tema 7. dna y la replicacion
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7/26/2019 Tema 7. DNA y la replicacion
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Tema 7. El DNA y la replicacin
La transmisin de la informacin gentica
NucletidosEstructuras primaria, secundaria y terciaria del DNA
Desnaturalizacin e hibridacin
Superenrollamientos
Helicasas y topoisomerasas
Empaquetamiento y organizacin del DNA
Nucleosomas e histonas
Caractersticas de la replicacin del DNA
El replicn
Iniciacin de la replicacin
DNA polimerasas
Los replisomas de procariotas y eucariotas
Terminacin
Telmeros y telomerasa
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Replicacin y expresin gnica en organismos procariotas y eucariotas
Nucleolo
Ribosomas del
r. e. rugoso
Citoplasma
Membrana plasmtica
NcleoLa traduccin ocurre en el
citoplasma, en ribosomas
asociados o no al retculo
endoplsmico rugoso
La replicacin y
la transcripcin
transcurren en el
ncleo
Eucariotas
!"#$%&&'()
+,-.'&'()
!"#)/&"'-&'()
En Procariotas, al no haber un ncleo diferenciado, la replicacin, transcripcin
y traduccin tienen lugar en el mismo y nico compartimento intracelular. Las dos
ltimas suelen transcurrir simultneamente.
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Los cidos nucleicos son cadenas de nucletidos o polinucletidos:
ADN DNA : Acido desoxirribonucleico (polmero de desoxirribonucletidos)ARN RNA : Acido ribonucleico (polmero de ribonucletidos)
El DNAcontiene la informacin transmisible en cdigo de 4 letras (4 bases),pero no es el molde para la sntesis de protenas.
El RNA mensajero o mRNA contiene el mensaje codificado para la sntesis de
protenas: tripletes de 4 posibles bases para codificar 20 letras o aminocidos.
!"#$%&&'()
+,-.'&'()
!"#)/&"'-&'()
El material gentico: los cidos nucleicos
U
U
U
U
U
U
Hebra
codificante
Hebra
molde
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Estructura y nomenclatura de nuclesidos y nucletidos
Adems de formar parte de los cidos nucleicos, los nucletidos pueden ser
transportadores de energa qumica (ATP, GTP), sealizadores intracelulares(AMPc, GMPc), o componentes de coenzimas (NAD+, CoA, FAD, etc).
bsica
neutrocido
(DNA)
(RNA)
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Niveles estructurales de los cidos nucleicos
Estructura primaria: polmero lineal formado por la unin de numerosos
nucletidos mediante enlaces fosfodister
DNA de cadena sencilla (ssDNA) y RNA
Estructura secundaria: disposicin espacial relativa de los nucletidos
que se encuentran prximos en la secuencia
DNA Doble cadena polinucleotdica (dsDNA)
RNA Zonas de apareamiento parcial y zonas sin aparear, conprotuberancias, bucles y horquillas en determinadas regiones
Estructura terciaria: todas aquellas de orden superior a los niveles
primario y secundario
DNA Estructuras resultantes del superenrollamiento, de la asociacin
con protenas en la cromatina y los cromosomas, y de secuenciasespeciales (DNA H trplex, DNA G tetraplex, Holliday junctions)
RNA Plegamiento tridimensional definido (tRNAs y otras estructuras)
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Estructura primaria del DNA : cadena polinucleotdica
Extremo
5
Extremo
3
CGT GA
A
T
G
C
Desoxirribonuclesidos 5 monofosfatode
las 4 bases nitrogenadas A, T, G, C.
Tiene extremos distintos: 5-fosfato y 3-OH.
Tiene sentido, direccionalidad o polaridad,por los enlaces fosfodister 3-5.
Cada cadena de DNA tiene individualidad,
dada por su secuenciade nucletidos.
