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Parte teorica I (14-14.15):Dal DNA alla terapia genica.

Terapia genicaI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004

Ridiculous idea

Cures all known diseases

Woudn’t give it to my dog

Good treatment

E.WFW. Alton, London ESGT Meeting 99

I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004

Umori sulla terapia genica

Il DNA come l’aspirina

WhatI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004

Vantaggi teorici:

• Lunga durata

• Trattamento della causa

• Specificita’

• Assenza di effetti collaterali

WhyI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004

Why not

• Danno (inefficienza) da protocollo terapeutico

• Dato il rischio quando e’ giustificata la terapia?

• Trasduzione della linea germinale (eugenetica)


Primo step:Scegliere, manipolare il DNA da usare comemedicina

HowI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004

N

DD

Secondo Step:Portare il DNA dentro alla cellula e farlo funzionare (a lungo)

N D

ND

ND


Terzo Step:Fare in modo che il processo funzioni in tutte le cellule eper la durata di vita dell’individuo (cervello=100x10e9neuroni).


Parte pratica I (14.15-15.30):Manipolazione del DNA


Primo step:Scegliere, manipolare il DNA da usare comemedicina


N

DD

Procedura sperimentale per l’estrazione diDNA umano

1. Congelamento/scongelamento per rompere lecellule (aliquote da 4x10e6 cellule in 500ul)li

2. Centrifugata 5’ a 13000 rpm per precipitare idetriti cellulari

3. Recupero supernatante e trasferimento in unanuova eppendorf

4. Aggiunta di 50 ul di NaAcO 3M(formazione dicomplessi )


5. Vortex

6. Aggiunta di 1 ml di EtOH 100% (formazionedel precipitato di DNA)

7. Vortex

8. Centrifugata 5’ a 13000 rpm per precipitare ilpellet di DNA



9. Eliminazione del supernatante

10. Incubazione del campione 3’ a temperaturaambiente per far evaporare l’EtOH

11.Pellet in 1 ml di H2O sterile



1. Preparazione aliquote da 15 ul di DNA estrattodalle cellule

2. Aggiunta di 3ul loading buffer

3. Caricamento su gel con controlli

4. Corsa a 100 volts per 15’

Procedura sperimentale per l’analisi diDNA umano


Parte teorica II (9.15-9.45 e 11.30-

12):

Gli esperimenti di terapia genica sull’

uomo.

Terapia GenicaI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004

La terapia genica oggi

• 636 protocolli clinici

• > 3496 pazienti

• > 20 paesi

• Ampio spettro di target terapeutici (AIDS,fibrosi cistica, emofilia, diabete, cancro…)

http://www.esgt.org


Protocolli clinici approvatiI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004

Fasi dei protocolli clinici approvati


•Fase I: pochi pazienti per stabilire la safe dose•Fase II: piu’ pazienti seguiti per piu’ tempo•Fase III: grande numero di pazienti seguiti per mesi oanni•Fase IV: fase 'post-marketing'

Protocolli clinici in funzione del tempoI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004

Caratteristiche dei target terapeutici“ideali”

• Malattie mortali

• Gene noto

• Accessibilita’ del tessuto colpito

• Regolazione del gene non determinante

• Stato clinico del malato reversibile


Malattie trattate con terapia genica


Geni usati nei protocolli di terapia genicaI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004

Sistemi di trasferimento genico usati neiprotocolli clinici di terapia genica


Protocolli clinici di terapia genica in (nord!)Italia

# author illness gene system phase comments

IT 001 C. BordignonSan Raffaele Milano

ADA ADA gene/ neogene

Retrovirus in PBL exvivo

I/II open


Precautional for Immunomodulation of DonorAnti-Tumor Immunity

TK/neo gene Retrovirus in PBL I/II open


Precautional for Immunomodulation of DonorAnti-Tumor Immunity

TK/neo gene Retrovirus in PBL I/II open

IT 004 Natale CascinelliIstituto Tumori, National Cancer Inst.Milano

melanoma IL-4 Retrovirus in melanomacell line

I/II 2/11 patientsclinical effect

IT 005 Natale CascinelliIstituto Tumori, National Cancer Inst.Milano

melanoma IL-2 Retrovirus in melanomacell line

I/II open

IT 006 V. M. FazioIstituto Medicina Sperimentale CNRRoma

Lymphoma leukemia Naked vectorintramuscolar

I open

IT 007 Giorgio ParmianiIstituto Tumori, National Cancer Inst.Oncologia SperimentaleMilano

Metastatic melanoma IL-4 Retrovirus I/II 2/11 patientsclinical effect

IT 008 A. AiutiSan Raffaele Telethon Institute for GeneTherapy (HSR-TIGET)Milan

ADA ADA gene Retrovirus in stem cells I open

IT 009 M MaioCentro di Riferimento OncologicoAviano

melanoma IL-2, IL-4 I open

IT0010

F. BelliNational Cancer InstituteMilanItaly

melanoma IL-2, IL-4 I Closed (results?)


