tests de selection des spermatozoides avant assistance ...en amp les techniques mises en oeuvre...

�9 ASSISTANCE MEDICALE A n d r o l o g i e (1999), 9, n ~ 2 , 2 8 6 - 2 9 4

LA PROCRI~ATION

Tests de S e l e c t i o n des S p e r m a t o z o i d e s avant A s s i s t a n c e M 6 d i c a l e h la P r o c r 6 a t i o n

C. MATHIEU (1) ET H. LUCAS (2)

1Laboratoire de Biologie de la Reproduction, HSpital PeUegrin, 33076 Bordeaux ; 2 Service d'Histologie Embryologie, Biologie de la Reproduction, HSpital Cochin, 75014 Paris

R E S U M E

Les t e c h n i q u e s de s~ lec t ion des s p e r m a t o - zo ides h u m a i n s s o n t n o m b r e u s e s e t s o u v e n t sp~c i f iques d u c e n t r e d ' a n d r o l o g i e qu i les p r a t i q u e . N o u s ne f a i s o n s p a s ici l ' i n v en t a i r e de t o u t e s ces t e c h n i q u e s ma i s r e p r e n o n s les p r i n c i p a l e s , le l a v a g e - c e n t r i f u g a t i o n , les m 6 t h o d e s d e f i l t r a t i o n 0 , S p e r m P r e p - ) , la m i g r a t i o n a s c e n d a n t e a ins i q u e les g r a d i e n t s d e d e n s i t 6 a v e c d e s s o l u t i o n s c o l l o i d a l e s ( -Pe rco l l - , ~ P u r e S p e r m - e t ~Isola te-) ou avec de n o u v e l l e s m o l 6 c u l e s i od4es n o n co l lo ida les ( - O p t i P r e p - ) . N o u s t e n t o n s de f a i r e u n e syn- th~se de la l i t t 6 r a t u r e a f in de d 4 g a g e r des m ~ t h o d o l o g i e s s t a n d a r d i s ~ e s p a r t e c h n i q u e e t n o u s d i s c u t o n s les a v a n t a g e s e t les incon- v~n ien t s de c h a c u n e d 'el le . La F r a n c e 4 tan t u n p a y s od les m i l i e u x u t i l i s4s p o u r u n e assis- t a n c e m4d ica l e h la p r o c r e a t i o n d o i v e n t avo i r ~t~ agr66s d ' u n p o i n t de v u e m i c r o b i o l o g i q u e , c e r t a i n s m i l i eux d 6 c r i t s ici 0~Percoll-) n 'on t p a s r evu ce t a g r 6 m e n t e t ne d o i v e n t pas ~tre u t i l i s~s en t h ~ r a p e u t i q u e a lo r s q u ' u n u s a g e d i a g n o s t i q u e es t poss ib l e .

C e r t a i n e s a n o m a l i e s d u s p e r m e n~ces s i t en t u n t y p e de p r 4 p a r a t i o n pa r t i cu l i~ r e . Nous d ~ c r i v o n s les t e c h n i q u e s les p lu s consen- sue l l e s p o u r t r a i t e r les s p e r m e s avec anti- c o r p s a n t i - s p e r m a t o z o i d e s , a v e c p r e s e n c e de l e u c o c y t e s o u s u s p e c t s d ' i n f e c t i o n , les s p e r m e s h y p e r v i s q u e u x , o u e n c o r e le r ecue i l d e s s p e r m a t o z o i d e s d a n s l ' u r i n e q u a n d il ex i s t e u n e 4 j a c u l a t i o n r 6 t r o g r a d e . Nous d6cri- v o n s p lus en d4 ta i l u n e t e c h n i q u e de pr6pa- r a t i o n des s p e r m e s c r y o c o n s e r v 4 s en s ' inspi- r a n t des r 4 s u l t a t s de r e c h e r c h e s f o n d a m e n -

ta les su r la cong~ la t i on -d~cong~ la t i on des gam6tes m~les h u m a i n s .

Enfin, n o u s p r o p o s o n s u n e c o n d u i t e h t en i r p o u r le choix d ' u n e t e c h n i q u e d 'AMP h propo- se r h u n coup le en t e n a n t c o m p t e des carac t4- r i s t i ques du spe rme , d u r 6 s u l t a t du t es t de s61ection s p e r m a t i q u e a ins i q u e de la su rv i e des gam6tes .

Mots clds : Sperme humain, prdparation du sperme, test de migration survie, gradients de densitd, Percoll, migration ascendante.

I. I N T R O D U C T I O N

Le t r a i t e m e n t du s p e r m e in vitro en vue d 'une Ass i s tance M6dicale ~ la P roc r6a t ion (AMP) a pour bu t de s61ectionner des spermatozo ides mobi les h morphologie normale , d'61iminer le p l a s m a s6minal, les d6bris cel lulaires, les cellules (telles que les leucocytes) ainsi que les spe rmatozo ides mor t s et dans une cer ta ine m e s u r e d ' amorcer la capac i ta t ion . Cet te s61ec- t ion se fait n a t u r e l l e m e n t dans les voies g6ni- ta les f6minines, a b o u t i s s a n t h la pr6sence sur le site de la f6condat ion de spermatozo~des suscep t ib les d '6tre les p lus f6condants de l'6ja- culat. La p r6pa ra t ion du s p e r m e in vitro essaie de reprodu i re cet te ac t ion ma i s les moyens uti- lis6s p e u v e n t avoir des effets secondai res d616- t6res sur les s p e r m a t o z o i d e s e t ce d ' au t an t p lus que le spe rme se ra i n i t i a l e m e n t alt6r6. La m6thode de s6para t ion du s p e r m e choisie sera

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donc u n c o m p r o m i s e n t r e le r e n d e m e n t de la sdlect ion et u n m i n i m u m d'effets secondaires . Le r~su l t a t o b t e n u p e r m e t t r a d 'o r ien te r vers u n type d 'AMP : i n s e m i n a t i o n i n t r a u te r ine , f~condat ion in vitro conven t ionne l l e ou avec m i c r o m a n i p u l a t i o n .