La secuencia siempre es 5 3:
5-ATGCG-3
ATGCG
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Estructura secundaria del DNA: hebras o cadenas antiparalelas
y complementarias unidas por puentes de H
Complementariedadentre bases:
siempre A-T (2 p. de H) y G-C (3p. de H)
A = T A / T = T / A = 1
G = C G / C = C / G = 1
Reglas de
Chargaff:
A + G= T + C= 50 % A + G / T + C = 1
pur = pir = 50% pur / pir = 1
3
35
5Disposicinautorreplicativa:
Cadenas antiparalelas:
ambas son 5-3 ensentidos opuestos
Hay igual distancia en los pares A-T y G-C entre los C1
de los enlaces glicosdicos (1,08 nm). As, el dsDNA tiene
el mismo grosor a lo largo de toda su estructura (2,4 nm)
Lado del surco mayor
Lado del surco menor
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surco
mayor
surcomenor
Tipos de dobles hlices de DNA: A, B, Z
Z: pur-pir, in vitro
DNA-A DNA-B DNA-ZDimetro de la hlice 2,55 nm 2,37 nm 1,84 nm
pb por giro de hlice 11 10,4 12
Rotacin por pb 33,6 34,6 -30
Rotacin de la hlice dextrgira dextrgira levgira
A: dsRNA, RNA/DNA B: dsDNA in vivo
La estructura ms
normal in vivo, y ladescrita por Watson y
Crick, es la forma B
Los esqueletos de DNA
y RNA son flexibles y, enbase a sus ngulos de
giro, puede adoptar
distintas conformaciones
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El apareamiento entre las baseses esencial para las
funciones de los cidos nucleicos: permite la separacinde las dobles hlices (desnaturalizacin o fusin) y su
asociacin (renaturalizacin e hibridacin)
Mantenimiento de la estructura secundaria del DNA
Estabilidad de la doble hlice- Puentes de H entre las bases complementarias apareadas
- Interacciones hidrofbicas entre las caras de las bases
- Fuerzas de van der Waals entre las bases apiladas, que
aumentan con la longitud del DNA
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Solvatacin de los fosfatos, que disminuye su repulsin
electrosttica
- Interacciones electrostticas con Mg2+, histonas y otrasprotenas de carcter bsico, que interaccionan con las
cargas negativas de los grupos fosfato y reducen la repulsin
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Desnaturalizacin o fusin (melting) del DNA
Por cada 1% de aumento en G-C, la Tmaumenta ~ 0,4C
Al aumentar la fuerza inicasube la Tm, porque se favorecen
los apareamientos parciales
!"#$%
""#$%
Clculo de los valores de Tmde un
DNA a partir de su secuencia
Tm= 2 (A+T) + 4 (G+C)
Tm= 70 + 41 (G+C) / n - 675 / n
El DNA se puede desnaturalizar por calor, poragentes qumicos o por enzimas (helicasas).
El proceso opuesto es la renaturalizacin.
Al producirse un desapilamiento de las bases,
hay un aumento en la A260: efecto hipercrmico alpasar de dsDNA a ssDNA (o efecto hipocrmicodesde ssDNA a dsDNA).
Tm: temperatura para llegar al 50% de hipercromicidad
parcial
total
parcial
50% dsDNA y
50% ssDNA
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Hibridacin de cidos nucleicos
La hibridacin es la asociacin entre cidos nucleicos de cadena sencilla
de distinto origen (es decir, no la reasociacin de un dsDNA), con secuencias
parcial o totalmente complementarias: se pueden formar dobles hlicesimperfectas sin complementariedad total
Adems de ser clave en algunos aspectos de la funcionalidad celular de
los cidos nucleicos (p.e. interferencia de RNA), la hibridacin es la base de
mltiples tcnicas de Biologa Molecular (PCR, Northern, Southern, FISH).
En ellas se usan fragmentos de DNA o RNA que se unen a sus secuencias
complementarias y sirven para iniciar la sntesis de DNA (cebadores) o paraidentificar esas secuencias (sondas, con marcaje).
