.edu.vn - xi -

Bảng 1.18: Tỷ lệ % tồn tại của Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, và

Bifidobacterium spp. trong sữa lên men bổ sung Spirulina và lên men thông thường trong

thời gian bảo quản ở 15°C. ............................................................................................... 174

Bảng 1.19: pH và độ chua của sản phẩm sữa lên men bổ sung Spirulina và lên men thông

thường trong thời gian lưu trữ ở 150C. ............................................................................. 176

Bảng 1.20: Số lượng tồn tại (logCFU/ml) của Streptococcus thermophilus, Lactobacillus

acidophilus, và Bifidobacterium spp. trong sữa lên men bổ sung Spirulina và lên men

thông thường trong thời gian bảo quản ở 4°C. ................................................................. 177

Bảng 1.21: Tỷ lệ % tồn tại của Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, và

Bifidobacterium spp. trong sữa lên men bổ sung Spirulina và lên men thông thường trong

thời gian bảo quản ở 4°C. ................................................................................................. 177

Bảng 1.22: pH và độ chua của sản phẩm sữa lên men bổ sung Spirulina và lên men thông

thường trong thời gian lưu trữ ở 40C. ............................................................................... 179

Bảng 2.1: Hàm lượng FOS của một số loại cây quả (mg/g chất khô) .............................. 186

Bảng 2.2: Nguồn enzyme tổng hợp FOS từ thực vật ....................................................... 188

Bảng 2.3: Vi sinh vật sản xuất FOS ................................................................................. 189

Bảng 2.4: Đặc tính của FOS so với một số loại đường khác ........................................... 190

Bảng 2.5: Diễn biến tăng trưởng của ngành công nghiệp mía đường trên toàn quốc ..... 210

Bảng 2.6: Kết quả tinh sạch β-fructofuranosidase từ A. niger IMI 303386 ..................... 215

Bảng 2.7: Ảnh hưởng của các ion kim loại và hợp chất lên hoạt tính enzyme β-

fructofuranosidase của A. niger ........................................................................................ 221

Bảng 2.8: Thành phần đường so sánh giữa FOS và FOS cao độ ..................................... 243

Bảng 2.9: Thành phần đường trong dịch mía ................................................................... 245

Bảng 2.10: Ảnh hưởng của tỉ lệ Enzyme/cơ chất tới sự biến đổi thành phần đường ....... 249

Bảng 2.11: Thành phần và hàm lượng đường có trong sản phẩm FOS ........................... 250

http://www.ebook.edu.vn - xii -

Bảng 2.12: Thành phần của bột dinh dưỡng trẻ em ......................................................... 253

Bảng 2.13: Kết quả đánh giá cảm quan bột dinh dưỡng trẻ em ....................................... 254

Bảng 2.14: Thành phần của bánh bích quy ...................................................................... 256

Bảng 2.15: Kết quả đánh giá cảm quan bánh bích quy .................................................... 257

Bảng 2.16: Thành phần của hai loại kẹo .......................................................................... 259

Bảng 2.17: Kết quả đánh giá cảm quan của hai loại kẹo .................................................. 259

http://www.ebook.edu.vn - xiii -

DANH MỤC HÌNH

PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Hình 2.1: Công thức cấu tạo Soyasaponin I – IV .............................................................. 17

Hình 2.2: Công thức cấu tạo isoflavone và dẫn xuất ......................................................... 17

Hình 2.3: Công thức hóa học của lycopene ........................................................................ 18

Hình 2.4: Công thức cấu tạo các hợp chất catechin trong trà xanh ................................... 20

Hình 2.5: Các hợp chất curcumin trong củ nghệ ................................................................ 22

Hình 2.6: Giới thiệu hình ảnh một số loại nấm .................................................................. 32

PHẦN 2: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN TRONG SẢN XUẤT THỰC

PHẨM CHỨC NĂNG

Hình 1.1 : Diện tích cây trồng CNSH trên thế giới từ 1996 đến 2007 ............................... 42

Hình 2.1: Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nhìn dưới kính hiển vi. .......................... 59

Hình 2.2: Khối u ở thực vật do Agrobacterium tumefaciens gây ra ................................... 59

Hình 2.3: Công thức cấu tạo của opine (octopin, nopalin) ................................................ 60

Hình 2.4: Sơ đồ gen của Ti-plasmid trong vi khuẩn A. tumefaciens ................................. 64

Hình 2.5: Sơ đồ plasmid tái tổ hợp dựa trên nguyên tắc của Ti-plasmid .......................... 64

Hình 2.6: Quá trình tạo cây chuyển gen nhờ A.tumefaciens. ............................................. 65

Hình 2.7 : Súng bắn gen (Hãng Biorad) ............................................................................. 66

Hình 2.8: Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen ................................................... 67

Hình 2.9 : Sơ đồ màng phospholipid kép .......................................................................... 68

Hình 2.10 : Cuvette nhựa có điện cực ................................................................................ 68

Hình 2.11: Sơ đồ bố trí mạch cơ bản của máy xung điện .................................................. 69

http://www.ebook.edu.vn - xiv -

Hình 2.12 : Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời trên màng bào chất

............................................................................................................................................ 70

Hình 2.13: Vi tiêm gen ngoại lai vào nhân của protoplast ................................................. 71

Hình 2.14 : Sơ đồ tạo động vật chuyển gen ....................................................................... 72

Hình 2.15: Trứng cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) trước và sau khi khử màng thứ

cấp (chorion) ....................................................................................................................... 75

Hình 2.16 : Phức hợp DNA-calcium phosphat .................................................................. 78

Hình 2.17: Sự kết hợp giữa DEAE-dextran và DNA ......................................................... 78

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của folate ................................................................................ 82

Hình 3.2: Con đường sinh tổng hợp folate ......................................................................... 87

Hình 3.3: Cấu trúc vector pMON10086 ............................................................................. 88

Hình 3.4: Vùng 5’ của cDNA GCHI tổng hợp ................................................................... 89

Hình 3.5: Nguyên lý tạo cây cà chua chuyển gen thế hệ 1 ................................................. 89

Hình 3.6: Phân tích HPLC huỳnh quang những pteridine oxi hóa trong quả chín đỏ (Cột

Ultramex C18 IP) ................................................................................................................. 93

Hình 3.7: Sự thay đổi trong lượng pteridine tổng của quả đối chứng (V2) và quả GCHI+

trong suốt quá trình chín ..................................................................................................... 94

Hình 3.8 : Các giai đoạn chín của cà chua ........................................................................ 94

Hình 3.9: Định lượng các pteridine chính trong quả chín đỏ của 3 thể biến nạp GCHI+ đại

diện ..................................................................................................................................... 95

Hình 3.10: Phân tích HPLC huỳnh quang peak 1 và 2 chưa biết trước và sau khi xử lý với

HCl, α-glucosidase hoặc β-glucosidase ............................................................................. 96

Hình 3.11: Hàm lượng folate tổng trong quả chín đỏ của 12 thể biến nạp GCHI+ và 10 thể

biến nạp đối chứng ............................................................................................................. 97

http://www.ebook.edu.vn - xv -

Hình 3.12: Phân tích folate trong quả GCHI+ và quả đối chứng ...................................... 98

Hình 3.13: Ảnh hưởng của PABA ngoại sinh đến hàm lượng folate ................................ 99

Hình 3.14: Nguyên lý tạo cây cà chua chuyển gen thế hệ 2 ............................................ 103

Hình 3.15: Hàm lượng folate, PABA, và pteridine tích lũy trong các dòng AtADCS+,

GCHI+ và GCHI+/AtADCS+ ......................................................................................... 104

Hình 3.16: Giản đồ đại diện của T-DNA trong các vector dùng để chuyển gen ............ 105

Hình 3.17: Mức PABA và folate tổng trong những dòng A ........................................... 107

Hình 3.18: Mức pterin và folate tổng trong những dòng G ............................................. 108

Hình 3.19: Mức PABA, pterin và folate tổng trong những dòng GA ............................. 108

Hình 3.20: So sánh thành phần các loại folate chính trong dòng GA so với dòng WT ... 110

Hình 3.21: Tỷ lệ tương đối của polyglutamate và monoglutamate folate của dòng GA và

WT ................................................................................................................................... 111

Hình 3.22: Sự thay đổi mức folate tổng trong hạt của dòng GA khi nấu ........................ 112

PHẦN 3: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ VI SINH TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM

CHỨC NĂNG

Hình 1.1: Hình dạng tảo Chlorella, Scenedesmus, Spirulina .......................................... 121

Hình 1.2: Hình dạng của tảo Spirulina ............................................................................ 124

Hình 1.3: Sơ đồ vòng đời của Spirulina .......................................................................... 125

Hình 1.4: Sơ đồ của quá trình chiết SC-CO2 ................................................................... 161

Hình 1.5: Hoạt chất chống oxy hóa được đánh giá bằng phương pháp ức chế quá trình

peroxide hóa của acid linoleic ......................................................................................... 165

Hình 2.1: Công thức cấu tạo của FOS ............................................................................. 187

Hình 2.2: Sự thay đổi nồng độ insulin trong máu ........................................................... 191

http://www.ebook.edu.vn - xvi -

Hình 2.3: Sự thay đổi nồng độ glucose trong máu .......................................................... 191

Hình 2.4: Sự thay đổi nồng độ fructose trong máu ......................................................... 192

Hình 2.5: Quy trình sản xuất FOS từ FTS vi sinh vật ..................................................... 201

Hình 2.6: Sơ đồ quy trình sản xuất FOS liên tục và không liên tục ................................. 202

Hình 2.7: Cơ chế chuyển hóa tạo FOS từ sucrose của FTS A.pullulans ......................... 206

Hình 2.8: Quá trình oxy hóa glucose dưới tác dụng của enzyme GOD .......................... 208

Hình 2.9: Phản ứng oxy hóa glucose dưới tác dụng của hệ 2 enzyme GOD và CAT ..... 209

Hình 2.10: Sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose ........................................................... 216

Hình 2.11: Sắc ký lọc gel Ultrogel AcA44 của β-fructofuranosidase ............................. 217

Hình 2.12: Kết quả điện di SDS-PAGE của β-fructofuranosidase ................................. 218

Hình 2.13: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính và độ ổn định của β-fructofuranosidase .... 219

Hình 2.14: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ ổn định của β-fructofuranosidase

.......................................................................................................................................... 220

Hình 2.15: Sự thay đổi pH và hoạt tính FTS trong quá trình nuôi cấy nhiều chu kì A.

oryzae CFR 202 ................................................................................................................ 225

Hình 2.16: Hàm lượng FOS sinh ra bởi FTS qua các chu kì nuôi cấy A. oryzae ............ 225

Hình 2.17: Nồng độ và phần khối lượng của các loại đường theo thời gian ................... 229

Hình 2.18: Sản xuất FOS sử dụng tế bào cố định và tế bào không cố định ..................... 230

Hình 2.19: Ảnh hưởng của lượng tế bào cố định trong mạng gluten ............................... 231

Hình 2.20: Phần khối lượng FOS và năng suất tạo FOS theo tốc độ dòng chảy ............. 232

Hình 2.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) lên hỗn hợp enzyme ........................ 236

Hình 2.22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ FOS tạo thành .......................................... 237

Hình 2.23: Ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn đến tỉ lệ FOS tạo thành ............................ 238

http://www.ebook.edu.vn - xvii -

Hình 2.24: Ảnh hưởng của lưu lượng oxy đến sản xuất FOS ......................................... 239

Hình 2.25: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến tỉ lệ tạo FOS ....................................... 240

Hình 2.26: Ảnh hưởng của nồng độ glucose oxidase lên tỉ lệ tạo FOS .......................... 241

Hình 2.27: Tỉ lệ các loại đường trong hỗn hợp phản ứng ở điều kiện tối ưu .................. 242

Hình 2.28: Sắc ký đồ HPLC của FOS và FOS cao độ .................................................... 242

Hình 2.29: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng vận chuyển Fructose ........................ 246

Hình 2.30: Ảnh hưởng của pH đến khả năng vận chuyển Fructose ................................ 247

Hình 2.31: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng vận chuyển Fructose ...................... 247

Hình 2.32: Sắc ký đồ của đường FOS và các loại đường trong mẫu nghiên cứu ........... 250

Hình 2.33: Sắc ký đồ của đường FOS chuẩn .................................................................. 250

Hình 2.34: Sơ đồ quy trình sản xuất siro FOS từ nước mía sử dụng Pectinex Ultra SP-L

.......................................................................................................................................... 251

Hình 2.35: Sơ đồ quy trình sản xuất bột dinh dưỡng trẻ em có bổ sung FOS ................ 253

Hình 2.36: Sơ đồ quy trình sản xuất bánh bích quy sử dụng đường FOS ....................... 255

Hình 2.37: Sơ đồ quy trình sản xuất đường cứng sử dụng đường FOS .......................... 258

http://www.ebook.edu.vn - xviii -

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AAPH : 2,2’-azobis (2-amidinopropane) hydrochloride.

ABT : Hệ vi khuẩn Lactobacillus acidophilus (A), Bifidobacteria (B), và

Streptococcus thermophilus (T)

ADCS : enzyme aminodeoxychorismate synthase

BHT : Butylated hydroxytoluene.

DALY : disability adjusted life years: tỷ lệ khuyết tật được điều chỉnh hàng năm

DFE : dietary folate equivalents: hàm lượng folate tương đương trong bữa ăn

FAME : Fat Acid Methyl Esters.

FDA : Food and Drug Administration: tổ chức Thực phẩm và Thuốc Hoa Kỳ

FOS : Fructooligosaccharide

FTS : Fructosyltransferase

GC-MS : Gas Chromatography-Mass Spectometry – Sắc kí khí-khối phổ.

GCHI :enzyme GTP cyclohydrolase I

GOD : Glucose oxidase

NTD : neural tube defects: dị tật ống thần kinh

PAPA : p-aminobenzoate

RSM : Response Surface Method – Phương pháp bề mặt đáp ứng.

SC-CO2 : Supercritical carbon dioxide – CO2 siêu tới hạn.

THF : tetrahydrofolate

Trolox : 6-hydroxyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid.

WT : wild type: chủng hoang dại

http://www.ebook.edu.vn - xix -

LỜI NÓI ĐẦU

Trong hơn 20 năm qua, người dân cũng như giới khoa học đã có thêm một cái nhìn

nữa về thực phẩm. Thực phẩm không chỉ là để duy trì sự sống mà còn thêm khả năng tăng

cường sức khỏe, giảm thiểu các bệnh mãn tính do thiếu cân bằng dinh dưỡng. Từ đó khơi

nguồn cho sự tìm hiểu và chế biến loại thực phẩm trong đó ngoài việc cung cấp nhu cầu

dinh dưỡng cơ bản mà các thành phần cấu tạo còn có tác dụng tích cực vào những nhiệm

vụ khác nhau của cơ thể. Đó là “ Thực phẩm chức năng”.

Các nhà khoa học trên thế giới đã dự báo rằng: thức ăn của con người trong thế kỉ

XXI sẽ là thực phẩm chức năng. Các hoạt chất mà thực phẩm chức năng mang lại cho con

người chính là những vị thuốc quý, giúp con người tăng cường miễn dịch, chống lão hóa,

kéo dài tuổi thọ, phòng và chữa các bệnh mãn tính, kể cả ung thư.

Loại thực phẩm chức năng đầu tiên được kể đến là những thực phẩm mà khi ở dạng

tự nhiên đã có những hoạt chất có lợi cho con người. Tiếp đó là nhóm thực phẩm có ít

hoạt chất hơn, phải bổ sung hoặc tinh chế, cô đặc lại ở dạng dễ sử dụng, hay biến đổi gen

để tăng hàm lượng một số chất có lợi.

Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, việc chế biến và sản

xuất thực phẩm chức năng đã trở nên dễ dàng hơn. Con người đã tạo ra các thực phẩm

chức năng rất đa dạng về thể loại và phong phú về hoạt tính sinh học. Đối với nước ta,

đây là lĩnh vực có nhiều triển vọng, bởi nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú và đa

dạng, cùng với sự đầu tư vào công nghệ sinh học, bước đầu đã đạt được một số thành tựu

đáng ghi nhận.

Phần 1: Tổng quan về thực phẩm chức năng

- 1 -

PHẦN 1

TỔNG QUAN VỀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Chương 1: Khái niệm thực phẩm chức năng

- 2 -

CHƯƠNG 1

KHÁI NIỆM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

1.1. Khái niệm thực phẩm chức năng

Khái niệm và tên gọi về thực phẩm chức năng bắt nguồn từ Nhật Bản. Vào năm 1980

Bộ Y tế và Sức khỏe của nước này bắt đầu xây dựng hệ thống tổ chức trong Bộ, tổ chức này

có nhiệm vụ điều chỉnh và công nhận những loại thực phẩm có hiệu quả cải thiện sức khỏe

của cộng đồng dân cư. Họ cho phép ghi trên nhãn hiệu hàng hóa thực phẩm sử dụng cho sức

khỏe con người, được viết tắt từ cụm từ tiếng Anh là FOSHU

(Foods for Specified Health Use). Sau hơn 20 năm hoạt động trên lĩnh vực này, đến tháng 9

năm 2001 đã có trên 271 sản phẩm thực phẩm mang nhãn hiệu FOSHU. Ở Nhật, thực phẩm

chức năng được định nghĩa như sau : Những loại thực phẩm có hiệu quả lên sức khỏe bởi

các chất dinh dưỡng truyền thống và các hoạt chất sinh học có chứa trong nó, người ta gọi

là thực phẩm chức năng. Sau đó, thực phẩm chức năng xuất hiện trên nhiều nước khác.

Ở Mỹ quan điểm về thực phẩm chức năng của ADA (The American Dietetic

Association): Thực phẩm chức năng là bao gồm tất cả các thành phần có trong nó và cũng

là thực phẩm được làm mạnh them, làm giàu thêm hoặc nâng cao thêm yếu tố nào đó, có

hiệu quả tiềm năng đến sức khỏe khi tiêu thụ một phần nó trong khẩu phần có nhiều loại

một cách thường xuyên với mức độ có tác dụng.

Theo FDA thì : Thực phẩm chức năng là loại thực phẩm cung cấp các chất dinh dưỡng

cơ bản có ích cho sức khỏe. Thực phẩm chức năng là thực phẩm mà nếu ăn nó, thì sức khỏe

sẽ tốt hơn khi không ăn nó. Ví dụ như rau xanh và trái cây có chứa đủ chất để làm tăng

cường sức khỏe. Những chất có hoạt tính sinh học trong thực phẩm chức năng có ích cho

sức khỏe hoặc có ảnh hưởng sinh lý theo hướng mong muốn.

Theo IFIC (The International Food Information Council) thì thực phẩm chức năng là

thực phẩm có lợi cho sức khỏe bởi các chất dinh dưỡng cơ bản.


- 3 -

Theo ILSI (The International Life Sciences Institute of North America) thì thực phẩm

chức năng là loại thực phẩm có chứa hoạt tính sinh học có ích cho sức khỏe trên cơ sở các

chất dinh dưỡng cơ bản.

Viện nghiên cứu Y học của Viện hàn lâm khoa học Mỹ cho rằng : thực phẩm chức

năng là thực phẩm có chứa một hay nhiều hơn những nguyên liệu thực phẩm có sửa đồi để

nâng cao hiệu quả cho sức khỏe.

Ở Trung Quốc thì thực phẩm chức năng được coi là thực phẩm bao gồm các chất dinh

dưỡng như thực phẩm bình thường, nhưng đặc biết có chứa yếu tố thứ hai hay thứ ba có tác

dụng phòng chống bệnh như là dược liệu.

Tại Việt Nam từ 1990 – 1991, Viện Dinh dưỡng đã xác định : Thực phẩm chức năng là

thực phẩm có chứa các chất có hoạt tính sinh học cần thiết cho sức khỏe bao gồm cả thực

phẩm chế biến cải tiến, thức ăn cổ truyền dân tộc và các thành phần không dinh dưỡng khác

có tác động đặc biệt và cần thiết cho sức khỏe.

Thuộc tính chức năng nói lên vai trò sinh học của một hay nhiều chất dinh dưỡng chức

năng có trong thực phẩm truyền thống, nó được phát hiện ra với những thành phần các chất

đặc biệt có hữu ích cho sức khỏe. Cần phải có sự kết hợp nghiên cứu yểm trợ để xác định

hiệu quả sức khỏe cũng như nguy cơ của thực phẩm chức năng khi ăn đơn điệu chúng với

những thành phần có hoạt tính sinh lý mạnh trong thực phẩm chức năng. Chuyên ngành

dinh dưỡng sẽ tiếp tục cùng với công nghệ thực phẩm, nhà nước, hội đồng khoa học, và các

cơ quan truyền thong phải có những chỉ dẫn chính xác rõ ràng về mặt khoa học của thực

phẩm và dinh dưỡng để người tiêu thụ biết cách áp dụng.

Khi nghiên cứu về thực phẩm chức năng và thuốc trị bệnh, người ta thấy nó như là

vùng giao thoa giữa thực phẩm và thuốc. Nó vừa chứa các chất dinh dưỡng như là thực

phẩm truyền thống, lại vừa có hoạt chất sinh học có tác dụng phòng trị bệnh như là thuốc

[3].


- 4 -

1.2. Phân biệt thực phẩm chức năng với một số thực phẩm khác

Sự khác biệt giữa Thực phẩm chức năng, Thực phẩm thuốc và Thực phẩm thông

thường được thể hiện qua sơ đồ sau :

1.2.1 Thực phẩm thông thường (Ordinary food ingredients)

Là thực phẩm với các thành phần và giá trị dinh dưỡng cơ bản được ghi trên nhãn và

phải đảm bảo yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm được cộng đồng và cơ quan quản lý thực

phẩm chấp nhận. Khi ăn loại thực phẩm này thì cơ thể phát triển một cách bình thường

trong điều kiện bình thường [3].

1.2.2 Thực phẩm chức năng (Functional Foods)

Là thực phẩm ngoài chất dinh dưỡng cơ bản ra, còn chứa một số hoạt chất chức năng

đặc biệt ở mức độ cao, có tác dụng phòng chống bệnh tật, đảm bảo cho sức khỏe bền vững.

Thực phẩm chức năng phải được công bố thành phần các chất dinh dưỡng chức năng trong

thực phẩm và có hướng dẫn sử dụng để phòng chống những bệnh tật gì. Thực phẩm chức

năng không cần phải có sự kê đơn hoặc quản lý theo dõi điều trị trong phòng và chữa trị

bệnh, thực phẩm phải được đăng kí theo qui định của điều lệ Vệ sinh an toàn thực phẩm [3].

1.2.3 Thực phẩm thuốc (Medical Foods)

Là thực phẩm phải đạt yêu cầu cao trong chế biến và phối trộn các thành phần dinh

dưỡng cùng với các hoạt chất có tác dụng dược lý theo tiêu chuẩn kỹ thuật của ngành dược

và ngành thực phẩm, phải đạt tiêu chuẩn thuốc uống và vệ sinh an toàn thực phẩm, phải

đăng kí theo tiêu chuẩn thuốc và thực phẩm của Bộ Y tế. Theo FDA ở Mỹ, từ năm 1938 thì

Thực phẩm Thực phẩm thông thường chức năng

Thực phẩm Thuốc và thuốc dược liệu


- 5 -

khi sử dụng thực phẩm thuốc phải được Bác sĩ kê đơn, chẩn đoán dinh dưỡng để có chế độ

ăn thích hợp cho bệnh nhân. Ví dụ như thức ăn qua xông để hỗ trợ sức lực cho bệnh nhân

trong quá trình điều trị [3].

1.2.4 Thuốc và dược liệu (drug)

Là sản phẩm bào chế phải được tuân thủ nghiêm ngặt của ngành dược, đảm bảo an

toàn và hiệu quả trong việc sử dụng để phòng và trị bệnh, thuốc phải được thử nghiệm hoàn

chỉnh trên lâm sang. Thuốc phải đăng ký theo tiêu chuẩn thuốc và phải có sự kê đơn của

Bác sĩ.

Trong bảng dưới đây tóm lược các đặc điểm của các loại thực phẩm và thuốc, các yêu

cầu sử dụng và dán nhãn trên bao bì.

Bảng 1.1: Phạm trù giữa thực phẩm và thuốc

Phạm trù Sản phẩm Thuốc và dược liệu Dược phẩm có qui định sử dụng, Bác sĩ kê đơn.

Dược phẩm không có qui định kê đơn của Bác sĩ, có hướng dẫn.

Thực phẩm thuốc Sản xuất theo qui trình sản xuất thuốc, thực phẩm. Được Bác sĩ chẩn đoán dinh dưỡng và kê đơn.

Thực phẩm chức năng Thế hệ I: Chọn lựa thực phẩm chức năng có trong tự nhiên. Thế hệ II: Thực phẩm được bổ sung tăng cường hoạt chất chức năng. Thế hệ III: Thực phẩm được phối hợp các hoạt chất chức năng.

Thực phẩm thông thường Thực phẩm mới Thực phẩm dinh dưỡng đặc biệt. Thực phẩm thông thường

[3]


- 6 -

1.3. Lịch sử nghiên cứu thực phẩm chức năng trong nước và trên thế giới

1.3.1. Trên thế giới

Từ năm 1900 đã có khái niệm sử dụng thực phẩm để phòng bệnh và tăng cường cho

sức khỏe. Lúc bấy giờ người ta biết dử dụng muối giàu iod để phòng và chữa bệnh bướu cổ,

ngày nay chúng ta coi đó là thực phẩm chức năng. Trước đó người ta còn biết sử dụng củ cà

rốt để chữa bệnh quáng gà, ngày nay ta coi đó là bệnh thiếu vitamin A và cà rốt cung cấp

tiền chất vitamin A để chữa bệnh.

Thời kì cổ đại Hypocrat coi thức ăn cũng là phương tiện điều trị bệnh. Nhưng lúc bấy

giờ, người ta chưa hiểu một cách rõ ràng chất nào trong thực phẩm có giá trị phòng và chữa

bệnh, phần lớn họ dùng thực phẩm để phòng và chữa bệnh theo kinh nghiệm. Vì vậy từ thế

kỉ thứ 19 trở về trước, người ta có quan niệm khi có bộ phận nào đó của cơ thể bị bệnh thì

tìm thức ăn tương ứng ăn vào sẽ chữa được bệnh, nói khác đi là “ đau cái gì ăn cái nấy”.

Điều này không đúng với các bệnh truyền nhiễm. Sau này khi ngành hóa học hữu cơ, hóa

phân tích, hóa sinh phát triển, người ta mới làm rõ ra vai trò sinh học của mỗi loại chất dinh

dưỡng trong thức ăn đối với cơ thể. Định nghĩa thực phẩm chức năng ngày càng sáng tỏ

hơn, ngày càng có sự giao thoa giữa ngành Y Dược với ngành chế biến thực phẩm. Nói

khác đi “ người thầy thuốc cũng là người đầu bếp, người đầu bếp cũng là người thầy thuốc”.

Hiện nay ở Trung Quốc và một số quốc gia khác phát triển thực phẩm chức năng rất

mạnh. Theo Zonglian Jin và Bodi Hui, trường Đại học Khoa học Bắc Kinh (2003) thì đến

cuối năm 2002 có đến 3799 sản phẩm thực phẩm chức năng được Bộ Y tế Trung Quốc

chuẩn y. Trong số này có đến 71,5% thực phẩm chức năng thuộc nhóm giúp cho cơ thể tăng

cường sức đề kháng để kháng bệnh, giúp cho cơ thể điều chỉnh lượng mỡ máu và giải thoát

mệt mỏi, thư giãn [3].

1.3.2. Tình hình sử dụng thực phẩm chức năng ở Việt Nam

Đối với nước ta, việc nghiên cứu tạo ra các chế phẩm thực phẩm chức năng mang

phương châm “ công nghệ cao, bản sắc cổ truyền” là hướng nghiên cứu rất lý thú và có lợi

thế, bởi vì chúng ta có thế mạnh về tài nguyên sinh học nhiệt đới và có kho tàng kinh


- 7 -

nghiệm phong phú của nền y học dân tộc. Từ lâu đời, nhân dân ta đã biết sử dụng bột cóc

để chống bệnh còi xương cho trẻ em, sử dụng côn trùng và các động vật rừng với mục đích

bổ dưỡng và làm thuốc chữa bệnh. Ngoài ra, còn nhiều loại sản phẩm biển có giá trị dinh

dưỡng cao, dược liệu quý như yến sào, bào ngư, hải sâm, vi cá, các loài nhuyễn thể

biển…phục vụ các bữa yến tiệc cung đình. Kho tàng kinh nghiệm này không ngừng được bổ

sung từ thế hệ này qua thế hệ khác qua quá trình lao động chinh phục thiên nhiên và đang

được nền y học hiện đại soi sáng, chứng minh.

Phòng Hóa sinh protein, thuộc Viện Công nghệ sinh học đã tiến hành phân tích sinh

hóa 4 loài hải sâm ăn được, 4 loài rắn biển ăn được và loài cầu gai. Từ đó đã phát hiện được

một số hoạt chất sinh học quan trọng có trong thịt của chúng. Các phát hiện này đã tạo cơ sở

khoa học cho việc nghiên cứu và sản xuất thực phẩm chức năng, các chế phẩm tăng lực đầu

tiên cho vận động viên Việt Nam. Bước đầu đưa vào sử dụng đã giúp cho các vận động viên

đạt được một số cải thiện về thể lực, thi đấu thành công.

Những kết quả nghiên cứu bước đầu về thực phẩm chức năng ở trong nước có ý nghĩa

to lớn, có triển vọng đóng góp cao cho ngành công nghiệp dược của nước ta.

Trong tương lai sẽ phát triển những loại thực phẩm cung cấp năng lượng cao, có thể

tích nhỏ, thuận lợi cho việc vận chuyển, không phải nấu nướng và khẩu vị phải đa dạng. Các

yếu tố trí nhớ và nâng cao sức đề kháng, sức chống chịu của cơ thể…sẽ được đưa vào thực

phẩm chức năng dùng cho nhân dân, người lao động trí óc, đặc biệt cho bộ đội trong các

cuộc hành quân thần tốc và trong chiến tranh tình hình mới[14].

Chương 2: Phân loại thực phẩm chức năng – Vai trò sinh học

- 8 -

CHƯƠNG 2

PHÂN LOẠI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG - VAI TRÒ SINH HỌC

2.1. Phân loại thực phẩm chức năng

Có nhiều cách phân loại:

Dựa vào đặc tính cấu tạo hóa học, người ta chia các chất dinh dưỡng chức năng theo

các nhóm sau:

2.1.1. Các chất xơ chức năng trong dinh dưỡng

Chất xơ là các polysaccharide không phải là tinh bột, là bộ khung, giá đỡ của các mô,

tế bào thực vật và có sức chống đỡ với các men tiêu hóa của người. Chất xơ có nhiều trong

rau, quả, phần cám của hạt gạo.

Thực phẩm có nhiều chất xơ có tác dụng làm khối phân trở nên lớn, xốp, kích thích

nhu động ruột, làm giảm thời gian lưu phân trong ruột già, chống táo bón. Ngoài ra chất xơ

còn hấp phụ độc tố trong ruột, không cho hấp thu vào cơ thể, thải chúng ra ngoài theo phân.

Người ta theo dõi thấy, khối lượng phân nhỏ hơn 100g mỗi ngày dễ làm tăng nguy cơ ung

thư đại tràng. Do đó cần có khối lượng phân lớn hơn 132g mỗi ngày. Điều đó cần lượng

chất xơ cần thiết là 17,9g/ngày.

Thực phẩm có nhiều chất xơ còn làm chậm hấp thu đường, có tác dụng tốt cho người

bệnh tiểu đường, béo phì. Chất xơ còn ngăn cản sự tái hấp thu cholesterol, có tác dụng tốt

cho người bệnh tim mạch.

Một số chất xơ tan có khả năng lên men sinh acid hữu cơ bởi vi sinh vật ở ruột già, tạo

môi trường acid, ức chế vi khuẩn lên men thối có hại, đồng thời các acid hữu cơ này cũng

được hấp thu, cung cấp năng lượng không phải đường cho cơ thể.


- 9 -

2.1.2. Các loại đường đa phân tử chức năng (Oligosaccharides)

Có nhiều loại đường đa phân tử (3 – 9 phân tử đường đơn), như đường đa

fructooligosaccharide có nhiều trong rau quả, lactooligosaccharide có trong sữa, những

oligosaccharide khác có nhiều trong hạt đậu nành…

Các loại đường này cơ thể không có khả năng tiêu hóa hấp thu ở đoạn trên của ruột do

đó làm chậm hấp thu đường, giảm bớt gánh nặng sản xuất insulin của tuyến tụy, vì thế có

tác dụng tốt cho người mắc bệnh tiểu đường. Loại đường này cũng có nhiều trong rau quả.

2.1.3. Acid amin, peptide và protein chức năng

Acid amin, peptide và protein là thành phần rất quan trọng để duy trì sức khỏe, sự

sống. Gần đây chúng còn được biết thêm như là một thực phẩm chức năng.

Acid amin cần thiết cho việc điều trị, phục hồi sức khỏe cho người bệnh tật, chấn

thương, điều hòa hoạt động của hệ thần kinh trung ương.

Peptid và protein có vai trò quan trọng trong việc tăng cường hoạt động của hệ thống

miễn dịch như protein kháng thể trong sữa đầu, protein kháng thể chống bệnh đường ruột

trong lòng đỏ trứng được sản xuất bằng cách tiêm vaccine vi khuẩn gây bệnh đường ruột

cho gà mái đẻ trứng. Ngoài ra, protein còn có tác dụng trong việc điều hòa hấp thu vitamin,

chất khoáng, hấp thu và nước. Một số loại protein như gelatin, casein …, những chất này ức

chế chuyển dạng tự angiotensin I thành angiotensin II, do đó làm giảm huyết áp, phòng

chống bệnh cao huyết áp.

Lượng peptide chứng năng có trong thực phẩm tự nhiên nhìn chung không cao. Vì vậy,

người ta tạo ra các loại peptide này bằng phương pháp hóa sinh, công nghệ gen hay vi sinh

vật trong công nghệ enzyme để thu một số lượng lớn tăng cường vào thực phẩm chế biến.

2.1.4. Vitamin và khoáng chất

Ngoài những tác dụng thông thường, vitamin và khoáng chất còn có một số tác dụng

khác trong việc phòng chống bệnh tật.


- 10 -

Carotene, vitamin A, E, C, glutathion, tocopherol, sắt, kẽm, selenium có khả năng

chống oxy hóa nên có khả năng phòng được những bệnh mãn tính, đặc biệt là bệnh tim

mạch, ung thư và lão hóa.

Vitamin B6, B12 và acid folic cũng làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch, có tác dụng

tốt cho sự phát triển bào thai và cho sức khỏe bà mẹ mang thai.

Kẽm và vitamin A làm tăng cường hoạt động của hệ thống miễn dịch, phòng ngừa các

bệnh nhiễm trùng, đặc biệt là tiêu chảy và nhiễm trùng hô hấp ở trẻ nhỏ.

2.1.5. Vi khuẩn sinh acid lactic, acid butyric

Đây là nhóm vi khuẩn có ích tiêu biểu cho những vi sinh vật đường ruột, có tác dụng

làm giảm hội chứng không dung nạp lactose, dự phòng và điều trị tiêu chảy. Ngoài ra nó

còn làm giảm cholesterol trong máu, phòng chống bệnh ung thư ruột kết, nhất là acid

butyric.

Những vi khuẩn này được cung cấp qua đường miệng như là một probiotic, có tác

dụng tăng cường miễn dịch, hạn chế táo bón, điều trị nhiễm trùng tiết niệu sinh dục.

2.1.6. Acid béo chưa no

Vai trò phòng bệnh của acid béo chưa no một nối đôi (MUFA) và nhiều nối đôi

(PUFA), omega-6 và omega-3 đã được nghiên cứu. Một số acid béo thuộc những loại này

có khả năng phòng ngừa một số bệnh mãn tính như: phòng ngừa hình thành huyết khối, xơ

vữa động mạch, phòng bệnh tăng huyết áp, giảm mỡ máu, loạn nhịp tim. Ngoài ra còn có

khả năng chống viêm khớp, bệnh vảy nến, ung thư.

Lecithin là một phospholipid có tác dụng cùng với omega-3 làm giảm cholesterol máu,

qua đó giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Lecithin có nhiều trong lòng đỏ trứng gà, đậu

nành, rau quả.


- 11 -

2.1.7. Các loại sắc tố thực vật

Thực vật có rất nhiều loại sắc tố khác nhau, dựa trên cấu trúc hóa học và màu sắc của

nó, sắc tố thực vật được chia làm 3 nhóm chính: nhóm sắc tố có màu xanh (Chlorophyll),

nhóm sắc tố màu vàng – đỏ (Carotenoid) và nhóm sắc tố màu tím (Anthocyanin).

Các sắc tố thực vật, nhất là nhóm carotenoid có vai trò chống oxy hóa rất mạnh, vì vậy

có tác dụng phá hủy các gốc tự do, ngăn chặn sự hình thành gốc tự do trong cơ thể, từ đó

bảo vệ tốt tế bào, tránh tổn thương do các yếu tố vật lý, hóa học gây ra. Nhờ đặc tính này mà

sắc tố thực vật có vai trò phòng ngừa bệnh ung thư.

Ngoài ra, các sắc tố thực vật còn được sử dụng làm màu thực phẩm tự nhiên rất an toàn

cho cơ thể.

2.2. Phân loại dựa theo nguyên liệu thực phẩm chức năng

2.2.1. Thực phẩm chức năng có nguồn gốc thực vật

Một số thực phẩm chức năng có nguồn gốc thực vật phổ biến như:

Đậu nành:

Là thực phẩm truyền thống của nhiều nước trên thế giới kể cả Việt Nam. Ngày nay,

ngoài quan tâm đến giá trị dinh dưỡng protein của nó, từ thập kỷ 90 đến nay, người ta còn

chú ý nhiều đến các chất dinh dưỡng chức năng trong đậu nành. Nó là loại thực phẩm có

khả năng phòng chống các bệnh tim mạch, ung thư, bệnh loãng xương và những biểu hiện

của hội chứng tiền mãn kinh.

Cà chua:

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy ăn nhiều cà chua làm giảm đáng kể nguy cơ ung

thư tiền liệt tuyến, ung thư vú, ung thư tuyến tiêu hóa, ung thư cổ tử cung, ung thư bàng

quang, ung thư da và phổi. Cà chua còn làm giảm nguy cơ nhồi máu cơ tim. Khả năng

phòng chống bệnh ung thư và tim mạch của cà chua được cho là nhờ lycopene, một dạng

của carotene có khả năng chống oxy hóa mạnh.


- 12 -

Tỏi (Allinum sativum):

Tỏi là loại thực phẩm chức năng thường được sử dụng nhất, có vai trò rất quan trọng

trong việc nâng cao sức khỏe con người. Nó có khả năng phòng bệnh ung thư, là chất kháng

sinh thực vật tự nhiên, chống tăng huyết áp và giảm cholesterol máu. Trong tỏi có nhiều hợp

chất chứa lưu huỳnh tan trong nước và tinh dầu tạo nên mùi vị rất rõ và đặc trưng, nhờ vậy

giúp cho tỏi có được những tác dụng y học trong việc phòng chống bệnh tật. Tỏi còn có tác

dụng làm giảm nguy cơ mắc các chứng bệnh tim mạch và huyết áp.

Các loại rau cải (Broccoli và Cruciferous Vegetables):

Nhiều nghiên cứu dịch tễ học cho thấy những người tiêu thụ nhiều rau họ cải, đặc biệt

là cải bắp, súp lơ (đặc biệt bông xanh), cải brussel giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư. Những

loại rau cải này chứa hợp chất glucosinolate, một loại glycoside có chứa lưu huỳnh chống

lại chất gây ung thư, đặc biệt là ung thư vú vì nó ức chế receptor estrogene.

Cam quýt:

Các loại quả thuộc nhóm này gồm cam, quýt, chanh, quất, bưởi… Một số nghiên cứu

dịch tễ học chỉ ra rằng các loại quả thuộc nhóm này có khả năng phòng chống nhiều loại

ung thư ở người nhờ hàm lượng vitamin C, acid folic và lượng chất xơ khá cao trong nó.

Rượu vang và nho đỏ:

Rượu vang, đặc biệt là vang đỏ có thể làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Tỷ lệ

mặc và tử vong do bệnh tim mạch ở cả nam và nữ giảm rõ rệt ở những người có sử dụng

thường xuyên rượu vang. Ở vùng sản xuất và sử dụng nhiều rượu vang đỏ ở Pháp, mặc dù

người dân ở đây ăn nhiều mỡ heo tuy nhiên tỷ lệ mắc bệnh tim mạch lại rất thấp vì họ uống

rượu vang đỏ hàng ngày. Trong rượu vang có flavonoid, đặc biệt rượu vang đỏ có nhiều

phenolic có tác dụng ngăn ngừa quá trình oxy hóa hạt mỡ LDL trong máu, từ đó làm giảm

sự tích đọng cholesterol trên thành mạch, tránh xơ vữa động mạch. Ngoài ra trong rượu

vang đỏ còn có những chất ngăn ngừa bệnh ung thư.


- 13 -

Trà:

Trà là một trong những thức uống phổ biến nhất trên thế giới. Trong trà có hợp chất

polyphenolic, có nhiều trong trà xanh, có vai trò chống ung thư, đặc biệt là ung thư vú. Hợp

chất polyphenolic có nhiều dẫn xuất khác nhau, có tác dụng chống oxy hóa mạnh , bảo vệ tế

bào tránh đột biến gen, vì vậy mà nó phòng chống được ung thư. Một số bằng chứng khác

cũng cho thấy việc tiêu thụ trà xanh còn làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch, vì trong trà

xanh chứa nhiều hợp chất flavonoid.

2.2.2. Thực phẩm chức năng có nguồn gốc động vật

Những loại thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ động vật đáng kể bao gồm: cá, sữa

và sản phẩm từ sữa, thịt bò…

Cá và dầu cá:

Trong cá, đặc biệt là cá biển có nhiều acid béo chưa no Omega-3. Đây là loại acid béo

chưa no có nhiều nối đôi (PUFA). Acid béo Omega-3, đặc biệt là DHA rất cần cho sự phát

triển não bộ đứa trẻ, ngoài ra nó có tác dụng làm giảm chlesterol xấu LDL và làm tăng

cholesterol tốt HDL, vì vậy có tác dụng bảo vệ tim mạch, tránh cao huyết áp và xơ vữa động

mạch.

Sữa và các sản phẩm từ sữa:

Sữa mẹ là thức ăn tốt nhất cho sự phát triển của em bé vì nó có thành phần dinh dưỡng

rất đầy đủ và cân đối, dễ tiêu hóa. Ngoài ra trong sữa mẹ còn có một lượng kháng thể đáng

kể phù hợp với cơ thể trẻ để chống lại sự xâm nhiễm vi trùng gây bệnh. Theo tài liệu của Hà

Huy Khôi (2004) thì trong sữa mẹ còn có yếu tố bifidus mà bản chất của nó là

lactooligosaccharide, có tác dụng kích thích nhóm vi sinh vật hữu ích trong ruột già như

Bifidobacterium phát triển, kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn gây hại. Những vi khuẩn có

ích trong đường ruột được coi là probiotic bao gồm: Bifidobacterium, Lactobacillus,

Enterobacteriaceae… Ngày nay người ta sử dụng nó để chế biến sữa chua yoghurt.


- 14 -

Sản phẩm sữa điều trị giàu chất xơ:

Sữa điều trị là loại sữa được thay thế chất béo bởi chất xơ tan, từ rau quả. Đây là loại

sữa có hàm lượng cholesterol rất thấp, được sử dụng phổ biến tại Hoa kỳ và Nhật bản. Chất

oligosaccharide bổ sung vào sữa có tác dụng kích thích vi khuẩn Bifidobacterium ở ruột già

phát triển, ức chế lên men thối.

Sữa giàu γ-globulin:

Người ta sử dụng những chủng vi sinh vật đặc biệt (bioincubator) để sản xuất tạo nhiều

γ-globulin trong sữa với mục đích điều trị bệnh.

Sữa chua probiotics:

Sử dụng chủng vi khuẩn hữu ích đường ruột Bifidobacterium cấy vào trong sữa chua

để hỗ trợ vi sinh vật đường ruột cạnh tranh ức chế vi sinh vật gây bệnh và có hại cho đường

tiêu hóa. Từ đó loại sữa chua probiotics này có tác dụng phòng chống bệnh tiêu chảy do vi

khuẩn gây ra.

Lactoferrin:

Một dạng protein có chứa sắt có trong sữa động vật có chức năng đề kháng sự phát

triển của vi sinh vật gây bệnh. Nó được coi là một phụ gia thực phẩm thiên nhiên thay thế

nhiều phụ gia hóa học khác trong chế biến thịt hộp, lạp xưởng, xúc xích. Nó không chỉ có

tác dụng sinh học cao mà còn làm giảm lượng vi sinh vật có hại gây bệnh trong đường ruột

và dạ dày. Nó còn được phổ biến trong thức ăn qua đường tiêu hóa.

Phomai cải tiến:

Sử dụng chủng vi sinh vật kết hợp với quy trình chế biến để làm giảm cholesterol,

giảm lượng béo và natrium trong phomai, rất tốt cho người bệnh tim mạch. Chủng vi sinh

vật đặc biệt này làm thay đổi thành phần chất lượng dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe, có tác

dụng phòng và điều trị bệnh.


- 15 -

Ngoài cách phân loại như trên, ở một số nước còn có các cách phân loại khác nhau. Ví

dụ ở Nhật Bản, bảng phân loại hệ thống FOSHU (Food for Specific Health Use) như sau:

Bảng 2.1: Hệ thống phân loại FOSHU

Tuyên bố về sức khoẻ Yếu tố chức năng Số sản phẩm

Loại thực phẩm trên thị trường

Thực phẩm cải thiện đường tiêu hoá

Prebiotics: oligosaccharides, rafftinose, lactulose, arabinose. Probiotics:lactocillus, bifidobacterium.

336

Nước giải khát, yaourt, bánh biscuit, đường viên, đậu nành đông, dấm, chocolate, soup bột, sữa lên men, miso soup, ngũ cốc

Thực phẩm cho người có cholesterol máu cao

Đạm đậu nành, alginate, chitosan, sitosterol ester

28

Nước giải khát, thịt viên, xúc xích, sữa đậu nành, bánh biscuit, magarin.

Thực phẩm cho người có huyết áp cao

Chuỗi acid amin 42 Nước giải khát, soup, acid lactic, nước uống lên men, đậu nành.

Thực phẩm cho người có triacyglycerol huyết thanh cao

Diaglycerol và sitosterol

9 Dầu ăn

Thực phẩm liên quan hấp thụ và chuyên chở khoáng chất

Casein, calcium citrate isoflavone

17 Nước giải khát, đậu nành lên men (natto), mứt.

Thực phẩm Non-caloriogenic

Manitol, polyphenols, paltinose, xylytol

6 Chocolate, chewing gum.

Thực phẩm cho những người quan tâm đến đường huyết

Bột mì albumin, tiêu hoá globin, polyphenol

4 Kẹo, soup, nước giải khát.

[73]


- 16 -

2.3. Vai trò sinh học của một số loại thực phẩm chức năng tới sức khỏe con người

2.3.1. Thực phẩm chức năng nguồn gốc thực vật

Đậu nành

Tên khoa học: Glycine max (L.) Merr., Glycine soja Sieb., et Zucc, G. hispida Moench.

Họ: đậu (Fabaceae)

Thành phần hóa học: hạt đậu nành chứa: nước 9.42%, protein 29.6%, chất béo 13.5-

24.2%, chất xơ 2.84-6.27%, carbohydrate 14.07-23.88%.

Protein đậu nành tương đối cân đối acid amin. Chất béo trong đậu nành chứa nhiều

acid béo chưa no omega-3 và omega-6. Trong vỏ hạt đậu nành có rất nhiều chất

fructooligosaccharide, là những chất xơ tan có tác dụng như là một prebiotic (không tiêu

hóa ở đoạn trên ruột non, nhưng tiêu hóa tốt ở ruột già do vi khuẩn cộng sinh

Bifidobacterium lên men sinh ra acid hữu cơ cung cấp cho vật chủ). Ngoài ra trong đậu nành

còn có chứa carotene (100UI/100g) và các vitamin khác. Đậu nành sống có chứa các

enzyme amylase, urease, lipoxidase, carboxylase, catalase và các chất kết dính, các chất

kháng men tiêu hóa protein (anti-trypsine). Đặc biệt đậu nành có chứa các dẫn xuất

flavonoid, là những chất chống oxy hóa, và isoflavone (có các dẫn xuất là genistein và

daidzein), có tính chất giống estrogen gọi là phytoestrogen. Trong đậu nành còn có chứa các

chất saponin gọi là soyasaponin I – IV.

Tác dụng dược lý phòng chống bệnh tật:

Bảo vệ gan: soyasaponin III và IV (có 2 đơn vị đường) có tác dụng bảo vệ gan mạnh

hơn soyasaponin I và II (có 3 đơn vị đường).

Ức chế monoaminoxydase A (MAO: một loại enzyme oxy hóa acid amin): flavonoid

trong đậu nành có tác dụng ức chế MAO, từ đó bảo vệ acid amin có 1 amin.

Chống oxy hóa (antioxydant): isoflavone có tác dụng chống oxy hóa mạnh hơn α-

tocopherol gấp 80 – 100 lần.


- 17 -

Làm giảm cholesterol máu: ở nhóm cholesterol cao vừa phải, đậu nành làm giảm

cholesterol toàn phần 9.3% (23.2mg/100ml máu); Cholesterol tỷ trọng thấp (LDL-

cholesterol) 12.9%; triglycerid máu giảm 10.5% (13.3mg/100ml).

Tác dụng kiểu estrogen: phytoestrogen (genistein và daidzein) có tác dụng làm giảm

cơn bốc hỏa rạo rực, khó chịu ở những phụ nữ tiền mãn kinh và mãn kinh.

Hình 2.1: Công thức cấu tạo Soyasaponin I – IV [3]

Hình 2.2: Công thức cấu tạo isoflavone và dẫn xuất [3]


- 18 -

Cà chua

Tên khoa học: Solanum lycopersicum L., hoặc Lycopersicum esculentum Mill.

Họ: cà (Solanaceae)

Thành phần hóa học: quả cà chứa trigonelin, stachydrin, cholin. Vỏ quả chứa nasunin,

shisonin, delphinidin-3-monoglucoside. Lá chứa 1,2,3,4-tetrahydroxynortropan, 4-ethyl-1,2-

benzendiol. Ngoài ra còn có melongosid F, melongosid H, melongosid K, melongosid M,

solasonin, arigininglycoside, nasunin. Đặc biệt trong quả cà chua chín đỏ có nhiều

lycoxanthin, monohydroxylycopene. Cà chua còn chứa trigonelin, β-amino-4-

ethylglycoxalin, acid cafeic, acid clorogenic, acid neoclorogenic, 5-nucleotid-5-

hydroxytryptamin, acid cyanhydric (vết), delphinidin. Quả có chứa nhiều pectin 11%, acid

oxalic. Hạt cà chua chứa dầu béo 21.2%, trong đó có nhiều acid linoleic.

Tác dụng dược lý:

Cao chiết với cồn ethylic và aceton từ lá cà chua có tác dụng giảm đau, an thần và gây

tê. Cà chua có tác dụng chống đái tháo đường trên động vật thí nghiệm. Lá cà chua có chứa

tomatin, một chất kháng khuẩn chống nấm. Tomatin còn được dùng để bán tổng hợp

steroid.

Cà chua giàu lycopene, chất có khả năng chống oxy hóa rất tốt. Bằng con đường chọn

giống và công nghệ sinh học biến đổi gen, các nhà khoa học đã tạo ra loại cà chua mới có

hàm lượng lycopene cao gấp 3.5 lần cà chua thường, có khả năng chống ung thư rất mạnh.

Hình 2.3: Công thức hóa học của lycopene [65]


- 19 -

Bảng 2.2: Hàm lượng lycopene trong một số sản phẩm cà chua

Loại sản phẩm cà chua Số lượng lycopene (mg) Súp cà chua, 1 chén 24.8

Mì sợ Spaghetti xốt cà chua, ½ chén 19.4 Cà chua đóng hộp, ½ chén 11.8

Xốt cà chua nấm, 2 muỗng canh 5.1 1 trái cà chua tươi chín, trung bình 3.7

[3]

Trà xanh

Tên khoa học: Camellia sinensis (L.) O.Ktze, Thea sinensis Seem.

Họ: trà (Theaceae)

Thành phần hóa học: trong lá trà tươi có polyphenol 22.2%, protein 17.2%, cafein

4.3%, xơ 27%, tinh bột 0.5%, đường khử 3.5%, pectin 6.5%, tro 5-6%. Trong lá tươi có

carotene, riboflavin, các acid nicotinic (PP), pantothenic và ascorbic. Chất tannin trong trà

xanh có rất nhiều hoạt chất sinh học như: epicatechin, galocatechin, ester galonyl của

epicatechin… tinh dầu trà xanh chủ yếu chứa jasmon, fufuryl alcol, α-muurolen, geranial,

methyl phenyl carbinol.

Tác dụng dược lý:

Chống đái tháo đường: thí nghiệm trên chuột gây đáo tháo đường nhân tạo bằng

alloxan. Nhóm chuột dùng trà 10g/kg thể trọng lượng đường huyết không tăng, nhóm đối

chứng không dùng trà đường huyết tăng.

Tăng sử dụng thiamin (vitamin B1): dùng trà làm tăng chuyển thiamin thành thiamin

pyrophosphat. Kết quả lượng thiamin trong cơ thể giảm, vì vậy dùng nhiều trà sẽ gây thiếu

thiamin trầm trọng.

Chống oxy hóa: nhờ vào các hoạt chất trong polyphenol.


- 20 -

Làm se niêm mạc đường tiêu hóa, chống tiêu chảy. Tuy nhiên làm giảm tiêu hóa hấp

thu các dưỡng chất, đặc biệt là Fe.

Cafein, theophylin, theobromin trong trà có tác dụng kích thích thần kinh, tăng cường

sức làm việc của trí óc và cơ, tăng hô hấp, tăng điều hòa nhịp tim, lợi tiểu và kích thích ăn

ngon.

Hàm lượng Fluor khá cao trong trà xanh làm tốt cho răng, chống sâu răng.

Các hợp chất catechin trong trà xanh: catechin là một hỗn hợp dạng flavan-3-ols (chứa

–CH2- tại vòng C), là một trong các nhóm của flavonoids. Có 4 loại catechin tương ứng với

4 cấu trúc khác nhau:

Hình 2.4: Công thức cấu tạo các hợp chất catechin trong trà xanh [3]

Catechin ức chế hữu hiệu các gốc tự do, chống béo phì, có tác dụng diệt khuẩn

E.coli O-157. EGCG chống lại tổn thương DNA và các bướu trong phổi do gốc tự do

gây ra, ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư, ngăn ngừa bệnh tiểu đường phát

triển, bảo vệ tim, giảm đột biến gen, giảm nguy cơ viêm khớp …


- 21 -

Bảng 2.3: Khả năng ức chế các gốc tự do của các hợp chất trong trà xanh

Tên hợp chất trong trà xanh

% Ức chế gốc tự do DPPH

% Ức chế gốc Superoxide

Ức chế men Lipoxygenase IC (μg/ml)

EGCG 74.8 69.4 4.6 EGC 59.3 39.9 7.7 ECG 36.1 23.9 6.1 EC 32.0 11.2 40.6

[3]

Củ nghệ

Tên khoa học: Curcuma domestica Valet., Curcuma longa L.

Họ: gừng (Zingiberaceae)

Thành phần hóa học: củ nghệ Ấn Độ: nước 13.1%, protein 6.3%, chất béo 5.1%, xơ

2.6%, carbohydrate 69.4%, chất khoáng 3.5%. Carotenoid quy ra theo vitamin A là

50UI/100g.

Các hoạt chất trong củ nghệ có: các chất màu phenolic chủ yếu là các dẫn xuất của

diarylheptan. Trong đó có 3 chất chủ yếu là curcumin I, II, III. Chất màu curcumin 0.3% tan

được trong nước.

Các hợp chất tinh dầu nghệ khoảng 1 – 5% trong đó có tumeron, zingibéren, cineol.

Tinh dầu nghệ được xác định là những sesquiterpen ceton arturmeron.

Tác dụng dược lý: Chống viêm cấp tính và mạn tính thông qua cơ chế chống oxy hóa

tại chỗ viêm do sắc tố curcumin, bảo vệ mô tế bào, phòng chống bệnh thận, giảm hội chứng

Azheimer’s, chống xơ vữa động mạch, ngăn ngừa ung thư, bảo vệ tim do làm giảm lượng

cholesterol và lipid máu.


- 22 -

Hình 2.5: Các hợp chất curcumin trong củ nghệ [65]

2.3.2. Thực phẩm chức năng từ nguồn nguyên liệu sinh vật biển và động vật

2.3.2.1. Nguồn nguyên liệu từ rong biển

Thành phần hóa học của rong biển

Sắc tố: Thành phần sắc tố khác nhau tùy từng loại rong: diệp lục tố, sắc tố đỏ, sắc tố

vàng, sắc tố nâu, sắc tố xanh lam…

Glucid: Bao gồm nhiều loại: monosaccharide, diosaccharide, polysaccharide. Mono-

và Dio-saccharide: Mannitol (rong nâu); Galacetose, mannose (rong đỏ). Disaccharide: Đối

với rong nâu thường có các chất: Alginic, Acid fucxinic, Fuccoidin, Laminarin, Cellulose.

Đôi với rong đỏ gồm: Agar, Carrageenan, Furcellaran, Xilan, Itridophican, cellulose, tinh

bột rong đỏ.

Protein: Hàm lượng protein tùy từng loại rong, thường protein trong rong nâu không

cao bằng rong đỏ nhưng nó khá hoàn hảo nên có thể sử dụng làm thực phẩm.

Ngoài ra còn có chất khoáng, nước, lipid…


- 23 -

Vai trò của rong biển

Là nguồn thực phẩm của con người:

Rong biển được coi là thực phẩm cho sức khỏe. Ở Nhật có những món ăn đặc trưng:

Nori (từ loài rong Phorphyra), Kombu (từ loài rong Laminaria), Wakame (từ loài rong

Undaria pinnatifida)…Ngoài ra còn nhiều món ăn được chế biến kết hợp với tảo bẹ, phổ tai

như phổ tai nấu với cá, thịt, nấu cháo với gạo hay món súp phổ tai.

Giá trị dược liệu và phòng chống bệnh tật của rong biển:

Rong biển được xem như là thuốc trị hen suyển, dạ dày, thuốc nhuận tràng, ngừa sạn

túi mật, chống nhiễm trùng đường tiết niệu, kiện toàn khả năng sinh dục, thuốc trị phong

thất lại thêm tính chất an thần và cũng hữu dụng với bệnh ngoài da.

Rong biển có tác dụng phòng và trị các bệnh: Ung thư, tim mạch, hạ chất mỡ, làm

loãng máu ngăn ngừa sự đóng cục tắc ngẵn mạch máu, bệnh bướu cổ do thiếu iod…

Ngoài ra, theo nghiên cứu của trường đại học New South Wales, Úc thì trong rong biển

ở Úc có chứa hợp chất furanone, nó có tác dụng ngăn chặn và phá vỡ khu trú của vi khuẩn,

nơi mà vi khuẩn tụ tập lại thành từng đám được bảo vệ bởi chất nhầy có cấu trúc bằng

polysaccharide – gọi đó là biofilm, chính biofilm bảo vệ cho vi khuẩn tránh được tác động

kháng sinh, kháng thể, nhờ đó mà vi khuẩn không bị tiêu diệt, tồn tại được trong cơ thể.

Chất Frucosterol mới tìm ra gần đây có tác dụng ngăn ngừa việc tạo ra các cục máu

đông trong mạch máu. Một số nguyên tố vi lượng trong rong vô cùng cần thiết cho cơ thể

con người như Selenium có chứa trong rong khá cao: 0,3-0,4 mg/kg vật chất khô, chất này

tham gia cấu trúc trong enzyme Glutathion peroxidase có tác dụng phá hủy các gốc tự do

trong cơ thể.

Rong biển giúp hệ thống miễn dịch hoạt động tốt và gia tăng hoạt động tổng thể của

con người. Nó cũng giúp quá trình trao đổi chất hiệu quả hơn và chống lại sự lão hóa.

Rong biển có chứa nhiều chất khoáng như kẽm, thiếc, selen, crom, antimon, bimut,

những chất ít tìm thấy trong các loại thực phẩm ngày nay. Các loại vitamin, bao gồm


- 24 -

vitamin E, A, C và B12 cũng có một hàm lượng khá lớn trong rong biển, chúng đem lại cho

con người đầy đủ dưỡng chất.

2.3.2.2. Nguồn nguyên liệu từ động vật

Chitosan Oligosaccharide: chất xơ trong động vật

Chitosan Oligosaccharide là một đường amin chức năng, không độc. Nó được ly trích

từ vỏ tôm, cua. Chitosan oligosaccharide là một hỗn hợp oligomers của D-glucosamine.

Trọng lượng phân tử trung bình của nó khoảng 2000.

Chitosan Oligosaccharide bị phân hủy bởi sự thủy phân do enzyme chitosanase. Sản

phẩm thủy phân chitosan có hai dẫn xuất là chitin và chitosan. Hỗn hợp chitin và chitosan

được gọi là chitosan vì chitosan chiếm tỷ lệ cao hơn nhiều so với chitin.

Chitosan Oligosaccharide đi qua dạ dày và ruột non mà không bị phân hủy và cũng

không hấp thu. Vì vậy, Chitosan Oligosaccharide đổ xuống kết tràng, ở đây nó bị enzyme

của vi sinh vật có ích trong ruột già phân giải lên men sinh acid có tác dụng như một

prebiotic, ức chế vi khuẩn lên men thối gây bệnh đường ruột. Như vậy Chitosan

Oligosaccharide có hiệu quả lên sức khỏe thể hiện qua các chức năng nổi bậc: Gắn với chất

béo và ức chế sự hấp thu chất béo nên góp phần chống béo phì, giảm thấp cholesterol xấu

LDL-cholesterol, tăng cholesterol tốt HDL-cholesterol, chống ung thư, chống nhiễm khuẩn,

thúc đẩy sự sản xuất kháng thể, hạ thấp đường huyết, kiểm soát huyết áp, phòng ngừa chứng

táo bón, làm tăng sự hấp thu Calcium, phòng ngừa bệnh tim mạch, làm giảm mức acid uric

trong máu.

Sữa ong chúa

Tác dụng của sữa ong chúa:

Tăng cường năng lượng cho hoạt động các cơ quan quan trọng trong cơ thể như: não

bộ, cơ tim, tuyến thượng thận…thông qua việc cung cấp năng lượng và thúc đẩy quá trình

hấp thu các chất sinh năng lượng và biến dưỡng nó.


- 25 -

Sữa ong chúa thúc đẩy tái tạo cơ quan bị hư tổn, thúc đẩy hình thành tế bào mới. Mặc

khác sữa ong chúa cũng ngăn chặn hiện tượng thoái biến của tế bào hiện hữu. Vì vậy sữa

ong chúa áp dụng rất tốt cho trẻ em, người già, thai phụ, người bệnh phục hồi sau cơn đau

nặng.

Giúp giải độc gan, duy trì tính đàn hồi của mạch máu, phòng trị chứng xơ cứng mạch

máu.

Phục hồi huyết cầu đối với người bị thiếu máu do: sốt rét, xạ trị hay quang tuyến X

trong trường hợp trị bệnh nhân ung thư.

Điều hòa lượng đường trong máu, đồng thời cải thiện trình trạng tổng quát của người

bệnh qua ảnh hưởng trên hệ thần kinh trung ương và mạng lưới tuần hoàn vi mạch, từ đó có

tác dụng tốt đối với người bị bệnh tiểu đường.

Ngoài ra còn nhiều tác dụng khác từ sữa ong chúa. Tuy nhiên không nên lạm dụng hay

cường điệu vai trò của sữa ong chúa, sữa ong chúa có ảnh hưởng tích lũy do đó không nên

dùng thường xuyên.

Sữa chua

Đây là thực phẩm bổ dưỡng cao, đồng thời cũng là loại thuốc ngăn ngừa bệnh viêm

ruột, tiêu chảy.

Sữa chua làm tăng tuổi thọ: kết quả thống kê trên nhiều quốc gia cho thấy số người thọ

trên 100 tuổi cao rõ rệt ở các địa phương có tập quán dùng sữa chua.

Một công trình nghiên cứu cho thấy những con bọ được nuôi bằng sữa chua có khả

năng miễn nhiễm vi trùng salmonella.

Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, một trong những loại vi sinh thường dùng để lên

men làm sữa chua, có tác dụng chống nhiễm trùng đường ruột một cách rõ rệt.

Năm 1963, bác sĩ Shahani đã ly trích 1 chất kháng sinh trong sữa chua đặt tên là

Acidophylline có tác dụng hữu hiệu không thua kém Penicilline. Đến nay người ta phát hiện


- 26 -

có tối thiểu 10 loại kháng sinh trong sữa chua không độc hại, dễ phân hủy trong môi trường,

không tồn dư trong cơ thể.

Khám phá gần đây nhất của Ý, Nhật Bản và Thụy Sĩ cho thấy sữa chua còn là tác chất

hưng phấn và kiện toàn hệ thống miễn nhiễm, sữa chua làm tăng hàm lượng kháng thể

chống vi khuẩn. Gần đây nhất người ta còn tìm thấy hàm lượng interferol có thể được gia

tăng gấp 3 lần trong máu của người có thói quen dùng sữa chua thường ngày.

