evaluari biochimice in explorarea hepatica

12
ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ENZIMELOR CU IMPORTANŢĂ ÎN EXPLORAREA HEPATICĂ GENERALITATI Datele de laborator care exploreaza afectarea hepatica sunt denumite in mod obisnuit teste functionale hepatice (TFH). Acestea cuprind o baterie de analize biochimice care susţin diagnosticul de hepatopatie. Ficatul este sediul unor multitudini impresionanate de procese biochimice, astfel încat nu există nici un test care sa poata fi considerat indicator unic pentru disfunctia hepatică. Astfel în cadrul testelor funcţionale hepatice un posibil profil biochimic ar avea următoarea structură: A. enzime hepatice: ALAT (alanin amino transferaza), ASAT(aspartat aminotransferaza), ALP (fosfataza alcalină) , GGT (gamma glutamiltranspeptidaza), LDH (lactat dehidrogenaza) etc. B. bilirubină serică C. proteine totale D. albumină E. uree ENZIME HEPATICE CU ROL ÎN DIAGNOSTIC DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ALANIN AMINOTRANSFERAZEI (ALAT) (GPT) Principiul metodei: Alanin aminotransferaza (ALAT) catalizează următoarea reacţie: COOH CH 2 CH 2 COOH COOH C=O CH 2 CH 2 COOH ALAT C NH 3 COOH C=O COOH CH 3 CH NH 2 COOH Acid

Upload: vuthu

Post on 28-Jan-2017

269 views

Category:

Documents


7 download

TRANSCRIPT

Page 1: evaluari biochimice in explorarea hepatica

ACTIVITATE EXPERIMENTALĂ

DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ENZIMELOR CU IMPORTANŢĂ ÎN EXPLORAREA

HEPATICĂ

GENERALITATI

Datele de laborator care exploreaza afectarea hepatica sunt denumite in mod obisnuit –

teste functionale hepatice (TFH). Acestea cuprind o baterie de analize biochimice care susţin

diagnosticul de hepatopatie. Ficatul este sediul unor multitudini impresionanate de procese

biochimice, astfel încat nu există nici un test care sa poata fi considerat indicator unic pentru

disfunctia hepatică.

Astfel în cadrul testelor funcţionale hepatice un posibil profil biochimic ar avea

următoarea structură:

A. enzime hepatice: ALAT (alanin amino transferaza), ASAT(aspartat

aminotransferaza), ALP (fosfataza alcalină) , GGT (gamma glutamiltranspeptidaza), LDH (lactat

dehidrogenaza) etc.

B. bilirubină serică

C. proteine totale

D. albumină

E. uree

ENZIME HEPATICE CU ROL ÎN DIAGNOSTIC

DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ALANIN AMINOTRANSFERAZEI (ALAT) – (GPT)

Principiul metodei:

Alanin aminotransferaza (ALAT) catalizează următoarea reacţie:

COOH

CH2

CH2

COOH

COOH

C=O

CH2

CH2

COOH

ALATC NH3

COOH

C=O

COOH

CH3

CH NH2

COOH

Acid

Page 2: evaluari biochimice in explorarea hepatica

-cetoglutaric Alanină Acid glutamic Acid piruvic

Piruvatul format este transformat în lactat de către NADH+H+ în reacţia catalizata de

LDH (lactat dehidrogenază) conform reacţiei:

CH3 C COOH

O OH

LDH

NAD

CH3 COOHCH

NADH+H+

Acid piruvic Acid lactic

Se măsoară viteza de diminuare a concentraţiei NADH+H+ pe măsură ce trece în NAD

+,

prin scăderea absorbţiei în UV. Ea este direct proporţională cu activitatea ALAT.

Aparatură:

Spectrofotometru

Cronometru

Reactivi:

1. Soluţie substrat; L-alanina 800 mM in tampon fosfat 100 mM şi pH=7,4

2. Amestec de: -cetoglutarat 10 mM, NADH++H

+ 0,2 mM, LDH 10mg/l în tampon

fosfat 100 mM, pH=7,4

Mod de lucru:

În momentul începerii determinărilor se amestecă soluţia 1 cu 2 (4 părţi reactiv 1 cu 1

parte reactiv 2 ).

Amestec de reactivi 1+2 (µl)

µl)

1000

Ser (µl)

k3CI f syy) C

250

Se agită bine şi se citesc extincţiile la lungimea de unda de 366 nm în cuve de l cm.

