Tentir Praktikum Mikrobiologi

Diagnostic mikrobiologi

1. Tujuan: Untuk memberi informasi yang akurat mengenai ada atau

tidaknya mikroorganisme, atau karakteristik biomarker dari

mikroorganisme pada spesimen yang berkaitan dengan proses

penyakit pasien.

2. Persyaratan penting:

Pengambilan, transport, dan pemrosesan yang tepat terhadap

specimen klinis

Kerja sama antar anggota tim medis:

Pelaksana klinis

Perawat

Pelaksana Laboratorium

Komunikasi dan edukasi yang terus berlangsung antara semua

anggota tim

3. Jenis:

Uji kultur bakteri dan jamur

Uji kultur virus

Uji serologi mikroorganisme

Diagnostik molekuler (kualitatif dan kuantitatif)

Genotyping (karakterisasi dari gen penting tertentu

mikroorganisme)

Kultur Darah untuk Bakteri dan Jamur

1. Faktor yang nentukan keberhasilan penemuan Mikrob di darah:

Tipe bacteremia yang tepat

Metode pengumpulan spesimen

Volume darah

Jumlah spesimen

Waktu kultur darah

Interpretasi hasil

2. Teknik ambil spesimen

Lakukan pengambilan spesimen sebelum pemakaian

antibiotik jika memungkinkan secara klinis

Botol kultur darah dan semua tabung diberi label:

i. Identitas pasien

ii. RS dan dokter

iii. Tipe spesimen

iv. Waktu pengambilan, dll

Specimen yang telah diambil terlalu lama untuk diperiksa

harus ditolak (tidak boleh diperiksa)

Pilih daerah pungsi vena. Hindari daerah sekitar vena

femoral

3. Volume darah:

Dewasa: <30 CFU/ml, semakin banyak darah semakin besar

kesempatan isolasi organisme

Anak2 < 5 CFU/ml, bayi: > 1000 CFU/ml

4. Penanganan kultur darah yang positif

Indikasi Pertumbuhan (makros)

i. Hemolisis pd SDM, gelembung udara, kekeruhan,

agregasi kecil dari pertumbuhan bakteri atau jamur

pada agar, pada permukaan, atau sepanjang dinding

botol.

Pewarnaan gram

Subkultur

5. Pewarnaan gram: pelaporan

Adanya sel host dan debris

Reaksi gram, morfologi, dan penyusunan sel bakteri yang

ditemukan. Melaporkan tidak ditemukannya bakteri dan sel

host sama pentingnya.

Boleh juga ditambahkan, jumlah relative dari sel bakteri

(jarang, sedikit, sedang, banyak) dapat diberikan

6. Subkultur

5% agar darah domba

Agar McConkey/Endo

Agar coklat

Agar darah anaerobic bersuplemen

7. Identifikasi pertumbuhan mikroorganisme dalam kultur

Identifikasi tahap awal

i. Reaksi gram dan morfologi sel

ii. Kondisi dan syarat tumbuh

Identifikasi lanjutan

i. Kemampuan produksi enzim yg bisa diditeksi oleh

tes sederhana

ii. Kemampuan metabolisme gula secara oksidatif atau

fermentatif

iii. Kemampuan menggunakan substrat untuk tumbuh

iv. Beberapa spesies diidentifikasi pada antigen dasar

milik mereka oleh reaksi suspensi sel dengan

antisera spesifik

8. Jamur

Diidentifikasi dari karakteristik koloni dan morfologi sel

Tes biokimia (asimilasi substrat)

Pertumbuhan lebih lambat dari bakteri & butuh wktu 2

minggu untuk identifikasi

Uji Sensitifitas Antibiotik

1. Metode langsung untuk menilai aktifitas satu atau lebih agen

antimicrobial melawan isolat bakteri

2. Metode yang secara langsung mendeteksi adanya mekanisme

resistensi spesifik pada isolat bakteri

3. Metode khusus yang digunakan untuk mengukur interaksi

kompleks antimikroba-mikroorganisme

4. Uji difusi cakram (diameter zona hambat)

• CLSI 2011

• Agar Mueller-Hinton (ø 100mm)

• Standar kekeruhan bakteri ~ 0,5 MacFarland

• Ukur diameter zona hambat → WHONET software → hasil

uji kepekaan S, I, R

5. Uji Dilusi (KHM dan KBM, melihat kekeruhan tabung):

• Uji konsentrasi penghambat minimum (MIC= minimum

inhibitory concentration)

• E-test (KHM)

Zona putih (Sensitif) tidak ada zona putih (resisten)

Apabila agak berkabut, maka bakteri dapat tumbuh pada konsentrasi

antibotik tersebut.