Báo cáo đầu tiên từ Bulgarie về khả năng chữa lành ung thư trên sinh vật thí nghiệm

nuôi bằng sữa chua. Sau đó viện Ung thư New York đã chứng minh là sữa chua có thể ngăn

chặn sự phát triển của tế bào ung thư, vi khuẩn lactic trong sữa chua có khả năng ức chế

hoạt động của các yếu tố gây ung thư, ngăn chặn được các độc tố ruột sinh ung thư.

Như vậy, theo Metschnikow để cho sữa chua trở thành dược phẩm cần phải biến sữa

tươi thành sữa chua với thành phần vi sinh hữu ích, sau đó ứng dụng sữa chua như là dược

phẩm đặc hiệu.

Cá và chất dầu Omega trong cá

Tác dụng của cá và dầu cá biển:

Ảnh hưởng trên hệ thống tim mạch: Người ta nhận thấy bệnh ngạnh tắc mạch cơ tim là

nguyên nhân hàng đầu ở các quốc gia được mệnh danh là văn minh, hiện đại, tiêu thụ rất

nhiều thịt động vật nuôi công nghiệp. Trong khi đó bệnh này rất xa lạ với dân tộc Esquimo

vốn có thói quen ăn cá biển mỗi ngày. Một công trình nghiên cứu tại Nauy cho thấy người

bị chứng máu đặc chỉ cần ăn mỗi ngày 100g cá biển thì sau 6 tuần thành phần của máu đã

trở lại bình thường mà không cần dùng thuốc, chất mỡ trong máu thậm chí còn tốt hơn

người ăn chay kiên thịt.

Tác dụng ngăn ngừa bệnh ung thư vú: Các chuyên gia ở trường đại học Rutgers, Hoa

Kỳ nhận thấy kích tố Prostaglandine có xu hướng tăng cao trong máu của người sống trong

vùng đang có ung bướu. Dầu gan cá với chất béo Omega có khả năng ngăn chặn sự hình

thành thoái quá của kích tố này, từ đó ngăn ngừa được bệnh ung thư vú.


- 27 -

Dầu cá còn dùng để trị thấp khớp, có khả năng trị thiên đầu thống và còn có hiệu quả

điều trị phục hồi cho người bị viêm thận mãn.

Cá biển và dầu cá Omega còn là sản phẩm dinh dưỡng thích hợp cho người cao huyết

áp.

Loài nhuyễn thể có vỏ: Trai, nghêu, sò, ốc

Trai là thực phẩm vô cùng quí giá nhờ vào hàm lượng kẽm trong thịt trai rất cao. Cơ

thể con người chỉ cần 15mg Zn mỗi ngày mà trong 100g thịt trai đã có đến 70mg Zn.

Các loại hải sản có vỏ cứng như: nghêu, sò, tôm, ốc cũng có tác dụng tương tự như

trai. Chất béo trong các hải sản này có chứa nhiều acid béo thiết yếu nên nó có tác dụng làm

giảm lượng mỡ no (LDL), nhưng nó có tác dụng cải thiện hàm lượng chất béo chưa no

(HDL) trong máu, HDL giúp ích cho việc vận chuyển cholesterol trên thành mạch, trong mô

bào về gan rồi thải ra ngoài theo dịch mật. Người ta còn phát hiện trong mỡ loài nhuyễn thể

có nhiều acid béo chưa no rất quan trọng như Docosahexenoic acid (DHA) rất cần để phát

triển màng tế bào não.

Nghêu, sò đã được nghiên cứu ở massachussets, các nhà khoa học đã chứng minh các

loại thực phẩm này cung cấp cho não bộ nhiều hoạt chất hưng phấn sự bài tiết kích tố nội

sinh để đẩy mạnh hoạt động tâm thần, thúc đẩy khả năng sáng tạo…

2.3.3. Thực phẩm chức năng từ nguồn nguyên liệu nấm

Nấm mèo, Mộc nhĩ

Tên khoa học: Auricularia polytricha

Là loại nấm có mũ giống tai mèo, mép nhăn nheo cuộn vào trong, mọc tự nhiên trên

các giá thể là cây gỗ đã mục.

Thành phần hóa học: Trong 100g mộc nhĩ chứa: 10,6g protein; 0,2g lipid; 65g glucid;

7,0g cellulose.

Tác dụng dược lý và giá trị phòng chống bệnh tật:


- 28 -

Nấm mèo là thực phẩm có giá trị vô cùng lớn để phòng chống bệnh tim mạch với khả

năng thay thế các loại thuốc làm loãng máu vốn có nhiều phản ứng phụ.

Các chuyên gia ở đại học Washington đã ly trích từ nấm mèo một hoạt chất chống

đông máu có tên gọi là Adenosine với cơ chế tác động tương đồng với Aspirine.

Nấm mèo có tác dụng kéo dài tuổi thọ, dùng để trị thiên đầu thống hoặc ngăn ngừa

biến chứng viêm tỉnh mạch hậu sản.

Nấm mèo còn có khả năng phòng chống vi khuẩn và ngăn chặn sự phát triển của tế bào

ung thư.

Tuy nhiên để phát huy khả năng làm loãng máu, không cần phải ăn nhiều nấm mèo,

chỉ cần ăn 10g nấm mèo mỗi ngày là đủ. Tuyệt đối không nên ăn sống nấm mèo, tốt nhất

nên nấu canh, nấu miếng, hầm với thuốc bắc…

Nấm đông cô, nấm hương

Tên khoa học: Lentinula edodes

Thành phần các hoạt chất dược phẩm: Nổi bật nhất là các dẫn suất mạch vòng có chứa

lưu huỳnh như cyclohexasulphur.

Hoạt tính dược phẩm của nấm đông cô:

Hoạt tính kháng sinh, kháng khuẩn, kháng virus của nấm: lentinan (một chế phẩm của

nấm hương) có tác dụng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm bệnh và ký sinh trùng,

chống lại sự viêm nhiễm của virus viêm não, chống bội nhiễm khuẩn ở các bệnh nhân bị

AIDS. Gần đây hoạt tính chống HIV-1, giảm độc tính của AZT bởi lentinan và các dẫn xuất

cũng được chứng minh, đặc biệt sulphat lentinan ức chế rất mạnh hoạt tính của reverse

transcriptase (enzyme sao chép ngược của HIV).

Hoạt động làm giảm cholesterol: Chất Eritidenin gồm Lentysin và Lentinacin do

Mizuno (1990,1993) xác định trong quả thể nấm hương nuôi trồng, chất này có khả năng

làm giảm mức cholesterol và các lipid trung tính trong máu, vì vậy nó có tác dụng tốt với

những người có bệnh tim mạch và huyết áp.


- 29 -

Nấm sò, nấm bào ngư

Tên khoa học: Pleurotus ostreatus

Nấm phân bố ở Bắc Mỹ, châu Á, châu Âu và một số nơi khác.Chúng sống trên thực

vật hoại sinh, đóng vai trò chìa khóa trong việc phân hủy cây gỗ đã chết để giữ cân bằng hệ

sinh thái rừng.

Tác dụng dược lý của dịch chiết từ nấm sò:

Dịch chiết nấm sò có khả năng kiểm soát có hiệu quả bệnh tim mạch và cholesterol

máu. Những nghiên cứu gần đây cho thấy nấm sò hạ thấp mức cholesterol và triglycerol

trong máu rất tốt.

Nấm sò có chứa mevinolin và một số hợp chất tương đối ít, có tác dụng cạnh tranh ức

chế enzyme HMG CoA reductase, đây là enzyme rất quan trọng để tổng hợp cholesterol.

Chính vì vậy khi sử dụng nấm này để ăn hoặc chiết xuất hoạt chất chữa bệnh có công dụng:

chống ung thư, tăng cường đáp ứng miễn dịch, chống lại sự viêm nhiễm, chống lại virus gây

bệnh, đồng thời nó cũng có tính chất như một kháng sinh.

Nấm Linh chi

Tên khoa học: Ganoderma lucidus

Nấm Linh chi thường sống hoại sinh trên gỗ mục như: gỗ lim, lim xẹt, muồng đen,

me…

Thành phần hóa học: Sterol: Ergosterol 0,3-0,4%, enzyme: Lysozyme, protease acid

và một số enzyme khác, protid: protein hòa tan, polypeptide, acid amin, đường: trehalose,

manitol, amin: betain, alkan: tetracosan, hentricotan, các acid béo, polysaccharide và nhiều

nguyên tố khoáng khác.

Tác dụng dược lý của nấm Linh chi:


- 30 -

Tác dụng lên đường huyết: Cao nước Linh chi làm giảm đường máu ở chuột nhắt

trắng. Các glucan A, B và C có tác dụng hạ đường máu rõ rệt. Đối với người Linh chi có tác

dụng làm ổn định đường huyết, nhất là những người bị bệnh đái tháo đường.

Tác dụng lên tim mạch: Linh chi tác dụng tốt lên bệnh đau thắt ngực, bệnh động mạch

vành, điều hòa và ổn định huyết áp. Đối với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch, dùng nấm Linh chi

có tác dụng giảm cholesterol toàn phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỷ trọng cao trong máu,

làm giảm hệ số sinh bệnh. Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu, giảm nồng độ

mỡ trong máu, giảm co tắc mạch, giải tỏa cơn đau thắt tim.

Tác dụng chống viêm: Viêm phế quản, hen, viêm gan mãn tính, thấp khớp, bệnh

đường tiêu hóa. Đối với bệnh về hô hấp, nấm Linh chi đem lại kết quả tốt, nhất là với những

ca điều trị viêm phế quản dị ứng, hen phế quản tới 80% có tác dụng giảm và làm nhẹ bệnh

theo hướng khỏi hẳn.

Đối với bệnh ung thư: Nấm Linh chi làm tăng cường và khôi phục hệ miễn dịch, vì vậy

khi điều trị ung thư cho kết quả tốt, khối u tiêu biến hoàn toàn.

Nấm Đông trùng hạ thảo

Bản chất là dạng ký sinh của loài nấm Cordyceps sinensic thuộc nhóm Ascomycetes

trên cơ thể ấu trùng của loài Hepialus Fabricius.

Thành phần hóa học: Protein: các dạng protein, peptide, có mặt đầy đủ các loại acid

amin; cacbohydrate: các dẫn xuất bắt nguồn từ D-mannitol, các dạng đường đơn

Oligosaccharide; đường đa Polysaccharide; sterol, acid béo, một số acid hữu cơ khác; Các

loại vitamin (B1, B2, B12, E, K) và các loại khoáng chất.

Thành phần hoạt chất và dược lý của nó:

Adenosine: Chen và Chu (1996) đã nghiên cứu được tính chất của 2’deoxyadenosine

áp dụng trong phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân và quang phổ hồng ngoại.

Cordycepin: Cordycepin (3’deoxyadenosine) và cordycepic acid (D-mannitol) là

những hợp chất đầu tiên ở loài Cordyceps có vai trò đáp ứng kháng khối u bên cạnh chức


- 31 -

năng hỗ trợ hệ thống miễn dịch. Cơ chế này được thực hiện khi có sự thay đổi trong cấu trúc

nucleoside Adenosine bình thường. Adenosine bị mất oxy, không hình thành cầu nối giữa

các nucleoside gần nhau trong thang xoắn DNA, không giữ được cấu trúc bền vững nữa.

Các tiến hành sao chép kế tiếp của DNA cũng không thể thực hiện khi có sự thay thế

Adenosine bằng Cordycepin trong phân tử DNA, dẫn đến sự tổng hợp mới DNA không thể

xảy ra, không có sự phân chia hay hình thành tế bào mới. Điều này ít ảnh hưởng đến sự

sống của tế bào động vật có vú vì ở mức độ phân tử tế bào có cơ chế sữa sai DNA. Tuy

nhiên sự thay thế này rất có ý nghĩa đối với hầu hết tế bào vi khuẩn và virus (bao gồm cả

virus HIV) vì chúng không có cơ chế sữa sai.

Các loại đường: Nhóm vòng 5-Cacbon bao gồm Cyclofurans với chức năng chưa rõ.

Nhóm beta-Glucan và Beta-Mannan tạo lien kết chéo tạo poly beta-mannan. Nhóm các

đường polymer 5-6 Cacbon tham gia liên kết tạo chuỗi trong cầu nối alpha và beta.

Hydroxyethyladenosine, HEAA: là nhóm hiếm thấy và hầu như không tìm thấy ở

nguồn nào khác trong tự nhiên.

Nhóm ức chế miễn dịch, chịu trách nhiệm chống sự thải loại cơ thể: Cyclosporin, một

vài hợp chất khác gần họ Cordyceps…

Các polysaccharide: Những polysaccharide bắt nguồn từ Cordycepic acid có giá trị cao

trong điều trị bệnh tăng Glucose huyết, chống khuẩn, chống khối u.

Các protein và những hợp chất chứa Nito, nhóm sterol và những thành phần khác. [3]


- 32 -

Hình 2.6: Giới thiệu hình ảnh một số loại nấm [65]

Chương 3: Phương pháp làm giàu các chất dinh dưỡng chức năng

- 33 -

CHƯƠNG 3

PHƯƠNG PHÁP LÀM GIÀU CÁC CHẤT DINH DƯỠNG CHỨC NĂNG

3.1. Chọn giống cây trồng vật nuôi giàu chất dinh dưỡng chức năng

Từ trước đến nay, khi tuyển chọn giống cây trồng, vật nuôi người ta thường chú ý đến

chỉ tiêu năng suất và thị hiếu về hình thức sản phẩm của người tiêu dùng, ít khi lựa chọn dựa

trên chỉ tiêu hàm lượng các chất dinh dưỡng chức năng. Điều này đã dẫn tới giá trị các hoạt

chất chức năng dần dần suy giảm. Vì vậy giá trị phòng bệnh của loại thực phẩm đó không

còn như gốc ban đầu của chúng. Con người ăn nhiều chất dinh dưỡng sinh năng lượng dẫn

đến bệnh béo phì ngày càng nhiều. Cần có sự nhận thức đúng đắn hơn về mục tiêu chọn

giống, từ đó tạo ra thực phẩm ngày càng bổ dưỡng hơn, có ý nghĩa phòng bệnh để bảo vậ

sức khỏe cho con người ngày càng tốt hơn. Sau đây là những gợi ý trong công tác chọn

giống theo hướng này:

− Đối với giống rau cải: Ví dụ giữa các giống cải bắp và cải bẹ người ta nhận thấy loại

trắng thường có hàm lượng carotene rất thấp hoặc không có. Trái lại những giống có màu

xanh thì bao giờ cũng có hàm lượng caroten cao hơn, có tác dụng ngăn ngừa nguy cơ các

loại ung thư niêm mạc.

− Đối với các loại củ quả thì loại có màu vàng, màu đỏ như khoai lang nghệ, bí đỏ, cà

chua, gấc, thanh long ruột vàng, ổi ruột hồng bao giờ cũng có hàm lượng carotene, lycopen,

xantophyll…cao hơn loại có ruột trắng. Đây là những chất chống oxy hóa khá mạnh nên nó

có tác dụng bảo vệ màng tế bào, từ đó cũng có tác dụng ngăn ngừa nguy cơ ung thư.

− Đối với các loại hạt cốc thì loại có màu vàng có chứa nhiều carotenoid hơn so với

loại trắng. Ngày nay ở Ấn Độ, các nhà khoa học đã tạo ra được giống lúa có ruột vàng rất

giàu caroten, đó có thể là một đóng góp rất lớn trong việc phòng ngừa có hiệu quả bệnh

thiếu vitamin A ở trẻ em thuộc các vùng nghèo.


- 34 -

Với những kĩ thuật hiện đại trong công nghệ sinh học, con người có thể nhanh chóng

đạt được thành tựu đưa các gen điều khiển tổng hợp ra nhiều các hoạt chất chức năng trong

các loại thực phẩm thông thường để biến nó thành thực phẩm chức năng có tác dụng phòng

ngừa bệnh tật, bảo vệ sức khỏe cho nhân loại ngày càng tốt hơn.

3.2. Làm giàu các chất dinh dưỡng chức năng thông qua con đường chế biến thực

phẩm

Trước đây, mục tiêu chính của công nghệ sau thu hoạch là để chế biến thực phẩm, bảo

vệ thực phẩm được lâu hơn, làm cho thực phẩm trở nên ngon hơn, hấp dẫn hơn, quyến rũ

hơn đối với người tiêu dùng. Ngày nay, tuy các mục tiêu đó vẫn còn tồn tại, song người tiêu

dùng còn đòi hỏi ở thực phẩm chế biến phải có giá trị phòng ngừa bệnh tật, bảo vệ sức khỏe

tốt hơn, an toàn hơn khi tiêu thụ chúng. Để làm được điều này cần phải:

− Cải tiến công nghệ chế biến cũ làm hư hại các hoạt chất sinh học chức năng trong

nguyên liệu thực phẩm như: hấp khử trùng ở nhiệt độ cao, sấy khô và bảo quản lâu dài trong

không khí, phơi nắng kéo dài dưới tia bức xạ mặt trời… sang công nghệ mới, ít làm hư hỏng

vitamin và các hoạt chất sinh học khác như: khử trùng nhanh bằng tia cobalt kết hợp với tiệt

trùng bằng phương pháp pasteur, sấy chân không ở nhiệt độ thấp, sử dụng phương pháp bao

bì hút chân không để cách ly thực phẩm với không khí.

− Thông qua con đường chế biến có thể bổ sung, tăng cường các chất dinh dưỡng và

hoạt chất chức năng. Ví dụ như: sữa cho người cao tuổi người ta bổ sung nhiều calcium hơn,

rút ra nhiều chất béo hơn so với bình thường để ngăn bệnh loãng xương. Sữa cho trẻ em thì

nên giàu chất béo, có nhiều acid béo thiết yếu, đặc biệt là DHA để tham gia cấu tạo màng tế

bào thần kinh, giúp cho sự phát triển não bộ của trẻ được thuận lợi, làm tăng chỉ số thông

minh. Muối ăn cho người vùng cao xa biển và vùng có nguy cơ bệnh bướu cổ nên bổ sung

Iod (KI) để chống lại bệnh tuyến giáp do thiếu Iod… và còn nhiều ví dụ khác nữa về việc

làm giàu chất dinh dưỡng chức năng qua con đường chế biến thực phẩm. Ngành chế biến

thực phẩm ở Việt Nam tuy còn rất trẻ so với Châu Âu, nhưng quan điểm ăn để phòng bệnh

và chữa bệnh đã có từ thế kỷ 17 (thời kì của nhà Bác học Y học phương Đông – Hải


- 35 -

Thượng Lãng Ông), chúng ta có rất nhiều nguyên liệu nhiệt đới để chế biến thành thực

phẩm chức năng, cần có những con người nhiệt tâm và thực tiễn để biến ý tưởng đó trở

thành hiện thực trong thời đại ngày nay.

3.3. Thông qua kĩ thuật, chăn nuôi để làm gia tăng hàm lượng các hoạt chất sinh học

chức năng trong thực phẩm của người

Đối với các giống cây trồng có năng suất cao, ngắn ngày thường sự tích lũy các

nguyên tố vi lượng cần thiết trong sản phẩm ít hơn giống cây trồng năng suất thấp, thời gian

sinh trưởng kéo dài. Một số vùng đất nghèo một vài nguyên tố vi lượng nào đó thì hàm

lượng của nó cũng thấp trong sản phẩm cây trồng. Từ nguyên liệu thức ăn gia súc thiếu yếu

tố dinh dưỡng vi lượng sẽ gây cho thú trạng thái thiếu cân đối. Con người ăn các sản phẩm

cây trồng vật nuôi như thế cũng sẽ bị bệnh thiếu vi chất dinh dưỡng. Để khắc phục sự khiếm

khuyết này, người ta giải quyết vấn đề bằng hai con đường: Bổ sung vào thức ăn những vi

chất dinh dưỡng thiếu hoặc thông qua con đường bón phân để làm giàu yếu tố vi lượng

thiếu hụt trong sản phẩm cây trồng.

Trong thức ăn chăn nuôi nếu bổ sung đầy đủ các yếu tố dinh dưỡng chức năng và có

giải pháp kĩ thuật để các hoạt chất chức năng hấp thu nhiều và ít bị biến đổi thì sẽ tích lũy

cao trong sản phẩm chăn nuôi. Từ đó cung cấp thực phẩm có giá trị phòng bệnh cho người.

Ví dụ người ta bổ sung Selen hữu cơ (Se-Plex) vào thức ăn để làm tăng lượng Se trong thịt

chống bệnh thoái hóa cơ do thiếu Se trong thực phẩm người. Ở Nam Triều Tiên và một số

quốc gia phát triển trên thế giới, thịt heo nuôi bằng thức ăn có bổ sung Sel-Plex bán giá cao

hơn bình thường. Bổ sung acid Omega-3 vào thức ăn gà đẻ để làm giàu acid béo thiết yếu,

làm giảm lượng cholesterol trong trứng có tác dụng phòng ngừa bệnh tim mạch. [3]

Chương 4: Những quy định chung về quản lý thực phẩm chức năng

- 36 -

CHƯƠNG 4

NHỮNG QUY ĐỊNH CHUNG VỀ QUẢN LÝ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG TRÊN THỊ TRƯỜNG

4.1. Qui định về sự công nhận tác dụng các chất dinh dưỡng chức năng lên sức khỏe

Theo quan điểm của ADA, Mỹ thì các loại thực phẩm chức năng phải được làm rõ

ràng bản chất khoa học của nó đối với sức khỏe. Khi đã có kết quả thử nghiệm lâm sàng rõ

ràng trên cơ thể, làm sáng tỏ tác dụng của các hoạt chất sinh học trong thực phẩm chức năng

thì mới được sự chứng nhận của FDA (Food and Drug Administration). Sau đây là các vấn

đề của thực phẩm chức năng cần phải được cơ quan quản lý nhà nước về thực phẩm và

thuốc công nhận:

4.1.1. Quản lý tiêu chuẩn về mặt khoa học của các chất dinh dưỡng chức năng

Có thể dựa vào các cơ quan khoa học như: Viện hàn lâm, Viện nghiên cứu khoa học kỹ

thuật, Viện nghiên cứu tiêu chuẩn chất lượng để xây dựng tiêu chí chứng nhận một loại thực

phẩm chức năng mới cho tương lai. Ở Mỹ có cơ quan chuyên trách là FDA làm việc này.

Họ có quyền hạn để quản lý và điều hành cấp Quốc gia. Có 5 yêu cầu cần phải có chứng

nhận cho một loại hoạt chất chức năng nào đó trong thực phẩm chức năng:

Yêu cầu về hàm lượng dinh dưỡng: Cho biết rõ sự hiện diện của chất dinh dưỡng chức

năng đặc biệt ở mức chắc chắn.

Yêu cầu về cấu trúc hóa học và chức năng của chất dinh dưỡng chức năng: Phải được

làm rõ trong thực phẩm và ảnh hưởng của nó đến chức năng sinh lý cơ thể.

Yêu cầu tác dụng lên sức khỏe: Phải được phát triển trong mối liên hệ giữa chế độ ăn

và những nguy cơ bệnh tật.

Xác nhận sức khỏe: Mối liên quan giữa những thành phần trong khẩu phần ăn và nguy

cơ bệnh tật.


- 37 -

4.1.2. Thực phẩm chức năng yêu cầu phải được chấp nhận của cơ quan quản lý nhà

nước về an toàn thực phẩm và dược phẩm trước khi đưa ra thị trường tiêu thụ

Bất cứ thực phẩm nào, dù là thực phẩm thông thường khi đưa ra thị trường mua bán

đều phải chịu sự quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm. Tùy theo mỗi nước mà cơ quan

quản lý đó có tên gọi khác nhau. Ở Việt Nam là cục vệ sinh an toàn thực phẩm trong Bộ Y

tế. Ở Mỹ là Hiệp hội thực phẩm và thuốc FDA. Riêng thực phẩm chức năng ngoài sự quản

lý của thực phẩm thông thường, còn phải chịu sự quản lý về thành phần và tác dụng của các

dược chất chức năng phòng chống bệnh tật trong thực phẩm. Tác dụng lâm sàng của thực

phẩm phải được minh chứng bằng những kết quả thử nghiệm khoa học chính xác, khi đó

mới được cơ quan quản lý an toàn thực phẩm cho phép ghi trên nhãn bao bì.

Ngoài ra, các chất có chức năng sinh học trong thực phẩm còn cần phải đạt đến một

liều lượng thích hợp thì chúng mới phát huy được chức năng sinh học, vì vậy cần có khuyến

cáo liều lượng sử dụng hợp lý.

4.2. Qui định về tên gọi và dán nhãn, lưu hành trên thị trường

4.1.1. Mục tiêu của dán nhãn thực phẩm thông thường và thực phẩm chức năng

Dán nhãn sản phẩm là giấy cam kết của nhà sản xuất với khách hàng được sự công

nhận của cơ quan quản lý nhà nước, là cơ sở để quản lý vệ sinh an toàn thực phẩm.

Dán nhãn đối với thực phẩm chức năng rất cần thiết để hướng dẫn người tiêu dùng biết

cách sử dụng thực phẩm chức năng phù hợp với tình trạng sức khỏe của mình, đề phòng

chống bệnh tật trong trường hợp cụ thể.

Dán nhãn còn mang tính chất quảng cáo, nhưng phải hoàn toàn đúng với tác dụng thật

mà thực phẩm chức năng mang lại, không nên nói quá mức khả năng của nó.

4.1.2. Cơ quan quản lý dán nhãn thực phẩm

Dán nhãn thực phẩm ở mỗi quốc gia, ví dụ như ở Mỹ phải dựa trên các cơ quan quản

lý nhà nước về thực phẩm như: FDA (Food and Drug Administration) và cơ quan thanh tra

an toàn thực phẩm FSIS (Food Safety and Inspection Serviec). FDA qui định dán nhãn cho


- 38 -

tất cả các thực phẩm, ngoại trừ thịt gia súc và gia cầm phải có thêm một cơ quan quản lý

thanh tra an toàn thực phẩm FSIS và sự quản lý của Bộ Nông nghiệp Mỹ USDA. Ở Việt

Nam chưa có tổ chức này, nhưng có Cục quản lý vệ sinh an toàn thực phẩm, Cục thú y, Bộ

Nông nghiệp. Có thể coi đây là những cơ quan chịu trách nhiệm quản lý dán nhãn thực

phẩm để hướng dẫn người tiêu dùng biết cách chọn lựa thực phẩm.

Hoạt động giáo dục và dán nhãn dinh dưỡng cho thực phẩm là hoạt động phải tiến

hành song song. Người tiêu dùng có biết được tác dụng dinh dưỡng và an toàn thực phẩm

thì mới tìm hiểu trên nhãn thực phẩm để chọn mua. Để tránh sự gian lận của nhà sản xuất

thực phẩm và sự nhầm lẫn cho người tiêu dùng, nhất thiết phải có cơ quan kiểm tra và quản

lý các chỉ tiêu đăng ký trên mặt hàng thực phẩm hay nói khác đi là nhãn hiệu thực phẩm.

Đối với nhà sản xuất thực phẩm thì dán nhãn thực phẩm là tờ đăng ký chất lượng hàng hóa

của họ với cơ quan quản lý thực phẩm nhà nước. Đối với người tiêu dùng thì dán nhãn thực

phẩm là sự cam kết của nhà sản xuất đối với khách hàng, là sự hướng dẫn sử dụng cho

khách hàng.

Trong thời kỳ công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, ngày càng có nhiều hàng hóa

thực phẩm chế biến sẵn, ngày càng giao lưu nhiều nước trên thế giới. Hàng hóa mà không

có nhãn mác sẽ không được giao lưu mua bán không những trên thế giới mà ngay cả trong

nước cũng vậy. Hàng hóa nhãn mác lung tung, không theo khuôn mẫu sẽ rất khó quản lý, tất

yếu sẽ không được lưu thông mua bán trên thị trường. Vì vậy, qui định kích thước và các

chỉ tiêu công bố trên nhãn mác như thế nào cần có sự thống nhất chung không những trong

phạm vi khu vực mà cả trên thế giới. [3]

Phần 2: Ứng dụng công nghệ di truyền trong sản xuất thực phẩm chức năng

SVTH: Nguyễn Kiều Oanh 39

PHẦN 2

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN TRONG

SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Chương 1: Thành tựu phát triển của thực phẩm chuyển gen


CHƯƠNG 1

THÀNH TỰU PHÁT TRIỂN CỦA THỰC PHẨM CHUYỂN GEN

1.1. Tình hình phát triển của thực phẩm chuyển gen trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.1. Trên thế giới

1.1.1.1 Thực vật

Tình hình chung :

Từ năm 1996 đến năm 2007, sau 12 năm được đưa vào canh tác đại trà, mang lại lợi

ích ổn định và bền vững, cây trồng CNSH đang được trồng ngày càng nhiều trên toàn thế

giới. Năm 2007 là năm thứ 12 liên tiếp diện tích cây trồng CNSH tiếp tục được mở rộng.

Đáng chú ý, diện tích trồng tiếp tục tăng 2 con số, đạt 12% tương đương với 12,3 triệu

héc-ta (30 triệu mẫu) – mức tăng cao thứ nhì trong vòng 5 năm trở lại đây. Diện tích đất

canh tác cây CNSH lên tới 114, 3 triệu héc-ta. Trong 12 năm đầu được đưa vào canh tác,

cây trồng CNSH đã mang lại nhiều lợi ích về kinh tế và môi trường cho nông dân ở cả

các nước công nghiệp cũng như các nước đang phát triển, nơi hàng triệu người nông dân

nghèo cũng được hưởng những lợi ích về mặt xã hội và nhân đạo, góp phần giúp họ xóa

bỏ nghèo đói [1].

Năm 2007, Hoa Kỳ, Argebtina, Brazil, Canada, Ấn Độ và Trung Quốc là các nước

đưa cây trồng CNSH vào canh tác nhiều nhất. Hoa Kỳ vẫn dẫn đầu thế giới với 57,7 triệu

héc-ta (chiếm 50% diện tích đất trồng cây CNSH trên thế giới). Đáng chú ý là 63% ngô

chuyển gen, 78% bông chuyển gen và 37% các loại cây chuyển gen khác ở Hoa Kỳ là các

sản phẩm mang nhiều gen kết hợp (các sản phẩm kết hợp nhiều đặc tính) có chứa hai hay

ba đặc tính và đem lại nhiều lợi ích trên một cây trồng. Xu thế của tương lai là sử dụng

những loại cây trồng công nghệ sinh học mang kiểu gen kết hợp này nhằm đáp ứng nhu

cầu của nông dân và người tiêu dùng [1].

Trong 12 năm vừa qua, các nhà khoa học đã nỗ lực tạo ra giống cây trồng mang tính

chống chịu tốt hơn đối với các yếu tố sinh học gây ra bởi côn trùng cỏ dại và bệnh cây.



Hiện nay các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu các loại cây như sắn, khoai

lang, cây lúa miến và rau để giúp đa dạng hoá và cân bằng chương trình phát triển cây

trồng công nghệ sinh học.

Bảng 1.1: Diện tích cây trồng Công nghệ sinh học năm 2007 trên thế giới

Thứ tự Nước Diện tích (triệu héc-ta)

Cây trồng CNSH

1* USA* 57.7 Đậu tương, ngô, bông, cải canola, bí, đu đủ, cỏ alfalfa

2* Argentina* 19.1 Đậu tương, ngô, bông 3* Brazil* 15.0 Đậu tương, bông 4* Canada* 7.0 Cải canola, ngô, đậu tương 5* India* 6.2 Bông 6* China* 3.8 Bông, cà chua, cây dương,

thuốc lá, đu đủ, hạt tiêu 7* Paraguay* 2.6 Đậu tương

Ngô, đậu tương, bông 8* South Africa* 1.8 9* Uruguay* 0.5 Đậu tương, ngô

Ngô 10* Philippines* 0.3 11* Australia* 0.1 Bông 12* Spain* 0.1 Ngô 13* Mexico* 0.1 Bông, đậu tương 14 Colombia <0.1 Bông, cẩm chướng 15 Chile <0.1 Ngô, đậu tương, cải canola

Ngô 16 France <0.1 17 18

Honduras <0.1 Ngô Czech Republic <0.1 Ngô

19 Portugal <0.1 Ngô 20 Germany <0.1 Ngô 21 Slovakia <0.1 Ngô

(*) 13 nước được xem là có diện tích trồng lớn, từ 50,000 ha trở lên.

[1]



Hình 1.1 : Diện tích cây trồng CNSH trên thế giới qua các năm từ 1996 đến 2007 [1]

Thành tựu trong lĩnh vực thực phẩm chức năng :

Cây lúa

Các nhà khoa học đã tạo ra giống lúa có hạt gạo vàng giàu carotene bằng con đường

chuyển gen. Gạo hạt vàng có tên gọi bằng tiếng Anh là “Golden rice”. Nó được tạo ra bởi

sự chuyển gen vào giống lúa truyền thống, làm cho giống lúa truyền thống có khả năng

tổng hợp beta-carotene. Có 3 gen điều khiển tổng hợp beta-carotene sau đây:

1. psy (phytoene synthase) từ cây thủy tiên hoa vàng (Narcissus pseudonarcissus)

2. lyc (lycopene cyclase) từ cây thủy tiên hoa vàng (Narcissus pseudonarcissus).

3. crt1 từ loài vi khuẩn trong đất là Erwinia uredovora

Gen psy, lyc và crt1 được chuyển vào hệ gen trong nhân cây lúa ở vị trí phía sau

đoạn promoter đặc biệt trong nội nhũ. Công trình này do Giáo sư Ingo Potrykus, người



Thụy Sĩ và Giáo sư Peter Beyer ở Đức sáng tạo ra và công bố vào năm 2000. Hiện nay

giống gạo hạt vàng này đang được nhân giống sản xuất ở Ấn Độ.

Cà chua

Năm 1994, giống cà chua biến đổi gen đầu tiên đã được FDA chấp nhận và đưa ra

thị trường. Tên thương mại giống cà chua này là “ Flavr Savr® tomato”. Trong cà chua

này người ta loại trừ gen tổng hợp ra enzyme polygalacturonase (enzyme này phân giải

pectin làm cho quả chín trở nên mau hư, khó bảo quản), giúp cho việc bảo quản cà chua

được lâu hơn, tốt hơn. Ngoài ra người ta còn cải thiện màu của cà chua đỏ hơn, giàu

lycopene hơn, tạo được độ đồng đều và chín cùng lúc, rất tiện cho cơ giới hóa thu hoạch

và chuyên chở.

Các nhà khoa học cũng đã tạo được giống cà chua chuyển gen giàu lycopene, kháng

sâu bệnh. Thông qua con đường chọn giống hay biến đổi gen, người ta có thể làm cho

hàm lượng lycopene trong giống cà chua mới cao gấp 3-4 lần so với giống cà chua bình

thường. FDA đã thử nghiệm và chấp nhận là giống cà chua chuyển gen này không tổng

hợp ra protein gây dị ứng, nó được tiêu hóa nhanh trong dạ dày, ruột. Giống cà chua

GMO này có thể làm tăng hàm lượng lycopene và beta-carotene, nếu được nhận gen điều

khiển tổng hợp chất này cao. Ngoài ra, giống cà chua này còn có những ưu điểm hơn về

mùi, vị và khả năng chống nấm gây bệnh tấn công.

Đậu tương

Đậu tương là một loại cây trồng lâu đời. Đây là loại cây chứa dầu đem lại lợi ích

kinh tế to lớn nhất trên thế giới. Hạt đậu tương có chứa tỷ lệ amino acid không thay thế

nhiều hơn cả thịt. Đậu tương được biến đổi gen để mang các tính trạng như khả năng

chống thuốc diệt cỏ và có hàm lượng oleic acid cao.

Cây cải dầu

Cây cải dầu được biến đổi gen với mục đích cải thiện chất lượng dinh dưỡng, đặc

biệt là hàm lượng chất béo hòa tan của loại cây này. Cây cải dầu được biến đổi gen mang

các tính trạng chống chịu thuốc diệt cỏ, có hàm lượng laurate và oleic acid cao.



Khoai tây

Khoai tây được xem là cây lương thực quan trọng thứ tư trên thế giới. Khoai tây

biến đổi gen mang các tính trạng như khả năng kháng côn trùng và kháng virus. Gần đây,

người ta đã nghiên cứu cho ra đời một loại khoai tây chuyển gen chứa vaccine ngừa viêm

gan B. Loại khoai tây này có khả năng kháng virus viêm gan B bằng cách tạo ra kháng

nguyên virus [24].

Đu đủ

Đu đủ là một loại cây trồng quan trọng ở khu vực Đông Nam Á. Đây là loại thực

phẩm chứa nhiều carotenoid, có chứa khoảng 7.2mg trong một quả.

Đu đủ còn được đánh giá cao trên lĩnh vực thực phẩm chức năng nhờ các enzyme

như papain, có tác dụng giống như các enzyme do dạ dày tiết ra nên rất cần thiết cho việc

tiêu hóa thực phẩm. Enzyme này tỏ ra hết sức hiệu quả trong việc phân hủy các hỗn hợp

protein, có tác dụng hỗ trợ trong các bệnh xơ hóa túi mật, tiêu hóa khó khăn và nóng rát

dạ dày, thiểu năng tuyến tụy, giảm hàm lượng enzyme pancreatin tiết ra.

Trong y học cổ truyền Nam Mỹ, đu đủ được đánh giá có hiệu lực trị bệnh tiểu

đường, hen suyễn và chống ký sinh trùng đường ruột, điều trị hiệu quả bệnh ho lao nếu

dùng đều đặn trong thời gian dài.

Hiện nay giống đu đủ chuyển gen ruột đỏ giàu lycopene, chống ung thư, lại kháng

được virus đã được phát triển ở các nước thuộc khu vực Đông Nam Á.

Chuối

Trong số các loại cây trồng nhiệt đới, chuối rất được ưa thích do hương vị hấp dẫn

của nó. Chuối không có chất béo, giàu chất dinh dưỡng, chứa hàm lượng kali và chất xơ

rất cao, và là nguồn cung cấp vitamin C chống oxy hóa. Chuối đang được nghiên cứu

biến đổi gen để mang các tính trạng như kháng virus, chín chậm. Chuối cũng là loại cây

dự kiến được dùng làm vaccine thực phẩm (edible vaccine) để phòng chống nhiều loại

bệnh dịch khủng khiếp ở các nước đang phát triển [2, 4].



2.1.1.2. Động vật

Thỏ chuyển gen

Thỏ là đối tượng chuyển gen nhằm mục đích tạo ra protein quý sử dụng trong y

dược thông qua tuyến sữa bởi các lý do sau đây :

- Giá phôi thỏ thấp nên có thể tạo ra một lượng lớn thỏ chuyển gen.

- Thời gian mang thai ngắn và thành thục sinh dục nhanh.

- Giá sản xuất thấp.

- Về mặt di truyền, thỏ gần với người hơn bất kì sinh vật cho sữa nào khác. Do vậy

nó là mô hình được chọn cho việc sản xuất các protein chữa bệnh cho người đặc biệt là

các protein phức tạp.

- Không truyền các bệnh nghiêm trọng do virus gây ra cho người.

- Một thỏ cái có thể tiết một lượng sữa lên đến 250ml sữa mỗi ngày. Trong qui trình

chuẩn, mỗi ngày chỉ có 100-150ml sữa được lấy từ một thỏ cái điển hình, tương đương

với 15 lít mỗi năm đối với một thỏ cái.

- Lượng protein tái tổ hợp trong sữa thỏ chuyển gen biến đổi từ 1-10g trong một lít.

Các loại protein có thể được sản xuất trong sữa thỏ là các kháng thể đơn dòng

(monoclonal antibody), vaccine...

Dê chuyển gen

Một thử nghiệm cũng đã được thực hiện để tạo ra dê chuyển gen bằng kỹ thuật vi

tiêm vào hợp tử đã ly tâm (Amstrong và cộng sự, 1987; Fabricant và cộng sự, 1987). Tỉ

lệ dê con cho sữa chuyển gen sinh ra là 5-10%. Một số protein dược phẩm đã được biểu

hiện ở sữa dê chuyển gen.

Bò chuyển gen

Các nhà khoa học trường Đại học Vermont đã sản xuất dòng thuần vô tính bò Jersey

để cung cấp gen chống bệnh viêm vú cho ngành Công nghệ sinh học tạo giống bò sữa có

khả năng chống lại bệnh viêm vú do vi khuẩn.



Gà chuyển gen

Gà chuyển gen được phát triển nhằm mục đích: sản xuất dược phẩm và các protein

khác trong trứng để sử dụng trong y học cho người và vật nuôi.

Trong lĩnh vực này, gà mái và trứng của chúng đang được sử dụng như là các nhà

máy sản xuất protein và kháng thể. Các nhà khoa học đã tạo ra gà chuyển gen có thể sản

xuất protein trong trứng. Đây là một bước quan trọng để tiến đến mục tiêu nhân giống gà

mái có thể đẻ những “quả trứng vàng” mà thuốc được đóng gói trong đó.

Sản xuất thuốc trong lòng trắng trứng có nhiều lợi thế :

- Gà có thể đẻ nhiều thế hệ trong một thời gian ngắn. Một thế hệ của gà là khoảng 6

tháng, ngắn hơn rất nhiều so với các động vật có vú lớn như dê chẳng hạn phải cần 18

tháng sinh trưởng từ phôi chuyển gen mới có khả năng cho sữa.

- Gà cũng sản xuất được nhiều protein, hàng năm mỗi gà mái có thể đẻ xấp xỉ

khoảng 330 quả trứng chứa 6,5 gam các protein khác nhau.

- Về mặt sinh học thì lòng trắng trứng ít phức tạp hơn sữa và có nhiều phương pháp

tách chiết các protein khác nhau từ trứng một cách dễ dàng.

Nghiên cứu gà chuyển gen đang được sử dụng để:

- Chế tạo vaccine.

- Sản xuất kháng thể trong trứng. Các kháng thể này được thêm vào trong thức ăn

để để chống nhiễm khuẩn (như E. coli).

- Sản xuất kháng thể thúc đẩy sự sinh trưởng trong noăn hoàng để cung cấp nguyên

liệu cho vật nuôi nhằm mục đích tăng tốc độ sinh trưởng của chúng.

- Sản xuất protein tái tổ hợp lactoferrin và lysozym. Đây là các chất bổ sung với

thuốc kháng sinh thúc đẩy sự sinh trưởng hoặc kháng thể trong khẩu phần thức ăn gia

cầm.

- Sản xuất kháng thể chống ung thư ở người.

- Tiết ra hormone sinh trưởng người để chữa bệnh lùn.



- Sản xuất trứng có hàm lượng cholesterol thấp hơn phục vụ cho con người.

- Sản xuất isoflavon đậu nành trong trứng để bán cho người tiêu dùng.

- Sản xuất các kháng thể như immoglobulin chim hoặc IgY một cách đặc biệt, thay

thế cho việc sử dụng các động vật thí nghiệm.

- Tạo dòng sản xuất gà thịt (broiler).

Một nhóm các nhà khoa học Anh đã phát triển thành công loại gà Chuyên trứng

biến đổi gen có khả năng đẻ ra những quả trứng chứa các loại protein chống ung thư.

Trung tâm sáng tạo ra cừu Dolly bằng sinh sản vô tính năm 1997, đã lai tạo thành

công khoảng 500 con gà biến đổi gen có khả năng đẻ trứng chống ung thư.

Loại protein chữa bệnh nằm trong lòng trắng trứng, đó là protein miR24 (một loại

kháng thể cho phép chữa trị bệnh ung thư da) có khả năng ngăn chặn sự tăng sinh của

virus trong tế bào. Có thể chiết xuất để sản xuất thuốc chữa ung thư có hiệu quả và ít tốn

chi phí. Tuy nhiên các nhà nghiên cứu vẫn còn phải mất khoảng 10 năm nữa để cung ứng

đại trà cho thị trường một loại protein chống ung thư giá rẻ này [2].

1.1.2. Tình hình phát triển thực phẩm chuyển gen ở Việt Nam

Về kỹ thuật công nghệ gen, Việt Nam ta còn rất non trẻ chỉ mới bắt đầu nghiên cứu

trong những năm gần đây chủ yếu trên đối tượng là thực vật. Lý do dễ thấy nhất là do

động vật có bộ gen lớn phức tạp và cơ chế điều hòa biểu hiện gen chặt chẽ.

Trong những năm qua, các phòng thí nghiệm trong nước đã tập trung nghiên cứu

chuyển gen vào một số cây trồng quan trọng như : lúa, ngô, đậu tương, bông, cải dầu, cải

bắp, hoa, thuốc lá… và các cây lâm nghiệp khác. Các gen kháng thuốc diệt cỏ và kháng

bệnh khô vằn đã được chuyển vào hai giống lúa DT10 và DT13, gen kháng bệnh bạc lá

vào giống lúa VL902, gen kháng sâu tơ vào giống cải bắp CB26. Các gen CryIA(c)

(kháng sâu), GNA (kháng rầy), Xa-21 kháng bạc lá) được chuyển vào loài phụ lúa

indica, gen β-caroten (tiền chất vitamin A) vào các giống lúa MTL250, IR64, KDML để

có giống lúa giàu vitamin A, gen Bt vào cây bông, gen anti-ACO (gen quả chín chậm và

hoa lâu tàn) vào hoa cúc, gen BT vào ngô, gen vỏ bọc (protein coat) kháng đốm vàng vào



đu đủ. Một số dòng bạch đàn được biến nạp gen để thay đổi hàm lượng và tính chất của

lignin cũng đang được thử nghiệm. Do nước ta chưa có luật an toàn sinh học, đặc biệt là

đối với cây trồng biến đổi gen nên tất cả các nghiên cứu mới chỉ dừng ở quy mô phòng

thí nghiệm và nhà kính.

Bên cạnh việc nghiên cứu và chọn tạo giống cây trồng biến đổi gen, chúng ta cũng

đang xây dựng những quy trình xác định cây trồng và sản phẩm biến đổi gen và đánh giá

khả năng gây hại của chúng. Để thực hiện nhiệm vụ này, các thông tin về các gen hiện

đang được sử dụng chuyển vào cây trồng đã được thu thập và phân tích như Xa-21

(kháng bệnh bạc lá lúa), gen CryIA (a, b, c, d) (kháng sâu), gen chitinaza (kháng nấm),

các gen P5C5, OAT, TPS, nhaA, HAL (chịu hạn và mặn), các gen CgS, SA (tăng hàm

lượng acid amin), các gen CP, replicaza (kháng bệnh đốm vòng), gen anti-ACO (gen quả

chín chậm và hoa lâu tàn), gen bar (kháng thuốc trừ cỏ). Quy trình xác định sự có mặt

của mỗi loại gen trong cây trồng, sản phẩm thức ăn cho người và cho vật nuôi đang được

xây dựng. Một số quy trình đã được ứng dụng trong thực tế để xác định cây trồng và sản

phẩm biến đổi gen như quy trình xác định gen bar và gen Bt [6].

1.2. Những đặc tính mới của sinh vật chuyển gen được dùng trong thực phẩm chức

năng

1.2.1. Thực vật

Sau đây là một số hướng nghiên cứu chính trong công nghệ chuyển gen ở thực vật

để tạo ra giống mới giàu chất dinh dưỡng chức năng, nâng cao chất lượng sản phẩm.

1.2.1.1. Carbohydrate và acid béo

Carbohydrate đóng vai trò quan trọng và có nhiều chức năng đối với thực vật và con

người. Người ta có thể thay đổi thành phần carbohydrate của thực vật bằng việc biểu hiện

những gen mới hoặc bất hoạt những gen hiện có.

Ví dụ: người ta đã thành công trong việc chuyển gen mã hóa cho RNA antisense

của enzyme tổng hợp các hạt tinh bột dưới sự điều khiển của promoter 35s RNA (enzyme



tổng hợp amylose). Khoai tây được tạo ra bằng cách này chỉ chứa amylopectin mà không

có amylose.

Acid béo gồm một chuỗi carbon dài với đầu cuối là nhóm carboxyl. Acid béo khác

nhau về độ dài của chuỗi carbon và độ bão hòa. Những đặc điểm này ảnh hưởng đến đặc

tính hóa học của acid béo. Có thể thay đổi chất béo theo hai hướng sau:

- Thứ nhất là thay đổi tỷ lệ acid béo bão hòa và chưa bão hòa.

- Thứ hai là tạo ra những acid béo có mạch carbon dài, chưa bão hòa, vì chúng được

coi là thực phẩm có giá trị.

Ví dụ: một gen mã hóa cho enzyme thioesterase được đưa vào cây cải dầu, đã tăng

hàm lượng lauric acid (CH3(CH2)10COO-), thuận lợi cho việc sản xuất bơ.

Gần đây các nhà nghiên cứu của Đại học Bristol (Anh) đã thông báo về việc sản

xuất hai chuỗi dài acid béo không sản sinh ra cholesterol với số lượng lớn ở thực vật bậc

cao. Việc sản xuất ra các loại dầu thiết yếu ở cây Arabidopsis thaliana cho thấy thực vật

chuyển gen có thể trở thành nguồn cung cấp các acid béo quan trọng dùng trong ăn uống

mà chúng ta thường chỉ nhận được từ cá.

Người ta cũng đã áp dụng thành công kỹ thuật gen đối với cây Arabidopsis thaliana

để tạo ra các acid béo thiết yếu khác như arachidonic acid và eiconsapentaenoic acid [4].

1.2.1.2. Hàm lượng protein và amino acid không thay thế

Hàm lượng protein và thành phần amino acid thay đổi rất nhiều trong thực phẩm

thực vật và thường thiếu các amino acid không thay thế như lysine, methionine, threonine

và tryptophan… Trong tương lai điều này sẽ được giải quyết bằng việc tạo các dòng cây

đậu tương hoặc ngô mang gen mã hóa cho protein giàu những amino acid này.

Một trong những thành công đầu tiên là tạo dòng ngô biến đổi gen có cân bằng

amino acid tốt hơn (hàm lượng protein cao hơn) có tên là Opaquez, có hàm lượng lysine

cao hơn (tăng 20% so với đối chứng).



1.2.1.3. Vitamin, chất khoáng và các nguyên tố vi lượng

Thực vật là nguồn cung cấp vitamin, chất khoáng và các nguyên tố vi lượng (trừ

vitamin B12 và D). Các thực vật khác nhau có lượng vitamin và chất khoáng khác nhau.

Tuy nhiên gạo là lương thực chính cho con người nhưng hầu như không chứa

vitamin A. Cây lúa chỉ sản sinh ra hợp chất carotenoid được chuyển thành vitamin A

trong những bộ phận có màu xanh của cây, tuy nhiên trong hạt gạo mà con người vẫn

dùng lại không có hợp chất này. Nếu chỉ sử dụng gạo trong các bữa ăn mà không thêm

các loại thức ăn có chứa vitamine A sẽ dẫn đến các bệnh về mắt do thiếu viatamine A. Vì

vậy một dòng lúa chuyển gen đã ra đời đáp ứng cho nhu cầu này, đó là dòng lúa tạo ra

những hạt gạo màu vàng được gọi là “gạo vàng – Golden rice”. Dòng lúa này đã được

chuyển gen mã hóa cho β- carotene – một tiền chất của vitamine A. Gen này được biểu

hiện ở nội nhũ vì vậy tiền vitamin A không bị mất đi khi xay xát. Nội nhũ bây giờ có màu

vàng là do β-carotene. 300g gạo này chứa đủ lượng β-carotene, đáp ứng nhu cầu hàng

ngày của con người.

Ngoài ra, còn có những dòng lúa chuyển gen giàu vitamine E, sắt để đáp ứng nhu

cầu về vitamin và khoáng chất cho con người.

1.2.1.4. Vaccine thực phẩm

Gần đây, các nhà khoa học đã coi cây trồng như một nguồn cung cấp các loại

vaccine phòng bệnh, bởi vì những loại vaccine thông thường đòi hỏi phải được lưu giữ

trong môi trường lạnh, điều vô cùng khó khăn ở những nơi xa xôi của các nước đang phát

triển. Một nghiên cứu gần đây đã công bố một bước đột phá trong lĩnh vực sản xuất

vaccine từ thực vật, đó là loại khoai tây chuyển gen chứa vaccine ngừa viêm gan B. Loại

khoai tây này có khả năng kháng virus viêm gan B bằng cách tạo ra kháng nguyên virus.

Các nhà nghiên cứu hy vọng rằng khi ăn loại khoai tây này, chất kháng nguyên sẽ gây ra

một phản ứng miễn dịch nhẹ trong cơ thể người. Từ đó, cơ thể người sẽ tạo ra chất miễn

dịch cá thể đối với bệnh lây nhiễm viêm gan B [24].



1.2.2. Động vật

Hiện nay trên thế giới có nhiều phòng thí nghiệm đã và đang tập trung nghiên cứu

để tạo ra động vật chuyển gen giàu chất dinh dưỡng chức năng, tuy nhiên chủ yếu tập

trung vào những hướng sau:

1.2.2.1.Tạo ra động vật chuyên sản xuất protein quý dùng trong y dược

Đây là hướng có nhiều triển vọng nhất bởi vì nhiều protein dược phẩm quý không

thể sản xuất qua con đường vi sinh hoặc sinh vật bậc thấp, do những sinh vật này không

có hệ enzyme để tạo ra những protein có cấu tạo phức tạp.

Bảng 1.2: Trang trại nuôi giống động vật sản xuất protein dược phẩm

Loại Protein dược phẩm Chức năng chữa bệnh Loài thú α-1-antitrypsin Có chức năng chống viêm Dê, Cừu Anti-thrombin III

Chống sự nhiễm trùng và xơ cứng nghẽn mạch, cục máu đông.

Dê

Collagen Chữa bỏng, gãy xương Bò Fibrinogen

Chữa bỏng, phẫu thuật, trong hóa trị liệu, trong dược phẩm

Heo, Cừu

Human hemoglobin Thay thế máu người, truyền máu Heo Human serum albumin

Chữa bỏng, shock, chấn thương, phẫu thuật…

Dê, Bò

Lactoferrin Trị vi khuẩn gây bệnh đường ruột Bò LAtPA (Tissue Plasminogen Activator)

Chữa loét do ứ máu tĩnh mạch

Dê

Monoclonal antibodies (Mab)

Chống ung thư kết tràng

Dê

Anti-TNFα IgG1 (monoclonal)

Chống lại cơn đau tim Dê

[66]

Ý định sử dụng tuyến sữa của động vật bậc cao để sản xuất ra protein quý lần đầu

tiên được Clark (1987) đề xuất. Nội dung của kỹ thuật này là gắn gen cấu trúc với ß-

lactoglobulin (là promoter điều khiển sự biểu hiện của gen ở tuyến sữa). Khi đưa tổ hợp



có chứa promoter ß-lactoglobulin vào cừu, chuột, Clark thấy chúng biểu hiện rất cao ở

tuyến sữa.

Sản xuất protein thông qua việc sản xuất sữa có nhiều lợi thế:

- Tuyến sữa của động vật có vú là một cơ quan sản xuất sinh học thích nghi cao độ

cho sự bài tiết.

- Tuyến sữa là một hệ thống sản xuất khổng lồ có khả năng tạo ra từ 23g (bò sữa)

đến 205g (chuột) protein/kg cơ thể trong thời kỳ tiết sữa tối đa.

- Nồng độ tế bào trong tuyến sữa của động vật có vú lớn hơn trong nuôi cấy tế bào

thông thường từ 100 đến 1000 lần.

- Nhiều protein được sản xuất ở tuyến sữa của động vật có vú có hoạt tính dược cao

do cơ quan này có đủ điều kiện thực hiện “chín hóa” (maturation) protein.

- Sữa là dịch tiết của cơ thể có thể được thu nhận một cách dễ dàng nhất, đặc biệt là

từ động vật nhai lại.

- Sự biểu hiện của gen ở tuyến sữa của động vật có vú là chính xác về thời gian.

- Sản lượng sữa tiết ra ở động vật có vú là khá lớn: ở dê lên đến 800 lít/năm, cừu

400 lít/năm, bò 8000 lít/năm, ở chuột là 1,5ml/lần...

Cho đến nay rất nhiều protein dược phẩm quý đã và đang được nghiên cứu để sản

xuất qua tuyến sữa của động vật như:

- α1- antitripsin và yếu tố làm đông máu IX (blood clotting factor IX) của người đã

được tiết ra trong sữa chuột, sữa cừu với nồng độ tương ứng là 5mg/ml và 25mg/ml.

- Chất hoạt hóa plasminogen mô người (human tissue plasminogen activator) làm

tăng đông máu đã được tiết ra ở sữa dê và sữa chuột.

- Gen urokinase người đã được đưa thành công vào lợn và tiết ra ở tuyến sữa nhờ

gen khởi động alpha-casein bò.

- Protein C người được tạo ra từ sữa chuột và sữa lợn chuyển gen...



Bảng 1.3: Những protein có tác dụng chữa bệnh trong sữa được sản xuất ra bởi thú

cho sữa chuyển gen

Tên protein Động vật Ứng dụng trong điều trị bệnh Antithrombin III Dê Làm giảm số lượng máu cần thiết trong

một số trường hợp phẫu thuật Factor VIII, Factor IX Dê, Heo, Cừu Chữa bệnh ưa chảy máu (hemophilia) CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)

Cừu Chữa bệnh xơ u nang (cystic fibrosis)

Lactoferrin Bò Protein kháng sinh tự nhiên được sử dụng trong phẫu thuật tim

α-1- antitrypsin Cừu Chữa bệnh xơ u nang và khí thủng Lysostaphin Bò Hợp chất kháng khuẩn để phòng bệnh

viêm vú bò Spider silk protein Dê Sản xuất chỉ Y khoa siêu nhỏ, siêu

chắc, siêu mạnh, tự tiêu… [67]

Bảng 1.4 : Một vài thông số liên quan đến việc tiết sữa ở động vật có vú

Động vật Thời gian mang thai

(tháng)

Thời gian thành thục

(tháng)

Số con trong một

lứa

Sản lượng sữa tiết ra

Số tháng tiết sữa

Chuột 0.75 1 10 1.5ml 3 - 6 Thỏ 1 6 8 1 – 1.5l 7 - 8 Lợn 4 8 9 200 – 400l 15 - 16 Cừu 5 6 2 200 – 400l 16 - 18 Dê 5 6 2 600 – 800l 16 - 18 Bò 9 15 1 8000l 30 - 33

[2]

Hiện tại đã có 2 protein được sản xuất bằng con đường này là α1-antitripsin người

và chất hoạt hoá plasminogen mô người. Chất đầu được sản xuất qua sữa cừu với nồng

độ 35g/l, còn chất sau sản xuất qua sữa dê. Những sản phẩm này hàng năm mang lại cho

hãng Genetech (Mỹ) hàng trăm triệu USD. Hiện tại các nhà khoa học Mỹ muốn giảm giá



thành của sản phẩm này bằng cách sản xuất qua sữa thỏ. Người ta dự đoán giá thành sản

xuất hormone này qua sữa thỏ chỉ bằng 1/3 giá thành hiện tại sản xuất nhờ vi sinh. Lý do

là chu kỳ sinh sản của thỏ ngắn và lượng protein sữa của thỏ lại cao. Trong một năm

lượng protein sữa của 6 con thỏ bằng của một con bò. Hiện tại chuột chuyển gen

hormone sinh trưởng đã tiết ra protein này với nồng độ 0,5g/l.

Bảng 1.5 : Ước tính sản lượng protein sinh phẩm trong sữa và qui mô đàn thú chuyển

gen trên thế giới

Loại protein sinh phẩm

Ước tính hàng năm cần (kg)

Ước tính qui mô thú Loài thú

Protein C 100 33 1,100

Bò Heo

tPA 75 600 Dê Cừu

α-1-antitrypsin 5,000 33,000 42,000

Cừu Dê

Factor IX 2 13 12

Cừu Heo

Human serum albumin

1,000 300 8,300

Bò Dê

[66]

Mặt khác, các protein dược phẩm mong muốn cũng được tạo ra trong dịch cơ thể

không thuộc mô vú như máu. Cho đến nay phương pháp này chỉ mới được sử dụng để

biểu hiện hemoglobin người với mức cao ở lợn chuyển gen (Sharma, 1994). Bên cạnh hai

phương pháp trên, các nhà khoa học đã phát triển động vật chuyển gen sản xuất ra dược

phẩm ở trong bàng quang của chúng. Khả năng sử dụng nước tiểu của động vật để sản

xuất protein tăng lên vào năm 1995, khi Tung-Tien Sung ở Đại học New York chứng

minh rằng có những gen chỉ hoạt động ở bàng quang. Các gen này mã hoá cho protein

uroplakins. Protein này là một thành phần tham gia hình thành nên màng bàng quang.

Kerr (1998) đã nghiên cứu tạo ra chuột chuyển gen sản xuất hormone sinh trưởng người

từ nước tiểu. Gen hormone sinh trưởng người được nối với promoter urolapkin. Promoter

này kiểm soát vị trí và thời gian hoạt động của gen. Chuột mang gen ngoại lai đã tạo ra



500 nanogam hormone sinh trưởng người trong một mili lít nước tiểu thải ra. Mặc dù sản

phẩm của chuột chuyển gen chỉ là một lượng nhỏ nhưng chúng cho thấy rằng trong tương

lai nước tiểu của vật nuôi có thể sẽ được lựa chọn. Nước tiểu có những ưu thế vượt trội

so với sữa. Cả động vật đực và cái đều tiết nước tiểu, được bắt đầu ngay sau khi sinh ra.

Nước tiểu của các đại gia súc chứa nhiều protein hơn ở trong sữa của chúng. Mặt khác,

trên thực tế chi phí cho việc tinh chế thuốc từ nước tiểu thấp hơn so với sữa. Một vài

protein có thể không thích hợp đối với việc khai thác từ sữa bởi vì chúng làm tổn thương

mô vú.

1.2.2.2. Nâng cao năng suất, chất lượng động vật bằng cách thay đổi các con đường

chuyển hóa trong cơ thể động vật

Nhiều phương pháp đã được đề xuất để nâng cao chất lượng dinh dưỡng của sữa.

Trong hướng này nổi bật là những nghiên cứu nâng cao chất lượng sữa bò, sữa cừu

bằng cách chuyển gen lactose vào các đối tượng quan tâm. Sự biểu hiện của gen này

được điều khiển bởi promoter của tuyến sữa. Trong sữa của những động vật chuyển gen

này, đường lactose bị thủy phân thành đường galactose và đường glucose. Do vậy những

người không quen uống sữa cũng có thể sử dụng được sữa này mà không cần quá trình

lên men.

Mới đây, các nhà khoa học (Brigid Brophy, 2003) đã chuyển thêm các gen mã hoá

β-casein (CSN2) và kappa-casein (CSN3) bò vào các nguyên bào sợi của bò và tạo ra bò

chuyển gen cho sữa có mức ß-casein và kappacasein cao hơn bình thường: hàm lượng ß-

casein tăng lên 8-20%, hàm lượng kappa-casein tăng gấp 2 lần và tỉ lệ kappa-casein so

với casein tổng số thay đổi một cách đáng kể. Hai loại casein là protein chủ yếu ở trong

sữa và là thành phần chính của sữa đông, chìa khoá của sự sản xuất phó-mát và sữa chua.

Các protein này rất quan trọng, chúng làm cho sữa có hàm lượng protein cao nhưng chứa

nhiều nước.



Bảng 1.6: Một số thay đổi các thành phần của sữa được đề xuất

Sự thay đổi Kết quả Tăng α-CN và ß-CN Cải tiến tính bền vững đối với nhiệt và

tăng hàm lượng calcium Tăng vị trí phosphoryl hoá trong casein

Tăng hàm lượng calcium

Tiết ß-LG Cải tiến tính tiêu hoá, giảm dị ứng và giảm nguồn cystein sơ cấp trong sữa.

Giảm α-LA Giảm lactose Thêm lactoferin người Tăng cường sự hấp thu sắt và bảo vệ

chống lại sự nhiễm trùng ruột Giảm sự biểu hiện của acetyl-CoA cacboxylase

Giảm hàm lượng mỡ, cải tiến chất lượng dinh dưỡng

Biểu hiện gen Ig Bảo vệ chống lại các bệnh như Salmonella và Listeria

Thay thế các gen protein sữa bò bằng các gen protein sữa người

Tạo ra sữa giống như sữa người

Tăng nồng độ kappa-CN Tăng tính ổn định của sự kết tụ casein, giảm kích thước mixen và giảm đông keo (gelation) và đông tụ (coagulation)

[2]

Chương 2: Các phương pháp chuyển gen


CHƯƠNG 2

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN

2. 1.Thực vật

2. 1.1. Phương pháp chung

Một số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen

Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng (totipotency).

Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gen

ngoại lai.

Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu

nhận gen biến nạp vào genome.

Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen, từng cơ quan,

từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.

Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA ngoại lai. Vì thế, cho đến nay chỉ có

thể chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus và bắn gen

hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen bằng phương pháp xung điện, siêu âm và vi

tiêm.

Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự biểu hiện tạm

thời của gen.

Các DNA (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ chưa đảm bảo là

đã liên kết ổn định với genome.

Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó chỉ ở nơi mà

nó được đưa vào.

Các bước cơ bản của quá trình chuyển gen:

Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm.

Phân lập gen (dùng phương pháp PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cDNA hoặc từ thư

viện genomic DNA).



Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp.

Biến nạp vào E. coli.

Tách chiết DNA plasmid.

Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương pháp khác nhau.

Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc.

Tái sinh cây biến nạp.

Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR hoặc Southern blot) và đánh giá mức

độ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot, ELISA hoặc các thử nghiệm in vivo

khác...). Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật riêng lẽ, các mô hoặc

cây hoàn chỉnh.