II. CHOIX D E S M I L I E U X UTILISES E N A M P

Les t e c h n i q u e s m i s e s en oeuvre d o i v e n t r~pondre a des cr i t~res d ' innocui t~ et de rende- m e n t ; si c e r t a i n s r~act i fs et mi l i eux p e u v e n t 5tre ut i l is~s au cours de t es t s de s~lection objectif d iagnos t ic , ils ne p e u v e n t en r evanche faire l 'objet d ' u n emplo i h u sage t h ~ r a p e u t i q u e chez l ' homme. Les cond i t ions d 'u t i l i sa t ion sont prScis~es p a r les f a b r i c a n t s et pa r la Direc t ion Gen~ra le de la S a n t e (DGS) qui diffuse r~gu- l i~ remen t les avis d u g r o u p e d 'exper t s de s~curit~ microb io log ique p o u r les mi l i eux uti l is~s en AMP c o n t e n a n t des d~riv~s h u m a i n s ou ani- maux .

Les t e c h n i q u e s et m i l i eux uti l is~s pou r la pre- p a r a t i o n du s p e r m e son t h a b i t u e l l e m e n t ~va- lugs s u r des c r i t~res de r e n d e m e n t et de mobi- lit5 des g a m e t e s . C e p e n d a n t , d ' au t r e s fonct ions du spermatozoYde p e u v e n t subi r les cons~- quences de ces m a n i p u l a t i o n s en par t i cu l ie r a u n i v e a u m e m b r a n a i r e . P a r exemple , ce r t a ins mi l i eux ut i l i s~s en F I V p e u v e n t exposer les spermatozo~des h des pe roxyda t ions m e m b r a - na i res [32]. De m ~ m e la p resence d ' H E P E S dans les m i l i e u x de p r e p a r a t i o n du s p e r m e n ' e s t p e u t ~ t re pa s s o u h a i t a b l e . E n effet, I ' HEPES es t c o n n u p o u r d i m i n u e r l ' incorpora- t ion ce l lu la i re de m o lecu l e s n~cessa i res a la s y n t h ~ s e g lyc op ro t~ ique . Le spermatozoYde ~ tan t u n e cel lule h a u t e m e n t diff~renci~e et m a t u r e , l ' i n co rpo ra t i on de ces molecu les n ' e s t p e u t ~tre pas u n h a n d i c a p pour le spe rma to - zoYde. P a r con t re , I ' H E P E S modif ie le po ten t ie l des m e m b r a n e s ce l lu la i res , b loque ce r t a in s c a n a u x chlore, affecte les sys t~mes de t r ans - por t t r a n s m e m b r a n a i r e s de molecules , interf'e- re avec le c a l c i u m ionis~, favorise la gen~se de r ad i caux l ibres e t p e u t i nh ibe r l 'u t i l i sa t ion de ce r t a ins ac ides a m i n e s p a r la cellule [6, 12, 20, 22, 43, 47, 64, 69, 79]. Tous ces r~su l t a t s exp , - r i m e n t a u x on t ~t~ o b t e n u s sur d ' au t r e s t ypes cel lu la i res que les s p e r m a t o z o i d e s m a i s l 'usage

de I ' H E P E S p o u r r a i t p o t e n t i e l l e m e n t p e r t u r - be r la d~s tab i l i sa t ion m e m b r a n a i r e s p e r m a - t ique , le d ~ c l e n c h e m e n t de la r~ac t ion acroso- m i q u e et donc la f~condance des g a m e t e s ma les . M~me si ce c o m p o s a n t es t ut i l is~ d e p u i s de n o m b r e u s e s ann~es , u n e ~va lua t ion de ses effets s p e r m a t i q u e s s ' impose h nous .

III. LAVAGE-CENTRIFUGATION D E S P E R M A T O Z O I D E S N O N SELEC-

T I O N N E S

Cet t e t e c h n i q u e tr~s s imp le cons i s te ~ d i lue r le s p e r m e d a n s u n m i l i e u a d ~ q u a t et de le cent r i - fuge r p e n d a n t 10 m i n u t e s ~ 300 ou 600g sui- v a n t les a u t e u r s . S a u f cas pa r t i cu l i e r s te ls que les o l i goas th~nozoospe rmies tr~s s~v~res [25], ce t te m ~ t h o d e es t ~ p rosc r i r e ca r elle p e r m e t s e u l e m e n t d '~ l iminer le p l a s m a s~mina l e t expose les spermatozo~des " n o r m a u x " aux p e r o x y d a t i o n s m e m b r a n a i r e s g~n~r~es p a r les leucocytes e t les spe rmatozo~des d~fic ients [1, 2, 3, 4]. De plus, la c e n t r i f u g a t i o n pa r elle- m ~ m e a des effets n~fas tes p a r t i c u l i ~ r e m e n t n e t s h p a r t i r de 600 g [7, 40, 44, 54].

