KLONING DAN KARAKTERISASI dnaJ Bacillus sp. RP1

TESISKarya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung

Oleh:

MAUREEN KUMAUNANG NIM: 20503025 Program Studi Kimia

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2006

ABSTRAK

KLONING DAN KARAKTERISASI dnaJ Bacillus sp. RP1Oleh: Maureen Kumaunang 20503025

DnaJ adalah protein chaperone yang membantu proses pelipatan, translokasi, dan degradasi protein. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi gen pengkode DnaJ dari bakteri termofilik Bacillus sp. RP1 dan untuk melakukan studi in silico terhadap produk gen yang dihasilkan. Gen pengkode DnaJ dari Bacillus sp. RP1 telah diisolasi dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer DJF1 dan DJR2 yang dirancang berdasarkan urutan nukleotida dnaJ B. stearothermophilus (Accession number Q45552), menghasilkan fragmen DNA berukuran 1,1 kpb. Analisis urutan nukleotida sebanyak 1053 pb dari fragmen DNA hasil PCR menunjukkan tingkat kesamaan 97% dengan chaperone putative dari Geobacillus kaustophilus (BA000043.1), serta 86% dengan operon DnaK dari Bacillus stearothermophilus (X90709.1). Fragmen DNA dnaJ telah diklon ke vektor pGEM-T. Prediksi model struktur DnaJ Bacillus sp. RP1 menunjukkan kemiripan dengan struktur domain-J DnaJ Escherichia coli sedangkan domain cys-rich menunjukkan perbedaan. Kata kunci: DnaJ, chaperone, Bacillus sp., in silico

ii

ABSTRACT CLONING AND CHARACTERIZATION OF dnaJ Bacillus sp. RP1By: Maureen Kumaunang 20503025

DnaJ is a chaperone which has function in facilitating folding, translocation, and degradation of protein. The aim of this research was to isolate gene encodes DnaJ from thermophilic bacteria, Bacillus sp. RP1 and to undertake in silico study of its gene product. dnaJ of Bacillus sp. RP1 was isolated by Polymerase Chain Reaction (PCR) method using DJF1 and DJR2 primers which were designed from nucleotide sequence of dnaJ B. stearothermophilus (Accession number Q45552). The size of the resulted DNA fragment was 1.1 kb. Analysis of 1053 bp from DNA fragment isolated by PCR showed that it has 97% similarity with putative chaperone of Geobacillus kaustophilus (BA000043.1) and 86% similarity with DnaK operon of B. stearothermophilus (X90709.1). dnaJ DNA fragment had been cloned into pGEM-T vector. Structure prediction of DnaJ Bacillus sp. RP1 showed that it has similar J-domain with that of DnaJ Escherichia coli but cys-rich domain is different. Keywords: DnaJ, chaperone, Bacillus sp., in silico

iii

Trust in the Lord with all your heart And lean not on your own understanding; In all your ways acknowledge Him, And He shall direct your pathsProverbs 3:5-6

To Yohanis, for being Yohanis

PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS

Tesis S2 yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan Institut Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di Institut Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya.

Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh tesis haruslah seizin Direktur Program Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung.

vi

UCAPAN TERIMA KASIHPuji dan syukur kepada Tuhan atas segala kasih dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini.

Melalui tulisan ini, penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan kepada: 1. Dessy Natalia, Ph.D., selaku pembimbing yang senantiasa sabar dalam membimbing penulis, memberikan pengetahuan dan pengarahan yang sangat bermanfaat bagi penulis dalam menghadapi masalah selama penelitian dan penyusunan tesis. 2. Dr. Muliawati Sindumarta atas segala bimbingan dan konsultasi dengan penulis selama penelitian. 3. Akhmaloka, Ph.D., selaku Ketua Departemen Kimia ITB, beserta seluruh Dosen program Magister Kimia yang telah memberikan bekal ilmu pengetahuan bagi penulis. 4. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi atas bantuan dana BPPS bagi penulis. 5. Dekan, Pembantu Dekan, serta Ketua Jurusan Kimia FMIPA Universitas Sam Ratulangi. 6. Hibah Bersaing XI, No. kontrak 239/P4T/DPPM/PHBXI/III/2003, Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional. 7. Third World Academy of Sciences (TWAS), Italy. 8. Segenap staf Laboratorium Rekayasa Genetika, Pusat Bioteknologi ITB 9. Segenaf karyawan Departemen Kimia ITB, khususnya di Laboratorium Biokimia Enzim, Pak Yayat, serta Pak Edy, Pak Dadan, Pak Adjat, Pak Yadi, dan Pak Budi. 10. Bu Lena, Yosi, Fean, Puspa, Wilza, Rahmi, Ake, Nisa, Karin, Dyah, Alia, Iman, Mas Cahyu, dan sesama rekan peneliti di Laboratorium Biokimia Enzim Departemen Kimia ITB. 11. Heli, Yanty, Mbak Puspa, Bu May, Bu Nina, Fivit, Gun Gun, Any, Vera, Jay, rekan-rekan seperjuangan Biokimia 2003, serta segenap rekan-rekan program Magister Kimia 2003.

vii

12. Pak Jon, Bu Prima, Mbak Santi, Elen, dan dr. Edwin atas segala konsultasi, motivasi, dan dukungan bagi penulis. 13. Almarhum ayah, ibu, seluruh keluarga, serta suamiku: Yohanis, orang-orang terkasih dan anugerah tak ternilai yang mendampingi hidupku: terima kasih atas kasih sayang, bantuan, dan dukungan doa bagi penulis.

Akhir kata, semoga tulisan ini bermanfaat dan menambah wawasan pengetahuan bagi kita semua.

Bandung, Februari 2006

Penulis

viii

DAFTAR ISIABSTRAK .................................................................................................. ii ABSTRACT ................................................................................................ iii LEMBAR PENGESAHAN .......................................................................... iv PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS .......................................................... vi UCAPAN TERIMA KASIH ........................................................................ vii DAFTAR ISI ............................................................................................... ix DAFTAR GAMBAR ................................................................................... xi DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xii DAFTAR TABEL ....................................................................................... xiii Bab I Bab II II.1 II.2 II.3 II.4 Pendahuluan ................................................................................... 1 Tinjauan Pustaka ............................................................................ 3 Pelipatan protein ............................................................................ 3 Molekul chaperone ........................................................................ 4 Sistem chaperone DnaK/DnaJ/GrpE .............................................. 5 Chaperone DnaJ Escherichia coli.................................................... 7

Bab III Metodologi Penelitian .................................................................... 10 III.1 III.2 III.3 Alat ................................................................................................ 10 Bahan ............................................................................................. 11 Metode kerja .................................................................................. 13

Bab IV Hasil dan Pembahasan .................................................................... 19 IV.1 IV.2 Bacillus sp. RP1 ............................................................................. 18 Studi in silico DnaJ Geobacillus kaustophilus (Q5KWZ8) dan Bacillus stearothermophilus (Q45552) ........................................... 19 IV.3 IV.4 IV.5 IV.6 Amplifikasi gen dnaJ Bacillus sp. RP1 ............................................ 27 Ligasi dnaJ dengan vektor pGEM-T ............................................ 28 Transformasi E. coli Top10 dengan pGEM-T .............................. 29 Analisis restriksi DNA plasmid rekombinan dengan enzim-enzim restriksi ...................................................................... 29 IV.7 Analisis urutan nukleotida dnaJ Bacillus sp. RP1 ............................ 30

ix

IV.8 IV.9 Bab V

Studi in silico DnaJ Bacillus sp. RP1 .............................................. 33 Diskusi ........................................................................................... 35 Kesimpulan .................................................................................... 38

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. 39

x

DAFTAR GAMBARGambar II.1 Gambar II.2 Gambar II.3 Gambar III.1 Gambar IV.1 Gambar IV.2 Gambar IV.3 Gambar IV.4 Gambar IV.5 Gambar IV.6 Gambar IV.7 Gambar IV.8 Gambar IV.9 Model mekanisme kerja sistem DnaK/DnaJ/GrpE E. coli ..... 6 Skema domain struktur DnaJ Escherichia coli .................... 7 Diagram pita domain-J dan domain cys-rich DnaJ E. coli .... 8 Peta vektor pGEM-T ......................................................... 12 Daerah lestari DnaJ .. ........................................................... 21 Prediksi ikatan disulfida dalam DnaJ.................................... 22 Penjajaran domain-J DnaJ .................................................... 23 Penjajaran domain cys-rich DnaJ ......................................... 23 Penjajaran protein DnaJ ...................................................... 24 Prediksi struktur domain-J DnaJ........................................... 25 Prediksi struktur domain cys-rich DnaJ ................................ 26 Elektroforegram fragmen DNA hasil PCR .......................... 27 Hasil transformasi E. coli Top10 dengan pGEM-T-dnaJ ... 29

Gambar IV.10 Elektroforegram hasil restriksi pGEM-T-dnaJ dengan enzim restriksi BamHI dan NdeI .................................................... 30 Gambat IV.11 Penjajaran nukleotida DNAJF_DJF1 dnaJ Bacillus sp. RP1 ................................................................... 32 Gambar IV.12 Penjajaran nukleotida DNAJR_DJR2 dnaJ Bacillus sp. RP1 ................................................................... 33 Gambar IV.13 Prediksi struktur domain-J DnaJ Bacillus sp. RP1 ................ 34 Gambar IV.14 Prediksi struktur domain cys-rich DnaJ Bacillus sp. RP1 ..... 35

xi

DAFTAR LAMPIRANLampiran A Lampiran B Lampiran C Analisis BLASTn 16s r RNA Bacillus sp. RP1 .................. 43 Pohon filogenetik 16s rRNA Bacillus sp. RP1 ................. 47 Analisis parameter fisika kimia DnaJ B. stearothermophilus (Q45552) ..................................... 48 Lampiran D Penjajaran nukleotida DnaJ Bacillus sp. RP1, chaperone putative G. kaustophilus (BA000043.1), dan DnaJ B. stearothermophilus (Q45552) ..................................... 50

xii

DAFTAR TABELTabel II.1 Berbagai penyakit yang disebabkan karena kesalahan pelipatan protein ...................................................................... 4 Tabel IV.1 Parameter fisika-kimia DnaJ .................................................... 20

xiii

1

Bab I PendahuluanUntuk menjadi protein yang aktif secara fungsional, rantai polipeptida yang baru disintesis akan mengalami proses folding (pelipatan). Pada awalnya, pelipatan protein dianggap sebagai proses spontan dan hanya ditentukan berdasarkan urutan asam-asam aminonya (Anfinsen, 1973). Sejumlah kajian yang telah dilakukan selama beberapa dekade terakhir, menunjukkan bahwa sebagian besar polipeptida yang baru disintesis memerlukan bantuan sistem seluler yang kompleks untuk melipat menjadi protein yang aktif (Gething & Sambrook, 1992; Hartl, 1996; Frydman, 2001).

Chaperone adalah kelompok protein yang membantu proses pelipatan polipeptida membentuk struktur tersier dan kuarterner. Chaperone juga berperan dalam translokasi protein melewati membran intraseluler serta memfasilitasi degradasi proteolitik dari protein yang tidak stabil (Fink, 1999).

DnaJ adalah chaperone anggota keluarga protein-J. DnaJ adalah homolog Hsp40 E. coli yang berperan penting sebagai co-chaperone dalam sistem DnaK. DnaJ dibutuhkan dalam berbagai proses seluler termasuk pelipatan, translokasi, dan degradasi protein. Sebagai bagian dari sistem chaperone DnaK, DnaJ berinteraksi secara langsung dengan substrat protein, mentransfer substrat tersebut ke DnaK dan berperan menstimulasi aktivitas ATPase DnaK yang menyebabkan DnaK dapat mencapai keadaan afinitas tinggi untuk berikatan dengan molekul substrat. DnaJ juga memiliki aktivitas chaperone in vitro sebagai holdase, di mana DnaJ mampu mengenal protein non-natif dan mencegah molekul protein tersebut mengalami agregasi (Langer et al., 1992).

DnaJ adalah kelompok protein yang lestari pada berbagai organisme prokariot maupun eukariot (famili Hsp40). DnaJ dan beberapa homolognya telah berhasil diisolasi, dimurnikan, dan dikarakterisasi. Beberapa di antaranya adalah Djp1p, homolog DnaJ dari Saccharomyces cerevisiae (Hettema et al., 1998), Thermus

2

thermophilus (Motohashi et al., 1994), Clostridium botulinum (Shukla & Singh, 1999), Trypanosoma cruzi (Tibbets et al., 1998), dan pada tikus (Yang et al., 2005). Gen pengkode DnaJ pada E. coli telah diisolasi dan ditentukan urutannya (Ohki et al., 1986; Bardwell et al., 1986). Selain itu, beberapa gen pengkode DnaJ berbagai organisme lainnya telah berhasil diisolasi dan ditentukan urutan nukleotida pengkodenya, di antaranya adalah dnaJ Bacillus stearothermophilus (Herbort et al., 1996), homolog dnaJ pada Synechoccus sp. (Oguchi et al., 1997), Halobacterium cutirubrum dan Deinococcus proteolyticus (Bustard & Gupta, 1997), hdj1 dan hdj2, homolog DnaJ pada manusia (Terada et al., 1997), Trypanosoma cruzi (Tibbetts et al., 1998), DJP1, homolog DnaJ pada Saccharomyces cerevisiae (Hettema et al., 1998), serta rDJL, homolog DnaJ pada tikus.