Citirea se face din minut în minut timp de 3 minute la 25 C

Calcularea rezultatelor:

Se face diferenţa între prima şi ultima citire şi se împarte la numărul de minute citite. Se

notează cu ( A/min).

Concentraţia ALAT în UI/l = ( A/min) x 1520

Observaţii: dacă valoarea ( A/min) creşte mai mult de 0,08 se recomandă diluarea a 0,1

ml probă cu 0,9 ml ser şi se înmulţeşte rezultatul cu 10. Citirile se pot efectua şi la 30 C şi 37

C.

Page 3: evaluari biochimice in explorarea hepatica

Intervale de referinţă:

25 C 30 C 37 C

Bărbaţi pînă la 22 UI/l pînă la 29 UI/l pînă la 40 UI/l

Femei pînă la 17 UI/l pînă la 22 UI/l pînă la 31 UI/l

DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ASPARTAT AMINOTRANSFERAZEI (ASAT)-

(GOT)

Principiul metodei:

Alanin aminotransferaza (ASAT) catalizează următoarea reacţie:

COOH

CH2

CH2

COOH

COOH

C=O

CH2

CH2

COOH

C=O

COOHCOOH

COOH

CH NH2

CH2ASAT

NH3HC

COOH

CH2

Acid Acid Acid Acid

α cetoglutaric aspartic glutamic oxalacetic

Oxalacetatul format este transformat în malat de către NADH++ H

+ în reacţia catalizată

de MDH (malat dehidrogenază) conform reacţiei:

COOH

CH2

COOH

HC OH

COOH

C=O

CH2

COOH

NAD

MDH

NADH+H+

Acid oxalacetic Acid malic

Se măsoară viteza de diminuare a cantităţii de NADH+H+ pe măsură ce trece în NAD

+,

prin scăderea absorbţiei în UV. Ea este direct proporţională cu activitatea enzimei ASAT.

Aparatură:

Spectrofotometru

Cronometru

Page 4: evaluari biochimice in explorarea hepatica

Reactivi:

1. Soluţie substrat: aspartat 200 mM în tampon fosfat 100 mM şi pH =7,4

2. Amestec de: -cetoglutarat 12 mM, NADH++H

+ 0,2 mM, LDH 10mg/l, MDH 10

mg/l în tampon fosfat 100 mM pH=7,4

Mod de lucru:

În momentul începerii determinărilor se amesteca soluţia 1 cu 2 (4 părţi reactiv 1 cu 1

parte reactiv 2 ).

Amestec de reactivi 1+2 (µl) 1000

Ser (µl) 250

Se agită bine şi se citesc extincţiile la lungimea de undă de 366 nm în cuve de 1 cm.

Citirea se face din minut în minut timp de 3 minute la 25 C

Calcularea rezultatelor:

Se face diferenţa între prima şi ultima citire şi se împarte la numărul de minute

citite. Se notează cu ( A/min). Concentraţia ALAT în U/l = ( A/min) x 1520.

Observaţii:

Dacă valoarea ( A/min) creşte mai mult de 0,08 se recomandă diluarea a 0,1 ml probă cu

0,9 ml ser şi se înmulţeşte rezultatul cu 10. Citirile se pot efectua şi la 30 C şi 37 C.

Intervale de referinţă:

25 C 30 C 37 C

Bărbaţi pînă la 18 U/l pînă la 25 U/l pînă la 37 U/l

Femei pînă la 15 U/l pînă la 21 U/l pînă la 31 U/l

Interpretarea rezultatelor:

Permeabilitatea membranei celulare hepatice creşte gradat funcţie de suferinţă.

Investigaţiile biochimice evidenţiază creşteri în ser a unor enzime celulare (ALAT, ASAT, LDH,

etc.).Nivelul seric al acestor enzime de leziune, variază în funcţie denumărul de hepatocite

afectate, de gravitatea lezării fiecărei celule, de viteza cu care s-a produs leziunea şi de viteza de

eliminare din ser (t 1/2) a enzimelor respective.

Page 5: evaluari biochimice in explorarea hepatica

Dozarea ALAT şi ASAT rămîne cea mai utilă şi sensibilă investigaţie biochimică în caz

de afectare hepatocelulară acută (virală, toxică, medicamentoasă), valori ≥ 500 U/l sugerînd acest

diagnostic.