Ada juga yang namanya E-Test

Uji Kultur untuk Virus

1. Kultur virus di lab

a. 3 tipe media yang telah dikembangkan:

i. Media yang terdiri dari seluruh organisme (bakteri,

tumbuhan, atau hewan)

ii. Telur berembrio (dibuahi)

no zone around disc =resistant

clear zonearound disc =

sensitive

bacterium

MIC=2mg/L

2mg/L

1mg/L

0.5mg/L

0.25mg/L

4mg/L

8mg/L

amount ofantibiotic

cloudiness meansbacteria can grow atthat concentration of

antibiotic

iii. Kultur sel

b. Kultur virus di bakteri

i. Beberapa bakteri mudah tumbuh dan dipelihara in

vitro

ii. Phages dapat tumbuh pada bakteri yang dipelihara

di kultur cairan atau pada plate agar.

iii. Metode:

1. Bakteri dan phages dicampurkan dengan agar

nutrient cair (hangat) dan dituangkan selapis

tipis pada permukaan plate agar

2. Selama inkubasi: bakteri yang terinfeksi akan

lisis dan melepaskan phages baru yang

menginfeksi bakteri sekitarnya, sementara

bakteri yang tidak terinfeksi tumbuh secara

normal

3. Setelah inkubasi: lahan bakteri terinterupsi

oleh zona bening yang disebut plak.

Uji Plaque

iv. Kultur virus di tumbuhan dan hewan

1. Virus bisa hidup di tumbuhan dan hewan lab

2. Tumbh: tembakau (Tobacco mozaic virus)

3. Hewan: tikus, mencit, babi guinea(hahaha)

hewan coba maksudnya, kelinci, babi,

primata

v. Kultur virus pada telur berembrio

Telur ayam:

1. Media kultur yang berguna (tidak mahal,

bebas kontaminasi mikroba, terdapat kuning

telur yang bernutrisi

2. Virus diinjeksikan kedalam telur berembrio

pada area yang paling baik untuk

pertumbuhan dan replikasi virus

vi. Kultur virus pada kultur sel (jaringan)

1. Kultur sel: sel diisolasi dari organisme dan

tumbuh pada permukaan medium atau agar (in

vitro)

a. Kultur sel diploid

Dibuat dri embrio hewan, tumbuhan atau manusia

yang telah diisolasi dikembangkan pada kondisi

tumbuh yang tepat.

b. Kultur sel kontinyu

Dikembangkan dari sel tumor, yang telah lama.

Sel HeLa: dari seorang wanita (Henrietta Lacks yg

meninggal karna Ca Servix 1951).

UJI SEROLOGI UNTUK MIKROORGANISME

Alasan Uji Serologis

• Beberapa organisme tidak dapat ditumbuhkan pada media buatan

• Isolasi organisme obligat intraselular memerlukan inokulasi binatang

atau sel kultur

• Deteksi toksin

• Organisme yang ditumbuhkan: labil dalam transpor, masa inkubasi

lama, sangat sulit sehingga tidak reliabel untuk diisolasi

Metode Uji Serologi

• Uji aglutinasi

• Uji presipitasi

• Uji fiksasi komplemen

• Uji netralisasi

• Teknik reagen-dilabeli dengan bantuan mikroskop

• Uji immunoassay dengan reagen dilabeli (RIA, EIA, FIA)

Deteksi antigen

• Antigen diidentifikasi dari spesimen yang diambil dari pasien terinfeksi

• Bisa digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme setelah

diperoleh dari kultur

• Beberapa komponen unik secara kimiawi <- menentukan metode

• Antigen dapat menempel pada antibodi <- membentuk produk stabil

Deteksi antibodi

• IgM

– Pada awal infeksi (7-10 hari)

– Infeksi aktif/akut

• IgG

– Pernah terinfeksi atau imunisasi

– Serodiagnosis memerlukan serum akut dan konvalesens

– Infeksi kronik

Hasil Positif Palsu

• Sebenarnya tidak terinfeksi, tapi hasil positif

• Antibodi untuk antigen lain yang mirip

• Reaktivasi laten karena infeksi oleh organisme lain

• Menerima imunoglobulin intravena

Hasil Negatif Palsu

• Terinfeksi, tapi hasil negatif

• Sistem imun tidak baik (kongenital atau imunodefisiensi didapat,

pengobatan imunosupresif)