Domain cys-rich pada DnaJ E. coli memiliki motif CXXCXGXG. Motif CXXC merupakan motif lestari pada sisi aktif berbagai protein disulfida oksidoreduktase, yaitu tioredoxin, Protein Disulfida Isomerase (PDI), dan DsbA. Adanya motif CXXC pada DnaJ E. coli menyebabkan DnaJ mempunyai aktivitas oksidasi reduksi dalam sel (Crouy-Chanel, 1995).

Penelitian

ini

bertujuan

untuk

mengisolasi

gen

pengkode

DnaJ

Bacillus sp. RP1 serta mempelajari produk gen secara in silico.

3

Bab II Tinjauan PustakaII.1 Pelipatan protein

Untuk menjadi protein yang memiliki aktivitas fungsional, rantai polipeptida yang baru disintesis mengalami proses pelipatan. Eksperimen klasik yang dilaksanakan oleh Anfinsen (1973) menyatakan bahwa struktur sekunder dan tersier suatu protein ditentukan oleh urutan asam-asam amino. Pada umumnya pelipatan protein dalam sel bukanlah suatu proses yang berlangsung secara spontan, namun membutuhkan bantuan molekul lain dan energi (Gething & Sambrook, 1992).

Pelipatan protein di dalam sel merupakan proses kompleks. Proses pelipatan dimulai dari rantai polipeptida yang baru terbentuk pada ribosom. Rantai polipeptida berada dalam keadaan yang sangat tidak beraturan (random coil state) sebelum proses pelipatan dimulai. Selain itu, konsentrasi makromolekul dalam sitosol, termasuk ribosom, asam nukleat, dan protein lain sangat tinggi. Dalam lingkungan yang sangat kompleks ini, residu asam amino hidrofobik dari polipeptida nascent terekspos ke permukaan dan proses pelipatan dari intermediet dapat berlangsung secara tidak tepat yang mengakibatkan terjadinya misfolding dan agregasi (Dobson, 2001; Hartl & Hayer-Hartl, 2002).

Proses folding dan unfolding protein merupakan tahap kunci dalam berbagai sistem biologis, misalnya translokasi protein melewati membran, protein trafficking, sekresi protein ekstrasel, serta kontrol dan regulasi siklus sel (Radford & Dobson, 1999). Kegagalan suatu protein dalam proses pelipatan dapat menyebabkan malfungsi berbagai sistem biologis yang mengarah pada timbulnya berbagai penyakit (Dobson, 2001). Tabel II.1 menampilkan sejumlah penyakit yang berkaitan dengan kesalahan pelipatan protein.

4

Tabel II.1 Berbagai penyakit yang disebabkan karena kesalahan proses pelipatan protein (Dobson, 2001) Lokasi pelipatan RE Sitosol Sitosol RE RE Sitosol RE RE RE RE Sitosol RE RE RE Sitosol Sitosol

Penyakit Cystic fibrosis Fenilketonuria Huntington Sindrom Marfan Osteogenesis imperfecta Sickle-cell anemia Defisiensi 1-antitripsin Tay-Sachs Scurvy Alzheimer Parkinson Scrapie/Creutzfeldt-Jakob Familial amyloidoses Retinitis pigmentosa Katarak Kanker

Protein CFTR PAH Huntington Fibrillin Prokolagen Hemoglobin 1-antitripsin heksosaminidase Kolagen amiloid / presenilin sinuklein Prion Transthyretin Rodopsin Kristalin p53

Keterangan: RE: retikulum endoplasma

Untuk mencegah kesalahan pelipatan protein serta mengoptimalkan proses pelipatan, telah diidentifikasi sejumlah molekul protein yang dapat membantu proses pelipatan protein di dalam sel. Protein-protein ini dapat diklasifikasikan dalam dua kelompok. Kelompok pertama dikenal dengan katalis, seperti Protein Disulfida Isomerase (PDI), dan peptidil prolil isomerase yang mempercepat pembentukan ikatan disulfida dan isomerisasi residu prolin dalam protein. Kelompok kedua adalah chaperone, yang mencegah terjadinya agregasi atau proses pelipatan prematur dari protein (Beissinger & Buchner, 1998).

II.2

Molekul chaperone

Definisi klasik untuk chaperone adalah protein yang melindungi dan mencegah misfolding dan agregasi pada polipeptida yang baru disintesis (Hartl and HayerHartl, 2002). Secara umum, chaperone mengenal residu hidrofobik dan daerah

5

yang belum terstruktur dengan baik (unstructured region) yang ada pada molekul protein dalam keadaan unfolded dan misfolded (Dougan et al., 2002). Pada umumnya chaperone diekspresi pada basal level dan akan meningkat pada kondisi stres lingkungan, seperti pada temperatur tinggi, sehingga chaperone dikelompokkan sebagai protein heat-shock (Hsp) (Gething & Sambrook, 1992).

Beberapa kelompok chaperone utama, adalah: sHsps (small heat-shock proteins, biasanya memiliki berat molekul antara 10 30 kDa); Hsp40 (berat molekul ratarata ~40 kDa, termasuk famili DnaJ); Hsp60 (berat molekul rata-rata ~60 kDa, termasuk famili GroEL); Hsp70 (berat molekul rata-rata ~70 kDa, termasuk famili DnaK); Hsp90 (berat molekul rata-rata ~90 kDa, termasuk famili HtpG); dan Hsp100 (berat molekul rata-rata ~100 kDa, termasuk famili ClpA dan ClpB).

Berdasarkan lokasi kerja, chaperone dapat dikelompokkan menjadi chaperone sitosolik dan ekstrasitosolik. Termasuk ke dalam chaperone sitosolik adalah DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES, sHsp, ClpA, dan ClpB. Chaperone sitosolik dapat dikelompokkan pula menjadi folder (bekerja dalam proses refold protein misfolded dan protein yang mengalami agregasi, misalnya DnaK dan GroEL), holder (berfungsi mencegah terjadinya agregasi protein tapi tidak dapat me-refold protein, misalnya DnaJ dan sHsp), dan unfolder (terlibat dalam proses unfold protein sebelum didegradasi, misalnya protein-protein Clp) (Dougan et al., 2002). Chaperone yang termasuk dalam kelompok ekstrasitosolik adalah protein PapDlike, Skp, Lol, tiol-disulfida oksidoreduktase, dan peptidil-prolil isomerase (Behren et al., 2001; Miyamoto et al., 2002; Bulieris et al., 2003).

II.3

Sistem chaperone DnaK/DnaJ/GrpE

Chaperone dari kelompok Hsp70 berperan dalam proses pelipatan protein dengan cara mencegah terjadinya agregasi dan degradasi misfolded protein. Hsp70 juga dibutuhkan untuk translokasi dari polipeptida prekursor. Sistem chaperone Hsp70 dari Escherichia coli terdiri dari DnaK, DnaJ, dan GrpE

6

Mekanisme kerja sistem chaperone DnaK/DnaJ/GrpE dapat dijelaskan sebagai berikut (Gambar II.1). Domain-J dari DnaJ berinteraksi dengan domain ATPase dari DnaK untuk mengikat protein substrat. Interaksi antar kedua domain ini terjadi antara tripeptida His-Pro-Asp pada domain-J dari DnaJ dengan domain ATPase dari DnaK. Interaksi ini akan menyebabkan percepatan hidrolisis ATP oleh DnaK serta mengubah DnaK menjadi dalam keadaan high affinity binding state untuk mengikat polipeptida unfolded. Setelah hidrolisis ATP dan pengikatan substrat oleh DnaK, DnaJ melepaskan diri dari kompleks DnaK-substrat. Kompleks ADP-DnaK-substrat tetap terjaga, sampai GrpE menginduksi proses pertukaran nukleotida, sehingga protein substrat terlepas dan DnaK dapat kembali memulai siklus pengikatan substrat yang sama atau protein lain (Laufen et al., 1999: Linke et al., 2003)

Gambar II.1

Model mekanisme kerja sistem chaperone DnaK/DnaJ/GrpE pada E. coli (Linke et al., 2003)

7

II.3

Chaperone DnaJ Escherichia coli

Molekul DnaJ E. coli adalah homodimer dengan bobot molekul ~43 kDa, terdiri dari 382 asam amino. DnaJ memiliki empat domain utama, yaitu domain-J, domain G/F, domain pengikatan Zn (Cys-rich domain), dan domain C-terminal (Gambar II.2).

H2N Domain-JDomain GF Domain cys-rich

COOH Domain Cterminal

Gambar II.2

Skema domain struktur DnaJ E. coli

Domain J (asam amino 1 76 dalam DnaJ) adalah motif pengenal untuk semua molekul chaperone Hsp40 (Hennessy et al., 2000). Domain ini memiliki urutan tripeptida lestari His-Pro-Asp (motif HPD), yang merupakan sisi interaksi dengan domain ATPase DnaK. Mutan DnaJ259 yang membawa mutasi titik dalam sekuen ini (His33Gln) memperlihatkan ketidakmampuannya untuk menstimulasi

hidrolisis ATP dari DnaK (Wall et al., 1994). Struktur domain-J DnaJ E. coli terdiri dari empat -heliks dengan adanya satu daerah loop yang mengandung tripeptida lestari His-Pro-Asp di antara heliks II dan heliks III (Gambar II.3.a; Pellechia et al., 1996).

Domain G/F berlokasi pada daerah downstream domain-J. Domain G/F (asam amino 77 107 dalam DnaJ) ini memiliki kandungan residu glisin dan fenilalanin yang tinggi. Motif G/F penting dalam menstimulasi secara maksimal aktivitas ATPase dari DnaK serta dalam konversi DnaK selanjutnya dalam mencapai keadaan afinitas tinggi secara in vitro. Domain ini juga diperlukan dalam aktivitas regulasi terhadap heat-shock secara in vivo (Wall et al., 1995). Domain pengikatan Zn2+ (asam amino 144 200 dalam DnaJ), juga dikenal sebagai domain yang kaya akan residu sistein (domain cys-rich), memiliki empat motif karakteristik -Cys-X-X-Cys-X-Gly-X-Gly- yang lestari untuk semua

8

homolog Hsp40 (Bardwell et al., 1986). Residu sistein ini terlibat dalam pengikatan dua ion Zn2+ untuk setiap monomer DnaJ (Szabo et al., 1996). Setiap pusat Zn dibentuk dari empat gugus tiol yang berikatan secara tetrahedral dengan satu ion Zn2+ (Banecki, et al., 1996). Data struktur NMR terakhir (MartinezYamout, et al., 2000) memperlihatkan bahwa pusat Zn I dibentuk dari sistein motif 1 (Cys144, Cys147) dan sistein motif 4 (Cys197, Cys200), sedangkan pusat Zn II dibentuk dari sistein motif 2 (Cys161, Cys164) dan sistein motif 3 (Cys183, Cys186). Kedua pusat Zn I dan II ini membentuk sayap pada struktur berbentuk V (Gambar II.3.b). Dua untai- antiparalel membentuk bagian luar setiap pusat Zn. Pada pusat Zn II, untai- dihubungkan dengan -hairpin loop, sedangkan pada pusat Zn I untai N-terminal dan C-terminal saling mendekati satu sama lain untuk membentuk untai-. Domain pengikatan Zn2+ dan C-terminal diperkirakan terlibat dalam pengikatan substrat (Szabo et al., 1996). Delesi terhadap domain cys-rich akan menghambat perubahan konformasi DnaK untuk mencapai keadaan high affinity binding state (Banecki et al., 1996).a) b)

Zn I

Zn II

Gambar II.3

Diagram pita domain-J dan domain cys-rich DnaJ E. coli, (a) Diagram pita domain-J, motif HPD terletak di antara heliks II dan heliks III (Pellechia et al., 1996); (b) Diagram pita domain cysrich. Untai- diperlihatkan oleh pita berwarna biru, atom Zn digambarkan oleh bola berwarna merah, residu sistein digambarkan sebagai stik berwarna kuning (Martinez-Yamout, et al., 2000)

9

DnaJ selain berfungsi sebagai chaperone juga menunjukkan adanya aktivitas protein-disulfida isomerase secara in vitro. Seperti kelompok protein-disulfida oksidoreduktase lainnya (tioredoxin, protein-disulfida isomerase, dan DsbA), DnaJ memiliki gugus ditiol/disulfida aktif sehingga mampu mengkatalisis pembentukan ikatan disulfida (renaturasi oksidatif RNase tereduksi), isomerisasi (refolding RNase yang teroksidasi secara acak), dan reduksi (reduksi insulin). Aktivitas oksidoreduktase DnaJ diperkirakan karena adanya motif CXXC pada domain cys-rich DnaJ, yang lestari untuk kelompok protein-disulfida

oksidoreduktase (Crouy-Chanel et al., 1995).

10

Bab III Metodologi PenelitianIII.1 Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat standar yang digunakan dalam pekerjaan rekayasa genetika di Laboratorium Protein dan Enzim, Departemen Kimia, ITB serta di Laboratorium Rekayasa Genetika, eks KPP Bioteknologi ITB.

Peralatan gelas yang digunakan terdiri dari cawan petri, gelas kimia, gelas ukur, labu erlenmeyer, labu takar, kaca arloji, batang pengaduk, pipet tetes, dan spreader. Mikropipet (Eppendorf, Germany), dengan ukuran 0,1-2,5 L, 0,510 L, 10-100 L, 100-1000 L; serta tip mikropipet berukuran 2,5 L, 10 L, 100 L, dan 1000 L; digunakan untuk pengambilan larutan dalam skala kecil. Tabung mikrosentrifuga (Eppendorf, Germany) berukuran 0,2 mL, dipergunakan dalam PCR, sedangkan tabung mikrosentrifuga berukuran 0,5 mL, dan 1,5 mL digunakan sebagai wadah sampel dalam skala kecil.