Valori crescute:

cele mai mari creşteri 100-2000 U/l apar în hepatitele virale, intoxicaţia cu tetraclorură

de carbon, în leziuni induse de medicamente.

creşterea rapidă şi marcantă a ASAT şi ALAT (>600 U/l şi adesea >2000 U/l) urmată de

o scădere bruscă în primele 12-72 de ore de la debut este considerată specifică pentru

obstrucţia acută a ductelor biliare.

creşteri importante ale ASAT şi ALAT asociate cu creşteri ale fosfatazei alcaline indică

icter hepatocelular.

ASAT crescută (≤300 U/l) şi ALAT (≤200 U/l) se înregistrează în obstrucţia biliară

completă. Enzimele revin la normal în decurs de o săptămînă de la îndepărtarea

obstrucţiei.

o stare patologică particulară caracterizată prin creşterea marcantă a enzimelor hepatice

(ALAT, ASAT,OTC), a celor musculare (creatinkinaza CK), precum şi a -amilazei şi

lipazei pancreatice se întîlneşte în sindromul Reye.

creşteri moderate al ALAT şi ASAT, asociate cu creşteri ale fosfatazei alcaline

sugerează icter colestatic.

valori mai ridicate de 150 U/l apar în hepatitele alcoolice (mai ales dacă pacientul are şi

delirum tremens).

valori ≤ 100 UI/l apar în ciroza alcoolică, nivelul ALAT este normal în 50 % din cazuri,

iar ASAT în 25% din cazuri.

creşteri abia schiţate ale ALAT şi ASAT apar în procesele neoplazice ale ficatului, cînd

leziunile celulare hepatice se produc pe arii limitate în jurul infiltratului

malign.(ASAT>ALAT).

ALAT şi ASAT cresc în urma transplantului hepatic, după reperfuzia alogrefei (de 4-5 ori

limita superioară a intervalului de referinţă).

Creşterile persistente sau tardive se pot datora rejecţiei, infecţiilor virale, abcesului

hepatic sau ocluzia arterei hepatice.

creşteri moderate ale ALAT şi ASAT se evidenţiază în infecţiile cu virus Epstein-Barr,

precum şi în mononucleoza serică.

Alături de creşterile individuale ale enzimelor celulare se produc şi modificări ale

raportului dintre ele. Astfel raportul ASAT/ALAT (raport de Ritis) la subiecţii normali

este 1,3, dar poate fi modificat în funcţie de afecţiune.

ASAT/ALAT<1 apare în hepatitele virale.

ASAT/ALAT >2, cu ALAT <300 U/l sugerează hepatită alcoolică.

ASAT/ALAT ≥3 la pacienţi cu ciroză hepatică sau cu hipertensiune portală sugerează

ciroză biliară primară.

Page 6: evaluari biochimice in explorarea hepatica

Valori scăzute :

deficit de piridoxal fosfat ce apare în sarcină, afecţiuni hepatice secundare

consumului de alcool.

neoplazii

infecţii urinare

În majoritatea afecţiunilor hepatice sunt necesare dozări seriate ale enzimelor, valoarea

acestora indicînd evoluţia clinică .

DETERMINAREA ACTIVITĂŢII GAMMA-GT ( -GT) (metoda cinetică)

Principiul metodei:

Determinarea activităţii -GT se face folosind ca substrat L- - glutamil-3-carboxi-4-

nitroanilida. Reacţia este următoarea:

NH2

HOOC CH2CH

NH NO2

C=OCH2

H2N C=OCH2

CH2 COOHHN

L-Gama-glutamil p-nitro-anilida Glicil-glicina

NH2

HOOC CH2CH C=OCH2

NH C=OCH2

CH2 COOHHN

H2N NO2

L-Gama-glutamil glicil-glicina p-nitro-anilina

Creşterea absorbanţei pe măsură ce se formează 4-nitroanilina este direct proporţională

cu activitatea -GT. Citirile se efectuează la 405 nm.

Page 7: evaluari biochimice in explorarea hepatica

Aparatură:

Spectrofotometru

Cronometru

Cronometru

Reactivi:

1. Soluţie glicilglicina in tampon TRIS pH=8,25, 100 mmol

2. Soluţie substrat L-γ-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida, de concentraţie 2,9 mmol/1

Mod de lucru:

1. Prepararea soluţiei de lucru:

Se amestecă 5 părţi reactivul 1 cu o parte reactiv 2. Această soluţie este stabilă 7 zile la

temperatură de 20-25 C sau 28 de zile la 2-8 C.