• Bayi yang sistem imunnya belum matur

• Titer antibodi belum naik setelah beberapa bulan infeksi (contoh

legionaire)

Prinsip Hemaglutinasi

1. Reaksi antibodi dengan antigen di permukaan sel darah merah (ex:

pemeriksaan golongan darah)

2. Hemaglutinasi oleh virus atau riketsia

3. Sel darah merah sebagai pembawa antigen

Aglutinasi dengan sel darah merah

Dasar hemaglutinasi bermacam-macam:

a. reaksi antibodi dengan antigen pada permukaan

sel darah merah: Penentuan golongan darah

b. hemaglutinasi oleh virus atau riketsia:

• pada permukaan sel darah merah terdapat reseptor spesifik

terhadap virus atau riketsia

• antibodi spesifik terhadap bagian virus yang berinteraksi

dengan reseptor pada sel darah merah dapat menghambat

hemaglutinas (hambatan hemaglutinasi: haemagglutinatio

inhibition/HI)

• Sel darah merah berfungsi sebagai pembawa antigen (passive

haemagglutination) :

• sel-sel darah merah yang telah dilapisi oleh antigen tertentu

dapat digunakan untuk mengetahui adanya antibodi terhadap

antigen tersebut di dalam serum penderita

Interpretasi

REAKSI FIKSASI KOMPLEMEN

• Komplemen dapat melekat pada kompleks antigen-antibodi

• Pada antigen yang tidak berupa sel, pengikatan komplemen tidak dapat

terlihat

• Pembuktian pengikatan komplemen:

diperlukan indikator berupa campuran:

suspensi sel darah merah kambing

larutan antibodi terhadap sel darah merah kambing

• Tahap 1 (Fiksasi komplemen)

– Antigen + antibodi + komplemen (Komplemen terikat)

• Tahap 2 (indikator)

– +SDM+Anti SDM -> komplemen tidak melisiskan SDM

Reaksi fiksasi komplemen

• Reaksi Positif: SDM tidak lisis

• Reaksi Negatif: SDM lisis

• Contoh:

– Wasserman -> sifilis

– Autoantibodi terhadap antigen sel tubuh

– Deteksi antibodi dengue

• Kenaikan 4 kali atau lebih dari fase akut ke fase konvalesens -> positif

• Kontrol eritrosit -> memastikan tidak autolisis

• Kontrol lisis -> memastikan fungsi antibodi dan komplemen

• Kontrol -> membantu kesulitan penilaian hasil uji, terutama bila semua

lisis atau semua tidak lisis

ELISA

• Deteksi Antibodi

– IgG

Positif: peningkatan titer 4x atau lebih

– IgM

Positif: Interpretasi sama dengan IgM blot

• Deteksi Antigen

Positif: nilai di atas nilai ambang (cut off)

Intepretasi Pemeriksaan :

Pada kasus ini terdapat dua jenis ELISA, yaitu indirect dan Sandwich. Kalau

pada indirect antigennya yang terselubung, apabila sandwich antibodi

monoklonalnya yang terselubung. (maksudnya terselubung disini

maksudnya terselimuti gitu ._.)

TES WIDAL

Prinsip kemampuan antibodi pada serum pasien untuk mengaglutinasi

antigen bakteri berwarna

Produk Antigen yang tersedia :

• Antigen Salmonella O (Somatik), Group A, B, C, D

• Antigen Salmonella H (Flagellar), Group A, B, C, D

• Reagen yang digunakan pada uji lab iniadalah 0,1% sodium azide

sebagai pengawet yang mana bersifat toksik jika tertelan dan

antigen diawetkan dengan menggunakan 0,5% Formalin.

• Tes Widal pemeriksaan serologi demam typhoid

• Titer O = 1/160 memerlukan dua kali pengambilan spesimen,

yaitu pada masa akut dan masa convalesencence dengan interval

waktu 10-14 hari. Diagnosis kenaikan titer >= 4 kali liter masa

akut.

• Dalam pelaksanaannya di lapangan, ternyata praktis pengambilan

spesimen untuk pemeriksaan tes Widal hanya menggunakan

spesimen tunggal. Kenaikan titer aglutinin yang tinggi pada

spesimen tunggal tidak dapat membedakan apakah infeksi

tersebut merupakan infeksi baru atau lama.

• Biasanya, antibodi O terlihat pada hari ke 6-8 dan antibodi H

terlihat pada hari ke 10-12 setelah munculnya gejala penyakit

demam typhoid.