2.1.2. Kỹ thuật cơ bản

2.1.2.1. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium

Nguyên tắc:

Phương pháp này đưa DNA vào tế bào thực vật qua trung gian của vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens (đây là loại được dùng phổ biến). Sau khi xâm nhiễm, chúng

gắn một đoạn DNA (T-DNA) vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến rối loạn

các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u.

Vi khuẩn A.tumefaciens là vi khuẩn gram âm trong đất mang độc tính.

A.tumefaciens và một số loài họ hàng có khả năng chuyển một phần nhỏ DNA của nó vào

tế bào thực vật (nhiều loại thực vật hạt kín hai lá mầm và ở một số ít thực vật một lá

mầm) và qua đó kích thích tạo khối u (gọi là crown-gal). Những khối u này là không gian

sống của vi khuẩn.

Một số chất dinh dưỡng (opine) có lợi cho vi khuẩn cũng được tạo ra trong những

khối u này. Những opine phổ biến nhất là nopalin và octopin. Về hóa học opine là những

sản phẩm ngưng tụ của một amino acid với một cetoacid hoặc một amino acid với đường.

Octopin được tạo nên từ amino acid là arginine và pyruvate, còn nopalin được tạo nên từ

arginine và α-cetoglutaraldehyd.



Hình 2.1: Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nhìn dưới kính hiển vi [2].

Hình 2.2: Khối u ở thực vật do Agrobacterium tumefaciens gây ra [2]



Hình 2.3: Công thức cấu tạo của opine (octopin, nopalin) [2].

Việc gây ra khối u và tổng hợp opine liên quan với sự có mặt của một loại plasmid

có kích thước lớn là Ti-plasmid trong tế bào vi khuẩn A. tumefaciens.

• Ti-plasmid của A. tumefaciens:

Ti-plasmid (tumor inducing – plasmid cảm ứng tạo khối u) được tìm thấy trong tất

cả các dòng A.tumefaciens gây độc, có kích thước khoảng 200-800 kb. Chúng được duy

trì ổn định trong Agrobacterium ở nhiệt độ dưới 30oC. Qua nghiên cứu cho thấy trong Ti-

plasmid có hai vùng quan trọng là: vùng T-DNA (transferred DNA) và vùng gây độc

(virulence – vir gen) liên quan đến sự hình thành khối u, sự tiếp hợp và sự tái bản của

plasmid trong Agrobacterium. Ngoài ra, còn có vùng đóng vai trò phân giải opine (vùng

T-DNA có khả năng tổng hợp loại opine nào thì vùng này có khả năng phân giải opine đó

để cung cấp năng lượng cho tế bào vi khuẩn).

- T-DNA: là một phần của Ti-plasmid (vùng T-DNA này có kích thước khoảng 12- 24

kb), được chuyển vào thực vật (transfer-DNA). Trên đó định vị những gen mã hóa cho

sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen tạo khối u. Trong Ti-plasmid, T-DNA

được giới hạn bởi hai vùng, vai trái và vai phải (LB: left border và RB: right border). Các

vai này gồm một trình tự lặp lại của 25 bp, là trình tự nhận biết cho việc cắt T-DNA.

Vai trái 5’ -TGNCAGGATATATATNNNNNNGTNANN- 3’

Vai phải 5’ -TGGCAGGATATATATNNNNNNGTAAAN- 3’



(Trình tự chung của vai trái và vai phải của T-DNA trên Ti-plasmid. N là một

nucleotide bất kỳ trong 4 nucleotide. Trình tự này có thể không giống nhau ở các chủng

vi khuẩn). Mặc dù vai trái cũng chứa đoạn lập lại 25 bp tương tự vai phải, nhưng những

nghiên cứu cho thấy vùng này không tham gia vào quá trình biến nạp.

- Vùng vir: nằm ngoài vùng T-DNA (độ dài khoảng 25 kb), có khoảng 25 gen được nhận

biết trong 7 đơn vị phiên mã là vir A, vir B, vir C, vir D, vir E, vir F, vir G. Những gen

vir này giữ các vai trò như: nhận ra tế bào thực vật, tấn công vào tế bào thực vật, cắt bỏ

đoạn, chuyển gen và có lẽ có cả vai trò trong sự xâm nhập của T-DNA vào tế bào ký chủ.

Trong đó, vir A, B, D, G cần thiết cho việc tạo khối u; vir C, E ảnh hưởng đến hiệu quả

chuyển gen trên biên độ ký chủ.

• Cơ chế biến nạp T-DNA vào tế bào ký chủ:

Để xảy ra quá trình biến nạp tế bào thực vật phải bị thương. Vì lúc này tế bào thực

vật tiết ra các hợp chất làm tín hiệu cảm ứng cho vi khuẩn tấn công và xâm nhập. Các

hợp chất cảm ứng được chia làm hai loại:

-Các monoccharide: tạo ra sự hấp dẫn trên một quãng đường dài đối với những

chủng vi khuẩn Agrobacterium độc và không độc đến vị trí vết thương ở rễ.

- Dạng tiền phenol và các chất trung gian của sự sinh tổng hợp lignin có vai trò rất

đặc biệt. Ở nồng độ thấp (<10-7M đối với acetosyngone) các phenolic này hoạt động như

chất lôi kéo chuyên biệt chỉ đối với chủng Agrobacterium độc. Sản phẩm của vir A và vir

G làm trung gian cho sự lôi kéo theo các hóa chất này. Tuy nhiên ở nồng độ cao hơn thì

các hợp chất phenolic cùng loại này có vai trò những chất cảm ứng chuyên biệt sự điều

hòa gen vir thông qua dấu hiệu kép (vir A và G) của cơ chế tải nạp tương tự với các hệ

thống điều hòa của các loài vi khuẩn khác.

Quá trình biến nạp T-DNA vào tế bào ký chủ gồm 10 bước như sau:

(1) Vi khuẩn nhận ra và tấn công vào tế bào ký chủ.

(2) Các hợp chất cảm ứng của tế bào ký chủ tiết ra cảm ứng với sản phẩm của hệ

thống tín hiệu kép (vir A và G).



(3) Vùng gen vir được hoạt hóa.

(4) Bản sao của T-DNA được tạo ra dưới sự có mặt phức hợp protein của vir

D1,D2.

(5) Bản sao này kết hợp với protein của vir D2, tạo thành phức hợp T-DNA protein

và với một số protein của các vir khác đi vào tế bào chất của tế bào ký chủ thông qua

kênh vir B/D4T4SS.

(6) Phức hợp này lại kết hợp với sản phẩm của vir E, rồi đi vào tế bào chất của tế

bào ký chủ. Protein của vir D2 và sản phẩm của vir E gắn với bản sao T-DNA có tác

dụng bảo vệ sợi T-DNA không bị phân cắt bởi các enzyme exonuclease.

(7) Phức hợp T-DNA protein đi vào nhân tế bào ký chủ.

(8) Khi đã vào trong nhân, T-DNA xác định điểm để xen vào.

(9) T-DNA tách ra khỏi các protein bảo vệ.

(10) T-DNA gắn vào bộ gen của tế bào ký chủ một cách ngẫu nhiên.

• Ứng dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trong chuyển gen thực vật:

Trên thực tế, A. tumefaciens chỉ gây hại ở cây hai lá mầm, vì vậy người ta cho rằng

chúng chỉ có thể biến nạp T-DNA vào bộ gen của cây hai lá mầm. Gần đây, nhiều tác giả

đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn Agrobacterium, các cây một lá mầm cũng có thể sản

xuất opine và có thể khai thác việc chuyển gen của Agrobacterium ở cây một lá mầm.

Mặc dù, Ti-plasmid của A.tumefaciens là vector tự nhiên nhưng chúng lại có nhược

điểm so với vectơ nhân dòng:

- Sự sản xuất phytohormon của tế bào thực vật chuyển gen (được nuôi cấy trong

môi trường) ngăn cản chúng tái sinh thành cây trưởng thành hoàn chỉnh và khỏe mạnh.

Do đó, gen mã hóa cho enzyme tham gia tổng hợp auxin và cytokinin cần phải được loại

bỏ khỏi Ti-plasmid.

- Gen mã hóa cho các enzyme tham gia tổng hợp opine không có vai trò đối với kỹ

thuật tạo thực vật chuyển gen và có thể làm giảm sức sống do tiêu hao năng lượng vào

việc tổng hợp opine. Do đó, các gen này phải loại bỏ khỏi plasmid.



- Ti-plasmid có kích thước lớn (200-800 kb) gây khó khăn trong quá trình thao tác

tạo DNA tái tổ hợp. Vì vậy, các đoạn DNA không cần thiết cho quá trình tạo dòng và

biểu hiện gen cần được loại bỏ.

- Ti-plasmid không sao chép trong E.coli nên việc nhân dòng plasmid tái tổ hợp

trong E.coli không thể thực hiện được. Do đó, khi xây dừng vectơ plasmid phải thêm

đoạn ori của plasmid E.coli để có thể sao chép trong tế bào E.coli.

Để khắc phục những nhược điểm, trên các nhà khoa học đã tạo ra vectơ tái tổ hợp

dựa trên nguyên tắc của Ti-plasmid. Những vectơ này gồm có các thành phần sau:

- Các gen chọn lọc (a selectable maker gene) như: neomycin phosphotransferase,

gen tạo khả năng kháng kanamycin của tế bào thực vật chuyển gen.

- Trình tự ori cần thiết cho sự sao chép và nhân đôi của plasmid trong E.coli.

- Trình tự vai phải của vùng T-DNA: vùng này tuyệt đối cần thiết cho quá trình

chuyển gen xảy ra. Một số vectơ có thể có trình tự cả hai vai.

- Vùng polylinker (multiple cloning site) để thuận tiện cho việc cắt và chèn gen vào

plasmid .

Khả năng chuyển gen tự nhiên được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy

di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn, bằng cách nuôi mẫu cấy trong môi trường

thích hợp có chứa Agrobacterium mang vectơ tái tổ hợp cần chuyển. Agrobacterium sẽ

xâm nhập vào mô mẫu cấy từ các vết thương ở mép và chuyển plasmid mang gen cần

chuyển vào tế bào thực vật. Sau đó, những tế bào này được tái sinh trên môi trường thích

hợp tạo thành cây hoàn chỉnh mang gen mong muốn.



Hình 2.4: Sơ đồ gen của Ti-plasmid trong vi khuẩn A. tumefaciens [2].

Hình 2.5: Sơ đồ plasmid tái tổ hợp dựa trên nguyên tắc của Ti-plasmid [2]



Hình 2.6: Quá trình tạo cây chuyển gen nhờ A.tumefaciens [2].



2.1.2.2. Phương pháp chuyển gen trực tiếp

Chuyển gen bằng súng bắn gen

Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế

bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật và được phát

triển vào đầu thập niên 1980 do các nhà thực vật học ở Đại học Corrnell cùng với các nhà

nghiên cứu ở Corrnell Nanofabrication Facility, Newyork, USA.

Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác nhau nhưng nguyên lý chung của phương

pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium để gia tốc các hạt.

Hình 2.7 : Súng bắn gen (Hãng Biorad )[2]

Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thước 6”x7”x10” nối với

hai bơm chân không. DNA ngoại lai được gắn vào các hạt tungsten có đường kính rất

nhỏ, khoảng 1μm (các kim loại năng khác như vàng và bạc cũng được sử dụng nhưng

không thường xuyên do giá cả đắt). Các hạt này được đặt trên một cái đĩa ở mặt bên

trong của súng. Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi làm cho cái đĩa bắn về phía trước với

tốc độ 1300 feet/s, tương đương với tốc độ khi một viên đạn rời khỏi nòng súng. Một tấm

chắn làm dừng đĩa lại và các hạt vàng hay tungsten được phóng về phía các tế bào đích.

Chúng xuyên qua vách tế bào và phóng thích các phân tử DNA. Súng bắn gen sử dụng kỹ

thuật DNA tái tổ hợp để hợp nhất sự biểu hiện các gen đa phân phối. Các tế bào biến đổi

di truyền có thể được sử dụng để tạo thực vật bao gồm cả sự sửa đổi di truyền mong

muốn ở trong tất cả các tế bào của chúng (Voiland, 1999) [2].



Hình 2.8: Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen [2]

Chuyển gen trực tiếp vào tế bào trần (protoplast)

Để DNA dễ xâm nhập được vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo

protoplast. Protoplast có thể được duy trì trong môi trường nuôi cấy như các tế bào sinh

trưởng một cách độc lập hoặc với một môi trường đặc hiệu, vách tế bào có thể được tạo

thành và toàn bộ các cây có thể được tái sinh từ các tế bào này.

Quá trình chuyển gen như thế này được thực hiện một cách trực tiếp bằng một cơ

chế vật lý đơn giản, không cần có vector.

Để nâng cao hiệu quả biến nạp, người ta đã xử lý protoplast với PEG (polyethylene

glycol) hoặc bằng xung điện.

Phương pháp chuyển gen này rất có hiệu quả, đặc biệt đối với những loài thực vật

mà phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium không thể thực hiện được.

Tuy nhiên, việc tạo protoplast cũng như tái sinh cây từ protoplast không đơn giản,

tốn nhiều công sức, bị ảnh hưởng của nhiều yếu tố môi trường.



Với phương pháp này, các nhà khoa học đã chuyển gen thành công vào một số loài

cây một lá mầm như loài lúa phụ Japonica (Datta, 1990), ngô (Doon, 1990), lúa mì

(Vassil, 1992) [2].

Chuyển gen bằng kỹ thuật xung điện

Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phương pháp cơ học được sử dụng để

đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phương pháp này,

một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn

cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA

ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào.

Hình 2.9 : Sơ đồ màng phospholipid kép [2]

Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái tương đối yếu của các tương tác kỵ nước của

phospholipid kép và khả năng tập hợp lại một cách tự động của nó sau khi bị rối loạn

(Purves, 2001). Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo thành dịch huyền phù và cho

vào trong một cuvette nhựa có điện cực.

Hình 2.10 : Cuvette nhựa có điện cực [2]



Để tạo ra xung điện cao thế trong một thời gian ngắn người ta sử dụng một thiết bị

gọi là máy xung gen (gene pulser). Quá trình cơ bản diễn ra bên trong máy này có thể

được trình bày bằng sơ đồ.

Hình 2.11: Sơ đồ bố trí mạch cơ bản của máy xung điện [2]

Sơ đồ này cho thấy mạch điện cơ bản cung cấp điện cho kỹ thuật xung điện. Khi

công tắc thứ nhất đóng, tụ điện nạp điện vào và tích một điện áp cao. Khi công tắc thứ hai

đóng, điện áp này phóng qua dịch huyền phù tế bào. Một xung điện cần thiết cho kỹ thuật

này thường là khoảng 10.000-100.000 v/cm (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào)

trong vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây. Xung điện này làm rối loạn

phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các lỗ tạm thời. Khả năng điện qua màng tế

bào cùng lúc tăng lên 0,5-1,0 v. Vì vậy các phân tử đã được nạp điện này đi qua màng tế

bào thông qua các lỗ bằng cách thức tương tự như điện di.



Hình 2.12 : Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời

trên màng bào chất [2]

Khi các ion đã nạp điện và các phân tử đi qua các lỗ, màng tế bào phóng điện và các

lỗ này đóng lại một cách nhanh chóng và phospholipid kép phục hồi lại cấu trúc cũ

(Weaver, 1995). Lúc này các phân tử mong muốn đã ở trong tế bào và chúng được sử

dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Phương pháp này có thể sử dụng đối với gần như tất cả các loại tế bào của các loài.

Lúc đầu phương pháp này được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào động vật có vú, về

sau cho cả tế bào thực vật ở dạng protoplast...

Các ứng dụng của kỹ thuật xung điện bao gồm:

- Biến nạp DNA

- Chuyển plasmid trực tiếp giữa các tế bào

- Dung hợp tế bào đa kích thích

- Phân phối thuốc qua da

- Liệu pháp hóa điện khối u ung thư

- Liệu pháp gen

Chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm

Nguyên tắc của phương pháp vi tiêm là một lượng nhỏ DNA được tiêm trực tiếp

vào nhân tế bào trần một cách cơ học dưới kính hiển vi.



Theo phương pháp này, tế bào được giữ trong ống thủy tinh (kim giữ) bằng lực hút

yếu và DNA được bơm trực tiếp vào nhân tế bào qua pipet thủy tinh rất nhỏ (kim tiêm).

Quá trình tiêm được theo dõi bằng kính hiển vi và sự thành công được nhận ra bởi một

chất phát huỳnh quang được tiêm cùng vào tế bào.

Hình 2.13: Vi tiêm gen ngoại lai vào nhân của protoplast [2].

2.2. Động vật

2.2.1. Nguyên tắc

Gồm các bước chính sau:

1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào

động vật.

2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen.

3. Biến nạp gen vào phôi động vật

4. Nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao)

5. Phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gen lạ

6.Tạo ra dòng động vật chuyển gen gốc một cách liên tục sản xuất động vật chuyển

gen.



Hình 2.14 : Sơ đồ tạo động vật chuyển gen [2].

2.2.1.1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế

bào động vật

Tách chiết, phân lập gen mong muốn

Gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào vật chủ phải được phân

lập và tinh chế.

Các công cụ sử dụng để tạo dòng bao gồm các enzyme đặc biệt có hoạt tính cắt và

nối DNA (enzyme cắt giới hạn và ligase), các mẫu ḍò (probe), vector và tế bào vật chủ.

Tế bào vật chủ thường được sử dụng là tế bào vi khuẩn E.coli và vector thường được sử

dụng là plasmid.

DNA mẫu chứa gen mong muốn và vector plasmid phải được cắt bởi cùng một loại

enzyme cắt giới hạn. Các đoạn DNA mẫu sau khi được cắt có mang gen mong muốn sẽ

được xen vào vector plasmid và các đầu của các đoạn DNA mẫu này và các đầu của

vector plasmid sẽ được nối với nhau nhờ ligase tạo thành plasmid tái tổ hợp. Sau đó các

plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào các tế bào vi khuẩn E.coli và các tế bào vi khuẩn



tiến hành sinh trưởng. Vào thời điểm này, các tế bào vi khuẩn chứa plasmid mang gen

mong muốn sẽ được phát hiện bằng mẫu dò. Chúng được nuôi cấy trong môi trường thích

hợp để sinh trưởng phát triển tạo ra hàng triệu bản sao của vector chứa gen này. Vector

chứa gen này sẽ được tách ra khỏi tế bào vi khuẩn và gen mong muốn sẽ được tách chiết.

Có thể phân lập được gen mong muốn từ mRNA hoặc protein. Từ mRNA dưới tác

động của enzyme sao chép ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung mạch đơn (single strand

complement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA bổ sung mạch kép (double strand

complement DNA- ds cDNA). DNA bổ sung (complement DNA- cDNA) này khác với

DNA gốc là không chứa các intron mà chỉ bao gồm các exon.

Hoặc từ sản phẩm protein, có thể suy ra trình tự nucleotid của gen cấu trúc trên cơ

sở trình tự các axit amin trong phân tử protein. Sau đó có thể thiết kế cặp mồi (primer) để

dò tìm đoạn gen mong muốn.

Tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật

Ở các đầu của cấu trúc có thể được sửa đổi bằng cách bổ sung các trình tự

polylinker chứa một số vị trí nhận biết các enzyme cắt giới hạn khác nhau. Trình tự

polylinker cho phép có thể xen vào cấu trúc này một vector để kiểm tra và tạo dòng.

Yếu tố điều hoà ở gần đầu 5’ của gen là promoter, có vai trò quyết định trong việc

điều hoà sự biểu hiện của gen. Promoter ở tế bào động vật có nguồn gốc hoặc từ động vật

như methallothionein (MT), thymidine kinase, ßactin, amylase, insulin, ß-lactoglobulin,

adiposite P2 ... hoặc từ virus động vật như Simian virus (SV40), Rous sarcoma virus

(RSV)...

Một yếu tố điều hoà khác là yếu tố tăng cường (enhancer), có chức năng tăng cường

sự biểu hiện của gen, không phụ thuộc vào vị trí và sự định hướng đối với gen. Đầu 3’

của gen cũng phải mang một trình tự poly-A để đảm bảo thích hợp cho quá trình phiên

mã và dịch mã.



2.2.1.2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen

Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền

nhân (pronucleus), giai đoạn mà nhân của tinh trùng và trứng chưa dung hợp (fusion) với

nhau.

Đối với động vật có vú, trứng chín được thu nhận bằng phương pháp sử dụng kích

dục tố theo chương trình đã được xây dựng cho mỗi loài hoặc bằng phương pháp nuôi

cấy trứng trong ống nghiệm. Sau đó thụ tinh nhân tạo để tạo ra trứng tiền nhân.

Để tạo ra một động vật chuyển gen, yêu cầu cần phải sử dụng hàng trăm thậm chí

hàng ngàn trứng thụ tinh. Ví dụ: Ở bò để đạt được một lượng phôi lớn như thế, nó phải

được kích thích để rụng một lượng lớn trứng (siêu rụng trứng) thành thục và được thụ

tinh nhân tạo.

Người ta đã ức chế gen tổng hợp hormone inhibin (inhibin được xem là hormone ức

chế sự rụng trứng) từ đó làm tăng tỉ lệ rụng trứng ở trâu bò.

Sự thụ tinh nhân tạo chỉ xảy ra khi một tinh trùng gặp một trứng ở trạng thái thành

thục tối ưu. Đối với cá, giai đoạn biến nạp thích hợp là phôi ở giai đoạn 1-4 tế bào. Giai

đọan này được tạo ra bằng thu nhận trứng, tinh dịch bằng phương pháp sử dụng kích dục

tố (kích thích tố trong nhau thai của người (HCG) hoặc não thuỳ thể cá chép...), rồi thụ

tinh nhân tạo.

2.2.1.3. Chuyển gen vào động vật

Việc đạt được mục đích của việc tạo ra động vật chuyển gen đòi hỏi sự phát triển

của các phương pháp có hiệu quả để chuyển gen mong muốn vào phôi. Hiện nay có nhiều

phương pháp khác chuyển gen nhau đang được sử dụng để tạo động vật chuyển gen: vi

tiêm, chuyển gen bằng cách sử dụng các tế bào gốc phôi, chuyển gen bằng cách sử dụng

vector virus...

2.2.1.4. Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm (đối với động vật bậc cao)

Tế bào trứng tiền nhân sau khi vi tiêm được nuôi cấy trong ống nghiệm để phát

triển đến giai đoạn phôi dâu (morula) hoặc túi phôi (blastocyst). Ở giai đoạn này màng



trong (pellucida) bị bong ra và phôi có thể làm tổ được ở dạ con. Những phôi này được

cấy chuyển vào con nhận đã được gây chửa giả (pseudopregnant) để phát triển thành cá

thể con.

Đối với động vật bậc thấp như cá không cần giai đoạn này. Tuy nhiên ở cá, trứng

sau khi thụ tinh màng thứ cấp (chorion) dày lên, rất dai và dính gây trở ngại cho việc định

vị chính xác mũi kim tiêm vào vị trí mong muốn để có thể đưa được DNA vào trứng.

Mặt khác giai đoạn phôi một tế bào ở cá rất ngắn trong khi đó việc vi tiêm đòi hỏi

nhiều thao tác tỉ mỉ và chính xác. Để khắc phục các nhược điểm này, người ta có thể tiến

hành loại màng thứ cấp (Hình 2.15), kéo dài giai đoạn phôi 1-4 tế bào và ấp nhân tạo

phôi trần để tạo cá bột.

A B

Hình 2.15: Trứng cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus) trước và sau khi khử màng

thứ cấp (chorion) [2]

A. Trứng cá chạch chưa khử màng thứ cấp

B. Trứng cá chạch đã được khử màng thứ cấp

2.2.1.5. Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen

Để khẳng định động vật có được chuyển gen lạ vào hay không, người ta phải kiểm

tra xem gen lạ có xâm nhập được vào bộ máy di truyền của động vật trưởng thành hay

không và sản phẩm của gen lạ có được tổng hợp ra hay không.



Đối với vấn đề thứ nhất người ta sử dụng phương pháp lai phân tử trên pha rắn

(Southern blot, Northern blot...) hoặc PCR.

Đối với vấn đề thứ hai, sản phẩm của gen lạ được đánh giá ở hai mức độ: phiên mã

và dịch mã. Sản phẩm phiên mã được đánh giá bằng phương pháp RT-PCR, sản phẩm

dịch mã được đánh giá bằng phương pháp Western blot, ELISA hoặc kỹ thuật miễn dịch

phóng xạ (RIA) để phát hiện protein lạ trong động vật. Theo dõi các thế hệ sau của động

vật chuyển gen (F1, F2, F3, ...) để xác định gen lạ có di truyền hay không.

2.2.1.6. Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục

Sau khi kiểm tra thấy gen ngoại lai đa được di truyền ổn định, tiến hành lai tạo và

chọn lọc để tạo dòng động vật chuyển gen.

2.2.2. Các phương pháp

2.2.2.1. Các phương pháp chuyển gen không sử dụng virus

Các phương pháp chuyển gen vào tế bào động vật có vú không sử dụng virus dựa

trên những nguyên tắc sau:

- DNA được chuyển nằm ở dạng kết tủa hay trong các phức hợp tích điện (kết tủa

calcium phosphate, chuyển nhiễm DEAE-dextran).

- Thông tin di truyền được chuyển vào tế bào đích sau khi được gắn kết hay gói vào

trong các túi mỡ hay túi màng sao cho có thể dung hợp với màng nguyên sinh chất của tế

bào chủ (dung hợp tế bào trần, lipofection, erythrocyte ghost transfer).

- Việc chuyển các acid nucleic được thực hiện hoàn hảo thông qua việc mở tế bào

bằng các phương pháp vật lý (vi tiêm, laserporing, electroporation).

Để chọn phương pháp tối ưu cho từng trường hợp cụ thể, cần phải xem xét các yếu

tố khác nhau như: vector, loại tế bào chuyển nhiễm, số lượng mẫu thí nghiệm, thời gian

biểu hiện, phương pháp phân tích phục vụ chuyển gen và số lượng DNA cần phải được

duy trì trong tế bào đích sau chuyển nhiễm.



Bảng 2.1: Các phương pháp chuyển gen không sử dụng các yếu tố virus

Phương pháp Một số điểm cần lưu ý Kết tủa calcium phosphate DEAE-dextran Lipofection Tạo lỗ bằng dòng điện Dung hợp tế bào trần Dung hợp với các erythrocyte ghost Tạo lỗ bằng tia laser Vi tiêm

Cho các tế bào có tính kết dính, lượng lớn DNA/tế bào được chuyển . Là phương pháp thường được sử dụng nhất Thường sử dụng cho dịch huyền phù các tế bào. Lượng lớn DNA được chuyển. Là phương pháp hiệu quả ; RNA và protein cũng được chuyển. Tính độc của lipid có giới hạn. Lượng nhỏ DNA hay sự hợp nhất từng bản sao một được chuyển ổn định vào trong từng tế bào riêng biệt ; đặc biệt thuận lợi với các tế bào lymphoid. Thường được sử dụng cho các tế bào lyphoid. Việc chuyển toàn bộ các hợp chất trong tế bào trần có thể không có lợi. Acid nucleic và protein có thể được chuyển. Hiệu quả cao, thiết bị máy móc phức tạp và đắt tiền. Công việc chuẩn bị rất tốn kém và phức tạp. Chỉ một số giới hạn các tế bào có thể được tiêm, tuy nhiên hiệu suất là 100%. Nhân hay thành phần của tế bào chất đều có thể là đối tượng được tiêm.

[12]

Phương pháp chuyển nhiễm calcium phosphate

Kỹ thuật calcium phosphate (calcium phosphate technique) đã được phát triển đầu

tiên là để xác định sự lây nhiễm của DNA virus (Graham,1973) và hiện nay được sử

dụng rộng rãi để thử nghiệm hoạt động biến nạp của DNA virus cũng như DNA tách

chiết từ các tế bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979; Pellicer, 1980).

• Nguyên lý :

Ủ các tế bào nhận với các chất đồng kết tủa DNA và calcium phosphat (Hình 2.16).

Kết tủa này bám vào tế bào và sau đó sẽ hấp thụ vào tế bào qua quá trình ẩm bào (Loyter,

1982). Trong tế bào, các phân tử DNA ngoại lai nằm trong không bào được tạo thành do

ẩm bào và lysosome thứ hai nhưng rất ít DNA đi đến nhân vả hợp nhất vào genome chủ.



Hình 2.16 : Phức hợp DNA-calcium phosphat [2]

Phương pháp chuyển nhiễm DEAE-dextran

Đây là tác nhân hóa học đầu tiên được sử dụng để chuyển DNA vào tế bào động vật

nuôi cấy.

• Nguyên lý :

DNA ngoại lai được cho vào một trường nuôi cấy với sự có mặt của DEAE-dextran.

DEAE-dextran sẽ kết hợp với DNA tích điện âm (Hình 2.17). Sự dư thừa điện tích dương

trong phức hợp DNA-polycation do sự đóng góp của polycation, cho phép phức hợp này

đi đến kết hợp chặt chẽ hơn với màng tế bào tích điện âm. Sự xâm nhập của phức hợp có

thể đạt được nhờ sự nhập bào (endocytosis).

Hình 2.17: Sự kết hợp giữa DEAE-dextran và DNA [2]



Dung hợp tế bào trần

Trực tiếp dung hòa tế bào trần của E.coli vào tế bào động vật có vú.

Electroporation (tạo lỗ bằng dòng điện): đã trình bày ở phần 2.1.2.2.

Lipofection :

Các túi lipid mỏng (lyposomes) nối với DNA tiếp xúc với tế bào, sự gắn dính xảy ra

và tiếp đó là sự dung hợp của các túi mang điện tích dương vào các tế bào mang điện tích

âm.

Sự sử dụng các lipid cation tổng hợp làm tăng rõ rệt hiệu suất của lipofection. Tuy

nhiên phương pháp này phụ thuộc nhiều vào loại và thành phần lipid sử dụng cũng như

loại tế bào nhận.

Phương pháp vi tiêm

Đây là phương pháp hiệu quả nhất để đưa DNA ngoại bào vào các bộ phận cụ thể

của tế bào. Thao tác được thực hiện trên các tế bào phôi (embryonal cell), là điều kiện

tiên quyết cho việc sản xuất các động vật chuyển gen.

2.2.2.2. Phương pháp chuyển gen nhờ vector virus

Về nguyên tắc, bất kỳ loại virus nào cũng có thể được sử dụng làm vector để

chuyển vật liệu di truyền vào trong tế bào. Nhiều nhóm trong số đó, các papovavirus,

adenovirus, retrovirus...được sử dụng vào những mục đích chuyên biệt. Các phần khác

nhau của genome virus được thay thế bằng gen cấu trúc quan tâm.

Virus có thể được sử dụng để lây nhiễm vào tế bào giai đoạn sớm của phôi trước

khi được chuyển ghép vào con mẹ. Gen chuyển với vector retrovirus xâm nhập một cách

hiệu quả vào hệ gen của vật chủ nhưng virus sử dụng phải là virus an toàn, không gây

bệnh.

Các cơ thể chuyển gen sinh ra từ phương pháp này là ở dạng khảm. Gen chuyển chỉ

có thể di truyền được nếu retrovirus hợp nhất vào một số tế bào sinh dục



Thế hệ (F1) cần kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển. Khi gen chuyển đã hợp nhất

trong các tế bào sinh dục thì được gọi là thể khảm dòng mầm. Sau đó chúng được lai

cùng dòng khoảng 10-20 thế hệ cho đến khi thu được các động vật chuyển gen đồng hợp

tử và gen chuyển có mặt ở trong tất cả mọi tế bào. Ở giai đoạn này, phôi mang gen

chuyển có thể được đông lạnh và được bảo quản cho các quá trình cấy chuyển về sau.

Chương 3: Tăng cường folate trong các loại cây thực phẩm


CHƯƠNG 3

TĂNG CƯỜNG FOLATE TRONG CÁC LOẠI CÂY THỰC PHẨM

Mở đầu

Tetrahydrofolate (THF) và các dẫn xuất của nó (gọi chung là folates) là những

cofactor thiết yếu cho chu trình chuyển hóa một carbon cần thiết để hình thành

methionine, serine, purines, và thymidylate [31].

Trong khi thực vật và vi sinh vật có thể tổng hợp folates, con người và động vật khác

thiếu con đường tổng hợp folate hoàn chỉnh. Vì vậy con người đòi hỏi một nguồn cung

cấp từ thực phẩm.

Đối với con người, nguồn cung cấp này chủ yếu là từ thực vật. Các loại rau xanh và

các loại hạt họ đậu giàu folate, nhưng các loại thực phẩm chủ yếu như: ngũ cốc, củ, quả

lại tương đối nghèo folate. Lượng folate trong các bữa ăn thật sự không đủ ở các nước

nghèo và dưới mức tối ưu ngay cả ở những nước giàu [36]. Các hậu quả của thiếu hụt

folate bao gồm khuyết tật bẩm sinh, thiếu máu, và tăng nguy cơ mắc các bệnh về mạch và

một số bệnh ung thư [22]. Do tầm quan trọng của chất folate đặc biệt là đối với phụ nữ

mang thai, nên các chương trình tăng cường dưỡng chất trong thực phẩm đã được triển

khai ở nhiều nước [69]. Chế độ ăn uống thiếu folate có thể được cải thiện bằng cách thêm

acid folic tổng hợp vào thực phẩm chủ yếu (fortification), hoặc bằng cách uống viên acid

folic (supplement), nhưng các giải pháp này có chi phí thường xuyên cao và rất khó thực

hiện ở các nước đang phát triển. Lượng acid folic thêm vào phải tương đương với mức

tiêu thụ trung bình từ sản phẩm thực phẩm làm giàu, có nghĩa là cứ 100 μg thực phẩm làm

giàu, sẽ tương ứng với 170 μg chế độ ăn uống folate tương đương (DFE) bởi vì acid folic

được cho rằng có mức khả dụng sinh học nhiều hơn folate tự nhiên 1.7 lần.



Tuy nhiên, tiêu thụ quá nhiều axit folic (> 1mg/ngày) có thể che giấu tình trạng thiếu

vitamin B12, do đó vấn đề làm giàu thực phẩm vẫn còn là một vấn đề gây tranh cãi trong

Liên minh Châu Âu.

Ở các nước thế giới thứ ba, làm giàu sinh học (biofortification) cho các loại cây

trồng chủ yếu phối hợp với thực hành y tế công cộng thông thường sẽ giúp ích trong việc

đạt được các chế độ ăn uống folate đề nghị, đặc biệt là ở các nước đang phát triển. Tăng

cường hàm lượng folate trong thức ăn bằng kỹ thuật chuyển hóa (metabolic engineering)

là một chiến lược thay thế đầy hứa hẹn [22].

3.1. Folate

3.1.1. Giới thiệu

Folate là một trong những vitamin B có tự nhiên trong thực phẩm. Folate thuộc

nhóm vitamin tan trong nước [16]

Folic acid (vitamin B9) là dạng folate trong thuốc bổ vitamin (supplement) và được

thêm vào các loại thực phẩm tăng cường (fortification) [68].

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của folate [22]



Phân tử folate chứa pteridine, p-ABA và glutamate.

Cấu trúc folate trên (hình 3.1) là dạng monoglutamyl của tetrahydrofolate (THF).

Vòng pteridine của folate có thể tồn tại ở dạng tetrahydro, dihydro hoặc oxi hóa hoàn toàn

[22].

3.1.2. Các dạng của folate

Folate là một coenzyme tham gia vào phản ứng chuyển hóa 1 nguyên tử carbon [16].

Tetrahydrofolate và các dẫn xuất 5,10-methylenetetrahydrofolate; 5,10-

methenyltetrahydrofolate; 10-formyltetrahydrofolate và 5-methyltetrahydrofolate là

những dạng hoạt động của folic acid.

Chức năng chủ yếu của tetrahydrofolate là điều hòa duy trì nồng độ formaldehyde

và formate trong cơ thể ở trạng thái cân bằng vừa không gây độc làm hại tế bào vừa sẵn

sàng tham gia quá trình chuyển hóa cần thiết. Ngoài ra nó còn là nguồn cung cấp nhóm

methyl –CH3 [16].

Những nguồn có nhiều folate là đậu đỗ, cây họ đậu, thực phẩm cam quít, rau ăn lá

màu xanh đậm, bánh mì và ngũ cốc được tăng cường, các loại hạnh và hạt [3].

Bảng 3.1: Những cây lương thực có folate

Loại cây Hàm lượng folate (nmol/g phần ăn được)Gạo (hạt trắng, chưa nấu) 0.13-0.18 Lúa mì (hạt cứng, trắng, chưa nấu) 0.84-0.95 Ngô (hạt vàng, chưa nấu) 0.42 Cà chua (quả) 0.2-0.64 Đậu Hòa Lan (xanh, chưa nấu) 1.45 Rau spinach (lá, chưa nấu) 4.31 Đậu (hồng, hạt trưởng thành, chưa nấu ) 10.28

[53]



3.1.3. Sự thiếu hụt folate và sức khỏe

Hiện nay, FDA đã chấp nhận folate như một chất dinh dưỡng chức năng [3]

Folate rất cần thiết cho việc sản sinh ra tế bào hồng cầu khỏe mạnh [53]. Nếu cơ thể

không có đủ folate, có thể bị thiếu máu, cảm thấy mệt mỏi hoặc yếu ớt, hoặc không thể

tập trung tư tưởng.

Ngoài ra, folate còn cần thiết để cơ thể tạo ra chất di truyền (DNA) mới, chẳng hạn

như trong thời gian thai nghén. Nếu phụ nữ dự định có thai, folate rất quan trọng vì folate

giúp ngừa một số khuyết tật bẩm sinh [68], có thể giảm nguy cơ sinh con thoát dịch não,

tủy sống, quái thai [3, 54].

Kết quả của việc thiếu folate dẫn đến các rối loạn nghiêm trọng, bao gồm cả các

khuyết tật ống thần kinh (NTD) như tật nứt đốt sống ở trẻ sơ sinh và bệnh thiếu máu. Chế

độ ăn uống đầy đủ folate có thể ngăn ngừa sự khởi đầu của những tình trạng này [53].

Người ta cho rằng các ống thần kinh được hình thành giữa ngày 21 và 27 sau khi thụ thai

(trước khi hầu hết phụ nữ nhận ra họ đang mang thai), nguy cơ NTD chỉ có thể được giảm

thiểu nếu phụ nữ có lượng folate cao từ giai đoạn gần thụ thai đến tuần mang thai thứ 12.

Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng tỷ lệ NTD ở các vùng nghèo nhất khu vực Ấn Độ và

Trung Quốc có thể gấp 10 lần so với ở phương Tây [22]. Tình trạng thiếu folate cũng liên

quan với sự xuất hiện của một số rối loạn thoái hóa thần kinh (như bệnh Alzheimer), nguy

cơ bệnh tim mạch cao hơn, và sự phát triển của một loạt các bệnh ung thu, mặc dù không

có mối quan hệ nhân quả nào được xác minh cho đến ngày hôm nay.

Tiêu dùng nguồn thực phẩm có hàm lượng folate cao rất quan trọng trong thời kỳ

phân bào nhanh và tăng trưởng, đặc biệt trong giai đoạn thai kỳ. Thiếu folate sẽ gây ra

hiện tượng thiếu một phần não (anencephaly) hoặc hiện tượng nứt đốt sống (spina bifida)

hoặc các dây thần kinh không đóng lại được ở trẻ em, và hiện tượng thiếu máu hồng cầu

to (megaloblastic anemia) ở người trưởng thành. Nhiều nghiên cứu cho thấy bổ sung

thêm folic acid sẽ làm giảm có ý nghĩa các hiện tượng khiếm khuyết ống thần kinh, đột

quỵ (stroke) và một vài bệnh ung thư [53].



3.1.4. Nhu cầu

Dưới đây là nhu cầu folate đề nghị được biểu diễn dưới đơn vị DFE (lượng folate

tương đương trong thực phẩm)

Bảng 3.2: Nhu cầu folate đề nghị cho trẻ em và người lớn

Độ tuổi

Nam và Nữ (μg DFE/ngày)

Phụ nữ có thai(μg DFE/ngày)

Phụ nữ cho con bú (μg DFE/ngày)

1-3 150 - - 4-8 200 - - 9-13 300 - -

14-18 400 600 500 19+ 400 600 500

[70]

Có khác biệt về mức hấp thụ folate trong thực phẩm tự nhiên và folic acid trong

thuốc bổ hoặc thêm vào thực phẩm làm giàu.

1 μg DFE (1 μg folate trong thực phẩm) tương đương với 0.6 μg folic acid từ thực

phẩm tăng cường hoặc thuốc bổ uống trong bữa ăn, và tương đương 0.5 μg thuốc bổ uống

khi bụng đói [68].

Theo như bảng 3.2 thì người lớn cần 400 μg lượng folate tương đương trong thực

phẩm (DFE) mỗi ngày.

Phụ nữ trong tuổi mang thai từ 14 tuổi trở đi, dù có kế hoạch có thai hay không, cần

400 μg DFE mỗi ngày.

Phụ nữ có thai và cho con bú sữa mẹ cần nhiều folate hơn. Lượng folate được đề

nghị là 600 μg DFE cho phụ nữ có thai và 500 μg DFE cho phụ nữ cho con bú sữa mẹ

Uống hơn 1 milligram mỗi ngày phải có chỉ định của bác sĩ [70].



3.2. Cà chua tăng cường folate thế hệ 1 [27]

Các nhà khoa học đã chọn cà chua để điều khiển con đường tổng hợp folate, bởi vì

chúng có tầm quan trọng trên toàn thế giới như một cây lương thực, về mặt di truyền học

phân tử đã được hiểu biết rõ ràng, và chúng chứa hàm lượng folate tương đối thấp [28].

Các nhà nghiên cứu tại Đại học Florida đã tìm ra một cách để tăng hàm lượng các vi

chất dinh dưỡng trong cà chua sử dụng việc thay đổi biến dưỡng. Nhóm nghiên cứu của

Rocío Díaz de la Garza đã tạo ra một loại cà chua chuyển gen sản sinh ra hàm lượng chất

folate tương đương với nửa hàm lượng đề xuất cần cho người lớn trong một khẩu phần ăn

chuẩn [27, 69].

3.2.1. Nguyên lý

Folates là phân tử gồm ba phần bao gồm pteridine, p-aminobenzoate (PABA), và

một hoặc nhiều glutamate. Ở thực vật, phần pteridine được sản xuất trong tế bào chất,

PABA được hình thành trong lạp thể, cả hai hợp lại với nhau và được glutamyl hóa trong

ty thể [27]. Trong quả cà chua, các enzyme đầu tiên của quá trình tổng hợp pteridine,

GTP cyclohydrolase I (GCHI), biến mất lúc quả bắt đầu chín, cắt đứt nguồn cung cấp

pteridine. Bởi vì cà chua chín chứa một lượng lớn glutamate và một lượng trung bình

PABA [27, 28]

Bước đầu tiên hợp lý để nâng cao quá trình tổng hợp folate là duy trì liên tục hoạt

động của GCHI. Một cách tiềm năng để đạt được điều này là sử dụng một gen tổng hợp

dựa trên GCHI của động vật có vú vì enzyme này dường như không chịu tác động kìm

hãm ngược (retroinhibition) in planta.

Có 2 lý do. Trước tiên, sự kìm hãm ngược GCHI của động vật có vú được qua trung

gian bởi một protein điều hòa phản hồi, mà ở thực vật không xuất hiện [21]. Thứ hai, sản

phẩm ức chế cuối của GCHI động vật có vú là tetrahydrobiopterin, chất này dường như

thiếu ở thực vật [35]. Các nhà khoa học đã đưa ra các kỹ thuật thành công tác động vào

con đường folate ở cà chua bằng cách sử dụng một gen GCHI tổng hợp.



Hình 3.2: Con đường sinh tổng hợp folate [22]

Các hợp chất viết tắt: ADC, aminodeoxychorismate; DHF, dihydrofolate; DHM,

dihydromonapterin; DHN, dihydroneopterin; DHP, dihydropteroate; –Glc, glucose ester;

–Glun, polyglutamate; HMDHP, hydroxymethyldihydropterin; –P, phosphate; –P2,

diphosphate; –P3, triphosphate; THF, tetrahydrofolate.

Các enzyme: 1, GTP cyclohydrolase I; 2, DHN-P3 pyrophosphatase; 3, non-specific

phosphatase; 4, dihydroneopterin aldolase; 5, aminodeoxychorismate synthase; 6,

aminodeoxychorismate lyase; 7, hydroxymethyldihydropterin pyrophosphokinase; 8,

dihydropteroate synthase; 9, dihydrofolate synthase; 10, dihydrofolate reductase; 11,

folylpolyglutamate synthase; 12, p-ABA glucosyltransferase.



3.2.2. Vật liệu và phương pháp

3.2.2.1. Cấu trúc vector biểu hiện

Vector pMON10086 [34] chứa promoter E8 của cà chua, terminator đậu Rubisco, và

gen kháng kanamycin npt II đã được điều chỉnh bằng cách cắt ở vị trí NotI và nối một

polylinker (5’-GGATCCGCGGCCGCGAATTCAGGCCTGGTACCGGCGCGCCAGA-

TCT-3’) vào vị trí BamHI duy nhất giữa promoter E8 và terminator.

cDNA GCHI của động vật có vú (GenBank accession no. BE136861) được điều

chỉnh bằng cách sử dụng mồi PCR để thay đổi trình tự của codon khởi đầu sang trình tự

tương đồng của thực vật TAAACAATG và để thay thế 17 codon hiếm (Hình 3.4). Những

nucleotide được mã hóa lại được in đậm và nghiêng.

cDNA tổng hợp này được chèn vào giữa vùng NotI và AscI của vector điều chỉnh

và đưa vào chủng Agrobacterium tumefaciens bằng phương pháp điện biến nạp.

Hình 3.3: Cấu trúc vector pMON10086 [34]



Hình 3.4: Vùng 5’ của cDNA GCHI tổng hợp [27]

Hình 3.5: Nguyên lý tạo cây cà chua chuyển gen thế hệ 1 [27]

3.2.2.2. Cây chuyển gen

Cấu trúc trình tự GCHI và vector đã được điều chỉnh được dùng để biến đổi cà chua

(Lycopersicon esculentum Mill., cv. MicroTom). Thể biến nạp được chọn và tái tạo trên

môi trường chứa 100μg.ml-1 kanamycin. Cây non kháng kanamycin được sàng lọc để tìm

ra cấu trúc GCHI bằng phương pháp PCR với mồi mong muốn nằm trong promoter E8

(5’-CTTTCTTGTTCCCATTTCTC-3’) và mồi đảo ngược (reverse primer) từ vùng mã

hóa GCHI (5’-ATGCACATGTGTGTCGCTTC-3’); thể biến nạp vector rỗng được kiểm

tra lại bằng cách sử dụng mồi cho gen npt II. Cây dương tính với cấu trúc GCHI được

chuyển qua đất và phát triển đến trưởng thành trong buồng tăng trưởng (16-h ngày; 23°C;

mật độ dòng quang hợp, 200 μmol photon mỗi m2 mỗi s mỗi 8-h đêm; 20°C) và tưới với

dung dịch dinh dưỡng.

Trái cây được thu hoạch ở các giai đoạn nêu trong văn bản. Để thống nhất, các giai

đoạn chín đỏ và đỏ được quy định tương ứng là 3 và 7 ngày sau giai đoạn breaker. Trong



thí nghiệm bổ sung PABA vào, trái cây giai đoạn breaker đã được cắt tại gốc của các

cuống, bổ sung PABA thông qua cuống với 2μmol PABA trong 100μ l nước hoặc nước

trong 1 ngày (đối với mẫu đối chứng), sau đó khử cuống (destalked) và cho chín thêm

trong hơn 6 ngày ở 23°C.

3.2.2.3. Phân tích Western Blot bằng kháng thể

Để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp, các cDNA GCHI tổng hợp được nhân dòng

vào vùng EcoRI và XhoI của plasmid pET28b (Novagen), có thêm các đoạn mẫu

hexahistidine cho cả hai đầu (termini).

Cấu trúc này được điện biến nạp vào tế bào Escherichia coli BL21 (DE3)

CodonPlus-RIL (Stratagene), và protein tái tổ hợp đã được phân lập từ các tế bào cảm

ứng isopropyl β-D-thiogalactoside bằng sắc ký ái lực Ni2+ dưới điều kiện biến tính, tiếp

theo là chuẩn bị SDS/PAGE.

Kháng thể thỏ đã được chuẩn bị bởi Cocalico Biologicals (Reamstown, PA). Để

hiển thị biểu hiện GCHI, protein được chiết xuất từ mô vỏ quả bằng cách nghiền trong

0.1M Tris HCl (pH 8,0) có chứa ascorbate 15 mM, DTT 2 mM, và

Polyvinylpolypyrrolidone 3% (wt/vol). Sau khi được làm sạch bằng cách ly tâm, các mẫu

(80 μg protein) được tách trên gel SDS-polyacrylamide, sau đó được chuyển qua màng

nitrocellulose, và khảo sát với huyết thanh miễn dịch pha loãng 1:2,000.

3.2.2.4. Phân tích pteridine và PABA.

Những múi quả đại diện (0,70g) được nghiền thành bột trong N2 lỏng và đồng nhất

với 7 ml methanol.

Đối với phân tích pteridine, một phần chia 600μl của chất đồng nhất (homogenate)

được trộn với 250μl của CHCl3 và 50μl nước, lắc trong 40 phút. Sau đó thêm 225μl

CHCl3 và 340μl nước. Sau khi lắc trong 20 phút và ly tâm để phá vỡ nhũ tương, pha dung

dịch nước được lấy ra, sấy in vacuo, và hòa tan lại trong 200μl nước. Mẫu được oxi hóa

bằng cách thêm 0,1 thể tích của một dung dịch gồm I2 1% và KI 2% (wt/vol) trong HCl 1



M và ủ trong bóng tối trong 1h, I2 thừa sau đó được lấy ra bằng cách thêm 10μl Na-

ascorbate 5% (wt/vol).

Các mẫu bị ôxi hóa được tách bằng HPLC với cột Ultremex C18 IP (Phenomenex,

Belmont, CA) 5 - μm, 250 x 4,6-mm, hoặc cột Synergi Fusion-RP 80 (Phenomenex) 4 -

μm, 4,6 x 250-mm tách rửa với Na-phosphate 10 mM (pH 6,0) 1,5 ml/min. Các peak

được phát hiện bằng mẫu dò huỳnh quang Waters 2.475 (350-450 nm) và xác định được

bằng cách tham chiếu đến các thang chuẩn và tính chất quang phổ.

Để kiểm tra các trạng thái ôxi hóa pteridine, 2-mercaptoethanol 10 mM và Na-

ascorbate 2% (wt /vol) được thêm vào môi trường dịch chiết methanol, và bước oxi hóa

được bỏ qua. Đỉnh pteridine liên hợp đã được thu hồi từ phase động nhờ phương pháp

trao đổi ion và được xử lý bằng HCl (1M, 100°C, 1 h) hoặc với α-glucosidase nấm men

hoặc almond β-glucosidase (2 đơn vị trong 40 μl dung dịch Na-phosphate 10mM, pH 6,0,

37°C, 5-120 phút).

Các đỉnh của 6-carboxypterin, neopterin, monapterin, và 6-hydroxymethylpterin

được định lượng tương đối so với thang chuẩn pteridines; đỉnh liên hợp được định lượng

tương đối tương ứng với pteridine tự do vì quá trình thủy phân không làm thay đổi năng

suất huỳnh quang. Thang chuẩn Pteridine từ phòng thí nghiệm Schircks (Jona, Thụy Sĩ).

Một phần 5-ml dịch chiết methanol trên được sử dụng cho phân tích PABA tổng (ví

dụ như, PABA tự do cộng với PABA glucose ester) bằng thủy phân acid, sắc ký trao đổi

cation, sự phân cắt ethyl acetate, và HPLC huỳnh quang.

3.2.2.5. Phân tích Folate

Folates được chiết xuất từ những phần quả đại diện (0,5-1,0 g) bằng cách đồng nhất

polytron trong 10 ml Na-Hepes 50 mM / 2 – (N-cyclohexylamino) ethanesulfonic acid 50

mM điều chỉnh đến pH 7,9 với HCl có chứa CaCl2 1 mM, Na-ascorbate 2% (Wt /vol), và

2-mercaptoethanol 10 mM. Sau đó đun sôi trong 10 phút và ly tâm (13.000 x g) trong 10

phút. Các pellet sau đó được chiết lại cùng một cách như vậy.



Các dịch chiết kết hợp được xử lý bằng 1ml huyết thanh chuột thẩm tách ở 37°C

trong 2 h để khử glutamyl hóa folate.

Mẫu sau đó đun sôi trong 15 phút, ly tâm như trên, lọc qua sợi thuỷ tinh, và đặt vào

cột ái lực folate. Sau khi được rửa sạch với 5 ml K-phosphate 25mM (pH 7,0)/ Na-

ascorbate 1% (đệm 1) có chứa NaCl 1M, sau đó với 5 ml chỉ dung dịch đệm 1, các cột

được tách rửa với 5 ml HPLC phase động A (xem bên dưới) có chứa acid ascorbic 1%.

Mẫu tách rửa (400μ l) được đưa phân tích HPLC với phát hiện điện hóa [20], sử dụng một

cột Prodigy ODS2 (Phenomenex) 5 –μm, 150 x 3,2 mm và một máy dò bốn-kênh

(CoulArray Model 5600A, ESA, Chelmsford, MA) với điện thế đặt ở 0, 300, 500, và 600

mV. Phase động là một hỗn hợp 2 cấu tử của K2HPO4 28 mM và H3PO4 0,59 mM (pH

2,5) (đệm A) và hỗn hợp của đệm A 75% (vol/vol) và CH3CN 25% (đệm B) với một

chương trình tách rửa phi tuyến trong 55-phút từ 90% đệm A đến 100% đệm B ở mức 1

ml/min. Kết quả máy dò được hiệu chỉnh bằng cách sử dụng THF, 5-methyl-THF, 5,10 –

methenyl-THF, 5-formyl-THF, và acid folic chuẩn từ Schircks.

Để phân tích của chiều dài đuôi polyglutamyl [20], quá trình xử lý huyết thanh chuột

được bỏ qua. Chiết xuất folate từ hồng cầu người đã được sử dụng để xác định thời gian

duy trì của 5 – methyl-THF polyglutamates [45].

3.2.3. Kết quả

3.2.3.1. Biểu hiện vượt mức GCHI trong quả chín làm tăng mức Pteridine

Một gen GCHI tổng hợp đã được xây dựng bằng cách mã hóa lại một phần cDNA

GCHI động vật có vú (Hình 3.4) và bằng cách điều chỉnh các trình tự xung quanh codon

đầu tiên để phù hợp với sự đồng nhất ở thực vật [37]. Gen tổng hợp này được đặt sau E8

promoter chín đặc hiệu [26] trong vector kép Agrobacterium và được đưa vào cây cà

chua.

Kiểm tra bằng phân tích Western để xác định thể biến nạp biểu hiện protein có kích

thước đúng 27kDa trong kiểu chín đặc hiệu.



12 thể biến nạp GCHI+ như thế, tạo thành 1 dãy các mức độ biểu hiện protein, được

chọn cho những phân tích xa hơn với 10 vector đối chứng rỗng. Các cây GCHI+ và trái

của chúng không thấy có khác biệt so với những cây đối chứng.

Pteridines được phân tích bởi HPLC huỳnh quang sau khi chuyển đổi sang dạng oxi

hóa đầy đủ, dạng huỳnh quang. Kết quả pteridine của quả GCHI+ khác rất nhiều so với

pteridine của những vector đối chứng (Hình 3.6). Đo ở giai đoạn chín đỏ, lượng pteridine

tổng của quả GCHI+ cao hơn 3 đến 140 lần hơn mức trung bình của những mẫu đối

chứng. Theo dõi pteridines trong quá trình chín cho thấy quả GCHI+ bắt đầu khác so với

những mẫu đối chứng sau giai đoạn chín xanh và hàm lượng pteridine của chúng cao nhất

ở giai đoạn chín đỏ (Hình 3.7). Mẫu tích lũy pteridine phù hợp với các hoạt động dự kiến

của promoter E8 được sử dụng để điều khiển biểu hiện GCHI [26].

Hình 3.6: Phân tích HPLC huỳnh quang những pteridine oxi hóa trong quả chín đỏ

(Cột Ultramex C18 IP) [27]

M102: Thể biến nạp GCHI+ đại diện; V6: Vector đối chứng

CPt: 6-carboxypterin; NPt: neopterin; MPt: monapterin; U1: unknown 1; U2: unknown 2;

HMPt: 6-hydroxymethylpterin.

Phút



Hình 3.7: Sự thay đổi trong lượng pteridine tổng của quả đối chứng (V2) và quả

GCHI+ trong suốt quá trình chín [27]

MG: giai đoạn chín màu xanh lá cây (mature green stage); Br: giai đoạn breaker (breaker

stage); R: giai đoạn quả màu đỏ (red stage); RR: giai đoạn chín đỏ (red-ripe stage)

Hình 3.8 : Các giai đoạn chín của cà chua [27]

Pteridien (nmol/g trọng lượng tươi)



3.2.3.2. Sự hình thành Pteridine

Loại pteridine chính tìm ra trong trái cây GCHI+ bao gồm neopterin, monapterin, 6-

hydroxymethylpterin, ở dạng oxi hóa của các chất trung gian tổng hợp folate, và 6-

carboxypterin, một chất dị hóa của pteridines và folates (Hình 3.6).

Sự nhận dạng của 6-hydroxymethylpterin đã được xác nhận bằng cách sử dụng

HPLC MS để kiểm tra khối lượng của nó ([M+H]+= m/z 194) và mô hình phân mảnh liên

quan đến một tiêu chuẩn đáng tin cậy. Quả GCHI+ cũng cho thấy đỉnh ở 7,5 và 9,5 phút

không phù hợp bất kỳ các tiêu chuẩn nào (Hình 3.6). Acid thủy phân chuyển hóa những

chất không xác định này (unknowns) về dạng neopterin và monapterin, tương ứng, cũng

như xử lý với almond β-glucosidase nhưng không phải α-glucosidase nấm men (Hình

3.10). Kết quả này chỉ ra rằng cả hai đỉnh chưa biết được chính là β -D-glycoside. Các tỷ

lệ tương đối của nhiều pteridines tương tự nhau trong tất cả các quả GCHI+, bất kể mức

độ tuyệt đối (Hình 3.9). Quả đối chứng có đỉnh nhỏ với cùng số lần retention giống như

hầu hết các pteridines trong quả GCHI+ (dữ liệu không được hiển thị) nhưng có quá ít vật

liệu để xác định quang phổ.

Hình 3.9: Định lượng các pteridine chính trong quả chín đỏ của 3 thể biến nạp

GCHI+ đại diện [27]

CPt: 6-carboxypterin; NPt: neopterin; Mpt: monapterin; NPt-G: neopterin

glycoside; MPt-G: monapterin glycoside; HMPt: 6-hydroxymethylpterin

Pteridien (nmol/g trọng lượng tươi)



Hình 3.10: Phân tích HPLC huỳnh quang peak 1 và 2 chưa biết trước và sau khi xử lý

với HCl, α-glucosidase hoặc β-glucosidase [27]

Các trạng thái ôxi hóa in vivo của pteridines trong các quả GCHI+ đại diện đã được

nghiên cứu bằng cách so sánh các mẫu chiết xuất với sự hiện diện của mercaptoethanol-2

và ascorbate (để duy trì trạng thái oxi hóa tự nhiên) và không được xử lý oxy hóa, với các

mẫu tương tự được chiết xuất và ôxi hóa như bình thường.

Phút Phút

Peak 1 chưa biết Peak 2 chưa biết

Đối chứng Đối chứng



Vì pteridines dạng khử không phát huỳnh quang, sự khác biệt trong kích thước giữa

các đỉnh giữa xử lý oxy hóa và không oxy hóa được đo bằng pteridines dạng khử. Phương

pháp này chỉ ra rằng vốn pteridine bị khử đặc trưng 50-90% ở giai đoạn breaker và giai

đoạn màu đỏ, nhưng ≤20% bị khử ở giai đoạn chín đỏ. Các pteridines dạng khử xuất hiện

là các dạng dihydro, không phải tetrahydro, bởi vì xử lý alkalinke I2 không sinh ra bất cứ

pterin nào, một sản phẩm theo giả định được phân ra từ tetrahydro pteridines trong các

điều kiện này [30].

3.2.3.3. Tích lũy pteridine làm tăng hàm lượng Folate.

Hàm lượng folate tổng của quả đối chứng giảm trong khoảng từ 0.8 đến 2.3 nmol/g

trọng lượng tươi (FW), trong khi hầu hết tất cả các quả GCHI+ vượt quá khoảng này

(Hình 3.11) và ý nghĩa của phân bố GCHI+ gấp đôi ở những mẫu đối chứng (2.99 so với

1.47nmol/g FW; khác biệt ý nghĩa ở mức P < 0.001 bằng t test).

Sự tăng folate được tích lũy chủ yếu bởi 5-methyl-THF và 5,10-methenyl-THF, cả 2

đều là dạng chủ yếu trong quả đối chứng chỉ chứa vector (hình 3.12).

Hình 3.11: Hàm lượng folate tổng trong quả chín đỏ của 12 thể biến nạp GCHI+ và 10

thể biến nạp đối chứng [27]

Folate (nmol/g trọng lượng tươi)



Hình 3.12: Phân tích folate trong quả GCHI+ và quả đối chứng [27]

(Phase động có tính axít được sử dụng trong phân tích HPLC gây ra chuyển đổi định

lượng của 10-formyl-THF sang 5,10-methenyl-THF, cho nên các đỉnh 5,10 -methenyl-

THF bao gồm cả 10-formyl-THF và 5,10-methenyl-THF bất kỳ có thể tồn tại từ trước)

Phân tích các dạng polyglutamyl của 5-methyl-THF cho thấy một phân bố tương tự

trong GCHI+ và quả đối chứng, với hexaglutamate chi phối trong cả hai loại quả này.

Các dạng folate khác cũng tồn tại chủ yếu như polyglutamates trong cả GCHI+ và

quả đối chứng (dữ liệu không được hiển thị). Kết hợp với nhau, những dữ liệu này cho

thấy folate tăng lên trong quả GCHI+ tất cả đều ở dạng bình thường.

Vùng phân bố của mức pteridine tổng so với hàm lượng folate cho thấy mức folate

tối đa đạt được với mức pteridien tổng số ≈25nmol mỗi g FW và khi tăng pteridine nhiều

hơn không mang lại lợi ích gì.

Trong thực tế, phân tích hồi quy chỉ ra sự tương quan tiêu cực đáng kể giữa hàm

lượng folate và mức pteridine cho trái cây với >25 nmol pteridine mỗi g FW. Tương quan

tiêu cực tương tự cũng được tìm thấy giữa folate và mỗi pteridine riêng lẻ ngoại trừ

hydroxylmethylpterin. Xu hướng tiêu cực như vậy sẽ làm tăng khả năng nếu pteridines




vượt quá giới hạn, vượt ra ngoài sẽ không cho hàm lượng folate cao, mà thực sự còn có

thể ngăn cản hình thành folate.

3.2.3.4. Sự tích lũy folate có liên quan đến sự suy giảm của PABA

Bởi vì vốn PABA tổng trong cà chua không được tác động là khoảng cùng độ lớn

(1-2 nmol/g FW) [46] với sự tăng folate trong quả GCHI+, các nhà khoa học đã kiểm tra

mối quan hệ giữa mức folate và PABA. Một mối quan hệ tiêu cực rõ ràng đã được chứng

minh, và quả GCHI+ có hàm lượng folate cao nhất có rất ít PABA. Hơn nữa, có thể tính

toán được từ dữ kiện thí nghiệm rằng trong 5 quả chứa nhiều folate nhất, 90-97% phần

PABA hiện diện trong quả ở dạng liên kết chặt chẽ với folate.

3.2.3.5. PABA ngoại sinh tăng sự tích lũy folate

Để kiểm tra sự suy giảm của PABA có giới hạn sự tích lũy folate hay không, quả

GCHI+ được thu hoạch ở giai đoạn breaker, cung cấp PABA qua cuống (hoặc nước với

mẫu đối chứng), và cho chín. Mô quả sau đó được phân tích để kiểm tra PABA và folate.

Giữa các quả từ 7 thể biến nạp khác nhau, những quả được cho PABA vào có mức PABA

cao hơn những quả đối chứng. (57±26 so với 1.8±0.5 nmol mỗi g FW) và có hàm lượng

folate cao hơn từ 2.5 đến 10 lần (hình 3.13). Cho PABA vào quả chứa vector rỗng không

làm tăng đáng kể mức folate (dữ liệu không được hiển thị). Mức folate trong mẫu đối

chứng cho nước vào quả GCHI+ (hình 3.13), chín ngoài cây, thì tương tự quả chín trên

cây (hình 3.11).

Hình 3.13: Ảnh hưởng của PABA ngoại sinh đến hàm lượng folate [27]


Nước PABA



3.2.4. Bàn luận

Đặt một enzyme không cảm ứng ngược (feedback-insensitive) ở đầu con đường tổng

hợp là kỹ thuật cơ bản để gia tăng dòng chuyển hóa, và như kết quả được trình bày, nó đã

làm việc trên nhánh pteridine của quá trình tổng hợp folate trên quả cà chua. GCHI động

vật có vú được chuyển vào được dự kiến sẽ không chịu kìm hãm ngược in planta và thể

hiện hiệu quả cao trong việc tăng dòng pteridines, cụ thể đã đạt đến mức 140 lần giá trị

trung bình trong quả đối chứng.