Identificacin o marcado de
cidos nucleicos mediante
una sonda de hibridacin
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Pueden ser desoxirribonucleasas (DNasas) o ribonucleasas (RNasas), y
endonucleasas o exonucleasas.
Las endonucleasascortan en el medio de la cadena polinucleotdica. Algunas
cortan de forma inespecfica, mientras que las llamadas endonucleasas derestriccin o enzimas de restriccin reconocen secuencias especficas de
dsDNA y cortan en ambas cadenas.
Las exonucleasashidrolizan enlaces comenzando por un extremo (3 5) dela cadena polinucleotdica, provocando la escisin de nucletidos de uno en uno
desde ese extremo.
Hidrlisis enzimtica de cidos nucleicos: las nucleasas
Las nucleasas son enzimas capaces de hidrolizar
enlaces fosfodister entre nucletidos de los cidosnucleicos.
El corte puede ser a uno u otro lado del grupo fosfato.
Endonucleasa de restriccin (DNA)
Endonucleasa inespecfica (RNA o DNA)
Exonucleasa (RNA o DNA)
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Estructuras plegadas de ssDNA y RNA
Tanto en ssDNA como en RNA, se forman zonas dedoble hlice local entre regiones con secuencias
palindrmicas o con complementariedad parcial,
que resultan interrumpidas por protuberancias, buclesy horquillas en las zonas sin complementariedad.
Estas estructuras forman giros y dobleces en la doblehlice, que a su vez generan estructuras
tridimensionalesms o menos flexibles y definidas,cuyo ejemplo ms conocido son los tRNAs.
Cuando hay varios apareamientos y estructurasposibles, la ms probable es la que tenga una G deformacin ms negativa, es decir, la que ms
interacciones dbiles desarrolle.
Horquilla
Secuenciaspalindrmicas
o repeticiones inversas
ssDNA o RNA
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Hlice
Superhlice
Estructura terciaria del DNA. Superhlices
La estructura del dsDNA ms estable(con la mayor !G deformacin) es la que desarrolla elmximo apareamiento
entre bases, que precisa del nmero adecuado de pares de
bases por vuelta (10,4 para el DNA B), segn el ngulo degiro y la rotacin entre nucletidos.
En estructuras de DNA cerradaso inmovilizadas, la doblehlice no puede rotar libremente sobre su eje, y se suelen
generar defectos o excesos de vueltas en ellas. Ello alterael nmero de pares de bases por vuelta y no permite al DNA
adquirir la estructura ms estable.
Para compensar los defectos o excesos de vueltas, elDNA desarrolla vueltas en el mismo sentido o el opuesto
generando vueltas de superhlice, lo que le permite ajustarel nmero de pares de bases por vuelta y mantener el
mximo apareamiento.
Esta propiedad es de
carcter topolgico, ytiene lugar sin ruptura deenlaces covalentes.
Cuando se rompe unacadena, las superhlicesse deshacen.
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Superhlice negativa:giro en el mismo sentido al de la hlice B (dextrgiro).
Producida por una falta de enrollamientode la doble hlice, para generarnuevas vueltas.
Superhlice positiva:giro en sentido opuesto al de la hlice B (levgiro).Producida por un exceso de enrollamientode la doble hlice, para compensar
las vueltas de ms.
En las clulas, el DNA suele estar superenrollado negativamenteporque esms conveniente y favorable energticamente: permite generar zonas de
apertura local de la doble hlice.
Sin embargo, en zonas concretas puede estar superenrollado positivamente.
Superhlice
negativa
Superhlice
positivaDNA relajado
Estructura terciaria. Superhlices
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Estructura terciaria del DNA. Topoismeros
Al ir aumentando el superenrollamiento,
el DNA presenta:
- Mayor grado de compactacin:necesario para el empaquetamiento enlas clulas y ncleos
- Menor superficie y mayor densidad
- Mayor velocidad de sedimentacin
-
Mayor velocidad de migracin en uncampo elctrico. As, los topoismerosse pueden separar electroforticamente.