2. Dozarea propriu-zisă:

Soluţie de lucru ( l) 500

Ser ( l) 50

Se agită şi citesc absorbantele la 1, 2 şi 3 minute

la

1,

2 si 3

minute

Calcularea rezultatelor:

Se face diferenţa între prima şi ultima citire şi se împarte la numărul de minute citite. Se

notează cu ( A/min). Concentraţia -GT (U/l) = ( A/min) x 1152.

Intervale de referinţă:

25 C 30 C 37 C

Bărbaţi 6-28 U/l 8-38 U/l 11-50 U/l

Femei 4-18 U/l 5-25 U/l 7-32 U/l

Observaţii:

Serul folosit trebuie să fie proaspăt şi nehemolizat, iar recoltarea se face pe citrat, oxalat

sau EDTA.

Linearitatea reacţiei se menţine până la valori de 280 U/l. Peste aceste valori se

recomandă diluarea a 0,1 ml probă cu 0,9 ml ser şi se înmulţeşte rezultatul cu 10.

Page 8: evaluari biochimice in explorarea hepatica

Interpretarea rezultatelor:

Valori crescute:

Dozarea γ-GT este cel mai sensibil indicator şi un test de screening folosit uzual

pentru determinarea alcoolismului. În acest caz creşterea γ-GT o depăşeşte pe cea a

celorlalte enzime hepatice dozate în mod curent. Gradul de creştere a γ-GT la un

alcoolic variază de la caz la caz şi depinde mai mult de persistenţa îndelungată a

consumului decît de cantitatea ingerată. S-a demonstrat că o încărcare suplimentară

cu alcool la un caz de alcoolism cronic produce în decurs de 24 de ore o creştere mult

mai accentuată a activităţii serice a γ-GT (3,5x LSN), comparativ cu o acceaşi

încărcare cu alcool la un subiect sănătos consumator ocazional de alcool.

Pacienţii alcoolici trataţi cu anticonvulsivante au valori ale γ-GT de 50 de ori

valoarea normală. La pacienţii trataţi cu anticonvulsivante, dar care nu consumă

alcool creşterile pentru γ-GT sunt modeste.

În icterul obstructiv creşterile pentru γ-GT sunt mai rapide şi mai importante decît

cele pentru ALP şi LAP.

În colestaza mecanică şi virală γ-GT creşte cam în aceeaşi proporţie cu ALP şi LAP,

pe cînd în colestaza medicamentoasă creşterea pentru γ-GT este mult mai mare.

În neoplasmul hepatic nivelul γ-GT creşte progresiv de la o examinare la alta.

În ciroza biliară primară valorile pentru γ-GT sunt de aproximativ 13x LSN (limita

superioară normală).

În hepatita acută creşterile sunt mai puţin marcante decît a celorlalte enzime hepatice,

dar este ultima care revine la normal, indicînd covalescenţa.

În hepatita cronică activă valorile pot atinge 7x LSN. În stadiul asimptomatic al bolii

poate fi singura enzimă hepatică ce prezintă valori serice crescute.

γ-GT reprezintă markerul cel mai sensibil al rejectului (după transplant hepatic),

nivelul enzimei creşte precoce înaintea ALP şi bilirubinei.

γ-GT prezintă creşteri importante alături de cele ale ALP în leptospiroza

icterohemoragică (boala Weil).

Valori crescute se înregistrează în tumori primitive sau metastatice ale ficatului

În intoxicaţia cu clorpromazină valorile pentru γ-GT cresc semnificativ.

Page 9: evaluari biochimice in explorarea hepatica

DETERMINAREA ACTIVITĂŢII FOSFATAZEI ALCALINE (ALP) (metoda cinetică)

Principiul metodei:

Fosfataza alcalina (ALP), în mediu alcalin (pH=8,6), catalizează hidroliza p-

nitrofenilfosfatului în p-nitrofenol şi fosfat. Reacţia este următoarea:

OH

NO2

O P

H2ONaOH

ALP

OH

O

NO2

OH

HO P OH

O

OH

p-nitrofenilfosfat Acid fosforic p-nitrofenol

Creşterea absorbanţei la 405 nm a p-nitrofenolului pe măsură ce se formează este direct

proporţională cu activitatea ALP.

