the science of western blotting9 転写~転写バッファー~ ゲルのサイズ保持...

メンブレンメーカーだから知っているウェスタンブロッティングのコツ

ラボジャパン事業本部

バイオサイエンス営業部間瀬久

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Contents

1 ウェスタンブロッティングの概要

2 電気泳動&転写

3 免疫検出

4 トラブルシューティング

5 吸引ろ過を用いた免疫反応

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ウェスタンブロッティングの概要

4

サンプル調製電気泳動転写免疫検出

タンパク質の分離分離したタンパク質のブロッティング膜への転写

特定のタンパク質の有無を検出

タンパク質精製、

分離、濃縮

ウェスタンブロッティングの概要

化学的サンプル調製/

細胞、オルガネラ溶解液

アフィニティビーズ

(アガロース & 磁気)

濃縮/脱塩

電気泳動ゲル

ローディングバッファー

ポジティブコントロール、分子量マーカー

泳動槽

ブロッティング装置

転写バッファー

メンブレン

ブロッティング用ろ紙

タンパク質染色試薬

ブロッキング

洗浄液

1次抗体

2次抗体

検出試薬

5

ウェスタンブロッティングを成功に導くために

タンパク質の

メンブレンへの結合抗体反応+

－

＋疎水結合による

吸着

孔径0.45mm/0.2mm

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電気泳動 & 転写

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電気泳動

SDSによってタンパク質の表面荷電を負電荷で打ち消され

ることで、タンパク質は分子量に依存して、ゲルの電場中を移動

電気泳動のTips

目的タンパク質が適切に解析できるアクリルアミドゲル濃度を選択

一定電圧、低電圧で泳動すると、バンドのゆがみ防止に

MembraneTransfer

BlockingAntibodyAddition

DetectionSample PrepGel Electro-

phoresis

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転写~転写において重要なこと~

① バッファー ② 電流・電圧 ③ メンブレン

溶出メタノール

SDS電流・電圧

吸着メタノール

SDS電流・電圧メンブレンの孔径

保持メンブレンの材質

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転写 ~転写バッファー~

ゲルのサイズ保持

膨潤を防止する。

脱水効果によりゲルを収縮させるため過剰の添加は溶出効率を低下させる

高分子タンパク質は溶出しにくいため、メタノール濃度を下げる(≦10%)ことで溶出効率が改善する

メンブレンへの吸着力の向上

バッファーやゲル中に含まれるSDSを除去しタンパク質の疎水性を高め、タンパク質とメンブレンとの相互作用を強める

低分子タンパク質は吸着力が低いため15~20%に濃度を上げると吸着力が向上する

Gel Electro-phoresis


DetectionSample PrepMembraneTransfer

メタノール

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転写 ~転写バッファー~




溶出効率の向上

タンパク質の溶解性を高めることでアクリルアミドゲルからのタンパク質溶出促進

メンブレンとタンパク質の相互作用を阻害

アミノ酸の疎水基と疎水結合を起こすことでメンブレンとタンパク質の疎水性相互作用を阻害する

SDS

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転写 ~ゲルの平衡化~




ゲルを転写バッファー中で10-15分平衡化することで、SDSが除かれ、タンパク質がメンブレンへ結合しやすくなる

平衡化

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転写 ~転写装置~

タンク式とセミドライ式

セミドライ式とタンク式では、転写スピード、サンプルへの熱の影響が異なる




Semi-Dry Tank System

Wet Tank System

タンク式セミドライ式

転写スピード遅い速い

熱の影響受けにくい受けやすい

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転写 ~メンブレンの材質~

初めてウェスタンブロッティングに使用された材質

プレウェッティング不要

強度が弱い

結合容量が低い

メタノールなどによるプレウェッティングが必要

複数回のストリッピング、リプロービング可能

長期間保存可能

結合容量が高い




Nitrocellulose

PVDF (polyvinylidene fluoride)

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転写 ~メンブレンの孔径~

タンパク質吸着容量をもたらす、高い表面積率（内部表面積）

<20kDaの低分子タンパク質、少量タンパク質のブロッティングに

孔径厚さ内部表面積*タンパク質

結合量**

Immobilon-P 0.45µm 140 µm 400 100

Immobilon-PSQ 0.2 µm 200 µm 1300 270

低バックグラウンドを実現する、低い表面積率（内部表面積）

≧20kDaのタンパク質で最も使用される

0.2 µm

0.45 µm




*内部表面積(m3)/外部面積(m3) **mg BSA/cm2

注意！！

0.2mm孔径のメンブレンはバックグラウンドが高くなりやすい

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転写 ~メンブレンの孔径~

A

0.45mm

B

0.2mm

C 0.2mm

吸着力の低い低分子タンパク質は0.2mmのメンブレンを使用することで

吸着力を補うことができるC 0.2mmA 0.45mm B 0.2mm

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免疫検出

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検出 ~検出方法~


BlockingSample PrepMembraneTransfer

AntibodyAddition

Detection

化学発光検出発色検出蛍光検出

主流な検出法

検出感度が複数

感度が低い

(化学発光のおよそ1/10)

シグナルが安定

定量的

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検出 ~抗体濃度~Gel Electro-

phoresisBlocking DetectionSample Prep

MembraneTransfer

AntibodyAddition

一次抗体の希釈 1/10,000 1/50,000 1/50,000

二次抗体の希釈 1/50,000 1/10,000 1/50,000

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

ヒト血清からのトランスフェリンの検出1:1/10002:1/50003:1/250004:1/1250005:1/625000

抗体希釈により、全体的なバックグラウンドが低減するサンプル量を減らすことにより、エキストラバンドが低減する

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低感度試薬高感度試薬高感度試薬

1 2 3 1 2 3 1 2 3

検出～抗体濃度と検出試薬～

一次抗体の希釈 1/10,000 1/10,000 1/200,000

二次抗体の希釈 1/50,000 1/50,000 1/200,000

Detection of ERK1 kinase in rat liver lysates.