Với một kỹ thuật cơ bản tương tự, nhưng sử dụng GCHI vi khuẩn, cũng đạt được

thành công trong gia tăng hàm lượng pteridine trong lá Arabidopsis [33]. Những chất

trung gian tổng hợp folate dihydroneopterin, dihydromonapterin, và

hydroxymethyldihydropterin nằm giữa pteridines được tích lũy trong cà chua GCHI+, cho

thấy rằng ba enzyme trực tiếp xuôi dòng của GCHI tất cả vẫn hoạt động trong quá trình

chín của trái cây và có thể làm dòng tăng lên.

Acid-không bền cùng gốc của neopterin và monapterin cùng ở trong số các

pteridines tìm thấy trong quả GCHI+ và, giống như các pteridines khác, xuất hiện rộng rãi

ở dạng dihydro in vivo.

Dựa trên tính nhạy cảm của chúng để thủy phân bởi almond β-glucosidase, chúng đã

được xác định là β-D-glycosides. Mặc dù glycoside của pteridines nhiều loại, bao gồm cả

neopterin và monapterin, được biết đến từ vi khuẩn lam và các sinh vật nhân sơ khác,

dường như không có báo cáo trước đó về sự xuất hiện của chúng trong thực vật.

Bởi vì quả có vector đối chứng cho thấy những đỉnh nhỏ với số lần duy trì tương tự

như glycosides, những hợp chất này có thể có vai trò như là một vốn dự trữ tự nhiên cho

tiền chất của folate. Nếu như vậy, một sự tương đương có thể được suy ra với tiền chất

PABA, mà tồn tại chủ yếu in vivo như glucose liên hợp.

So với lượng dư thừa lớn của pteridines trong quả GCHI+, sự gia tăng folate là

khiêm tốn (2 lần trong hầu hết quả GCHI+, và gần bằng 3 lần trong trường hợp cao nhất)



Do đó, rõ ràng có một sự kiềm chế về dòng trong con đường tổng hợp folate trong

quả cà chua ở một vài điểm ở hạ nguồn từ hydroxymethyldihydropterin (Hình 3.2).

Các kiềm hãm tương tự áp dụng cho các con đường tổng hợp folate trong lá

Arabidopsis, bởi vì gần 1.000 lần tăng pteridines chỉ tăng 3 lần folates [33]. Một ứng cử

viên mạnh mẽ cho sự kiềm hãm này là việc cung cấp PABA (hình 3.2). Các mối tương

quan ngược giữa PABA và mức folate, những sự suy giảm nghiêm trọng của PABA trong

quả GCHI+ với hàm lượng folate cao, và sự gia tăng folate trong khi PABA được cung

cấp (hình 3.13) tất cả chỉ ra rằng PABA trở thành giới hạn thông lượng để folates tăng

trong quả chín. Cách lý giải này tiếp tục được ủng hộ bằng việc tìm thấy biểu hiện của

gen đầu tiên của quá trình tổng hợp PABA, aminodeoxychorismate synthase, chấm dứt

đột ngột sau khi giai đoạn breaker.

Mục tiêu kỹ thuật tiếp theo là tăng cường sinh tổng hợp của PABA trong quả cà

chua đã được thiết kế để sản xuất vượt quá hàm lượng pteridines. Thật thú vị, việc cung

cấp PABA cũng hạn chế tổng hợp folate trong vi khuẩn lactic acid.

Sự tích lũy quá nhiều các chất trung gian diễn ra khi quá trình kìm hãm ngược được

hủy bỏ bằng kỹ thuật, đôi khi có thể phản tác dụng. Đã có một số bằng chứng về điều này

trong nghiên cứu của chúng tôi, bởi vì trong quả giàu pteridine nhất, mức folate vẫn có

tương quan ngược với mức pteridine tổng và với hầu hết các mức pteridine riêng lẻ. Có

thể hình dung là pteridine tích lũy có vai trò như là chất ảnh hưởng tiêu cực đến con

đường folate, ví dụ như enzyme kìm hãm cạnh tranh hoặc chất vận chuyển.

Dù trong trường hợp nào đi nữa, việc tích tụ quá nhiều pteridine rõ ràng không cần

thiết để tăng cường mức folate. Hơn nữa, mức pteridine bên ngoài phạm vi tự nhiên cho

cây là không mong muốn từ quan điểm dinh dưỡng vì ảnh hưởng của lượng pteridine cao

là chưa biết. So sánh với phạm vi tự nhiên của mức pteridine báo cáo trong cây trồng thực

phẩm, mức pteridine tổng trong quả GCHI+ cao hơn 10 lần, và mức trong lá Arabidopsis

đã qua kỹ thuật là nhiều hơn gấp 1,000 lần.



Quả GCHI+ chuyển gen là một bước quan trọng đầu tiên hướng tới một sản phẩm

làm giàu sinh học hữu hiệu, bởi vì mức folate cao nhất đạt được cho đến nay (≈4nmol mỗi

g FW) là tương đương với 180μg mỗi 100g tiêu chuẩn. Mức này sẽ cung cấp cho toàn bộ

chế độ ăn uống đề nghị đối với một đứa trẻ và gần một nửa cho người lớn. Tuy nhiên, các

mức folate cao đã được quan sát trong quả GCHI+ chín trên cây, và quả tương đương

chín sau khi cắt cuống ở giai đoạn breaker chứa ít folate hơn. Ảnh hưởng tiêu cực này của

sự cắt cuống có thể quy cho mạng lưới lớn folate giảm xuống trong quả cắt cuống [21] và

có thể giải thích vì sao hàm lượng folate của cà chua trữ quá thấp, bởi vì chúng chín sau

khi thu hoạch. Trong mọi trường hợp, sự mất mát folate sau thu hoạch cho thấy rằng sự

quan tâm kỹ thuật phải được đặt lên trên sự giảm hụt folate cũng như sự tổng hợp folate.

3.3. Cà chua tăng cường folate thế hệ 2 [28]


3.3.1.1. Cấu trúc vector biểu hiện

Trong thí nghiệm này các nhà khoa học đã sử dụng vector pMON10086 chứa

promoter E8 cà chua, trình tự mã hóa AtADCS, At2g28880. Trình tự tương đồng của thực

vật TAAACA được thêm vào trước codon bắt đầu.

cDNA tổng hợp này được chèn vào giữa vùng NotI và AscI của vector điều chỉnh và

đưa vào chủng Agrobacterium tumefaciens bằng phương pháp điện biến nạp [28].

3.3.1.2. Cây cà chua chuyển gen

Cà chua chuyển gen bởi A. tumefaciens chứa cấu trúc AtADCS, sẽ được chọn lọc và

tái tạo tương tự như cà chua chuyển gen thế hệ 1.



Hình 3.14: Nguyên lý tạo cây cà chua chuyển gen thế hệ 2 [28]

3.3.1.3. Lai các cây chuyển gen

Ở thí nghiệm này người ta tiến hành lai các cây chuyển gen GCHI+ và AtADCS+

với nhau. Quả của các dòng AtADCS+ và GCHI+/AtADCS+ sẽ được thu hoạch ở giai

đoạn chín đỏ, bảo quản trong N2 lỏng, trữ ở -80oC cho đến khi được đem ra phân tích.

3.3.2. Kết quả

Quả chuyển gen AtADCS+ chứa mức trung bình gấp 19 lần lượng PABA, so với

mẫu đối chứng thuộc chủng hoang dại, không có sự gia tăng hàm lượng folate.

Quả chuyển gen GCHI+/AtADCS+ tích lũy lượng folate trung bình gấp 19 lần mẫu

đối chứng, mức folate đạt được (840 μg mỗi 100g phần ăn được) có thể cung cấp đủ nhu

cầu folate hằng ngày của một người trưởng thành.



Hình 3.15: Hàm lượng folate, PABA, và pteridine tích lũy trong các dòng AtADCS+,

GCHI+ và GCHI+/AtADCS+ [28]



3.4. Gạo tăng cường folate [53]

Mặc dù gạo là loại cây lương thực chính, cung cấp 80% lượng calo hàng ngày cho 3

tỷ người, nó lại nghèo nguồn vi chất dinh dưỡng thiết yếu, bao gồm folates (vitamin B9)

(xem bảng 3.1). Do đó, thiếu folate rất phổ biến, đặc biệt là ở các nước đang phát triển.

Các nhà khoa học đã tăng cường mức folate trong gạo bằng cách biểu hiện vượt mức

gen A. thaliana mã hóa cho GTPCHI và ADCS, từ một locus T-DNA đơn. Gen kìm hãm

ngược GTPCHI của cây đã được lựa chọn để tránh sự tích lũy quá cao không mong muốn

của chất trung gian.


Để so sánh hiệu quả của kỹ thuật tổng hợp sinh học folate từ 2 nhánh, ba vector biến

đổi gen đã được xây dựng (Hình 3.16). Cấu trúc G chứa một cDNA mã hóa A. thaliana

GTPCHI, dưới sự kiểm soát của các promoter globulin (glb-1) đặc hiệu của nội nhũ gạo.

Cấu trúc A chứa cDNA mã hóa A. thaliana ACDS dưới sự kiểm soát của promoter

glutelin B1 (gluB1) đặc hiệu của nội nhũ gạo. Cấu trúc GA xây dựng kết hợp cả hai caset

biểu hiện G và A trên một T-DNA đơn.

Hình 3.16: Giản đồ đại diện của T-DNA trong các vector dùng để chuyển gen [53]

Cấu trúc G

Cấu trúc A

Cấu trúc GA



Thanh mở miêu tả các promoter, mũi tên đen miêu tả vùng cDNA mã hóa, thanh

màu xám cho biết terminators phiên mã.

LB và RB, cạnh T-DNA trái và phải,

T35S và Tn, terminators phiên mã của bản sao 35S của cauliflower mosaic virus

(virus gây bệnh ở TV) và gen nopaline synthase của Agrobacterium tumefaciens( là vi

khuẩn có dạng hình cây gậy do chen 1 phân đoạn nhỏ của DNA gọi là T-DNA),

35S, Glb-1 và GluB1, phần lõi cauliflower mosaic virus 35S promoter với trình tự

tăng cường nhân đôi, promoter globulin lúa và promoter glutelin B1 lúa,

GTPCHI, mã hóa trình tự A. thaliana GTP cyclohydrolase I;

ADCS, mã hóa trình tự của ADC synthase từ A. thaliana;

hptII, gen mã hóa hygromycin phosphotransferase

Tất cả các vectơ được chuyển vào trong bộ gen của lúa Nippon Bare japonica bằng

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Cây chuyển gen có kiểu hình không thể phân biệt

được với chủng hoang dại (WT) trong suốt quá trình phát triển và cũng có khả năng tạo

hạt tương tự.

3.4.2. Kết quả

3.4.2.1. Phân tích dòng chuyển gen A

Mức PABA tổng trung bình gấp 49 lần so với cây đối chứng (15,3 ± 7,6 so với 0,32

± 0,03 nmol / g, tương ứng) (hình 3.17), thể hiện sự nâng cao hiệu quả của nhánh PABA

trong quá trình sinh tổng hợp folate.



Hình 3.17: Mức PABA và folate tổng trong những dòng A [53]

Tuy nhiên, hàm lượng folate tổng trong tất cả các dòng A được phân tích bé hơn 6

lần so với các hạt WT hoặc hạt của các cây đối chứng có chuyển gen nhưng chứa vector

rỗng (hình 3.17), bộc lộ một sự kìm hãm cho đến nay chưa được phát hiện lên quá trình

sinh tổng hợp folate bời nồng độ PABA cao trong khi không có mặt mức dihyroneopterin

cao.

Mức PABA trong cà chua chuyển gen càng cao (lên đến 140 nmol/g) biểu hiện vượt

mức ADCS A. thaliana, không có sự giảm đồng thời mức folate [28], có thể phản ánh sự

khác biệt chủ yếu trong việc điều hòa sinh tổng hợp của folate trong cà chua và gạo.

3.4.2.2. Phân tích dòng chuyển gen G

Những hạt biến đổi gen dòng G đã không cho thấy một sự khác biệt đáng kể trong

hàm lượng folate so với những cây đối chứng.

Tuy nhiên, phân tích những chất trung gian sinh tổng hợp pterin và dạng oxy hóa

của chúng (hydroxymethyldihydropterin (HMDHP), dihydroneopterin (DHN),

hydroxymethylpterin (HMP) và neopterin) cho thấy lượng tích lũy pterin trung bình cao

(nmol/g trọng lượng tươi)



gấp 25 lần. Pterin phong phú nhất là neopterin (69,9% ± 12,6%), tiếp theo HMP (25,9% ±

11,6%) và DHN (5,4% ± 1,8%), trong khi HMDHP không được phát hiện (Hình 3.18).

Hình 3.18: Mức pterin và folate tổng trong những dòng G [53]

3.4.2.3. Phân tích dòng chuyển gen GA

Hình 3.19: Mức PABA, pterin và folate tổng trong những dòng GA [53]





Ngược lại với 2 dòng A và G, hạt của các dòng GA chuyển gen thể hiện sự tích lũy

lượng folate lớn, từ 6,0 đến 38,3 nmol / g, cao hơn 15-100 lần so với WT hoặc trong các

cây chuyển gen với vector rỗng (Hình 3.19).

Đáng chú ý, tất cả các dòng GA tích lũy được lượng PABA tương đối cao, mặc dù

thực tế là lượng thừa PABA có liên quan trực tiếp đến việc sinh tổng hợp folate. Tuy

nhiên, số lượng PABA trung bình thấp hơn 2 lần so với dòng A (7,8 ± 2,8 và 15,3 ± 7,6

nmol / g, tương ứng) và thấp hơn 4,5-10 lần trong cà chua được tăng cường folate [28].

Sự gia tăng giới hạn của lượng PABA trong gạo tăng cường không nên quan tâm nhiều vì

PABA được liệt kê trong hợp chất GRAS (thường được coi là an toàn) [71] với một lượng

giới hạn 30 mg / ngày. Lượng này tương ứng với 17 kg hạt của dòng GA đồng hợp tử

17.8 với mức PABA cao nhất (12,8 ± 2,7 nmol / g).

Mức pterins trung bình trong những hạt của dòng GA (0,23 ± 0,12 nmol / g) thấp

hơn 5,5 lần so với dòng G (1,23 ± 0,54 nmol / g), mặc dù vẫn còn cao hơn 4 lần so với hạt

đối chứng. Tuy nhiên, các mức này vẫn thấp hơn 80 lần so với cà chua được tăng cường

folate [28] và ở cùng mức so với quả cà chua WT, do đó về tính an toàn của gạo tăng

cường sinh học, về hàm lượng pterin vượt mức, có thể gây hậu quả đối với sức khỏe con

người, do vai trò quan trọng của pterins trong sinh lý con người [44].

Hạt lúa tăng cường folate chứa PABA và pterin ít hơn nhiều so với cà chua tăng

cường folate [28]. Tỷ lệ mol của folates / PABA / pterins trong cà chua tăng cường folate

cao xấp xỉ 1/2.5/0.75 [28], so với 1/0.5/0.013 ở gạo tăng cường.

Các phần folate chính trong thực vật chuyển gen GA được đại diện bởi 5-

methyltetrahydrofolate, mà trung bình chiếm đến 89% của tổng lượng folate (Hình 3.20).

Điều này làm cho gạo tăng cường sinh học vượt trội hơn so với gạo tăng cường chất acid

folic, mà là bắt buộc ở một số nước. Tiêu thụ lượng folic acid từ tăng cường công nghiệp

cao có thể che đậy các triệu chứng thiếu hụt vitamin B12, nhưng điều này không phải là

vấn đề khi sử dụng 5-methyltetrahydrofolate như một chất bổ sung. Vì vậy, gạo tăng



cường folate là một thay thế tuyệt vời cho các khu vực, nơi tăng cường acid folic công

nghiệp là không thể.

Hình 3.20: So sánh thành phần những loại folate chính trong dòng GA so với dòng

WT [53]

Hơn nữa, bởi vì polyglutamylation được biết như là chất ảnh hưởng tiêu cực đến

sinh học khả dụng folate, chúng tôi xác định tỷ lệ phần trăm của polyglutamylated folates

trong lượng folate tổng của 2 dòng chuyển gen so với WT. Khoảng 2,6-14% folates là

polyglutamated trong dòng chuyển gen so với 50% trong WT (Hình 3.21), cho thấy khả

dụng sinh học của folates trong các dòng tăng cường cao hơn.

H4PteGlu: tetrahydrofolate; 5-CH3-H4PteGlu:5-methyltetrahydrofolate; PteGlu: folic acid; 5-CHO-H4PteGlu: 5-formyltetrahydrofolate; 10-CHO-PteGlu: 10-formylfolic acid; 5,10-CH=H4PteGlu: 5,10-methenyltetrahydrofolate



Hình 3.21: Tỷ lệ tương đối của polyglutamate và monoglutamate folate của dòng GA

và WT [53].

Mức tối đa của folate tăng cường có trong hạt gạo, cụ thể là 38,3 nmol / g, cao hơn

trong cà chua tăng cường folate (25 nmol / g) [28] và tương đương với 1.723 μg/100 g

khối lượng tươi, đó là lượng folate cao nhất được báo cáo trong các loài thực vật cho đến

nay. Nó vượt quá ngưỡng folate đề nghị hàng ngày cho người lớn (400 μg) nhiều hơn gấp

4 lần và cũng trên 2,5 lần lượng folate cho phụ nữ mang thai (600 μg) [70].

Thí nghiệm nấu chứng minh, sau 30 phút được đun sôi thì 45% folate thất thoát

(Hình 3.22). Giả sử rằng mức khả dụng sinh học trung bình của folate tự nhiên trong một

chế độ ăn uống “hỗn hợp” khoảng 50%, 100 g các hạt gạo tăng cường folate có khả năng

đáp ứng yêu cầu folate hàng ngày cho một người trưởng thành hoặc ít nhất là cung cấp

hầu hết yêu cầu hàng ngày.



Hình 3.22: Sự thay đổi mức folate tổng trong hạt của dòng GA khi nấu [53]

3.5. Những thành tựu và hướng phát triển

3.5.1. Thành tựu

3.5.1.1. Biểu hiện vượt mức GTP cyclohydrolase I (GTPCHI)

Những nghiên cứu đầu tiên trên quả cà chua và Arabidopsis thaliana [27, 33] nhằm

biểu hiện vượt mức enzyme đầu tiên trong nhánh pteridine của con đường folate, enzyme

GTP cyclohydrolase I (GTPCH I, Hình 3.2). Trong cả 2 trường hợp đều sử dụng gen

không có nguồn gốc từ thực vật (gen có nguồn gốc từ động vật hữu nhũ và vi khuẩn

(GenBank accessions BE136861 và AE000304). Tuy nhiên, hàm lượng folate chỉ tăng lên

2 đến 4 lần, cho thấy sự cần thiết của những kỹ thuật xa hơn nữa của con đường này.


Chưa nấu

Đã nấu



Phân tích PABA tổng (PABA cộng với glucose ester của nó) trong quả cà chua

chuyển gen cho thấy sự suy giảm rất lớn của PABA. Cung cấp PABA ngoại sinh cho việc

biểu hiện vượt mức GTPCHI ở cà chua chuyển gen làm tăng hàm lượng folate nhiều hơn

từ 2.5 đến 10 lần. Điều này chỉ ra rằng không những cần thiết phải tăng đồng thời cả 2

tiền chất của folate (pterin và PABA) mà còn phải chứng tỏ tiềm năng có thật của việc

tăng nồng độ folate trong tế bào thực vật.

3.5.1.2. Kết hợp biểu hiện vượt mức GTPCHI với aminodeoxychorismate synthase

(ADCS)

Những phát hiện đầy hứa hẹn này thức đẩy một vòng khác trong quả cà chua, trong

đó, enzyme đầu tiên của nhánh p-ABA của con đường folate, aminodeoxychorismate

synthase (ADCS, hình 3.2) sẽ được biểu hiện vượt mức, sử dụng gen từ Arabidopsis

(At2g28880; GenBank NP_850127) [28]. Kết quả là quả chuyển gen chứa mức trung bình

gấp 19 lần lượng p-ABA, so với mẫu đối chứng thuộc chủng hoang dại, không có sự gia

tăng hàm lượng folate.

Khi đặc điểm này được kết hợp với lượng pteridine cũng được biểu hiện vượt mức

bằng cách lai, quả chuyển đổi gen 2 lần tích lũy lượng folate trung bình gấp 19 lần mẫu

đối chứng, mức folate đạt được (840 μg mỗi 100g phần ăn được) có thể cung cấp đủ nhu

cầu folate hằng ngày của một người trưởng thành.

Tuy nhiên, kỹ thuật này cũng dẫn đến sự tích lũy pteridines và p-ABA gấp 20 lần so

với chủng hoang dại đối chứng. Mặc dù mức p-ABA trong cà chua chuyển gen vô hại với

sức khỏe con người, trạng thái của pteridines vẫn chưa được làm rõ và cần được khảo sát

[28]. Con người và động vật tổng hợp pterin quan trọng, tetrahydrobiopterin (H4B), tham

gia vào quá trình tổng hợp nitric oxide và các chất dẫn truyền thần kinh, chẳng hạn như

dopamine [41]. Ngoài ra, dihydroneopterin và dạng ôxi hóa của nó, neopterin, cũng được

là chất đánh dấu được biết đến trong sự kích thích hệ miễn dịch và được sử dụng rộng rãi

trong chẩn đoán nhiều bệnh [41]. Chúng cũng tham gia vào phản ứng stress [41]. Do đó

tình trạng xáo trộn của pteridine có thể có ảnh hưởng đến sức khỏe con người, tuy nhiên



vai trò và tương tác của tổng hợp nội sinh với chế độ ăn uống pteridines trong quá trình

chuyển hóa ở động vật có vú vẫn chưa rõ ràng.

Trong phương pháp tạo giống lúa được làm giàu folate, gene Arabidopsis mã hóa

GTPCHI (GenBank AF489530) và ADCS đã được biểu hiện vượt mức dưới sự kiểm soát

của promoter mạnh trên một locus gene duy nhất. Hạt gạo chuyển gen đã biểu hiện vượt

mức cả 2 gen của Arabidopsis chứa hàm lượng folate cao gấp 100 lần so với chủng hoang

dại (1723 so với 17μg/100g khối lượng tươi). Thí nghiệm nấu chín cũng đã chứng minh

rằng 100g gạo chuyển gen có thể cung cấp đủ nhu cầu folate hằng ngày của một người

trưởng thành hay ít nhất lượng cung cấp nhiều nhất của nó [53]. Hơn nữa, mức độ của

những chất trung gian được tổng hợp, pterin và p-ABA, thấp hơn đáng kể so với quả cà

chua được làm giàu folate.

3.5.2. Hướng phát triển

3.5.2.1. Lợi ích trực tiếp của việc làm giàu sinh học

Sử dụng một cây lương thực chính được làm giàu folate sẽ giúp chiến đấu với sự

thiếu hụt folate. Điều này mang lại hai lợi ích ngay lập tức.

Trước tiên, việc làm giàu sinh học cung cấp sự bền vững khi so sánh với làm giàu

công nghiệp (bổ sung acid folic tổng hợp cho các loại thực phẩm có nguồn gốc từ ngũ

cốc) và dược phẩm bổ sung. Việc phát triển của một loại cây trồng làm giàu sinh học trên

quy mô lớn đầu tư một lần mà có thể mang lại lợi ích cho sức khỏe của hàng triệu người

và do đó có thể tạo ra một hiệu ứng cấp số nhân [25].

Thứ hai, cây trồng làm giàu sinh học có thể cải thiện lượng folate cho một bộ phận

dân số nông thôn suy dinh dưỡng không có khả năng hưởng lợi từ thực phẩm tăng cường

công nghiệp hoặc các loại thực phẩm bổ sung, thường chỉ có sẵn trong thành phố. Vì vậy,

tăng cường sinh học là bổ sung cho các kế hoạch can thiệp khác.



3.5.2.2. Sự thích nghi theo vùng

Để đảm bảo nông dân có thể thông qua thực phẩm tăng cường sinh học, điều quan

trọng là năng suất cây trồng và/ hoặc lợi nhuận phải đồng thời tăng. Việc này có thể đạt

được bằng cách chuyển đặc điểm tăng cường sinh học vào kiểu gen cho năng suất cao.

Vì vậy, sẽ có những dòng tăng cường sinh học đưa vào chương trình gây giống kết

hợp với các giống địa phương thích nghi với một hệ sinh thái nông nghiệp. Điều này rõ

ràng sẽ đòi hỏi một mức độ nhất định của năng lực nghiên cứu quốc gia. Tuy nhiên, trong

khu vực như Đông Nam Á, các hệ thống hiệu quả cho việc phổ biến giống cây trồng cải

thiện đã có tại chỗ, làm cho việc thực hiện chỉ tốn chi phí tối thiểu.

3.5.2.3. Sự sinh lợi của việc tăng cường sinh học

Việc tăng cường sinh học dự kiến sẽ sinh lợi dựa trên các nghiên cứu định lượng lợi

ích sức khỏe tiềm năng cho vitamin A, sắt và kẽm có trong cây trồng tăng cường sử dụng

phương pháp tiếp cận DALY [42]. Mô hình này tính toán việc giảm gánh nặng bệnh tật

hiện tại liên kết với tình trạng thiếu vitamin từ tăng cường sinh học mà ra, có tính đến

lượng tiêu thụ hiện tại các cây trồng lương thực, việc tiêu thụ dự kiến của các vi chất dinh

dưỡng sau khi tăng cường sinh học cho cây trồng, và tỷ lệ dân số dự kiến sẽ tiêu thụ cây

trồng tăng cường sinh học. Áp dụng phương pháp DALY cho tác động của gạo vàng 2

(một phiên bản cải tiến của tăng cường β-carotene gạo vàng) ở Ấn Độ ước tính đã giảm đi

gánh nặng của thiếu vitamin A (VAD) từ 9% (tác động yếu) đến 59% (tác động mạnh)

[52]. Ngay cả việc giảm 9% chi phí có thể chuyển sang cứu hàng ngàn người từ mù hoặc

tử vong do bệnh truyền nhiễm. Hơn nữa, gạo vàng 2 hứa hẹn sẽ có chi phí hiệu quả, bởi vì

người ta ước tính rằng, ngay cả dưới tác động thấp, chi phí tiết kiệm một DALY là ít hơn

20 đô la Mỹ so với một chi phí tối thiểu là 134 đô la Mỹ thực hiện bằng cách dùng

vitamin A bổ sung [52].



Rất ít khả năng thực phẩm thực vật được làm giàu folate sẽ gây nên bất kì thay đổi

cảm quan nào, giống như trường hợp của gạo vàng, cho nên từ quan điểm này, người tiêu

dùng có thể chấp nhận những sản phẩm này. Tuy nhiên, mối quan tâm về khả năng tác

động gây hại môi trường (ví dụ như: mất đa dạng sinh học) và y tế (ví dụ: bệnh dị ứng) là

không thể tránh khỏi, đặc biệt là ở EU, nếu tăng cường sinh học đạt được bằng kỹ thuật

trao đổi chất. Điều này không có nghĩa là phương pháp tiếp cận kỹ thuật cần được từ bỏ,

bởi vì chấp nhận cây trồng 'biến đổi gen' phát triển cũng giống như là chấp nhận những

lợi ích của nó, như đã xảy ra cho những đột phá khoa học và y tế khác trong hai thế kỷ

trước (ví dụ như những tranh cãi rộng rãi xung quanh việc tiêm phòng đại trà đầu tiên,

một sự can thiệp đã xóa bệnh đậu mùa, vào thời gian đó một căn bệnh chết người). Các

rủi ro sức khỏe và lợi ích của thực phẩm chuyển gen hầu như chỉ phụ thuộc vào thành

phần hóa học (các chất dinh dưỡng, chất chuyển hóa, các yếu tố antinutritional, …) của

sản phẩm, chứ không phải vào công nghệ sử dụng để đạt được sự thay đổi. Thật vậy, có

thể nói rằng kỹ thuật di truyền đã cung cấp nhiều sự thay đổi có mục đích, đặc hiệu và dự

đoán được trên thành phần cây lương thực hơn so với nhiều phương pháp tiếp cận "thông

thường" (Bao gồm chăn nuôi thông thường, giống đột biến, lai soma, …).

Hướng phát triển chung

Việc làm giàu folate trên hai loài một lá mầm và hai lá mầm thành công đã khẳng

định rằng việc tăng đồng thời trên 2 nhánh pterin và p-ABA có thể được sử dụng như là

một bước tiến chung có thể ứng dụng vào những cây khác. Sự tối ưu hóa dòng chuyển

hóa có thể đạt được bằng cách tác động vào những enzyme khác.

Công việc trong tương lai sẽ bao gồm việc tạo ra các dòng có folate cao bằng cách

lai giống hoặc chuyển gen trực tiếp. Đây là thuận lợi lớn bởi thực tế là cả hai gen đã

chuyển đều nằm trên một T-DNA đơn. Kỹ thuật trao đổi chất cũng có thể được áp dụng

cho các loại cây thân cỏ và không phải thân cỏ quan trọng với kinh tế quốc dân. Nghiên

cứu sâu hơn sẽ là cần thiết để đánh giá khả dụng sinh học và hiệu lực sinh học của cây



tăng cường chất folate cũng như sự ổn định folate trong thời gian lưu trữ lâu dài điển hình

cho các sản phẩm ngũ cốc.

3.6. Kết luận về các loại cây trồng chuyển gen được làm giàu folate

Gạo, cà chua và cây Arabidopsis tăng cường folate đã được phát triển bằng cách sử

dụng kỹ thuật trao đổi chất đơn giản. Các nhà khoa học đã đủ hiểu biết về hóa sinh folate

trong cây trồng để dự tính các loại cây trồng tăng cường khác, chẳng hạn như lúa mì,

chuối và khoai tây. Hiện nay, sự thiếu hụt folate vẫn còn, và sẽ tiếp tục như vậy cho đến

khi triển khai các kế hoạch trên cơ sở nông nghiệp để giúp giảm gánh nặng toàn cầu này.

Tăng cường folate trên cây lương thực nên là những can thiệp có giá trị, bổ sung và hiệu

quả trong cuộc chiến chống thiếu hụt folate toàn cầu, trên tất cả ở các nước nghèo.

Chương 4: Kết luận


CHƯƠNG 4

KẾT LUẬN VỀ CÂY CHUYỂN GEN GIÀU

CHẤT DINH DƯỠNG CHỨC NĂNG

Các giống cây trồng chuyển gen ngày càng được phát triển nhờ vào các công cụ của

Công nghệ sinh học hiện đại. Chính vì vậy mà bên cạnh các thuận lợi mà thực phẩm

chuyển gen mang lại, nhiều người cũng lo ngại rằng liệu các loại thực phẩm này có an

toàn bằng các loại thực phẩm có được nhờ sử dụng các biện pháp nông nghiệp truyền

thống hay không. Dưới đây là tóm tắt các lợi ích tiềm tàng và nguy cơ tiềm ẩn của các cây

chuyển gen.

Lợi ích tiềm tàng

1. Cây trồng biến đổi gen tăng năng suất, giảm bệnh tật và sâu bệnh, từ đó giảm sử

dụng thuốc trừ sâu, giảm thiểu ô nhiểm môi trường.

2. Thêm vào đó chất dinh dưỡng và mùi vị được cải thiện, có hiệu quả cho sức khỏe

người tiêu thụ.

3. Thực phẩm biến đổi gen có thể làm tăng hoạt chất thuốc, nhất là những thực phẩm

có chức năng vaccine sẽ làm tăng cường khả năng miễn dịch của con người đối với bệnh

tật nan y như viêm gan siêu vi B,…, mà thực phẩm thông thường không thể có được.

4. Rau sản xuất kháng thể, có thể ăn để trị bệnh nhiễm trùng.

Một số ví dụ như: lúa gạo giàu vitamin A và sắt, khoai tây tăng hàm lượng tinh bột,

vaccine ăn được ở ngô và khoai tây, dầu ăn có lợi cho sức khỏe hơn từ đậu nành và cải

dầu…

Nguy cơ tiềm ẩn

1. Hiện tại người ta chưa biết được một cách chắc chắn thực phẩm biến đổi gen gây

hại cho con người và môi trường như thế nào?

Chương 4: Kết luận


2. Do thận trọng nên thực phẩm GMO khó có cơ hội để phát triển nhanh được.

Người ta sợ rằng thực phẩm chuyển gen tổng hợp ra một loại protein gây dị ứng có hại

đến sức khỏe lâu dài của con người.

3. Mặt khác thực phẩm chuyển gen có thể là nguyên nhân làm mất tính đa dạng sinh

học mà thiên nhiên đã tạo hóa ra qua một quá trình thích ứng lâu dài, sẽ mất đi khả năng

thích nghi của các sinh vật.

4. Từ cây thực phẩm GM, các gen GM thụ phấn chéo lên cỏ dại sẽ ra sao?

Cuối cùng, vì tầm quan trọng của lương thực thực phẩm cho con người, nên các

chính sách liên quan tới cây chuyển gen sẽ phải dựa trên những cuộc tranh luận cởi mở và

trung thực có sự tham gia của mọi thành phần trong xã hội.

Phần 3: Ứng dụng công nghệ vi sinh trong sản xuất thực phẩm chức năng

- 120 -

PHẦN 3

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ VI SINH TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Chương 1: Tảo Spirulina

SVTH: Nguyễn Thị Minh Tâm 121

CHƯƠNG 1

TẢO SPIRULINA 1.1. Giới thiệu chung

Đầu những năm 70 của thế kỷ XX, những nhà khoa học người Pháp phát hiện ra tảo

có khả năng phát triển nhanh và có hàm lượng protein rất cao.

Tảo (agae) là một nhóm vi sinh vật, nhưng chúng khác với vi khuẩn và nấm men ở

chỗ chúng có diệp lục và có khả năng tổng hợp được các chất hữu cơ từ các chất vô cơ

dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời.

Tảo chia làm 9 ngành: tảo lam (Cyanophyta); tảo lục (Chorophyta); tảo silic

(Diatomea); tảo vàng ánh (Chysophyta); tảo giáp (Pynophyta); tảo mắt (Euglenophyta);

tảo roi lệch (Hererocontac); tảo đỏ (Rhodophyta); tảo nâu.

Trên thế giới hiện nay có nhiều loại tảo. Tuy nhiên, cho đến nay chỉ có ba loại tảo

đơn bào được sản xuất theo qui mô lớn và có lợi ích kinh tế cao: Chlorella, Spirulina,

Scenedesmus, trong đó hai loài Chlorella và Spirulina được sản xuất nhiều hơn.

Hình 1.1: Hình dạng tảo Chlorella, Scenedesmus, Spirulina [65]

Những ưu điểm cơ bản của tảo đơn bào được các nhà khoa học và các nhà sản xuất

quan tâm bao gồm:



Tảo đơn bào có hàm lượng protein rất cao (chiếm khoảng 70-75% chất khô), protein

của tảo thuộc loại protein hoàn hảo và có chất lượng cao. Cho đến nay người ta chưa tìm

thấy độc tố nguy hiểm tồn tại trong sinh khối tảo.

Tảo là loài sinh vật tự dưỡng, chúng hoàn toàn có thể tự tổng hợp chất hữu cơ cho sự

phát triển của mình từ các chất vô cơ, CO2, ánh sáng như ở thực vật.

Tảo có kích thước tế bào lớn, chúng hoàn toàn đáp ứng tốt mọi yêu cầu kỹ thuật, đặc

biệt rất thuận lợi trong giai đoạn thu nhận.

Chúng không bị virus tấn công, sống trong những điều kiện đơn giản.

Hiện nay, tảo Spirulina được nuôi trồng nhiều hơn tảo Chlorella, vì giữa hai loài

tảo này, tảo Spirulina có rất nhiều ưu điểm hơn hẳn tảo Chlorella:

Tảo Spirulina có hàm lượng protein cao hơn hẳn Chlorella. Protein trong tế bào

Spirulina là 60-70%, Chlorella là 40-50%.

Kích thước tảo Spirulina lớn hơn kích thước tảo Chlorella. Mặt khác, tảo Spirulina

trong quá trình phát triển có xu hưởng nổi trên bề mặt, trong khi đó tảo Chlorella có kích

thước nhỏ lại có xu hướng lắng chìm khi không khuấy trộn. Thu hoạch tảo Spirulina bằng

những phương pháp rất đơn giản, trong khi thu hoạch tảo Chlorella phức tạp giống như

thu hoạch sinh khối nấm men hoặc sinh khối vi khuẩn.

Tảo Spirulina chứa rất nhiều loại vitamin, trong khi tảo Chlorella chứa ít loại

vitamin hơn. Thành tế bào tảo Spirulina mỏng, thành tế bào Chlorella dày. Do đó hệ số

tiêu hóa khi ta dùng tảo Spirulina cao hơn tảo Chlorella. Tảo Spirulina phát triển trong

môi trường kiềm còn tảo Chlorella phát triển trong môi trường acid yếu.

Khi dùng CO2 như nguồn carbon, mà nguồn carbon này trong điều kiện kiềm đất dễ

chuyển hóa sang dạng dễ hấp thụ theo phản ứng sau:

Spirulina hấp thụ CO2 theo chiều hướng này tốt hơn tảo Chlorella [13].

Vì vậy, ngày nay tảo Spirulina được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong các

lĩnh vực của đời sống.



1.2. Tổng quan về tảo Spirulina

1.2.1. Lịch sử phát hiện

Spirulina là tên gọi do nhà tảo học người Đức – Deurben đặt vào năm 1827 dựa trên

hình thái đặc trưng nhất là dạng sợi xoắn ốc với khoảng 5-7 vòng đều nhau không phân

nhánh. Cũng vào năm 1827, Turpin lần đầu tiên phân lập được Spirulina từ nguồn nước

tự nhiên.

Năm 1963, giáo sư Clement (người Pháp) đã nghiên cứu thành công việc nuôi

Spirulina ở qui mô công nghiệp.

Năm 1973, Tổ chức Nông lương Quốc tế (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO)

đã chính thức công nhận Spirulina là nguồn dinh dưỡng và dược liệu quý, đặc biệt trong

chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa.

Năm 1977, Viện sinh vật học là nơi tiên phong trong việc nuôi trồng Spirulina ở

Việt Nam theo mô hình ngoài trời, không mái che, có sục khí CO2 tại xí nghiệp nước suối

Vĩnh Hảo (Bình Thuận) [3].

1.2.2. Phân loại

− Ngành: Cyanophyta

− Lớp: Cyanophyceae

− Bộ: Oscillatoriales

− Họ: Oscillatoriaceae

− Giống: Spirulina [13]

1.2.3. Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina

Tảo Spirulina có dạng xoắn lò xo khoảng 5-7 vòng đều nhau không phân nhánh.

Đường kính xoắn khoảng 35-50 m, bước xoắn 60 m, chiều dài thay đổi có thể đạt

0,25mm. Nhiều trường hợp tảo Spirulina có kích thước lớn hơn.

Tảo là trung gian giữa vi khuẩn và tảo nhân thực. Người ta cho rằng tảo Spirulina

giống với vi khuẩn hơn, do đó tảo Spirulina còn có tên là vi khuẩn lam.

Tảo có khả năng vận chuyển theo hình thức trượt xung quanh trục của chúng. Vận

tốc vận chuyển của chúng có thể đạt 5 micron/giây [13].



1.2.3.1. Cấu tạo

Hình 1.2: Hình dạng của tảo Spirulina [65]

Là tảo lam đa bào dạng sợi, gồm nhiều hình trụ xếp không phân nhánh. Mỗi tế bào

của sợi có chiều rộng 5 m, dài 2mm. Không có lục lạp mà chỉ chứa thylacoid phân bố

đều trong tế bào. Không có không bào. Không có nhân điển hình, vùng nhân không rõ,

trong đó có chứa DNA (Hedeskog và Hifsten A.1980) [13].

Thành tế bào có cấu trúc nhiều lớp chứa mucopolymer, pectin, và các loại

polysaccharide khác. Màng tế bào nằm sát ngay dưới thành tế bào và nối với màng quang

hợp thylacoid tại một vài điểm.

Bộ máy quang hợp của Spirulina:[5]

+ Phycobilisome: chứa phycobiliprotein và protein liên kết được gắn vào bề mặt

ngoài của thylacoid. Phycobilisome có khối lượng khoảng 7 triệu dalton và có thể tách

nguyên vẹn để nghiên cứu. Đối với phycobilisome có cả phycoerythin và phycocyanin thì

lớp ngoài cùng là phycoerythin, tiếp theo là phycocyanin và phần trong cùng là

allophycocyanin.

+ Phycobilisome hoạt động như một anten thu nhận năng lượng mặt trời để chuyển

vào PS II. Con đường truyền năng lượng bắt đầu từ phycoerythin sang phycocyanin và

cuối cùng đến allophycocyanin trước khi đạt tới PS II.

+ Có khoảng 50% năng lượng ánh sáng mặt trời Spirulina nhận được nhờ

phycobilisome.

+ Các sắc tố quang hợp gồm chlorophylla, carotenoid, phycocyanin, allophycocyanin

và thường có carotenoid-glycoside như myxoxanthophyll, oscillaxanthin.



Spirulina có chứa 3 nhóm sắc tố chính:

Chlorophyll hấp thụ ánh sáng lam và đỏ.

Carotenoid hấp thụ ánh sáng lam và lục.

Phycobillin hấp thụ ánh sáng lục, vàng và da cam.

1.2.3.2. Sinh sản của Spirulina

Tảo lam là vi sinh vật xuất hiện cùng lúc với vi khuẩn trên trái đất (Cifferi O, Tiboni

O, 1985). Hiện nay người ta biết khoảng 2500 loài. Tảo lam phân bố rất rộng và có khả

năng chịu nhiệt rất cao. Người ta phát hiện chúng sống ở những suối nước nóng đến 690C

[13].

Tảo Spirulina có phương thức sinh sản vô tính, từ một cơ thể mẹ trưởng thành (gọi

là trichome), tự phân chia thành nhiều mảnh, mỗi mảnh gồm một số vòng xoắn (2-4 tế

bào, gọi là hormogonia). Để tạo thành các hormogonia, sợi Spirulina sẽ hình thành các tế

bào chuyên biệt cho sự sinh sản (gọi là đoạn necridia). Các necridia hình thành các đĩa

lõm ở 2 mặt và tạo ra hormogonia bởi sự chia cắt tại vị trí các đĩa. Khi đã phát triển, dần

dần phần đầu hormogonia bị tiêu giảm và trở nên tròn nhưng vách tế bào vẫn có chiều dày

không đổi. Các hormogonia phát triển, trưởng thành và chu kỉ sinh sản lặp lại để đảm bảo

vòng đời của Spirulina.

Hình 1.3: Sơ đồ vòng đời của Spirulina [13]



Thông thường Spirulina sinh sản bằng cách gãy ra từng khúc. Trong trường hợp gặp

điều kiện không thuận lợi, Spirulina cũng có khả năng tạo bào tử giống như ở vi khuẩn.

Chu kì phát triển của Spirulina rất ngắn. Chu kì này thường diễn ra trong 24h như của tảo

Chlorella [13].

1.2.4. Thành phần hóa học của Spirulina

Spirulina chứa hàm lượng protein rất cao và chứa đầy đủ các vitamin.

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của Spirulina

STT Thành phần Số lượng (% chất khô) 1 2 3 4 5 6 7

Protein tổng số Glucid Lipid Acid nucleic Diệp lục Carotene Tro

60 ÷ 70 13 ÷ 16

7 ÷ 8 4,29 0,76 0,23 4 ÷ 5

[13]

Spirulina có giá trị dinh dưỡng cao vì chứa hàm lượng protein cao và các chất có

hoạt tính sinh học khác. Giá trị protein trung bình của Spirulina là 65%, cao hơn so với

nhiều loại thực phẩm. Ví dụ, hàm lượng protein của cá và thịt là 15-20%, nước tương là

35%, sữa cô đặc là 35%, trứng là 12% và ngũ cốc là 8-14% [22].

Spirulina là nguồn giàu vitamin B12 nhất. Nếu hằng ngày ta sử dụng 1g Spirulina thì

sẽ đáp ứng nhu cầu vitamin B12 hằng ngày. Ngoài ra, Spirulina còn chứa các vitamin khác

như A, B1, B3, B6, E và H (Bảng 1.2).

Spirulina giàu sắt và calcium, hỗ trợ tốt cho máu, cho xương và răng. Lượng

calcium của Spirulina cao hơn trong sữa. Lượng sắt trong Spirulina cao hơn 12 lần so với

trong các loại thực phẩm khác. Ngoài ra, Spirulina cũng giàu magnesium, potassium.

Những khoáng đa lượng bao gồm sodium, calcium, magnesium, potassium, chlorine,

sulfur và phosphorous. Các khoáng vi lượng gồm iodine, calcium, magnesium, fluoride,

manganese, boron, nickel và cobalt (Bảng 1.2).



Bảng 1.2: Thành phần vitamin của Spirulina

Vitamin Trên 10g Nhu cầu hàng ngày cho phép

% so với nhu cầu hàng ngày cho

phép Vitamin A (β-caroten) Vitamin B1 (Thiamine) Vitamin B2 (Riboflavin)

Vitamin B3 (Niacin) Vitamin B6 (Pyridoxine)

Vitamin B12 (Cyanocobalamine)

Vitamin E (α-tocopherol) Folacin

Phanthothenic acid Biotin

Inositol

23000IU 0,31µg 0,35 µg 1,46 µg 80 µg 32 µg 1IU 1 µg

10 µg 0,50 µg

6,40

5000 1,5 1,7 20 2,0 6,0 30 400 10 - -

460 21 21 7 4

533 3

0,04 1 - -

[32]

Bảng 1.3: Thành phần khoáng của tảo Spirulina

Khoáng Trên 10g Nhu cầu hàng ngày cho phép

% so với nhu cầu hàng ngày cho

phép Calcium

Iron Phosphorus Magnesium

Zinc Potassium

Copper Manganese Chromium

Sodium Selenium

70 mg 10 mg 80 mg 40 mg 300 µg 140 mg 120 µg 500 µg 25 µg 90 mg 10 µg

1000 mg 18 mg

1000 mg 400 mg 15 mg

3500 mg 2 mg 2 mg

120 µg 2400 mg

70 µg

7 55 8

10 2 4 6

25 21 4

14 [32]



Spirulina chứa 18 trong số 20 loại amino acid được biết. Một số amino acid có hàm

lượng cao trong Spirulina như glutamic acid (14,6%); aspartic acid (9,8%); leucine

(8,7%); aniline (7,6%)… (Bảng 1.4).

Bảng 1.4: Thành phần acid amin của tảo Spirulina

STT Thành phần

µg/10g Số lượng (% tổng

chất khô)

STT Thành phần

µg/10g Số lượng (% tổng

chất khô)1 2 3 4 5 6 7 8 9

Isoleucin Leucin Lysin

Methionin Phenilalanin

Theonin Tryptophan

Valin Alanin

350 540 290 140 280 320 90

400 470

5,6 8,7 4,7 2,3 4,5 5,2 1,5 6,5 7,6

10 11 12 13 14 15 16 17 18

Arginin A.aspartic

Cystin A.glutamic

Glycin Histidin Prolin Serin

Tyrosin

430 610 60

910 320 100 270 320 300

6,9 9,8 1,0 14,6 5,2 1,6 4,3 5,2 4,8 [13]

Các chất màu trong Spirulina: Spirulina có màu xanh lam-lục là do Spirulina chứa

nhiều sắc tố với hàm lượng cao như chlorophyll, phycocyanin, beta-caroten, xanthophylls

(Bảng 1.5).

Bảng 1.5: Các chất màu trong Spirulina

Chất màu Màu sắc Hàm lượng trong 10g % Spirulina Phycocyanin Chlorophyll Carotenoids

Xanh da trời Xanh lá cây Màu vàng

cam

1400µg 100 µg 37 µg

14% 1,0%

0,37%

[32]



1.2.5. Tình hình nuôi trồng và phát triển Spirulina

1.2.5.1. Trên thế giới

Spirulina được trồng đại trà ở các nước trên thế giới từ những năm 1972, các nước

sản xuất vi tảo chủ yếu tập trung ở Châu Á và vành đai Thái Bình Dương. Những khu vực

và vùng lãnh thổ có sản lượng vi tảo lớn là Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Hàn Quốc,

Hoa Kỳ, Mehico…

Khởi đầu là vào những năm 1970, một doanh nghiệp tảo đầu tiên của Hoa Kỳ đã bắt

tay vào nuôi thử nghiệm mô hình pilot trên các bể nhân tạo. Họ chọn thung lũng hoang

mạc Imperial thuộc bang California vì nơi đây có nhiệt độ trung bình cao nhờ ánh nắng

mặt trời và tránh xa vùng ô nhiễm đô thị.

Đến năm 1981, một sự hợp tác đầu tiên giữa doanh nhân California và thương nhân

Nhật bản đã hình thành nên Earthrise Farms và chính thức đi vào sản xuất ổn định năm

1982. Ngày nay, Earthrise Farms cung cấp sản phẩm cho hơn 40 quốc gia và nguồn

Spirulina ở đây được xem là tốt nhất [32].

Ngoài ra, trên thế giới còn có các trang trại nuôi trồng tảo Spirulina với quy mô lớn,

chất lượng cao như:

− Trang trại Twin Tauong (Myanmar)

− Trang trại Sosa Texcoco (Mehico)

− Công ty tảo Siam (Thái Lan)

− Trang trại Chenhai (Trung Quốc)

− Nông trại Hawai ( Hoa Kỳ)…

1.2.5.2 Việt Nam

Ở Việt Nam, từ năm 1972 các nhà khoa học bắt đầu đặt vấn đề nghiên cứu tảo

Spirulina do GS.TS Nguyễn Hữu Phước chủ trì.

Năm 1976, việc thử nghiệm nuôi trồng tảo Spirulina đã được tiến hành trong thời

gian 4-5 tháng tại Nghĩa Đô, Hà Nội đã thu được kết quả khá khả quan.



Vào năm 1985, Sở Y Tế thành phố Hồ Chí Minh đã tiếp nhận giống tảo Spirulina

đầu tiên do ông bà R.D.Fox tặng. Sau đó, tảo giống được giao cho Trạm nghiên cứu dược

liệu (nay là Trung tâm dinh dưỡng thành phố Hồ Chí Minh) giữ giống và nuôi trồng [3].

Hiện nay, có 2 nơi nuôi trồng tảo Spirulina lớn ở nước ta, đó là:

− Công ty cổ phần nước khoáng Vĩnh Hảo (Bình Thuận)

− Và một cơ sở ở Bình Chánh, thành phố Hồ Chí Minh.

Có thể nói, Vĩnh Hảo là đơn vị tiên phong trong việc nuôi trồng và sản xuất tảo

Spirulina lớn nhất nước ta. Việc nuôi trồng Spirulina tại thành phố Hồ Chí Minh lại là

nguồn nguyên liệu sản xuất thức ăn chủ yếu cho gà, tôm…Sau một thời gian không tìm

được đầu ra và giá thành chưa hợp lý nên các cơ sở trên đã không thể tiếp tục việc nuôi

trồng trên được nữa.

Nhìn chung, lịch sử nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina ở nước ta đã thu được

nhiều kết quả ban đầu đáng kích lệ.

Tuy nhiên, cho đến nay việc nuôi trồng đa số vẫn mang tính nhỏ lẻ, lạc hậu không

đáp ứng được nhu cầu sử dụng tảo ngày càng cao.

Vì vậy, trước những giá trị về mọi mặt mà tảo Spirulina mang lại, cần phải tiến hành

cải thiện, thúc đẩy ngành công nghiệp nuôi trồng tảo nhằm đáp ứng nhu cầu trong nước

và xuất khẩu ra thị trường nước ngoài.

1.2.6. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng Spirulina

1.2.6.1. Trên thế giới

Nghiên cứu ứng dụng Spirulina trong thực phẩm

Spirulina đã được nghiên cứu sản xuất và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác

nhau ở các nước trên thế giới. Hiện nay, Spirulina được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong

thực phẩm và mỹ phẩm. Spirulina được nghiên cứu bổ sung vào rất nhiều sản phẩm thực

phẩm như: mì sợi, yaourt, kẹo, trà xanh, bánh quy, bánh mì, bia…Các sản phẩm này được

bán ở siêu thị của nhiều nước như: Chi Lê, Đan Mạch, Hà Lan, Mỹ, Úc, New Zealand…

(Bảng 1.6) [19].

Nghiên cứu ứng dụng Spirulina trong mỹ phẩm



Các sản phẩm mỹ phẩm có bổ sung Spirulina cũng đã xuất hiện ở các siêu thị như:

Sản phẩm bảo vệ da, dầu gội, kem…Các thành phần chiết xuất từ tảo Spirulina như

protein, polysaccharide, vitamin và khoáng được dùng để sản xuất các mỹ phẩm làm đẹp

cho phụ nữ như: mỹ phẩm săn sóc bảo vệ da đầu, bảo vệ tóc, bảo vệ da, làm lành sẹo mau

chóng, chống mụn nhọt và làm trắng da [59].

Bảng 1.6: Các loại thực phẩm được chế biến từ tảo Spirulina

STT Loại thực phẩm Tỉ lệ Spirulina được bổ sung (%)

Nhà chế biến

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15

16

17

18 20

Die (nước sốt tảo Spirulina) Bánh mì trắng

Mì gói Bánh bích quy

Bánh ngọt Cousorus (thịt băm)

Sữa chua Pastas (bột sữa)

Chocolate Rượu, bia

Kem caramel Thạch gelatine

Nước mật hoa quả Mứt nhừ

Atories (rượu từ ngô của Mehico)

Hỗn hợp ngũ cốc, bột mì và tảo Spirulina)

Bột ngô được xử lý bằng nước vôi nóng có bột gạo và

tảo Spirulina) Bột ngô và tảo Spirulina

Xúc xích

9,1 3

14 4

3÷6 2

2÷5 3÷6 3÷5

5÷10 5÷10 5÷10 5÷10 5÷10 5,5÷8

12÷14

10,4

10÷14 10÷30

Orstrom ở Tchard Nestle INIA

Sosa Lauce Nestle Dijon Dijon

Sosy Dunal Sasa E.N.C.B

- -

Sasa E.N.C.B - - - - - -

Bệnh viện Bichaf [9]



Nghiên cứu ứng dụng Spirulina trong dược phẩm

Ức chế khả năng tái tạo của sự sinh sản HIV-1 bằng nước chiết xuất Spirulina:

Nước chiết xuất Spirulina ngăn ngừa sự sinh sản HIV-1 ở con người nhờ các bạch

cầu lumpo T và bạch cầu đơn nhân của hệ miễn dịch được gia tăng trong máu ngoại biên.

Chiết xuất cô đặc 5-10μg/ml cho thấy làm giảm sự sản sinh virus khoảng 50%, và chiết

xuất cô đặc 100 μg/ml cho thấy ức chế 90-100% mà không độc tính đối với tế bào thường

[32].

Calcium Spirulan từ tảo xanh Spirulina, ức chế sự tái tạo màng bao virus:

Việc phân cắt trực tiếp các hoạt tính sinh học của chiết xuất từ tảo Spirulina dẫn đến

việc cô lập các chất polysaccharide sulfate mới có tên gọi là Calcium Spirulina (Ca-SP)

như một chất chống virus chính yếu. Polysaccharide được tổng hợp bởi ribose, mannose,

fructose, galactose, xylose, glucose, acid galacturonic, sulfate và calcium. Ca-SP được

tổng hợp để ngăn chặn sự tái tạo nhiều loại virus phát triển bao gồm virus Herpes đơn bào

dạng 1, virus sởi, quai bị, cúm A và HIV-1. Người ta khám phá ra rằng Ca-SP ngăn chặn

được quá trình thâm nhập của virus vào trong các tế bào động thực vật.

Chiết xuất tảo Spirulina-Dunaliella có khả năng ngăn ngừa ung thư miệng:

Chiết xuất của tảo Spirulina-Dunaliella đã cho thấy là ngăn ngừa được sự phát triển

của khối u trong miệng chuột túi khi tiêm dịch Spirulina vào chúng điển hình 3 lần mỗi

tuần trong 28 tuần. Những động vật không được điều trị, tất cả đều có những khối u nói

chung bên phải miệng túi. Những con được nuôi bằng canthanxanthin theo thống kê cho

thấy giảm xuống đáng kể về số lượng và kích cỡ khối u so với những con chỉ được kiểm

soát. Những động vật được nuôi dưỡng với β-carotene cũng được chứng minh là giảm

đáng kể một lượng nhỏ hơn về cả số lượng và kích cỡ khối u. Tuy nhiên, một phần nhỏ

nhóm chuột túi được ăn tảo có dấu hiệu của chứng loạn sản và ung thư biểu mô sớm là

nguyên nhân hủy diệt.

Các nghiên cứu khác:

Học viện y khoa quân sự Trung Hoa, viện y học và viện bức xạ Suzhou thuộc bộ

công nghiệp hạt nhân đã nghiên cứu ảnh hưởng của Spirulina, kết quả cho thấy việc bổ



sung Spirulina làm tăng khả năng miễn dịch và tăng tỉ lệ sống sót của chuột khi chiếu các

tia phóng xạ gây chết người. Một số bệnh viện ở thành phố Kumming, tỉnh Yuan, dùng

Spirulina như một loại thuốc có tác dụng giảm lượng lipid trong máu.

Đại học Beijing đã chiết xuất thành công phân tử có hoạt tính sinh học từ Spirulina

để ngăn chặn ảnh hưởng của việc nhiễm các kim loại nặng, cũng như ngăn chặn sự phát

triển của các khối u. Nhiều cơ quan ở Trung Quốc đã tập trung vào các nghiên cứu sinh

học phân tử ngăn chặn khối u bướu, chống lại sự lão hóa và chống các tia phóng xạ [9].

Trên thế giới đã có rất nhiều sản phẩm Spirulina được bán dưới dạng thuốc với

nhiều tên gọi khác nhau như: Linagreen, Heilina, Spirulina kayaky, Spirulian C, Light

Force Spirulina. Spirulina thường sản xuất dưới dạng viên nén, mỗi viên có trọng lượng

500mg trong đó chứa khoảng 200-300mg tảo khô. Loại này được dùng để chữa trị một số

bệnh như viêm gan, viêm khớp, ung thư, tăng cường sức khỏe, giảm cân và phòng chống

suy dinh dưỡng ở trẻ em.

Nghiên cứu ứng dụng Spirulina trong chăn nuôi

Trung Quốc sử dụng Spirulina làm thức ăn thay thế quan trọng cho tôm để kích

thích khả năng tăng trưởng nhanh, tăng khả năng miễn dịch và sống sót của tôm. Thức ăn

cho tôm có bổ sung Spirulina giúp giảm thời gian nuôi cũng như tỉ lệ tử vong. Viện

nghiên cứu đất và phân bón của Học viện khoa học nông nghiệp Trung Hoa hợp tác với

Viện nghiên cứu nuôi trồng Jianxi đã nghiên cứu việc bổ sung vào thức ăn cho tôm ở

Tangxian, tỉnh Hebei. Chiều dài ấu trùng tôm tăng lên 18% sau khi dùng sản phẩm bổ

sung Spirulina. Tỉ lệ sống sót của tôm con tăng đến 23,8%. Giá của thức ăn cũng rẻ hơn

48% so với các thức ăn thường.

Thức ăn có chứa Spirulina giúp tăng sức đề kháng của các loại cá có giá trị cao, tăng

khả năng sống sót từ 15% lên 30%. Khi thêm Spirulina vào thức ăn gia súc, gia cầm, tốc

độ sinh trưởng của chúng tăng lên.

Spirulina cũng được sử dụng làm thức ăn cho cá cảnh, loại thức ăn này được sản

xuất bởi công ty Guangdong Jiande, phổ biến ở Nhật Bản và các nước Đông Nam Á.



Nghiên cứu ứng dụng Spirulina trong xử lý môi trường

Từ năm 1975, Oswald và cộng sự tại trường Đại học Tổng Hợp Califonia đã thử

nghiệm dùng Spirulina trong xử lý nước thải công nghiệp và đi đến kết luận: trong hệ xử

lý nước thải, Spirulina có vai trò tạo O2, tăng độ kết lắng, loại trừ kim loại và các chất hữu

cơ độc hại.

1.2.6.2. Việt Nam

Từ năm 1977, Nhà nước đã chú trọng vào việc nghiên cứu và nuôi trồng thử nghiệm

vi tảo Spirulina, bước đầu thành công ở một số nơi như Vĩnh Hảo, Đắc Lắc, Đồng

Nai…Từ nguồn nguyên liệu Spirulina đạt chất lượng cao và ổn định, các nhà khoa học đã

sản xuất thành công một số loại thuốc như Linavina, Lactogil (xí nghiệp Mekophar); Cốm

bổ, bột dinh dưỡng Enalac (Trung tâm dinh dưỡng trẻ em thành phố Hồ Chí Minh),

Gelule Spilina (Lebo, Helvinam, Trường Đại Học Y Dược)…

Trung tâm dinh dưỡng trẻ em Tp. Hồ Chí Minh:[3], [15]

Theo báo cáo tháng 05 năm 1997 của Trung tâm dinh dưỡng trẻ em thì từ năm 1989,

Trung tâm dinh dưỡng được thành phố giao cho chức năng nghiên cứu và phát triển

Spirulina. Tuy nhiên, việc tiêu thụ vi tảo Spirulina trong vài năm gần đây gặp khó khăn vì

người tiêu dùng chưa quen do màu sắc và mùi lạ. Vì vậy trung tâm đã nghiên cứu và đưa

Spirulina vào thức ăn, vì khi đưa Spirulina vào cơ thể bằng con đường này sẽ thuận lợi

hơn và ít chịu ảnh hưởng của yếu tố cảm quan, đồng thời góp phần hồi phục nhanh chóng

sức khỏe cho bệnh nhân. Ngoài ra, trung tâm còn sản xuất bột dinh dưỡng Enalac có bổ

sung Spirulina để giải quyết vấn đề suy dinh dưỡng ở trẻ em, phục hồi dinh dưỡng cho

người già, bước đầu đã đạt được nhiều thành quả đáng khích lệ. Để sản xuất 50-100 tấn

bột dinh dưỡng/ tháng, cần cung cấp số lượng Spirulina khô là 750-1500 kg. Điều này

cho thấy nhu cầu cung cấp Spirulina hiện nay là rất lớn. Kết quả tiến hành thử nghiệm sử

dụng bột dinh dưỡng Enalac ở các bệnh viện cho mọi đối tượng của Trung tâm dinh

dưỡng đã đạt được nhiều thành quả tốt đẹp như:



− Bột dinh dưỡng Enalac dễ sử dụng, cung cấp nhiều năng lượng và các yếu tố vi

lượng, dễ tiêu hóa, hấp thu rất tốt trong việc hỗ trợ cho các bệnh nhân nặng không tự ăn

được hay cần bổ sung dinh dưỡng.

− Trong việc điều trị suy dinh dưỡng ở người già và trẻ em thì số người tăng cân sau

đợt dùng Enalac là trên 70%.

− Enalac an toàn cho người sử dụng và có giá thành phù hợp trong điều kiện kinh tế

nước ta hiện nay.

− Tuy nhiên, để có thể khẳng định chắc chắn và phát huy được tìm năng của loại siêu

thực phẩm này chúng ta cần thực hiện nghiên cứu lâm sàn sâu rộng hơn trên mọi đối

tượng và kéo dài trong thời gian cần thiết.

Viện Nghiên cứu Ứng Dụng Công Nghệ (Bộ Khoa Học Công Nghệ và Môi

Trường):

Bằng các phương pháp công nghệ sinh học, cán bộ của Viện Nghiên Cứu Ứng Dụng

Công Nghệ (Bộ Khoa Học Công Nghệ và Môi Trường) đã chiết xuất được một số chất có

hoạt tính sinh học cao như phycocyanin. Việc kết hợp phycocyanin và tia xạ Cobalt 60

trong điều trị bệnh ung thư vòm họng. Kết quả là hạn chế 70-80% sự phát triển của tế bào

ung thư, bệnh nhân phục hồi và tăng thể trọng sau đó. Nhiều loại vitamin, khoáng và các

hợp phần dinh dưỡng khác trong Spirulina có tác dụng bồi dưỡng sức khỏe, chống suy

dinh dưỡng, bảo vệ cơ thể khỏi tác hại của chất phóng xạ và chống suy mòn do nhiễm hơi

độc.

Viện Sinh Vật Học:

Giáo sư Đặng Đình Kim (Viện Sinh Vật Học) và Y.Lemoine (Đại Học Sư Phạm

Pari) đã tiến hành nuôi trồng Spirulina trong bình tam giác chứa môi trường Zarrouk

trong điều kiện kiểm soát về nhiệt độ, ánh sáng, thời gian chiếu sáng. Sau khi vi tảo

Spirulina đạt yêu cầu về sinh trưởng và phát triển, giáo sư và cộng sự tiến hành xác định

protein tổng (bằng phương pháp Bio Rad), hàm lượng phycobiliprotein, xác định acid

tổng số và các acyl lipid (sắc ký trên máy Girdel Chromatographie Serie 300).



Ngoài ra, việc thử nghiệm nuôi trồng Spirulina bằng nước thải hầm biogas không chỉ

là biện pháp mở rộng sản xuất và hạ giá thành sản phẩm mà còn giải quyết môi trường

sinh thái cho nông thôn. Loài vi tào này còn được sử dụng để xử lý nước thải giàu NH4 từ

nhà máy sản xuất ure thuộc xí nghiệp Liên Hiệp Phân Đạm Hóa Chất Hà Bắc, kết quả cho

thấy: nước thải sau khi pha loãng và bổ sung thêm một số chất khoáng cần thiết rồi dùng

nuôi Spirulina đã mang lại năng suất cao và có tác dụng bảo vệ môi trường.