Autoclave model H7101 (China) digunakan untuk sterilisasi alat dan media. Oven (Memmert) digunakan untuk mengeringkan peralatan gelas dan plastik. Neraca analitik (Mettler Toledo, Switzerland) digunakan untuk pengukuran massa bahan kimia. pH-meter (Expandomatic IV, Beckman) digunakan untuk pengukuran pH larutan.

Shaking incubator Thermolyne, shaking incubator Labline, shaking incubator Dubnoff Fisher digunakan untuk inkubasi biakan sel. Vortex (Fisher vortex Genie) digunakan untuk keperluan homogenisasi. Spektrofotometer (SmartSpecTM 3000) digunakan untuk pengukuran optical density.

Mikrosentrifuga dingin (Biofuge Heraeus) dan mikrosentrifuga suhu kamar (Beckmann MicrofugeTM) digunakan untuk pengendapan DNA dalam skala kecil.

11

Peralatan elektroforesis (Mini Subcell GT Base DNA Biorad) digunakan untuk memisahkan fragmen DNA. Lampu WL/UV (Vilbert Lourmat) digunakan untuk visualisasi hasil elektroforesis. Kamera polaroid model DS34 digunakan untuk dokumentasi.

III.2

Bahan

III.2.1 Bacillus sp. RP1

Bacillus sp. RP1 diperoleh dari Laboratorium Protein dan Enzim, Departemen Kimia, ITB (Putra, 1999).

III.2.2 Escherichia coli

Escherichia coli Top10 (F-mcrA, (mrr-hsdRMS-mcrBC), 80lacZM15, lacX74, recA1, araD139, galU, galK, (ara-leu)7697, rpsL (StrR), endA1, nupG), diperoleh dari Laboratorium Protein dan Enzim, Departemen Kimia, Institut Teknologi Bandung, dan digunakan sebagai sel inang untuk perbanyakan DNA plasmid. Pemeliharaan E. coli menggunakan media Luria Bertani (LB) cair dengan komposisi bakto tripton 1%, ekstrak ragi 0,5%, dan NaCl 1,5%. Untuk membuat media padat ditambahkan bakto agar 1,5% ke dalam media cair.

III.2.3 Plasmid Plasmid yang digunakan adalah pGEM-T (Promega, Gambar III.1) yang diperoleh dari Laboratorium Rekayasa Genetika, eks KPP Bioteknologi, ITB.

III.2.4 Zat kimia

Zat kimia yang digunakan dalam penelitian ini, adalah NaCl, bakto-tripton, baktoagar, ekstrak ragi, ampisilin, lisozim, EDTA, Tris base, agarosa, etanol, sukrosa, bromfenol biru, etidium bromida, kalsium klorida, natrium hidroksida, dan isopropanol.

12

Enzim restriksi yang digunakan adalah BamHI (Amersham), NdeI (Amersham), dan HindIII (Bohringer Mannheim).

Gambar III.1 Peta vektor pGEM-T

III.3

Metode kerja

III.3.1 Peremajaan kultur bakteri

Peremajaan kultur bakteri dilakukan dengan menumbuhkan kultur pada media padat. Bacillus sp. RP1 ditumbuhkan pada media LB dan diinkubasi pada suhu 60 oC selama 1216 jam. E. coli Top10 diremajakan pada media LB dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 18 jam. Penyimpanan biakan untuk waktu yang lama pada suhu 70 oC menggunakan gliserol (15%).

III.3.2 Amplifikasi gen dnaJ dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) Primer yang digunakan dalam proses PCR dirancang berdasarkan urutan nukleotida gen dnaJ dari operon DnaK B. stearothermophilus yang telah dipublikasikan (Accession number Q45552). Primer DJF1 digunakan sebagai primer forward dan primer DJR2 digunakan sebagai primer reverse. Urutan nukleotida dari kedua primer tersebut, adalah: DJF1:5-GAGGACATATG GCGAAGCGTGATTATTATG-3, sedangkan DJR2: 5GAGGAGGATCCTCA

13

TGATTCTGGTTTAAACGC-3. Primer DJF1 memiliki sisi pemotongan NdeI, sedangkan primer DJR2 memiliki sisi pemotongan BamHI (nukleotida yang digarisbawahi). Komposisi reaksi PCR terdiri atas templat DNA kromosom Bacillus sp. RP1 200 ng, primer DJF1 1 M, primer DJR2 1 M, dNTP 0,2 M (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), bufer PCR 1X (dari stok bufer PCR 10X: KCl 50 mM, bufer Tris-Cl 10 mM pH 8,3, gelatin 0,01% [b/v]), MgCl2 2mM, dan enzim Taq DNA Polimerase sebanyak 1,25 unit. Reaksi PCR dilakukan dalam volume total 20 L. Denaturasi templat DNA dilakukan pada suhu 94 oC selama 1 menit. Penempelan primer (annealing) dilakukan pada suhu 48 oC selama 1 menit. Reaksi polimerisasi dilakukan pada suhu 72 oC selama 1,5 menit. Siklus ini dilakukan sebanyak 30 kali. III.3.3 Pemurnian fragmen DNA dnaJ dengan GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit

Fragmen DNA dnaJ hasil reaksi PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa. Fragmen DNA dnaJ dimurnikan dengan GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech). Gel agarosa yang mengandung fragmen DNA dnaJ dipotong dan ditimbang. Untuk setiap miligram potongan gel ditambahkan 10 L capture buffer dengan volume akhir tidak melebihi 300 L. Campuran dihomogenkan dengan cara divorteks, dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 60 oC selama 5 15 menit agar semua gel larut. Campuran yang telah homogen dimasukkan ke dalam kolom GFX, diinkubasi selama 1 menit pada temperatur ruang, selanjutnya disentrifugasi pada 13.600 x g selama 30 detik. Supernatan dibuang, kemudian kolom dicuci dengan 500 L bufer pencuci, lalu disentrifugasi pada 13.600 x g selama 30 detik. Kolom GFX yang mengikat fragmen DNA dnaJ dimasukkan ke tabung Eppendorf 1,5 mL, kemudian elusi dengan 40 L ddH2O steril dan diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Setelah itu, campuran disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 13.600 x g. Fragmen DNA dnaJ hasil pemurnian dielektroforesis pada tegangan 80 V selama 30 menit. Konsentrasi relatif dnaJ ditentukan dengan cara membandingkan

14

intensitas pita dnaJ dengan pita DNA/HindIII yang digunakan sebagai marker yang telah diketahui konsentrasinya. III.3.4 Ligasi fragmen dnaJ dengan vektor pGEM-T Fragmen DNA hasil PCR diligasi dengan vektor pGEM-T yang berukuran 3003 pb. Perbandingan jumlah vektor pGEM-T dengan fragmen dnaJ yang akan diligasikan adalah 1:5. Jumlah fragmen dnaJ yang diligasikan dihitung berdasarkan persamaan:bobot dnaJ (ng ) = bobot vektor pGEMT (ng ) ukuran dnaJ (kb) ukuran vektor pGEMT (kb) 5 1

Berdasarkan perhitungan tersebut, maka sebanyak 92 ng fragmen dnaJ yang telah dimurnikan kemudian diligasikan dengan 50 ng vektor pGEM-T. Campuran ditambahkan satu unit enzim T4 DNA ligase dan diinkubasi selama 32 jam pada suhu 4 oC.

III.3.5 Transformasi E. coli Top10 dengan DNA plasmid rekombinan

Transformasi E. coli Top10 dilakukan menggunakan metode Sambrook et al. (1989) yang dimodifikasi. Satu koloni tunggal E. coli Top10 ditumbuhkan dalam 5 mL media LB pada suhu 37 oC dengan laju pengocokan 150 rpm, selama 16 18 jam. Selanjutnya, dilakukan subkultur 1 % ke dalam 10 mL media LB baru dan diinkubasi pada suhu 37 oC dengan laju pengocokan 150 rpm hingga OD600 mencapai 0,4 0,6. Sel dipindahkan ke 5 buah tabung Eppendorf 1,5 mL, kemudian disentrifuga dengan kecepatan 9000 rpm selama 5 menit. Pelet sel diresuspensi dengan 500 L CaCl2 0,1 M dingin. Selanjutnya diinkubasi dalam es selama 10 menit. Campuran disentrifuga pada kecepatan 9000 rpm selama 5 menit dan pelet sel yang diperoleh diresuspensi dalam 100 L CaCl2 0,1 M dingin dan disimpan pada suhu 4 oC selama 2 24 jam sebagai sel kompeten.

15

Tabung Eppendorf yang berisi 100 L sel kompeten ditambahkan 200 ng DNA plasmid rekombinan hasil reaksi ligasi. Campuran sel kompeten dan DNA diinkubasi dalam es selama 1 jam, selanjutnya diberi heat-shock pada suhu 42 oC selama 90 detik dan didinginkan dalam es selama 10 menit. Sebanyak 900 L media LB baru ditambahkan ke dalam campuran dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1,5 jam dengan laju pengocokan 150 rpm. Campuran disentrifuga pada kecepatan 3000 rpm selama 1 menit, kemudian pelet sel dan 200 L supernatan diresuspensi dan selanjutnya di-spread pada media LB padat yang telah mengandung ampisilin 100 g/mL. Sel diinkubasi pada suhu 37 oC selama 16 18 jam.

III.3.6 Isolasi DNA plasmid skala kecil

Isolasi DNA plasmid skala kecil dilakukan menggunakan metode Holmes dan Quigley (1981) yang dimodifikasi (Sambrook et al., 1989). Koloni tunggal transforman E. coli ditumbuhkan pada 5 mL media cair LB yang mengandung ampisilin 100 g/mL dan diinkubasi pada suhu 37 oC dengan laju pengocokan 150 rpm selama 16 18 jam. Sel biakan disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensi dengan 350 L bufer STET (8% b/v sukrosa, 5% b/v tritonX-100, 50 mM EDTA, 50 mM Tris-Cl pH 8,0). Suspensi sel ditambahkan 25 L lisozim 10 mg/mL, kemudian diinversi 45 kali perlahanlahan dan didiamkan pada suhu kamar selama 2 menit. Selanjutnya suspensi sel dimasukkan ke dalam air mendidih selama 40 detik. Setelah itu tabung disentrifugasi pada 13000 rpm selama 10 menit pada suhu kamar atau 4 oC. Pelet sel pada dasar tabung dibuang dengan menggunakan tusuk gigi steril. Setelah itu, sebanyak 200 L isopropanol ditambahkan ke supernatan dan diinversi 45 kali dan diinkubasi pada suhu 20 oC selama 10 menit. Selanjutnya, tabung disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm pada suhu kamar atau 4 oC untuk memperoleh pelet DNA, kemudian dikeringkan pada suhu 37 oC selama 3060 menit. Setelah itu pelet DNA dilarutkan dengan 40 L ddH2O dan disimpan pada suhu 20 oC.

16

III.3.7 Isolasi DNA plasmid dengan QIAPrep Spin Miniprep Kit

Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan menggunakan metode QIAPrep Spin Miniprep Kit. E. coli Top10 yang mengandung plasmid ditumbuhkan dalam media LB cair yang mengandung ampisilin 100 g/mL selama 16 18 jam pada suhu 37o

C dengan pengocokan 150 rpm. Kultur sel sebanyak 1,5 mL

disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Pelet sel diresuspensi dengan 250 L bufer P1, kemudian ditambahkan 250 L bufer P2 dan diinversi sebanyak 46 kali. Campuran kemudian ditambahkan 350 L bufer N3 dan tabung diinversi beberapa kali, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 10 menit. Supernatan dimasukkan ke dalam kolom QIAPrep dan disentrifuga kembali selama 30 60 detik pada kecepatan 13000 rpm. Kolom QIAPrep kemudian dicuci dengan 500 L bufer PB dan disentrifuga selama 3060 detik pada kecepatan 13000 rpm. Cairan dipisahkan dan kolom dicuci dengan menambahkan 750 L bufer PE dan disentrifuga selama 3060 detik pada kecepatan 13000 rpm. Supernatan dibuang kemudian kolom QIAPrep disentrifuga kembali selama 1 menit. Kolom QIAPrep selanjutnya diletakkan pada tabung Eppendorf 1,5 mL baru. DNA plasmid yang terikat pada kolom dielusi dengan menambahkan 50 L ddH2O steril dan didiamkan selama 1 menit, selanjutnya disentrifuga selama 1 menit pada kecepatan 13000 rpm.

III.3.7 Pemotongan DNA plasmid pGEM-dnaJ dengan enzim NdeI dan BamHI

DNA plasmid yang mengandung fragmen DNA dnaJ sisipan hasil isolasi dengan QIAPrep Spin Miniprep Kit sebanyak 1,0 g dipotong dengan enzim restriksi NdeI (Promega) yang memiliki aktivitas 10 unit dan enzim restriksi BamHI (Promega) yang memiliki aktivitas 15 unit dengan menggunakan bufer K (200 mM Tris-Cl pH 8,5; 100 mM MgCl2; 10 mM DTT; 1000 mM KCl) yang kompatibel untuk kedua enzim restriksi. Pemotongan dilakukan pada suhu 37 oC selama semalam. Hasil pemotongan dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% pada tegangan 85 V selama 30 menit.