Topoismeros: ismeros topolgicos de la misma molcula de DNA, que se
diferencian entre s por el grado de superenrollamiento.
Se pueden interconvertir entre s gracias a la accin de las topoisomerasas,que son enzimas capaces de aadir o eliminar superenrollamientos.
nodo (+)
ctodo (-)DNA ms relajado
DNA ms superenrollado
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Importancia de las helicasas y topoisomerasas
helicasas
topoisomerasas
Para la copia, expresin y funcionalidad del DNA es necesario abrir la doble
hlice, lo que hacen las enzimas helicasas.
Al desenrollarla se introduce un exceso de vueltasde hlice en la zona
adyacente, que no puede rotar libremente, por lo que se crean superhlicespositivasen esas zonas.
Estas tienen que ser eliminadas por las topoisomerasas,para que la tensin
no sea excesiva y el DNA se pueda seguir abriendo.
Las topoisomerasas tambin pueden introducir nuevos superenrollamientos
para compactarel DNA.
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Helicasas
Helicasas replicativas:
DnaBen E. coli
Mcm2-7en eucariotas
Son enzimas que catalizan la rotura de los puentes de hidrgeno de la
doble hlice del DNA con gasto de ATP, produciendo una desnaturalizacinnatural, local y procesiva, y generando DNA de cadena sencilla.
Otras trabajan con hbridos DNA-RNA o con RNA de doble cadena.Requieren ATP para su unin al DNA y lo hidrolizan durante su accin.
Son hexamricas y circulares, lo que les da alta procesividad: se cierran
sobre una hebra, se deslizan y deshacen el dsDNA.
Algunas van en sentido 5!3 y otras en 3!5.
Funcionan en replicacin, transcripcin y reparacin del DNA, y en generalen todas las funciones del DNA y el RNA.
En los procesos de replicacin estn fsicamente asociadas a las primasas.
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En su actividad interconvierten topoismeros para solventar problemas topolgicos.
As, desenrollan, desanudan o desencadenan DNA eliminandosuperenrollamientos,pero tambin pueden compactar el DNA aadiendovueltas de superhlice.
Para su accin tienen actividades enzimticas nucleasay trans-esterificadora,que realizan acciones de corte y reempalme en una o las dos hebras del DNA.
Pueden relajar superhlices (-) y (+) e introducir superhlices (-) y (+): cada tipo de
topoisomerasa hace una o ms de esas opciones.
Las Topo I cortan el DNA en una
de las cadenas, relajando el DNA alquitar una vuelta de superhlice.
Las Topo II gastan ATP para cortar
el DNA en las dos cadenas,aadiendo o quitando dos vueltas desuperhlice o separando molculas
de DNA entrelazadas.
Cada una tiene sustratos y
acciones caractersticas en lareplicacin, transcripcin, reparacin,organizacin de la cromatina, mitosis
o recombinacin.
Topoisomerasas
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Dentro de la clula, el DNA est condensado y empaquetado con protenas,
formando un nucleoideen Procariotas y cromatinaen Eucariotas.
La condensacin y empaquetamientodel DNA sirve para:
Compactarlo, para que quepa en la clula.
Protegerlode lesiones, sobre todo en mitosis.
Transmitireficazmente el DNA a las clulas hijas.
Organizarla molcula de DNA para facilitar los procesos en los que interviene.
La condensacin se realiza gracias a la asociacin con protenas especficas, quelo pliegan,enrollan y forman bucles, dando niveles de organizacin superioresyevitando que el DNA se convierta en un ovillo enmaraado inaccesible.
Empaquetamiento del DNA con protenas
En Procariotas, el nico
cromosoma o nucleoide,casi siempre circular, est
empaquetado y organizadogracias a las nucleoid
associated proteinso NAPs.