1.2.7. Công nghệ nuôi trồng tảo Spirulina

1.2.7.1. Giới thiệu các hệ thống nuôi tảo Spirulina

Công nghệ nuôi trồng Spirulina theo hệ thống hở (O.E.S):

Spirulina sống trong môi trường dinh dưỡng đựng trong bình, chậu, bể… được vận

động bằng khuấy trộn theo kiểu tịnh tiến 2 chiều và tảo hấp thu ánh sáng mặt trời để phát

triển. Kiểu nuôi này phụ thuộc vào thời tiết cần có giải pháp khắc phục.

Công nghệ nuôi trồng tảo Spirulina theo hệ thống kín (C.E.S):

Spirulina được nuôi trong các bể lên men vi sinh khối (bioreactor) vận động bằng

máy khuấy trộn theo 3 chiều, tảo hấp thu ánh sáng nhân tạo hay tự nhiên. Nhiều kiểu CES

được thiết kế như thùng lên men cổ điển hoặc kiểu ống xoắn ốc…[7].

1.2.7.2. Tiêu chuẩn chọn giống Spirulina

Chọn giống theo mục đích sử dụng: làm thực phẩm (chọn giống giàu protein,

vitamin, không có hoặc chứa ít mùi khó chịu khi sử dụng), làm dược phẩm (chọn giống

chiết xuất được chất mong muốn với liều lượng cao), làm mỹ phẩm ( chọn giống chiết

xuất ra được nhiều chất dưỡng da, chống lão hóa da như vitamin E- chống oxy hóa…)

Chọn giống ít hấp phụ, tích tụ các chất độc của môi trường nuôi cấy như: Pb,

arsenic. Giống Spirulina chất lượng tốt là giống hấp phụ ít nhất các chất độc trong cùng

điều kiện thí nghiệm.

Chọn giống cho năng suất cao, dễ thu hoạch, dễ thích nghi, sức chống chịu tốt.

Giống spirulina phải được mua ở những cơ sở uy tín. Đồng thời nơi nuôi trồng

Spirulina cũng nên được trang bị những phòng thí nghiệm để phục vụ cho công tác giữ và

nhân giống phục vụ sản xuất. Ở nước ta có bảo tàng giống tảo Việt Nam là nơi cung cấp



giống và tư vấn xây dựng qui trình nuôi tảo - do giáo sư Dương Đức Tiến thành lập từ

năm 1982 [7].

1.2.7.3. Điều kiện nuôi tảo

Spirulina cần môi trường nuôi kiềm (muối natri cacbonat và pH cao). Nhiệt độ nước

dao động từ 25 – 400C, nhiệt độ tối thích là 350C. Cần ánh sáng để tiến hành quá trình

quang hợp tạo ra sinh khối. Môi trường nước cần được khuấy đều liên tục.

Các chất dinh dưỡng cần được cung cấp là phosphor, nitơ, sắt cùng với các chất

khoáng khác, các chất khoáng này cần được cung cấp thông qua dạng hòa tan trong dung

dịch.

Dưới điều kiện tối ưu, Spirulina có thể tăng gấp đôi sinh khối và thể tích sau 24h

nuôi.

Có thể xây dựng các trang trại gia đình với quy mô từ 10 – 50m2, các trang trại thủ

công có thể tới 300m2, trang trại thương mại có thể tới 1hecta và các trang trại quy mô

công nghiệp lớn với sản lượng thu được từ 100 – 500kg hoặc 1 tấn sinh khối tảo trên ngày

[3].

1.2.7.4. Môi trường nuôi tảo

Thành phần chính là NaHCO3 pha trộn với các môi trường dưới đây:

Bảng 1.7: Môi trường cơ bản( môi trường Zarrouk)

Hóa chất Hàm lượng Hóa chất Hàm lượng

K2HPO4

K2SO4

MgSO4.7H2O

CaCl2.2 H2O

0,1g/200ml

0,2g/200ml

0,04g/200ml

0,008g/200ml

NaNO3

NaCl

FeSO4

EDTA

0,5g/200ml

0,2g/200ml

0,0002g/200ml

0,016g/200ml

[13]



Bảng 1.8: Môi trường bổ sung 1


H3BO3

ZnSO4.7 H2O

MoC3

2,86g/l

0,22g/l

0,01g/l

MnCl2.4 H2O

CuSO4.5 H2O

1,81g/l

0,08g/l

[13]

Bảng 1.9: Môi trường bổ sung 2


K2Cr2(SO4)3.24 H2O

Ti2(SO4)3

960g/l

400g/l

NiSO4.7 H2O

Co(NO3)2.6 H2O

478g/l

44g/l

[13]

1.2.7.5. Qui trình nuôi tảo

Đầu tiên phải lựa chọn vị trí cho trang trại. Kích thước và kiểu trang trại cũng cần

được xác định theo đặc thù về khí hậu, nguồn nước, khả năng tài chính. Xây dựng bể, lắp

đặt các cánh khuấy và mô tơ.

Chuẩn bị các chủng tảo và nhân giống chúng từ trong phòng thí nghiệm. Phải chuẩn

bị ít nhất 100 lít chủng giống.

Chọn lượng môi trường nuôi cấy thích hợp, ít tốn kém nhất và các nguồn hóa chất

phải dễ nhập.

Nếu bể có kích thước lớn hơn 10m2, cần rào bằng chất liệu nilon, plastic hoặc bê

tông và lắp đặt các máy bơm khuấy.

Đối với các bể nuôi rất lớn, phải tiến hành nuôi cấy liên tục và sau đó khi thu hoạch

phải bớt lại ít nhất 1/5 thể tích bể. Ngoài ra, để tránh sốc pH và sự thay đổi áp suất thẩm

thấu quá đột ngột, ta phải bổ sung môi trường nuôi cấy mới với từng lượng nhỏ theo chu

kỳ 12h một lần.

Công thức đơn giản nhất để tiến hành xây dựng bể thủ công là: sàn bằng bê tông,

khung gỗ và che chắn bằng vật liệu plastic.



Nhiệt độ nước cần kiểm tra 2 lần trong ngày. Tốt nhất là ghi lại nhiệt độ ở từng giờ

nếu có thiết bị ghi tự động. Nhiệt độ phải duy trì không cao hơn 410C và không thấp hơn

210C trong suốt cả ngày.

Giá trị pH tối ưu là 9,5 song thường trong các bể nuôi dao động từ 10 – 10,5. Vào

buổi chiều do quang hợp mạnh nên pH có thể tăng lên đến 11,5. Nhưng vào ban đêm do

quá trình hô hấp, chuyển hóa carbohydrate thành protein,…và giải phóng CO2 vào trong

nước nên pH lại trở về mức 10 – 10,5 vào sáng hôm sau [3].

1.2.7.6. Thu hoạch tảo

Thu hoạch được thực hiện bằng cách lọc qua màng polyester, đường kính mắt lưới

30μm. Thiết bị lọc được đặt nghiêng chút ít để có thể tiến hành lọc được liên tục đồng

thời rửa và vớt. Sau đó chuyển chúng qua giai đoạn vắt nước bằng máy vắt, ép hoặc nhờ

màng rung cho nước chảy bớt xuống. Bánh tảo sau đó được cắt ra thành từng miếng, khúc

nhờ dao. Sau giai đoạn này nước vẫn chiếm 70 – 80%.

Trong giai đoạn này tảo Spirulina do chứa nhiều đạm nên chúng dễ bị vi khuẩn tấn

công và lên men tạo sản phẩm không mong muốn chỉ trong vài giờ tùy thuộc vào nhiệt

độ. Đó là lý do tại sao người Aztecs và Kanembous đã nghĩ cách đổ sinh khối vào các bể

cát, chúng bị cát hút nước và lõm xuống cát. Nhờ có cát nóng dưới ánh sáng mặt trời

chúng sẽ trở nên khô chỉ sau 4 – 5h, như vậy có thể chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn.

Tuy nhiên, việc phơi trực tiếp dưới ánh sáng mặt trời lại có thể gây ra việc phá hủy

diệp lục tố, làm giảm hàm lượng carotene và vitamin nhóm B của sản phẩm. Vì vậy các

trang trại nuôi trồng Spirulina thủ công, nhỏ lẻ thường phơi bằng cách cho dịch tảo vào

trong các hộp kim loại rồi đem phơi ngoài nắng từ đó sử dụng hơi nóng và gió thổi qua

làm bay hơi nước.

Người ta còn sử dụng thiết bị đơn giản hình xylanh, một đầu có châm các lỗ nhỏ

đường kính 2mm, rồi cho rong tảo vào trong. Sau đó ép mạnh một đầu, tảo sẽ chảy ra

thành các sợi như sợi mì, tiếp theo trải nhẹ lên các khung bằng kim loại hoặc bằng gỗ rồi

đưa vào trong các hộp để làm khô. Hộp làm khô có kích thước các lỗ vào và ra bằng nhau

cho phép không khí lưu thông được dễ dàng [3].



1.2.8. Các phương pháp phá vỡ tế bào S.platensis

1.2.8.1. Phương pháp vật lý

Phương pháp sốc nhiệt:

Phương pháp này được thực hiện bằng cách đưa huyền phù tế bào xuống nhiệt độ

thấp, sau đó ngay lập tức nâng nhiệt lên nhanh đến 400C, khi đó thành tế bào bị phá vỡ và

ta thu được huyền phù tế bào vỡ. Dịch huyền phù được pha loãng, lọc qua giấy thu dịch

chiết.

Phương pháp phá vỡ tế bào bằng sóng cực ngắn (microware):

Là kỹ thuật dựa trên đặc tính gia nhiệt của vi sóng (microware). Những sản phẩm

nội bào của vi khuẩn, đặc biệt là các phân tử nhỏ được trích ly dễ dàng sau khi tế bào

được xử lý với vi sóng.

Phương pháp sốc thẩm thấu:

Trong phương pháp này, đầu tiên tạo ra áp suất thẩm thấu cân bằng giữa bên trong

và bên ngoài tế bào trong môi trường giàu saccharose. Sau đó nhanh chóng pha loãng

dung dịch saccharose. Sự chênh lệch áp suất đột ngột sẽ làm tổn thương màng tế bào.

Phương pháp đông lạnh và rã đông:

Huyền phù tế bào được đông lạnh trong tủ đông, sau đó được rã đông ở nhiệt độ

phòng. Các tế bào bị trương lên và cuối cùng bị vỡ ra do sự hình thành và tan ra của các

tinh thể đá.

1.2.8.2. Phương pháp sinh học

Sử dụng enzyme Lysozyme:

Điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme:

− Nhiệt độ 450C

− Nồng độ Lysozyme: 5000µg/ml, pH 6.0

− Nồng độ cơ chất: 0,1g Spirulina/10ml

− Thời gian ủ: 60 phút

Sử dụng enzyme Viscozym L:

Điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme:



− Nhiệt độ 450C

− Hàm lượng Viscozym: 10% V huyền phù

− Nồng độ cơ chất: 1g Spirulina/50ml

− Thời gian ủ: 60 phút

Theo nghiên cứu của Lương Đình Quát (2007), Nghiên cứu các phương pháp xử lý

sinh khối vi khuẩn lam S.platensis để sản xuất một số loại nước uống giàu dinh dưỡng,

Luận văn thạc sĩ. Đã tiến hành thử nghiệm các phương pháp xử lý trên và thu được kết

quả:

Phương pháp sốc nhiệt: Cho hiệu suất thấp, tuy nhiên hoạt tính protein hòa tan trong

dịch chiết được đảm bảo.

Phương pháp sốc thẩm thấu: Cho hiệu suất 55,1% ở nồng độ đường saccharose 50%

sau thời gian ủ là 1h và protein không bị biến tính. Phương pháp này thích hợp với sản

phẩm chứa hàm lượng đường cao.

Phương pháp xử lý bằng sóng cực ngắn: Cho hiệu suất cao hơn 3 phương pháp trên,

đạt hiệu suất 66,1% ở 3 chu kì. Tuy nhiên, trong phương pháp này protein bị biến tính

theo chu kỳ.

Xử lý bằng Lysozyme: Cho hiệu suất 69,3% ở nồng độ Lysozyme 5000µg/ml

Xử lý bằng Viscozym L: Cho hiệu suất 73,6% ở hàm lượng 10% Viscozym so với

dịch huyền phù.

Như vậy, nhìn chung phương pháp xử lý bằng enzyme cho hiệu quả tốt hơn so với

các phương pháp vật lý thông thường. Sau khi phá vỡ tế bào, hỗn hợp được đem đi

nghiền, sau đó tách vách và các mảnh vỡ tế bào ra khỏi dịch bằng các phương pháp lọc, ly

tâm…[8].



1.3. Nghiên cứu tình huống

1.3.1. Nghiên cứu xử lý tảo Spirulina: [48]

1.3.1.1. Lĩnh vực nghiên cứu

Spirulina là sản phẩm thực phẩm giàu chất dinh dưỡng, nó bao gồm cả đặc tính của

rau xanh và thành phần chất dinh dưỡng của chính nó. Điều này cho phép biểu diễn các

chất dinh dưỡng của Spirulina dưới dạng thức ăn thông thường dễ hấp thụ.

Spirulina thường được cung cấp dưới dạng bột khô. Số lượng lớn bột Spirulina

thường được sản xuất bởi việc thu hoạch tảo ướt từ các quá trình sản xuất ở quy mô lớn

trong các hồ nhân tạo ngoài trời. Tuy nhiên, do bột Spirulina sản xuất bằng phương pháp

này có mùi vị đặc trưng của tảo nên nó được sử dụng rất hạn chế trong ngành công nghiệp

thực phẩm, chủ yếu sử dụng trong thực phẩm bổ dưỡng và thức ăn cho động vật.

Đã có một vài phương pháp được áp dụng để giảm mùi vị đặc trưng của Spirulina

như thêm dịch chiết từ lá trà vào dịch huyền phù Spirulina, sau đó làm khô và tạo bột.

Tuy nhiên, bột Spirulina thu được bằng phương pháp này vẫn còn giữ một phần mùi vị

đặc trưng của Spirulina.

Đồng thời, trong công nghiệp sản xuất thực phẩm nói chung, điều cần thiết là giảm

thiểu lượng vi khuẩn tạp nhiễm. Thông thường hay sử dụng phương pháp xử lý nhiệt ở

1300C, sau đó đưa vào hệ lên men và thực hiện quá trình lên men ở độ chua định trước,

sản phẩm sau lên men được làm mát về nhiệt độ mà quá trình lên men không còn xảy ra.

Phương pháp này có thể làm giảm số lượng vi khuẩn tạp nhiễm nhưng vì xử lý ở nhiệt độ

cao nên các cấu tử hoạt động mong muốn trong Spirulina cũng bị mất.

Vì vậy, yêu cầu đặt ra là xử lý Spirulina sao cho có thể giảm thiểu mùi vị đặc trưng,

giảm số vi khuẩn tạp nhiễm nhưng vẫn giữ lại được các cấu tử hoạt động mong muốn

trong Spirulina.

1.3.1.2. Tóm tắt nghiên cứu

Khi thực hiện sự pha trộn Spirulina với vi khuẩn lactic và nuôi cấy vi khuẩn lactic,

người ta nhận thấy nó có thể làm giảm mùi vị đặc trưng của Spirulina. Sự giảm mùi vị

đặc trưng của Spirulina và giảm lượng vi khuẩn tạp nhiễm là nhờ hoạt động kháng khuẩn



của các acid hữu cơ như acid acetic, acid lactic…và các chất kháng khuẩn tạo ra trong quá

trình nuôi cấy của vi khuẩn lactic. Trong khi đó vẫn giữ được các cấu tử hoạt động trong

Spirulina.

Spirulina được xử lý theo cách này sẽ dễ dàng sử dụng trong các thực phẩm sức

khỏe và các thực phẩm liên quan khác.

Theo cách này, các nghiên cứu hiện nay đã đưa ra một quy trình xử lý Spirulina, quy

trình này bao gồm nghiên cứu Spirulina không qua giai đoạn đun nóng và tiệt trùng, vi

khuẩn lactic và đường, sau đó khảo sát quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic. Spirulina được

sử dụng khoảng 1-20g/100g khối lượng của tổng Spirulina, vi khuẩn lactic và nước kết

hợp. Số lượng vi khuẩn lactic khi bắt đầu nuôi cấy khoảng 106 – 109 tế bào/g Spirulina

(chất rắn cơ sở). Trong trường hợp này vi khuẩn lactic thường được nuôi ở pH từ 6-8

trong khoảng thời gian 24h. Spirulina được dùng có thể ở dạng bột hoặc dạng tươi sống.

Vi khuẩn lactic sử dụng thuộc loài Pediococcus hoặc Lactobacillus. Đường sử dụng là

loại galactooligosaccharide.

1.3.1.3. Mô tả chi tiết nghiên cứu

Spirulina:

Tảo Spirulina sử dụng thuộc lớp Cyanophyceae, họ Oscillatoriaceae, giống

Spirulina. Ví dụ như S.platenis, S.maxima, S.geitleri, S.siamese, S.major, S.subsalsa,

S.princeps, S.laxissima, S.curta, S. spirulinoides.

Spirulina xuất khẩu dưới dạng các hình thức: spirulina sống, spirulina khô, spirulina

đã qua xử lý bằng máy móc cơ học hoặc các phương pháp xử lý khác. Spirulina sống có

thể thu được bằng phương pháp tách ly tâm và lọc sau khi thu hoạch từ bể nuôi. Spirulina

khô tạo ra từ Spirulina sống thu được bằng phương pháp trên đã được đông lạnh, sau đó

sấy khô hoặc phun khô. Spirulina đã qua xử lý bằng máy móc cơ học hoặc các phương

pháp khác bao gồm đối tượng là Spirulina sống được đưa vào các máy cơ học để đồng

nhất hoặc có thể được xử lý sau khi sấy khô.

Spirulina được dùng trong quá trình nghiên cứu xử lý tốt nhất là dùng Spirulina sống

vì nó giữ lại nhiều hơn các cấu tử hoạt động của Spirulina.



Tùy mức độ khác nhau mà nước được loại bỏ trong quá trình thu hoạch. Spirulina

sống nhìn chung đều ở dạng huyền phù trong nước. Cũng có thể ở dạng paste có hàm

lượng nước thấp hơn huyền phù, hoặc ở dạng bánh có hàm lượng nước thấp hơn dạng

paste. Spirulina có thể được dùng dưới bất cứ hình thức nào nhưng có lẽ thích hợp nhất là

dùng Spirulina dạng huyền phù. Nếu Spirulina khô hoặc Spirulina đã qua xử lý được

dùng trong qui trình nghiên cứu thì có thể dùng ở trạng thái khô hoặc thêm nước vào để

nó thành dạng huyền phù, paste hoặc dạng bánh như trường hợp của Spirulina sống.

Để tránh sự mất mát các cấu tử hoạt động trong Spirulina, Spirulina được dùng trong

nghiên cứu phải chưa qua giai đoạn xử lý tiệt trùng ban đầu. Spirulina chứa các thành

phần duy trì sức khỏe bao gồm: Phycocianin có tác dụng chống viêm gan và bảo vệ hoạt

động của gan, chlorophyll (chất diệp lục) có tác dụng kháng khuẩn, chống dị ứng, thúc

đẩy sự trao đổi chất, ngăn ngừa ung thư, làm sạch máu…Việc xử lý tiệt trùng sẽ tiêu hủy

các cấu tử hoạt động.

Vi khuẩn lactic:

Vi khuẩn lactic đã được dùng từ thời cổ đại trong việc xử lý nhiều loại thực phẩm,

bao gồm các sản phẩm như sữa lên men, đồ uống qua quá trình ủ, rau dưa và trái cây, với

mục đích bảo quản và tạo hương liệu thực phẩm.

Vi khuẩn lactic và chất chuyển hóa của chúng cũng có nhiều tác động sinh lý mong

muốn như làm giảm cholesterol máu, hoạt động hạ huyết áp. Vì thế chúng được sử dụng

như các sản phẩm thực phẩm để thúc đẩy sức khỏe.

Vi khuẩn lactic được phân loại theo môi trường nó sống như vi khuẩn lactic trong

sữa, vi khuẩn lactic từ thực vật, vi khuẩn lactic đường ruột, vi khuẩn lactic có xuất xứ

trong các hồ muối tự nhiên nơi Spirulina phát triển. Vi khuẩn lactic cũng có thể được

phân loại theo nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của nó như vi khuẩn lactic ưa ấm, vi

khuẩn lactic ưa nhiệt…

Vi khuẩn lactic sử dụng trong nghiên cứu có thể thuộc các chi Lactobacillus,

Pediococcus, Tetragenococcus, Carnobacterium, Vagococcus, Leuconostoc, Weissella,



Oenococcus, Atopobium, Streptococcus, Enterococus, Lactococcus, Aerococcus,

Alloiococcus, Melissococcus và Bifidobacterium.

Vi khuẩn lactic thuộc chi Pediococcus thích hợp sử dụng hơn vì nó có thể làm giảm

mùi vị đặc trưng của Spirulina.

Các vi khuẩn lactic được sử dụng có thể được phát triển trên môi trường thạch hoặc

môi trường lỏng rồi được bảo quản bằng cách làm lạnh hoặc sấy khô. Thích hợp nhất đối

với bảo quản vi khuẩn lactic là được cấy chuyền và nuôi dưỡng trong môi trường lỏng vì

vi khuẩn lactic có tỷ lệ tăng trưởng nhanh chóng và hoạt độ cao, có khả năng tạo ra hương

vị (acetaldehyde, diacetyl) và axit hữu cơ.

Môi trường lỏng mà vi khuẩn lactic được nuôi cấy là môi trường MRS được thiết kế

bởi Man, Rogosa and Sharpe, môi trường whey chứa các thành phần của sữa, môi trường

sữa không béo. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy bao gồm việc đưa vi khuẩn lactic vào môi

trường lỏng và duy trì môi trường trong tình trạng hiếu khí hoặc kị khí thích hợp với vi

khuẩn lactic được nuôi cấy. Thực hiện 8-36h ở chế độ tĩnh hoặc khuấy trộn ở nhiệt độ

20 – 400C.

Quá trình xử lý:

Hỗn hợp Spirulina và vi khuẩn lactic được duy trì ở trạng thái ẩm ướt hoặc được giữ

trong nước. Thông thường hay giữ hỗn hợp trong nước. Khi phối trộn hỗn hợp, để tăng

hiệu quả nuôi cấy vi khuẩn lactic và tăng khả năng tạo hương, thì thích hợp hơn cả là

dùng Spirulina ở dạng huyền phù của Spirulina sống và vi khuẩn lactic được nuôi cấy

trong môi trường lỏng. Nếu lượng nước không đủ có thể thêm nước vào hòa trộn. Nước

được sử dụng là nước đã qua tiệt trùng.

Để đạt hiệu quả tốt khi thu hoạch và làm khô sau quá trình nuôi cấy thì Spirulina

chứa trong hỗn hợp được duy trì trong nước với lượng tốt nhất từ 1-20g/100g hỗn hợp.

Hỗn hợp được đặt trong trạng thái nuôi cấy tĩnh hoặc khuấy trộn nhờ cánh khuấy, nuôi

cấy hiếu khí hoặc kị khí tùy loài sử dụng.

Để có thể ngăn chặn sự tạp nhiễm của vi khuẩn bên ngoài, số vi khuẩn lactic thích

hợp để bắt đầu cho quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic là từ 106-109 tế bào/1g Spirulina.



Độ pH khi hỗn hợp Spirulina và vi khuẩn lactic được giữ trong nước thay đổi theo

từng giai đoạn và thích hợp trong khoảng pH từ 6-8.

Nhiệt độ nuôi cấy có thể là bất cứ nhiệt độ nào mà tại đó vi khuẩn lactic có thể phát

triển. Tuy nhiên, nhiệt độ tốt nhất cho sự phát triển của vi khuẩn lactic và tránh sự tổn thất

các cấu tử hoạt động trong Spirulina, nhiệt độ thích hợp là từ 20 – 400C.

Thời gian nuôi cấy tốt nhất là từ 8 -24h. Để ngăn chặn hoàn toàn sự phát triển của vi

khuẩn tạp nhiễm, đồng thời giảm được mùi vị đặc trưng của Spirulina, số vi khuẩn lactic

sau nuôi cấy thích hợp là tăng từ 80 – 300 lần so với lượng vi khuẩn bắt đầu nuôi cấy.

Để duy trì một pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn lactic, độ pH có thể được

điều chỉnh bằng cách thêm một hợp chất cơ bản như amonium hydroxide. Tuy nhiên, nhờ

sự hiện diện của acid lactic và một số chất được tạo bởi vi khuẩn lactic, độ pH của huyền

phù Spirulina được đưa về 4, đây là điều mong muốn để giảm các vi khuẩn tạp nhiễm.

Để giảm thiểu đến mức tối đa mùi vị đặc trưng của Spirulina, người ta đã nghiên cứu

và bổ sung thêm đường vào hỗn hợp nuôi cấy để ức chế mùi vị.

Đường có thể là monosaccharide, oligosaccharide, polysaccharide. Cụ thể

monosaccharides bao gồm glucose, galactose, mannose, frucrose, ribose and xylose.

Oligosaccharides bao gồm disaccharide như sucrose and maltose, fructooligosaccharide,

xylooligosaccharide và raflinose. Polysaccharides bao gồm amylose, amylopectin,

cellulose, glycogen, β-glucan và mucopolysaccharide. Đường thích hợp sử dụng là

oligosaccharide và tốt nhất là galactooligosaccharide.

Việc pha trộn đường vào hỗn hợp theo nhiều cách, có thể Spirulina được đưa vào

hỗn hợp mà đường được hòa trộn với vi khuẩn lactic trước đó, hoặc có thể vi khuẩn lactic

được đưa vào hỗn hợp mà đường đã pha trộn với Spirulina trước đó. Thích hợp hơn là

dùng đường ở dạng rắn, mặc dù có thể dùng ở dạng dung dịch bằng cách hòa tan đường

vào nước hoặc các dạng tương tự. Lượng đường được sử dụng thích hợp là từ 3-10g/100g

hỗn hợp.

Tác dụng kháng khuẩn của acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic…) và các chất kháng

khuẩn được sinh ra trong suốt thời gian tăng trưởng của vi khuẩn làm giảm vi khuẩn tạp



nhiễm trong huyền phù Spirulina, làm cho vi khuẩn lactic chiếm ưu thế. Hơn nữa, hương

vị được sinh ra từ vi khuẩn lactic như acetaldehyde hay diacetyl làm giảm mùi vị đặc

trưng của tảo Spirulina, cung cấp một hương vị mới trong sản phẩm thực phẩm. Spirulina

thu được có thể được sử dụng trực tiếp mà không cần loại bỏ bớt vi khuẩn lactic.

Nếu cần thiết tảo Spirulina thu được sau quá trình xử lý có thể được sấy khô hoặc

làm thành bột. Quá trình xử lý khô được thực hiện đến độ ẩm 4-7%. Và việc xử lý nên giữ

sao cho duy trì được hàm lượng vi khuẩn lactic ưa thích. Ví dụ phương pháp làm khô

thích hợp như sấy khô, phun khô, phương pháp phun khô có lợi thế hơn về mặt chi phí.

Trong suốt thời gian xử lý khô, hiệu quả sản xuất tăng lên khi tăng nhiệt độ lên tối đa.

Tuy nhiên, để đảm bảo chất lượng Spirulina tốt và tránh làm giảm số lượng vi khuẩn

lactic thì nhiệt độ sấy thích hợp là 30-700C và tốt nhất là 40-600C.

Kết luận:

Spirulina thu được sau quá trình xử lý có khả năng giảm thiểu số lượng vi khuẩn tạp

nhiễm không mong muốn, giảm mùi vị đặc trưng của tảo Spirulina. Hơn nữa, tảo

Spirulina có thể được kết hợp với vi khuẩn lactic tạo hỗn hợp với nhiều thành phần có

ích cho sức khỏe. Do đó, Spirulina như vậy có thể được sử dụng không chỉ trong thực

phẩm y dược, mà còn trong các sản phẩm thực phẩm nói chung, thức uống, sản phẩm bổ

sung dinh dưỡng…

1.3.1.4. Giới thiệu các ví dụ minh họa nghiên cứu

Các ví dụ cơ sở (nuôi cấy giống vi khuẩn), các ví dụ nghiên cứu (thực hiện theo điều

kiện nghiên cứu) và các ví dụ so sánh được đưa ra để minh họa.

Ví dụ cơ sở:

Ví dụ cơ sở 1:

Chuẩn bị giống vi khuẩn lactic nuôi cấy:

Vi khuẩn lactic Lactobacillus plantarum bảo quản đông lạnh được cấy vào 10ml môi

trường MRS và nuôi cấy ở 300C trong 18h để cung cấp giống vi khuẩn lactic. Đây gọi là

vi khuẩn lactic nuôi cấy 1.



Ví dụ cơ sở 2 đến 5: Tương tự như ví dụ cơ sở 1, chỉ thay thế vi khuẩn lactic.

Ví dụ 2: Sử dụng Lactobacillus lactis Vi khuẩn lactic nuôi cấy 2

Ví dụ 3: Sử dụng Lactobacillus acidophilus Vi khuẩn lactic nuôi cấy 3

Ví dụ 4: Sử dụng Leuconostoc Vi khuẩn lactic nuôi cấy 4

Ví dụ 5: Sử dụng Pediococcus Vi khuẩn lactic nuôi cấy 5

Ví dụ nghiên cứu:

Ví dụ 1:

Spirulina được nuôi cấy và thu hoạch trong bể nuôi cấy trong 7 ngày kể từ ngày

chiếu sáng liên tục bằng cách sử dụng ánh sáng nhân tạo, sau đó thu hoạch. Sau khi được

thu hoạch, Spirulina được rửa bằng nước muối sinh lý, 20g Spirulina sau khi rửa được tạo

huyền phù trong 180ml nước muối sinh lý đã được bổ sung 10g galactooligosaccharide.

Vi khuẩn lactic nuôi cấy 1 chuẩn bị ở ví dụ cơ sở được tiêm vào dịch huyền phù một

lượng khoảng 5×108 tế bào/g trọng lượng khô của Spirulina. Điều chỉnh về pH 7.0 với

dung dịch NaOH 0,1M và nuôi cấy có lắc ở 300C trong 24h. Sau đó, dịch nuôi cấy được

đưa vào mấy sấy phun nhỏ và phun khô đến nhiệt độ thành phẩm 550C và thu được bột

Spirulina. Đây được coi là bột Spirulina 1.

Ví dụ 2 đến 5: Thực hiện tương tự như ví dụ 1, chỉ thay thế vi khuẩn lactic.

Ví dụ 2: Sử dụng vi khuẩn lactic nuôi cấy 2 Bột Spirulina 2




Khi thực hiện ví dụ nghiên cứu 1-5, số lượng vi khuẩn lactic sau khi nuôi cấy tăng

lên 10-80 lần so với số lượng vi khuẩn lactic khi bắt đầu nuôi cấy.

Ví dụ 6:

10g bột khô Spirulina được tạo huyền phù trong 190ml nước muối sinh lý tạo thành

dung dịch huyền phù. Huyền phù này được bổ sung 10g galactooligosaccharide . Sau đó

dịch huyền phù được tiêm vào dung dịch vi khuẩn lactic nuôi cấy 1 đã được chuẩn bị



trước với hàm lượng 2×108 tế bào/g Spirulina. Dung dịch được chỉnh pH đến 7.0 bằng

NaOH 0,1M, quá trình nuôi cấy được thực hiện ở 300C trong 24h. Sau đó, dịch nuôi cấy

được đưa vào mấy sấy phun nhỏ và phun khô đến nhiệt độ thành phẩm 550C và thu được

bột Spirulina. Đây được coi là bột Spirulina 6.

Ví dụ 7 đến 10: Tương tự ví dụ 6, chỉ thay thế vi khuẩn lactic.





Khi thực hiện ví dụ nghiên cứu 6-10, số lượng vi khuẩn lactic sau khi nuôi cấy tăng

50-200 lần so với số lượng vi khuẩn lactic bắt đầu nuôi cấy.

Ví dụ so sánh:

Ví dụ so sánh 1:

Spirulina được nuôi cấy và thu hoạch trong bể nuôi cấy trong 7 ngày kể từ ngày

chiếu sáng liên tục bằng ánh sáng nhân tạo, sau đó thu hoạch. Sau khi thu hoạch Spirulina

được rửa sạch bằng nước muối sinh lý, 20g Spirulina được tạo huyền phù trong 180ml

nước muối sinh lý. Huyền phù sau đó được đưa vào máy sấy phun nhỏ và sấy khô đến

nhiệt độ thành phẩm 550C, bột Spirulina này được dùng làm mẫu đối chứng, đây gọi là

bột Spirulina A.

Kiểm tra mẫu bột từ 1 đến 10 và so sánh với mẫu bột A:

Tổng tế bào vi khuẩn khác vi khuẩn lactic trong bột Spirulina từ 1 đến 10 và bột

Spirulina A đã được xác định, vị và mùi cũng được đánh giá bằng cách kiểm tra cảm

quan. Các kết quả được hiển thị trong bảng 1.10. Xác định tổng tế bào và kiểm tra cảm

quan được thực hiện bằng cách dùng nhóm 10 người.

Xác định số lượng vi khuẩn:

Dịch huyền phù được chuẩn bị bằng cách dùng 1g bột Spirulina trong 19ml nước

muối sinh lý, huyền phù được pha loãng thêm 1 lần, 10 lần, 102 lần, 103 lần, 104 lần. Mỗi



ml của mỗi mẫu pha loãng được trộn với 10ml môi trường agar trên đĩa petri, để đóng

rắn, sau đó nuôi cấy ở 350C trong 48h.

Sử dụng một môi trường thạch xác định để có 30-300 khuẩn lạc phát triển, tổng các

khuẩn lạc trên môi trường agar được xác định. Số này được nhân lên với độ pha loãng.

Đánh giá về vị:

Bột Spirulina A được sử dụng như mẫu đối chứng. Trong mỗi trường hợp, 0,1g

Spirulina được đặt trên lưỡi và nếm thử. Cách chấm điểm vị dựa trên các tiêu chí bên

dưới và cường độ vị được xác định bằng cách sử dụng công thức (1.1). Giá trị cường độ

thấp hơn chứng tỏ mùi vị đặc trưng của Spirulina yếu hơn.

+3: Vị đặc trưng Spirulina giống như mẫu chuẩn

+2: Vị đặc trưng của Spirulina yếu

+1: Vị đặc trưng của Spirulina rất yếu

0: Không có vị đặc trưng của Spirulina.

Cường độ = (0 × N0 + 1 × N1 + 2 × N2 + 3 × N3 )/N (1.1)

Trong đó: N là tổng số chuyên gia đã thử, N0 là số chuyên gia cho điểm 0, N1 là số

chuyên gia cho điểm 1, N2 là số chuyên gia cho điểm 2, N3 là số chuyên gia cho điểm 3.

Đánh giá mùi:

Bột Spirulina A được dùng như mẫu đối chứng. Trong mỗi trường hợp, 2g bột

Spirulina được đặt trong một túi polyethylene, miệng túi được đóng và chúng được rung

trong 10s, sau đó mùi trong túi được ngửi, các chuyên gia chấm điểm dựa trên các tiêu chí

dưới đây, và cường độ mùi được xác định bằng công thức (1.1). Giá trị cường độ thấp hơn

chứng tỏ mùi Spirulina yếu hơn.

+3: Mùi đặc trưng Spirulina giống như mẫu chuẩn

+2: Mùi đặc trưng của Spirulina yếu

+1: Mùi đặc trưng của Spirulina rất yếu

0: Không có mùi đặc trưng của Spirulina.



Bảng 1.10: So sánh mẫu thử nghiệm từ 1 đến 10 với mẫu chuẩn

Mẫu STT bột Spirulina

STT vi khuẩn lactic nuôi cấy

Số lượng vi khuẩn

Vị Mùi

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 Đối chứng

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 A

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Không

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

4.0 × 104

+ 0.3 + 0.4 + 0.4 + 0.3 + 0.2 + 0.8 + 0.7 + 0.7 + 0.7 + 0.4 + 3.0

+ 0.3 + 0.3 + 0.3 + 0.3 + 0.2 + 0.7 + 0.7 + 0.7 + 0.6 + 0.5 + 3.0

[48]


Không bổ sung galactooligosaccharide. Huyền phù được chuẩn bị bằng cách lấy 10g

bột khô Spirulina hòa trong 190ml nước muối sinh lý. Huyền phù được tiêm vào vi khuẩn

lactic nuôi cấy 1 được chuẩn bị trước đó với một lượng khoảng 2 ×108 tế bào/g Spirulina.

pH được chỉnh về 7 bằng dung dịch NaOH 0,1M và nuôi cấy trong 24h ở 300C. Dịch thu

được được đưa vào mấy sấy phun nhỏ và phun khô đến nhiệt độ thành phẩm 550C thu

được bột Spirulina, bột này được gọi là bột Spirulina B.

Ví dụ so sánh 3 đến 5: Tương tự ví dụ 2, chỉ thay thế vi khuẩn lactic.

Ví dụ 3: Sử dụng vi khuẩn lactic nuôi cấy 2 Bột Spirulina C

Ví dụ 4: Sử dụng vi khuẩn lactic nuôi cấy 3 Bột Spirulina D

Ví dụ 5: Sử dụng vi khuẩn lactic nuôi cấy 4 Bột Spirulina E

So sánh thử nghiệm từ 2 đến 5:



Tổng tế bào vi khuẩn khác vi khuẩn lactic (được gọi là số tế bào sống) được xác định

trong bột Spirulina B đến E thu được trong các ví dụ so sánh 2 đến 5, mùi và vị cũng

được đánh giá bằng phương pháp cảm quan.

Kết quả được hiển thị trong bảng 1.11. Tương tự như phương pháp dùng đánh giá

mùi và vị trong các thử nghiệm 1 đến 10.

Bảng 1.11: Các mẫu so sánh không bổ sung đường được so sánh với mẫu chuẩn

Mẫu STT bột

Spirulina

STT vi khuẩn lactic

nuôi cấy

Đường Số lượng vi khuẩn

Vị Mùi

Mẫu so sánh 2 Mẫu so sánh 3 Mẫu so sánh 4 Mẫu so sánh 5

Mẫu chuẩn

B C D E A

1 2 3 4

Không

Không Không Không Không Không

2.0 × 102

3.0 × 102 8.0 × 103 1.0 × 103

4.0 × 104

+ 0.8 + 0.9 + 1.2 + 1.1 + 3.0

+ 0.6 + 0.9 + 1.2 + 1.2 + 3.0

[48]

Rõ ràng rằng từ các ví dụ so sánh và các ví dụ nghiên cứu 1 đến 10, việc bổ sung

đường để ức chế sự phát triển của tế bào sống và giảm bớt mùi vị đặc trưng.


Hàm lượng phycocyanin được xác định trong bột Spirulina F (ví dụ so sánh 6) thu

được bằng cách tiệt trùng bột ở nhiệt độ cao, bổ sung đường galactooligosaccharide và

nuôi cấy. So sánh với bột Spirulina 6 thu được trong ví dụ nghiên cứu 6 (sử dụng

Spirulina bột mà không tiệt trùng nhiệt độ cao) và bột Spirulina ban đầu không được tiệt

trùng nhiệt độ cao.

Bột Spirulina F được sản xuất như sau: 10g bột Spirulina trong 190ml nước muối

sinh lý và huyền phù được tiệt trùng trong 3s ở 1300C, sau đó huyền phù được lảm lạnh

nhanh chóng đến nhiệt độ phòng. Huyền phù này về sau được dùng để sản xuất bột

Spirulina bằng phương pháp như ví dụ nghiên cứu 6. Sản phẩm tạo thành được gọi là bột

Spirulina F.



Hàm lượng phycocyanin được phân tích theo phương pháp của Hiệp hội thực phẩm

dinh dưỡng và sức khỏe của Nhật Bản. Đó là, 0,5g bột Spirulina được bổ sung vào 25ml

đệm sodium phosphate (pH 6), tạo huyền phù và chiết xuất. Dịch chiết sau đó được ly tâm

và lọc qua giấy lọc, thu supernatant. Tiếp theo 2ml của supernatant được pha loãng với

nước thành 50ml và đo phổ ở bước sóng 560nm, 618nm và 650 nm. Hàm lượng

phycocyanin được xác định bằng công thức 1.2:

Phycocyanin (%) = [(0,198 × A618 – 0,0019 × A560 – 0,133 × A650) × D × 100]/W (1.2)

Trong đó: A560 là độ hấp thu ở 560nm, A618 là độ hấp thu ở 618nm, A650 là độ hấp

thu ở 650nm, D là mức độ pha loãng (trong trường hợp này, 25 x 25 = 625), và W là khối

lượng mẫu (mg).

Bảng1.12: So sánh hàm lượng phycocyanin giữa các mẫu

STT bột Spirulina

Hàm lượng phycocyanin (%)

Ví dụ so sánh 8 Ví dụ nghiên cứu 6

Đối chứng

F 6 A

0.8 7.8 9.0

[48]

Ví dụ so sánh này chứng tỏ bột Spirulina nuôi cấy từ tảo Spirulina đã được tiệt trùng

nhiệt độ cao có chứa hàm lượng phycocyanin nhỏ hơn nhiều bột Spirulina thu được theo

quy trình nghiên cứu.

Như vậy, với các thí nghiệm trên ta thấy việc đặt tảo trong môi trường nuôi cấy vi

khuẩn lactic có bổ sung đường có tác dụng giảm đáng kể lượng vi khuẩn tạp nhiễm và

mùi vị đặc trưng của tảo.



1.3.2. Nghiên cứu chiết suất các hợp chất chống oxy hóa từ S.platensis

1.3.2.1. Giới thiệu một vài hợp chất chống oxy hóa và các acid thiết yếu thu được từ

nghiên cứu

Flavonoids:

Flavonoid là nhóm hợp chất có nhiều tác dụng sinh học. Các dẫn chất flavonoid là

chất chống oxy hóa do có khả năng dập tắt các gốc tự do như OH, ROO (là các yếu tố gây

biến dị, hủy họa tế bào, ung thư, tăng nhanh sự lão hóa…). Đồng thời, flavonoid tạo phức

với các ion kim loại nên ngăn cản các phản ứng oxy hóa mà những ion đó là enzyme xúc

tác. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch,

tai biến, lão hóa, thoái hóa gan, tổn thương do bức xạ.

Flavonoid làm bền thành mạch, được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng

tĩnh mạch, trĩ, rối loạn tuần hoàn võng mạc… Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid như

quercetin, rutin, myciretin…có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim [64].

β-caroten:

β-caroten tự nhiên từ các loại trái cây, rau cải có tác dụng giảm nguy cơ của nhiều

bệnh ung thư. Đặc biệt β-caroten từ Spirulina có hàm lượng cao gấp 20 lần trong cà rốt.

Chỉ cần sử dụng 1g Spirulina/ ngày có thể giảm chứng bệnh về mắt đối với trẻ sắp tới tuổi

đến trường. 1g Spirulina/ngày giúp giảm nguy cơ ung thư vòm miệng của 44% đàn ông

có thói quen nhai trầu thuốc.

Ngoài ra, β-caroten còn có hàng loạt tác dụng có lợi cho sức khỏe. Lợi ích đáng kể

nhất là khả năng hoạt hóa một số loại tế bào miễn dịch của cơ thể, có khả năng làm tăng

dung tích phổi giúp hít thở sâu hơn, tác dụng giảm tổn thương DNA, bảo vệ da tránh tác

hại của ánh nắng mặt trời, hạ thấp nguy cơ mắc một số loại ung thư, góp phần giảm nồng

độ cholesterol máu cũng như nguy cơ một số bệnh tim mạch. β-caroten còn là nguồn cung

cấp vitamin A an toàn (vitamin A liều cao có thể gây ngộ độc) vì cơ thể chuyển β-caroten

thành vitamin A chậm hơn [60].

Vitamin A: (retinol, axerophthol...)

Vitamin A có nhiều chức năng quan trọng đối với cơ thể con người:



Mắt được cấu tạo bởi các sắc tố có chứa vitamin A. Vì vậy sự có mặt của vitamin A

là một phần không thể thiếu đối với việc đảm bảo thị giác của con người. Vitamin A kích

thích quá trình phát triển của các biểu mô như mô sừng, ruột và các con đường hô hấp. Nó

cũng ảnh hưởng đặc biệt đến da, kích thích sự liền sẹo và phòng ngừa các chứng bệnh của

da như trứng cá.

Vitamin A có vai trò quan trọng trong sự phát triển tế bào của con người, là yếu tố

không thể thiếu đối với sự phát triển của phôi thai và trẻ em. Vitamin A còn có vai trò đối

với sự phát triển của xương, thiếu vitamin A làm xương mềm và mảnh hơn bình thường.

Vitamin A kéo dài quá trình lão hóa do làm ngăn chặn sự phát triển của các gốc tự

do. Hoạt động kìm hãm của nó với các gốc tự do cũng dẫn đến ngăn chặn được một số

bệnh ung thư [58].

α-tocopherol:

Là hợp chất có hoạt tính vitamin E. Có tác dụng ngăn cản quá trình oxy hóa các

thành phần thiết yếu trong tế bào, ngăn cản tạo thành các sản phẩm oxy hóa độc hại, tăng

hấp thu vitamin A qua ruột, bảo vệ vitamin A khỏi bị thoái hóa do oxy hóa làm cho nồng

độ vitamin A trong tế bào tăng lên, chống lại tác dụng của chứng thừa vitamin A. Ngoài

ra còn có tác dụng kiềm hãm tốc độ lão hóa ở da [61].

Acid palmitic, acid linoleic, acid linolenic:

Acid palmitic là acid béo bão hòa, không có nối đôi, gồm 16 carbon.

Acid linoleic, acid linolenic đã được công nhận là acid béo thiết yếu. Acid linoleic

(LA) gồm 18 carbon, 2 nối đôi, thuộc nhóm ω-6 và acid linolenic 18 carbon, 3 nối đôi,

thuộc nhóm ω-3. Các acid béo này là tiền chất của các acid béo dòng ω-3 và ω-6 như acid

arachidonic gồm 20 carbon, 4 nối đôi, thuộc nhóm ω-6 và EPA gồm 20 carbon, 5 nối đôi,

thuộc nhóm ω-6; DHA gồm 22 carbon, 6 nối đôi, thuộc nhóm ω-3 và từ đó tạo ra một loạt

chất có hoạt tính sinh học cao như các loại protaglandines, leukotrienes, thromboxanes

[62].



1.3.2.2. Giới thiệu phương pháp chiết xuất tối ưu sử dụng trong nghiên cứu

Trong những năm gần đây, phương pháp chiết xuất CO2 siêu tới hạn đã nhận được

sự quan tâm ngày càng tăng như một cách thay thế quan trọng các phương pháp chiết xuất

dung môi truyền thống. CO2 là một dung môi lý tưởng để chiết xuất một vài loại hợp chất

tự nhiên sử dụng trong thực phẩm vì nó không độc hại, không nổ, luôn sẵn có và dễ dàng

loại bỏ sau khi chiết xuất. Do đó, chất lượng chiết xuất CO2 siêu tới hạn là cao hơn so với

chiết xuất lỏng-lỏng với dung môi hữu cơ hoặc bằng hơi nước chưng cất vì những phương

pháp này có thể gây ra sự biến chất do nhiệt hoặc để lại dung môi độc hại trong sản phẩm.

Khái niệm chiết suất siêu tới hạn:

Là quá trình phân tách một hay một số chất từ hỗn hợp (dược liệu, hỗn hợp nguyên

liệu) bằng cách sử dụng chất lỏng CO2 siêu tới hạn như một dung môi. Khi ở trạng thái

này CO2 có đặc tính về độ tan tương tự như một chất lỏng đồng thời có khả năng khuếch

tán và độ nhớt gần với chất khí, nhờ vậy chúng có khả năng khuếch tán và hòa tan nhanh

các hoạt chất trong nguyên liệu. Gore (1891) là người đầu tiên phát hiện ra khả năng hòa

tan tốt của Naphtalen và Camphor trong CO2 lỏng. Sau đó Andrews (1875) đã nghiên cứu

về đặc tính của CO2 ở trạng thái siêu tới hạn. Tuy nhiên, tới đầu những năm 1970 công

nghệ chiết xuất các hợp chất tự nhiên bằng dung môi CO2 siêu tới hạn (SC-CO2) mới thực

sự phát triển và đi vào ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm

như: loại cafein trong cà phê và chè xanh, chiết xuất dầu vừng đen, chiết polyphenol từ

chè xanh, loại bỏ cholesterol trong thực phẩm, loại alcol trong đồ uống, chiết xuất phẩm

màu, chiết xuất các hoạt chất chống oxy hóa, chiết xuất tinh dầu, hương liệu từ thực vật

sử dụng trong mỹ phẩm, thực phẩm…

Ưu điểm của SC-CO2 trong chiết xuất hoạt chất tự nhiên:

CO2 có điểm tới hạn thấp (nhiệt độ gần như ở nhiệt độ phòng, áp suất thấp) vì vậy

các hoạt chất ít bị oxy hoá hay phân huỷ bởi nhiệt độ và oxy hoà tan, ngoài ra vấn đề

thiết kế hệ thống chiết xuất đảm bảo đủ áp lực siêu tới hạn cũng dễ dàng hơn nên khả

năng ứng dụng cho quy mô sản xuất công nghiệp cũng thuận lợi.



Sản phẩm sau khi chiết không còn tồn dư dung môi vì CO2 dễ dàng chuyển sang

trạng thái khí và bay hơi toàn bộ sau khi giảm áp suất, nhiệt độ xuống dưới điểm tới hạn.

Vì vậy, chiết xuất theo phương pháp này rất phù hợp đối với các sản phẩm dùng làm thực

phẩm, thuốc, mỹ phẩm.

Khả năng chiết xuất chọn lọc do:

− Độ tan của SC-CO2 thay đổi khi áp suất và nhiệt độ đạt siêu tới hạn thay đổi vậy

nó sẽ hoà tan chọn lọc các chất khác nhau ở nhiệt độ, áp suất tương ứng. Thông thường

các tinh dầu dễ bay hơi có thể được chiết ở áp suất dưới 100bar, trong khi các chất béo

được chiết ở áp suất cao hơn.

− Dung môi SC-CO2 sẽ phân cực hơn khi được hoà trộn với các dung môi phụ trợ

phân cực như: methanol, ethanol vì vậy khả năng hoà tan các hợp chất sẽ đa dạng hơn.

Tuy nhiên, các dung môi phụ trợ có thể làm thay đổi điểm tới hạn của CO2 do đó trong

thực nghiệm cần phải khảo sát tỷ lệ dung môi phụ trợ thích hợp để ít ảnh hưởng đến điểm

tới hạn.

Thời gian chiết xuất ngắn: Do chất lỏng siêu giới hạn có hệ số khuếch tán cao hơn

chất lỏng, trong khi độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ nên khả năng khuếch tán của dung

môi vào trong tế bào nhanh hơn vì vậy thời gian chiết được rút ngắn hơn chất lỏng thông

thường.

Không thay đổi hoặc mất hương thơm, màu sắc tự nhiên ban đầu của hoạt chất.

Không tạo ra mùi ,vị lạ do SC-CO2 là chất trơ, không mùi vị và bay hơi hoàn toàn khi

thay đổi trạng thái siêu tới hạn.

CO2 không ăn mòn thiết bị, không gây cháy nổ trong quá trình vận hành, an toàn,

thân thiện với môi trường, giá thành rẻ, dễ kiếm, ngoài ra có thể tái sử dụng trong thời

gian dài [63].



1.3.2.3. Nghiên cứu mô hình tối ưu hóa quá trình chiết tách hợp chất chống oxy hóa

từ S.platensis bằng phương pháp CO2 siêu tới hạn: [56]

Tóm tắt:

Quá trình chiết tách CO2 siêu tới hạn của những chất chống oxy hóa từ Spirulina

platensis đã được tối ưu hóa bằng cách sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng RSM

(Response Surface Method). Khoảng 10,26g/kg dịch chiết từ Spirulina có thể thu được

dưới điều kiện tối ưu ở 480C, 20MPa trong khoảng 4h. Các hoạt chất chống oxy hóa được

xác định dưới điều kiện tối ưu, xác định bằng phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa

acid linoleic, kết quả thu được cho thấy khả năng hoạt động thấp hơn so với BHT và

Trolox nhưng cao hơn đáng kể so với α-tocopherol trong 300 phút và trở thành tương tự

α-tocopherol sau đó. Các thành phần của dịch chiết đã được phân tích rõ hơn và kết quả

cho thấy dịch chiết chứa 85,1g/kg flavonoids, 77,8g/kg β-caroten, 113,2g/kg vitamin A và

3,4g/kg α-tocopherol. Các acid béo chủ yếu chứa trong dịch chiết bao gồm acid palmitic

(35,32%), acid linolenic (21,66%), và acid linoleic (20,58%).

Giới thiệu:

Spirulina platensis là một loại thực phẩm sức khỏe có giá trị cao với hàm lượng cao

về protein, vitamin, khoáng chất, các acid béo chưa no, zeaxanthin, myxoxanthophyll, và

cũng đã được báo cáo về tiềm năng dược phẩm (Li, Guo, & Li, 2003; Morist, Montesinos,

Cusido, & Godia, 2001).

Việc thu hồi các thành phần hoạt tính từ Spirulina platensis đã đặt ra một vấn đề do

sự hiện diện của dung môi hữu cơ còn sót lại và sự mất ổn định của dịch chiết.

Chiết xuất CO2 siêu tới hạn (SC- CO2) là một lựa chọn hấp dẫn để chiết tách chất

lỏng thông thường do thân thiện với môi trường và không dư lượng dung môi có hại. Hơn

nữa, quá trình chiết tách SC- CO2 đã được thực hiện trong quá trình chiết xuất chất chống

oxy hóa từ lá hương thảo, cây xô thơm, và các loại thảo mộc. Chất hoạt động chống oxy

hóa được xử lý bởi SC- CO2 cao hơn đáng kể so với các phương pháp thông thường. Vì

vậy, quá trình chiết tách chất lỏng siêu tới hạn được xem là một quá trình rất có triển vọng

trong tương lai.



Trong bài báo này, phương pháp bề mặt đáp ứng RSM được thông qua để tối ưu hóa

điều kiện về nhiệt độ, áp suất, thời gian cho quá trình chiết tách SC- CO2 và để đạt được

phương trình hồi qui mong muốn. Trong đó, chất hoạt động chống oxy hóa của dịch chiết

dưới điều kiện tối ưu được xác định bằng cách ức chế quá trình peroxide hóa acid linoleic.

Hơn nữa, các thành phần của dịch chiết này đã được phân tích có thể góp phần rất lớn

vào hoạt động chống oxy hóa. Vì vậy, điều này dự kiến sẽ tìm được chất chống oxy hóa

tự nhiên với hoạt lực rất lớn từ Spirulina.

Nguyên liệu và phương pháp:

Nguyên liệu:

Spirulina platensis được cung cấp bởi Jiangsu Academic of Agricultural Sciences

(Nanjing, Trung Quốc). Butylated hydroxytoluene (BHT) từ khu công nghiệp hóa chất

Nanjing (Nanjing, Trung Quốc). Linoleic acid, 2,2’-azobis (2-amidinopropane)

hydrochloride (AAPH) thu được từ công ty TNHH Hóa chất công nghiệp Wako (Osaka,

Nhật Bản). Rutin, vitamin A, β-caroten, α-tocopherol, 6-hydroxyl-2,5,7,8-

tetramethylchroman-2-carboxylicacid (Trolox) được mua từ công ty hóa chất Sigma

(ST.Louis, MO, USA).

Tối ưu hóa qui trình:

Qui trình tách chiết được tối ưu hóa bởi Box-Behnken để thu được hiệu suất chất

chống oxy hóa từ Spirulina cao hơn. Các yếu tố và mức độ khảo sát trong nghiên cứu

được thể hiện trên bảng 1.13. Thiết kế thử nghiệm, phân tích dữ liệu, xây dựng mô hình

bậc 2 được tiến hành bằng cách sử dụng phần mềm Design Expert (Phiên bản 6.0.5, Stat-

Ease Inc., Minneapolis, MN, USA).



Bảng 1.13: Mức độ mã hóa thử nghiệm của các yếu tố dùng trong thiết kế Box-

Behnken

Yếu tố Kí hiệu Mức độ mã hóa -1 0 1

Nhiệt độ (0C) Áp suất (MPa) Thời gian (h)

A B C

32 20 2

40 30 3

48 40 4

[56]

Chiết suất chất chống oxy hóa:

Chiết xuất chất lỏng siêu tới hạn được thực hiện trên bình chiết chất lỏng siêu tới hạn

Hua’an (công ty TNHH Hua’an, Nantong, Trung Quốc) với dung tích bình chiết 1lít. Biểu

đồ dòng chảy của quá trình chiết chất lỏng siêu tới hạn được thể hiện ở Hình 1.4. Các bộ

phận chính của thiết bị bao gồm bình chiết ở áp suất cao và 2 bình tách. Tỷ lệ dòng chảy

của khí CO2, nhiệt độ và áp suất chiết tách được giám sát bởi các đồng hồ trên mặt trước,

thời gian tách chiết được thiết lập bằng cách hẹn giờ. CO2 được cung cấp từ một xylanh

khí. Trước khi nó được đưa vào bể chứa dịch chiết đã được đổ đầy mẫu bởi máy bơm,

CO2 được điều áp đến áp suất mong muốn và đun nóng đến nhiệt độ qui định để đạt được

trạng thái siêu tới hạn. Ethanol tuyệt đối hoạt động như một chất đồng dung môi được bổ

sung vào một bình phun hơi và hòa trộn với mẫu trong bình chiết bởi một máy bơm khác.

Hệ thống này được ổn định trong 2h dưới điều kiện trên trước khi bắt đầu thử nghiệm.

Dịch chiết chiết xuất dưới diều kiện tối ưu được thu nhận để phân tích hoạt tính chống

oxy hóa và thành phần.



Hình 1.4: Sơ đồ của quá trình chiết SC-CO2 [56]

1.Xylanh khí đốt; 2. Bộ phận lọc; 3. Bộ phận làm mát; 4. Máy nén; 5. Bộ phận tạo nhiệt

trước; 6. Máy chiết; 7,8. Bộ phận phân tách; 9. Lưu lượng kế; 10. Áp kế đo áp suất dòng

chảy; 11. Đồng hồ chỉ thị áp suất.

Xác định hoạt độ chất chống oxy hóa:

Hoạt độ chất chống oxy hóa trong dịch chiết từ S.platensis được xác định bởi hệ

thống acid linoleic (Huang, Mendis, & Kim, 2005; Takeshi, Mizuho, Reiji, Hachiro, &

Nobutaka, 2001). Mẫu gồm: 1ml của 5mg chất chiết hòa tan trong ethanol nguyên chất,

4ml dung dịch đệm Natri phosphate 0,05M (pH = 7). Mẫu đối chứng gồm: 1ml ethanol

nguyên chất và 2ml nước cất được trộn với 2ml acid linoleic 2,5%(v/v) trong ethanol.

Quá trình peroxide hóa được bắt đầu bằng cách bổ sung 0,4ml AAPH 0,1M và được thực

hiện ở 370C trong bóng tối. Các mức độ oxy hóa được đo bằng cách đọc mức hấp thu ở

bước sóng 500nm sau khi nhuộm màu với FeCl2 và ammonium thiocyanate (NH4SCN)

(Kikuzaki & Nakatani, 1993). BHT, α-tocopherol, Trolox được dùng như chất chuẩn để

so sánh.



Phân tích các thành phần của dịch chiết:

Xác định hàm lượng flavonoids:

Hàm lượng flavonoids trong dịch chiết từ S.platensis được đo bằng phương pháp tạo

phức màu với AlCl3 dựa trên sự hình thành phức hợp Al-flavonoids (Djeridane et al.,

2006). Dịch chiết được pha loãng với ethanol nguyên chất tới một nồng độ thích hợp. Sau

đó 1ml của mẫu sau pha loãng được trộn với 1ml của dung dịch methanolic 2% (w/v) của

AlCl3. Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút, đo độ hấp thu của hỗn hợp ở bước sóng

430nm bằng máy quang phổ. Rutin được sử dụng như một chất chuẩn.

Định lượng β-caroten, vitamin A và α-tocopherol:

β-caroten trong dịch chiết được kiểm soát bằng hệ thống HPLC (Công ty Shimadzu,

Kyoto, Nhật Bản). Được trang bị với DGU-14 A Degasser, LC-10AT quaternary pump,

và SPD-10AV UV–Visible phát hiện ở 450 nm. Quá trình phân tách được thực hiện trên

cột Zorbax SB-C18, 150mm × 4,6mm, kích thước hạt 5μm (Agilent Technologies,

Wilmington, DE, USA) (Zhang & Omaye, 2001). Pha động bao gồm

acetonitrile/methylene chloride với tỷ lệ 7:3 (v/v), tốc độ chảy 1ml/phút.

Vitamin A và α-tocopherol trong dịch chiết đồng thời cũng được xác định bằng hệ

thống phân tích HPLC (Zhang & Omaye, 2001). Pha động sử dụng dung môi methanol,

tốc độ 1ml/phút. Vitamin A và α-tocopherol được phát hiện ở bước sóng tương ứng 325

và 292 nm.

Phân tích mẫu acid béo:

Mẫu acid béo trong dịch chiết được phân tích bằng phương pháp GC–MS

(Hartvigsen, Hansen, Lund, Bukhave, & Hølmer, 2000). Đầu tiên, mẫu được tạo FAME

(Fat Acid Methyl Esters) với MeOH, xúc tác acid sunfuric đậm đặc. Tiếp đó, mẫu được

tiêm vào hệ thống GC ở 2500C. Nhiệt độ lò được cài đặt ở 1800C trong 1 phút sau đó tăng

lên 2300C với 100C/1 phút. Nhiệt độ cuối cùng được duy trì trong 3 phút. Sau đó, các

thành phần được xác định bằng cách phân tích phổ khối lượng. Việc phân tích các thành

phần được so sánh với tiêu chuẩn của viện Quốc Gia Mỹ và thư viện công nghệ (NIST).



Kết quả và thảo luận:

Tối ưu hóa qui trình:

Box-Behnken đã thiết kế ma trận của các yếu tố được đưa ra trong bảng 1.14 cùng

với các thí nghiệm và dự đoán giá trị hiệu suất của dịch chiết từ S.platensis. Bằng cách áp

dụng nhiều phương pháp phân tích hồi quy, phương trình hồi quy có thể thu được và đưa

ra như phương trình 1.3.

Y = 7.02900 – 0.26063A – 0.011275B – 1.14775C + 0.0032266A2 + 0.00059000B2

+ 0.13400C2 – 0.00065625AB + 0.011563AC – 0.0010000BC (1.3)

Trong đó Y là sản lượng dự đoán của dịch chiết từ S.platensis.

Bảng 1.14: Ma trận thiết kế bởi Box-Behnken cùng với thí nghiệm và dự đoán giá trị

hiệu suất của dịch chiết.

STT Nhiệt độ (0C)

Ápsuất (MPa)

Thời gian (h)

Sản lượng (g/kg) Thực nghiệm Dự đoán

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

-1 1 -1 1 -1 1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

-1 -1 1 1 0 0 0 0 -1 1 -1 1 0 0 0 0 0

0 0 0 0 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 0 0 0 0 0

4.00 6.68 4.28 4.89 4.23 4.66 4.90 9.09 4.26 3.23 5.48 3.97 2.33 2.06 1.98 2.50 2.69

3.96 6.98 3.99 4.93 4.79 4.89 4.67 8.53 3.74 2.97 5.74 4.49 2.31 2.31 2.31 2.31 2.31

[56]



Bằng việc giải quyết các ma trận nghịch đảo với phần mềm Design Expert, mức độ

tối ưu của các yếu tố thử nghiệm là 480C, 20MPa, và hơn 4h, dưới những điều kiện này

dự đoán sản lượng tối đa của dịch chiết từ S.platensis là khoảng 10,26g/kg. Tính phù hợp

của mô hình được kiểm chứng bằng thực nghiệm. Các thí nghiệm xác minh đã được thực

hiện dưới sự kết hợp khác nhau của các tham số trong qui trình được tạo ra bởi phần mềm

Design Expert. Các hệ số tương quan (R) giữa thực nghiệm và dự đoán giá trị là 0,9882,

điều này cho thấy rằng giá trị thử nghiệm và giá trị dự đoán là tương thích và cũng cho

thấy rằng mô hình là thỏa đáng và chính xác.

Hoạt độ chất chống oxy hóa của dịch chiết:

Hoạt độ chất chống oxy hóa của dịch chiết từ S. platensis được khảo nghiệm bằng

phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa của acid linolenic và kết quả được thể hiện

trong hình 1.5. Khả năng hấp thụ cao là thể hiện mức độ cao của quá trình peroxide hóa

acid linoleic và hoạt động chống oxy hóa thấp của các chất chống oxy hóa. Hoạt động của

chất chiết từ S.platensis được so sánh là thấp hơn so với BHT và Trolox nhưng cao hơn

đáng kể so với α-tocopherol trong 300 phút và trở thành tương tự sau đó. Hoạt động

chống oxy hóa của chất chiết xuất từ S.platensis và chất chống oxy hóa chuẩn giảm theo

thứ tự: Trolox > BHT > chất chiết > α-tocopherol.

Tuy nhiên, phân tích thống kê chỉ ra không có sự khác biệt đáng kể giữa Trolox và

BHT. Và mô hình này được xem như là tương tự với BHT > Trolox > α-tocopherol được

báo cáo bởi Dubuisson, Gulcin và Hu (Dubuisson et al., 2001; Gulcin, Mshvildadze,

Gepdiremen, & Elias, 2006; Hu, Xu, Chen, & Yang, 2004).



