CARACTERE BIOCHIMICE DE CULTURĂ ALE MICROORGANISMELOR

Examinarea caracterelor biochimice de cultură ale unui microorganism constă din evidenţierea echipamentului său enzimatic şi a particularităţilor sale metabolice şi reprezintă una din cele mai importante etape în identificarea şi clasificarea unui microorganism.

Testele biochimice sunt standardizate şi se efectuează numai pe culturi pure, folosind culturi microbiene martor care produc reacţie pozitivă sau negativă şi medii speciale, numite medii de diagnostic diferenţiat.

Prezentăm în tabelul urmator principiile care stau la baza unora dintre testele biochimice, teste care sunt frecvent utilizate în practica microbiologică la caracterizarea şi identificarea speciilor microbiene.

Tabel 1.

Testul biochimic

Principiul testului Evaluarea testului Microorganisme martor/ Observatii

Evidenţierea producerii de gaz la

fermentaţia glucidelor

Evidentiaza capacitatea microorganismelor de a fermenta glucidele cu producere de dioxid de carbon, care se acumulează în tubuşorul Durham.

Reacţie pozitivă: Gazul se acumulează în tubuşorul Durham şi determină ridicarea lui la suprafaţa mediului de cultură;Reacţie negativă: nu se observă acumularea de gaz în tubuşorul Durham.

Unele bacterii şi majoritatea drojdiilor.

Testul roşului de

metil (fermentaţia acidă mixtă)

Evidentiaza metabolizarea glucozei cu producere de acid (lactic, acetic, succinic, formic), dioxid de carbon, hidrogen şi etanol. Acumularea acestor acizi determină scăderea pH din mediu la valori mai mici de 4.5 şi poate fi pusă în evidenţă cu ajutorul substanţei indicatoare de pH roşu de metil.

Reacţie pozitivă: adăugarea indicatorului în mediul de cultură determină colorarea în roşu a mediului. Reacţie negativă: adăugarea substanţei indicator de pH colorează mediul în galben.

Escherichia sp., Salmonella sp., Proteus sp.

Testul Voges-

Proskauer

Reacţia Voges-Proskauer pune în evidenţă capacitatea unui microorganism de a produce acetil-metil-carbinol, care în mediu alcalin este oxidat la

Reacţie pozitivă: apariţia în mediu a culorii roşii. Reacţie negativă: culoarea mediului

E. aerogenes

diacetil. Diacetilul se combină cu arginina, creatinina sau creatina din mediu şi determină apariţia unei coloraţii roşii.

rămâne neschimbată.

Producerea catalazei

Testul detecteaza producerea de catalaza, care converteste apa oxigenata (H2O2) in apa si oxigen.

Reacţie pozitivă: se observa o reactie efervescenta daca o picatura de H2O2 se depunde pe colonie;Reacţie martor: o alta picatura de H2O2 se depune pe mediu si se compara reactiile obtinute.

In cazul bacteriilor crescute pe sange agar pot aparea reactii fals pozitive datorita prezentei in mediu a celulelor rosii ale sangelui.

Testul producerii oxidazei

Testul detecteaza producerea de oxidazei. In cazul metodei cu hârtia de filtru, pe aceasta se depun cateva picaturi de dimetil-parafenildiamina-hidroclorat 1% si o mica portiune din colonie dezvoltata pe mediu neselectiv.

Reacţia pozitivă: după 10-15 secunde coloniile oxidază-pozitive îşi schimbă culoarea în roz, apoi în roşu închis, devenind în final negre.Reacţia negativă: coloniile oxidază-negative nu îşi modifică culoarea.

Este unul dintre cele mai importante teste, deoarece permite diferenţierea între microorganismele din familia oxidază-negative (Enterobacteriacetae) şi alte specii oxidază-pozitive (Pseudomonas sp.).