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Empaquetamiento del DNA en eucariotas: cromatina
Cromatina: ~ 1 DNA / 1 histonas / 1 protenas no histonas
Cromatina interfsica- el DNA est menos empaquetado o condensado
- resulta accesible para las protenas
Eucromatina: poco condensada, replicacin temprana
Heterocromatina: muy condensada, replicacin tarda
- h. constitutiva: centrmeros, telmeros y otras regiones
- h. facultativa: caracterstica de cada tipo celular
- El estado de la cromatina est controlado por los sistemas epigenticos y
por unin de protenas, que deciden el grado de compactacin
- Para la actividad transcripcional hace falta que la cromatina est en forma
de eucromatina
Cromosomas mitticos
- DNA con mximo empaquetamiento
- formacin controlada por el ciclo celular
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DNA de doble hlice
Cromatina en cuentas de
collar formadas pornucleosomas sin H1empaquetado 6 veces
Fibra de cromatina de 30 nm
con nucleosomas y H1, en
solenoide o zig-zag
empaquetado 40 veces
Lazos de eucromatina en
interfase
empaquetado 103-104veces
Seccin condensada
de un cromosoma
Cromosoma
metafsico entero
"#$%&'(#&)
Niveles de condensacin del DNA eucaritico
solenoide zig-zag
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Nucleosoma:el elemento bsico de la cromatina
Un nucleosoma est formado por 146 pb de DNA coreque rodea al ncleo
o core histnico, de carcter proteico, al que se une mediante mltiplesinteracciones electrostticas y puentes de H.
Es una especie de cilindro plano de 11 nm de dimetro y 6 nm de altura.La relacin entre la masa del DNA y de las protenas es 1:1.
Ncleo o corehistnico: est formado por un octmero de histonas (2x)
H2A, H2B, H3 y H4. No tiene histona H1.
El DNA forma 1,65 vueltas superenrolladas negativamente, lo que
disminuye los problemas topolgicos al desenrollarlo.
Entre cada dos nucleosomas hay DNA espaciador.
DNA ncleoo core
ncleo o corehistnico
DNAespaciador
nucleosoma
DNA del
nucleosoma
DNA ncleo o core: 146 pb
DNA espaciador: 13-110 pb
DNA total: "160-260 pb
histonas
DNA
En humanos hay unos 3 x 107
nucleosomas por clula
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H2B
H2B
Tetrmero H3-H4 Octmero de histonas
Las histonas core forman sus dmeros y tetrmeros, e interaccionan con el DNA,
a travs de un dominio conservado llamadopliegue histnico
Son muy ricas en
aminocidos bsicos
Estn muy conservadas
evolutivamente entre ellas yentre distintas especies
Hay variantes histnicas
de H1, H2A y H3
Propiedades generales de las histonas
Tipo de histona Histona P mol Lys + Arg
Histonas core H2A 14000 20 %
H2B 13900 22 %H3 15400 23 %
H4 11400 24 %
Histona ligadora H1 20800 32 %
Pliegue histnico:
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La compactacin y organizacin funcional de la
cromatina est facilitada por el superenrollamientoy alta concentracin del DNA, y por la accin de
protenas arquitectnicas.La unin de la histona H1permite formar a la
cromatina una estructura ms empaquetada: de la
fibra de 10 nm a la de 30 nm.Las colas histnicas sobresalen del nucleosoma
e intervienen en la compactacin y funcionalidad dela cromatina.