Hình 1.5: Hoạt chất chống oxy hóa được đánh giá bằng phương pháp ức chế quá

trình peroxide hóa của acid linoleic [56]

Các thành phần của dịch chiết:

Acid béo được phân tích bằng GC-MS, acid palmitic (35,32%), acid linolenic

(21,66%), và acid linoleic (20,58%) là những thành phần chính hiện diện (Bảng 1.15).

Hơn nữa, các thành phần mà có thể đóng góp to lớn cho hoạt động chống oxy hóa

cũng được thăm dò phân tích, kết quả là 85,1g/kg flavonoids, 77,8 g/kg β-caroten,

113,2g/kg vitamin A, 3,4g/kg α-tocopherol chứa trong dịch chiết từ S.platensis. Bảng

1.16.



Bảng 1.15: Thành phần và hàm lượng tương đối của acid béo trong dịch chiết từ

S. platensis

Thời gian giữ lại của GC-MS (min)

Thành phần Công thức phân tử

Hàm lượng tương đối (%)

4.13 4.97 6.75 6.87 7.06 7.15 9.05 9.84 10.21 10.32 10.65 10.99 11.50 12.39 12.86 16.88

2,6-Diisopropylphenol Pentadecanoic acid

Palmitic acid -

Zoomaric acid Zoomaric acid

- Stearic acid Oleic acid Oleic acid

Linoleic acid Linoleic acid

Linolenic acid Linoleic acid

- -

C12H18O C15H30O2

C16H30O2

- C16H30O2

C16H30O2

- C18H36O2

C18H34O2

C18H34O2

C18H32O2

C18H32O2

C18H30O2

C18H32O2

- -

1.71 1.16

35.52 1.57 1.74 5.96 0.83 2.02 2.81 2.70 1.28

18.40 21.66 0.90 0.69 1.06

' - ' Thành phần chưa được nghiên cứu trong thư viện NIST [56]

Bảng 1.16: Những thành phần có thể đóng góp trong chất hoạt động chống oxy hóa từ

S.platensis

Thành phần Hàm lượng (g/kg) Flavonoids β-caroten Vitamin A

α-Tocopherol

85.1 ± 7.3 77.8 ± 6.8

113.2 ± 2.7 3.4 ± 0.3

[56]



Kết luận:

Dịch chiết từ Spirulina platensis đã được nghiên cứu chứa nhiều thành phần hoạt

động có ích cho sức khỏe, ngăn ngừa hoặc ức chế ung thư, thúc đẩy miễn dịch... Vì vậy,

việc nghiên cứu chiết tách và tối ưu hóa quy trình chiết tách để nâng cao hiệu suất đang

được nhiều nhà khoa học quan tâm. Ngoài các chất chống oxy hóa và acid thiết yếu chứa

trong tảo, một số nghiên cứu khác cũng đã tìm thấy hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết,

chúng đã được thử nghiệm và nhận thấy có thể chống lại bốn loài vi khuẩn khác nhau: vi

khuẩn gram dương (Staphylococcus aureus), vi khuẩn gram âm (E.coli), nấm men

(Candida albicans) và nấm mốc (Aspergillus niger) [47]. Nhờ vậy, dịch chiết từ tảo

Spirulina ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm.

1.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của sinh khối Spirulina platensis lên hệ vi khuẩn của

sữa lên men ABT trong suốt thời gian bảo quản: [55]

Tóm tắt:

Mục tiêu của nghiên cứu này là nghiên cứu tác động của sinh khối vi khuẩn lam

(S.platensis) lên sản phẩm sữa lên men probiotic trong thời gian lưu trữ ở hai nhiệt độ

khác nhau.

Sữa lên men ABT bổ sung Spirulina được sản xuất bằng cách sử dụng quá trình lên

men nhanh chóng với mồi (ABT) là hệ vi khuẩn Lactobacillus acidophilus (A),

Bifidobacteria (B), và Streptococcus thermophilus (T). Nuôi cấy trong 6h ở 400C.

Đối với các sản phẩm bổ sung vi tảo lam, sinh khối S.platensis được thêm vào sữa

và khuấy trộn đều ở pH 4,5 – 4,6. Sau đó sữa lên men ABT được làm lạnh đến 250C rồi

đổ đầy vào các ống ly tâm đậy kín nắp đã được vô trùng, tiếp tục được làm lạnh ở 40C

trong 24h, sau đó được lưu trữ ở 150C trong 18 ngày hoặc 40C trong 42 ngày. Phân tích vi

sinh và đo độ chua được thực hiện định kì.

Sinh khối tảo S.platensis tác động có lợi đến sự tồn tại của vi khuẩn mồi ABT bất kể

nhiệt độ lưu trữ. Sự acid hóa xảy ra ở 150C, trong khi đó độ pH vẫn giữ ổn định trong suốt

quá trình lưu trữ ở 40C. Sự phong phú của các chất có hoạt tính trong S.platensis có tầm



quan trọng rất lớn về giá trị dinh dưỡng, do đó các sinh khối của vi tảo cung cấp một cơ

hội mới trong sản xuất các sản phẩm sữa chức năng.

Giới thiệu:

Bifidobacteria và một số loài Lactobacillus gần đây đã nhận được sự chú ý như

những vi khuẩn probiotic, duy trì sự cân bằng lành mạnh giữa hệ vi sinh vật có lợi và có

hại trong đường tiêu hóa. Chúng liên kết và tác động tích cực đến sức khỏe, do đó, đã

được kết hợp vào một loạt các sản phẩm sữa.

Thuộc tính probiotic của Bifidobacterium spp. và Lactobacillus acidophilus bao gồm

ngăn ngừa và giảm bớt tiêu chảy (Alm, 1997), tránh sự lây nhiễm rota virus ở trẻ sơ sinh

(Saavedra et al., 1994), phòng chống táo bón ở người cao tuổi (Alm, 1991), cải thiện sự

dung nạp lactose (Lin et al, 1991), giảm mức cholesterol trong máu (Agerbaek et

al.,1995), kích thích hệ thống miễn dịch (Schiffirin et al.,1995) và cải thiện trong việc bảo

vệ chống lại ung thư (Krishnakumar và Gordon, 2001).

Các nhà khoa học tin tưởng rằng người tiêu dùng sẽ không cần phải tiêu thụ nhiều

thuốc, vitamin nhân tạo, khoáng bổ sung nếu quá trình lên men sữa được làm giàu với các

vitamin, protein, acid béo thiết yếu và nguyên tố vi lượng có nguồn gốc tự nhiên. Một

cách đơn giản để đạt được điều này là sử dụng vi khuẩn lam trong sản xuất các sản phẩm

sữa (Varge Szigeti, 1998).

Vi khuẩn lam thuộc tảo prokaryote, có sự liên quan chặt chẽ đến vi khuẩn hơn các

loại tảo eurkaryote. S.platensis là một vi tảo phù du hình thành các quần thể lớn trong các

bể nước. Sinh khối khô của S.platensis có độ ẩm từ 3-7%, 55-60% protein, 6-8% lipid,

12-20% carbohydrate, 7-10% chất tro, 8-10% chất xơ, 1-1,5% chất diệp lục a và nhiều

loại vitamin. S.platensis đặc biệt giàu protein. Protein có tiềm năng kinh tế cao nhất là

biliprotein (ví dụ c-phycocyanin, allophycocyanin), là sắc tố xanh khi hòa tan trong nước.

Protein có chứa hàm lượng phycocyanin lên đến 20%. Thành phần acid béo chịu ảnh

hưởng chủ yếu của điều kiện môi trường. S.platensis được đặc trưng bởi 45-50% acid béo



bão hòa và 50-55% acid béo chưa bão hòa, chứa đến 30% của acid béo là acid γ-linolenic,

một acid béo chưa no rất tốt và được xem là có thuộc tính của thuốc.

Từ những năm 1970, S.platensis đã được bán trên thị trường và tiêu thụ như là một

nguồn thực phẩm an toàn cho con người và đã được chấp nhận là nguồn dinh dưỡng cho

con người bởi chính phủ, cơ quan y tế và hiệp hội 80 nước gồm cả Mỹ và Hungary. Dựa

trên các tiêu chí nghiên cứu về an toàn và chất lượng, hơn 70% thị trường hiện nay,

Spirulina là dành cho con người, chủ yếu là thực phẩm sức khỏe. Tổng số sản phẩm sản

xuất hàng năm của sản phẩm bổ sung sinh khối Spirulina được ước tính khoảng 1000-

1500 tấn (Belay, 1997).

Nhiều tổ chức trên thế giới đang nghiên cứu để đảm bảo một sản phẩm probiotic có

thể cung cấp số lượng đủ lớn vi khuẩn có ích nhằm đảm bảo lợi ích cho khách hàng.

Nồng độ ít nhất tại thời điểm tiêu thụ 106-107 CFU/g. Quy định thực phẩm ở Hungary quy

định rằng sữa lên men probiotic phải có và cho đến hết hạn sử dụng, số lượng vi khuẩn có

ích phải trong khoảng 107CFU/g sản phẩm.

Mục đích của nghiên cứu này là để điều tra tác động của sinh khối vi khuẩn lam lên

đặc tính của hệ vi khuẩn và vi sinh vật gây hư hỏng sữa lên men ABT trong suốt thời gian

lưu trữ ở 150C và 40C.

Nguyên liệu và phương pháp:

Nguyên liệu:

Sữa tiệt trùng thương mại (4lít), mỗi lít chứa 36g chất béo, 34g protein, 47g lactose

và 7g chất tro, trong đó bổ sung thêm 10g bột sữa đã tách béo. Nguyên liệu thô này được

đo lường sang 2 lọ (2lít), được đun nóng đến 900C và để trong 10 phút trước khi làm lạnh

về nhiệt độ cấy mầm nhằm đảm bảo đủ để biến tính protein trong dịch sữa (Kessler,

1988).



Nuôi cấy vi khuẩn mồi:

ABT được nuôi cấy trong bể đông khô DVS được thiết lập bởi học viện nghiên cứu

ngành sữa của Hungary. Nó dùng để cấy mầm trực tiếp trong chế biến sữa vì nuôi cấy

DVS không cần phải hoạt hóa hoặc xử lý trước khi sử dụng.

Sinh khối S.platensis:

Sinh khối S.platensis được thu từ viện chế biến ngũ cốc (Bergholz-Rehbrucke, Đức).

Mỗi kg chứa 576g protein, 111g lipid tổng, 114g chất tro. Nghiên cứu trước đây, 3g/l sinh

khối vi khuẩn lam được bổ sung là tốt nhất về thuộc tính cảm quan và chi phí.

Sản xuất và lưu trữ của sữa lên men ABT:

ABT sau nuôi cấy được bổ sung vào sữa đã xử lý nhiệt được làm lạnh xuống 420C

với tỉ lệ 0,2 U/L, tương ứng với 2% (v/v). Nuôi cấy trong 6h ở 400C. Trong trường hợp

sản phẩm chứa vi khuẩn lam, sinh khối S.platensis được thêm vào sữa (2lít) và khuấy trộn

liên tục ở pH 4,5 – 4,6. Sau đó, hỗn hợp sữa lên men ABT đã được bổ sung Spirulina

được làm lạnh xuống 250C trong nước đá rồi đổ đầy vào 40 ống ly tâm (50ml) đậy kín

nắp đã được vô trùng. Do đó, có tất cả 80 đơn vị sản phẩm. Sau 24h làm lạnh ở 40C, một

nửa số mẫu được đặt vào nơi làm mát và sưởi ấm ở 150C, một nửa khác lưu trữ trong điều

kiện lạnh ở 40C. Quy trình thử nghiệm được lặp lại 3 lần.

Phân tích vi sinh:

Ba mẫu chứa vi khuẩn lam và 3 mẫu thông thường được thực hiện tại mỗi thời điểm

lấy mẫu, tức là, sau 0, 3, 6, 9, 12, 15 và 18 ngày lưu trữ ở 150C và sau 0, 7, 14, 21, 28, 35,

42 ngày lưu trữ ở 40C. Mẫu được vô trùng loại bỏ khỏi ống ly tâm, pha loãng mẫu bằng

cách trộn 10ml mẫu với 90ml dung dịch peptone 0,1%. Mẫu có thể pha loãng thêm nếu

cần thiết. Phương pháp đổ đĩa được sử dụng đếm vi sinh vật, ngoại trừ coliforms và

E.coli, phương pháp định lượng MPN được sử dụng để xác định hai loại này.



Streptococcus thermophilus:

Thạch M17 được dùng để đếm S.thermophilus. Độ pH môi trường là 6,9 ± 0,1. Các

đĩa cấy được ủ ở 370C trong 48h ở điều kiện hiếu khí. S.thermophilus hình thành các

khuẩn lạc với đường kính 1-2mm, các đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU), được thể hiện

dưới dạng log CFU/ml để báo cáo sự tồn tại của Streptococcus.

Lactobacillus acidophilus:

Môi trường thạch MRS-maltose với pH 6,2 ± 0,1 được sử dụng để đếm

Lactobacillus acidophilus. Các đĩa được ủ ở 370C trong 72h. Bình nuôi cấy kị khí 2,5 lít

được sử dụng để tạo điều kiện kị khí, oxy khí quyển được hấp thụ bởi các túi AnaeroGen

AN 25. Tổng số được thể hiện dưới dạng log CFU/ml. Lactobacilli được xác định trên các

loại khuẩn lạc cơ sở đã được xác nhận bằng kính hiển vi. Lactobacillus acidophilus là vi

khuẩn gram dương, dạng que với đuôi tròn.

Bifidobacterium spp:

Acid nalidixic (0,030g), neomycin sulfate (0.200g), lithium chloride (0,600g),

paromomycin sulfate (0,250g). Tất cả được thu từ Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO),

được tạo huyền phù trong nước cất (100ml), sau đó được vô trùng bằng cách lọc qua thiết

bị lọc Milipore (Millipore Corporation, Bedford, MA) với đường kính lỗ 0,22µm. Độ pH

của dung dịch được điều chỉnh đến 7,3 ± 0,1 bằng NaOH 0,1M trước khi khử trùng. 5ml

của dịch kháng sinh này được bổ sung vào 100ml MRS- agar (pH 6,2 ± 0,1) trước khi sử

dụng. Các môi trường nuôi cấy như vậy được sử dụng để đếm Bifidobacteria. Các đĩa

được ủ ở 370C trong 5 ngày. Điều kiện kị khí được tạo ra bằng cách dùng bình nuôi cấy kị

khí với các túi AnaeroGen AN 25. Tổng số được thể hiện dưới dạng log CFU/ml. Các

khuẩn lạc Bifidobacteria được nhận dạng với hình dạng bất thường dạng chữ V, Y hoặc

hình hột đậu và được chứng thực bằng cách quan sát dưới kính hiển vi.



Nấm men và nấm mốc:

YGC agar (Merck KGaA,DarmStadt, Đức), được sử dụng để đếm nấm men và nấm

mốc. pH của môi trường 6,6 ± 0,1. Các đĩa nuôi cấy được ủ hiểu khí ở 250C trong 5 ngày.

Coliforms và E.coli:

Phương pháp MPM được dùng để xác định coliforms và E.coli. Môi trường Brilliant

Green Bile 2% được bổ sung với tryptophane và 4-methylumbelliferyl-beta-D-

glucuronide được phân phối vào ống nghiệm của Durham. pH của dịch 7,2 ± 0,1. Các ống

thử nghiệm được ủ ở 370C trong 24-48h dưới điều kiện hiếu khí. Trong thử nghiệm này,

sự hiện diện của coliforms được phát hiện bởi sự hình thành bong bóng khí trong các ống

Durman. Các ống dương tính với coliforms được kiểm tra dưới ánh sáng UV (366nm).

Thuốc thử Kovacs indole được bổ sung vào ống nghiệm để phát huỳnh quang dưới ánh

sáng UV và sự hiện diện của E.coli được xác nhận bởi sự xuất hiện các vòng tròn đỏ sau 1

đến 2 phút. Các mẫu nuôi cấy thử nghiệm được so sánh với mẫu đối chứng.

Đo độ acid:

Giá trị pH được đo ở nhiệt độ phòng với dụng cụ đo pH HI 8521 và kết hợp với các

điện cực (Hanna Instruments Deutschland GmbH, Karlsruhe, Đức) đã được chuẩn hóa với

dung dịch đệm pH chuẩn 4 và 7.

Chuẩn độ độ chua:

Mẫu 20ml được chuẩn độ với NaOH 0,1N, dùng phenolphtalein là chất chỉ thị, độ

chua thể hiện dưới dạng độ Soxhlet-Henkel (0SH). Kết quả được thể hiện dưới dạng %

của acid lactic.

Phân tích thống kê:

Tác động của sinh khối S.platensis trên hệ vi khuẩn đặc trưng, pH và độ chua của

sữa lên men ABT trong thời gian lưu trữ được phân tích bởi phần mềm STATISTICA 4.5.

Kết quả của sự khác biệt đã được thành lập ở P < 0,05 trong mọi trường hợp.



Kết quả và thảo luận:

Lưu trữ ở 150C:

Sự tồn tại của hệ vi khuẩn đặc trưng trong mẫu sữa lên men ABT lưu trữ ở 150C

được minh họa trong bảng 1.17 và 1.18.

Streptococcus thermophilus là thành phần có số lượng nhiều nhất, tổng giá trị của nó

vượt quá 109 CFU/ml vào đầu thời gian lưu trữ. Phát hiện này là phù hợp với đặc tính

được đưa ra bởi nhà sản xuất cho nuôi cấy mồi ABT. Mẫu 0 ngày, tổng số S.

thermophilus trong sữa lên men ABT bổ sung sinh khối S.platensis cao hơn so với mẫu

thông thường, điều đó chứng tỏ tác dụng kích thích của sinh khối vi khuẩn lam lên sự

phát triển vi khuẩn mồi hình cầu (Varga et al, 1999). Sau 3 ngày nhận thấy có sự tăng lên

trong tổng số S. thermophilus trong cả sản phẩm thông thường và sản phẩm bổ sung

Spirulina nhưng càng về sau quan sát thấy có xu hướng giảm xuống. Tuy nhiên, tổng

Streptococci được tìm thấy trong phạm vi 109 CFU/ml sau 18 ngày bảo quản ở 150C. Sự

khác biệt giữa Streptococci trong mẫu chứa vi khuẩn lam và mẫu thông thường là có sự

tăng lên của Streptococci trong mẫu chứa vi khuẩn lam suốt thời gian lưu trữ.

Tỉ lệ phần trăm khả năng tồn tại của L. acidophilus trong suốt thời gian bảo quản ở

150C cũng tương tự như S. thermophilus. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng tổng số

L. acidophilus ban đầu thấp hơn của Streptococcus. Sau khi tăng nhẹ tổng số tế bào tồn tại

trong suốt 3 ngày lưu trữ đầu tiên, tiếp tục quan sát thấy có sự giảm dần.

Medina và Jordano (1995) thấy rằng mật độ sinh vật tồn tại trong sữa chua probiotic

ban đầu tăng lên trong quá trình sản xuất, đạt tối đa và rồi giảm xuống trong sản phẩm

trong suốt thời gian lưu trữ lạnh. Qui định thực phẩm ở Hungari yêu cầu các sản phẩm

sữa lên men có chứa vi khuẩn lactic có nồng độ ban đầu ít nhất là 107 CFU/g.



Bảng 1.17: Số lượng tồn tại (log CFU/ml) của Streptococcus thermophilus,

Lactobacillus acidophilus, và Bifidobacterium spp. trong sữa lên men bổ sung

Spirulina và lên men thông thường trong thời gian bảo quản ở 15°C.

Thời gian lưu trữ (ngày)

S. thermophilus L. acidophilus Bifidobacterium spp. Bổ sung Spirulina

Bình thường

Bổ sung Spirulina

Bình thường

Bổ sung Spirulina

Bình thường

0 3 6 9

12 15 18

9.17±0.10 9.45±0.15 9.35±0.12 9.30±0.13 9.28±0.11 9.23±0.13 9.27±0.08

9.03±0.06 9.26±0.18 9.15±0.11 9.02±0.03 9.06±0.14 9.05±0.11 8.99±0.15

7.38±0.07 7.49±0.07 7.35±0.08 7.34±0.12 7.39±0.19 7.32±0.11 7.30±0.06

7.11±0.08 7.27±0.17 7.20±0.14 7.19±0.15 7.18±0.13 7.15±0.13 7.09±0.16

6.36±0.08 5.95±0.12 5.65±0.09 5.41±0.12 5.37±0.04 5.31±0.08 5.33±0.14

6.19±0.09 5.64±0.15 5.36±0.14 5.17±0.03 5.22±0.07 5.15±0.03 5.13±0.08

[55]

Bảng 1.18: Tỷ lệ % tồn tại của Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus,

và Bifidobacterium spp. trong sữa lên men bổ sung Spirulina và lên men thông thường

trong thời gian bảo quản ở 15°C.



Bình thường

Bổ sung Spirulina

Bình thường

Bổ sung Spirulina

Bình thường

0 3 6 9

12 15 18

100.00 190.55 151.36 134.90 128.82 114.82 125.89

100.00 169.82 131.83 97.72

107.15 104.71 91.20

100.00 128.82 93.33 91.20 102.33 87.10 83.18

100.00 144.54 123.03 120.23 117.49 109.65 95.50

100.00 38.90 19.50 11.22 10.23 8.91 9.33

100.00 28.18 14.79 9.55

10.72 9.12 8.71

[55]



Theo những báo cáo trước đây (Chr.Hansen A/S, 1995; Medina and Jordano, 1995).

Ban đầu tổng số Bifidobacterium spp. dao động trong khoảng 1×106 đến 5×106 CFU/ml.

Giảm số lượng tồn tại của Bifidobacteria là rõ rệt hơn so với hai vi khuẩn lactic kia. Chỉ

có 10% được giữ lại sau 9 ngày bảo quản, sau đó không có sự giảm thêm đáng kể mật độ

Bifidobacteria trong 9 ngày tiếp theo.

Mẫu chứa vi khuẩn lam có tổng số Bifidobacteria cao hơn so với mẫu thông thường

ở cuối thời gian bảo quản. Sự tồn tại của Bifidobacteria trong các sản phẩm sữa lên men

là một điều đáng quan tâm. Sự tồn tại của Bifidobacterium spp. ở điều kiện pH thấp (3,7 –

4,3) được nghiên cứu bởi Lankaputhra et al.(1996). Hơn 50% các chủng được kiểm tra

mất khả năng tồn tại sau 6 ngày lưu trữ ở pH 4,3, tuy nhiên một số chủng sống tốt sau 6

tuần lưu trữ ỡ tất cả giá trị pH nghiên cứu. Sự tồn tại ban đầu cao của Bifidobacteria (>108

CFU/g) có tác dụng bảo vệ chống lại những acid gây hại đến vi sinh vật.

Sữa lên men được đặc trưng bởi mức độ oxy thấp, độ chua cao, và sản xuất ra các

hợp chất kháng sinh nhờ vi khuẩn mồi. Vì vậy, một số vi sinh vật gây bệnh hay gây hư

hỏng không thể tồn tại trong sản phẩm này (Northolt, 1983). Không có sự tăng trưởng của

nấm men, nấm mốc, vi khuẩn coliform hay E.coli trong sữa lên men ABT bổ sung

Spirulina hoặc trong sữa thông thường trong suốt thời gian lưu trữ, mặc dù các sản phẩm

được sản xuất dưới điều kiện phòng thí nghiệm và mẫu được lưu trữ tại một nhiệt độ

tương đối cao.

Độ pH của sản phẩm lên men có thể giảm đáng kể trong suốt thời gian lưu trữ, có

thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sự sống còn của L. acidophilus và Bifidobacterium

spp., sự tăng trưởng của Bifidobacteria chậm đáng kể ở pH dưới 5,0, đây là điều cần chú ý

đối với tổng số Bifidobacteria so với 2 vi khuẩn mồi kia.

Bảng 1.19 thể hiện sự thay đổi pH và độ chua của sản phẩm sữa lên men ABT trong

thời gian lưu trữ ở 150C.



Bảng 1.19: pH và độ chua của sản phẩm sữa lên men bổ sung Spirulina và lên men

thông thường trong thời gian lưu trữ ở 150C.


pH Độ chua Bổ sung Spirulina

Bình thường Bổ sung Spirulina

Bình thường

0 3 6 9

12 15 18

4.33 ± 0.01 4.20 ± 0.01 4.13 ± 0.01 4.07 ± 0.02 4.06 ± 0.01 4.05 ± 0.01 4.04 ± 0.01

4.28 ± 0.01 4.18 ± 0.01 4.11 ± 0.01 4.10 ± 0.01 4.08 ± 0.01 4.07 ± 0.01 4.06 ± 0.01

0.98 ± 0.02 1.22 ± 0.01 1.26 ± 0.01 1.28 ± 0.01 1.30 ± 0.01 1.31 ± 0.01 1.31 ± 0.02

0.96 ± 0.01 1.17 ± 0.01 1.23 ± 0.01 1.25 ± 0.01 1.26 ± 0.01 1.26 ± 0.01 1.27 ± 0.01

[55]

Độ pH của mẫu vi khuẩn lam cao hơn so với mẫu thông thường vào lúc bắt đầu lưu

trữ. Thực tế sinh khối S.platensis có tính kiềm và nó chỉ bổ sung vào sữa trong giai đoạn

đầu và khuấy trộn liên tục ở pH 4,5 – 4,6. Tuy nhiên, sự acid hóa xảy ra vì nhiệt độ lưu

trữ cao và vì sinh khối vi khuẩn lam có tác động kích thích sự sản sinh acid. Khoảng 0,3%

acid lactic và acid acetic được hình thành trong 18 ngày lưu trữ ở 150C và hàm lượng

trong mẫu bổ sung Spirulina nhiều hơn so với mẫu thông thường. Do đó, độ pH của sản

phẩm lên men có bổ sung Spirulina thấp hơn sữa lên men thông thường vào cuối thời gian

lưu trữ.

Lưu trữ ở 40C:

Bảng 1.20 và 1.21 minh họa cho sự tồn tại của hệ vi sinh vật đặc trưng trong sữa lên

men ABT trong suốt thời gian lưu trữ ở 40C. Hầu như không có hiện tượng giảm số lượng

tồn tại của S. thermophilus trong 4 tuần đầu tiên khi lưu trữ ở 40C, nhưng sau đó quan sát

thấy sự sụt giảm đáng kể của S. thermophilus, mẫu vi khuẩn lam bị tác động ít hơn so với

mẫu thông thường. Sản phẩm bổ sung Spirulina có tổng số S. thermophilus cao hơn so

với sữa lên men thông thường sau 6 tuần bảo quản lạnh.



Bảng 1.20: Số lượng tồn tại (logCFU/ml) của Streptococcus thermophilus,

Lactobacillus acidophilus, và Bifidobacterium spp. trong sữa lên men bổ sung

Spirulina và lên men thông thường trong thời gian bảo quản ở 4°C.



Bình thường

Bổ sung Spirulina

Bình thường

Bổ sung Spirulina

Bình thường

0 7

14 21 28 35 42

9.17±0.10 9.28±0.06 9.21±0.12 9.21±0.12 9.11±0.07 9.05±0.18 8.86±0.16

9.03±0.06 9.12±0.16 9.13±0.08 9.11±0.03 9.01±0.06 8.85±0.14 8.64±0.18

7.38±0.07 7.48±0.08 7.42±0.10 7.40±0.11 7.38±0.15 7.35±0.07 7.31±0.13

7.11±0.08 7.25±0.11 7.28±0.11 7.25±0.13 7.20±0.09 7.01±0.14 7.00±0.17

6.36±0.08 6.42±0.06 6.34±0.03 5.88±0.05 5.91±0.09 5.23±0.09 4.86±0.05

6.19±0.09 6.30±0.06 6.17±0.08 5.82±0.06 5.73±0.10 5.07±0.03 4.69±0.08

[55]

Bảng 1.21: Tỷ lệ % tồn tại của Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus,

và Bifidobacterium spp. trong sữa lên men bổ sung Spirulina và lên men thông thường

trong thời gian bảo quản ở 4°C.



Bình thường

Bổ sung Spirulina

Bình thường

Bổ sung Spirulina

Bình thường

0 7

14 21 28 35 42

100.00 128.82 109.65 109.65 87.10 75.86 49.98

100.00 123.03 125.89 120.23 95.50 66.07 40.74

100.00 125.89 109.65 104.71 100.00 93.33 85.11

100.00 138.04 147.91 138.04 123.03 79.43 77.62

100.00 114.82 95.50 33.11 35.48 7.41 3.16

100.00 128.82 95.50 42.66 34.67 7.59 3.16

[55]



Robinson (1987) đã báo cáo về sự tồn tại của L. acidophilus trong yogurt

acidophilus. Các sản phẩm được kiểm tra đã cho các giá trị 9,5 × 106; 7,6 × 106 và 4,0 ×

106 CFU/ml tương ứng giá trị thử nghiệm ban đầu và sau 7, 14 ngày lưu trữ lạnh. Trong

nghiên cứu này, tương tự với những gì đã thử nghiệm với S. thermophilus, không có sự

tổn thất về khả năng tồn tại của Lactobacilli xảy ra trong 28 ngày đầu tiên bảo quản lạnh.

Sau đó, tiếp tục quan sát thấy có sự sụt giảm. Số lượng tồn tại của Lactobacilli được giữ

lại trong sản phẩm bổ sung Spirulina là cao hơn sản phẩm thông thường trong cùng giai

đoạn. Tổng số L. acidophilus đạt giá trị yêu cầu 107 CFU/ml ở mỗi thời gian lấy mẫu, do

đó, có tiềm năng cung cấp đầy đủ lợi ích sức khỏe cho đến 42 ngày lưu trữ lạnh.

Reuter (1989) đã nói rằng, độ chua thích hợp, sự ảnh hưởng của oxy và ở nhiệt độ

lạnh, không phải là vấn đề cho sự tồn tại Bifidobacteria ngay cả sau 4 tuần. Trong thử

nghiệm này, trên 95% khả năng tồn tại của Bifidobacteria được giữ lại sau 14 ngày lưu

trữ ở 40C. Tuy nhiên, sự giảm mật độ Bifidobacteria được quan sát trong 4 tuần sau đó,

đặc biệt là giữa 28 và 35 ngày. Không có sự khác biệt đáng kể giữa mẫu bổ sung và mẫu

thông thường về mặt này. Tuy nhiên, trong toàn bộ thời gian lưu trữ, số lượng

Bifidobacteria tồn tại trong sữa lên men ABT bổ sung Spirulina vẫn cao hơn so với mẫu

thông thường.

Tầm quan trọng của việc lưu trữ ở nhiệt độ thấp được làm sáng tỏ vì thực tế rằng sự

tồn tại của Bifidobacteria sau 28 ngày lưu trữ ở 40C là tương tự kết quả thu được sau 3

ngày ở 150C.

Không có sự tăng trưởng của nấm men, nấm mốc, coliforms, E.coli phát hiện trong

mẫu bất kì, điều đó cho thấy sinh khối S.platensis có tiềm năng về thuộc tính kháng sinh.

Bảng 1.22 cho thấy sự thay đổi độ chua và pH của sữa lên men ABT trong suốt thời

gian lưu trữ lạnh ở 40C.



Bảng 1.22: pH và độ chua của sản phẩm sữa lên men bổ sung Spirulina và lên men thông thường trong thời gian lưu trữ ở 40C.


pH Độ chua Bổ sung Spirulina

Bình thường Bổ sung Spirulina

Bình thường

0 7

14 21 28 35 42

4.33 ± 0.01 4.30 ± 0.01 4.27 ± 0.01 4.23 ± 0.01 4.24 ± 0.02 4.25 ± 0.01 4.24 ± 0.01

4.28 ± 0.01 4.28 ± 0.02 4.26 ± 0.01 4.24 ± 0.01 4.25 ± 0.01 4.26 ± 0.01 4.23 ± 0.01

0.98 ± 0.02 1.13 ± 0.03 1.17 ± 0.01 1.19 ± 0.01 1.19 ± 0.01 1.20 ± 0.01 1.21 ± 0.01

0.96 ± 0.01 1.11 ± 0.05 1.14 ± 0.01 1.13 ± 0.01 1.17 ± 0.01 1.18 ± 0.01 1.19 ± 0.01

[55]

Không có sự acid hóa xảy ra ở nhiệt độ này. Có sự sụt giảm pH ít hơn 0,1 đơn vị

trong sản phẩm có bổ sung Spirulina suốt 42 ngày lưu trữ, còn pH của mẫu thông thường

giảm với mức độ ít hơn. Bất kì việc tăng nhiệt độ bảo quản dường như có tầm quan trọng

thiết yếu bởi vì Medina và Jordano (1995) đã quan sát thấy sự suy giảm pH tới 0,3 đến

0,4 đơn vị trong trường hợp sản phẩm sữa lên men ABT lưu trữ 36 ngày ở 70C. Trong

thử nghiệm này, số lượng acid lactic và acid acetic sinh ra sau 42 ngày bảo quản ở 40C có

thể so sánh với kết quả đo sau 3 ngày ở 150C.

Kết luận:

Kết quả của nghiên cứu này chứng minh rằng sinh khối S.platensis có ảnh hưởng

tích cực đến sự tồn tại của vi khuẩn mồi ABT bất kể nhiệt độ lưu trữ. Sự hiện diện của L.

acidophilus dao động trong phạm vi 107CFU/ml trong mỗi lần lấy mẫu, và tổng số S.

thermophilus cũng vượt quá giới hạn, đạt giá trị cao hơn 109 CFU/ml trong hầu hết các

trường hợp. Một điều đáng quan tâm là Bifidobacteria rất dễ bị tổn thương bởi các acid có

hại. Số lượng của chúng giảm nhanh hơn so với Lactobacilli và Streptococci. Tuy nhiên,

việc bổ sung sinh khối S.platensis tạo ra tác động có lợi lên sự tồn tại của chúng.



Không có vi sinh vật gây hư hỏng phát hiện trong bất kỳ lần lấy mẫu nào, điều đó

cho thấy khả năng sát khuẩn cao trong suốt quá trình chế biến và đóng gói sản phẩm.

Nhiệt độ bảo quản ở 150C dẫn đến một số trường hợp xảy ra sự acid hóa, trong khi đó, độ

pH ổn định trong quá trình bảo quản lạnh ở 40C.

Ngoài những lợi ích trên, sinh khối vi khuẩn lam giúp tăng amino acid thiết yếu,

vitamin của sữa bò và nó cũng cải thiện thành phần acid béo. Sự phong phú các thành

phần hoạt tính trong S.platensis có tầm quan trọng rất lớn như một nguồn dinh dưỡng, vì

lý do đó, sinh khối vi khuẩn lam mở ra một cơ hội mới cho việc sản xuất các sản phẩm

sữa chức năng.

1.4. Giới thiệu một số sản phẩm Spirulina hiện nay

Spir @ Cid:

Công dụng:

− Hỗ trợ điều trị và phòng bệnh ung thư.

− Hạn chế các tác dụng phụ do xạ trị và hóa trị trong

điều trị ung thư.

− Nâng cao sức đề kháng cho người nhiễm HIV.

Spir @ HA:

Công dụng:

− Điều hoà huyết áp.

− Làm chắc thành mạch, giảm mỡ máu.

− Chống tai biến mạch máu não.

− Giảm căng thẳng trí não khi học, làm việc; cải

thiện trí nhớ, tăng khả năng tư duy, tăng thị lực.

− Bồi bổ sức khỏe, giúp tăng cường sức đề kháng.



Spir @ B:

Công dụng:

− Chống suy dinh dưỡng.

− Bồi bổ sức khỏe.

− Giúp tăng cường sức đề kháng.

− Giúp làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể.

− Kiểm soát trọng lượng cơ thể.

− Làm giảm mỡ trong máu.

Dia Spir @:

Công dụng:

− Hỗ trợ dinh dưỡng và phòng bệnh tiểu đường. Gảm

đường huyết khi dùng kèm với thuốc trị tiều đường.

− Hạn chế các tác dụng phụ do một số thuốc trị bệnh

tiểu đường gây ra.

− Trường hợp mới mắc bệnh, nếu dùng dia Spir@ lâu

dài kết hợp với chế độ sinh hoạt và ăn uống hợp lý thì

đường huyết có thể nhanh chóng trở lại bình thường.

Spir @ CĐ:

Công dụng:

− Chống và giải độc cho gan thận do bia, rượu.

− Phòng chống các bệnh do các gốc tự do trong môi

trường sống gây ra.

− Làm chậm quá trình lão hoá cơ thể.

− Giảm Cholesterol và chống xơ vữa động mạch.

− Tăng sức đề kháng cho cơ thể, bồi bổ sức khoẻ



Bột tảo Spi – 1:

Công dụng:

− Bột tảo Spi-1 bổ sung vitamin, chất dinh dưỡng giúp

tăng cường sức đề kháng cho cơ thể.

− Hạn chế quá trình lão hóa. Ngăn ngừa các bệnh các bệnh

thời đại như béo phì, tim mạch ,tiểu đường huyết áp cao…

− Làm đẹp da, giúp phụ nữ có làn da hồng hào hơn…

Ngoài ra, Spirulina còn được bổ sung vào công đoạn chế biến các sản phẩm thực

phẩm thông thường nhằm tăng hàm lượng dinh dưỡng: Sữa chua, kem, mì ăn liền,

nước uống thể thao, bánh biscuit…

1.5. Kết luận

Tảo xoắn Spirulina là một loại vi tảo, có giá trị dinh dưỡng cao. Loại tảo này có

chứa trên 60g protein/ 100g tảo khô, bao gồm 18 loại acid amin cần thiết không thể thiếu

cho cơ thể, nhất là đối với trẻ em như: isoleucin, lysine, methionin, phenylalanine,

threonin, tryptophan và valine. Ngoài ra, protein của Spirulina có đặc tính là màng tế bào

dễ bị phá vỡ nên hiệu suất hấp thu protein trong loại tảo này rất cao, trên 95%. Chất béo

trong tảo chiếm khoảng 6%, nhưng có tính chất ưu việt là một nguồn dinh dưỡng rất giàu

acid béo omega-3 ( DHA) và acid béo Gamma Linolenic (GLA), là các loại acid béo đặc

biệt quý giá có tác dụng trong hoàn thiện tế bào thần kinh trung ương cho trẻ em, giúp

tăng cường trí nhớ cho trẻ em, và ngăn ngừa suy giảm trí nhớ ở người cao tuổi.

Tảo Spirulina còn là nguồn cung cấp nhiều vitamin và khoáng chất cần thiết cho cơ

thể. Giàu các vitamin B1, B2, B6, B12, vitamin E, đặc biệt là B12 rất cao, gấp 3 lần gan

động vật, vượt xa các nguồn thức ăn khác, có tác dụng quan trọng trong việc tạo thành các



tế bào máu. β-caroten có hàm lượng gấp 10 lần trong cà rốt, có tác dụng chống oxy hóa,

ngăn ngừa xơ vữa động mạch. Các chất khoáng và vi khoáng có sắt, đồng, mangan, canxi,

magnegium...Với những ưu điểm kể trên tảo Spirulina là nguồn thức ăn tiềm năng, có giá

trị dinh dưỡng rất tốt giúp ngăn ngừa, phục hồi suy dinh dưỡng và thiếu vi chất dinh

dưỡng cho mọi lứa tuổi.

Do có nhiều chất dinh dưỡng và công dụng như vậy, tảo xoắn Spirulina thật sự là

loại thực phẩm quý giá cho sức khỏe con người. Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này hiện

nay vẫn chưa được phổ biến rộng rãi ở nước ta do quy mô nuôi trồng còn hạn hẹp. Vì vậy,

với việc mở rộng quy mô nuôi trồng, tối ưu các phương pháp xử lý tảo sau thu hoạch

nhằm tăng giá trị cảm quan và tận dụng triệt để những hợp chất quý giá trong tảo, từ đó sẽ

tạo ra một cơ hội mới cho thị trường tảo ở Việt Nam.

Chương 2: Fructooligosaccharide

SVTH: Vũ Thị Ngọc An 184

CHƯƠNG 2

FRUCTOOLIGOSACCHARIDE (FOS)

2.1. Tổng quan về FOS

2.1.1. Khái niệm FOS

Gần đây trong dinh dưỡng, người ta chú ý đến carbohydrate trong khẩu phần ăn, mà

trước tiên là chất xơ. Tuy cơ thể không lên men tiêu hóa được, nhưng chất xơ đóng vai trò

quan trọng trong cuộc chiến chống lại những bệnh tật về tim mạch và một số trường hợp

ung thư đường ruột [40].

Nhiều loại carbohydrate được nghiên cứu đóng vai trò như một prebiotic, với các

đặc tính như:

• Không bị hấp thu ở tuyến tiêu hóa trên.

• Lên men bởi vi sinh vật trong ruột.

• Kích thích chọn lọc sự phát triển và hoạt tính của một số vi khuẩn có khả năng

cải thiện sức khỏe.

Đường chức năng là một bộ phận quan trọng trong nhóm thực phẩm chức năng được

tập trung nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây và có tiềm năng trở thành loại chất

ngọt mới thay thế cho sucrose, loại đường truyền thống.

Có nhiều loại đường chức năng: palatinose, maltitol, sorbitol, lactitol,

fructooligosaccharide (FOS), galactooligosaccharide (GOS), isomaltooligosaccharide

(IMO) … trong đó, đường FOS nổi bật từ những năm 1980 và được nghiên cứu nhiều hơn

cả, không chỉ vì công nghệ sản xuất đơn giản, mà nó còn có nhiều đặc tính sinh học có lợi

cho sức khỏe con người: kích thích tiêu hóa, giảm cholesterol, phospholipid, triglyceride,

chống béo phì, an toàn cho người bị bệnh tiểu đường, ngăn ngừa sâu răng … Đặc biệt,



FOS còn giúp tăng khả năng hấp thu Ca, Mg, Fe…, ngăn ngừa bệnh thiếu máu, thiếu sắt,

cân bằng ion Mg2+, Ca2+ trong cơ thể, chống loãng xương [39].

FOS là chất tạo ngọt năng lượng thấp, không được hấp thu ở tuyến tiêu hóa trên, tuy

nhiên được sử dụng chọn lọc bởi hệ vi khuẩn đường ruột Bifidobacteria, nên có đặc tính

prebiotic.

Ở Mỹ, inulin và FOS là những sản phẩm dẫn đầu thị trường, tiếp sau đó là GOS. Ở

Nhật, ngoài những loại đường trên còn có IMO, oligosaccharide đậu nành,

xylooligosaccharide, gentiooligosaccharide và lactosucrose. Công ty Meiji Seika ở Nhật

là công ty đầu tiên sản xuất thành công sảm phẩm FOS thương mại bằng enzyme chuyển

hóa từ Asp. niger và bán trên thị trường với tên thương mại là Neosugar (1984). Gần đây

hơn, công ty Cheil Food & Chemicals ở Hàn Quốc đã thành công trong việc cố định tế

bào nấm sợi Aureobasidium pullulans để sản xuất FOS quy mô công nghiệp. FOS đang

dần thay thế các loại đường truyền thống như đường kính và syrup giàu fructose, được sử

dụng rộng rãi trong thực phẩm và thức ăn gia súc [58].

2.1.2. Nguồn gốc FOS – Cấu tạo

FOS có nhiều trong tự nhiên, tồn tại trong các loại rau quả như chuối, mận, đào,

quýt, atiso, cà chua, hành, tỏi… Hàm lượng FOS ở một số loại rau quả có thể tham khảo ở

bảng 2.1 [18].

FOS là những oligosaccharide mà trong phân tử của chúng gồm một phân tử đường

sucrose liên kết với 1, 2 hay 3 gốc fructose thông qua mối liên kết β-2,1-glucoside. Công

thức tổng quát của đường FOS là GFn, trong đó n là số nhóm n = 2, 3, 4 (G là gốc đường

glucose, F là gốc đường fructose), tương ứng là các đường 1-kestose (GF2), nystose (GF3)

và fructofuranosylnystose (GF4) với công thức cấu tạo như hình 2.1 [58]. Tuy nhiên,

nhiều nhà nghiên cứu khác cũng gộp cả các loại đường khác như fructan, glucofructosan

và inulin vào nhóm đường FOS [58].



Bảng 2.1: Hàm lượng FOS của một số loại cây quả (mg/g chất khô)

Loại cây quả 1-Kestose

(GF2) Nystose (GF3)

Fructofuranosylnystose (GF4)

Tổng FOS (GFn)

Chuối 5.9 0.1 0.0 6.0 Quýt 1.7 0.0 1.11 2.8 Đào 3.5 0.0 0.0 3.5 Lê 0.8 0.0 0.0 0.8

Mận 1.8 0.2 0.0 2.0 Dưa hấu 2.8 0.0 0.1 3.0

Măng 0.3 0.0 0.0 0.3 Rau dền đỏ 0.1 0.0 0.0 0.1 Rau cần tây 0.2 0.0 0.4 0.6

Hành ta 0.4 0.3 0.4 1.1 Dứa Nhật Bản 0.5 0.0 0.0 0.5

Cà chua 0.2 0.0 0.4 0.6 Tỏi 8.7 1.2 0.4 10.3

Cây atiso 93.9 94.3 98.1 286.2 Hành tây 15.5 6.7 4.2 26.4

[18]



Hình 2.1: Công thức cấu tạo của FOS [58]

Trong tự nhiên, FOS được hình thành dưới tác dụng của enzyme chuyển hóa

fructose. Quá trình trích ly FOS từ những loại thực vật này ở quy mô công nghiệp không

có tính kinh tế do nồng độ rất thấp, lượng enzyme lại bị giới hạn bởi điều kiện thời tiết, vì

vậy, FOS thương mại được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp hoặc thủy phân. Bảng

2.2 nêu một số loại thực vật có enzyme tổng hợp FOS [58].



Bảng 2.2: Nguồn enzyme tổng hợp FOS từ thực vật

Nguồn Tác giả

Agave americana (Cây thùa) Bhatia và cs. (1979);

Nandra và Bhatia (1980)

Agave vera cruze (Cây thùa) Bhatia và cs. (1954, 1955);

Satyanarayana (1976)

Asparagus officinalis (măng tây) Shiomi và cs. (1976, 1979a, 1979b, 1980,

1981, 1982)

Allium cepa (củ hành) Darbyshire và cs. (1978);

Henry và Darbyshire (1980)

Cichorium intybus (rau diếp xoăn) Shingh và Bhatia (1971);

Chandorkar và Collins (1972)

Crinum longifolium Bhatia và cs. (1959)

Lá củ cải đường Allen và Bacon (1956)

Helianthus tuberosus (atisô Jerusalem) Edelman và Dickerson (1966);

Scott và cs. (1966); Praznik và cs. (1990)

Lactuca sativa L. (rau diếp) Chandorkar và Collins (1972)

Lycoris radiata (hạt cây đơn tử diệp) Nagamatsu và cs. (1990)

Taraxacum officinale (cây bồ công anh) Chandorkar và Collins (1972)

[58]

FOS có thể được sản xuất ở quy mô công nghiệp từ nguồn nguyên liệu sucrose, với

xúc tác là enzyme thu nhận từ các loại nấm mốc như Aureobasidiums sp. và Aspergillus

niger [58]. Bảng 2.3 cho biết các nguồn thu enzyme chuyển hóa FOS từ vi sinh vật [58].



Bảng 2.3: Vi sinh vật sản xuất FOS

Nguồn Tác giả Aureobasidium pullulans Jung và cs. (1987, 1989); Yun và cs.

(1990, 1992, 1993a, b, c, d); Smith và cs. (1980)

Aureobasidium sp. Hayashi và cs. (1989, 1990, 1991a, b) Arthrobacter sp. Fujita và cs. (1990) Aspergillus japonicus Duan và cs. (1994) Aspergillus niger Hidaka và cs. (1988, 1989); Bealing và

Bacon (1953) Aspergillus oryzae Pazur (1952); Kida và cs. (1988);

Bealing và Bacon (1953) Aspergillus phoenicis Balken và cs. (1991) Aspergillus sydowi Muramatsu và cs. (1988); Claviceps purpurea Dickerson (1972); Arcamone và cs.

(1970) Fusarium oxysporum Gupta và cs. (1982); Maruyama và cs.

(1979); Patel và cs. (1994) Penicillium frequentans Usami và cs. (1991) Penicillium spinulosum Bealing và Bacon (1953) Phytophthora parasitica Hankin và Meintype (1977) Scopulariopsis brevicaulis Takeda và cs. (1994) Saccharomyces cerevisiae Straathof và cs. (1986)

[58]

2.1.3. Tính chất của FOS:

Theo Gross, kestose là loại đường kết tinh màu trắng có góc quay cực [α]D20 là

+28.50 và nhiệt độ nóng chảy là 199 – 2000C. Độ ngọt của kestose, nystose và

fructofuranosylnystose so với sucrose lần lượt là 31%, 32% và 16%. Độ ngọt tổng của ba

loại đường này (FOS) chỉ bằng 30% độ ngọt của đường sucrose [58].

Vị ngọt của FOS tương tự sucrose. Đường FOS hút ẩm mạnh, nªn khã b¶o qu¶n ë

tr¹ng th¸i tinh thÓ trong thêi gian dài. Ở cïng mét nång ®é, FOS cã ®é nhít cao hơn ®é



nhít cña sucrose. §é bÒn nhiÖt cña FOS cũng cao h¬n sucrose. §ưêng FOS bÒn trong d¶i

pH 4.0- 7.0 và nhiÖt ®é cao tíi 1400C [58].

Ở dạng lỏng, FOS mạch ngắn là chất lỏng trong, không màu hoặc màu vàng như

syrup, có mùi trái cây và vị ngọt. Ở dạng bột, FOS có màu trắng đến vàng nhạt, mùi trái

cây và vị ngọt. FOS hòa tan trong nước [11].

Mét sè t¸c gi¶ khi nghiªn cøu vÒ tÝnh chÊt ho¸ lý cña FOS ®Òu ®ưa ra mét kÕt luËn

chung là cã nhiÒu tÝnh chÊt hãa lý tư¬ng tù sucrose như ®é hòa tan, ®é ®«ng ®Æc, nhiÖt ®é

s«i và c¸c th«ng sè vÒ qu¸ tr×nh kÕt tinh. Kh¸c víi ®ưêng sucrose FOS mang nhiÒu ®Æc

tÝnh sinh häc ưu viÖt h¬n. §©y chÝnh là ®Æc ®iÓm khiÕn c¸c nhà thùc phÈm chó ý và tËp

trung khai th¸c lo¹i ®ưêng này [58].

Bảng 2.4: Đặc tính của FOS so với một số loại đường khác Đường Độ ngọt

(Sucrose = 1)

Độ ổn định Độ nhớt Tính hút

ẩm Nhiệt độ pH

Sorbitol 0.7 < 1600C 2 – 10 Thấp Cao

Xylitol 0.9 < 1600C 2 – 10 Rất thấp Cao

Mannitol 0.5 < 1600C 2 – 10 Thấp Thấp

Erythritol 0.65 < 1600C 2 – 10 Rất thấp Thấp

Maltitol 0.75 < 1600C 2 – 10 Cao Trung bình

Isomalt 0.60 < 1600C 2 – 10 Cao Thấp

Lactitol 0.40 < 1600C 2 – 10 Rất thấp Trung bình

Maltidex 0.75 < 1600C 2 – 10 Cao Trung bình

FOS 0.30 < 1600C 2 – 10 = sucrose Trung bình

[18]



2.1.4. Ảnh hưởng của FOS lên cơ thể và sức khỏe con người

2.1.4.1. Ảnh hưởng cña FOS ®Õn sù chuyÓn hãa carbohydrate

FOS kh«ng hoÆc rÊt Ýt bÞ thuû ph©n bëi hÖ enzyme ®ưêng ruét, nªn khi ¨n lưîng

®ưêng trong m¸u kh«ng bÞ biÕn ®éng.ThÝ nghiÖm vÒ sù thay ®æi hàm lưîng ®ưêng và

insulin trong m¸u theo thêi gian sau khi ¨n FOS ®· cho kÕt qu¶ như h×nh 2.2; 2.3 và 2.4

[18]. KÕt qu¶ cho thÊy tr¸i víi sucrose, khi ¨n FOS, trong cùng một kho¶ng thêi gian,

lưîng ®ưêng trong m¸u kh«ng hÒ thay ®æi.

Hình 2.2: Sự thay đổi nồng độ insulin trong máu [18]

Hình 2.3: Sự thay đổi nồng độ glucose trong máu [18]



Hình 2.4: Sự thay đổi nồng độ fructose trong máu [18]

Liều lượng FOS cần cho người trưởng thành là 8g/ngày [51]. Tõ kÕt qu¶ cña mét

sè nghiªn cøu kh¸c cho thÊy, ®èi víi nh÷ng người bÞ m¾c bÖnh tiÓu ®ưêng nÕu mçi ngày

¨n 8g FOS, lượng ®ưêng trong m¸u sÏ gi¶m nhanh trong vßng 14 ngày.

Nh÷ng biÕn ®æi cã tÝnh tÝch cùc ph¸t sinh khi chuyÓn ho¸ glucose và chÊt bÐo trong

qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt víi sù hiÖn diÖn cña FOS. Nguyªn nh©n cña çc hiÖu øng này là do

FOS kh«ng bÞ tiªu ho¸ ë ruét non bëi t¸c dông cña hÖ enzyme ®ưêng ruét, mà bÞ lªn men

trong ruét già dưíi t¸c dông cña vi khuÈn Bifidobacterium (là mét chi trong hä

Lactobacteraceae, tÕ bào h×nh que, ph©n nh¸nh, th¼ng hoÆc cong, bÊt ®éng, gram +, sèng

kþ khÝ, ưa Êm, kh«ng sinh bào tö, thưêng gÆp trong ruét già). KÕt qu¶ cña qu¸ tr×nh là sinh

ra çc acid bÐo ®o¶n m¹ch (SCFA) như acid acetic, acid propionic và acid butyric. Çc

chÊt này sau ®ã ®ưîc thÊm vào thành ruét già hoÆc chuyÓn lªn gan, øc chÕ sù gia t¨ng cña

glucose và chÊt bÐo trong m¸u.

§èi víi bÖnh nh©n m¾c bÖnh tiÓu ®ưêng (cã hoÆc kh«ng rèi lo¹n tiÕt insulin) ngoài

sù bÊt b×nh thưêng vÒ hàm lưîng ®ưêng trong m¸u, chÊt bÐo trong m¸u còng lu«n bÞ rèi

lo¹n. V× thÕ viÖc h¹n chÕ sù gia t¨ng hàm lượng chÊt bÐo trong m¸u còng là mét biÖn ph¸p

®Ó ch÷a bÖnh tiÓu ®ưêng. Víi ý tưëng trªn, Agheli và çc céng sù gÇn ®©y ®· nghiªn cøu



và chØ ra r»ng nhãm chuét m¾c bÖnh tiÓu ®ưêng cã kh¸ng tiÕt isulin khi ¨n thøc ¨n cã

chøa 10% FOS ®· gi¶m ®¸ng kÓ hàm lưîng phospholipid và triglyceride trong m¸u. KÕt

qu¶ này ®· kh¼ng ®Þnh l¹i b¸o ço trưíc ®ã cña Delzenne, ngưêi ®· chØ ra r»ng FOS cã

kh¶ n¨ng làm gi¶m lưîng chÊt bÐo trong m¸u cña chuét. Còng theo Agheli, FOS kh«ng

chØ làm thay ®æi hàm lưîng chÊt bÐo trong m¸u mà cßn cã thÓ ®iÒu chØnh sù t¹o ra çc

enzyme tæng hîp acid bÐo. Trong gan, ho¹t lùc cña enzyme trªn t¨ng lªn nÕu chØ ¨n

sucrose nhưng sÏ ®ưîc b×nh thưêng ho¸ bëi sù cung øng FOS. Như vËy FOS cã vai trß kh¸

tÝch cùc trong viÖc phßng và ch÷a bÖnh tiÓu ®ưêng xÐt ë gãc ®é bÖnh lý liªn quan ®Õn sù

gia t¨ng cña lipoprotein trong m¸u. V× thÕ FOS hiÖn nay ®ưîc dïng nhiÒu như là mét chÊt

ngät thÊp n¨ng lưîng ®Æc biÖt dành cho çc ®èi tưîng m¾c bÖnh tiÓu ®ưêng [18].

2.1.4.2. Ảnh hưëng cña FOS ®Õn hÖ vi sinh vËt đường ruột

T¸c ®éng cña FOS ®Õn hÖ vi sinh vËt ®ưêng ruét ®· ®ưîc nhiÒu t¸c gi¶ nghiªn cøu.

B»ng thÝ nghiÖm ngo¹i thÓ Gross. D khi nghiªn cøu hÖ vi sinh vËt trùc tràng cho thÊy çc

nßi Bifidobacterium spp. và Bacteroides spp cã thÓ ph¸t triÓn m¹nh trong m«i trưêng dinh

dưìng cã chøa FOS, ngưîc l¹i Escherichia coli và Clostridium perfringens l¹i bÞ tiªu diÖt

trong m«i trưêng này. Cßn kÕt qu¶ thÝ nghiÖm trªn c¬ thÓ cho thÊy c¶ hai ®èi tưîng ngưêi

và ®éng vËt ë çc løa tuæi kh¸c nhau sau khi ¨n FOS cho thÊy sè lưîng vi sinh vËt

Bifidobacterium và Lactobacilli trong ®¹i tràng t¨ng lªn, trong khi ®ã sè lưîng vi sinh vËt

Clostridium perfringens l¹i gi¶m xuèng. ThÝ nghiÖm cßn chØ râ r»ng do FOS cã cÊu t¹o

m¹ch th¼ng ng¾n nªn ®· t¸c ®éng ®Õn kh¶ n¨ng lªn men cña çc vi sinh vËt nãi trªn. Cßn

çc lo¹i fructoligosaccharides m¹ch nh¸nh hoÆc inulin m¹ch th¼ng nhưng dài th× ¶nh

hưëng trªn rÊt h¹n chÕ.

HiÖn nay Bifidobacterium ®ưîc ®Æc biÖt quan t©m trong lÜnh vùc sinh häc bëi nã

mang nhiÒu lîi Ých cho c¬ thÓ sèng. Vi khuÈn Bifidobacterium tån t¹i và ph¸t huy t¸c

dông ngay trong c¬ thÓ chñ, ®iÒu này rÊt cã ý nghÜa v× nã cã thÓ phßng chèng çc bÖnh tËt

vÒ ®ưêng ruét, do Bifidobacterium cã kh¶ n¨ng s¶n sinh çc acid m¹ch ng¾n như acid

acetic, acid lactic trong qu¸ tr×nh lªn men ®ưêng. Sù gia t¨ng hàm lưîng acid sÏ cã t¸c



dông gi¶m pH trong ®ưêng ruét, gi÷ g×n ho¹t ®éng trao ®æi chÊt cña çc vi sinh vËt ®ưêng

ruét kh¸c æn ®Þnh, ®óng quy luËt, h¹n chÕ hoÆc ng¨n ngõa sù ph¸t triÓn cña çc vi sinh vËt

g©y bÖnh và çc vi sinh vËt g©y thèi r÷a. ë møc ®é cao h¬n nghiªn cøu cßn chØ ra r»ng qu¸

tr×nh gi¶m pH trong ®ưêng ruét cã t¸c dông trùc tiÕp phßng và trÞ bÖnh ung thư ruét th«ng

qua viÖc ng¨n trõ sù ph¸t triÓn cña bacterium ho¹i sinh và øc chÕ ho¹t lùc cña çc enzyme

như nitroreductase, β-glucoronidase và decarboxylase. §©y là nh÷ng enzyme tham gia qu¸

tr×nh chuyÓn ho¸ nit¬ t¹o çc s¶n phÈm trung gian cã kh¶ n¨ng g©y ung thư (nh÷ng dÉn

xuÊt phenol cña tyrosin và tryprophan). Ngoài ra vi khuÈn Bifidobacterium cßn cã kh¶

n¨ng t¹o vitamin, nhÊt là vitamin nhãm B, gi¶m cholesterol trong m¸u và t¸i sinh hÖ vi

sinh vËt ®ưêng ruét cho çc bÖnh nh©n sau khi dïng nhiÒu kh¸ng sinh ®iÒu trÞ bÖnh [18].

2.1.4.3. Ảnh hưëng cña FOS ®Õn bÖnh s©u r¨ng

BÖnh s©u r¨ng chñ yÕu là do vi khuÈn Streptococcus mutans và çc liªn cÇu khuÈn

g©y nªn. Çc vi sinh vËt trªn cã rÊt nhiÒu trong khoang miÖng cña ngưêi và ®éng vËt. Khi

thøc ¨n ®ưa vào, chóng sÏ lùa chän çc thành phÇn dinh dưìng phï hîp ®Ó lªn men, ph¸t

triÓn và g©y bÖnh. Streptococcus mutans sử dụng nguồn đường tạo thành các acid và β-

glucans không tan là nguyên nhân chính gây sâu răng.V× vËy nÕu trong thành phÇn thøc

¨n cña ta kh«ng chøa hoÆc chøa Ýt chÊt thÝch hîp cho qu¸ tr×nh dinh dưìng cña lo¹i vi sinh

vËt trªn sÏ cã thÓ ng¨n ngõa ®ưîc bÖnh.

§Ó xÐt ¶nh hưëng cña FOS ®Õn bÖnh s©u r¨ng ngưêi ta ®· thÝ nghiÖm trªn c¬ thÓ

chuét. KÕt qu¶ cho thÊy nhãm chuét thÝ nghiÖm (¨n FOS) bÞ s©u r¨ng Ýt h¬n nhiÒu so víi

nhãm chuét ®èi chøng (¨n sucrose). Çc thÝ nghiÖm nu«i cÊy vi sinh vËt ph©n lËp tõ

khoang miÖng lªn m«i trưêng FOS ®· chøng tá c¬ chÕ vÒ kh¶ n¨ng phßng bÖnh s©u r¨ng

cña nã. §ã là do FOS kh«ng ph¶i là m«i trưêng thÝch hîp cho çc vi sinh vËt g©y bÖnh

trªn ph¸t triÓn. Ngoài ra Ikeda. T cßn nghiªn cøu cho thÊy FOS kh«ng nh÷ng chØ cã kh¶

n¨ng phßng mà cßn cã kh¶ n¨ng ch÷a bÖnh bÖnh s©u r¨ng. V× thÕ ngày nay nhiÒu n¬i trªn

thÕ giíi ngưêi ta ®· dïng FOS thay thÕ cho ®ưêng kÝnh trong thành phÇn ¨n hoÆc trong

chÕ biÕn b¸nh kÑo, ®Æc biÖt là b¸nh kÑo cho trÎ em ®Ó phßng bÖnh s©u r¨ng [18].



2.1.4.4. Vai trß thóc ®Èy qu¸ tr×nh hÊp thô calcium cña FOS:

NhiÒu nghiªn cøu cho thÊy, sö dông FOS cã thÓ t¨ng cưêng sù hÊp thô calcium cña

tÕ bào. Nhê ®Æc tÝnh này, FOS cã thÓ gióp cho con ngưêi phßng và chèng çc bÖnh vÒ

chuyÓn ho¸ và bÖnh lo·ng xư¬ng. Qu¸ tr×nh thóc ®Èy hÊp thô calcium cña FOS x¶y ra

trong ruét già. C¬ chÕ thóc ®Èy trªn chưa ®ưîc x¸c ®Þnh mét çch râ ràng nhưng cã mét

kÕt luËn chung là do ba yÕu tè sau:

• §ưêng FOS trong ruét già bÞ çc vi sinh vËt sinh acid lªn men, làm gi¶m pH cña

m«i trưêng, dÉn ®Õn sù t¸i hoà tan cña çc muèi calcium.

• Trong ruét già vi khuÈn Bifidobacterium lªn men m¹nh khi m«i trưêng cã chøa

FOS sinh ra çc acid m¹ch ng¾n, çc acid này khuyÕch t¸n vào tÕ bào biÓu b× thành

ruét, tõ ®ã thóc ®Èy sù hÊp thô calcium.

• Sù dÞch chuyÓn FOS trong ruét già sÏ kÐo theo sù dÞch chuyÓn cña hîp chÊt

calcium-protein, nhê ®ã calcium ®ưîc tiÕp xóc nhiÒu h¬n víi çc tÕ bào thành ruét,

t¹o ®iÒu kiÖn tèt cho sù hÊp thô vào m¸u. Ngoài calcium, FOS ®ång thêi cßn thóc

®Èy sù hÊp thô c¶ magiª. §iÒu này thóc ®Èy qu¸ tr×nh ph¸t triÓn xư¬ng, t¨ng cưêng

hàm lưîng calcium trong xư¬ng [18].

2.1.5. TÝnh an toàn và ứng dụng của FOS

§Ó kh¼ng ®Þnh tÝnh an toàn cña FOS ®èi víi c¬ thÓ sèng, ®· cã nhiÒu nghiªn cøu vÒ

tÕ bào và gen cña ®éng vËt ¨n FOS. Çc nghiªn cøu này chñ yÕu tËp trung ®Ó tr¶ lêi çc

c©u hái là khi ®éng vËt sö dông FOS cã ¶nh hưëng ®Õn kh¶ n¨ng kh¸ng khuÈn cña tÕ bào

hay kh«ng? Cã g©y ra ®ét biÕn vÒ gen dÉn ®Õn sù tæng hîp ADN bÊt qui t¾c hay kh«ng?

TÊt c¶ çc nghiªn cøu ®· ®i ®Õn kÕt luËn là FOS kh«ng g©y ®éc h¹i ®Õn tÕ bào cña chñ thÓ.