17

III.3.9 Elektroforesis gel agarosa

Elektroforesis gel agarosa dilakukan untuk menganalisis fragmen DNA hasil PCR, hasil isolasi DNA plasmid, dan hasil pemotongan DNA plasmid rekombinan dengan enzim restriksi. Agarosa (Difco) 1% [0,3 g agarosa dalam 30 mL bufer TAE 1X (Tris-asetat 0,04 M; Na2EDTA 0,001 M pH 8)] dipanaskan hingga mendidih. Selanjutnya didinginkan hingga suhunya mencapai 55 oC. Kemudian ke dalam larutan agarosa ditambahkan Etidium bromida 0,5 g/mL. Larutan agarosa dituang ke dalam cetakan dan dibiarkan hingga padat. Selanjutnya gel agarosa diletakkan dalam alat elektroforesis yang telah diisi bufer TAE 1X.

Penyiapan sampel DNA dilakukan di atas parafilm. Sampel ditambah loading buffer 6X (0,1% b/v bromofenol biru; 40% b/v sukrosa). Elektroforesis dilakukan pada tegangan 80 85 V selama 30 menit. DNA divisualisasi di bawah sinar UV dan didokumentasikan dengan kamera polaroid DS34.

III.3.10 Penentuan urutan nukleotida fragmen dnaJ

Penentuan urutan nukleotida dnaJ dilakukan dengan memanfaatkan fasilitas yang tersedia pada Macrogen (www.macrogen.com). Prosedur meliputi perbanyakan DNA dengan PCR Big DyeTM Terminator serta penentuan urutan nukleotida dengan menggunakan Automatic Sequencer 3730xl.

18

Bab IV Hasil dan PembahasanProses pelipatan polipetida yang baru disintesis untuk mencapai konformasi struktur yang tepat membutuhkan bantuan chaperone. Chaperone DnaJ (homolog Hsp40) bersama-sama dengan DnaK (homolog Hsp70) dan GrpE, berperan dalam proses pelipatan, transpor protein serta degradasi misfolded protein. Secara in vitro, DnaJ dapat mengenal protein non-natif dan mencegah agregasi protein intermediet (Szabo et al., 1996). Domain cys-rich pada DnaJ E. coli memiliki empat motif berulang CXXCXGXG, di mana motif CXXC merupakan motif lestari pada sisi aktif berbagai protein disulfida oksidoreduktase, yaitu tioredoxin, Protein Disulfida Isomerase (PDI), dan dsbA (Crouy-Chanel, 1995).

Penelitian ini bertujuan untuk mengkloning dan menentukan urutan nukleotida pengkode DnaJ dari bakteri termofilik Bacillus sp. RP1 serta melakukan studi in silico terhadap produk gen yang dihasilkan. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi untuk penelitian lanjutan mengenai fungsi DnaJ pada stres oksidatif serta pembentukan ikatan disulfida secara in vivo.

IV.1

Bacillus sp. RP1

Bacillus sp. RP1 merupakan bakteri yang diisolasi dari sumber air panas Cimanggu, Jawa Barat (Putra, 1999). Bakteri ini memiliki sifat termofilik karena mampu hidup dalam kondisi temperatur ekstrim, yaitu 50-70 oC. Analisis BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool-nucleotide, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/; Altschul et al., 1997) terhadap 498 nukleotida 16s rRNA Bacillus sp. RP1 menunjukkan kemiripan 99% dengan 16s rRNA B. stearothermophilus (AY608942.1) serta 99% dengan 16s rRNA Geobacillus kaustophilus (AY608934.1) (Lampiran A). Analisis pohon filogenetik dengan menggunakan metode Clustal terhadap 16s rRNA Bacillus sp. RP1 menunjukkan kedekatan dengan G. kaustophilus dan B. stearothermophilus (Lampiran B).

19

IV.2

Studi in silico DnaJ Bacillus stearothermophilus (Accession number Q45552) dan DnaJ Geobacillus kaustophilus (Accession number Q5KWZ8)

Urutan nukleotida pengkode DnaJ B. stearothermophilus telah disekuens dan merupakan bagian dari operon DnaK serta telah didaftarkan dalam Genebank dengan Accession number X90709.1 (Herbort et al., 1996). Urutan nukleotida pengkode DnaJ G. kaustophilus diperoleh dari DNA genomik G. kaustophilus (Accession number BA000043.1). Protein DnaJ B. stearothermophilus memiliki kode akses SwissProt Q45552, sedangkan DnaJ putative G. kaustophilus memiliki kode akses Q5KWZ8. Dari empat domain yang umum dimiliki DnaJ, telah berhasil ditentukan struktur untuk domain-J dari DnaJ E. coli (Hill et al., 1995), HDJ1 manusia (Qian et al., 1996), serta domain cys-rich dari DnaJ E. coli (Martinez-Yamout et al., 2000), sedangkan struktur DnaJ secara keseluruhan belum ditentukan. Oleh karena itu, struktur domain-J dan domain cys-rich dari DnaJ Q45552 dan Q5KWZ8 akan dipelajari secara in silico berdasarkan struktur model yang telah ada dalam Protein Data Bank serta akan dibandingkan dengan struktur DnaJ E. coli.

IV.1.1 Parameter fisika-kimia DnaJ

Berdasarkan komposisi asam-asam amino penyusunnya, maka dilakukan analisis parameter fisika-kimia DnaJ dengan menggunakan program Protean dari DNAStar serta ProtParam yang tersedia dalam situs http://www.expasy.org/tools/ protparam.html. Hasil analisis parameter fisika-kimia DnaJ Q45552 dan Q5KWZ8 secara lengkap dicantumkan dalam Lampiran C. Secara ringkas, hasil analisis parameter fisika-kimia DnaJ Q45552 dan Q5KWZ8 ditampilkan dalam Tabel IV.1. Sebagai perbandingan, ditampilkan pula parameter fisika-kimia DnaJ E. coli P08622.

20

Tabel IV.1 Parameter fisika-kimia DnaJ

Parameter Jumlah asam amino Bobot molekul (Da) Rumus molekul pI teoritis Jumlah residu bermuatan negatif Jumlah residu bermuatan positif Indeks instabilitasKeterangan P08622 Q45552 Q5KWZ8

P08622 375 40969,1 C1779H2817N533 O549S16 8,03 51

Q45552 380 42637,6 C1880H2979N555 O548S16 9,67 43

Q5KWZ8 382 41928,2 C1849H2879N537 O555S13 8,7 53

53

68

59

32,54

42,89

37,1

: : DnaJ E. coli : DnaJ B. stearothermophilus : DnaJ G. kaustophilus

Tabel di atas memperlihatkan bahwa jumlah asam amino penyusun ketiga DnaJ bervariasi antara 375 sampai 382 asam amino. Oleh karena itu, bobot atom ketiga DnaJ yang dianalisis juga bervariasi antara 40,9 kDa hingga 42,6 kDa. DnaJ B. stearothermophilus juga memiliki pI teoritis tertinggi di antara ketiga DnaJ yang dianalisis. Hal ini kemungkinan disebabkan karena komposisi residu bermuatan positif yang dimiliki DnaJ B. stearothermophilus paling banyak dibandingkan kedua DnaJ yang lain. Selain itu, nilai indeks instabilitas DnaJ

B. stearothermophilus adalah 42,89. Nilai indeks instabilitas lebih dari 40 menunjukkan bahwa suatu protein tidak stabil. Nilai ini menunjukkan bahwa DnaJ B. stearothermophilus adalah protein yang tidak stabil bila dibandingkan dengan kedua DnaJ lain yang masing-masing memiliki nilai indeks instabilitas kurang dari 40.

21

IV.1.2 Prediksi struktur DnaJ

Domain lestari dari struktur DnaJ dianalisis dengan menggunakan Conserved Domain Search NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/cddsrv) (Gambar IV.1). DnaJ (bagian yang berwarna abu-abu) memiliki tiga domain, yaitu domainJ (bagian berwarna merah), domain cys-rich (bagian berwarna hijau), serta domain C-terminal (bagian berwarna biru).

Gambar IV.1

Daerah lestari DnaJ dengan menggunakan fasilitas Conserved Domain Search dari NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov/structure/ cdd/cddsrv).

Analisis selanjutnya dilakukan untuk mencari ikatan disulfida yang ada dalam struktur DnaJ. Prediksi dilakukan dengan menggunakan program DISULFIND yang tersedia dalam Prosite (http://www.expasy.org/tools/scanprosite). DnaJ B. sterothermophilus Q45552 memiliki 4 ikatan disulfida, yaitu antara C148C151, C165C168, C191C194, dan C205C208 (Gambar IV.2a), sedangkan DnaJ G. kaustophilus ikatan disulfidanya terbentuk antara C150-C153, C167-C170, C193-C196, dan C207-C210 (Gambar IV.2b). DnaJ E. coli (P08622) juga memiliki empat ikatan disulfida yaitu antara C144C147, C161C164, C183 C186, dan C197C200. Keempat ikatan disulfida ini membentuk domain pengikatan Zn2+, yang memiliki motif -CXXCXGXG-. DnaJ B. sterothermophilus Q45552 memiliki motif -CXXCXGXG-, yang diperlihatkan dalam kotak A, B, C, dan D (Gambar IV.2). Pengikatan Zn2+ diperkirakan terjadi antara motif A D serta antara B C.

22

a)

A

B

........130.......140.......150........160.......170.......180 LQYTMTLTFEEAAFGKETDIEIPSEETCNTCHGTGAKPGTKPETCPHCHGAGQISTEQST

........190.......200.......210.......220.......230.......240 PFGRIVNRRTCPYCGGTGQYIKEKCTTCGGTGRVKRRKKIHVKIPAGIDDGQQLRVAGQG

C

D

b)

A

B

.......140.......150.......160........170.......180.......190 EAAFGKETEIEIPREETCDTCQGSGAKPGTSPTSCPHCHGSGQVTSEQATPFGRIVNRRT

C

D

.......200.......210.......220........230.......240.......250 CPVCGGTGRYIPEKCPTCGGTGRVKRRKKIHVKIPAGVDDGQQLRVAGQGEPGVNGGPPG

Gambar IV.2

Prediksi ikatan disulfida dalam DnaJ (a) B. stearothermophilus Q45552; (b) G. kaustophilus Q5KWZ8 ( )

Dari hasil penjajaran terhadap protein DnaJ B. stearothermophilus Q45552 dan DnaJ G. kaustophilus Q5KWZ8 ditemukan dua motif lestari untuk DnaJ pada domain-J (Gambar IV.3) serta satu motif lestari pada domain cys-rich (Gambar IV.4). Motif yang pertama dalam domain-J adalah urutan asam amino His-ProAsp (motif HPD), sedangkan motif kedua adalah Gln-Lys-Arg-Ala (motif QKRA). Motif HPD sangat lestari untuk keluarga protein-J. Motif ini berperan dalam interaksi antara domain-J dari DnaJ dengan domain ATPase dari DnaK (Greene et al., 1998). Sedangkan motif QKRAA berperan dalam interaksi antara DnaJ dengan domain pengikatan substrat pada DnaK (Suh et al., 1995; Auger and Roudier, 1997). Sedangkan untuk DnaJ G. kaustophilus Q5KWZ8 hanya ditemukan motif HPD pada domain-J dan tidak ditemukan motif QKRAA melainkan EKRAR (Gambar IV.3). Dalam domain cys-rich DnaJ B. stearothermophilus Q45552 serta DnaJ G. kaustophilus Q5KWZ8 ditemukan dua motif pengikatan Zn2+, yaitu -CXXCXGXG-. Motif pengikatan Zn ini berperan dalam pengikatan protein unfolded serta mencegah agregasi proten non-natif (Szabo et al., 1996). Hasil BLASTp (BLAST protein) terhadap DnaJ B.