IV. M E T H O D E S D E FILTRATION ET D ' A D H E R E N C E

La f i l t r a t ion su r l a ine de ve r r e d~cri te en 1977 p a r P a u l s o n et Po l akosk i [60] r epose su r le p r inc ipe de l ' adh~s ion a u ve r r e des s p e r m a t o - zo~des m o r t s e t des d~bris ce l lu la i res . C e t t e t e c h n i q u e a fai t l 'objet de q u e l q u e s publ ica- t ions d a n s son emplo i en A M P [76] e t p l u s r ~ c e m m e n t Van der B e r g h et coll. [75] l 'ont ut i - l i s l e avec succ~s d a n s la p r e p a r a t i o n d u sper- m e a v a n t in jec t ion i n t r a c y t o p l a s m i q u e de spermatozo~de (ICSI). U n e ~ tude r~cente [71] lu i r e c o n n a i t des a v a n t a g e s s u p ~ r i e u r s h la cent r i - f u g a t i o n su r g r a d i e n t de Percoll , ce qui va l ' encon t r e des o b s e r v a t i o n s de S h e r m a n et coll. [68]; ces a u t e u r s a v a i e n t d~cr i t des l~sions de la m e m b r a n e p l a s m i q u e de la t~te d u s p e r m a - tozo~de a ins i que des a n o m a l i e s de l ' ac rosome p r o b a b l e m e n t i m p u t a b l e s h la f i l t r a t ion s u r l a ine de ve r re d'ofi l ' a b a n d o n de ce t te tech- n ique j u s q u ' h u n e d a t e r~cente . La f i l t r a t i on su r bi l les de ve r re [13, 23, 24] ne s emble gu~re avoir empor t~ la convic t ion des d i f f~ren tes ~quipes l ' ayan t test~e.

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La f i l t ra t ion sur colonne Sephadex ( -S pe r m Pr ep , ) est uti l is4e par quelques 6quipes qui lui t rouvent une 6quivalence en termes d'efficacit6 par rapport ~ la centrifugation sur gradient de Percoll mais avec une plus grande rapidit6 d'ex4cution [18, 70, 80]. Une r6serve doit cependant 8tre 6raise pour l 'usage en clinique en raison du r61e d6Mt6re observ6 sur la f6condation in vitro et le d6veloppement des embryons de souris incub6s dans le milieu recueilli apr6s rin~age de la colonne de filtration [67]; d 'autre part, un effet n6gatif sur la mobilit6 des spermatozoides 6tait observ6. M6me si ce mil ieu de rin~age de la colonne n'est pas utilis6 pour la pr6parat ion du sperme, on ne peut exclure la persistance de facteurs d616t6res ~ l'6tat de traces dans le sup- port de filtration.

V. M I G R A T I O N A S C E N D A N T E .

La migrat ion ascendante peut s 'effectuer par t i r d u s p e r m e ou ~ partir d ' u n c u l o t de s p e r m a t o z o i d e s obtenus apr6s un ou deux lavages centrifugation.

La migrat ion ascendante ~ part i r d u s p e r m e consiste ~ d6poser le sperme sous le mil ieu de migrat ion et ~ laisser migrer les spermatozo~des pendant une heure ~ 37~ L'utilisation de plusieurs tubes pour augmente r l ' interface sperme-mil ieu permet d'am61iorer le rendement de la technique [16, 26]. Cette m6thode est sup6rieure ~ la migrat ion ~ par t i r d'un culot de spermatozoides en te rme de concen- t rat ion en spermatozoides mobiles progressifs

morphologie normale en part iculier pour le pourcentage d'acrosomes normaux [39]. Dans le cadre d'une FIV, il sera n6cessaire de r6ali- ser un lavage-centr ifugation des spermatozoides recueillis avec le milieu de migrat ion qui r i squent d 'ent ra iner avec eux un film de plasma s6minal qui pourrai t avoir un effet n4gatif sur la f4condation par la pr6sence de facteurs d6capacitants [42].

La migra t ion d e s s p e r m a t o z o i d e s a p r 6 s l a v a g e - c e n t r i f u g a t i o n est utilis6e depuis longtemps en FIV [48] et s 'est t a rgemen t r4pandue. Apr6s la centrifugation, le surna- geant est 61imin6 et 1 ml de milieu appropri6 est d6pos6 au-dessus du culot spermatique. La

dur6e de la migrat ion est de 30 minutes/~ une heure selon la qualit6 du sperme, la migrat ion peut ~tre faite h temp6ra ture ambiante ou mieux h 37~ dans une atmosph6re contenant 5 % de C02. La part ie du milieu de migrat ion la plus 61oign6e du culot est celle qui est r6cu- p6r6e de pr6f6rence ~ la part ie la plus proche du culot que l'on peut 6tre amen4 h uti l iser si le nombre de spermatozoides r6cup6r6s dans la partie sup6rieure est trop faible. Russel et Rogers [66] ont propos6 de remett re en suspension dans un faible volume de milieu (0,2 - 0,3 ml) le culot obtenu apr6s lavage et de d6po- ser ce m61ange au fond d'un tube contenant 2 ml de milieu. La remise en suspension des spermatozoa'des apr6s centrifugation permet- t rai t aux gam6tes mobiles de s'extraire plus facilement du culot pour migrer, en part iculier en cas d 'as th6nozoospermie, alors que les gam6tes immobiles s6dimentent; afin d'aug- menter l ' interface spermatozoides milieu de migration, le tube est inclin6 h 30-60 degr6s et les conditions de temps et d 'environnement sont les m~mes que pour la m6thode de migration d6crite pr6c6demment. Quelle que soit la var iante util is6e, la migra t ion a scendan te apr6s lavage-centrifugation expose les spermatozoides aux dommages li6s ~ la centrifugation et aux peroxydations membrana i res [2, 3, 7].