Elementos que controlan el empaquetamiento de la cromatina
Las colas sufren modificaciones qumicas reversibles
(acetilacin, metilacin, fosforilacin) en residuosespecficos, que controlan el estado estructural y
funcional de la cromatinaa travs de interacciones entreellas y con otras protenas (cdigo de las histonas)
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La cromatina interfsica se une y organiza sobre un soporte
estructural formado por protenas y RNA llamado matriz nuclear
En interfase, los cromosomas
se posicionan en territorioscromosmicosespecficos
Metafase
Interfase
Protenashistnicas y
no histnicasFibra de30 nm
Nucleosoma(11 nm)
DNA (2 nm)Poro nuclear
Fibras de la matriz nuclear
Fibra decromatina
Membrana nuclear
*+%&,-
$."/#+&
0+-)1 2# 34&+
2# "&)(+5$+
2# 67 $(
8,4&+ 2#
"&)(+5$
+ 2# 67
$(
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Las SAR/MARo S/MAR
son regiones especiales
del DNA mediante lascuales la cromatina se unea las estructuras de la
matriz y del scaffold o
armazn cromosmico
Empaquetamiento cromosmico y armazn o scaffold
*+%&,- )
/.$
S/MAR
Armazn
o scaffold
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Principios de la replicacin del DNA
1.- El genoma completo se replica una sola vez en cada ciclo celular.
Si hay ms de un origen, como en eucariotas, lo hacen de forma
sincronizada, pero no necesariamente simultnea.2.- La divisin celularno tiene lugar mientras no se haya completado
la replicacin: ha de haber alternancia. Los reguladores del ciclo celular
disparan los mecanismos que inician la replicacin y la divisin celular.
3.- La replicacin es semiconservativa, requiere un cebadorparaempezar la sntesis de DNA, y sta slo procede en direccin 5!3.
Fases de la replicacin
- Iniciacin: reconocimiento del origen por el iniciador proteico y apertura
del DNA por las helicasas.
- Elongacin: sntesis del DNA por los replisomaso complejos de
replicacin en las horquillasde replicacin.- Terminacin: procesos especiales en los finales de los replicones
circulares procariotas o de los lineales eucariotas.
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La replicacin del DNA es semiconservativa
En la replicacin, cada cadena sirve de molde para la sntesis de otra
cadena complementaria, que queda apareada con ella. As, cada nueva
doble hlice tiene una cadena parental y otra de nueva sntesis, por loque la replicacin es semiconservativa.
Experimento de Meselson y Stahl (1958):
la replicacin es SEMICONSERVATIVA
5 -A-T-C-G-T-A-C- 3
3 -T-A-G-C-A-T-G- 5
5 -A-T-C-G-T-A-C- 3
3 -T-A-G-C-A-T-G- 5
5 -A-T-C-G-T-A-C- 3
3 -T-A-G-C-A-T-G- 5
Replicacin
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Hay un solo replicnen Procariotas pero muchos en Eucariotas,
para disminuir el tiempo de replicacin de los genomas grandes
Procariotas: un replicn:un solo origen de replicacin
Escherichia coli: 4,6 Mpb = 1 origen x 2 horquillas x 60 kb/min x 30 min
Eucariotas: muchos replicones: muchos orgenes coordinados
Homo sapiens: 2900 Mpb = 50.000 orgenes x 2 horquillas x 2-3 kb/min x 10 min
Un replicnes un fragmento de DNA que se replica de forma autnomaa
partir de un origende replicacin. Es decir, es una unidad de replicacin.
Contiene un inicio (origen) y a veces un final (terminador).
La replicacin es bidireccionala partir del origen
procariotas
eucariotas
horquillas dereplicacin
unidireccional
bidireccional
origen
origen
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Inicio de la replicacin en E. coli: origen oriCe iniciador DnaA
primosoma
SSB
girasa(topoisomerasa)
DnaB: helicasa
DnaC: cargador de la helicasa
DnaG:
primasa
SSB: protena de unin a ssDNAreplisoma
oriC
Para la iniciacin de cualquier evento de replicacin, es necesaria la interaccin
entre una secuencia llamada origen de replicacin o replicador (que es loprimero que se replica), y un factor proteico llamado iniciador.