Liposomi (8.6 %)

DNA

+

+

+

+

+

+

+

+

+

DNA_

_ _

_

_

__

_ __


Trasferimento di un gene reporter nel topo conliposomi (intraven.)Andamento in funzione del tempo.

Liposomi: durataI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004

Tossicita’ dose dipendente di liposomi-DNA iniettatinella cavita’ nasale di topi di Laboratorio (sezionipolmonari 48h p.i.)

Liposomi: tossicita’I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004

Why Virus (70.6%)I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004

Virus ricombinante ex vivo: efficacia sull’uomo


Ex-vivo Retrovirus-mediated gene therapy:ADA protocolli 1990NIH, USA (Science 1995, Blaese et al)

• Sicuro

• Inefficiente

• Risultati non definitivi: trattamento parallelo conproteina


Virus ricombinante ex vivo: efficacia sull’uomo

G

Successo o catastrofe? 2 pazienti / 11, 1 protocollo / 263

1998


Virus ricombinante ex vivo: efficacia e tossicita’sull’uomo

Adverse event (1 caso/ 256 protocolli clinici)

Wilson and coworkers; Science 2000Winstar Institute U-Penn USA

• OCT deficienza, X-linked• Adenovirus E2tsE1-/OCT• Iniettato nella vena epatica 3.8x1013 particles• 4 giorni dopo l’iniezione il paziente muore• WHY?

Virus ricombinante in vivo: tossicita’ sull’uomo


Virus ricombinante in vivo: la rispostaimmunitaria

Inflammation CTL Abs

48h 7 d 21 d


Topi di Laboratorio con tumore trattati con virus(AdIL-2)

Risposta immunitaria: dal male il bene?


Virus ricombinante ex vivo su cellule staminaliI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004

Valutazione del rischio

Virus:•RC virus (problema nel paziente e nell’ambiente)•Immunogenicita’•Creazione di nuovi virus•Mutagenesi inserzionale•Danno da prodotto genico•Irreversibilita’ Non-virus:•Immungenicita’, tossicita’•Danno da prodotto genico


Come si controlla il rischio biologicoI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004

In Laboratorio• Inattivazione del virus (delezioni, targeting, controllo trascrizionale,

cell marking)• Manipolazione sotto cappe Biohazard• P2, P3• Isolatori per gli animali• Analisi dei preparati da usare per I trattamenti (presenza di

materiale batterico, presenza di RCA)

Sul paziente• Selezione del target• Isolatori per i pazienti trattati con virus• Analisi della risposta immunitaria/infiammatoria• Analisi della presenza di virus circolante• Follow up clinico su lunghi tempi

Organismi di controllo giuridico dei protocolliclinici di terapia genica

•Italia: Ministero della salute

•Europa:The European Agency for the evaluation ofMedicinal products (EMEA) http://www.emea.eu.int/sitemap.htm

•USA: FDA


Parte pratica II (9.45-11 e 12-13.15):Trasferimento genico nellacellula umana mediante virus


Secondo Step:Portare il DNA dentro alla cellula e farlo funzionare (a lungo)

N D

ND

ND


1. Visualizzazione al microscopio di cellule umane. (12

piastrine 6well con 24 pozzetti contenenti ciascuno

5x10e6 cellule HeLa). (10’)

2. Cenni sulla quantita’ di virus da usare, sul vettore e sul

transgene in uso. (5’)

3. Aspirazione del mezzo di coltura dalle cellule da trasdurre.

(15’)

4. Aggiunta alle cellule del virus ricombinante (2000 opu per

pozzetto in 500ul, tot. 2.4x10e10 opu). ( 15’)

Procedura sperimentale per latrasduzione di DNA in cellule umane


Parte pratica III (9.30-10-30 e12-13):Analisi della cellula umanageneticamente modificata


1.Trasferimento su vetrino delle cellule trasdotte

2.Visualizzazione al microscopio del transgene

(GFP) espresso dalle cellule con microscopio a

fluorescenza

Procedura sperimentale per la visualizzazionedella cellula umana geneticamente modificata



Si ringraziano

Gioia CherubiniStefania Piersanti

Per il prezioso contributo alla parte sperimentale diquesta sezione del corso Open Lab

Terapia genica

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