Reducerea nitratului

Evidentiaza capacitatea bacteriilor facultativ aerobe de a produce nitraze care converteste nitratul la nitrit. Enzima se evidentiaza rapid, in absenta oxigenului liber cu reactivii: acid sulfanilic si dimetil-α-naftilamina.

Reacţia pozitivă: adaugarea in mediu de crestere cu nitrat a catorva picaturi de reactivi determina apariţia în mediu a culorii roşii. Reacţia negativă: mediul nu îşi modifică culoarea.

E. coli

Testul indolului

Evidentiaza capacitatea unor bacterii de a degrada triptofanul cu producere de indol şi acid piruvic. Indolul se evidenţiază rapid cu ajutorul reactivului Kovacs.

Reacţie pozitivă: apariţia unui inel colorat în roşu la suprafaţa mediului lichid.

Reacţie negativă: apariţia unui inel galben la suprafaţa mediului lichid.

E. coli, Proteus vulgaris

Hidroliza Evidentiaza capacitatea unor Reacţie pozitivă: Permite diferentierea

ureei bacterii de a hidroliza urea cu producere de amoniac, care alcalinizeaza pH mediului. Aceasta poate fi pusă în evidenţă cu ajutorul substanţei indicatoare de pH roşu fenol, care are o culoare galbena la pH 6.8 si rosu la cresterea pH peste valoarea 8.1.

adăugarea indicatorului în mediul de cultură determină colorarea în roşu a mediului. Reacţie negativă: adăugarea substanţei indicator de pH colorează mediul în galben.

intre grupul Proteus si alte bacterii gram-negative patogene

Producerea de H2S

Testul evidentiaza producerea de H2S prin dezaminarea cisteinei. Producerea de H2S pe mediu cu sulfat feros (mediul Kligler) determina formarea unui precipitat negru

Reacţie pozitivă: mediul formeaza un precipitat negru.Reacţie negativă: mediul nu îşi modifică culoarea rosie datorita indicatorului rosu fenol.

Proteus vulgaris

Testul utilizării citratului

Evidentiaza bacteriile care au capacitatea de a utiliza citratul ca unică sursă de carbon, ceea ce determină alcalinizarea mediului, evidenţiată cu ajutorul unei substanţe indicatoare de pH.

Reacţie pozitivă: culoarea mediului Simmons virează de la galben spre albastru.Reacţie negativă: mediul nu îşi modifică culoarea.

E. aerogenes, Salmonella typhimurium

Deaminarea fenilalaninei

Evidentiaza dezaminarea fenilalaninei cu producere de acid fenilpiruvic care in prezenta de FeCl2 10% formeaza un compus colorat in verde.

Reacţie pozitivă: In prezenta de clorura ferica mediul cu fenilalanina se coloreaza in verde. Reacţie negativă: mediul nu îşi modifică culoarea.

Proteus sp., Morganella sp., Providencia sp.

SISTEME MULTITEST DE IDENTIFICARE A MICROORGANISMELOR

Identificarea şi clasificarea microorganismelor este un proces complex, care se poate realiza prin două categorii de metode:

metode clasice, care presupun utilizarea cheilor taxonomice de identificare a germenilor, se găsesc prezentate în manuale de specialitate cum sunt Bergey`s Manual of Determinative Bacteriology, pentru bacterii, şi determinatoarele lui Lodder, 1974, Kreger van Rij, 1984 sau Barnett, 1990, pentru fungi;

metode moderne, care utilizează sisteme multitest de identificare a diferitelor grupe de microorganisme, metode care au la bază cheile biochimice de identificare. Cele mai utilizate sisteme multitest de identificare rapidă sunt: sistemul Enterotube II pentru enterobacterii, sistemul Oxi/Ferm Tube pentru bacteriile Gram-negative şi oxidazo-pozitive, sistemul API pentru bacterii, fungi şi stafilococi - API 20E, API 20C, API Staph-Ident System.