En outre, ces techniques ont un faible rendement, ce qui est un inconv6nient en cas d'oligo et/ou asth6nozoospermie ; Tea et coll. [73] ont d6crit une m4thode dite de migration s6dimen- tation pour am61iorer le r endement en cas de spermes d6ficients. Cependant , les techniques de centrifugation en gradient de densit6 lui sont pr6f6r6es ac tue l lement dans de telles situations.

VI. LES G R A D I E N T S DE D E N S I T E .

Divers compos6s ont 6t6 utilis6s pour la consti- tution des gradients de densit6. A l 'heure actuelle sont employ6s la silice collo~dale et le iodixanol. Le ,Percol l , (Pharmacia-Sigma) est constitu6 de silice collo~dale recouverte de polyvinylpyrrolidone [61, 62] Son usage doit 6tre s t r ic tement limit6 aux tests de migrat ion- survie (TMS) ~ vis6e diagnostique car certains lots peuvent contenir des quantit4s non n6gli- geables d 'endotoxines . En r u e d'AMP, le

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-PURESPERM- (NidaCon, GSteborg, Su6de) ou -I'ISOLATE- (Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA), qui sont 6galement des solutions de silice colloidale recouverte de silane et agr66s pour un usage humain , doivent 6tre utilis6s. Les r6sultats obtenus avec ces deux produits sont comparables ~ ceux du ,Percoll , [14, 19].

Appliqu6e aux spermatozoides humains pour la premi6re fois en 1981 par Gorus et Pipeleers [34], la pr6parat ion sur gradient de Percoll en vue d'AMP a connu un grand d6veloppement avant que son usage n'en soit restreint. Des simplifications [9, 29] ont 6t6 apport6es a la m6thode initiale (emploi d'un gradient discon- t inu ~ 6 densit6s) et plusieurs auteurs propo- s6rent des gradients simplifi6s ~ 2 ou 3 phases de densit6s diff6rentes [27, 53, 57, 63]. Cette simplification apparaissai t b6n6fique dans les oligoasth6nozoospermies sans rien faire perdre des avantages de la technique originelle du ,,Percoll- ~ 6 couches [52]:

- le plasma s6minal et les cellules autres que les spermatozoides sont re tenus dans les part ies hautes du gradient (faible densit6),

- les spermatozoides morts ou ~ mobilit6 d6fi- ciente sont retrouv6s dans ces m6mes fractions de faible densit6.

dans les fractions de forte densit6 sont concentr6s les spermatozoides les plus mobiles, avec de tr6s bonnes caract6ristiques morphologiques et pr6sentant une bonne matur i t6 nucl6aire avec une f6condance sup6rieure aux spermatozoides s61ectionn6s par migrat ion ascendante [5, 9, 10, 17, 45, 46, 65, 72]. Tr6s r6cemment [19], une 6tude a soulev6 l 'hypoth6se de 16sions membra- naires li6es au Percoll et un autre travail [71] a d6crit des anomalies de l'acrosome et du flagelle plus fr6quentes apr6s Percoll qu'apr6s filtration sur laine de verre. Ces publications vont ~ l 'encontre des donn6es g6n6ralement admises.

La technique de centrifugation sur gradient la plus employ6e actuel lement consiste ~ utiliser un gradient ~ 2 densit6s (45 et 90 % - pourcen- tages d6finis par rapport ~ la solution m6re isoosmotique dite 100 %) et ~ centrifuger le sperme d6pos6 au dessus du gradient, ~ 300 g pendant 20 minutes [52, 54]. Le lavage-centri-

fugation de la fraction de haute densit6 conte- nan t les spermatozoides les plus mobiles est simple ou double suivant les au teurs et les vi tesses et t emps de cen t r i fuga t ion sont variables (de 150 g ~ 600 g et de 5 ~ 10 minutes); il semble pr6f6rable de ne pas aller tm-del~ de 400 g pour l imiter les effets d616- t6res de la centrifugation sans descendre en dessous de 300 g pour ne pas perdre en effica- cit6 [51].

I1 a 6t6 propos6 diverses am61iorations pour les oligoasth6nozoospermies parmi lesquelles le recours ~ des gradients hyperosmotiques [15, 77] mais leur prat ique ne s'est pas r6pandue.

VII. G R A D I E N T S D E I O D I X A N O L

Le Percoll 6tant main tenant d6conseill6 pour un usage th6rapeutique chez l 'humain, le recours h des nouvelles techniques de pr6paration des spermatozoides s'est av6r6 indispensable . Hormis les nouvelles solutions de silice collo~dale commercial is6es sous l 'appel la t ion -PureSperm, et ,Isolate- qui remplacent le ,Percoll , en AMP, de nouvelles mol6cules sont propos6es. Des mol6cules iod6es classiquement utilis6es comme produits de contraste radiolo- gique peuvent trouver leur place en AMP pour confectionner des gradients de densit6. Le metrizamide, le iohexol (Nycodenz) et le iodixanol qui est un dim6re de Nycodenz (Optiprep"), sont des mol6cules ~ forte densit6 candidates pour une utilisation en AMP [30, 36].