T¸c gi¶ Clevenger M.A. cßn làm thÝ nghiÖm trªn chuét ®Ó kiÓm tra vÒ ®éc tè cÊp tÝnh và

m·n tÝnh còng như kh¶ n¨ng g©y ung thư cña FOS. KÕt qu¶ cho thÊy FOS kh«ng cã biÓu

hiÖn cña çc ®éc tè khi cho chuét ¨n h¬n 2,17mg/kg/ngày [18].

Phô thuéc vào ®é tinh khiÕt, FOS thư¬ng phÈm chñ yÕu cã hai lo¹i là FOS phæ th«ng

(®é tinh khiÕt tõ 45% ®Õn 60%) và FOS cao ®é (®é tinh khiÕt cao h¬n 75%). §ưêng FOS



phæ th«ng thưêng ®ưîc dïng trùc tiÕp như mét lo¹i thùc phÈm hoÆc như mét chÊt ngät bæ

sung trong chÕ biÕn çc lo¹i thùc phÈm kh¸c. Cßn FOS cao ®é thưêng ®Ó chuyªn dïng cho

çc ®èi tưîng m¾c bÖnh, ¨n kiªng. Ngoài ra cßn cã lo¹i tinh khiÕt 100 % dïng cho c«ng

viÖc ph©n tÝch ho¸ häc. Lo¹i cã ®é tinh khiÕt thÊp cã thÓ dïng làm chÊt bæ sung trong m«i

trưêng nu«i cÊy vi khuÈn Bifidobacterium.

Theo tài liÖu c«ng bè th× c¬ thÓ ngưêi mét ngày chØ cã thÓ hÊp thô 2-12g FOS, nªn

viÖc dïng FOS bæ sung vào thùc phÈm kh¸c như mét chÊt phô gia ®Ó t¨ng cưêng ho¹t tÝnh

sinh häc cña thùc phÈm là øng dông ®Çu tiªn và quan träng cña FOS trong lÜnh vùc chÕ

biÕn thùc phÈm. Do FOS cã ®Æc tÝnh là cã vÞ ngät, thÊp n¨ng lưîng và cã ho¹t tÝnh sinh

häc nªn thưêng ®ưîc bæ sung vào çc lo¹i b¸nh, kÑo, b¸nh quy và çc s¶n phÈm cña s÷a

hoÆc kÕt hîp trén lÉn vào trong çc chÊt ngät kh¸c.

Ở NhËt B¶n FOS ®ưîc dïng ®Ó bæ sung vào h¬n 500 lo¹i thùc phÈm. N¨m 1984 ë

nưíc này ®· cã mét thÞ trưêng réng lín cho FOS. §Õn n¨m 1990 lưîng FOS tiªu thô trong

c¶ nưíc lªn ®Õn 4000 tÊn. §ưêng FOS b¸n trªn thÞ trưêng NhËt B¶n rÊt ®a d¹ng, tõ lo¹i cã

hàm lưîng rÊt thÊp ®Õn lo¹i cã ®é tinh khiÕt cao ®Õn 98%, phôc vô cho nhiÒu môc ®Ých

kh¸c nhau, lo¹i hàm lưîng thÊp dïng làm chÊt kÝch thÝch trong m«i trưêng lªn men cho vi

khuÈn Bifidobacterium, chÊt cã hàm lưîng trung b×nh dïng cho ngưêi ¨n trùc tiÕp hoÆc bæ

sung vào thùc phÈm cßn lo¹i tinh khiÕt dïng trong kü thuËt ph©n tÝch.

Ở Mü và NhËt B¶n ngưêi ta cßn sö dông FOS ®Ó làm chÊt bæ sung trong thøc ¨n cho

gia sóc [58]. Nhê ®Æc tÝnh cña FOS là cã thÓ t¨ng cưêng ho¹t ®éng cña hÖ tiªu ho¸ nªn

gióp cho gia sóc ¨n nhiÒu, t¨ng c©n nhanh .

T¹i Trung Quèc ®Õn tËn n¨m 1992 c«ng nghiÖp s¶n xuÊt FOS míi b¾t ®Çu, nhưng

trong vßng mưêi n¨m ngành c«ng nghiÖp này ®· cã bưíc ph¸t triÓn vưît bËc. NÕu như

n¨m 1999 toàn Trung Quèc míi chØ cã 2 nhà m¸y s¶n xuÊt FOS t¹i V©n Nam và Giang T«

víi c«ng suÊt 2000 tÊn/n¨m th× ®Õn ®Çu n¨m 2002 sè nhà m¸y s¶n xuÊt FOS trong toàn

quèc ®· lªn ®Õn mưêi c¬ së víi c«ng suÊt tõ 2000 tÊn ®Õn 4000 tÊn/n¨m. S¶n phÈm FOS ë

nưíc này ®ưîc dïng nhiÒu cho çc ®èi tưîng già, trÎ em và nh÷ng ngưêi bÖnh trong thêi



kú phôc håi søc khoÎ ®Ó t¨ng cưêng ho¹t ®éng tiªu ho¸, gióp cho çc ®èi tưîng trªn nhuËn

tràng, ¨n tèt.

Ở Mü và Ch©u ¢u, nhiÒu c«ng ty ®· và ®ang xin chøng chØ GRAS (Generally

Recognized As Safe) cho viÖc sö dông s¶n phÈm FOS cña m×nh, và như thÕ FOS ®· ®ưîc

c«ng nhËn chÝnh thøc b»ng v¨n b¶n vÒ ®é an toàn thùc phÈm. Nhê ®ã sè lưîng ngưêi tiªu

dïng FOS ngày càng t¨ng cao [18].

2.1.6. T×nh h×nh nghiªn cøu và s¶n xuÊt FOS trªn thÕ giíi

Fructooligosaccharide cã thÓ thu nhËn ®ưîc b»ng çch chiÕt xuÊt chóng tõ çc lo¹i

c©y qu¶, hoÆc b»ng çc phư¬ng ph¸p ho¸ häc, ho¸ lý, ho¸ sinh... Nhưng cho tíi nay

phư¬ng ph¸p ®ưîc coi là hiÖu qu¶ và cã kh¶ n¨ng c«ng nghiÖp ho¸ nhÊt là phư¬ng ph¸p

c«ng nghÖ sinh häc. B¾t ®Çu b»ng sù ph¸t hiÖn mét sè chñng nÊm men và nÊm mèc cã kh¶

n¨ng sinh tæng hîp enzyme xóc t¸c qu¸ tr×nh chuyÓn ho¸ sucrose thành FOS, cho tíi nay

®· cã rÊt nhiÒu nghiªn cøu vÒ lÜnh vùc s¶n xuÊt ®ưêng này theo c«ng nghÖ sinh hãa. Çc

nghiªn cøu chñ yÕu tËp trung vào viÖc ph©n lËp tuyÓn chän gièng ®Ó sinh tæng hîp

enzyme, øng dông enzyme trong s¶n xuÊt FOS và nghiªn cøu tinh chÕ FOS ...

2.1.6.1. Nghiªn cøu sinh tæng hîp enzyme cho s¶n xuÊt FOS

V× enzyme chuyÓn ho¸ fructose trong thùc vËt cã ho¹t tÝnh thÊp và thưêng là hçn hîp

cña mét vài lo¹i và l¹i bÞ h¹n chÕ khai th¸c do cã tÝnh thêi vô, nªn viÖc chiÕt t¸ch enzyme

tõ thùc vËt ®Ó phôc vô cho c«ng nghiÖp s¶n xuÊt FOS kh«ng cã tÝnh kh¶ thi. Cïng víi sù

ph¸t triÓn cña c«ng nghÖ sinh häc, viÖc øng dông vi sinh vËt trong s¶n xuÊt enzyme ngày

càng nhiÒu. Còng như çc lo¹i enzyme kh¸c, nguån cung cÊp enzyme chuyÓn ho¸ fructose

cho c«ng nghiÖp chÕ biÕn FOS chñ yÕu là tõ vi sinh vËt.

Hidaka và çc céng sù là nh÷ng ngưêi ®Çu tiªn nghiªn cøu kh¶ n¨ng c«ng nghiÖp

ho¸ s¶n xuÊt FOS tõ ®ưêng kÝnh. ¤ng còng là ngưêi ®· ®ưa ra phư¬ng ph¸p x¸c ®Þnh ho¹t

lùc fructosyltransferase (FTS) và ®¹i lưîng biÓu thÞ mèi liªn quan gi÷a ho¹t lùc FTS và

hiÖu suÊt chuyÓn ho¸ sucrose thành FOS (tû lÖ ho¹t tÝnh chuyÓn ho¸ víi ho¹t tÝnh thuû



ph©n UT/U

H) mà cho tíi nay vÉn ®ưîc coi như là phư¬ng ph¸p c¬ së cho hÇu hÕt çc

nghiªn cøu liªn quan tíi FOS. B»ng nghiªn cøu cña m×nh Hidaka ®· t×m ra nhiÒu chñng vi

sinh vËt thuéc çc loài như Aspegillus awamori, Saccharomices cerivisiae, Aspegillus

niger… cã kh¶ n¨ng tæng hîp FTS. Th«ng qua qu¸ tr×nh ph©n lËp, tuyÓn chän theo ho¹t

lùc chuyÓn ho¸ và tû lÖ ho¹t tÝnh chuyÓn ho¸ víi ho¹t tÝnh thuû ph©n (UT/U

H), t¸c gi¶ ®·

kh¼ng ®Þnh nÊm mèc Asp. niger là nguån vi sinh vËt tèt nhÊt cho lªn men tæng hîp FTS.

Kh¶ n¨ng sinh tæng hîp FTS cña Aureobasidium pullulans còng ®ưîc Jung K.H và

çc céng sù nghiªn cøu. T¸c gi¶ này ®· kÕt luËn r»ng sucrose là nguån carbon lý tưëng

cho lªn men sinh tæng hîp FTS và hiÖu suÊt tæng hîp FTS cña chñng vi sinh vËt trªn t¨ng

tû lÖ thuËn víi nång ®é sucrose trong m«i trưêng lªn men. Khi nghiªn cøu thu nhËn FTS

tõ F.oxysporum, t¸c gi¶ ngưêi Anh Patel V. và çc céng sù cßn ®i ®Õn kÕt luËn r»ng qu¸

tr×nh lªn men cña vi sinh vËt trong m«i trưêng chøa sucrose cã sù tæng hîp FTS mang ho¹t

tÝnh invertase và ho¹t tÝnh chuyÓn ho¸. N¨m 1992 Bo Jiang ®· ph©n lËp ®ưîc mét chñng

Asp. niger AS0023 cã kh¶ n¨ng tæng hîp FTS víi ho¹t lùc cao. Ngoài ra cßn rÊt nhiÒu t¸c

gi¶ kh¸c như Hayashi ®· nghiªn cøu chän ra chñng Aureobasidium sp. dïng ®Ó sinh tæng

hîp FTS cho s¶n xuÊt FOS. Jung và Smith còng cã çc c«ng bè vÒ kh¶ n¨ng sinh FTS cña

loài Aureobasidium pullulans. Van Balken ®· nghiªn cøu thành c«ng qu¸ tr×nh tæng hîp

FTS tõ Aspegillus phoenicis và ®· øng dông ®Ó s¶n xuÊt FOS ®¹t ®é tinh khiÕt 60%. Fujita

®· ph¸t hiÖn gièng A. bacterium còng cã kh¶ n¨ng tæng hîp FTS. GÇn ®©y Takeda cßn t×m

ra lo¹i mèc Scopulariosis brevicaulis cã kh¶ n¨ng tæng hîp FTS chØ xóc t¸c t¹o ®ưêng 1-

kestose. Ngoài ra çc vi sinh vËt kh¸c như A.japonicus, Penicillium rigolosum,

Acetobacter diazotrokicus SRT4 còng cã kh¶ n¨ng tæng hîp FTS, çc vi sinh vËt này ®·

®ưîc nghiªn cøu và øng dông trong c«ng nghiÖp s¶n xuÊt FOS.

Mét ®Æc ®iÓm chung cho tÊt c¶ çc kÕt qu¶ nghiªn cøu trªn cho thÊy, hÇu hÕt FTS

trong çc vi sinh vËt t×m ®ưîc chñ yÕu là enzyme néi bào và lu«n chøa ®ång thêi c¶ hai

ho¹t tÝnh là thuû ph©n và chuyÓn ho¸. Tû lÖ ho¹t lùc cña hai ho¹t tÝnh trªn thay ®æi phô

thuéc vào chñng lo¹i gièng và ®iÒu kiÖn lªn men, ®iÒu kiÖn ph¶n øng… [18].



FTS được sản xuất bằng cách lên men chìm hiếu khí với một số chủng nấm. Các

thông số của quá trình lên men như độ thoáng khí, khuấy đảo, pH và nhiệt độ cần được

xác định cho từng loại vi sinh vật. Điều kiện chung cho tổng hợp FTS thông qua nuôi cấy

vi sinh vật trong môi trường đã được nghiên cứu kĩ. Ví dụ như sucrose là nguồn carbon

tốt nhất cho sự phát triển sinh khối và hoạt động của enzyme. pH cần duy trì lớn hơn 5.5

và nhiệt độ tối ưu cho tế bào sinh trưởng là khoảng 300C. Ở Aureobasidium sp., enzyme

nội bào sau đó được tiết ra ngoài môi trường. Hoạt động của enzyme nội bào được kích

thích mạnh khi tăng nồng độ ion Mg2+. Khi hàm lượng sucrose trong môi trường bị giới

hạn, FOS sẽ được sử dụng làm nguồn cung cấp carbon. Sau 6h nuôi cấy với 20% sucrose,

khoảng 55% (w/w) FOS được tạo thành. Tế bào vi sinh vật sau đó được loại ra khỏi canh

trường bằng cách ly tâm và enzyme được chiết tách nhờ lysozyme hoặc có thể cố định số

tế bào vi sinh vật chứa enzyme đó và đưa vào sản xuất FOS [58].

2.1.6.2. Nghiªn cøu và s¶n xuÊt FOS 50 (FOS phæ th«ng)

HiÖn nay ë NhËt, Trung Quèc, Hàn Quèc, Mü và çc nưíc kh¸c, FOS ®· ®ưîc s¶n

xuÊt ë qui m« c«ng nghiÖp và hàng n¨m cho ra thÞ trưêng hàng ngàn tÊn s¶n phÈm. Th«ng

thưêng FOS phæ th«ng ®ưîc s¶n xuÊt theo phư¬ng thøc liªn tôc và kh«ng liªn tôc. Trong

phư¬ng thøc s¶n xuÊt liªn tôc c«ng nghÖ cè ®Þnh enzyme hoÆc cè ®Þnh tÕ bào ®ưîc sö

dông, cßn ®èi víi phư¬ng thøc s¶n xuÊt kh«ng liªn tôc th× sö dông enzyme ®· chiÕt t¸ch.

Gi¶i ph¸p cè ®Þnh enzyme và cè ®ịnh tÕ bào trong s¶n xuÊt FOS cho hiÖu qu¶ cao h¬n v×

s¶n xuÊt ®ưîc liªn tôc, tiªu hao n¨ng lưîng Ýt, nhà xưëng nhá… nhưng tÝnh æn ®Þnh kÐm

và cÇn m¸y mãc thiÕt bÞ hiÖn ®¹i, nhà xưëng tiªu chuÈn. MÆc dï vËy, ®©y l¹i là phư¬ng

ph¸p cã kh¶ n¨ng c«ng nghiÖp ho¸ cao và ®ưîc tËp trung nghiªn cøu nhiÒu ë çc nưíc cã

nÒn c«ng nghiÖp ph¸t triÓn như NhËt B¶n, Trung Quèc, Hàn Quèc…

Phư¬ng thøc kh«ng liªn tôc trong s¶n xuÊt FOS ®ßi hái ph¶i trang bÞ thªm mét c«ng

®o¹n trÝch ly enzyme và làm s¹ch t¹p chÊt sau qu¸ tr×nh chuyÓn ho¸. Bï l¹i kü thuËt s¶n

xuÊt l¹i ®¬n gi¶n và thiÕt bÞ còng rÎ tiÒn h¬n. Phư¬ng ph¸p này ®ưîc sö dông nhiÒu ë çc

qui m« nhá, ®Çu tư thÊp. Nghiªn cøu c«ng nghÖ này cã Yun, J. W., theo phư¬ng ph¸p này



t¸c gi¶ ®· kÕt hîp FTS víi çc enzyme kh¸c s¶n xuÊt ra FOS cã ®é tinh khiÕt cao tíi 98%.

Ngoài hai gi¶i ph¸p trªn hiÖn nay ngưêi ta cßn dïng phư¬ng ph¸p ®¬n gi¶n, víi phư¬ng

ph¸p này tÕ bào vi sinh vËt ®ưîc sö dông như mét nguån enzyme. Phư¬ng ph¸p ®¬n gi¶n

này ®ang ®ưîc dïng trong mét sè nhà m¸y ë Trung Quèc.

Çc c«ng bè kÕt qu¶ nghiªn cøu vÒ cè ®Þnh enzyme ®Ó s¶n xuÊt FOS rÊt nhiÒu. §iÓn

h×nh cã Hayashi S., t¸c gi¶ này ®· cè ®Þnh FTS tæng hîp tõ A. pullulans sp ®Ó s¶n xuÊt

FOS. Ngoài ra Yun J.W., mét t¸c gi¶ ngưêi Hàn Quèc còng ®· nghiªn cøu thành c«ng

c«ng nghÖ s¶n xuÊt FOS liªn tôc b»ng phư¬ng ph¸p cè ®Þnh FTS trªn çc h¹t nhùa trao ®æi

ion. §èi víi c«ng nghÖ cè ®Þnh tÕ bào, Jiang Bo ®· t×m ra chÊt mang thÝch hîp cho cè ®Þnh

tÕ bào ph¸t triÓn Asp. niger AS0023 ®Ó s¶n xuÊt FOS là calcium alginate. T¸c gi¶ sau ®ã

còng ®· x¸c ®Þnh ®ưîc çc th«ng sè kü thuËt thÝch øng cho qu¸ tr×nh chuyÓn ho¸ FOS tõ

sucrose trªn cét ph¶n øng [b,i].

Phương pháp cố định enzyme thoạt đầu có vẻ có nhiều ưu điểm hơn là cố định tế

bào nhờ phương pháp cố định đơn giản và năng suất thể tích cao hơn do quá trình tổng

hợp diễn ra nhanh hơn. Tuy nhiên, tế bào cố định có ưu điểm là ổn định hơn trong quá

trình hoạt động. Chọn lựa phương pháp cố định enzyme hay tế bào cũng còn đang là vấn

đề tranh cãi do cả năng suất và độ ổn định đều là yếu tố cần thiết trong sản xuất công

nghiệp [58].

Quy trình chung cho sản xuất FOS nhờ FTS tổng hợp từ vi sinh vật qua các bước

như hình 2.5 [50]



Hình 2.5: Quy trình sản xuất FOS từ FTS vi sinh vật [50]



Quy trình sản xuất FOS thương mại theo phương pháp liên tục và không liên tục

được trình bày trên sơ đồ 2.1

Hình 2.6: Sơ đồ quy trình sản xuất FOS liên tục và không liên tục [58]

Canh trường nuôi cấy tế bào

Tách chiết enzyme Cố định tế bào

Phản ứng enzyme Thiết bị phản ứng cột

Dung dịch sucrose

Tinh sạch

Cô đặc

Thanh trùng

Sản phẩm



2.1.6.3. Nghiªn cøu và s¶n xuÊt FOS cao ®é

Qu¸ tr×nh chuyÓn hãa sucrose thành FOS phæ th«ng dưíi t¸c dông cña FTS cã thÓ

biÓu diÔn mét çch tæng qu¸t như sau:

GF + GF G + GF + GF2 + GF3 + GF4

Sucrose Sucrose Glucose Sucrose FOS

Qua phư¬ng tr×nh ph¶n øng ta thÊy, ngoài FOS ra, s¶n phÈm thu ®ưîc cßn chøa mét

lưîng glucose nhÊt ®Þnh. §ưêng glucose xuÊt hiÖn trong ph¶n øng kh«ng nh÷ng làm gi¶m

®é tinh khiÕt cña FOS mà cßn øc chÕ ho¹t tÝnh cña enzyme. V× chÊt øc chÕ này mà ta chØ

thu ®ưîc dÞch ®ưêng phæ th«ng cã nång ®é FOS kh«ng qu¸ 55% cßn l¹i h¬n 45% là

sucrose và glucose. V× thÕ muèn thu ®ưîc FOS cã ®é tinh khiÕt cao (FOS cao ®é) hoÆc

FOS tinh khiÕt, cÇn thiÕt ph¶i t¸ch bá hoÆc chuyÓn ho¸ lưîng glucose và sucrose cßn sãt

l¹i. Cho tíi nay çc phư¬ng ph¸p tinh sạch ®ưîc ¸p dông chñ yÕu bao gåm:

Läc gel: ë NhËt gÇn ®©y phư¬ng ph¸p này ®· ®ưîc ®ưa vào ¸p dông ë qui m« c«ng

nghiÖp. Dùa trªn nguyªn lÝ cña sù kh¸c nhau vÒ kÝch cì ph©n tö cña çc cÊu tö ph©n t¸n

trong dÞch mà ngưêi ta ph©n li ®ưîc riªng rÏ tõng lo¹i ®ưêng, nhê ®ã cã thÓ t¸ch, lo¹i bá

glucose ra. Phư¬ng ph¸p này cÇn cã hÖ thèng thiÕt bÞ tinh läc ®ång bé ®¾t tiÒn do ®ã hiÖu

qu¶ kinh tÕ kh«ng cao.

Läc Nano: §©y là mét phư¬ng ph¸p míi, sö dông kü thuËt thÈm thÊu ngưîc, cã

nhiÒu tÝnh ưu viÖt rÊt phï hîp víi qui m« c«ng nghiÖp [11].

Phư¬ng ph¸p trao ®æi ion: trong phư¬ng ph¸p này çc ®ưêng thành phÇn ®ưîc ph©n

li khi ®i qua cét cã chøa çc h¹t nhùa trao ®æi ion. Nhê ®ã ta cã thÓ t¸ch glucose và

sucrose ra khái dÞch FOS.

Dïng c«ng nghÖ lªn men: Phư¬ng ph¸p này ®ưîc thùc hiÖn th«ng qua viÖc sö dông

vi sinh vËt ®Ó lªn men glucose cã trong dung dÞch, lo¹i vi sinh vËt hay ®ưîc dïng là nÊm

men. Phư¬ng ph¸p này ®ưîc sö dông rÊt nhiÒu bëi nã cho hiÖu qu¶ kinh tÕ cao, tuy thÕ nã

còng cßn tån t¹i là s¶n phÈm FOS bÞ nhiÔm bÈn và g©y mïi vÞ l¹.



Dïng c«ng nghÖ enzyme: Cã hai lo¹i enzyme ®ưîc sö dông ®Ó ph©n gi¶i glucose là

glucoseisomerase (GI) và glucooxidase (GOD).

• Sö dông enzyme GI: Trong phư¬ng ph¸p này enzyme GI cã vai trß trong chuyÓn

ho¸ glucose cã trong dÞch thành fructose. VÒ lÝ thuyÕt fructose míi sinh ra l¹i g¾n

kÕt víi sucrose ®Ó t¹o thành FOS. Nhưng trong thùc tÕ thÝ nghiÖm cho thÊy

fructose míi t¹o ra kh«ng cã kh¶ n¨ng g¾n kÕt víi sucrose, kestose hoÆc nystose.

V× thÕ trong phư¬ng ph¸p này chØ cã thÓ làm gi¶m glucose trong dÞch thñy ph©n

chø kh«ng n©ng cao ®é tinh khiÕt cña dÞch FOS ®ưîc.

• Sö dông enzyme GOD: B»ng çch này enzyme GOD cã nhiÖm vô ph©n gi¶i

glucose thành acid gluconic. §©y là lo¹i enzyme ®ưîc coi là cã hiÖu qu¶ nhÊt

trong viÖc chuyÓn ho¸ glucose trong s¶n xuÊt FOS cao độ (có thể đến 98%).

Còng như trong s¶n xuÊt FOS phæ th«ng, c«ng nghÖ s¶n xuÊt FOS tinh khiÕt cã

thÓ thùc hiÖn b»ng hai phư¬ng ph¸p là cè ®Þnh và kh«ng cè ®Þnh enzyme (tÕ bào).

§¹i ®a sè çc nghiªn cøu ®· chän hÖ enzyme FTS, GOD và catalase (CAT), cè ®Þnh

trªn chÊt mang như calcium alginate và h¹t trao ®æi ion råi ®ưîc nhåi vào cét ph¶n

øng. Víi c«ng nghÖ này Yun, J. W. ®· liªn tôc s¶n xuÊt ®ưîc FOS cã ®é tinh khiÕt

cao h¬n 90%. Jiang Bo cßn kÕt hîp cè ®Þnh tÕ bào nÊm mèc AS0023 víi GOD và GI

®Ó s¶n xuÊt FOS ®¹t ®é tinh khiÕt 72%. Cßn Lamia b»ng phư¬ng ph¸p kh«ng liªn tôc

còng dïng hÖ enzyme GOD và CAT ®Ó s¶n xuÊt FOS cao ®é. T¸c gi¶ ®· t×m ®ưîc ra

®iÒu kiÖn tèi ưu cho ho¹t ®éng cña hÖ enzyme trªn và ®· n©ng cao ®ưîc ®é tinh khiÕt

cña FOS phæ th«ng tõ 50% lªn 82% [18, 57, 58].

2.1.7. Giíi thiÖu các enzyme trong sản xuất FOS

2.1.7.1. Enzyme fructosyltransferase (FTS)

FTS là tªn gäi chung cho çc enzyme cã ho¹t tÝnh xóc t¸c qu¸ tr×nh chuyÓn dÞch gèc

fructose. Qu¸ tr×nh trªn cã thÓ x¶y ra theo hai çch là c¾t kh«ng g¾n và c¾t råi g¾n. Kh¶

n¨ng xóc t¸c c¾t kh«ng g¾n cña enzyme là ho¹t tÝnh thuû ph©n (viÕt t¾t là UH) , cßn kh¶

n¨ng c¾t råi g¾n là ho¹t tÝnh chuyÓn ho¸ (viÕt t¾t là UT).



Nhiều nhà nghiên cứu vẫn gọi tên loại enzyme dùng sản xuất FOS là β-D-

fructofuranosidase, một loại enzyme thuộc nhóm thủy phân kí hiệu EC.3.2.1.26. Nguyên

nhân có thể là do hoạt tính chuyển gốc fructose ban đầu được phát hiện ở enzyme

invertase khi tiến hành thí nghiệm với mẫu có nồng độ sucrose cao. Trong khi đó số khác

lại gọi enzyme này là fructosyltransferase, kí hiệu EC.2.4.1.9, nhằm phân biệt với các

enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân khác [58].

Phô thuéc vào vÞ trÝ g¾n çc gèc fructose lªn chÊt nhËn, enzyme này ®ưîc ph©n ra

nhiÒu lo¹i víi çc tªn gäi kh¸c nhau như: 6G-fructosyltransferase (6G-FT), 6F-

fructosyltransferase (6F-FT) và 1F-fructosyltransferase (1F-FT). Çc enzyme trªn xóc t¸c

lªn ph©n tö sucrose t¹o ra çc lo¹i FOS cã ph©n tö lưîng như nhau nhưng kh«ng gièng

nhau vÒ cÊu tróc ph©n tö. Ba enzyme 6G-FT , 6F-FT và 1F-FT xóc t¸c g¾n vào ph©n tö

®ưêng ë çc vÞ trÝ kh¸c nhau t¹o ra çc ®ưêng tư¬ng øng.

Çc FTS cã nguån gèc tõ thùc vËt chØ cã ho¹t tÝnh UT, nhưng mang tÝnh ®Æc hiÖu c¬

chÊt tư¬ng ®èi (g¾n gèc fructose vào ph©n tö ®ưêng sucrose kh¸c ë nhiÒu vÞ trÝ kh¸c

nhau). Kh¸c víi enzyme tæng hîp tõ vi sinh vËt, FTS trong thùc vËt cã ph©n tö lưîng nhá

h¬n và trong ph©n tö kh«ng chøa nhãm glucoside. NhiÖt ®é thÝch hîp cho ho¹t ®éng cña

chóng là 300C – 450C [18].

Trong khi ®ã FTS cã nguån gèc tõ vi sinh vËt l¹i cã c¶ hai lo¹i ho¹t tÝnh UT và UH

nhưng ho¹t tÝnh g¾n l¹i cã tÝnh ®Æc hiÖu c¬ chÊt gÇn như tuyÖt ®èi. Enzyme FTS cã nguån

gèc kh¸c nhau còng kh¸c nhau vÒ cÊu t¹o ho¸ häc. FTS tæng hîp tõ vi sinh vËt là nh÷ng

enzyme ®a cÊu tö, cã ph©n tö lưîng cao (>10.000 Da), trong ph©n tö cã chøa çc nhãm

glucoside. NhiÖt ®é ho¹t ®éng thÝch hîp cña enzyme này là 500C – 600C, rộng hơn so với

enzyme từ thực vật, pH thÝch hîp là 5 - 6.5 và nồng độ sucrose từ 700-850g/l [58].

Một số chất ức chế và xúc tác hoạt động chuyển hóa của FTS cũng được nghiên cứu.

Ở loài cây Agave americana, FTS được xúc tác bởi các ion Ca2+, Mg2+, Co và Li+ và bị ức

chế bởi Ag+, Pb, Hg, Al3+ và Sn. Trong khi đó, enzyme sản xuất bởi loài nấm sợi

Aureobasidium sp. bị ức chế bởi Hg, Cu và Pb [58].



FTS là lo¹i enzyme ®Æc hiÖu, nã chØ cã thÓ t¸c dông xóc t¸c ph©n c¾t và g¾n kÕt gèc

fructose trong ph©n tö sucrose hoÆc c¸c dÉn xuÊt cña sucrose ®Ó t¹o thành FOS. Cßn ë

trong dung dÞch chØ cã fructose và glucose th× enzyme này kh«ng cã kh¶ n¨ng xóc t¸c t¹o

FOS.

Một đơn vị hoạt tính của FTS được tính là lượng enzyme chuyển hóa 1 μmol

fructose trong 1 phút. Cơ chế chung cho phản ứng chuyển hóa gốc fructose như sau:

GF + fructosyltransferase → F – fructosyltransferase + G

F-fructosyltransferase + GF → GF2 + fructosyltransferase

Hình 2.6 cho thấy cơ chế xúc tác phản ứng tạo các FOS từ sucrose của

fructosyltransferase thu từ A.pullulans.

Hình 2.7: Cơ chế chuyển hóa tạo FOS từ sucrose của FTS A.pullulans [58]

G, GF, GF2, GF3, GF4 lần lượt là glucose, sucrose, 1-kestose, nystose, 1F-

fructofuranosylnystose.



2.1.7.2. Giíi thiÖu vÒ enzyme glucooxidase (GOD)

Çc nghiªn cøu vÒ cÊu t¹o và ®Æc tÝnh cña enzyme GOD ®· ®ưîc A. Crueger và

W.Crueger thùc hiÖn n¨m 1990. Çc t¸c gi¶ ®· kÕt luËn enzyme GOD là hîp chÊt

glucoprotein, cã ph©n tö lưîng kho¶ng 155.103 DA. GOD chøa 2 ph©n tö FAD và 16%

khèi lưîng ph©n tö là carbohydrate (mannose, galactose và glucosamine dưíi d¹ng N-

acetyl). M¹ch carbohydrate trong ph©n tö GOD kh«ng tham gia xóc t¸c và cÊu t¹o cña nã

cho tíi nay còng chưa ®ưîc nghiªn cøu râ ràng.

Enzyme GOD sinh tæng hîp tõ A. niger cã cÊu t¹o bëi 583 acid amin. §iÓm ®¼ng

®iÖn cña enzyme này là pH 4.2. Enzyme GOD cã tÝnh ®Æc hiÖu rÊt cao, chØ cÇn mét thay

®æi nhá trong cÊu tróc th× ho¹t lùc oxy hãa cña enzyme ®· kh¸c h¼n nhau, vÝ dô gèc

glucose trong ph©n tö enzyme ë d¹ng β - D glucose cã ho¹t tÝnh oxy hãa m¹nh h¬n α - D

glucose 157 lÇn. Enzyme GOD cßn cã mét ®Æc tÝnh quan träng là rÊt an toàn vÒ mÆt thùc

phÈm.

Ph¶n øng oxy ho¸ cña glucose dưíi xóc t¸c cña enzyme GOD ®ưîc thùc hiÖn theo

çc phư¬ng tr×nh biÓu diÔn ë h×nh 2.7.

Theo phư¬ng tr×nh ph¶n øng ta thÊy, ®Çu tiªn glucose dưíi t¸c dông cña enzyme

GOD bÞ oxy ho¸ t¹o thành β-D-glucolacton, sau ®ã tù ph©n thành acid gluconic. Sù t¹o

thành acid gluconic sÏ làm gi¶m pH cña m«i trưêng, nªn trong qu¸ tr×nh ph¶n øng ph¶i

®ång thêi bæ sung kiÒm ®Ó ®iÒu chØnh pH (phư¬ng ph¸p potentionmetric).

Theo c¬ chÕ ho¹t ®éng cña enzyme GOD th× qu¸ tr×nh oxy ho¸ glucose lu«n cã sù

h×nh thành H2O2., chÝnh s¶n phÈm phô này l¹i øc chÕ ho¹t ®éng cña enzyme GOD.



Hình 2.8: Quá trình oxy hóa glucose dưới tác dụng của enzyme GOD [18]

VÒ ¶nh hưëng cña H2O2 trong ph¶n øng oxy ho¸ glucose ®· ®ưîc nhiÒu t¸c gi¶

nghiªn cøu như Kleppe, Bourdillon, Tse và Googh. C¸c kÕt qu¶ ®Òu cho thÊy ho¹t lùc cña

GOD gi¶m tû lÖ víi sù t¨ng cña nång ®é H2O2. Và v× thÕ trong s¶n xuÊt FOS nÕu chØ dïng

mét enzyme GOD th× ta chØ cã thÓ chuyÓn hãa ®ưîc mét phÇn nhÊt ®Þnh lưîng glucose

sinh ra và ®é tinh khiÕt cña FOS còng sÏ bÞ h¹n chÕ ë møc thÊp. KÕt qu¶ nghiªn cøu cña

Lamia cho thÊy mÆc dï ®· dïng nhiÒu phư¬ng pháp ®Ó c¶i thiÖn ®iÒu kiÖn ph¶n øng oxy

hãa glucose cã enzyme GOD xóc t¸c nhưng hàm lưîng FOS trong s¶n phÈm kh«ng thÓ

vưît qu¸ 61.26 % và lưîng glucose bÞ chuyÓn hãa chØ h¹n chÕ trong kho¶ng 16%. Ho¹t

lùc cña enzyme GOD lu«n biÓu hiÖn gi¶m m¹nh sau 5 giê ph¶n øng.

§Ó gi¶i quyÕt tån t¹i trªn, cÇn thiÕt ph¶i lo¹i bá nh©n tè øc chÕ enzyme GOD là

H2O2. §iÒu này cã thÓ tiÕn hành b»ng c¸ch bæ sung thªm mét lo¹i enzyme kh¸c cã kh¶

n¨ng chuyÓn hãa H2O2 ®ã là catalase (CAT). Qu¸ tr×nh oxy hãa glucose dưíi t¸c dông cña

hÖ enzyme GOD- CAT ®ưîc thÓ hiÖn theo phư¬ng tr×nh ph¶n øng ë h×nh 2.8. [18, 57]



Hình 2.9: Phản ứng oxy hóa glucose dưới tác dụng của hệ 2 enzyme GOD và CAT [18]

2.1.8. TiÒm n¨ng cho s¶n xuÊt FOS t¹i ViÖt Nam

ViÖt Nam là mét nưíc cã ngành c«ng nghiÖp mÝa ®ưêng ph¸t triÓn tõ rÊt sím. Thùc

hiÖn chñ trư¬ng và chÝnh s¸ch cña chÝnh phñ, ®Õn n¨m 2000 ®· cã 47 nhà m¸y trrªn toàn

quèc ®i vào ho¹t ®éng và s¶n lưîng ®ưêng ®¹t tíi mét triÖu tÊn. C©y mÝa cã thÓ trång ë tÊt

c¶ çc ®Þa danh toàn quèc. Çc vïng tËp trung trång mÝa nhiÒu là çc tØnh thuéc B¾c Trung

Bé, Nam Trung Bé, §«ng Nam Bé và §ång B»ng S«ng Cöu Long. S¶n lưîng mÝa và

®ưêng mÝa hàng n¨m kh«ng ngõng ®ưîc n©ng cao. Qu¸ tr×nh t¨ng trưëng cña ngành c«ng

nghiÖp mÝa ®ưêng tõ n¨m 1998 ®Õn n¨m 2001 ®ưîc tr×nh bày trªn b¶ng 2.5

Sè liÖu thèng kª trªn b¶ng 2.5 cho thÊy ViÖt Nam cã s¶n lưîng ®ưêng mÝa tư¬ng ®èi

cao, ®ã là nguån nguyªn liÖu dåi dào cho ngành s¶n xuÊt FOS, mét mÆt hàng chưa ®ưîc

ph¸t triÓn trong thÞ trưêng néi ®Þa.



Bảng 2.5: Diễn biến tăng trưởng của ngành công nghiệp mía đường trên toàn quốc Năm 1998 1999 2000 2001

Sản lượng mía

(nghìn tấn)

13843.5 17760.3 15044.3 14325.4

Sản lượng đường

(nghìn tấn)

736.0 947.3 1208.7 1957.8

Diện tích trồng mía

(nghìn hecta)

283.0 344.2 302.3 291.0

[18]

Cïng víi nguån nguyªn liÖu dåi dào, ViÖt Nam cßn cã nguån nh©n lùc lín, cã tr×nh

®é khoa häc ®Ó làm chñ c«ng nghÖ sinh häc nãi chung và chÕ biÕn thùc phÈm nãi riªng.

V× vËy viÖc më ra mét ngành s¶n xuÊt míi sö dông c«ng nghÖ hiÖn ®¹i ®Ó t¹o nªn s¶n

phÈm FOS víi nhiÒu ®Æc tÝnh ưu viÖt, cã gi¸ trÞ cao h¬n ®ưêng kÝnh vÒ ®Æc tÝnh chøc n¨ng,

cung cÊp cho thÞ trưêng trong nưíc và xuÊt khÈu, làm nguyªn liÖu cho c¸c s¶n phÈm chøc

n¨ng như b¸nh kÑo, thùc phÈm cho ngưêi m¾c bÖnh tiÓu ®ưêng, s÷a và bét dinh dưìng

cho trÎ em… là cÇn thiÕt và hoàn toàn kh¶ thi.



2.2. Thu nhận và tinh sạch enzyme β-fructofuranosidase từ chủng nấm mốc

Aspergillus niger IMI303386 [43]

2.2.1. Tóm tắt nghiên cứu

Enzyme nội bào β-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26) thu nhận từ Aspergillus niger

IMI303386 được tinh sạch để đạt đến độ đồng nhất bằng phương pháp điện di SDS-

PAGE với chất tạo tủa (NH4)2SO4, sắc ký trao đổi ion DEAE Sepharose và lọc gel

Ultrogel AcA44. Quy trình này đem lại độ tinh sạch gấp 50 lần và hiệu suất thu hồi

enzyme là 42%. Khối lượng phân tử β-fructofuranosidase thu được nằm trong khoảng 120

– 130 kDa. Phân tích tại điểm đẳng điện nhận thấy enzyme này gồm 2 loại protein. pI của

2 loại protein này là 5.4 và 4.4. Ba2+, Mg2+, Ca2+ và sodium-EDTA đóng vai trò là các

chất hoạt hóa trong khi Hg2+, Ag+ và Ni2+ là các chất ức chế mạnh hoạt động của enzyme

β-fructofuranosidase. Enzyme β-fructofuranosidase hoạt động ổn định trong khoảng pH

từ 4 – 8 và đạt tối ưu tại pH 5.5. Nhiệt độ tối ưu của enzyme là 500C và có thể hoạt động

ổn định tới 550C. Trên 90% hoạt tính của enzyme vẫn được giữ lại sau 5h lên men. β-

fructofuranosidase thu từ Aspergillus niger IMI 303386 là một glycoprotein với 17% hàm

lượng carbohydrate.

2.2.2. Nguyên liệu và phương pháp

Nguyên liệu:

Giống A. niger IMI 303386 được mua từ Viện nấm quốc tế (International

Mycological Institute), Surrey, UK và được lưu giữ trên môi trường agar dextrose khoai

tây.

Cột trao đổi ion resin DEAE-Sepharose và bộ kit xác định pI từ Pharmacia (Uppsala,

Thụy Điển).

Thang chuẩn cho điện di SDS-PAGE từ Bio-Rad Laboratories (CA, USA).

Ultrogel AcA44 từ Biosep (CA, USA).

Tất cả các hóa chất sử dụng khác đều được phân tích và mua từ nguồn thương mại

có sẵn.



Nuôi cấy A. niger và thu nhận β-fructofuranosidase:

Cho 5ml nước cất vô trùng vào ống thạch nghiêng chứa giống A. niger IMI 303386

trên môi trường agar dextrose khoai tây để chuẩn bị dịch treo bào tử. 5ml dịch bào tử sau

đó được cấy truyền vào bình 250ml chứa 100ml môi trường nuôi cấy gồm các chất tỉ lệ

(w/v): 1% glucose, 1% dịch chiết nấm men, 2% NaNO3, 0.05% MgSO4. 7H2O, 0.5%

K2HPO4. pH môi trường được điều chỉnh đến 7.4 trước khi đem hấp. Canh trường được ủ

trong 24h ở 280C với chế độ lắc 200 vòng/phút. Tiếp sau đó, cho 15ml dịch chứa hệ sợi

nấm vào 5 bình 1lít chứa sẵn 300ml môi trường với tỉ lệ (w/v) các chất như sau: 2%

sucrose, 0.4% L-asparagine, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4. 7H2O, 0.01% CaCl2. Các bình

sau đó được lên men trong 48h ở 280C, chế độ lắc 200 vòng/phút.

Thu nhận enzyme:

Sau 48h lên men, hệ sợi nấm được thu nhận bằng cách lọc qua giấy lọc Whatman

No.1 và rửa nhiều lần với đệm phosphate 0.1M, pH 6.5. Sau đó sợi nấm được nghiền với

lượng cát gấp đôi và lượng tối thiểu dd đệm. Sau khi sợi nấm được nghiền đồng đều thì

đem ly tâm ở chế độ 15000 × g trong 20 phút và thu nhận dịch enzyme thô là phần nổi.

Phân tích hoạt tính enzyme:

Hoạt tính thủy phân và chuyển hóa:

3ml hỗn hợp phản ứng chứa 0.75ml đệm phosphate 0.2M pH 6.5, 1.5ml sucrose 5%

(w/v) và 0.65ml nước cất được ủ ở 500C trong 10 phút. Sau đó thêm vào 0.1ml enzyme đã

pha loãng với nồng độ thích hợp và tiếp tục ủ thêm 15 phút nữa. Phản ứng kết thúc khi đặt

các ống nghiệm vào nồi polyethylene glycol 400 đun sôi trong 10 phút. Sau khi làm

nguội, lấy 2ml và 1ml mẫu phản ứng đi xác định hàm lượng đường khử và glucose lần

lượt theo phương pháp Somogyi/ Nelson và phương pháp glucose oxidase-peroxidase

(GOD/POD). 2 mẫu sau đó được đem đi so màu ở bước sóng 520nm, từ đó xác định hàm

lượng đường khử và glucose thông qua đường chuẩn. Hoạt tính thủy phân được xác định

bằng cách đo lượng đường khử tạo thành từ sucrose (R). Hoạt tính chuyển hóa xác định



bằng cách đo cả lượng đường khử và glucose (G) tạo thành từ sucrose. Hàm lượng

fructose tự do (F) và fructose chuyển hóa (F’) trong hỗn hợp phản ứng được xác định

bằng công thức:

F = R – G

F’ = G – F = 2G – R

Một đơn vị hoạt tính thủy phân được xác định là lượng enzyme cần thiết để giải

phóng 1μmol đường khử trong 1 phút.

Một đơn vị hoạt tính chuyển hóa được xem là số μmol fructose được chuyển nhóm

trong 1 phút.

Xác định hàm lượng protein:

Hàm lượng protein được ước lượng bằng cách đo độ hấp thu ở 280nm hoặc sử dụng

bộ kit phân tích protein của Pierce (USA).

Tinh sạch enzyme:

Tất cả các bước tinh sạch được tiến hành ở 40C sử dụng hệ thống FPLC của hãng

Pharmacia, Uppsala, Thụy Điển. Các phân đoạn sau đó được đem đi kiểm tra hàm lượng

protein ở 280nm và xác định hoạt tính enzyme.

Phân tích điện di:

Quy trình được mô tả bởi Laemmli. Protein được nhuộm với 0.25% Coomassie

brilliant blue G-250. Các chất sau được sử dụng làm dấu chuẩn (Bio-Rad): myosin (200

kDa), β-galactosidase (116.25 kDa), phosphorylase B (97 kDa), serum albumin (66.2

kDa), ovalbumin (45 kDa), carbonic anhydrase (31 kDa), chất ức chế trypsin (21.5 kDa),

lysozyme (14.4 kDa) và aprotinin (6.5 kDa). Gel agarose 1% được sử dụng để xác định

điểm đẳng điện pI của β-fructofuranosidase ở 40C trong khoảng pH 2.5 – 10.



Siêu lọc:

Quá trình siêu lọc được tiến hành trong bể nước đá nhằm cô đặc và thẩm tách dung

dịch enzyme, sử dụng hệ thống siêu lọc Amicon (USA) với màng lọc PM-10.

Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính enzyme:

Tiến hành khảo sát trong khoảng pH từ 2.0 – 11 để xác định ảnh hưởng của pH. Xác

định ảnh hưởng của nhiệt độ trong khoảng 25 – 750C ở pH 5.5.

Ảnh hưởng của ion kim loại và các hợp chất khác lên hoạt tính của enzyme:

Hòa tan 1mM các muối kim loại (HgCl2, ZnSO4, CuSO4, AgNO3, CoCl2, MnSO4,

FeSO4, BaCl2, CaCl2, MgSO4, NaN3, NiSO4), 10mM dd disodium-EDTA và 10mM urea

trong 50mM dd đệm phosphate pH 5.5. Sau đó đem phân tích hoạt tính enzyme như trên.

Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên tính ổn định của enzyme:

Xác định ảnh hưởng của pH: dd enzyme 8.5 U được đem ủ ở 400C. Các mẫu thí

nghiệm được ủ ở những khoảng thời gian khác nhau và đem xác định hoạt tính.

Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ: dd enzyme được đặt trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ

khác nhau trong khoảng 25 – 750C tại pH 5.5. Các mẫu thí nghiệm sau đó được đặt ngay

vào trong nước đá trước khi đem xác định hoạt tính.

Xác định hàm lượng carbohydrate của enzyme:

Phương pháp dùng phenol-sulfuric được mô tả bởi Dubois và cộng sự. 10μL dd

enzyme chứa 50μg protein (định lượng bởi phương pháp BCA) được pha loãng vào 1mL

nước cất. Thêm vào 1ml thuốc thử phenol và 5ml H2SO4. Khuấy đều hỗn hợp và làm

nguội xuống nhiệt độ phòng trước khi đo độ hấp thu ở 490nm. Hàm lượng carbohydrate

được xác định thông qua đường chuẩn xác định sẵn bởi glucose. Thí nghiệm tiến hành với

3 mẫu giống nhau.



2.2.3. Kết quả và bàn luận

Tinh sạch β-fructofuranosidase

Bảng 2.6: Kết quả tinh sạch β-fructofuranosidase từ A. niger IMI 303386

Phương pháp

tinh sạch

Protein tổng

(mg)

Hoạt tính

tổng (U)

Hoạt tính

riêng (U/mg)

Độ tinh

sạch

Hiệu suất

(%)

Enzyme thô 93.00 96.50 1.04 1 100.0

Kết tủa 43.60 86.40 1.98 1.9 89.5

DEAE-

Sepharose

1.76 73.04 41.50 40 75.7

Ultrogel

AcA44

0.78 40.30 51.67 49.8 41.8

[43]

40ml enzyme sau khi chiết tách chứa 93mg protein và hoạt tính chuyển hóa của

enzyme là 96.5U được tủa bằng (NH4)2SO4 độ bão hòa 80% trong bồn nước đá. Hỗn hợp

được giữ qua đêm ở 40C để tạo tủa. Lượng protein kết tủa được thu nhận sau khi ly tâm

15000 × g, 40C trong 20 phút và hòa tan với một lượng tối thiểu đệm phosphate 0.02M

(pH 6.5). Khoảng 90% hoạt tính tổng của β-fructofuranosidase được giữ lại sau quá trình

này với độ tinh sạch là 2 lần.

Toàn bộ số mẫu enzyme sau khi hòa tan vào đệm ở trên tiếp tục được nạp qua cột

sắc ký trao đổi ion DEAE Sepharose dòng chảy nhanh (25cm x 2.5cm) với hệ thống

FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) và đệm Natri acetate 50mM pH 5.5. Protein

bị giữ lại trên cột sẽ được tách rửa khỏi cột bằng đệm Natri acetate chứa 0.2% Natri azide

(NaN3) với gradien nồng độ 0 – 0.5mL NaCl trong 500ml thể tích dd đệm.



Hình 2.10: Sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose [43]

Theo hình 2.9 thì một lượng lớn protein tạp đã được tách loại và khoảng 75% hoạt

tính thủy phân của β-fructofuranosidase được thu hồi với độ tinh sạch là 5.7. Các phân

đoạn chứa peak được gộp lại và cô đặc nhờ phương pháp siêu lọc bằng màng chống thấm

10kDa, sau đó thẩm tách với đệm phosphate 0.02M pH 6.5.

Mẫu sau khi cô đặc được cho vào cột Ultogel AcA44 (90cm x 1.6cm) dùng đệm

phosphate 50mM pH 6.5 chứa 0.2% NaN3. Protein được rửa giải bằng đệm giống như vậy

với tốc độ dòng chảy 16mL/h.

Đo độ hấp thu ở bước sóng 280nm xác định được 2 protein thành phần và hoạt tính

enzyme tương ứng. Các phân đoạn chứa enzyme được gộp chung và cô đặc bằng phương

pháp lọc màng (Amicon UV 10). Độ tinh sạch enzyme khoảng 50 lần và hiệu suất thu hồi

hoạt tính enzyme tăng lên 42%.



Sau khi tiến hành qua 3 bước tinh sạch (tủa bằng amoni sulphate, sắc kí trao đổi ion

và lọc gel) thì enzyme β-fructofuranosidase đã đạt độ tinh sạch là 50 lần và hiệu suất thu

hồi hoạt tính là 42%.

Hình 2.11: Sắc ký lọc gel Ultrogel AcA44 của β-fructofuranosidase [43]

Các tính chất hóa lý của β-fructofuranosidase thu nhận từ A. niger:

Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy chỉ có một loại protein trong dd enzyme đem

phân tích. Enzyme sau đó được tinh sạch để đạt đến một độ đồng nhất biểu kiến. Khối

lượng phân tử của enzyme nằm trong khoảng 120 – 130 kDa.

Kết quả nghiên cứu của L’Hocine và cộng sự cho thấy A. niger AS0023 tạo ra 2

dạng enzyme: fructosyltransferase với khối lượng phân tử từ 81 – 168 kDa khi phân tích

SDS-PAGE và invertase khối lượng phân tử từ 71 – 111 kDa. Hirayama và cộng sự cũng



phân tích β-fructofuranosidase từ A. niger ATCC 20611 và cho kết quả khối lượng phân

tử dựa trên SDS-PAGE là 100 kDa, lọc gel là 340 kDa.

Như vậy có thể kết luận rằng β-fructofuranosidase thu nhận từ A. niger gồm ít nhất 2

thành phần có khối lượng phân tử như nhau. Khối lượng phân tử của một thành phần nằm

trong khoảng từ 40 – 200 kDa. Dựa trên kết quả phân tích điểm đẳng điện, β-

fructofuranosidase từ A. niger cho ra một vạch đậm ở pH 5.4 và vạch mờ hơn ở pH 4.4.

Hiện nay vẫn có rất ít thông tin về pI của invertase từ A. niger.

Hình 2.12: Kết quả điện di SDS-PAGE của β-fructofuranosidase [43]

M: Dấu chuẩn ; P: enzyme tinh sạch



Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính và tính ổn định của enzyme β-

fructofuranosidase:

β-fructofuranosidase thu nhận từ A. niger IMI 303386 có hoạt tính mạnh trong

khoảng 5.0 – 6.5 và tối ưu ở pH 5.5. Kết quả này gần với giá trị pH tối ưu của

frutctosyltransferase (pH 5.8) nhưng cao hơn invertase (pH 4.4) (Theo kết quả của

L’Hocine và cộng sự).

Hình 2.13: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính và độ ổn định của β-fructofuranosidase [43]

Dựa vào đồ thị trên hình 2.12, khoảng pH hoạt động ổn định của β-

fructofuranosidase từ A. niger là 4.0 – 8.0. Khi ủ enzyme ở 400C ở các giá trị pH này thì

ít nhất 90% hoạt tính của enzyme vẫn được giữ lại sau 5h. Enzyme bị mất hoạt tính nhanh

chóng ở các giá trị pH thấp hơn 4.0 hoặc cao hơn 8.0.



Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính và độ ổn định của enzyme β-

fructofuranosidase:

Trên hình 2.13 cho thấy enzyme hoạt động mạnh nhất ở 500C và mất hoạt tính nhanh

chóng khi tăng nhiệt độ cao hơn 600C. Sau 5h ủ ở pH 5.5, cho thấy β-fructofuranosidase

hoạt động ổn định ở nhiệt độ thấp hơn 600C. Hơn 90% hoạt tính của enzyme được giữ lại.

Kết quả này cho thấy các phản ứng chuyển hóa nên thực hiện trong khoảng nhiệt độ từ 50

– 550C.

Hình 2.14: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ ổn định của β-fructofuranosidase [43]



Ảnh hưởng của ion kim loại và các hợp chất khác lên hoạt động của β-

fructofuranosidase:

Kết quả ở bảng 2.7 chỉ ra khi thêm lần lượt 1mM Ba2+, Mg2+, Ca2+ và 10mM Natri-

EDTA, hoạt tính của enzyme mạnh hơn. Kết quả rõ nhất khi thêm 1mM MgSO4 (tăng

15%) và 10mM Natri-EDTA (tăng 17%). Hg2+, Zn2+, Ag+ và Ni2+ là các chất ức chế

mạnh. Khi thêm 1mM các ion này thì β-fructofuranosidase gần như mất hết hoạt tính. Khi

bổ sung 1mM Co2+ và Cu2+, enzyme mất 15 – 20% hoạt tính.

Bảng 2.7: Ảnh hưởng của các ion kim loại và hợp chất lên hoạt tính enzyme β-

fructofuranosidase của A. niger

Hợp chất (1mM) Hoạt tính còn lại (%)

Không bổ sung 100

HgCl2 2

ZnSO4 0

CuSO4 83

AgNO3 0

FeSO4 92

CoCl2 78

MnSO4 91

BaCl2 108

MgSO4 115

CaCl2 112

Natri-EDTA (10mM) 117

NaN3 98

NiSO4 15

Urea (10mM) 103

[43]



Hàm lượng carbohydrate của β-fructofuranosidase từ A. niger:

β-fructofuranosidase từ A. niger IMI 303386 là một glycoprotein với hàm lượng

carbohydrate là 17% xác định theo phương pháp phenol-H2SO4. Kết quả này phù hợp với

giả thuyết cho rằng enzyme từ nấm là glycoprotein với hàm lượng carbohydrate từ 2 –

20%.

2.3. Lên men tái sử dụng nhiều chu kì chủng Aspergillus oryzae CFR 202 thu nhận

enzyme fructosyltransferase và ứng dụng sản xuất đường fructooligosaccharide [49]


Tiến hành lên men chìm Aspergillus oryzae CFR 202 nhằm thu nhận

fructosyltransferase ứng dùng sản xuất FOS. Dạng pellet (cấu trúc búi sợi do hệ sợi nấm

cuộn xoắn lại trong quá trình lên men) của nấm mốc A. oryzae thu nhận sau 48h lên men

được bổ sung môi trường sau mỗi 24h và thu enzyme fructosyltransferase (FTS). Enzyme

thu được đem sử dụng cho quá trình sản xuất FOS với cơ chất là sucrose 60% ở nhiệt độ

550C, pH 5.15.

Hoạt tính enzyme FTS đuợc duy trì trong khoảng 15 ± 2U/ml/phút lên đến 6 chu kì

nuôi cấy. Hiệu suất tạo FOS là 53% ở chu kì thứ 6. Pellet không được tái sử dụng trên 6

chu kì do sau đó quá trình tự phân xảy ra. Hệ thống này mang nhiều lợi ích và có tính

kinh tế cao do không cần bổ sung thêm chất dinh dưỡng và không đòi hỏi phải nhân thêm

giống mới trước khi lên men.

Môi trường dùng để nhân giống đã được tối ưu trước đó. Với điều kiện phát triển tối

ưu, nấm sợi A. oryzae tạo thành dạng pellet chắc, tròn, ổn định trong suốt 90h lên men.

Dạng pellet có nhiều thuận lợi như nhỏ gọn, hệ sợi nấm không bị mắc vào thiết bị …

Enzyme FTS tạo ra bởi A. oryzae là enzyme ngoại bào. Sau khi kết thúc 1 chu kì lên

men thu enzyme trong 24h thì thu nhận dịch lên men, sinh khối nấm được thu nhận lại

bằng lọc để chuẩn bị cho chu kì lên men kế tiếp.




Hóa chất:

Tất cả hóa chất sử dụng đều được phân tích. Các loại đường FOS chuẩn 1-kestose,

1-nystose, 1-fructofuranosyl nystose được cung cấp bởi Wako Pure Chemical Industries,

Osaka, Nhật bản.

Chủng vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy:

Aspergillus oryzae CFR 202 được lấy từ bộ sưu tập CFTRI, Mysore. Giống được lưu

giữ trên môi trường agar dextrose khoai tây ở 40C.

Cấy giống:

Bào tử cấy 5 ngày trên ống thạch nghiêng được cấy truyền vào 100ml môi trường

chứa 1% sucrose và 0.2% dịch chiết nấm men (pH 5.5) trong các bình 500ml, đem hấp ở

1210C trong 15 phút. Sau đó các bình giống được ủ ở 30 ± 10C trên máy lắc vòng chế độ

250 vòng/phút trong 24h.

Sản xuất enzyme fructosyltransferase bằng lên men tái sử dụng tế bào:

Các bình giống sau khi ủ 24h thì được chuyển vào 100ml môi trường lên men chứa

10% sucrose, 0.8% dịch chiết nấm men, 1% NaNO3, 0.03% MgSO4. 7H2O, 0.4%

K2HPO4, 0.9% KH2PO4, 1% NH4Cl và 0.6% NaCl với pH ban đầu là 5 trong bình 500ml.

Các bình này sau đó lại đem ủ ở 30 ± 10C trên máy lắc vòng chế độ 250 vòng/phút. Quá

trình lên men kết thúc sau 48h. Dịch lên men được gạn ra trong điều kiện vô khuẩn. Môi

trường mới lại được bổ sung vào bình chứa pellet. Sau mỗi 24h, canh trường lại được gạn

ra và bổ sung môi trường mới. Quá trình lên men có thể tiếp tục trong 144h tiếp theo.

Canh trường gạn ra được kiểm tra pH, hoạt tính enzyme, và đưa vào sản xuất FOS.

Phân tích fructosyltransferase:

Hỗn hợp phản ứng chứa 1.5ml sucrose 60% (w/v) pha trong đệm citrate 0.1M và

0.5ml dịch enzyme thô. Thí nghiệm tiến hành ở 55 ± 10C trong 1h trong bể nước. Kết thúc



phản ứng bằng cách ngâm hỗn hợp trong nước sôi trong vòng 15phút. Glucose giải phóng

trong phản ứng được xác định bằng bộ kit glucose sử dụng phương pháp GOD/POD (Ấn

Độ). Một đơn vị hoạt tính fructosyltransferase được xác định là lượng enzyme cần để giải

phóng 1μmol glucose trong mỗi ml trong 1 phút dưới điều kiện phản ứng đã đề cập ở

trên.

Sản xuất FOS:

Hỗn hợp phản ứng (1.5ml sucrose 60% trong đệm citrate 0.1M pH 5.5 và 0.5ml dịch

enzyme thô) được ủ với điều kiện phản ứng nêu trên trong 18h. Sản phẩm sau đó được

phân tích bằng hệ thống HPLC của Nhật. Pha động là dung dịch acetonitrile : nước (tỉ lệ

3:1) với tốc độ chảy là 1.0ml/phút. Các mẫu sau đó được pha loãng nồng độ thích hợp và

lọc qua màng lọc Millipore có kích thước lỗ 0.45μm.


Sau 48h lên men thì pellet được tái sử dụng sau mỗi 24h để sản xuất FTS trong môi

trường mới. Trong quá trình đó, pH của dịch lên men tăng từ 5.0 – 6.03 sau 48h lên men.

Sau đó tiếp tục tăng lên 6.18 sau 96h lên men và giữ nguyên cho đến khi kết thúc lên men

trong 7 ngày (Hình 2.14)

Hoạt tính enzyme là 7.8U/ml/phút sau 48h lên men. Hoạt tính đạt giá trị cao nhất là

16.5U/ml/phút sau 2 chu kì liên tiếp và giảm còn 11.9U/ml/phút ở cuối chu kì 6 (hình

2.15).



Hình 2.15: Sự thay đổi pH và hoạt tính FTS trong quá trình nuôi cấy nhiều chu kì A.

oryzae CFR 202 [49]

Hình 2.16: Hàm lượng FOS sinh ra bởi FTS qua các chu kì nuôi cấy A. oryzae [49]



Sau 6 chu kì lên men liên tiếp pellet A. oryzae không thể tái sử dụng được nữa do nó

mất cấu trúc búi sợi chắc, tròn và bắt đầu phân rã. Hoạt động sản xuất FOS không bị suy

giảm trong suốt 6 chu kì lên men. Hiệu suất thu nhận FOS giữ ở mức 53% (w/w) trong 6

chu kì tái sử dụng pellet.

2.4. Cố định tế bào nấm mốc Aspergillus japonicus vào chất mang gluten và ứng

dụng sản xuất đường fructooligosaccharide [23]


Nghiên cứu nhằm mục đích cố định Aspergillus japonicus bằng cách bẫy vào mạng

gluten ứng dụng sản xuất FOS từ sucrose nhờ enzyme β-fructofuranosidase. Khi đem ủ

1g hệ sợi nấm đã cố định trong đó chứa 20% (w/w) tế bào với 100ml dd sucrose nồng độ

ban đầu là 400g/l thì tổng lượng FOS thu được là 61% (w/w) lượng đường tổng sau khi

tiến hành 1 mẻ phản ứng trong 5h. Tốc độ phản ứng tăng theo lượng tế bào bẫy trong

mạng gluten và đạt giá trị cao nhất khi lượng tế bào là 20% (w/w). Các sợi gluten cố định

sợi nấm được nhồi vào trong cột phản ứng để sản xuất FOS liên tục. Sản lượng thu được

là 173g/h trong 1 lít thể tích cột phản ứng với tốc độ dòng chảy là 0.8ml/phút. Khối lượng

các phân đoạn FOS tăng từ 0.2 – 0.54 w/w khi dòng chảy giảm từ 1 còn 0.1ml/phút, cùng

với thời gian lưu tăng từ 0.35 lên 3.5h. Hệ sợi nấm được bẫy trong mạng gluten và tế bào

cố định trong đó ổn định trong thời gian dài.

Gluten được nhận thấy là vật liệu thích hợp để cố định sợi nấm cùng với enzyme

sản xuất FOS. Gluten là một dạng polymer tự nhiên, và là phụ phẩm của công nghiệp sản

xuất bột mì. Sử dụng gluten có các ưu điểm như nó là chất có thể phân giải được, rẻ tiền,

không độc và là nguồn nguyên liệu có sẵn.




Chủng và tế bào nuôi cấy:

Aspergillus japonicus TIT-KJ1 được cung cấp bởi tiến sĩ K-J Duan ở bộ môn công

nghệ sinh học, trường đại học Tatung, Taipei, Đài Loan.

Môi trường lỏng chứa 20% đường sucrose, 1% dịch trích đường maltose, và 1% dịch

chiết nấm men đã được dùng. Các tế bào được nuôi ở chế độ lắc (200v/p) ở 300C trong 36

giờ. Để thu được những sợi nấm dùng cho cố định, tế bào sẽ được thu nhận, và trộn đều

với chất làm đồng nhất polytron trong dung dịch đệm chứa Triton X-114 ở 40C trong 24

giờ, và làm đông khô ở -850C.

Cố định tế bào:

Bột gluten (10g, Sigma) được hòa tan trong 200ml dung dịch NaOH 0.05N. Sau khi

ly tâm loại những phần không tan, phần dd gluten còn lại được điều chỉnh với HCl 0.1N.

Khi pH giảm còn 11, tiếp tục thêm 5ml dung dịch tinh bột đã bị oxy hóa vào (22%, w/v),

và sau đó pH được giảm tiếp xuống 6. Sau khi đã làm lắng gluten dạng keo và loại bỏ

những phần nổi lên trên bề mặt, phần keo lắng được trộn đều với sợi nấm đã nghiền nhỏ

của A.japonicus. Phần gel này sau đó được làm khô ở dạng những sợi tế bào cố định với

đường kính 0.25cm. Những gel khô sau cùng được cắt thành những mảnh nhỏ có kích

thước 0.25cm x 0.4 cm và trữ ở 40C trước khi đem sử dụng.