Comparativ cu metodele clasice, utilizarea sistemelor multitest de identificare prezintă o serie de avantaje, dintre care amintim:

obţinerea rezultatelor într-un timp foarte scurt, în unele cazuri chiar într-un interval de 5 ore; uniformitatea rezultatelor; precizia/siguranţa rezultatelor; simplitatea tehnicilor de lucru; un consum minim de materiale şi medii de cultură.

Pentru a exemplifica, prezentăm în continuare tehnica de lucru pentru identificarea cu sistemul API 20E, produs de firma Analytab Products, Plainview, New York şi folosit la identificarea microorganismelor din familia Enterobacteriaceae şi a altor bacterii Gram-negative oxidazo-negative (Fig. 8.23.).

Exemplu: 5 144 572 = E. coli

Fig. 8.23. Tehnica de lucru pentru identificarea microorganismelor cu ajutorul sistemului API 20E (prelucrare după H. Benson, 1990)

1 -Selectarea unui izolat colonial din tulpina de testat, care este inoculată în ser fiziologic şi omogenizarea suspensiei cu un agitator tip Vortex; 2 -După notarea datelor la capătul plăcii

(numărul coloniei şi numele executantului) se dispersează în tavă, cu ajutorul pisetei, 5 ml de apă distilată sterilă; 3 - Galeria API 20E se plasează cu grijă în tavă, pentru a preveni contaminarea; 4

- Se dispersează suspensie de microorganisme în cele 20 de compartimente ale galeriei API, folosind o pipetă Pasteur sterilă (se vor umple parţial compartimentele notate: ADH, LDC, ODC,

H2S şi URE şi se vor umple complet compartimentele CIT , VP şi GEL ); 5 - În compartimentele ADH, LDC, ODC, H2S şi URE se adaugă cu o altă pipetă Pasteur şi ulei

mineral steril, pentru a asigura condiţii de anaerobioză; 6- După incubare şi adăugarea reactivilor se citesc rezultatele, se stabileşte numărul caracteristic şi se consultă Indexul furnizat de firmă; 7

- Exemplu de citire a rezultatelor pentru E. coli.

Sistemul API 20E este fabricat din plastic şi este alcătuit din două componente:

o tavă din plastic, care permite asigurarea unui mediu umed în timpul efectuării testului; o galerie pe care se găsesc 20 de compartimente separate, fiecare compartiment fiind reprezentat de o alveolă şi un tub în care se află mediu nutritiv deshidratat specific.

Sistemul permite realizarea simultană a 23 de teste biochimice diferite.

Tehnica de lucru:

Etapa I Inocularea

izolarea în cultură pură a microorganismului de testat;

se realizează coloraţia Gram şi testul oxidazei pentru a confirma faptul că microorganismul testat este Gram-negativ şi oxidază-negativ;

se notează pe testul API numărul microorganismului de testat şi numele lucrătorului care efectuează identificarea;

toate operaţiile ulterioare se efectuează respectându-se condiţiile de manipulare aseptică, pentru a preveni contaminarea cu germeni din aer sau de pe masa de lucru;

se selectează o colonie microbiană, care este transferată într-o soluţie de 0,85% NaCl (ser fiziologic);

soluţia de ser fiziologic inoculată este bine omogenizată cu ajutorul unui agitator tip Vortex;

în tava sistemului API se dispersează cu ajutorul pisetei 5 ml de apă distilată sterilă;

galeria API se introduce cu grijă în tavă, în aşa fel încât să se prevină contaminarea testului cu germeni de pe masa de lucru;

dispersarea soluţiei de ser fiziologic inoculate în cele 20 de alveole ale galeriei API, folosind o pipetă Pasteur sterilă;

se vor umple parţial compartimentele notate: ADH, LDC, ODC, H2S şi URE (aceste compartimente sunt subliniate);

se vor umple complet compartimentele CIT , VP şi GEL (aceste compartimente fiind marcate);

se adaugă cu o altă pipetă Pasteur ulei mineral steril la suprafaţa lichidului din compartimentele ADH, LDC, ODC, H2S şi URE, pentru a asigura condiţii de anaerobioză.

se acoperă cu un capac din plastic testul API 20E şi se incubează la termostat, la 37°C, pentru 18-24 de ore.