DENGUE BLOT DENGAN DETEKSI IgG atau IgM

• Deteksi presumtif kualitatif IgM dan IgG terhadap virus dengue

dalam serum manusia, plasma dan darah utuh dapat digunakan

untuk diferensiasi presumptif antara infeksi primer dan sekunder.

• Jika positif harus dikonfirmasi lagi karena tes ini sifatnya

presumtif.

• Spesimen : serum dipisahkan secepatnya dan dimasukkan ke

refrigerator pada suhu 2-8oC atau disimpan beku pada suhu -20oC

atau lebih dingin lagi jika tesnya tidak dilaksanakan dalam jangka

waktu 2 hari.

Interpretasi

• Infeksi primer :Antibodi IgM dapat dideteksi dari pasien dengue pada

3-5 hari setelah onset demam terjadi. Infeksi biasanya terjadi secara

persisten selama 30-90 hari.

• Infeksi sekunder : Ditandai oleh tinggina IgG yang biasanya dibarengi

oleh peningkatan IgM.

• Sensitivitas dari uji ini adalah sbb:

• Dengue primer: IgM positive dan IgG negative

• Infeksi sekunder: IgG Positif dengan atau tanpa hasil IgM positif

• Dapat terjadi reaktivitas yang berlainan apabila terdapat flavivirus.

PEMERIKSAAN MOLEKULAR

• Hibridisasi probe asam nukleat bertanda dengan sekuens spesifik asam

nukleat dan sebuah spesimen uji yang kemudian dideteksi pasangan

hibridnya.

• Probe (pelacak) asam nukleat biasanya dilabeli dengan enzim, substrat

antigen, molekul chemiluminescent, atau radioisotop untuk

memfasilitasi deteksi produk hibridasi.

PCR

Amplifikasi sebuah bagian khusus DNA yang mengandung informasi

berguna untuk diagnosis.

Campuran Reaksi PCR :

- Target DNA untuk diamplifikasi

- Master mix (primer DNA oligonucleotida, 4 nucleotide

triphosphate, DNA polimerase termostabil, MgCl2, buffer)

3 Fase denaturation, primer annealing, primer extension

1. Template DNA sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA

baru yang sama DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen

DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung

fragmen DNA target yang dituju.

2. Primer sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan

diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada

ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA.

3. dNTPs (deoxynucleotide triphosphates) campuran dATP

(deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP

(deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat) building

block DNA menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer

membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA

template.

4. Buffer PCR dan MgCl2

Buffer untuk menjamin pH medium

MgCl2 sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi

aktivitas DNA polimerase meningkatkan interaksi primer

dengan templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP

(senyawa antara)

5. Enzim polimerase DNA ebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi

DNA

RT-PCR untuk Diagnosis Infeksi Virus Dengue

Primer Sekuens Nukleotida Posisi

Genom

Ukuran

Produk

(bp)

D1 5’-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3’ 134-161 511

D2 5’-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3’ 616-644 511

TS1 5’-CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3’ 568-586 482

TS2 5’-CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3’ 232-252 119

TS3 5’-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3’ 400-421 290

TS4 5’-CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA-3’ 506-527 392

Secara umum, RT-PCR meliputi tiga tahap tahap reverse transcription,

tahap denaturasi dsDNA pada suhu 95°C, dan tahap sintesis DNA dari

primer yang dilakukan menggunakan enzim Taq DNA polymerase yang

thermostable dan keberadaan dNTP.

Tahap reverse transcription (RT) RNA ditranskrip menjadi cDNA

menggunakan enzim reverse transcriptase dan primer enzim DNA

polymerase yang digunakan untuk menghasilkan amplicon hanya dapat

bekerja pada template yang berupa DNA.

Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

untuk Diagnosis Infeksi Virus Dengue

VIRAL LOAD

VIRAL LOAD kemampuan mengukur jumlah partikel virus kinetika

replikasi virus dalam penderita dapat diikuti

PENANGANAN INFEKSI HIV

Penurunan Viral Load HIV memeriksa jumlah RNA virus dalam 1 mililiter

plasma (Deteksi RNA virus kuantitatif)

Peningkatan jumlah sel T CD4+

Tujuan dilakukan pada infeksi HIV

1. Menetapkan diagnosis

2. Memutuskan dimulai atau dihentikannya terapi

3. Mengganti komposisi obat-obat antiretrovirus

Penanganan penyakit

Prognosis

Strategi pengobatan