Au cours de la centrifugation d'un gradient de densit6s, les spermatozo~des migrent pour s'ar- r6ter ~ l 'endroit off le milieu qui les entoure est de la m~me densit6 que les spermatozoides: on dit que la centrifugation des spermatozo~des est isopycnique. Dans le cas des gradients de silice colloidale (,Percoll,), la phase de plus forte densit6 est d 'une densit6 (1,10 g/ml) inf6- r ieure ~ celle des spermatozo~des qui est en moyenne de 1,12 g/ml [58], il y a donc culotta- ge des cellules. M~me les forces de centrifugation les plus 61ev6es sont incapables d 'entrai- ner les spermatozoides au-del~ de leur point d'6quilibre de densit6 avec le milieu qu'ils tra- versent. C'est ce principe de centr i fugat ion qui a 6t6 repris pour la confection des gradients d ' ,Optiprep-.

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Le sperme entier est m61ang6 avec la solution 100 % d ' ,Optiprep, prate ~ l 'emploi (1vol./1,2

vol.). Cette suspension spermat ique d'une den- sit6 de 1,32 g/ml est d6pos6e au fond d'un tube conique et recouverte par deux fractions de 2 ml chacune de solutions d ' -Optiprep, ~ 5 1 % (densit6 1,17g/ml) et ~ 26 % (densit6 1,09 g/ml). La centrifugation de 20 minutes ~ 300 x g permet d'observer les spermatozo~des s61ectionn6s sous la forme d'un anneau cellulaire ~ l'interface des deux phases 5 1 % et 26 %. Les spermatozoides s61ectionn6s (densit6 1,12 g/ml) ne peuvent pas p6n6trer la phase ~ 26 % de den- sit6 trop faible (1,09 g/ml).

Une caract6ristique originale de la solution d ' ,Optiprep- est qu'elle p6n6tre les cellules aux membranes alt6r6es, ce qui par d6finition la diff6rencie d'une solution collo~dale. Les cellules alt6r6es, spermatozoides et leucocytes ne seront donc pas retrouv6es dans la s61ection mais res teront dans le fond du tube car p6n6- tr6es par la solution d'Optiprep ~ 100 % de densit6 forte.

La densit6 d'un spermatozoide est repr6sent6e par sa t6te, le flagelle n ' inf luant quas iment pas sur la densit6 de la cellule. Pendan t la matu- rat ion testiculaire et 6pididymaire des sperma- tozoYdes, ils acqui6rent leur mobilit6 et leur capacit6 f6condante en m6me temps qu'augmente leur densit6 nucl6aire. Avec des gradients de densit6 comme le Percoll, on s61ec- t ionne des spermatozoides ayan t peu d'anomalies c6phaliques et ayant une bonne condensation nucl6aire [74] ce qui est corr616 avec une bonne f6condance des spermatozo~des in vitro [9, 15, 72, 74]. Quand il s'agit des spermatozoides s61ectionn6s sur gradient d '-Optiprep,, les gam6tes ayant la mei l leure condensation nucl6aire sont 6galement s61ectionn6s mais l 'int6grit6 de leur membrane est indispensable.

La technique de s61ection par -Opt iprep , donne un rendement non significativement plus faible que les gradients de solution colloidale [19] mais mont re ra peut 6tre une sup6rio- rit6 en terme de f6condance des spermatozoides aux membranes intactes s61ectionn6s. Cette technique m6rite d'6tre 6valu6e plus pr6- cis6ment.

V I I I . Q U E L L E T E C H N I Q U E U T I L I S E R ?

SPERME NORMAL

Lorsque le sperme est normal selon les crit6res OMS [56], la migrat ion ascendante peut 6tre utilis6e pour pr6parer les spermatozoides en vue d'une IIU ou d'une FIV classique ou avec micromanipulat ion (ICSI).

ANOMALIES NON SPI~CIFIQUES DU SPERME

En revanche, la pr6sence d'une oligo et /ou asth6nozoospermie impose le recours au gradient de densit6 pour obtenir un nombre suffi- sant de spermatozoides mobiles ~ ins6miner in utdro (IIU) ou in vitro (FIV).

Dans les oligoasth6not6ratozoospermies tr6s s6v6res, les gradients de densit6 peuvent ~tre utiles mais le lavage simple peut suffire pour obtenir le nombre de spermatozoides n6cessai- re ~ la microinjection [25].

CAS PARTICULIERS :

- A u t o i m m u n i s a t i o n a n t i s p e r m a t o z o i d e s

Lorsqu'il existe une auto- immunisat ion anti- spermatozoides avec anticorps anti-spermato- zoYdes (ACAS) fix6s sur les gam6tes m~les et/ou pr6sents dans le plasma s6minal, divers moyens ont 6t6 propos6s pour l imiter leur effet sur la f6condation. Pour que les ACAS pr6sents dans le plasma s6minal ne v iennent se fixer sur les spermatozoides apr6s l '6jaculation pendant le temps de la liqu6faction, l '6jaculat sera recueilli dans 5 ~ 10 ml de mil ieu contenant de l ' a lbumine [55]. I m m 6 d i a t e m e n t apr6s le recueil, le sperme dilu6 dans le milieu sera centrifug6 pour 61iminer le plasma s6minal. Cette technique permet de d iminuer significa- t ivement le taux de spermatozoides porteurs d'ACAS. D'autres auteurs aff irment que l'incu- bation du sperme avec du Test-Yolk buffer permet 6galement d'61iminer une part ie des ACAS mais ces r6sultats res tent ~ confirmer pour valider la technique [37, 81]. Les spermes ainsi pr6par6s sont ensui te centrifug6s sur un gradient de densit6.