Etapa II Evaluarea testului

Înainte de începerea acestei etape se va studia Anexa 6, care explică simbolurile utilizate şi prezintă modul de interpretare a reacţiilor pentru fiecare test.

se citeşte rezultatul din compartimentul GLU:

dacă rezultatul este negativ (după incubare 18-24 de ore), atunci microorganismul testat nu aparţine familiei Enterobacteriaceae şi pentru identificarea lui este necesară o perioadă suplimentară de incubare;

dacă rezultatul în compartimentul GLU este negativ, dar pe placă apar mai puţin de trei rezultate pozitive, rezultatele obţinute nu sunt relevante;

dacă testul GLU este pozitiv (galben) şi apar mai mult de trei reacţii pozitive pe placă atunci testul se va continua;

se adaugă următorii reactivi:

în tubul TDA se adaugă o picătură de clorură ferică 10% şi se notează apariţia reacţiei pozitive (roşu-cafeniu) sau negative (galben);

în tubul VP se adaugă o picătură de soluţie Barritt A sau B şi se citeşte rezultatul după 10 minute (culoarea roz apărută imediat după adăugarea reactivului nu se ia în considerare); reacţia pozitivă (roz închis sau roşu) sau negativă (incolor);

în tubul IND se adaugă o picătură de reactiv Kovacs şi se citeşte rezultatul după două minute: reacţie pozitivă (apare un inel roşu) sau negativă (apare un inel galben spre cafeniu);

se examinează tubul GLU pentru a observa prezenţa bulelor de gaz, care indică reducerea azotitului (NO2

-) şi formarea azotului gazos (N2);

Ulterior se adaugă la testul GLU două picături de reactiv pentru azotit, iar reacţia se citeşte după 2-3 minute: reacţia pozitivă, care confirmă reducerea nitratului (roşu). Pentru a confirma testul negativ se adaugă praf de zinc, iar rezultatele se citesc după 10 minute: reacţia este pozitivă dacă apare culoarea roz-portocaliu, care confirmă faptul că nu s-a realizat reducerea azotitului sau reacţia este negativă, dacă apare culoarea galbenă, care confirmă prezenţa N2.

în compartimentele MAN, INO şi SOR se adaugă câte o picătură de peroxid de hidrogen (apă oxigenată) şi se citeşte rezultatul după 2 minute: reacţie pozitivă, care confirmă producerea de catalază (apar bule) sau reacţie negativă. Cele mai bune rezultate vor fi obţinute în cazul în care nu s-a produs gaz prin fermentaţie.

evaluarea finală a testului presupune înregistrarea tuturor rezultatelor şi stabilirea unui număr caracteristic format din 7 cifre:

pe foaia de observaţie testele sunt grupate câte trei, rezultând astfel 7 grupe (Fig. 8.24.);

fiecare dintre teste este evaluat cu un număr de puncte 1, 2 sau 4;

Informaţii suplimentare

Microorganismul identificat

pe baza consultări Anexei 6 se notează pe foaia de observaţie în dreptul fiecărui test rezultatul testului (+ sau -);

dacă testul este pozitiv i se va acorda punctajul corespunzător, iar dacă este negativ testul va fi evaluat cu 0;

la nivelul fiecărui grup se numără punctajul rezultat, obţinându-se astfel cifrele numărului caracteristic;

la numărul caracteristic format din 7 cifre se pot adăuga 2 cifre ce reprezintă numărul suplimentar şi care apreciază reacţiile: NO2 – reducerea azotatului la azotit, N2 – reducerea completă a azotatului la azot sau amine, MOT – observarea motilităţii, MAC – creşterea pe mediu Mac Corkey, OF/O – utilizarea oxidativă a glucozei şi OF-F – fermentaţia glucozei.

identificarea speciei se realizează consultând Indexul furnizat de firmă;

la finalul experimentului toate componentele sistemului API 20E se introduc într-un recipient cu amestec dezinfectant (nu se aruncă la gunoi).