23

stearothermophilus Q45552 diperoleh kemiripan 83% dengan DnaJ Geobacillus thermoglucosidasius (Q9KWS6), 71% dengan DnaJ G. kaustophilus (Q5KWZ8),* 20 * 40 MAKRDYYEILGVSKNATKEEIKKAYRKLSKKYHPDVNK-EPDAAE MAKRDYYEILGVSKNATKEEIKKAYRKLSKKYHPDINK-EPDAAE MAKRDYYEILGVSKNATKDEIKKAYRKLSKQYHPDVNK-APDAAE MSKRDYYEVLGVGKSASKDEIKKAYRKLSKKYHPDINK-EAGAAE -AKQDYYEILGVSKTAEEREIKKAYKRLAMKYHPDRNQGDKEAEA maKrDYYE6LGVsK A k EIKKAY44LskkYHPD Nk Aae * 60 * 80 * KFKEIKEAYEVLSDDQKRAHYDQFGQAD-PNQGFGG--FRSDDFD KFKEIKEAYEVLSDDQKRAHYDQFGHAD-PNQGFGG--FRSDDFD KFKEIKEAYEVLSDDEKRARYDRFGHAD-PNETFGGGGFQGGGFD KFKEVKEAYETLSDDQKRAHYDQFGHTD-PNQGFGG--GGFGGGD KFKEIKEAYEVLTDSQKRAAYDQYGHAAFEQGGMGGG-GFGGGAD KFKE6KEAYEvL3Dd2KRA YDq5Ghad pn gfGG D

DnaJ_Bacst DnaJ_Geotr DnaJ_Geoka DnaJ_Bacli DnaJ_Ecoli

: : : : :

: : : : :

44 44 44 44 44

DnaJ_Bacst DnaJ_Geotr DnaJ_Geoka DnaJ_Bacli DnaJ_Ecoli

: : : : :

: : : : :

86 86 88 86 88

66% dengan DnaJ B. licheniformis (Q65H55), dan 43% dengan DnaJ E. coli (Q8FLC5) (Gambar IV.5).Gambar IV.3 Penjajaran domain-J DnaJ yang memperlihatkan motif HPD (highlight merah) dan motif QKRAA (highlight biru). Bacst, B. stearothermophilus; Geotr, Geobacillus thermoglucosidasius; Geoka, G. kaustophilus; Bacli, B. licheniformis; Ecoli, E. coli. Penjajaran menggunakan program Genedoc.140 * 160 * 180 TFEEAAFGKETDIEIPSEETCNTCHGTGAKPGTKPETCPHCHGAG TFEEAVFGKETDIEIPREETCNTCHGTGAKPGTKKETCSYCHGTG TFEEAAFGKETEIEIPREETCDTCQGSGAKPGTSPTSCPHCHGSG SFEEAAFGKETTIEIPREETCETCSGSGAKPGTKPETCSHCGGSG TLEEAVRGVTKEIRIPTLEECDVCHGSGAKPGTQPQTCPTCHGSG 3fEEA fGket IeIP eEtC tC G3GAKPGT p 3C ChG G * 200 * 220 QISTEQSTPFGRIVNRRTCPYCGGTGQYIKEKCTTCGGTGRVKRR QISTEQSTPFGRIVNRRTCPYCGGTGQYIKERCTTCGGTGRVKRR QVTSEQATPFGRIVNRRTCPVCGGTGRYIPEKCPTCGGTGRVKRR QLNMEQSTPFGKVVNRRVCHYCNGTGKQIKHKCSTCGGTGKVKKR QVQMRQ----GFFAVQQTCPHCQGRGTLIKDPCNKCHGHGRVERS Q6 eQ tpfG vnrrtCp C GtG Ik C tCgGtG4Vk4r

DnaJ_Bacst DnaJ_Geotr DnaJ_Geoka DnaJ_Bacli DnaJ_Ecoli

: : : : :

: : : : :

172 172 174 169 167

DnaJ_Bacst DnaJ_Geotr DnaJ_Geoka DnaJ_Bacli DnaJ_Ecoli

: : : : :

: : : : :

217 217 219 214 208

Gambar IV.4

Penjajaran domain cys-rich DnaJ yang memperlihatkan motif CXXCXGXG. Residu cys diberi highlight berwarna kuning, sedangkan residu Gly diberi highlight berwarna hijau. Bacst, B. stearothermophilus; Geotr, Geobacillus thermoglucosidasius; Geoka, G. kaustophilus; Bacli, B. licheniformis; Ecoli, E. coli. Penjajaran dilakukan dengan menggunakan program Genedoc.

24

DnaJ_Bacst DnaJ_Geotr DnaJ_Geoka DnaJ_Bacli DnaJ_Ecoli

: : : : :

* 20 * 40 * 60 MAKRDYYEILGVSKNATKEEIKKAYRKLSKKYHPDVNK-EPDAAEKFKEIKEAYEVLSDD MAKRDYYEILGVSKNATKEEIKKAYRKLSKKYHPDINK-EPDAAEKFKEIKEAYEVLSDD MAKRDYYEILGVSKNATKDEIKKAYRKLSKQYHPDVNK-APDAAEKFKEIKEAYEVLSDD MSKRDYYEVLGVGKSASKDEIKKAYRKLSKKYHPDINK-EAGAAEKFKEVKEAYETLSDD -AKQDYYEILGVSKTAEEREIKKAYKRLAMKYHPDRNQGDKEAEAKFKEIKEAYEVLTDS maKrDYYE6LGVsK A k EIKKAY44LskkYHPD Nk AaeKFKE6KEAYEvL3Dd * 80 * 100 * 120 QKRAHYDQFGQAD-PNQGFGG--FRSDDFDLGGFSGF--GGFEDIFNTFFGGGR--RRNP QKRAHYDQFGHAD-PNQGFGG--FRSDDFDFGGFSGF--SGFDDIFSTFFGGGR--RRDP EKRARYDRFGHAD-PNETFGGGGFQGGGFDFGGFSGF--GGFEDIFETFFGAGP--RRRA QKRAHYDQFGHTD-PNQGFGG--GGFGGGDFGG------FGFDDIFSSIFGGGA-RRRDP QKRAAYDQYGHAAFEQGGMGGG-GFGGGADFSD-------IFGDVFGDIFGGGR----GR 2KRA YDq5Ghad pn gfGG Dfgg gF D6F FGgG rr * 140 * 160 * 180 NAPRAGADLQYTMTLTFEEAAFGKETDIEIPSEETCNTCHGTGAKPGTKPETCPHCHGAG NAPRAGADLQYTMTLTFEEAVFGKETDIEIPREETCNTCHGTGAKPGTKKETCSYCHGTG SGPRKGADVEYMMTLTFEEAAFGKETEIEIPREETCDTCQGSGAKPGTSPTSCPHCHGSG NAPRQGADLQYTMTLSFEEAAFGKETTIEIPREETCETCSGSGAKPGTKPETCSHCGGSG QRAARGADLRYNMELTLEEAVRGVTKEIRIPTLEECDVCHGSGAKPGTQPQTCPTCHGSG pr GAD6 Y MtL3fEEA fGket IeIP eEtC tC G3GAKPGT p 3C ChG G * 200 * 220 * 240 QISTEQSTPFGRIVNRRTCPYCGGTGQYIKEKCTTCGGTGRVKRRKKIHVKIPAGIDDGQ QISTEQSTPFGRIVNRRTCPYCGGTGQYIKERCTTCGGTGRVKRRKKIHVKIPAGIDDGQ QVTSEQATPFGRIVNRRTCPVCGGTGRYIPEKCPTCGGTGRVKRRKKIHVKIPAGVDDGQ QLNMEQSTPFGKVVNRRVCHYCNGTGKQIKHKCSTCGGTGKVKKRKKINVTIPAGVDDGQ QVQMRQ----GFFAVQQTCPHCQGRGTLIKDPCNKCHGHGRVERSKTLSVKIPAGVDTGD Q6 eQ tpfG vnrrtCp C GtG Ik C tCgGtG4Vk4rKk6 VkIPAG6DdGq * 260 * 280 * 300 QLRVAGQGERGLTVGRREIYILSFMWSRM-SFLNVTAMIFIA-KCRLRLRKLRLGMKSKS QLRVAGQGEPGINGGPPGDLYIVFHVEPH-EFFERDGDDIYC-EIPLTFAQAALGDEIEV QLRVAGQGEPGVNGGPPGDLYIIFRVEPH-EFFKRDGDDIYC-EVPLSFAQAALGDEIEV QLRVAGQGEPGINGGPSGDLFVVFRVQEH-EFFERDGDDIYC-EMPLTFAQAALGDEIEV RIRLAGEGEAGEHGAPAGDLYVQVQVKQH-PIFEREGNNLYC-EVPINFAMAALGGEIEV q6R6AG2GE G ggp gdl 6 f v h ff r g yc e p6 fa aaLG eiev * 320 * 340 * 360 RPFTGKLKLKIPAGTQTGTRLRLKGKGVPNVRGYGYGDQHVIVRVVTPTKLTEKQKQLLR PTLHGKVRLKIPAGTQTGTKFRLKGKGVPNVRGYGYGDQHVIVRVVTPTKLTEKQKQLLR PTLHGHVKLKIPAGTQTGTRFRLKGKGVPNVRGYGQGDQHVIVRVVTPTKLTEKQKQLLR PTLHGKVKLKVPAGTQTGTKFRLKGKGVANVRGYGQGDQHIVVRVVTPTNLTENQKNILR PTLDGRVKLKVPGETQTGKLFRMRGKGVKSVRGGAQGDLLCRVVVETPVGLNEKQKQLLQ ptl G 64LK6PagTQTGt fR64GKGV nVRGyg GDqh VrVvTPt LtEkQKq6Lr * 380 * EFDQLGGS---SMHHEPHDRFFDKVKKAFKPES EFDQLGGS---SMHQGPHGRFFEKVKKAFKGES EFERLGGD---TMHDGPHGRFFEKVKKAFKGEA EFAEVSG----NMPDEQEMSFFDKVKRAFK--ELQESFGGPTGEHNSPRSKSFFDGVKKFF---Ef G m FF kVK4aFk

: : : : :

59 59 59 59 59

DnaJ_Bacst DnaJ_Geotr DnaJ_Geoka DnaJ_Bacli DnaJ_Ecoli

: : : : :

: : : : :

112 112 114 109 107

DnaJ_Bacst DnaJ_Geotr DnaJ_Geoka DnaJ_Bacli DnaJ_Ecoli

: : : : :

: : : : :

172 172 174 169 167

DnaJ_Bacst DnaJ_Geotr DnaJ_Geoka DnaJ_Bacli DnaJ_Ecoli

: : : : :

: : : : :

232 232 234 229 223

DnaJ_Bacst DnaJ_Geotr DnaJ_Geoka DnaJ_Bacli DnaJ_Ecoli

: : : : :

: : : : :

290 290 292 287 281

DnaJ_Bacst DnaJ_Geotr DnaJ_Geoka DnaJ_Bacli DnaJ_Ecoli

: : : : :

: : : : :

350 350 352 347 341

DnaJ_Bacst DnaJ_Geotr DnaJ_Geoka DnaJ_Bacli DnaJ_Ecoli

: : : : :

: : : : :

380 380 382 373 370

Gambar IV.5

Penjajaran protein DnaJ. Bacst, Bacillus stearothermophilus; Geotr, G. thermoglucosidasius; Geoka, G. kaustophilus; Bacli, B. licheniformis;

25

Ecoli, Escherichia coli. Penjajaran dilakukan dengan menggunakan program Genedoc

Prediksi struktur DnaJ dilakukan dengan menggunakan program Swiss Model (http://swissmodel.unibas.ch). Oleh karena struktur DnaJ secara lengkap belum ditentukan, maka prediksi yang dapat dilakukan hanya terhadap domain-J (Gambar IV.6) serta domain cys-rich (Gambar IV.7). Domain-J DnaJ B. stearothermophilus Q45552 tersusun oleh 4 struktur -heliks yang menyerupai struktur domain-J E. coli P08622 (PDB ID: 1BQZ; Hill et al., 1995). I terdiri dari Asp5 sampai Gly11. II tersusun oleh Lys 18 sampai Lys31. III tersusun oleh Ala42 sampai Glu 54. IV tersusun oleh Asp59 sampai Asp66. Motif HPD terletak di antara II dengan III sedangkan motif QKRAA pada IV. Domain-J DnaJ G. kaustophilus juga terdiri dari 4 struktur -heliks yang menyerupai struktur domain-J E. coli. I terdiri dari Asp5 sampai Gly11. II tersusun oleh Lys 18 sampai Gln31. III tersusun oleh Ala43 sampai Ser57, sedangkan IV tersusun oleh Asp59 sampai Asp66. Motif HPD pada DnaJ G. kaustophilus terletak di antara II dengan III, sedangkan motif EKRAR pada IV.

IV

IV

IV

I II III II I III

I

II

III

a

b

c

Gambar IV.6

Prediksi struktur domain-J DnaJ. a) DnaJ E. coli (P08622); b) DnaJ B. stearothermophilus (Q45552); c) DnaJ G. kaustophilus (Q5KWZ8). Pita biru tua menunjukkan untai heliks. Analisis struktur menggunakan

26

program Geno3D (Combet et al., 2002), sedangkan untuk tampilan struktur digunakan program Yasara (http://www.YASARA.org).

DnaJ B. stearothermophilus Q45552 dan DnaJ G. kaustophilus Q5KWZ8 diperkirakan memiliki empat motif berulang CXXCXGXG yang menyusun dua motif pengikatan Zn2+ (Gambar IV.7b dan IV.7c). Kedua motif pengikatan Zn ini menyerupai motif pengikatan Zn2+ pada struktur domain cys-rich DnaJ E. coli (Gambar IV.7a). aI VI V III ZnII II

IV

aa

ZnI

bI VI V ZnI

IV

I ZnII I II

c

I ZnII

ZnI

Gambar IV.7

Prediksi struktur domain cys-rich DnaJ. a) DnaJ E. coli (P08622, PDB ID: 1EXK); b). DnaJ B. stearothermophilus (Q45552); c). DnaJ G. kaustophilus (Q5KWZ8). Pita merah menunjukkan untai-. Atom Zn berbentuk bola berwarna ungu. Analisis struktur menggunakan program

27

Domain cys-rich DnaJ Q45552 terbentuk oleh 6 untai (Gambar IV.7b). Untai 1 dimulai dari residu Ser144 sampai Cys148. Untai 1 paralel dengan untai 6 yang terdiri dari residu Gly212 sampai Lys215. Untai 2 yang tersusun dari residu Glu163 sampai Cys165 paralel dengan untai 5 yang tersusun dari residu Gly198 sampai Tyr200. Sedangkan untai 3 yang terdiri dari residu Gly172 sampai Ser175 paralel dengan untai 4 yang terdiri dari Asn187 sampai Thr190. Sedangkan pada domain cys-rich DnaJ G. kaustophilus Q5KWZ8, hanya tersusun oleh dua untai . Untai 1 dimulai dari Val40 sampai Thr41 paralel dengan untai 2 yang dimulai dari Asn53 sampai Arg55 (Gambar IV.7c).

Geno3D (Combet et al., 2002), sedangkan untuk tampilan struktur digunakan program Yasara (http://www.YASARA.org).