- P r 4 s e n c e d e l e u c o c y t e s .

I1 est pr6f6rable d'avoir recours ~ la technique

290

de centrifugation sur gradient afin d'6viter la compaction des spermatozoides avec les leucocytes dans le culot spermatique comme ce serait le cas pour la technique de migrat ion ascendante. Des t ra i tements in vitro ~ vis6e antioxydante ont 6t6 propos6s [8, 35, 38, 59], mais leur emploi en prat ique clinique n'a pas encore 6t6 valid4.

- S p e r m e h y p e r v i s q u e u x .

Certains spermes se liqu6fient mal et posent un probl6me pour la mise en route de leur pr6- parat ion. La m6thode la moins agressive consiste a di luer le sperme puis ~ l 'aspirer et le refouler plusieurs fois ~ l'aide d'une pipette Pasteur . Le passage forc6 ~ t ravers une aiguille mont6e sur une seringue ou l'utilisation d'enzymes sont ~ proscrire car non d6nu6s d'innocuit6 pour les spermatozoides. En parti- culier, les enzymes pourra ient avoir une action mal contr616e sur des prot6ines membranai res spermatiques et leur origine le plus souvent animale pose un probl6me de s6curit6 micro- biologique.

- E j a c u l a t i o n r 6 t r o g r a d e .

Le pH ur ina i re est habi tuel lement acide est par cons6quent d616t6re pour les spermatozoides [21, 50]. De mani6re ~ alcaliniser les urines, il est demand4 au patient de prendre une cuill6re ~ caf6 de bicarbonate de soude la veille et le ma t in du recueil du sperme. Deux heures avant le pr616vement de sperme, le pat ient doit boire un litre d'eau plate en 6vi- tant les eaux min6rales et ne pas ur iner jusqu'au pr616vement. I1 est parfois possible de r6tablir le caract6re ant4rograde de l'6jacula- tion [21] en d e m a n d a n t au patient de prat iquer une mas turba t ion debout vessie pleine. En cas d'6chec il faudra alors t ra i ter rapidement les urines recueill ies imm6dia tement apr6s mas- turbation. L'osmolarit6 de l 'urine sera contr6- 16e car un choc hypoosmotique peut alt6rer gravement la mobilit6 des gam6tes. Apr6s lavage-centrifugation des urines, le culot est remis en suspension dans un milieu appropri6 et centrifug6 sur un gradient de densit4 [41].

- S p e r m e s i n f e c t ~ s .

L'infection du sperme est une contre-indication I'AMP. Cependan t le sperme contient fr6-

quemment des germes commensaux voire des pathog6nes mais en faible quant i t6 qu'il conviendra d'61iminer. La centrifugation sur gradient de ~Percoll, [11, 29, 63] et la migration ascendante [28, 78] permet ten t le plus souvent d'61iminer les bact6ries mais peuvent 6tre prises en d6faut pour E. Coli et les ent6ro- coques [33]. Pa r contre, les g rad ien t s de ,,Percoll- la issent passer les levures de type C a n d i d a A l b i c a n s [49].

- S p e r m e s c r y o c o n s e r v ~ s

La pr6parat ion des spermes cryoconserv6s n6cessite quelques particularit6s. En effet, avant cong41ation le sperme est m61ang6 avec un milieu cryoprotecteur ayant une osmolarit6 tr6s forte. L'objectif de la pr6paration des spermatozoides sera de res taure r au mieux la mobilit6 des gam6tes apr6s d6cong61ation et pour cela il sera n6cessaire de d6barrasser len- tement les spermatozoides du milieu cryoprotecteur. Plusieurs techniques de pr6parat ion des spermatozoides congel6s sont ut i l is6es mais une seule a 6t6 tr6s pr6cis6ment 6valu6e par l'6quipe de J K Critser [31] et pe rmet de pr6server au mieux la mobilit6 des gam6tes.

La pr6parat ion des spermes cryoconserv6s commence par l '6tape de d6cong61ation rapide de la paillette en la sor tant de l'azote liquide et en la gardant dans la main (proche de 37~ jusqu'~ la liqu6faction de son contenu. La technique de d6cong61ation en i m m e r g e a n t la paillette dans un bain marie est ~ proscrire sauf en cas de paillettes compl6tement scel- 16es, dites de hau te s6curit6.

Avant cong41ation, le sperme a 6t6 dilu6 volume ~ volume avec du milieu cryoprotecteur tr~s hyperosmolaire, il est donc n6cessaire apr6s d4cong61ation et avant de s61ectionner les spermatozoides de faire redescendre l'os- molarit6 dans des valeurs proches de celles du plasma, 300 mOsm. C'est cette 6tape qui condi- t ionnera la bonne res taura t ion de la mobilit6 spermatique [31].

Pour cela, le contenu d 'une paillette de sperme est dilu4 tr6s progressivement avec un m~me volume de milieu aux alentours de 300 mOsm. Pour une paillette d 'un volume de 2001~1, 8 fois 251al de mil ieu seront additionn6s au contenu de la pail let te s6quent ie l lement toutes les

291

m i n u t e s . E n s u i t e , ce t t e s u s p e n s i o n s p e r m a - t ique es t d6pos6e s u r u n g r a d i e n t de dens i t6 et t r a i t6e c l a s s i q u e m e n t .