1 : 15μl2 : 7μl3 : 3.5μl

高感度試薬を用いて抗体濃度を調節することでより高感度のシグナルを得ることができる

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検出感度はサンプル量と抗体の親和性により変化

検出 ~適正な検出条件の選択~


BlockingSample PrepMembraneTransfer

AntibodyAddition

Detection

1:10001次抗体濃度 1:5000 1:10,000

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ブロッキング ~オーバーブロッキング~

ＮＦＤＭ濃度の希釈によってオーバーブロッキングを防ぐことが可能

5%NFDM 0.5% NFDM 0.1% NFDM 0.05% NFDM


AntibodyAddition


Blocking

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ブロッキング ~非タンパク質のブロッキング剤~

5% NFDM Bløk-FL5% NFDM Bløk-PO


AntibodyAddition


Blocking

蛍光検出リン酸化タンパク質の検出

自家蛍光を抑制リン酸化タンパク質によるバックグラウ

ンドを抑制

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トラブルシューティング

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転写 ~低分子タンパク質の転写~

0.2 µm の転写メンブレンを使用

転写バッファーに10-20% のメタノールを添加

転写バッファーからSDS を除く

転写時間の短縮




メタノール SDS 転写時間メンブレン

低分子タンパク質･ペプチド 0.22 um

高分子タンパク質 0.45 um

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転写 ~高分子タンパク質の転写~

ゲルの平衡化時間を長く

転写バッファーのメタノール濃度を下げる

低電圧で長く転写をする




メタノール SDS 転写時間メンブレン

低分子タンパク質･ペプチド 0.22 um

高分子タンパク質 0.45 um

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検出 ~抗体濃度の調製~

問題 1次抗体濃度 2次抗体濃度

バックグラウンドが高い

バンドが薄い・検出できない


Blocking DetectionSample PrepMembraneTransfer

AntibodyAddition

“リバースウェスタン”

（目的バンドは白く、他は黒い状態）

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SNAP i.d.® 吸引式免疫反応システム

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SNAP i.d. ~反応~


MembraneTransfer

DetectionSample Prep BlockingAntibodyAddition

膜表面に比べて、膜内部の反応効率・洗浄効果が低下する

従来の振盪器を用いた

分子拡散による反応

「SNAP i.d.」を用いた

吸引ろ過による反応

溶液が膜を通過するため、膜内部でも高い反応効率・洗浄効果を維持

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従来法とSNAP i.d.のウェスタンブロッティングの所要時間比較

1次抗体の添加とインキュベーション

洗浄

2次抗体の添加とインキュベーション

洗浄ブロッキング

~1 時間 1 時間~O/N ~15 分 >1 時間 ~15 分

20 秒 10 分 1 分 10 分 1 分

4-20 hrs

22 minvs


MembraneTransfer


従来の免疫検出

SNAP i.d.

吸引ろ過を使用することで所要時間が30分以内に！

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従来法 vs SNAP i.d. ~試薬のレシピ~

SNAP i.d. を効果的に使用するためには条件の最適化が必要

Step 従来法 SNAP i.d.

ブロッキング 5% NFDM 0.5% NFDM

一次抗体濃度 1x 3~5x

洗浄 (3x) 1x 1x

二次抗体濃度 1x 3~5x

洗浄 (3x) 1x 1x


MembraneTransfer


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従来法 vs SNAP i.d.~洗浄効率~


MembraneTransfer


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SNAP i.d.TM Works for Proteins of Different Molecular Weights

200

100

50

10

低高

タンパク質の発現量

目的

タン

パク

質の

分子

量(k

Da)

58

Vimentin

Transferrin

90

p38

38 Erk1/2

44

42

60

SrcAkt

60

Cyclophilin A

18

53

P53

SOX-2

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Synaptophysin

38

GAPDH

36Actin

42

Hsp70

70

Albumin

66

180

EGFR

Nestin

220

100

Hexon

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Summary

SNAP i.d.での免疫反応

22分でブロッキングから2次抗体の反応まで

反応条件の迅速確認に最適

条件を最適化することで、ウェスタンをより有効な研究ツールに

ウェスタンブロッティング

転写

メタノールと SDS の濃度確認

ゲルの平衡化

小さい分子の捕捉には0.2mm

ブロッキング、検出

1次抗体、2次抗体の濃度の調製

最適試薬選択

抗体反応を妨害しないブロッキング試薬

最適な感度の検出試薬を選定

ウェスタンは

吸ったら

速いねん

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ご清聴ありがとうございましたwww.millipore.com/western

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