IV.2

Amplifikasi gen dnaJ Bacillus sp. RP1

Berdasarkan hasil analisis 16s rRNA dnaJ Bacillus sp. RP1, maka primer yang digunakan dalam penelitian ini dirancang berdasarkan urutan nukleotida dnaJ B. stearothermophilus (Accession number Q45552). Primer yang digunakan adalah DJF1 (5-GAGGACATATGGCGAAGCGTGATTATTATG-3) sebagai primer forward, yang telah disisipkan dengan sisi pemotongan enzim restriksi NdeI serta DJR2 (5-GAGGAGGATCCTCATGATTCTGGTTTAAACGC-3) sebagai primer reverse, yang telah disisipkan dengan sisi pemotongan enzim restriksi BamHI. Templat yang digunakan adalah DNA kromosom Bacillus sp. RP1.

Amplifikasi gen pengkode DnaJ menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran 1,1 kb (Gambar IV.8). Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan Mg2+, yang berperan sebagai kofaktor Taq polimerase, dengan konsentrasi 2 mM dan 3 mM. Amplifikasi menggunakan konsentrasi MgCl2 2 mM memberikan hasil optimal yang ditunjukkan dengan adanya pita DNA yang tebal dengan ukuran sekitar 1,1 kpb.

28

23130 9416 6557 4361 2322 2027 564 (pb)

1

2

3

dnaJ 1,1 kpb

Gambar IV.8

Elektroforegram fragmen DNA hasil PCR. Lajur 1. Marka DNA/ HindIII; Lajur 2. Fragmen DNA hasil PCR dengan [MgCl2] 2 mM; Lajur 3. Fragmen DNA hasil PCR dengan [MgCl2] 3 mM.

IV.3

Ligasi dnaJ dengan vektor pGEM-T

Fragmen DNA yang diperoleh dari PCR dimurnikan dengan GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit, kemudian diligasi ke dalam vektor kloning pGEM-T. Fragmen DNA dnaJ yang diperoleh dari PCR mengandung basa adenin (A) pada ujung 3, sedangkan vektor pGEM-T memiliki nukleotida timin (T) pada ujung 5. Pada proses ligasi ini akan terjadi pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 3 hidroksil dan ujung 5 fosfat DNA yang berdekatan. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim T4 DNA ligase. Pada vektor pGEM-T dan fragmen DNA hasil PCR memiliki ujung lancip yang saling kompatibel, sehingga pertama kali akan terbentuk ikatan hidrogen antara basa A pada fragmen DNA hasil PCR dengan basa T pada vektor pGEM-T. Selanjutnya, ujung dari masingmasing DNA tersebut akan diligasi oleh enzim T4 DNA ligase membentuk ikatan fosfodiester. Fragmen DNA hasil PCR dan vektor pGEM-T akan membentuk plasmid sirkular.

29

IV.4

Transformasi E. coli Top10 dengan pGEM-T-dnaJ

Sel inang E. coli Top10 ditransformasi dengan hasil ligasi vektor pGEM-T dengan fragmen DNA dnaJ produk PCR. Pada transformasi tersebut diperoleh koloni biru dan koloni putih yang tumbuh pada media padat yang mengandung ampisilin 100 g/mL (Gambar IV.9). Koloni biru dan putih diperoleh karena pada media pertumbuhan ditambahkan X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-beta-Dgalaktopiranosida) dan IPTG (isopropiltio--D-galaktosida). Koloni biru adalah koloni yang diperkirakan mengandung vektor pGEM-T, sedangkan koloni putih adalah koloni yang membawa pGEM-T-dnaJ.

koloni putih

koloni biru

Gambar IV.9

Hasil transformasi E. coli Top10 dengan pGEM-T-dnaJ.

IV.5

Analisis restriksi DNA plasmid rekombinan dengan enzim-enzim restriksi

Plasmid rekombinan pGEM-T-dnaJ mempunyai ukuran 4147 pb, di mana pGEM-T berukuran 3003 pb dan gen dnaJ 1143 pb. Di dalam plasmid rekombinan pGEM-T-dnaJ terdapat sisi pemotongan enzim restriksi BamHI dan NdeI sehingga dilakukan analisis restriksi terhadap pGEM-T-dnaJ dengan menggunakan enzim-enzim restriksi tersebut. Plasmid pGEM-T yang tidak

30

dipotong menunjukkan adanya pita berukuran 3 kpb (Gambar IV.10 lajur 2). Pemotongan plasmid dengan BamHI menunjukkan adanya pita tunggal berukuran 4,1 kpb (Gambar IV.10 lajur 3). Hasil ini sesuai dengan harapan, karena pada pGEM-T-dnaJ hanya terdapat satu daerah pemotongan enzim BamHI, yaitu pada bagian sisipan gen dnaJ, sehingga akan menghasilkan satu fragmen DNA apabila dipotong dengan enzim tersebut. Pemotongan dengan BamHI dan NdeI menghasilkan 2 pita berukuran 3 kpb dan 1,1 kpb (Gambar IV.10 lajur 5) yang menunjukkan adanya pita pGEM-T ( 3 kpb) dan dnaJ ( 1,1 kpb). Ukuran pita plasmid ini menunjukkan bahwa plasmid pGEM-T membawa dnaJ sisipan.

23130 9416 6557 4361 2322 2027 564 (pb)

1

2

3

4

5pGEM-T 3,0 kpb dnaJ 1,1 kpb

Gambar IV.10 Elektroforegram hasil restriksi pGEM-T-dnaJ dengan enzim restriksi BamHI dan NdeI. Lajur 1, marka DNA/HindIII; lajur 2. pGEM-T-dnaJ tanpa dipotong; lajur 3. pGEM-T-dnaJ/BamHI; lajur 4. pGEM-TdnaJ/NdeI; lajur 5. pGEM-T-dnaJ/BamHI-NdeI

IV.6

Analisis urutan nukleotida dnaJ Bacillus sp. RP1

Fragmen DNA dnaJ Bacillus sp. RP1 hasil pemurnian dengan GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit selanjutnya disekuensing. Urutan nukleotida hasil sekuensing dengan primer DJF1 (forward) dan DJR2 (reverse) berturut-turut diberi nama DNAJF-DJF1 dan DNAJR-DJR2. Dengan menggunakan primer DJF1 berhasil disekuensing sejumlah 926 pb (Lampiran D). Melalui program Editseq dari DNAStar, ditentukan urutan nukleotida komplemennya. Selanjutnya dilakukan BLASTtn terhadap 926 pb DNAJ-DJF1 tersebut. Analisis ini dilakukan

31

untuk mengetahui tingkat kesamaan nukleotida DNAJF-DJF1 dengan urutan nukleotida yang ada pada basis data Genebank. Analisis terhadap 717 pb urutan nukleotida DNAJF-DJF1 (Gambar IV.11) menunjukkan tingkat kesamaan 95% dengan protein chaperone G. kaustophilus (BA000043.1). Sedangkan 279 nukleotida hasil sekuensing DNAJF-DJF1 menunjukkan tingkat kesamaan 83% dengan operon DnaK dari B. stearothermophilus (X90709.1).

Pada sekuensing terhadap DNAJR-DJR2 dengan menggunakan primer DJR2 berhasil diperoleh 1099 nukleotida. Selanjutnya dilakukan analisis BLASTn terhadap ke-1099 pb DNAJ-DJR2. Analisis terhadap 204 pb DNAJR-DJR2 (Gambar IV.12) menunjukkan tingkat kesamaan 97% dengan protein chaperone G. kaustophilus (BA000043.1). kesamaan Sedangkan 87% dengan sebanyak operon 138 DnaK nukleotida dari B.

menunjukkan

tingkat

stearothermophilus (X90709.1).

Hasil

sekuensing

terhadap

DNAJ-DJF1

dan

DNAJ-DJR2

selanjutnya

digabungkan untuk memperkirakan urutan nukleotida dnaJ Bacillus sp. RP1. Selanjutnya dilakukan penjajaran terhadap hasil penggabungan DNAJ-DJF1 dan DNAJ-DJR2 tersebut terhadap urutan nukleotida chaperone putative

G. kaustophilus (BA000043.1) serta dnaJ B. stearothermophilus (Q45552), dengan menggunakan program ClustalX dan Genedoc (Lampiran D). Analisis BLASTn terhadap 1053 pb hasil penggabungan urutan nukleotida dnaJ Bacillus sp. RP1 menunjukkan tingkat kemiripan 97% terhadap chaperone putative G. kaustophilus (BA000043.1) serta 86% terhadap operon DnaK dari B. stearothermophilus (X90709.1).

32

* 20 * 40 * 60 * DNAJF-DJF : TTTGAAGAAGGGGGGTTTGGAAAGATAACGGAAATTGAAATTCCGCGGGAAGAGACGTGAGACACGTGCC : DNAJ-GEOKA : TTTGAAGAAGCGGCGTTCGGAAAAGAAACGGAAATTGAAATTCCGCGGGAAGAGACGTGCGACACGTGCC : DNAJ-Q4555 : TTTGAAGAAGCAGCGTTTGGCAAAGAAACCGATATTGAAATTCCGAGCGAAGAAACGTGCAACACTTGCC : TTTGAAGAAGcgGcGTTtGGaAAagaAACgGAaATTGAAATTCCGcGgGAAGAgACGTGcgACACgTGCC 80 * 100 * 120 * 140 DNAJF-DJF : AAGGCAGGGGAGCGTAACCGGGCACAAGCCCGACGTTTTTACAGCATTGCCACGGCAGCGGGCAAGTGAC : DNAJ-GEOKA : AGGGCAGCGGAGCGAAACCGGGCACAAGCCCGACGTCTTGTCCGCATTGCCACGGCAGCGGGCAAGTGAC : DNAJ-Q4555 : ATGGCACCGGAGCAAAACCGGGCACAAAGCCGGAAACATGTCCGCATTGTCACGGGGCAGGACAAATAAG : A GGCAgcGGAGCgaAACCGGGCACAAgcCCGacgtctTgtCcGCATTGcCACGGcagcGGgCAAgTgAc * 160 * 180 * 200 * DNAJF-DJF : AAGCGAACAGGCGACGCCGTTTGGCCGCATCGTCAACCGCCGGACATGTCCCGTCTGCGGCGGCACGGGC : DNAJ-GEOKA : AAGCGAACAAGCGACGCCATTTGGCCGCATCGTCAACCGCCGGACATGCCCCGTCTGCGGTGGCACGGGC : DNAJ-Q4555 : CACGGAGCAATCCACCCCGTTTGGGCGCATCGTCAATCGTCGCACCTGTCCATATTGCGGTGGGACAGGG : aAgcGAaCAagCgACgCCgTTTGGcCGCATCGTCAAcCGcCGgACaTGtCCcgtcTGCGGtGGcACgGGc 220 * 240 * 260 * 280 DNAJF-DJF : CGGTACATTCCGGAGAAATGCCCAACGTGCGGCGGCACGGGACGCGTCAAACGGCGGAAAAAAATTCACG : DNAJ-GEOKA : CGGTACATTCCGGAGAAATGCCCAACGTGCGGCGGCACGGGACGCGTCAAACGGCGAAAAAAAATTCACG : DNAJ-Q4555 : CAATATATTAAAGAAAAATGTACGACATGTGGCGGCACTGGCCGCGTAAAACGACGGAAAAAAATCCATG : CggTAcATTccgGAgAAATGccCaACgTGcGGCGGCACgGGaCGCGTcAAACGgCGgAAAAAAATtCAcG * 300 * 320 * 340 * DNAJF-DJF : TCAAAATTCCAGCCGGCGTCGACGACGGCCAGCAGCTGCGCGTCGCCGGCCAAGGGGAGCCAGGGGTCAA : DNAJ-GEOKA : TCAAAATTCCAGCCGGCGTCGACGACGGCCAGCAGCTGCGCGTCGCCGGCCAAGGGGAGCCAGGGGTCAA : DNAJ-Q4555 : TGAAAATCCCGGCCGGAATTGATGATGGACAACAATTGCGCGTTGCCGGCCAAGGAGAGC-GGGGATTAA : TcAAAATtCCaGCCGGcgTcGAcGAcGGcCAgCAgcTGCGCGTcGCCGGCCAAGGgGAGCcaGGGgTcAA 360 * 380 * 400 * 420 DNAJF-DJF : TGGCGGGCCGCCGGGCGATTTGTACATCATCTTCCGCGTCGAACCACATGAGTTTTTCAAACGCGACGGC : DNAJ-GEOKA : TGGCGGGCCCCCGGGCGATTTGTACATCATCTTCCGAGTCGAACCACATGAGTTTTTCAAACGCGACGGC : DNAJ-Q4555 : CGGTGGGCCGCCGGGAGATTTATATATTGTCTTTCATGTGGAGCCGCATGAGTTTTTTGAACGTGACGGC : tGGcGGGCCgCCGGGcGATTTgTAcATcaTCTTcCg GTcGAaCCaCATGAGTTTTTcaAACGcGACGGC * 440 * 460 * 480 * DNAJF-DJF : GACGATATTTATTGCGAAGTGCCGCTGTCGTTCGCCCAGGCGGCGCTCGGCGATGAGATCGAAGTGCCGA : DNAJ-GEOKA : GACGATATTTATTGCGAAGTGCCGTTGTCGTTCGCCCAGGCCGCGCTCGGCGATGAGATCGAAGTGCCGA : DNAJ-Q4555 : GATGATATTTATTGCGAAGTGCCGCTTACGTTTGCGCAAGCTGCGCTTGGGGATGAAATCGAAGTCCCGA : GAcGATATTTATTGCGAAGTGCCGcTgtCGTTcGCcCAgGC GCGCTcGGcGATGAgATCGAAGTgCCGA 500 * 520 * 540 * 560 DNAJF-DJF : CGCTCCATGGCCATGT-GAAGCTGAAAATTCCGGCCGGCACGCAAACGGGCACGCGCTTCCGCTTGAAGG : DNAJ-GEOKA : CGCTCCATGGCCATGT-GAAGCTGAAAATCCCGGCCGGCACGCAAACGGGCACGCGCTTCCGCTTGAAGG : DNAJ-Q4555 : CCCTTCACGGGAAAGTTGAAGTTGAAAATTCCGGCAGGCACGCAAACAGGAACGAGATTGCGCTTAAAAG : CgCTcCAtGGccAtGT GAAGcTGAAAATtCCGGCcGGCACGCAAACgGGcACGcGcTTcCGCTTgAAgG * 580 * 600 * 620 * DNAJF-DJF : GAAAAGGGGTGCCGAACGTGCGCGGCTACGGCCAAGGCGATCAGCACGTCATCGTCCGCGTTGTGACGCC : DNAJ-GEOKA : GAAAAGGGGTGCCGAACGTACGGGGCTACGGCCAAGGCGATCAGCACGTCATTGTCCGCGTTGTGACGCC : DNAJ-Q4555 : GAAAAGGAGTGCCGAATGTGCGCGGCTATGGCTATGGCGACCAGCATGTCATTGTCCGCGTTGTTACGCC : GAAAAGGgGTGCCGAAcGTgCGcGGCTAcGGCcAaGGCGAtCAGCAcGTCATtGTCCGCGTTGTgACGCC 640 * 660 * 680 * 700 DNAJF-DJF : GACGAAGCTGACCGAAAAACAAAAGCAGCTGTTGCGCGAGTTTGATCGGCTCGGCGGAGACACGATGCAC : DNAJ-GEOKA : GACGAAGCTGACCGAAAAGCAAAAGCAGCTGCTGCGCGAGTTTGAACGGCTCGGCGGAGACACGATGCAC : DNAJ-Q4555 : GACGAAACTGACGGAAAAGCAAAAGCAATTGTTGCGCGAATTTGACCAATTAGGCGGTTCGAGCATGCAT : GACGAAgCTGACcGAAAAgCAAAAGCAgcTGtTGCGCGAgTTTGA CggcTcGGCGGagacAcgATGCAc * DNAJF-DJF : GACGGGCCGCACGGCCGT : DNAJ-GEOKA : GACGGGCCGCACGGCCGT : DNAJ-Q4555 : CATGAACCACATGACCGC : gAcGggCCgCAcGgCCGt