XI. O R I E N T A T I O N T H E R A P E U T I Q U E E N AMP.

Le choix de la t e c h n i q u e d 'AMP p r e n d en c o m p t e les f a c t e u r s f 6 m i n i n s d ' infer t i l i t6 . P a r exemple , l ' absence de t r o m p e s chez u n e f e m m e es t b ien stir u n e con t r e - ind i ca t ion ~ la r6al isa- t ion d'IA. Le n o m b r e de s p e r m a t o z o i d e s qu'i l e s t poss ible d ' ob t e n i r ~ p a r t i r du s p e r m e est 6 g a l e m e n t t r6s i m p o r t a n t d a n s le choix de la t e c h n i q u e d ' A M P ~ proposer . C 'es t pourquo i , il s e m b l e r a i t t o t a l e m e n t i l logique de p ropose r u n ac te t h 6 r a p e u t i q u e ~ u n couple p o u r leque l u n e 4va lua t ion p r6a lab le d u s p e r m e d a n s le cadre d ' u n t e s t de s61ect ion-survie n ' a u r a i t pas 6t6 r6alis6. D ' a u t r e s pa r t , les IA son t ~ p ropose r en pr ior i t6 m 6 m e si la qua l i t6 du s p e r m e es t m6diocre m a i s que le Tes t de M i g r a t i o n - S u r v i e (TMS) p e r m e t d ' ob t e n i r u n mi l l ion de s p e r m a - tozoides s61ectionn6s. D a n s ce cas, la r6al isa- t i on de 6 IA es t i m p o r t a n t e ~ r e s p e c t e r p u i s q u e n4cessa i re ~ d o n n e r t o u t e s ses chances de gros- sesse au couple n o t a m m e n t en cas d 'a l t4ra- t ions non sp6ci f iques des ca rac t6 r i s t i ques du spe rme .

La d4cision de la m e i l l e u r e t h 6 r a p e u t i q u e p ropose r au couple se ra donc pr i se en fonc t ion d u n o m b r e to ta l de spermatozo~des mobi les recuei l l i s d a n s la p r 6 p a r a t i o n du s p e r m e en t e n a n t c o m p t e d u p o u r c e n t a g e de f o r m e s typ iques . E n effet, en cas de t 6 r a t o z o o s p e r m i e m a j e u r e la f6condance s p e r m a t i q u e ne pour- r a i t pas c o r r e c t e m e n t s ' e x p r i m e r et il ne se ra i t pa s logique de p r o p o s e r des i n s 6 m i n a t i o n s i n t r a - u t 6 r i n e s si ~ c e t t e t 6 r a t o z o o s p e r m i e s ' a jou ta i t u n n o m b r e de spermatozo~des ins6- m i n 6 s t r6s faible.

Le TMS r6al is6 a v a n t u n e A M P c o m p r e n d en p l u s de l '6 tape de s41ection, u n e 6va lua t i on de la su rv ie des s p e r m a t o z o i d e s ~ 2 h., 4 h. e t 24 h. apr6s p r 6 p a r a t i o n . Ce t t e surv ie es t e s t im6e s u r la mobi l i t6 des g a m 6 t e s aux d i f f6ren ts t e m p s . L 'absence de su rv i e au t e m p s 4 h com- p r o m e t les c h a n c e s de f6conda t ion en F I V clas- s ique et o r i e n t e r a p l u t 6 t ve rs I 'ICSI. La su rv ie

24 h e u r e s pose c e p e n d a n t des p rob l6mes de

s t a n d a r d i s a t i o n . I1 s e m b l e n6cessa i re d ' a jus t e r la concen t r a t i on s p e r m a t i q u e et d ' e s t imer la surv ie dans u n m i l i e u ~ la compos i t ion b ien d6finie. A c t u e l l e m e n t , ces 616ments de s tan- d a rd i s a t i on n ' e x i s t e n t pas .

E n ce qui conce rne le n o m b r e de spe rma to - zoides m o b i l e s s61ec t ionn6s a u TMS, les chiffres s u i v a n t s son t d o n n 6 s ~ t i t re d 'ordre de g r a n d e u r car c h a q u e doss i e r doi t ~tre appr6ci6 au cas p a r cas.

Lorsque la p r 6 p a r a t i o n d ' u n 6jacula t con t i en t au moins 1 x 106 spe rmatozo~des mobi les progressifs (mobil i t6 de t ype " a " et " b " se lon I 'OMS) [56] les i n s 6 m i n a t i o n s i n t r a -u t6 r ine s p e u v e n t 6tre p ropos6es . U n n o m b r e de sperma tozo ides i n f6 r i eu r doi t fa ire r ecour i r au c u m u l de deux 6 jacu la t s recuei l l i s ~ u ne h e u r e d ' in terval le . L 'object i f p o u r les IA es t de ne pas de scend re en de s so us de 0,5 x 106 spe rma to - zo~des mobi les i n s6min6s .

La F IV c lass ique n6cess i t e le recuei l d ' au mo ins 0,5 x 106 de s p e r m a t o z o i d e s mobi les et en t r e 0,2 et 0,5 x 106 s p e r m a t o z o i d e s il s e ra n6cessa i re de r e c o u r i r ~ la t e c h n i q u e de F IV en mic rogou t t e s qui p e r m e t de n ' i n s 6 m i n e r que 5 000 ~ 10 000 s p e r m a t o z o i d e s p a r ovocyte.