Nr. referinţă ________________________________________

Data ______________________________________________

Locul recoltării ______________________________________

Persoana care a realizat recoltarea/analiza _________________

ONPG

ADH

LDC

ODC

CIT

H

2S

URE

TDA

IND

VP

GEL

GLU

MAN

INO

SOR

RHA

SAC

MEL

AMY

ARA

OXI

1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4

5h

24 h

48 h

Număr

NO2

N2

MOT

MAC

OF-O

OF-F

1 2 4 1 2 4

5h

24 h

48 h

Număr

Fig. 8.24. Foaia de observaţie pentru testul API 20E

Test 8.4

1. Explicaţi importanţa examinării caracterelor biochimice pentru procesul de identificare a microorganismelor.

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Completaţi spaţiile libere din frazele următoare:

a) testele biochimice sunt _____________ şi se efectuează numai pe culturi pure, folosind __________________________ care produc reacţie pozitivă sau negativă şi medii speciale, numite _________________________________________________________

b) testul Voges-Proskauer reprezintă _____________________________________ ______________________________________________________________________

c) testul catalazei este utilizat la ______________________________________________

3. Explicati principiul testului de producere a H2S.

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4. Explicaţi principiul metodei de evidenţiere a producerii de gaz la fermentaţia glucidelor.

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Metoda de evidenţiere a proprietăţilor zaharolitice presupune:

a) evidenţierea producerii de CO2 cu ajutorul unei substanţe indicatoare de pH;b) identificarea speciilor de bacterii care au capacitatea de a metaboliza zaharurile cu

producere de acid;c) modificarea pH-ului în mediu datorită activităţii microorganismelor care utilizează

acizi.

6. Precizaţi principalul scop al testului de hidroliza a ureei in cazul testarii bacteriilor patogene Gram-negative din intestine.

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

7. Explicaţi principiul testului de utilizarea a citratului si scopul sau.

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

8. Completaţi spaţiile libere din frazele următoare:

a) tulpinile _______________________________ produc reacţie pozitivă la testul indolului;

b) la testul Voges-Proskauer tulpina martor-pozitiv este _______ _______________ iar tulpina martor-negativ ___________________;

c) la testul utilizării citratului se utilizează mediul ___________;

9. Microorganismele care utilizează citratul fac parte din categoria:

a) bacteriilor;

b) drojdiilor;

c) fungilor imperfecţi.

10. Explicati principiul testului de dezaminare a fenilalaninei si precizati care Enterobacteriaceae sunt diferentiate prin acest test.

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Test 8.5

1. Prezentaţi avantajele utilizării sistemelor multitest de identificare a microorganismelor.____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Completaţi spaţiile libere din frazele următoare:

a) principalul dezavantaj al identificari patogenilor prin metode clasice este _________________________________________________________________________

b) sistemul API 20E este folosit la identificarea __________________________________

c) pentru identificarea enterobacteriilor se folosesc__________________________________________________________________

d) sistemul API 20E este format din____________________________________________

________________________________________________________________________

e) sistemul API 20E permite realizarea a_________________ teste biochimice diferite;

3. Prezentaţi etapa I (Inocularea) de identificare a germenilor cu ajutorul sistemului API 20E.

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4. Explicaţi ce informaţii ne oferă reacţia din testul GLU.

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Precizaţi care sunt reactivii necesari la evaluarea rezultatelor în etapa a II de identificare cu sistemul API 20E şi în care compartimente se adaugă.

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________