70 70 70

140 140 140

210 210 210

280 280 280

350 350 349

420 420 419

490 490 489

559 559 559

629 629 629

699 699 699

717 717 717

Gambar IV.11 Penjajaran nukleotida DNAJF_DJF1 dnaJ Bacillus sp. RP1, dengan DnaJ G. kaustophilus (DNAJ-GEOKA, BA000043.1), dan DnaJ B. stearothermophilus (DNAJ-Q4555, X90709.1)

33

* 20 * 40 * DNAJ-GEOKA : CGGCGTCAGCAAAAACGCGACGAAAGACGAGATCAAAAAAGCGTATCGAAAGCTT : DNAJ-Q4555 : CGGAGTCAGCAAAAACGCGACAAAAGAAGAGATTAAAAAAGCGTACCGGAAGCTT : DNAJR-DJR2 : CGCCGTCAC--AAAACGCGACGAA-GACGAGATCAAAAAAGCGTATCGAAAGCTT : CGgcGTCAgcaAAAACGCGACgAAaGAcGAGATcAAAAAAGCGTAtCGaAAGCTT 60 * 80 * 100 * DNAJ-GEOKA : TCGAAGCAGTATCATCCAGATGTGAACAAAGCCCCGGACGCCGCGGAGAAGTTTA : DNAJ-Q4555 : TCGAAAAAGTATCATCCAGATGTAAACAAAGAGCCCGATGCGGCGGAGAAATTTA : DNAJR-DJR2 : TCGAAGCAGTATCATCCAGATGTGAACAAAGCCCCGGACGCCGCGGAGAAGTTTA : TCGAAgcAGTATCATCCAGATGTgAACAAAGccCCgGAcGCcGCGGAGAAgTTTA 120 * 140 * 160 DNAJ-GEOKA : AGGAAATTAAAGAGGCGTACGAAGTGTTAAGCGATGATGAAAAGCGGGCCCGCTA : DNAJ-Q4555 : AAGAAATTAAAGAAGCGTACGAAGTTTTAAGCGATGATCAAAAGCGGGCCCATTA : DNAJR-DJR2 : AGGAAATTAAAGAGGCGTACGAAGTGTTAAGCGATGATGAAAAGCGGGCCCGCTA : AgGAAATTAAAGAgGCGTACGAAGTgTTAAGCGATGATgAAAAGCGGGCCCgcTA * 180 * 200 DNAJ-GEOKA : CGACCGCTTTGGCCATGCCGACCCGAACGAAACGTTTGG : DNAJ-Q4555 : CGATCAATTTGGCCAGGCCGATCCAAATCA-AGGCTTCG : DNAJR-DJR2 : CGACCGCTTCGGCCATGCCGACCCGACCCACACGTTTGA : CGAcCgcTTtGGCCAtGCCGAcCCgAaccA AcGtTTgg

55 55 52

110 110 107

165 165 162

204 203 201

Gambar IV.12 Penjajaran nukleotida DNAJR_DJR2 dnaJ Bacillus sp. RP1, dengan DnaJ G. kaustophilus (DNAJ-GEOKA, BA000043.1), dan DnaJ B. stearothermophilus (DNAJ-Q4555, X90709.1)

IV.7 Studi in silico struktur DnaJ Bacillus sp. RP1

Deduksi terhadap urutan asam amino dnaJ Bacillus sp. RP1, berhasil ditemukan daerah lestari pada ujung N-terminal, yang merupakan motif pengenal untuk DnaJ, yaitu urutan His-Pro-Asp. Selain itu, ditemukan pula empat motif pengikatan Zn (-C-X-X-C-X-G-X-G-) pada domain cys-rich.

Prediksi model struktur DnaJ Bacillus sp. RP1 dilakukan dengan menggunakan program Geno3D (Combet et al., 2002). Model struktur domain-J DnaJ Bacillus sp. RP1 diperkirakan terdiri dari empat struktur -heliks. I terdiri atas Asp5 sampai Gly11, II terdiri atas Thr17 sampai Lys30, III terdiri atas Asp41 sampai Ser57, sedangkan IV terdiri dari Asp59 sampai Arg67. Motif lestari HPD berada di antara II dan III (Gambar IV.13).

34

IV

Gambar IV.13 Prediksi struktur domain-J DnaJ Bacillus sp. RP1. Pita biru menunjukkan untai -heliks.

Pemodelan selanjutnya dilakukan terhadap 81 asam amino yang berada pada domain cys-rich (Gambar IV.14). Dari hasil pemodelan diperoleh bahwa domain cys-rich DnaJ Bacillus sp. RP1 memiliki kemiripan dengan DnaJ E. coli (PDB ID: 1EXKA, Martinez-Yamout et al., 2000). Dari hasil pemodelan struktur struktur diperkirakan bahwa domain cys-rich DnaJ Bacillus sp. RP1 memiliki empat motif pengikatan Zn2+. Motif I adalah -CDTCQGRG-, motif II: -CQHCHGSG-, motif III: -CCPVCGGTG-, dan motif IV: -CPTCGGTG-. DnaJ Bacillus sp. RP1 memiliki bentuk seperti huruf V yang diperpanjang. Masing-masing sayap yang membentuk V terdiri atas dua motif untuk pengikatan Zn2+. Motif I dibentuk dari Cys12, Cys15, Cys69, dan Cys72, sedangkan motif II dibentuk oleh Cys29, Cys32, Cys55, dan Cys58. Pada Gambar IV.14 terlihat pula bahwa DnaJ Bacillus sp. RP1 memiliki 4 untai . Untai 1 dibentuk oleh residu Glu10 yang paralel dengan untai 4 yang tersusun oleh residu Val78. Sedangkan, untai 2 yang

35

dibentuk oleh residu Val38 sampai Ser40 paralel dengan untai 3 yang tersusun dari residu Asn51 sampai Arg53. Model struktur domain cys-rich DnaJ Bacillus sp. RP1 menunjukkan adanya perbedaan dengan domain cys-rich E. coli (Martinez-Yamout et al., 2000) dan DnaJ Q45552 (bagian IV.1.3 dalam tesis ini) yang keduanya memiliki 6 untai , juga dengan DnaJ Q5KWZ8 yang memiliki 2 untai .III I II

IV

ZnI

ZnII

Gambar IV.14 Prediksi struktur domain cys-rich DnaJ Bacillus sp. RP1. Untai- ditunjukkan dengan pita berwarna merah. Residu sistein berwarna hijau. Analisis struktur dilakukan dengan menggunakan program Geno3D (Combet et al., 2002), sedangkan tampilan struktur digunakan program Yasara (http://www.YASARA.org).

IV.8

Diskusi

Strategi untuk memperoleh gen dnaJ Bacillus sp. RP1 dilakukan melalui beberapa tahap isolasi gen yang meliputi, perancangan primer, isolasi gen menggunakan PCR, ligasi fragmen DNA dnaJ dengan vektor pGEM-T, serta transformasi E. coli Top10 menggunakan plasmid rekombinan pGEM-T-dnaJ.

Isolasi gen menggunakan teknik PCR menghasilkan fragmen DNA berukuran 1,1 kpb. Fragmen DNA dnaJ ini kemudian dimurnikan dan diligasi dengan vektor pGEM-T. Selanjutnya E. coli Top10 ditransformasi dengan hasil ligasi. Isolasi plasmid rekombinan menghasilkan fragmen DNA berukuran 4,1 kpb. Dengan menggunakan enzim restriksi NdeI dan BamHI diperoleh fragmen DNA

36

berukuran 1,1 kpb dan 3,0 kpb. Fragmen DNA berukuran 1,1 kpb diperkirakan adalah dnaJ.

Sekuensing terhadap fragmen DNA dnaJ hasil PCR menghasilkan 926 pb dengan menggunakan primer DJF1, sedangkan dengan menggunakan primer DJR2 diperoleh 1099 pb. Penggabungan terhadap kedua hasil sekuensing ini belum berhasil menentukan urutan nukleotida dnaJ Bacillus sp. RP1 secara utuh, karena pada N-terminal ditemukan kekurangan ~21 nukleotida, sedangkan pada Cterminal ditemukan adanya kekurangan ~18 nukleotida. Namun demikian, hasil analisis BLASTn terhadap penggabungan urutan nukleotida fragmen DNA dnaJ hasil PCR menunjukkan sebanyak 1053 pb dnaJ Bacillus sp. RP1 menunjukkan tingkat kemiripan 97% terhadap chaperone putative G. kaustophilus

(BA000043.1) serta 86% terhadap operon DnaK B. stearothermophilus (X90709.1). Hal ini dapat dijadikan kesimpulan sementara bahwa fragmen DNA yang berhasil diisolasi adalah molekul chaperone.

Selanjutnya dilakukan analisis in silico untuk memperkirakan kemungkinan struktur fragmen DNA hasil isolasi dengan PCR. Hasil studi in silico ini menunjukkan adanya kemiripan struktur antara domain-J DnaJ Bacillus sp. RP1 dengan domain-J DnaJ E. coli. Domain-J DnaJ Bacillus sp. RP1 terdiri atas empat struktur -heliks sama seperti struktur domain-J DnaJ E. coli. Selain itu pada domain-J DnaJ B. stearothermophilus ditemukan dua motif lestari untuk kelompok protein DnaJ (homolog Hsp40). Motif yang pertama adalah motif HisPro-Asp (motif HPD) yang terletak di antara heliks II dan heliks III. Hal yang sama ditunjukkan pada domain-J DnaJ E. coli, di mana motif HPD ini terletak di antara heliks II dan heliks III. Motif kedua yang ditemukan adalah motif QKRA yang juga lestari untuk kelompok protein DnaJ (homolog Hsp40). Sedangkan pada DnaJ G. kaustophilus juga ditemukan motif lestari His-Pro-Asp (HPD), tetapi tidak memiliki motif QKRAA melainkan EKRAR. Selain itu, prediksi terhadap struktur domain-J DnaJ G. kaustophilus menunjukkan bahwa domain-J DnaJ G. kaustophilus memiliki kemiripan dengan struktur DnaJ E. coli.

37

Domain cys-rich DnaJ Bacillus sp. RP1 memiliki empat struktur serta empat motif CXXCXGXG secara berulang. Keempat motif ini merupakan penyusun motif pengikatan ion Zn2+. Motif I adalah CDTCQGRG, motif II adalah CQHCHGSG, motif III adalah CPVCGGTG, dan motif IV adalah CPTCGGTG. Prediksi terhadap struktur domain cys-rich DnaJ Bacillus sp. RP1 ini menunjukkan kemiripan dengan struktur domain cys-rich DnaJ E. coli. Keempat motif pengikatan Zn ini membentuk domain pengikatan dua ion Zn2+, di mana motif I dan IV membentuk motif pengikatan ZnI sedangkan motif II dan III berinteraksi membentu motif pengikatan ZnII. Interaksi antara keempat motif ini membuat struktur DnaJ berbentuk seperti huruf V, dengan kedua motif pengikatan ZnI dan ZnII menyusun masing-masing sayap dari huruf V. Model struktur seperti huruf V ini menunjukkan kemiripan dengan domain cys-rich DnaJ E. coli. Tetapi DnaJ Bacillus sp. RP1 hanya memiliki 4 untai , sedangkan DnaJ E. coli dan B. stearothermophilus Q45552 memiliki 6 untai . Dibandingkan dengan struktur DnaJ G. kaustophilus, domain cys-rich-nya juga berbentuk seperti huruf V yang tersusun dari empat motif CXXCXGXG secara berulang, tetapi DnaJ G. kaustophilus hanya memiliki 2 struktur .