Aparatura:

Spectrofotometru

Cronometru

Reactivi:

1. 2-amino-2-metil-1-propanol, pH 10,4; 0,90 mol/L

Acetat de magneziu 1,6 mmol/L

Sulfat de zinc 0,4 mmol/L

2. p-nitrofenilfosfat 16 mmol/L

3. Ser sau plasma (recoltate pe heparină)

4. Mod de lucru

a. Prepararea soluţiei de lucru: se amestecă 4 părţi reactiv 1 cu o parte reactiv 2. Această

soluţie este stabilă 5 zile la temperatură de 20-25 C sau 28 de zile la 2-8 C.

Page 10: evaluari biochimice in explorarea hepatica

b. Dozarea propriu-zisa:

Reactivi ( l) Probă ( l) Blanc ( l)

Soluţie de lucru 100 100

Ser 20 -

Apă distilată - 20

Se agită şi citesc absorbanţele la 1, 2 şi 3 minute

5. Calcularea rezultatelor:

Se face diferenţa între prima şi ultima citire atât pentru probă cât şi pentru blanc şi se

împarte la numărul de minute cronometrate. Se notează cu ( A/min probă) şi ( A/min

blanc). ( A/min)=( A/min probă)-( A/min blanc).

Activitatea ALP (U/l) = ( A/min) x 2757

6. Intervale de referinţă:

Adulţi:

ALP (U/l)

Femei 20-50 ani 42-98

Bărbaţi 20-50 ani 53-128

Femei > 60 ani 53-141

Bărbaţi > 60 ani 56-119

Copii:

Fete Băieţi ALP (U/l)

1-30 zile 48-106 75-319

1 lună-1 an 124-341 82-383

1-3 ani 108-317 104-345

4-6 ani 96-297 93-309

7- 9 ani 69-325 86-315

10-12 ani 51-332 42-362

13-15 ani 50-162 74-390

16-18 ani 47-119 52-171

Observaţii:

Testul este realizat pentru a determina activităţile ALP care corespund unei A/min.,

maxime de 0.25. Peste aceasta valoare se recomandă diluarea a 0,1 ml probă cu 0,9 ml ser şi se

înmulţeşte rezultatul cu 10.

Page 11: evaluari biochimice in explorarea hepatica

Nu s-au observat interferenţe pentru următoarele substrate: acid ascorbic până la 30

mg/dl, bilirubină conjugată până la 60 mg/dl, bilirubină neconjugată până la 25 mg/dl,

trigliceride pînă la 2000 mg/dl. Limita minimă de detecţie este de 2 U/l.

Interpretarea rezultatelor:

Valori crescute:

obstrucţie biliară − (este considerată cel mai bun marker al obstrucţiei biliare, dar nu

diferenţiază colestaza intrahepatică de obstrucţia extrahepatică). În boala

hepatobiliară obstructivă nivelul seric al ALP creşte în paralel cu cel al 5 -NT (5

nucleotidazei) şi LAP (leucin aminopeptidazei).

creşteri ale ALP în paralel cu -GT şi 5 -NT apar în ciroza biliară primară.

raportul -GT/ALP 5 susţine diagnosticul de boală hepatică alcoolică. Creşteri ale -

GT determinate de alcool sau anticonvulsivante nu sunt însoţite de creşterea ALP.

Stabilirea cauzei creşterii ALP este extrem de utilă în vederea diferenţierii

diagnosticului.

Enzima

serică

Obstrucţie

biliară

Afecţiune

osoasă Copilărie Sarcină

ALP C C C C

5 -NT C N N N

LAP C N N C

-GT C N N N

Unde: C = valori crescute; N = valori normale

nivelul ALP creşte înaintea apariţiei icterului

nivele marcat crescute ale ALP apar la sugarii cu atrezie biliară intrahepatică, dar

mult mai scăzute în caz de atrezie extrahepatică.

creşteri modeste (cam de 3 ori valoarea normală) sunt specifice şi pot fi întîlnite în

orice afecţiune hepatică (hepatită virală, hepatită cronică, ciroză hepatică, afecţiuni

hepatice infiltrative), dar şi în alte boli cu interesare hepatică (ex. insuficienţa

cardiacă congestivă).

Valori scăzute:

Scăderi ale ALP apar în glicogenoza de tip I (deficit de glucozo-fosfataza).

Page 12: evaluari biochimice in explorarea hepatica