Sản xuất fructooligosacchride:

Bổ sung 1g (hoặc 1 lượng cụ thể nào đó) mảnh tế bào cố định vào 100 ml dung dịch

đường sucrose (40%, w/v) để sản xuất FOS ở 370C dưới chế độ lắc 125v/p đặt trong bể

nước. Quá trình sản xuất FOSs được kiểm soát bằng cách đo hàm lượng FOS tạo thành

trong dung dịch. FOS được sản xuất liên tục bằng cách nhồi 8g các mảnh tế bào cố định

vào cột kích thước 18cm x 1.55cm. Dung dịch sucrose (40%, w/v) được cho đi qua cột

với vận tốc dòng chảy xác định. Nhiệt độ của cột được duy trì ở 370C. Sản phẩm trong

hỗn hợp phản ứng được phân tích bằng HPLC sử dụng cột Econosphere NH2 (5μ



cartridge, 250 mm x 4.6 mm). Sắc ký tiến hành trong điều kiện như sau: nhiệt độ cột

300C, tốc độ dòng chảy 1.5 ml/phút; pha di động là acetonitrile – H2O (75:25); máy dò

Water 410 RI. Tổng FOS tạo thành được giả định là tổng của 1-kestose và nystose. Lượng

FOS cao hơn thường chỉ chiếm 3% và được bỏ qua. Trong tất cả các phép phân tích,

lượng nhỏ fructose được xem như là glucose.

Vận tốc phản ứng ở giờ đầu tiên:

Để xác định tốc độ phản ứng được xúc tác bởi β-D-fructofuranosidase, 55 ml dung

dịch sucrose (40%, w/v) được ủ với 0.2g tế bào cố định ở 370C, trong 1 giờ. Hàm lượng

các loại đường trong hỗn hợp được xác định bằng HPLC. Vận tốc phản ứng được tính

như là lượng sucrose bị chuyển hóa trên một đơn vị thời gian với hoạt động xúc tác của

enzyme kèm theo sợi nấm cố định.

2.4.3. Kết quả

Sản xuất FOS theo mẻ với tế bào cố định:

Hình 2.16 biểu diễn động học của phản ứng transfructosyl ở sucrose, sử dụng các

mảnh gluten nhỏ bẫy những sợi nấm của Aspergillus japonicus. Khi ủ 100 ml dung dịch

sucrose 40% (w/v) với 1g tế bào cố định có mật độ tế bào là 20% (w/w), sucrose nhanh

chóng biến đổi thành glucose và 1-kestose (GF2) theo tiến trình phản ứng. Sau 4 giờ hàm

lượng 1-kestose tạo ra đạt giá trị cao nhất. 1-kestose sau đó được chuyển hóa thành

nystose (GF3). Tổng lượng FOS, mà chủ yếu là 1-kestose và nystose, đạt đến giá trị cực

đại là khoảng 61% lượng đường trong hỗn hợp phản ứng sau 5h. Phần khối lượng của

FOS tổng tạo thành gần như không đổi cho đến khi hàm lượng nystose vượt qua 1-kestose

tại thời điểm phản ứng diễn ra được 8 giờ. Mặc dù vậy, lượng FOS tổng đã hạ xuống dần

sau đó.



Hình 2.17: Nồng độ và phần khối lượng của các loại đường theo thời gian [23]

Khi dùng một lượng nhỏ tế bào cố định, ví dụ như 0.2g, thì thời gian để đạt tới hàm

lượng FOS cực đại là 15h, và hàm lượng 1-kestose và nystose bằng nhau là 18 giờ. Như

biểu diễn ở hình 2.17, phần khối lượng FOS tổng tại những thời điểm này thì giống như

khi sử dụng 1g tế bào cố định. Khi một lượng tương đương sợi nấm khô (0.04g khối

lượng tế bào khô) được dùng trực tiếp để sản xuất FOS từ đường sucrose thì tốc độ phản

ứng diễn ra nhanh hơn và thời gian thu lượng FOS lớn nhất cũng đươc rút ngắn so với khi

sử dụng 0.2 g tế bào cố định. Thời gian để hàm lượng FOS đạt cực đại và lượng 1-kestose

và nystose bằng nhau lần lượt là 12 và 15 giờ khi xúc tác phản ứng bằng tế bào nguyên

vẹn.



Hình 2.18: Sản xuất FOS sử dụng tế bào cố định và tế bào không cố định [23]

Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong gluten:

Hình 2.18 biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng tế bào có trong gluten lên hoạt tính

enzyme sản xuất FOS. Để xác định vận tốc phản ứng, 0.2 g tế bào cố định đã được trộn

với 50 ml dung dịch sucrose (40% w/v) và phản ứng xảy ra trong 1 giờ. Tốc độ phản ứng

ở giờ đầu tiên (g/h) được tính dựa trên lượng sucrose đã biến đổi. Ngoại trừ trường hợp tỷ

lệ tế bào là 2.5% hoặc ít hơn, nếu nồng độ cơ chất vượt quá 5% có thể làm tốc độ phản

ứng không đạt như thời kỳ đầu. Tốc độ phản ứng ở giờ đầu tiên có thể gần với vận tốc

ban đầu. Ở hình 2.18, tốc độ phản ứng tăng đến giá trị cực đại là 5.2 g/h cùng với sự tăng

hàm lượng tế bào, trong khi vận tốc riêng trên 1 đơn vị khối lượng tế bào đạt đến giá trị

tối đa (190g/hg trọng lượng khô tế bào) ở tỉ lệ tế bào 5% w/w, và sau đó giảm xuống mặc

dù hàm lượng tế bào tăng do sự cản trở không gian và sự khuếch tán vật chất qua thành tế

bào gặp khó khăn.



Hình 2.19: Ảnh hưởng của lượng tế bào cố định trong mạng gluten [23]

Sản xuất FOS liên tục:

Sucrose với nồng độ 400 g/l được bơm liên tục vào cột phản ứng đã nhồi các mảnh

gluten chứa sợi nấm cố định. Hình 2.19 biển diễn ảnh hưởng của lưu lượng dòng chảy lên

năng suất tạo FOS. Phần khối lượng của FOS tăng lên cùng với sự giảm đi của tốc độ

dòng chảy đồng thời thời gian lưu tăng lên. Phần khối lượng FOS tăng từ 0.2 đến 0.54

w/w khi tốc độ dòng chảy giảm từ 1 đến 0.1 ml/phút, tương ứng với thời gian tăng từ 0.35

đến 3.5 giờ. Hình 2.19 cũng cho thấy năng suất theo tốc độ dòng chảy và phần khối lượng

FOS tổng, tăng theo tốc độ dòng chảy, và khả năng tạo FOS cao nhất khi sử dụng tốc độ

chảy 0.8 ml/phút. Khi thể tích hỗn hợp phản ứng trong cột còn 34 ml, năng suất cao nhất

đạt được khi tốc độ dòng chảy là 0.8 ml/phút được tính là 173 g FOS sản xuất trong 1 giờ

trên 1 lít thể tích phản ứng.

Cột phản ứng được hoạt động trong thời gian dài với ống dẫn sucrose có nồng độ

400g/l. Khi lưu lượng dòng chảy là 0.1 ml/phút, tương ứng với thời gian lưu trung bình là



3.5 giờ, phần khối lượng của FOS tổng ở chỗ thoát của cột gần bằng 0.53 w/w sau 4 giờ

khởi động. Phần khối lượng của FOS duy trì ở hàm lượng từ 0.52-0.54 w/w trong khoảng

4 ngày đầu. Những sợi nấm sau khi được bẫy trong mạng gluten và những tế bào liên kết

cố định sản sinh ra enzyme có hoạt tính duy trì ở mức cao. Mặt khác, phần khối lượng

FOS giảm dần khoảng 0.4 w/w khi tiếp tục hoạt động trong 18 ngày sau đó. Hoạt động

sản xuất FOS giảm khoảng 50% giá trị ban đầu sau khi cột phản ứng được dùng liên tục

34 ngày.

Hình 2.20: Phần khối lượng FOS và năng suất tạo FOS theo tốc độ dòng chảy [23]



2.5. Sản xuất Fructooligosaccharide cao độ từ sucrose sử dụng hệ enzyme β-

fructofuranosidase và glucose oxidase [57]


FOS cao độ được nghiên cứu sản xuất từ sucrose bằng phương pháp lên men không

liên tục sử dụng hệ enzyme β-fructofuranosidase và glucose oxidase. Hệ enzyme này

được tiếp vào thiết bị phản ứng dạng khuấy trộn chứa 0.7l sucrose, phản ứng xảy ra trong

25h. Nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng cho thí nghiệm

nhằm sản xuất hàng loạt FOS cao độ với hệ 2 enzyme β-fructofuranosidase và glucose

oxidase.

Các điều kiện hoạt động tối ưu cho hệ 2 enzyme như sau: pH 5.5, nhiệt độ 400C,

hàm lượng sucrose 400 g/l, tốc độ khuấy trộn 550 vòng/phút, lưu lượng oxy 0.7 l/phút., tỉ

lệ enzyme phối trộn: 10 đơn vị β-fructofuranosidase kết hợp với 15 đơn vị glucose

oxidase trong 1g sucrose. Phản ứng diễn ra trong điều kiện tối ưu, hệ 2 enzyme đã phản

ứng hết với sucrose và glucose, FOS tạo thành với hàm lượng lên đến 98%. So với

phương pháp sản xuất FOS chỉ sử dụng enzyme β-fructofuranosidase, FOS cao độ được

sản xuất bởi hệ enzyme β-fructofuranosidase và glucose oxidase có điểm khác biệt cơ bản

là hàm lượng nystose tích lũy cao hơn, và chỉ có một lượng nhỏ fructofuranosyl nystose

tạo thành.


Hóa chất:

Đường sucrose sử dụng trong thí nghiệm là đường thực phẩm, các hóa chất khác ở

dạng tinh chế. Oxy 99.5% được sử dụng cho phản ứng enzyme glucose oxidase.

Enzyme:

β-fructofuranosidase thu nhận từ việc nuôi cấy chủng Aureobasidium pullulans

KFCC 10524 (Hàn Quốc) đã được mô tả bởi Jung và cộng sự. Dung dịch enzyme được

chuẩn bị như sau: các tế bào ở log phase được thu nhận bằng ly tâm và hòa tan lại vào



nước đã khử hết ion. Dịch treo tế bào được xử lý với 2% (w/v) kitalase trong 2h ở 450C

sau đó lọc sử dụng chất trợ lọc điatomit. Nước lọc chứa nhiều protein khác nhau được sử

dụng làm enzyme thô mà không cần tinh sạch.

Glucose oxidase (từ Aspergillus niger, hoạt tính riêng 25000 U/g) mua từ Sigma

(USA), sử dụng ngay không cần tinh sạch thêm.

Phân tích enzyme:

Hoạt tính của β-fructofuranosidase được xác định bằng cách đo lượng glucose sinh

ra trong điều kiện sau: hỗn hợp phản ứng gồm 7.5ml sucrose 800g/l, 2.3ml đệm Natri

citrate 0.1M pH 5.5, và 0.2ml dung dịch enzyme; pH 5.5; nhiệt độ 550C; thời gian phản

ứng 1h. Một đơn vị hoạt tính β-fructofuranosidase được xác định bằng lượng enzyme cần

thiết để giải phóng 1μmol glucose trong một phút ở điều kiện thí nghiệm.

Hoạt tính của glucose oxidase được tính theo lượng glucose biến mất trong bình

phản ứng khuấy trộn 2l theo các điều kiện khảo nghiệm sau: cơ chất 0.7l β-D-glucose

400g/l, lưu lượng oxy 0.7 l/phút, tốc độ khuấy trộn 550 vòng/phút, 1ml dd glucose

oxidase hòa trong đệm citrate 0.1M, nhiệt độ 400C, pH 5.1. Một đơn vị hoạt tính của

glucose oxidase là lượng enzyme cần thiết để oxy hóa 1μmol glucose trong điều kiện

phản ứng đã mô tả. Lượng glucose sinh ra được xác định theo phương pháp glucose

oxidase-peroxidase (dùng bộ kit chẩn đoán Sigma).

Phương pháp phân tích:

Tất cả sản phẩm phản ứng được phân tích bằng phương pháp HPLC sử dụng cột

HPX 42C (0.78 x 30cm, Bio-Rad) và máy dò khúc xạ RI-4. Nhiệt độ cột được giữ ở 850C.

Nước được sử dụng làm pha động với tốc độ chảy 1.0ml/phút. FOS tổng số được cho là

tổng của 1-kestose (GF2) và nystose (GF3). FOS mạch dài hơn thường nhỏ hơn 3% nên bỏ

qua.



Xác định pH và nhiệt độ tối ưu cho β-fructofuranosidase và glucose oxidase:

Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt động của enzyme glucose oxidase được

nghiên cứu trong thiết bị phản ứng 2l của BIOLAB. Thể tích phản ứng là 0.7l, lưu lượng

oxy 0,7l/phút, và lượng enzyme sử dụng là 10 đơn vị cho mỗi gram sucrose. Tuy nhiên,

cơ chất được thay thế bởi β-D-glucose 400 g/l và thời gian phản ứng giảm xuống còn 30

phút. Nhiệt độ tiến hành ở 400C. Ảnh hưởng của nhiệt độ được nghiên cứu ở pH 5.5.

Để tối ưu hóa pH và nhiệt độ cho β-fructofuranosidase, phản ứng được tiến hành

trong 30 phút với 10 đơn vị enzyme cho mỗi gram sucrose , sử dụng hỗn hợp phản ứng

tương tự như cho thí nghiệm phân tích enzyme. Ảnh hưởng của nhiệt độ được nghiên cứu

ở pH 5.5 và ảnh hưởng của pH thì tiến hành ở nhiệt độ 55°C. Các kết quả đã được trình

bày là hoạt tính tương đối (% lớn nhất) sau khi phân tích các sản phẩm phản ứng bằng

HPLC.


Nhiệt độ và pH tối ưu cho glucose oxidase và β-fructofuranosidase:

Những tác động của nhiệt độ và pH lên hoạt tính enzym của β-fructofuranosidase và

glucose oxidase được kiểm tra riêng biệt (Hình 2.20).

Nhiệt độ tối ưu của 2 enzyme có sự khác biệt đáng kể. Các nhiệt độ tối ưu cho

glucose oxidase và β-fructofuranosidase tương ứng là 35°C và 55°C. Đối với glucose

oxidase, nhiệt độ tăng có nghĩa là nồng độ oxy giảm. Về cơ bản tính hòa tan của oxy giảm

khi nhiệt độ tăng lên. Mặt khác, pH tối ưu cho glucose oxidase gần như tương tự với β-

fructofuranosidase, trong khoảng 5 – 6. Kobayashi và cs. báo cáo một kết quả tương tự

rằng điều kiện phản ứng tối ưu cho glucose oxidase nguồn gốc từ Penicillium

amagasakiense là ở nhiệt độ 40°C và pH 5 – 6. Căn cứ vào kết quả này, tất cả các thí

nghiệm phản ứng được thực hiện trong phạm vi nhiệt độ 35 - 45°C và pH cố định là 5.5

để tối ưu hóa hệ 2 enzyme.



Hình 2.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) lên hỗn hợp enzyme [57]

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hỗn hợp enzyme:

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình sản xuất FOS cao độ được tiến hành nghiên

cứu với 600g/l sucrose ở ba nhiệt độ 35, 40 và 45°C (Hình 2.21). Ở cả ba nhiệt độ, ban

đầu FOS được tạo ra rất nhanh, và giảm dần theo thời gian phản ứng. Ngoài ra, tốc độ tạo

FOS ban đầu nhanh hơn khi nhiệt độ phản ứng tăng, mặc dù hiệu suất chuyển hóa FOS

đạt giá trị tương đương 83% sau 25h. Điều này có thể được giải thích do mức độ kích

hoạt enzyme khi nhiệt độ tăng không đủ bù đắp cho lượng oxy hòa tan giảm trong hệ

thống. Vì vậy, 40°C được chọn làm nhiệt độ phản ứng cho sản xuất FOS cao độ.



Hình 2.22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ FOS tạo thành [57]

Ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn:

Ảnh hưởng sự truyền khối đến hoạt tính chung của hỗn hợp enzyme được khảo

nghiệm với 600 g/l sucrose (với các tốc độ khuấy trộn khác nhau), với kết quả đưa ra là tỷ

lệ sản xuất FOS. Bộ phận truyền động là một turbin 6 cánh khuấy (đường kính 5.8cm,

làm bằng thép không gỉ) đặc cách đáy thiết bị phản ứng 5cm.

Tsukamoto và cs. đã nghiên cứu vai trò quan trọng của tốc độ khuấy trộn đến tỷ lệ

phản ứng của glucose oxidase cố định trên chất mang và thấy rằng tỷ lệ ban đầu là hầu

như không đổi với tốc độ khuấy trên 1.300 vòng/phút. Tuy nhiên, trong hệ thống này,

không có sự khác biệt đáng kể trong tỷ lệ sản xuất FOS nếu tốc độ khuấy trên 550

vòng/phút (Hình 2.22). Điều này cho thấy vai trò của sự truyền khối, không giống như



quá trình phản ứng bằng enzyme cố định, là không quan trọng khi tốc độ khuấy cao hơn

550 vòng/phút. Sau đây, tất cả các thí nghiệm tiếp theo được thực hiện với chế độ khuấy

đảo 550 vòng/phút.

Hình 2.23: Ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn đến tỉ lệ FOS tạo thành [57]

Ảnh hưởng của lưu lượng oxy:

Hình 2.23 cho thấy ảnh hưởng của tốc độ dòng chảy khí oxy lên sản xuất FOS. Khi

không cung cấp oxy, cả tỷ lệ sản xuất và chuyển đổi được rất thấp, năng suất gần như

giống nhau khi chỉ sử dụng một loại enzyme β-fructofuranosidase.

Lưu lượng oxy cần thiết để đạt được lượng FOS mong muốn được xác định là phải

lớn hơn 0.7 l/phút. Sự hạn chế khuếch tán của oxy vào dd đường nồng độ cao (nồng độ

sucrose ban đầu 600 g/l) làm hàm lượng oxy hòa tan trong hỗn hợp phản ứng không đạt



độ bão hòa. Kết quả là, 0,7 l/phút được chọn là lưu lượng oxy cho tất cả các thí nghiệm

tiếp theo.

Hình 2.24: Ảnh hưởng của lưu lượng oxy đến sản xuất FOS [57]

Ảnh hưởng của nồng độ sucrose:

Tiến hành khảo nghiệm nồng độ sucrose trong khoảng 400 – 700 g/l để xác định giá

trị tối ưu. Hình 2.24 cho thấy hỗn hợp enzyme có hoạt động tương tự trên một dải nồng

độ sucrose và sau 15h phản ứng thì hầu như không đổi. Ở nồng độ đường cao thì oxy hòa

tan giảm nên tỉ lệ tạo FOS cũng giảm. Do đó chọn nồng độ sucrose cho các thí nghiệm về

sau là 400 g/l.



Hình 2.25: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến tỉ lệ tạo FOS [57]

Ảnh hưởng của nồng độ glucose oxidase:

Theo báo cáo trước đó của nhóm tác giả thì hàm lượng β-fructofuranosidase tối ưu

cho sản xuất FOS là 5 đơn vị cho mỗi gram sucrose ở 55°C. Trong nghiên cứu này thì hệ

hỗn hợp 2 enzyme cần một lượng β-fructofuranosidase cao hơn bởi vì nhiệt độ tối ưu của

hỗn hợp enzyme (40°C) là thấp hơn nhiều so với 55°C. Với lượng cố định 10 đơn vị β-

fructofuranosidase cho mỗi gram sucrose thì lượng glucose oxidase dao động trong

khoảng 5-15 đơn vị cho mỗi gram sucrose (400 g/l). Khi thêm 5 hoặc 10 đơn vị glucose

oxidase thì lượng glucose còn lại sau 25h phản ứng tương ứng là 18% và 5%.



Tuy nhiên, hoạt tính ban đầu của glucose oxidase không được duy trì ở mức cao

trong suốt thời gian phản ứng 25h vì enzyme bị vô hiệu hoá bởi H2O2, một trong những

sản phẩm phản ứng. Hình 2.25 và 2.26 cũng cho thấy khi sử dụng 15 đơn vị glucose

oxidase, sucrose và glucose phản ứng hết và lượng FOS tạo thành đạt gần 98%. Có thể

kết luận 15 đơn vị glucose oxidase đủ để sản xuất FOS cao độ. Lượng catalase lẫn trong

glucose oxidase (dưới 1%) cũng góp phần phân hủy H2O2 (Lưu ý rằng ngay cả một dấu

vết nhỏ của catalase cũng là một số lớn đơn vị).

Hình 2.26: Ảnh hưởng của nồng độ glucose oxidase lên tỉ lệ tạo FOS [57]



Hình 2.27: Tỉ lệ các loại đường trong hỗn hợp phản ứng ở điều kiện tối ưu [57]

Hình 2.28: Sắc ký đồ HPLC của FOS và FOS cao độ [57]

Thời gian lưu 5.2, 5.9, 6.9, 8.2 phút tương ứng nystose, 1-kestose, sucrose, glucose



Bảng 2.8 cho thấy thành phần đường trong sản phẩm FOS cao độ thu được dưới các

điều kiện phản ứng tối ưu đã mô tả và một số khác biệt chủ yếu khi so sánh với sản xuất

FOS chỉ sử dụng β-fructofuranosidase.

Bảng 2.8: Thành phần đường so sánh giữa FOS và FOS cao độ a

Đường FOSb FOS cao độ c Glucose 27.73 0 Sucrose 14.01 1.68

1-kestose 39.78 43.63 Nystose 18.48 54.69

FOS tổng 58.26 98.32d [57]

a: % theo hàm lượng chất khô; b: điều kiện phản ứng: 10 đơn vị β-fructofuranosidase cho 1 gram sucrose, 400C, pH

5.5, 25h c: điều kiện phản ứng: 10 đơn vị β-fructofuranosidase và 15 đơn vị glucose oxidase

cho 1 gram sucrose trong điều kiện tối ưu đã mô tả. d: acid gluconic đã được loại ra bằng cột resin trao đổi cation trước khi phân tích

HPLC. Các dạng đường FOS cao hơn nystose chỉ thấy ở dạng vết, mặc dù hàm lượng cao

của nystose được duy trì trong suốt thời gian phản ứng. Theo cơ chế phản ứng của β-

fructofuranosidase thì dạng đường FOS cao hơn, chẳng hạn như fructofuranosylnystose

(GF4), sẽ được tạo ra bằng cách sử dụng nystose như cơ chất nền. Kết quả này cho thấy sự

khác biệt đáng kể trong động học của β-fructofuranosidase giữa một hệ thống chỉ sử

dụng duy nhất β-Fructofuranosidase và hệ thống hỗn hợp 2 enzyme này.

Có thể kết luận đây là một phương pháp đầy hứa hẹn cho sản xuất FOS cao độ lên

đến 98% bằng cách sử dụng một hệ hỗn hợp enzyme β-fructofuranosidase và glucose

oxidase. Hệ hỗn hợp enzyme rõ ràng đóng một vai trò quan trọng trong việc nâng cao độ

tinh khiết của FOS, không chỉ bởi việc loại bỏ glucose, mà sucrose cũng được sử dụng tối

đa.



2.6. Ứng dụng công nghệ enzyme để thu nhận đường chức năng

fructooligosaccharide từ dịch mía ở Việt Nam [10]


Nước ta là nước có ngành công nghiệp mía đường khá phát triển, các vùng nguyên

liệu mía phân bố khá rộng rãi (5 vùng sinh thái) trải rộng từ Bắc vào Nam. Do đó, chúng

ta sản xuất đường FOS từ nguyên liệu ban đầu là mía khá thuận lợi.

Mục đích của nghiên cứu là tìm hiểu các đặc tính của enzyme β-fructofuranosidase

trong chế phẩm enzyme thương mại Pectinex Ultra SP-L (Novozymes) nhằm ứng dụng

thu nhận đường chức năng FOS từ dịch mía.

Chế phẩm Pectinex Ultra SP-L chứa β-fructofuranosidase với hoạt lực 58.1 U/ml.

Các điều kiện tối ưu được chọn: nhiệt độ 400C, pH 5.6, 240ml và tỉ lệ enzyme : dịch mía

là 2 : 100 (v/v).

Sirô FOS thu được sau khi sử dụng chế phẩm Pectinex Ultra SP-L chứa các thành

phần đường như sau: 50.4% FOS, 10.4% saccharose, 3.9% fructose và 35.3% glucose.

2.6.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Vật liệu:

DÞch mÝa cña gièng mÝa chÝn trung b×nh F156 trång trong vô 2005 - 2006 ®ưîc sö

dông ®Ó nghiªn cøu. §ưêng saccharose là lo¹i ®ưêng tr¾ng tinh luyÖn cã hàm lưîng

99,62%, cã ®é Èm 0,05% và ®ưêng khö: < 0,05%.

ChÕ phÈm enzyme pectinex Ultra SP-L (hãng Novozymes, §an M¹ch) là chÕ phÈm

d¹ng láng, màu n©u ®en, ®Æc s¸nh, cã mïi th¬m ®Æc trưng, trong ®ã cã chøa enzyme β-D-

fructofuranosidase ®ưîc s¶n xuÊt tõ chñng aspergillus niger.

Phư¬ng ph¸p:

TiÕn hành 4 ®ît lÊy mÉu mÝa ë 4 giai ®o¹n (thêi ®iÓm) kh¸c nhau ®Ó kiÓm tra thành

phÇn ®ưêng trong dÞch mÝa. Mçi ®ît tiÕn hành kiÓm tra 3 mÉu ®Ó lÊy kÕt qu¶ trung b×nh.



Ho¹t tÝnh cña enzyme b-D Fructofuranosidase ®ưîc x¸c ®Þnh theo phư¬ng ph¸p do

Seikagaku ®Ò xuÊt (tham kh¶o tài liÖu cña Whitaker &cs, 2004), hàm lưîng ®ưêng khö

theo phư¬ng ph¸p Lane - Eynone (tham kh¶o tài liÖu cña §Æng ThÞ Thu & cs, 1997), hàm

lưîng ®ưêng theo phư¬ng ph¸p ®ưîc NguyÔn V¨n Mïi m« t¶ (2001) và thành phÇn và

hàm lưîng ®ưêng trong s¶n phÈm FOS thu ®ưîc b»ng phư¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng

cao (HPLC) trªn hÖ thèng s¾c ký HP 1100 (hãng Aligence, Mü) t¹i Phßng ph©n tÝch và

kiÓm ®Þnh chÊt lưîng thùc phÈm, ViÖn C«ng NghiÖp Thùc PhÈm.

C¸c lo¹i ®ưêng trong mÉu chuÈn (Trung Quèc) và mÉu nghiªn cøu ®ưîc ph©n chia

trªn cét s¾c ký supelco Ca 30cm x 7,8mm ID (hãng Supelco, Mü), tèc ®é dßng ch¶y

1ml/min, Detector là Detector ®o chØ sè khóc x¹ - RI.

2.6.3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận:

X¸c ®Þnh ho¹t tÝnh cña enzyme β-D-fructofuranosidase trong chÕ phÈm

Pectinex Ultra SP-L và hàm lưîng ®ưêng saccharose trong dÞch mÝa:

§Ó cã ®Þnh hưíng sö dông chÕ phÈm enzyme pectinex-Ultra SP-L, ho¹t tÝnh cña

enzyme β-D fructofuranosidase ®ã ®ưîc x¸c ®Þnh. Sè ®¬n vÞ ho¹t tÝnh trong 1ml dung dÞch

chÕ phÈm enzyme là 58,1 U/ml. Do chÕ phẩm Pectinex Ultra SP-L chøa enzyme β-D

fructofuranosidase, do ®ã cã thÓ sö dông chÕ phÈm này ®Ó thu nhËn c¸c

fructooligosaccharide (FOS) tõ ®ưêng saccharose.

Hàm lưîng 3 lo¹i ®ưêng chÝnh trong dÞch mÝa thu ®ưîc tr×nh bày ë b¶ng 2.9.

Bảng 2.9: Thành phần đường trong dịch mía Đợt kiểm tra Saccharose Glucose Fructose

(% w/w) (% w/w) (% w/w) 1 90.6 6.2 3.2 2 91.6 6.3 2.1 3 90.6 6.2 3.2 4 90.6 6.2 3.2

Trung bình 90.9 6.2 2.9 [10]



Sè liÖu cña b¶ng 2.9 cho thÊy thành phÇn ®ưêng trong nưíc mÝa tư¬ng ®èi ®ång ®Òu

trªn 4 mÉu nưíc mÝa ph©n tÝch. Trong sè 3 lo¹i ®ưêng x¸c ®Þnh, dÞch mÝa chøa hàm lưîng

®ưêng saccharose là chñ yÕu (~ 90%). Ngoài ra dÞch mÝa cßn chøa ®ưêng glucose (~6%)

và ®ưêng fructose (~3%).

X¸c ®Þnh ®iÒu kiÖn tèi ưu cho enzyme ho¹t ®éng:

Ảnh hưëng cña nhiÖt ®é, pH và thêi gian ph¶n øng ®Õn ho¹t tÝnh cña enzyme và kh¶

n¨ng vËn chuyÓn ®ưêng fructose ®Ó t¹o thành ®ưêng FOS ®ã ®ưîc nghiªn cøu. H×nh 2.28

cho thÊy hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn t¹o FOS t¨ng dÇn tõ nhiÖt ®é 25- 400C và

®¹t cùc ®¹i t¹i gi¸ trÞ nhiÖt ®é 400C víi hàm lưîng là 6,9%. Sau ®ã hàm lưîng fructose

®ưîc vËn chuyÓn gi¶m dÇn tõ nhiÖt ®é 45- 500C. §iÒu ®ã chøng tá kh¶ n¨ng ph¶n øng thÓ

hiÖn ho¹t tÝnh transferase cña enzyme ®¹t cùc ®¹i t¹i gi¸ trÞ nhiÖt ®é 400C.

Hình 2.29: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng vận chuyển Fructose [10]

H×nh 2.29 cho thÊy khi gi¸ trÞ pH t¨ng tõ 4,5-5,5, hàm lưîng fructose ®ưîc vËn

chuyÓn t¹o FOS còng t¨ng lªn và ®¹t cùc ®¹i t¹i gi¸ trÞ pH 5,5 víi hàm lưîng fructose

chuyÓn hãa ®¹t 6,9%. Sau ®ã, khi tiÕp tôc t¨ng tõ pH 5,5-7, hàm lưîng fructose ®ưîc vËn

chuyÓn l¹i gi¶m xuèng. T¹i gi¸ trÞ pH = 7 hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn chØ b»ng

09%. T¹i gi¸ trÞ pH 5,5 hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn t¹o FOS ®¹t gi¸ trÞ cao nhÊt.



Hình 2.30: Ảnh hưởng của pH đến khả năng vận chuyển Fructose [10]

H×nh 2.30 cho ta thÊy thêi gian ph¶n øng càng t¨ng th× hàm lưîng fructose ®ưîc vËn

chuyÓn t¹o FOS càng t¨ng. Thêi gian ph¶n øng t¨ng tõ 30 ®Õn 240 phót th× hàm lưîng

fructose ®ưîc vËn chuyÓn t¹o FOS t¨ng cao trªn 1%. Hàm lưîng fructose ®ưîc vËn

chuyÓn ë møc thÊp nhÊt là 0.3% ë 30 phót. Víi thêi gian tõ 240 phót ®Õn 300 phót th× hàm

lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn t¨ng lªn kh«ng ®¸ng kÓ. V× vËy, thêi gian ph¶n øng cña

chÕ phÈm enzyme ®ưîc chän là 240 phót. Lóc này, hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn

t¹o FOS ®¹t 7,0%.

Trªn c¬ së c¸c kÕt qu¶ thu ®ưîc nhiÖt ®é 40oC, pH 5,5 và thêi gian ph¶n øng 240

phót ®ã ®ưîc chän cho ph¶n øng thu nhËn ®ưêng FOS tõ dÞch mÝa.

Hình 2.31: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng vận chuyển Fructose [10]



Ảnh hưëng cña tû lÖ enzyme/c¬ chÊt tíi sù biÕn ®æi thành phÇn ®ưêng:

Lưîng chÕ phÈm enzyme bæ sung là mét yÕu tè rÊt quan träng nh»m t¨ng kh¶ n¨ng

thñy ph©n và vËn chuyÓn, chÊt lưîng và gi¸ thành s¶n phÈm. NÕu bæ sung víi lưîng

enzyme thÊp th× kh¶ n¨ng thñy ph©n thÊp, thêi gian thñy ph©n kÐo dài làm cho s¶n phÈm

biÕn màu, chÊt lưîng và thành phÇn ®ưêng biÕn ®æi kh«ng như mong muèn. Ngưîc l¹i

nÕu lưîng chÕ phÈm enzyme bæ sung càng cao th× hiÖu qu¶ thñy ph©n còng càng cao (®¹t

®Õn ®iÓm cùc ®¹i). Tuy nhiªn bæ sung enzyme trong qu¸ tr×nh s¶n xuÊt cÇn ph¶i quan t©m

®Õn gi¸ thành cña enzyme. V× vËy ®Ó ®¶m b¶o c¶ yÕu tè kinh tÕ và yÕu tè kü thuËt ph¶i

chän ra mét tû lÖ thÝch hîp gi÷a c¸c yÕu tè ®ã.

Khi bæ sung enzyme víi c¸c lưîng kh¸c nhau tõ 0,005 ®Õn 0,04 và tiÕn hành ph¶n

øng ë ®iÒu kiÖn: nhiÖt ®é: 400C, pH 5,5 và thêi gian ph¶n øng 240 phót, lưîng enzyme

t¨ng th× hàm lưîng fructose vËn chuyÓn t¹o FOS còng t¨ng theo (b¶ng 2.10). §iÒu ®ã

chøng tá ho¹t tÝnh transferase cña enzyme còng t¨ng khi nång ®é enzyme t¨ng. Khi lưîng

enzyme t¨ng tõ 0,005 - 0,02 th× hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn t¹o FOS t¨ng tõ

0,6% ®Õn 6,9%. Nhưng khi lưîng enzyme t¨ng tõ 0,02 ®Õn 0,04 th× hàm lưîng fructose

®ưîc vËn chuyÓn chØ t¨ng tõ 6,9% ®Õn 7,9% (=1%). Như vËy là hàm lưîng fructose ®ưîc

vËn chuyÓn t¨ng rÊt chËm tõ nång ®é ezyme trong kho¶ng này. Bªn c¹nh ®ã hàm lưîng

saccharose+FOS gi¶m dÇn theo chiÒu t¨ng cña lưîng enzyme, cßn ngưîc l¹i hàm lưîng

glucose t¨ng dÇn theo chiÒu t¨ng cña lưîng enzyme. Sè liÖu còng cho thÊy kh¶ n¨ng thñy

ph©n cña enzyme t¨ng dÇn khi t¨ng nång ®é enzyme.

KÕt qu¶ thu ®ưîc ë b¶ng 2.10 cho phÐp chän tû lÖ enzyme/c¬ chÊt: 2ml chÕ phÈm

enzyme cho 100ml dÞch mÝa trong quy tr×nh s¶n xuÊt là hîp lý h¬n ®¸p øng yªu cÇu vÒ gi¸

thành cho s¶n phÈm.



Bảng 2.10: Ảnh hưởng của tỉ lệ Enzyme/cơ chất tới sự biến đổi thành phần đường Tỉ lệ

Enzyme/nước mía (v/v)

Saccharose + FOS (%w/w)

Glucose (%w/w)

Fructose (%w/w)

Fructose vận chuyển

(%w/w) 0 90.6 6.2 3.2 0

0.005 85.7 9.0 5.3 0.6 0.01 82.2 11.7 6.1 2.6

0.015 80.1 13.9 6.0 4.8 0.02 73.5 18.2 8.2 6.9

0.025 73.4 18.4 8.1 7.2 0.03 71.7 19.5 8.8 7.6

0.035 70.6 20.1 9.3 7.7 0.04 69.7 20.6 9.7 7.9

[10]

Thành phÇn ®ưêng FOS cã trong s¶n phÈm:

Thành phÇn và hàm lưîng c¸c lo¹i ®ưêng cã trong chÕ phÈm FOS ®ã ®ưîc x¸c ®Þnh

và ®Þnh lưîng (h×nh 2.31, 2.32 và b¶ng 2.11). Siro FOS thu nhËn ®ưîc theo quy tr×nh s¶n

xuÊt tr×nh bày ë s¬ ®å 1 ®ưîc ph©n tÝch thành phÇn và hàm lưîng c¸c lo¹i ®ưêng trªn m¸y

s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC). MÉu ®èi chøng là ®ưêng FOS b¸n trªn thÞ trưêng

Trung Quèc. Sè liÖu b¶ng 2.11 và s¾c ký ®å (h×nh 2.31 và 2.32) cho thÊy hàm lưîng FOS

®¹t gi¸ trÞ cao nhÊt, chiÕm 50,4%, hàm lưîng fructose chiÕm tû lÖ thÊp nhÊt 3,9%. Bªn

c¹nh ®ã hàm lưîng saccharose cßn l¹i víi tû lÖ thÊp (10,4%) và lưîng glucose chiÕm tû lÖ

kh¸ cao (35,3%). §iÒu này chøng tá hiÖu qu¶ thñy ph©n và kh¶ n¨ng vËn chuyÓn fructose

cña chÕ phÈm enzyme pectinex Ultra SP-L ®¹t tû lÖ cao. Víi hàm lưîng fructose chiÕm

3,9% cho thÊy hiÖu suÊt chuyÓn hãa rÊt cao.

Víi viÖc sö dông chÕ phÈm enzyme Pectinex Ultra SP-L cho siro FOS cã chÊt lưîng

tư¬ng ®ư¬ng như ®ưêng FOS cña Trung Quèc b¸n trªn thÞ trưêng.



Hình 2.32: Sắc ký đồ của đường FOS và các loại đường trong mẫu nghiên cứu [10]

Hình 2.33: Sắc ký đồ của đường FOS chuẩn [10]

Bảng 2.11: Thành phần và hàm lượng đường có trong sản phẩm FOS

Loại đường Hàm lượng (%) FOS 50.4

Saccharose 10.4 Glucose 35.3 Fructose 3.9

[10]



Quy tr×nh s¶n xuÊt đề nghị:

Hình 2.34: Sơ đồ quy trình sản xuất siro FOS từ nước mía sử dụng Pectinex Ultra SP-

L [10]

2.6.4. Kết luận

Hoạt tính của enzyme β-D-fructofuranosidase có trong chế phẩm Pectinex Ultra SP-

L là 58.1U/ml. C¸c ®iÒu kiÖn cho viÖc xö lý enzyme Pectinex Ultra SP-L ®ã ®ưîc lùa chän

gåm: NhiÖt ®é thÝch hîp là 400C, pH thÝch hîp là 5.5, thêi gian ph¶n øng là 240 phót, tû

lÖ enzyme/nưíc mÝa (200Bx) là 2ml/100ml dÞch mÝa.



Tõ ®ã nghiªn cøu ®Ò xuÊt mét quy tr×nh s¶n xuÊt siro FOS tõ nưíc mÝa cã sö dông

chÕ phÈm Pectinex Ultra SP-L víi Siro FOS thành phÈm cã thành phÇn và hàm lưîng c¸c

lo¹i ®ưêng là: ®ưêng FOS: 50,4%, saccharose: 10,4%, fructose: 3,9% và glucose: 35,3%.

2.7. Nghiên cứu sử dụng đường FOS trong sản xuất một số thực phẩm chức năng ở

Việt Nam [18]

2.7.1. Sản xuất bột dinh dưỡng trẻ em

Nghiªn cøu s¶n xuÊt dét dinh dưìng trÎ em ®· ®ưîc thùc hiÖn t¹i Viện C«ng nghiÖp

thùc phÈm tõ nh÷ng n¨m 90 cña thÕ kû trưíc. KÕt qu¶ nghiªn cøu ®· ®ưîc chuyÓn giao

®Õn nhiÒu c¬ së s¶n xuÊt và ngay t¹i ViÖn C«ng nghiÖp thùc phÈm chóng t«i còng cã mét

d©y chuyÒn s¶n xuÊt theo c«ng nghÖ nÊu Ðp næ ®· nghiªn cøu. §Ó ®¹t ®ưîc môc ®Ých là

®ưa s¶n phÈm ®ưêng FOS vào bét dinh dưìng trÎ em nh»m n©ng cao gi¸ trÞ dinh dưìng

còng như gi¸ trÞ sinh häc, chóng t«i ®· tËn dông d©y chuyÒn thiÕt bÞ cã s½n, c¶i tiÕn c«ng

nghÖ c¬ së trong nghiªn cøu sö dông ®ưêng FOS vào s¶n xuÊt bét dinh dưìng trÎ em. §èi

tưîng nghiªn cøu cña chóng t«i là bét dinh dưìng lo¹i ngät.



Hình 2.35: Sơ đồ quy trình sản xuất bột dinh dưỡng trẻ em có bổ sung FOS [18] Bột dinh dưỡng có bổ sung đường chức năng FOS sau đó được đem đi phân tích

thành phần dinh dưỡng và đánh giá cảm quan. Kết quả được trình bày ở bảng 2.12 và

2.13.

Bảng 2.12: Thành phần của bột dinh dưỡng trẻ em

Các chỉ tiêu Đơn vị tính Bột dinh dưỡng thường

Bột dinh dưỡng FOS

Ẩm % 6.0 6.0 Đạm % 12.5 12.0 Béo % 4.5 4.0 Glucid tổng % 75.5 76.5 Đường FOS % 0 5

[18]



Bảng 2.13: Kết quả đánh giá cảm quan bột dinh dưỡng trẻ em (thang điểm 10)

Các chỉ tiêu Bột thường Bột có bổ sung FOS Màu 9 9.5 Mùi 9 9 Vị 8 9 Hương 9 9 Trạng thái 9 8.5 Tổng thể 8.8 9

[18]

KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy viÖc bæ sung ®ưêng FOS thay thÕ ®ưêng kÝnh trong s¶n

xuÊt bét dinh dưìng trÎ em là hoàn toàn dÔ dàng và kh¶ thi trong s¶n xuÊt lín v× c«ng

nghÖ s¶n xuÊt mÆt hàng míi này kh«ng cÇn sù thay ®æi lín vÒ thiÕt bÞ còng như c«ng nghÖ

mà s¶n phÈm thu ®ưîc l¹i cã hư¬ng vÞ th¬m ngon h¬n so víi s¶n phÈm th«ng thưêng l¹i

mang ®Æc tÝnh chøc n¨ng gióp cho trÎ dÔ tiªu ho¸, ¨n ngon miÖng và cßn phßng chèng mét

sè bÖnh kh¸c n÷a như ®Æc tÝnh cña ®ưêng FOS ®· giíi thiÖu. VÒ mÆt gi¸ thành s¶n phÈm

này sÏ ®¾t h¬n so víi mÉu ®èi chøng là 2334 ®/kg. Sù t¨ng gi¸ này qu¸ nhá so víi gi¸

thành bét dinh dưìng bán trên thị trường.

2.7.2. Sản xuất bánh bích quy

B¸nh bÝch quy là s¶n phÈm ®ưîc s¶n xuÊt tõ hai nguyªn liÖu chÝnh là bét m× và

®ưêng cïng víi çc chÊt bæ dưìng như b¬, trøng, s÷a... th«ng qua qu¸ tr×nh nưíng, dưíi

t¸c dông cña nhiÖt ®é, s¶n phÈm thu ®ưîc là mét lo¹i thùc phÈm th¬m ngon dÏ tiªu ho¸,

giàu hydratcabon, protein và lipit. Víi ®Æc tÝnh là s¶n phÈm kh«, hàm lưîng nưíc thÊp nªn

b¸nh quy rÊt dÔ b¶o qu¶n và thuËn tiÖn cho viÖc chuyªn chë còng như tiªu dïng. V× thÕ

b¸nh quy tõ bao ®êi nay lu«n là s¶n phÈm ®ưîc ngưêi tiªu dïng ưa thÝch. Çc ®èi tưîng

sö dông b¸nh quy rÊt ®a d¹ng, tõ trÎ em ®Õn ngưêi già, tõ ngưêi khoÎ ®Õn ngưêi bÖnh.

Ph¹m vi sö dông còng rÊt réng tõ thành phè ®Õn çc miÒn xa x«i hÎo l¸nh.

V× ®ưêng FOS cã çc tÝnh chÊt và hư¬ng vÞ gÇn gièng như ®ưêng kÝnh, nªn hưíng bæ

sung ®ưêng FOS vào b¸nh bÝch quy như mét chÊt thay thÕ ®ưêng kÝnh. Còng như trong



s¶n xuÊt bét dinh dưìng, môc tiªu cña s¶n phÈm là ph¶i chøa tõ 5% – 10 % ®ưêng FOS.

§èi tưîng sö dông sÏ là FOS 50 ®Ó gi¶m gi¸ thành.

S¶n phÈm b¸nh bÝch quy cã bæ sung ®ưêng FOS sau ®ã ®ưîc ®em ®i ph©n tÝch thành

phÇn dinh dưìng và ®¸nh gi¸ chÊt lưîng c¶m quan, kÕt qu¶ ®ưîc thÓ hiÖn trªn b¶ng 2.14

và 2.15. Tõ c¸c kÕt qu¶ trªn ta thÊy viÖc sö dông ®ưêng FOS vào s¶n xuÊt b¸nh bÝch quy

c«ng nghiÖp là hoàn toàn kh¶ thi. S¶n phÈm míi này ngoài gi¸ trÞ c¶i thiÖn chÊt lưîng cña

b¸nh quy ra nã cßn cã t¸c dông c¶i thiÖn và phßng chèng bÖnh tËt cña ®ưêng FOS n÷a.

Hình 2.36: Sơ đồ quy trình sản xuất bánh bích quy sử dụng đường FOS [18]



Bảng 2.14: Thành phần của bánh bích quy

Các chỉ tiêu Đơn vị tính Bánh quy thường Bánh quy FOS Ẩm % 6.20 6.2 Đạm % 6.80 6.8 Béo % 3.90 3.92 Glucid tổng % 69.3 70.0 Đường FOS % 0 7

[18]



Bảng 2.15: Kết quả đánh giá cảm quan bánh bích quy (thang điểm 10)

Các chỉ tiêu Bánh quy thường Bánh quy FOS Màu 9 9.5 Mùi 9 9 Vị 8 9 Hương 9 9 Trạng thái 9 9 Tổng thể 9 9.1

[18]

2.7.3. Sản xuất kẹo

KÑo là mét trong nh÷ng s¶n phÈm chÝnh, chiÕm khèi lưîng bËc nhÊt trong c«ng

nghiÖp chÕ biÕn ®ưêng. Phô thuéc vào ®Æc tÝnh như tr¹ng th¸i, thành phÇn, mÉu mã và

hư¬ng vÞ, kÑo ®ưîc chia ra làm nhiÒu chñng lo¹i như kÑo cøng, kÑo mÒm, kÑo dai ... Do

®Æc tÝnh dÔ b¶o qu¶n, thuËn tiÖn sö dông và hư¬ng vÞ th¬m ngon nªn kÑo ®· ®ưîc s¶n xuÊt

và tiªu dïng réng r·i tõ bao ®êi nay trªn kh¾p thÕ giíi, cho mäi ®èi tưîng. §Ó t¨ng cưêng

gi¸ trÞ cña kÑo chóng t«i tiÕn hành nghiªn cøu sö dông ®ưêng chøc n¨ng FOS víi môc

®Ých gióp cho ®«ng ®¶o ngưêi tiªu dïng ®ưîc tiÕp nhËn s¶n phÈm ®ưêng chøc n¨ng FOS

®Ó c¶i thiÖn và t¨ng cưêng kh¶ n¨ng phßng chèng bÖnh tËt.

Trong khu«n khæ thêi gian và kinh phÝ cã h¹n nên chØ chän lo¹i kÑo cøng kh«ng

nh©n làm ®èi tưîng nghiªn cøu.



Hình 2.37: Sơ đồ quy trình sản xuất đường cứng sử dụng đường FOS [18]

ViÖc bæ sung ®ưêng FOS vào s¶n xuÊt kÑo thùc tÕ cho kÕt qu¶ rÊt tèt, ngoài nh÷ng

®Æc tÝnh cã ®ưîc nhê hàm lưîng ®ưêng FOS cã chøa trong nã, gi¸ trÞ c¶m quan cña kÑo

cßn ®ưîc ®¸nh gi¸ rÊt cao bëi hư¬ng th¬m vÞ ngät dÞu m¸t và ®é xèp dÎo. Trong sè c¸c

chuyªn gia cña héi ®ång c¶m quan cßn cho biÕt, vÞ ngät m¸t cña kÑo khi thay thÕ ®ưêng

FOS cã ®ưîc là do kh«ng nh÷ng tù b¶n th©n ®ưêng FOS mang ®Õn mà h×nh như ®ưêng

FOS cßn cã kh¶ n¨ng c¶i thiÖn vÞ ngät cña ®ưêng kÝnh và c¸c lo¹i ®ưêng kh¸c làm cho

chóng dÞu h¬n, m¸t h¬n.



B¶ng 2.16 và 2.17 dưíi ®©y là kÕt qu¶ ph©n tÝch so s¸nh thành dinh dưìng và ®iÓm

c¶m quan cña s¶n phÈm kÑo cøng bæ sung 200 g/kg ®ưêng FOS víi mÉu kÑo ®èi chøng.

Bảng 2.16: Thành phần của hai loại kẹo

Các chỉ tiêu Đơn vị tính Kẹo cứng thường Kẹo cứng FOS Ẩm % 6.2 6.2 Đạm % 2.2 2.15 Béo % 3.1 3.0

Glucid tổng % 80 82 Đường FOS % 0 7.5

[18]

Bảng 2.17: Kết quả đánh giá cảm quan của hai loại kẹo

Các chỉ tiêu Kẹo cứng thường Kẹo cứng FOS Màu 9 9.5 Mùi 8.5 9 Vị 7.5 9 Hương 9 9 Trạng thái 9 9 Tổng thể 8.6 9.1

[18]

2.8. Kết luận chung về sản xuất FOS và ứng dụng cho đến nay

FOS được sản xuất trên quy mô công nghiệp sử dụng hệ enzyme fructosyltransferase

từ vi sinh vật. Cho đến nay quy trình sản xuất đã có nhiều bước tiến vượt bậc cùng với sự

phát triển của công nghệ sinh học trên toàn cầu. Các phương pháp cố định enzyme, cố

định tế bào giúp FOS được sản xuất hàng loạt với quy mô lớn hơn. FOS cao độ được sản

xuất với các phương pháp sử dụng hệ đa enzyme, lọc nano, lên men… đảm bảo độ tinh

khiết của FOS khi bổ sung vào thực phẩm. Phương pháp phân tích thành phần FOS được

sử dụng phổ biến hiện nay với độ chính xác cao là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng

cao HPLC.



Một bước tiến mới trong kĩ thuật di truyền đã mở ra một kỉ nguyên mới cho FOS.

Các nhà khoa học đã nghiên cứu tạo dòng gene sản xuất fructosyltransferase vào E.coli,

giúp việc sản xuất FOS trên quy mô công nghiệp dễ dàng hơn với năng suất cao hơn gấp

bội.

Như vậy, với các đặc tính chức năng quan trọng, FOS ngày càng được biết đến là

một trong những thực phẩm chức năng hàng đầu hiện nay, tạo nên bước tiến mới trong

ngành công nghiệp thực phẩm. Ở nước ta, FOS chưa được sản xuất hàng loạt mà mới chỉ

thử nghiệm trên quy mô nhỏ. Trong tương lai không xa, với nguồn nguyên liệu tại chỗ dồi

dào là mía, tiềm năng cho sản xuất FOS của Việt Nam là rất lớn và cần được đầu tư đúng

mức.

- 261 -

KẾT LUẬN CHUNG ĐỀ TÀI

Đồ án “Công nghệ sinh học ứng dụng trong sản xuất và chế biến thực phẩm chức

năng” đã trình bày một cách tổng quát những vấn đề liên quan đến thực phẩm chức năng

hiện nay và đi sâu vào 2 hướng lớn: ứng dụng công nghệ di truyền để làm giàu các chất

dinh dưỡng chức năng với nhóm sản phẩm bổ sung folate và ứng dụng công nghệ vi sinh

trong sản xuất và chế biến thực phẩm chức năng với 2 sản phẩm được quan tâm hiện nay

là tảo Spirulina và đường chức năng Fructooligosaccharide.

Bước đầu các hướng nghiên cứu của đề tài đã khái quát tình hình phát triển và sản

xuất các sản phẩm đã nêu, tổng hợp lại một số nghiên cứu đã được khoa học công nhận và

đề ra hướng phát triển trong thực trạng Việt Nam hiện nay./.

- 262 -

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tham khảo trong nước:

[1]. Clive James (2007). Báo cáo tóm tắt : Hiện trạng cây trồng CNSH/ cây trồng chuyển

đổi gen trên toàn cầu năm 2007, ISAAA.

[2]. Công nghệ gen trong nông nghiệp. Giáo trình Đại học Huế.

[3]. Dương Thanh Liêm (2009), Thực phẩm chức năng và sức khỏe bền vững, NXB ĐH

Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh.

[4]. Glick, B. R., Pasternak, J. J. (2007). Công nghệ sinh học phân tử Nguyên lý và ứng

dụng của DNA tái tổ hợp. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

[5]. Huỳnh Lâm Minh Thùy (2008), Ứng dụng Spirulina vào sản xuất sữa chua, Luận văn

thạc sĩ, ĐH Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh.

[6] Lã Tuấn Nghĩa, Trần Duy Quý (2005). Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học

phục vụ sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam trong 20 năm qua (1985-2005). Tạp chí Sinh

học, 28, 1-9.

[7]. Lê Văn Lăng (1999), Spirulina, NXB Y Học.

[8]. Lương Đình Quát (2007), Nghiên cứu các phương pháp xử lý sinh khối vi khuẩn lam

S.platensis để sản xuất một số loại nước uống giàu dinh dưỡng, Luận văn thạc sĩ, ĐH

Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh.

[9]. Mai Ngọc Thảo (2008), Ứng dụng Spirulina vào sản xuất bánh mì ngọt và bánh mì

lạt, Luận văn thạc sĩ, ĐH Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh.

[10]. Ngô Xuân Mạnh và cộng sự (2006), Ứng dụng công nghệ Enzyme để thu nhận

đường chức năng Fructooligosaccharide (FOS) từ dịch mía, Tạp chí Khoa học kỹ thuật

Nông nghiệp, tập IV, số 6, 105 – 111.

- 263 -

[11]. Nguyễn Đình Thị Như Nguyện (2009), Nghiên cứu quá trình tinh sạch

Fructooligosaccharide bằng phương pháp lọc nano, Luận văn cao học công nghệ thực

phẩm, Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh.

[12] Nguyễn Đức Lượng và cộng sự (2002). Công nghệ gen. Nhà xuất bản Đại học Quốc

gia Tp.HCM.

[13]. Nguyễn Đức Lượng (2006), Công nghệ vi sinh tập 2 - Vi sinh vật học công nghiệp,

NXB ĐH Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.

[14]. Nguyễn Tài Lương (2005). Thực phẩm chức năng-Thức ăn của con người ở thế kỷ

21. Ứng dụng công nghệ sinh học tạo các chế phẩm thực phẩm chức năng phục vụ sức

khỏe của cộng đồng. Tạp chí sinh học, 27, 1-5.

[15]. Nguyễn Thị Như Ngọc (2003), Nghiên cứu chế biến một số thực phẩm có bổ sung

tảo Spirulina, Luận văn thạc sĩ, ĐH Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh.

[16]. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên (1998). Giáo trình sinh hóa hiện đại. Nhà

xuất bản Giáo Dục.

[17]. Trần Hồng Hà (2004). An toàn sinh học- Đánh giá và quản lý rủi ro các sinh vật

biến đổi gen, Nhà xuất bản Bộ tài nguyên và môi trường.

[18]. Trịnh Thị Kim Vân và cộng sự (2004), Nghiên cứu sản xuất đường

fructooligosaccharide bằng công nghệ đa enzyme và ứng dụng trong sản xuất thức ăn trẻ

em và bánh kẹo chức năng, Báo cáo tổng kết Khoa học và kỹ thuật, Bộ Khoa học và công

nghệ - Viện công nghiệp thực phẩm.

Tài liệu tham khảo nước ngoài:

[19]. Ahsan, M., Habib, B., Parvin, M. (2008), A review on culture, production and use of

spirulina as food for humans and feeds for domestic animals and fish, Department of

Aquaculture, Bangladesh Agricultural University, Mymensingh, Bangladesh.

- 264 -

[20]. Bagley, P. J. & Selhub, J. (2000). Analysis of Folate Form Distribution by Affinity

Followed by Reversed-Phase Chromatography with Electrochemical Detection. Clin.

Chem. 46, 404–411.

[21]. Basset, G., Quinlivan, E. P., Ziemak, M. J., Díaz de la Garza, R., Fischer, M.,

Schiffmann, S., Bacher, A., Gregory, J. F., III, & Hanson, A. D. (2002). Folate synthesis

in plants: The first step of the pterin branch is mediated by a unique bimodular GTP

cyclohydrolase I. Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 99, 12489–12494.

[22]. Bekaert, S. et al. (2008). Folate biofortification in food plants. Trends in Plant

Science. 13, 28-35.

[23]. Chien, C.S., Lee, W.C, Lin, T.J. (2001), Immobilization of Aspergillus japonicus by

entrapping cells in gluten for production of fructooligosaccharides, Enzyme and Microbial

Technology 29, 252 – 257.

[24]. Daniell. H; Singh, N. D; Mason, H; Streatfield, S. J (2009) Plant-made vaccine

antigens and biopharmaceuticals. Trends in Plant Science, 14, 669-679.

[25]. Datta, S. and Bouis, H.E. (2000) Application of biotechnology to improving the

nutritional quality of rice. Food Nutr. Bull. 21, 451–456.

[26]. Deikman, J., Kline, R. & Fischer, R. L. (1992) Organization of Ripening and

Ethylene Regulatory Regions in a Fruit-Specific Promoter from Tomato (Lycopersicon

esculentum). Plant Physiol. 100, 2013–2017.

[27]. Díaz de la Garza, R. et al. (2004) Folate biofortification in tomatoes by engineering

the pteridine branch of folate synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 13720–13725.

[28]. Díaz de la Garza, R.I. et al. (2007) Folate biofortification of tomato fruit. Proc. Natl.

Acad. Sci. U. S. A. 104, 4218–4222.

[29]. Fell, D. A. (1998) Increasing the flux in metabolic pathways: A metabolic control

analysis perspective.Biotechnol. Bioeng. 58, 121–124.

- 265 -

[30]. Fukushima, T. & Nixon, J. C. (1980) Anal. Biochem. 102, 176–188.

[31]. Hanson, A.D. and Roje, S. (2001) One-carbon metabolism in higher plants. Annu.

Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 52, 119–137.

[32]. Henrichkson, R. (2009), Earth Food Spirulina, Ronore Enterprises, Inc., Hana,

Maui, Hawaii.

[33]. Hossain, T., Rosenberg, I., Selhub, J., Kishore, G., Beachy, R. & Schubert,

K.(2004). Enhancement of folates in plants through metabolic engineering. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 101, 5158–5163.

[34]. Klee, H. J. & Kishore, G. M. (1996). U.S. Patent 5,512,466.

[35]. Kohashi, M., Tomita, K. & Iwai, K. (1980). Analysis of Conjugated Pterins in Food

Resources and Human Urine. Agric. Biol. Chem. 44, 2089–2094.

[36]. Konings, E. J., Roomans, H. H., Dorant, E., Goldbohm, R. A., Saris, W. H. &

van den Brandt, P. A. (2001). Folate intake of the Dutch population according to newly

established liquid chromatography data for foods. Am. J. Clin. Nutr, 73, 765–776.

[37]. Koziel, M. G., Carozzi, N. B. & Desai, N. (1996) Optimizing expression of

transgenes with an emphasis on post-transcriptional events. Plant Mol. Biol. 32, 393–405.

[38]. Lin, T.J., Lee, Y.C. (2008), High content fructooligosaccharides production using

two immobilized microorganisms in an internal-loop air

[39]. Lobo, A.R., Colli, C., Tullia, M.C, Filisetti, C. (2006), Fructooligosaccharide

improve bone mass and biomechanical properties in rats, Nutrition Research 26, 413 –

420.

[40]. Mesa, M.D., Silván, J.M., Olza, J., Gil, A., Castillo, M.D. (2008), Antioxidant

properties of soy protein–fructooligosaccharide glycation systems and its hydrolyzates,

Food Research International 41, 606 – 615.

- 266 -

[41]. Murr, C. et al. (2002) Neopterin as a marker for immune system activation. Curr.

Drug Metab. 3, 175–187.

[42]. Nestel, P. et al. (2006) Biofortification of staple food crops. J. Nutr. 136, 1064–

1067.

[43]. Nguyen, Q.D., Szabó., J.M.R., Bhat, M.K., Hoschke, A. (2005), Purification and

some properties of β-fructofuranosidase from Aspergillus niger IMI303386, Process

Biochemistry 40, 2461 – 2466.

[44]. Patarca, R. J. (2003). The Role of Pteridines in Physiology and Pathology

Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 22, 117–127.

[45]. Pfeiffer, C. M. & Gregory, J. F., III (1996). Enzymatic deconjugation of erythrocyte

polyglutamyl folates during preparation for folate assay: investigation with reversed-

phase liquid chromatography .Clin. Chem. 42,1847–1854.

[46]. Quinlivan, E. P., Roje, S., Basset, G., Shachar-Hill, Y., Gregory, J. F., III, &

Hanson, A. D. (2003). The Folate Precursor p-Aminobenzoate Is Reversibly Converted to

Its Glucose Ester in the Plant Cytosol. J. Biol. Chem. 278, 20731–20737.

[47]. Jiménez, C., Cossío, B.L, Labella, D., Niell, F.X. (2007), Screening of functional

compounds in supercritical fluid extracts from Spirulina platensis, Food Chemistry, 102,

1357-1367.

[48]. Sakakibara, M., Fukuda, Y. (2006), Process for treating Spiruilna, United States

Patent.

[49]. Sangeetha, P.T., Ramesh, M.N., Prapulla, S.G. (2005), Fructooligosaccharide

production using fructosyl transferase obtained from recycling culture of Aspergillus

oryzae CFR 202, Process Biochemistry 40, 1085 – 1088.

- 267 -

[50]. Sangeetha, P.T., Ramesh, M.N., Prapulla, S.G. (2005), Recent trends in the

microbial production, analysis and application of Fructooligosaccharides, Trends in Food

Science & Technology 16, 442 – 457.

[51]. Santos, A.M.P., Maugeri, F. (2007), Synthesis of Fructooligosaccharides from

sucrose using inulinase from Kluyveromyces marxianus, Food Technol. Biotechnol. 45 (2)

181 – 186.

[52]. Stein, A.J. et al. (2006) Potential impact and cost-effectiveness of golden rice. Nat.

Biotechnol. 24, 1200–1201.

[53]. Storozhenko, S. et al. (2007) Folate fortification of rice by metabolic engineering.

Nat. Biotechnol. 25, 1277–1279.

[54]. Stover, P.J. (2004) Physiology of folate and vitamin B-12 in health and disease.

Nutr. Rev. 62, S3–S12.

[55]. Varga, L., Szigeti, J., Kovács, R., Földes, T., Buti, S. (2002), Influence of a

Spirulina platensis Biomass on the Microflora of Fermented ABT Milks During Storage,

Journal of Dairy Science, 85, 1031-1038.

[56]. Wang, L., Pan, B., Sheng, J., Xu, J., Hu, Q. (2007), Antioxidant activity of Spirulina

platensis extracts by supercritical carbon dioxide extraction, Food Chemistry, 105, 36-41.

[57]. Yun, J.W., Lee, M.G., Song, S.K. (1994), Batch production of High-content

Fructooligosaccharids from sucrose by the mixed-enzyme system of β-fructofuranosidase

and glucose oxidase, Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.77, No.2, 159 –

163.

[58]. Yun, J.W. (1996), Fructooligosaccharide – occurrence, preparation and application,

Enzyme and Microbial Technology 19, 107 – 117.

- 268 -

Web tham khảo:

[59].http://www.khoe24.vn/home/Kien-thuc-san-pham/Thong-tin-san-pham/tao-spirulina-

thuc-an-ky-dieu.

[60]. http://www.thucphamsuckhoe.vn/NewsDetails.aspx?NewsID=30462d3d-c65e-4003-

8603-f8c9285051b6.

[61]. http://vi.wikipedia.org/wiki/Vitamin.

[62].http://www.medinet.hcmcity.gov.vn/ttyh/bshkhkt/vtchatbeodoivoitreem04-11-

2003.htm.

[63]. http://tpcnhocvienquany.com/?tab=detail_news&catid=MQ==&id=NTY.

[64]. http://www.vihuco.com/modules.php?name=News&file=article&sid=20.

[65]. http://images.google.com/

[66]. http://www.genco.com/

[67]. http://www.ext.vt.edu/pubs/biotech/443-003/443-003.html#L3

[68]. www.healthlinkbc.ca/healthfiles/index.stm

[69]. http://www.agbiotech.com/vn

[70]. http://ods.od.nih.gov/factsheets/folate.asp

[71]. http://www.cfsan.fda. Gov/dms~/OPA-appa.html

[72]. http://www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/search/

[73].http://thucphamvadoisong.vn/

thuc pham chuc nang

Documents