Hasil-hasil di atas menunjukkan bahwa gen yang diperoleh dari isolasi dengan metode PCR menggunakan primer-primer yang dirancang berdasarkan urutan nukleotida dnaJ B. stearothermophilus diperkirakan merupakan gen pengkode DnaJ dari Bacillus sp. RP1. Hal ini diperkuat dengan hasil studi in silico terhadap produk gen tersebut, di mana motif lestari yang dimiliki oleh DnaJ, yaitu motif HPD dan QKRA pada domain-J serta motif CXXCXGXG pada domain cys-rich, dimiliki juga oleh gen hasil isolasi. Prediksi terhadap model struktur juga memperkuat dugaan bahwa produk gen yang dihasilkan adalah DnaJ, karena prediksi model struktur dua domain DnaJ Bacillus sp. RP1, yaitu domain-J dan domain cys-rich memiliki kemiripan dengan domain-J dan domain cys-rich DnaJ E. coli yang telah berhasil ditentukan.

38

Bab V KesimpulanV.1 Kesimpulan1. Amplifikasi gen pengkode DnaJ Bacillus sp. RP1 dengan metode PCR menggunakan primer yang dirancang berdasarkan urutan nukleotida dnaJ B. stearothermophilus (Q45552) menghasilkan fragmen DNA berukuran sekitar 1,1 kpb 2. Kloning dnaJ Bacillus sp. RP1 ke vektor pGEM-T telah berhasil dilakukan setelah diperoleh fragmen DNA berukuran sekitar 4,1 kpb 3. Analisis urutan nukleotida pengkode DnaJ Bacillus sp. RP1 sebanyak 1053 pb menunjukkan tingkat kesamaan 97% dengan chaperone putative G. kaustophilus (BA000043.1) serta 86% dengan operon DnaK B. stearothermophilus (X90709.1) 4. DnaJ Bacillus sp. RP1 memiliki motif lestari HPD dan QKRA pada domain-J, serta motif CXXCXGXG pada domain cys-rich 5. Prediksi struktur DnaJ Bacillus sp. RP1 menunjukkan kemiripan dengan struktur domain-J DnaJ E. coli sedangkan domain cys-rich menunjukkan perbedaan

V.2

Saran

Untuk mengetahui aktivitas DnaJ Bacillus sp. RP1 disarankan agar penelitian lanjutan dapat dilakukan untuk mempelajari fungsi DnaJ Bacillus sp. RP1 pada stres oksidatif serta dalam pembentukan ikatan disulfida secara in vivo.

39

DAFTAR PUSTAKA1. Altschul, S.F., Madden, T.L., Schffer, A.A, Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D.J. (1997), Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res, 25, 3389-3402. Anfinsen, C.B. (1973), Principles that govern the folding of protein chains, Science, 181, 223-230. Auger, I., Roudier, J.,(1997), A function for the QKRAA amino acid motif: mediating binding of DnaJ to DnaK, J Clin Invest, 99, 1818-1822. Banecki, B., Liberek, K., Wall, D., Wawrzynow, A., Georgopoulos, C., Bertoli, E., Tanfani, F., Zylicz, M. (1996), Structure-function analysis of the zinc finger region of the DnaJ molecular chaperone, J Biol Chem, 271, 14840-14848. Bardwell, J.C., Tilly, K., Craig, E., King, J., Zylicz, M., Georgopoulos, C. (1986), The nucleotide sequence of the Escherichia coli K12 dnaJ+ gene. A gene that encodes a heat shock protein, J Biol Chem, 261, 1782-1785. Behrens, S., Maier, R., H. de Cock, Schmid, F.X., and Gross, C.A. (2001), The SurA periplasmic PPIase lacking its parvulin domains functions in vivo and has chaperone activity. Embo J, 20, 285-290 Beissinger, M., Buchner, J. (1998), How chaperones fold protein, Biol Chem, 379, 245-259. Bukau, B., Horwich, A.L. (1998), The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines, Cell, 92, 351-366. Bulieris, P.V., Behrens, S., Holst, O., Kleinschmidt, J.H. (2003). Folding and insertion of the outer membrane protein OmpA is assisted by the chaperone Skp and by lipopolysaccharide. J Biol Chem, 278, 9092-9097 Bustard, K., Gupta, R.S. (1997), The sequences of heat shock protein 40 (DnaJ) homologs provide evidence for a close evolutionary relationship between the Deinococcus-thermus group and cyanobacteria, J Mol Evol, 45, 193-199. Combet, C., Jambon, M., Deleage, G., Geourjon, C. (2002), Bioinformatics, 18, 213-217. Crouy-Chanel, A., Kohiyama, M., Richarme, G. (1995), A novel function of Escherichia coli chaperone DnaJ, J Biol Chem, 270, 22669-22672. Dobson, C.M. (2001), The structural basis of protein folding and its links with human disease, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 356, 133-145. Dougan, D.A., Mogk, A., Bukau, B. (2002), Protein folding and degradation in bacteria: to degrade or not to degrade? That is the question, Cell Mol Life Sci, 59, 1607-1611.

2. 3. 4.

5.

6.

7. 8. 9.

10.

11. 12. 13. 14.

40

15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22.

Fink, A.L. (1999), Chaperone-mediated protein folding, Physiol Rev, 79, 425-449. Frydman, J. (2001), Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones, Annu Rev Biochem, 70, 603-647. Gething, M.J., Sambrook, J. (1992), Protein folding in the cell, Nature, 355, 33-45. Greene, M.K., Maskos, K., Landry, S.J. (1998), Role of the J-domain in the cooperation of Hsp40 with Hsp70, Proc Natl Acad Sci, 95, 6108-6113. Han, W., Christen, P. (2003), Mechanism of targeting action of DnaJ in the DnaK molecular chaperone system, 278, 19038-19047. Hartl, F.U. (1996), Molecular chaperones in cellular protein folding, Nature, 381, 571-579. Hartl, F.U., Hayer-Hartl, M. (2002), Molecular chaperones in the cytosol: from nascent protein to folded protein, Science, 295, 1852-1858. Hennessy, F. Cheetham, M.E., Dirr, H.W., Blatch, G.L. (2000), Analysis of the levels of conservation of the J domain among the various types of DnaJlike proteins, Cell Stress Chaperones, 5, 347-352. Herbort, M., Schn, U., Angermann, K., Lang, J., Schumann, W. (1996), Cloning and sequencing of the dnaK operon of Bacillus stearothermophilus, Gene, 170, 81-84. Hettema, E.H., Ruigrok, C.C.M., Koerkamp, M.G., van den Berg, M., Tabak, H.F., Distel, B., Braakman, I. (1998), The cytosolic DnaJ-like protein Djp1p is involved specifically in peroxisomal protein import, J Cell Biol, 142, 421-426. Hill, R.B., Flanagan, J.M., Prestegard, J.H. (1995), 1H and 15N magnetic resonance assignments, secondary structure, and tertiary fold of Escherichia coli DnaJ (1-78), Biochemistry, 34, 5587-5596. Jaenicke, R. (1991), Protein folding: local structures, domains, subunits, and assemblies, Biochemistry, 30, 3147-3153. Langer, T., Lu, C., Echols, H., Flanagan, J., Hayer, M.K., Hartl, F.U. (1992), Successive action of DnaK, DnaJ, and GroEL along the pathway of chaperone-mediated protein folding, Nature, 356, 683-689. Laufen, T., Mayer, M.P., Beisel, C., Klostermeier, D., Mogk, A., Reinstein, J., Bukau, B. (1999), Mechanism of regulation of hsp70 chaperones by DnaJ cochaperones, Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 5452-5457. Linke, K., Wolfram, T., Bussemer, J., Jakob, U. (2003), The roles of the two zinc binding sites in DnaJ, J Biol Chem, 278, 44457-44463. Martinez-Yamout, M., Legge, G.B., Zhang, O., Wright, P.E., Dyson, H.J. (2000), Solution structure of the cysteine-rich domain of the Escherichia coli chaperone protein DnaJ, J Mol Biol, 300, 805-814.

23.

24.

25.

26. 27.

28.

29. 30.

41

31.

Mayer, M.P., Schroder, H., Rudiger, S., Paal, K., Laufen, T., Bukau, B. (2000), Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70, Nat Struct Biol, 7, 586-591. McCarty, J.S., Buchberger,A., Reinstein, J., Bukau, B. (1995), The role of ATP in the functional cycle of the DnaK chaperone system, J Mol Bio, 249, 126-137. Miyamoto, A., Matsuyama, S., Tokuda, H. (2002), Dominant negative mutant of a lipoprotein-specific molecular chaperone, LolA, tightly associates with LolCDE, FEBS Lett, 528, 193-198. Motohashi, K., Taguchi, H., Ishii, N., Yoshida, M. (1996), Isolation of the stable hexameric DnaKDnaJ complex from Thermus thermophilus, J Biol Chem, 269, 27074-27079. Oguchi, K., Nimura, K., Yoshikawa, H., Takahashi, H. (1997), Sequence and analysis of dnaJ homologue gene in cyanobacterium Synechoccus sp. PCC7942, Biochem Biophys Res Commun, 236, 461-468. Ohki, M., Tamura, F., Nishimura, S., Uchida, H. (1986), Nucleoetida sequence of the Escherichia coli dnaJ gene and purification of the gene product, J Biol Chem, 261, 1778-1792. Pellechia, M., Szyperski, T., Wall, D., Georgopoulos, C., Wuthrich, K. (1996), NMR structure of the J-domain and the Gly/Phe-rich region of the Escherichia coli DnaJ chaperone, J Mol Biol, 260, 236-250. Putra, R. (1999), Isolasi dan karakterisasi bakteri termofilik sumber air panas Cimanggu dan deteksi aktivitas glukosa isomerase, skripsi, ITB. Qian, Y.Q., Patel, D., Hartl, F.U., McColl, D.J. (1996), Nuclear magnetic resonance solution structure of the human Hsp40 (HDJ-1) J-domain, J Mol Biol, 260, 224-235. Radford, S.E., Dobson, C.M. (1999), From computer simulations to human disease: emerging themes in protein folding, Cell, 97, 291-296. Rudiger, S., Schneider-Mergener, J., Bukau, B. (2001), Its substrate specifity characterizes the DnaJ co-chaperone as a scanning factor for the DnaK chaperone, EMBO J., 20, 1042-1050. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY. Shi, Y.Y., Tang, W., Hao, S.F., Wang, C.C. (2005), Contributions of cysteine residues in Zn2 to Zinc Fingers and Thiol-Disulfide Oxidoreductase Activities of Chaperone DnaJ, Biochemistry, 44, 1683-1688. Shukhla, H.D., Singh, B.R. (1999), Identification of DnaJ-like chaperone in Clostridium botulinum type A, J Protein Chem, 18, 695-702. Suh, W.C., Burkholder, W.F., Lu, C.Z., Zhao, X., Gottesman, M.E., Gross, C.A. (1995), Interaction of the Hsp70 molecular chaperone, DnaK, with its cochaperone DnaJ, Proc Natl Acad Sci, 95, 15223-15228.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

38. 39.

40. 41.

42. 43.

44. 45.

42

46.

Szabo, A., Korszun, R., Hartl, F.U., Flanagan, J. (1996), A zinc finger-like domain of the molecular chaperone DnaJ is involved in binding to denatured protein substrates, EMBO J, 15, 408-417. Szabo, A., Langer, T., Schroder, H., Flanagan, J., Bukau, B., Hartl, F.U. (1994), The ATP hydrolysis-dependent reaction cycle of the Escherichia coli Hsp70 system DnaK, DnaJ, and GrpE, Proc Natl Acad Sci USA, 91, 10345-10350. Tibbetts, R.S., Jensen, J.L., Olson, C.L., Wang, F.D., Engman, D.M. (1998), The DnaJ family of protein chaperones in Trypanosoma cruzi, Mol Biochem Parasitol, 91, 319-325. Terada, K., Kanazawa, M., Bukau, B., Mori, M. (1997), The human DnaJ homologue dj2 facilitates mitochondrial protein import and luciferase refolding, J Cell Biol, 5, 1089-1098. Wall, D., Zylicz, M., Georgopoulos, C. (1994), The NH2-terminal 108 amino acids of the Escherichia coli DnaJ protein stimulate the ATPase activity of DnaK and are sufficient for lambda replication, J Mol Biol, 269, 5446-5451. Wall, D., Zylicz, M., Georgopoulos, C. (1995), The conserved G/F motif of the DnaJ chaperone is necessary for the activation of the substrate binding properties of the DnaK chaperone, J Biol Chem, 270, 2139-2144. Yang, C., Miao, S., Zong, S., Koide, S.S., Wang, L. (2005), Identification and characterization of rDJL, a novel member of the DnaJ protein family, in rat testis, FEBS Lett, 579, 5734-5740.

47.

48.

49.

50.

51.

52.