Enf in , I ' ICSI d e m e u r e la seu le possibil i t6 th6- r a p e u t i q u e lo r sque m o i n s de 0,2 X 106 sperma tozo ides mobi les s o n t r6cup6r6s ou q u ' u n e t6 ra tozoospe rmie m a j e u r e es t observ6e.

X. C O N C L U S I O N

La mise en oeuvre d ' u n e A M P n6cess i te la r6a- l i sa t ion pr6a lab le d ' u n t e s t d e m i g r a t i o n s u r v i e a ins i que le pr6c ise le t ex te du "Guide de B o n n e s P r a t i q u e s de I 'AMP" (J.O. d u 28.02.99). Ce t e s t p e r m e t t r a de d 6 t e r m i n e r la me i l l eu re m 6 t h o d e de p r 4 p a r a t i o n des s p e r m a - tozoides pou r le p a t i e n t concern6 et condi t ion- n e r a le choix d ' u ne AMP. B ien stir, ce choix ne r e p o s a n t pas u n i q u e m e n t s u r le r 4 su l t a t d u t e s t de m i g r a t i o n - s u r v i e , d ' a u t r e s inves t iga- t ions d i a g n o s t i q u e s p e u v e n t s 'envisager .

Deux m 6 t h o d e s p r i n c i p a l e s s o n t a c t u e l l e m e n t u t i l i s6es : la m i g r a t i o n a s c e n d a n t e et la centr i - fuga t ion su r g r a d i e n t de silice colloidale. Les biologis tes do iven t r e s t e r v ig i l an t s su r l ' emploi de ce r t a ins p r o d u i t s e t il e s t r e c o m m a n d 6 d 'ut i -

292

l i s e r des m i l i e u x p r ~ t s h l ' e m p l o i e t a g r ~ s p o u r

u n u s a g e h u m a i n . D e m ~ m e , il f a u t 4 v i t e r t o u t e

s u p p l e m e n t a t i o n d e s m i l i e u x c o m m e r c i a l i s ~ s

p a r des m o l e c u l e s d o n t l ' e f f e t n ' a p a s ~t~ p r~a -

l a b l e m e n t v a l i d ~ p a r u n e e x p e r i m e n t a t i o n .

A B S T R A C T

S e l e c t i o n P r o c e d u r e s o f s p e r m a t o z o a b e f o r e a s s i s t e d r e p r o d u c t i v e

t e c h n o l o g i e s

C . M A T H I E U , H . L U C A S

T h e r e are m a n y p r o c e d u r e s to s e l e c t s p e r m a - t o z o a b u t t h o s e p r o c e d u r e s are o f t e n s p e c i f i c o f e a c h a n d r o l o g y c e n t r e . T h i s r e v i e w that i s n o t an e x h a u s t i v e r e v i e w o f t h e n u m e r o u s m e t h o d s p u b l i s h e d i s r a t h e r d e v o i d e d t o f o c u s o n t h e m a i n t e c h n i q u e s , t h e s p e r m w a s h i n g , t h e f i l t r a t i o n m e t h o d s ( ,~SpermPrep- ) , t h e s w i m - u p , a n d t h e d i s c o n t i - n u o u s d e n s i t y g r a d i e n t s w i t h c o l l o i d a l so lu - t i o n s ( , (Percol l - , P u r e S p e r m " a n d - I s o l a t e - ) i n c l u d i n g i o d i n a t e d o r g a n i c m o l e c u l e a s (~OptiPrep- . T h e f i r s t p a r t p r e s e n t s a s y n t h e - s i s o f l i t e r a t u r e in o r d e r to b r i n g o u t s t a n d a r - d i z e d p r o c e d u r e s , a n d a s u m m a r y o f t h e a d v a n t a g e s a n d d i s a d v a n t a g e s o f e a c h s tep o f t h e s e p r o c e d u r e s .

S o m e s p e c i f i c a n o m a l i e s o f s p e r m n e e d part i - c u l a r t r e a t m e n t s . T h e r e is a c o n s e n s u s o n t h e v a l i d a t e d t e c h n i q u e s t o p r e p a r e s e m e n s a m p l e s in t h e p r e s e n c e o f a n t i s p e r m ant ibo - d ies , l e u k o c y t e s , b a c t e r i a l c o n t a m i n a n t s , a n d a l s o s e m e n s a m p l e s e x h i b i t i n g h y p e r v i s c o s i t y o r in c a s e o f r e t r o g r a d e e j a c u l a t i o n . C r y o p r e - s e r v e d s p e r m p r e p a r a t i o n is a l so d e s c r i b e d w i t h r e f e r e n c e s t o e x p e r i m e n t a l r e s u l t s in f r e e z i n g - t h a w i n g h u m a n s p e r m a t o z o a . T h e s e c o n d p a r t p r o p o s e s g u i d e l i n e s for t h e the - r a p e u t i c c h o i c e o f t h e a p p r o p r i a t e a s s i s t e d r e p r o d u c t i v e t e c h n o l o g i e s (i .e : i n t r a u t e r i n e ar t i f i c ia l i n s e m i n a t i o n , in v i t r o f e r t i l i z a t i o n o r i n t r a c y t o p l a s m i c s p e r m i n j e c t i o n ) accor - d i n g to s e m e n p a r a m e t e r s , a n d to t h e o u t c o m e o f s p e r m s e l e c t i o n a n d s u r v i v a l .

Key-words : Human semen, sperm preparation, swim-up, density gradients, Percoll, filtration methods.

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tests de selection des spermatozoides avant assistance ...en amp les techniques mises en oeuvre...

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