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En los cromosomas de eucariotas hay muchos orgenes potenciales
sobre los que se forman complejos prerreplicativos preRC, que luego
pueden ser o no usados como orgenes de replicacin
En Eucariotas los orgenes no estn definidos
por secuencias determinadas, sino por variosposibles elementosde secuencia, estructura
y modificaciones de la cromatina, as como
por la unin de protenas a ellos
Los orgenes son activados por la unin
de determinadas protenas y finalmente
la fosforilacin de la helicasa Mcm 2-7,
que abre el DNA
No todos los posibles orgenes son activados y
usados como orgenes en cada ciclo replicativo
Los dominios replicativos tienen mltiples
orgenes, y no se replican a la vez
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Pueden usar rNTPs o dNTPs, pero usan ms los
primeros por su abundancia, por lo que loscebadores suelen ser de RNA.
Pueden comenzar la sntesis copiando cualquier
secuencia, pero tienen ciertas preferencias. P.e., laprimasa DnaG de E. colitiene preferencia por 3-
GTC.
En eucariotas la actividad Pol
-primasa produce
cebadores hbridos, con una parte inicial de RNA(8-12 nt) y otra final de DNA (10-20 nt).
Las primasasinician la sntesis de cadenas polinucleotdicas
primasacebador
de RNA
Son RNA polimerasasdependientes de DNA, y sintetizan cebadores de
5-12 nt para que sea posible la iniciacin de la replicacin del DNA molde.
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Son enzimas capaces de replicar DNA, es decir, de sintetizar una hebra deDNA copia usando como molde otra hebra de DNA.
Las que sintetizan el DNA en la replicacin se llaman REPLICASAS.
+ requerimientos
- molde:cadena complementaria
- cebador:RNA o DNA con un extremo 3-OH
- los 4 desoxirribonuclesidos 5 trifosfato:dATP, dGTP, dCTP, dTTP
- Mg2+(o Zn2+):para la catlisis
+ reaccin: (DNA)n+ dNTP!
(DNA)n+1+ PPi G0
= - 6 kJ/mol+ direccin o polaridad de sntesis 5'!3
+ tienen un solo sitio activopara los 4 posibles sustratos
+ tienen alta fidelidad y altaprocesividad
Caractersticas de las DNA polimerasas (DNA pol)
Actividades que pueden estar presentes en las DNA polimerasas
-
polimerasa 5'!
3: adicin de 1 nucletido a un extremo 3-OH libre,elegido por su apareamiento con el molde.
- exonucleasa 3'!5correctorao editora: verifica el apareamiento y corta
el ltimo nucletido si no es correcto.
- exonucleasa 5'!3: elimina DNA (o RNA) de forma procesiva desde unamella. Junto con la polimerasa hace corrimiento de mella.
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Sntesis de DNA: elongacin de una cadena de DNA
por la actividad DNA polimerasa
La energa para la reaccin
proviene del enlace fosfato del
dNTP. Tambin est favorecida
por la liberacin e hidrlisis delPPi (!G0= - 31 kJ/mol)
Sntesis de una cadena de DNA complementaria a la molde mediante la formacin deun enlace fosfoster entre una cadena creciente con un extremo 3-OH libre (cebador) y
un dNTP entrante. Las DNA pol tienen un solo centro activo, y seleccionan el nucletido
correcto slo en base a la geometra del par formado con la base del molde.
Si el apareamiento es correcto, el
grupo 3-OH hace un ataque
nuclefilo sobre el fosfato #del
dNTP entrante y se forma el enlaceCebador
Molde
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El proceso replicativo de E. colicomete un error por cada 108-1010 nt aadidos
(tasa de error 10-8-10-10). Como el genoma es de 4,6 x 106pb, ello implica 1 errorpor cada ~ 20 a 2000 replicaciones.
Esto mejora notablemente las tasas de error para las sntesis de RNA yprotenas, que son del orden de 10-4.
Es una tasa de error muy baja para deberse slo al apareamiento y geometra
de los pares de bases en el centro activo de la replicasa.
Tasas de error:
- polimerasa: 10-4
-10-5
- exonucleasas editoras: 10-2-10-3
- sistemas de reparacin posreplicativos: 10-2-10-3
Fidelidad de la replicacin
Actividad editora o correctora
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Polaridad 5!3 en la replicacin
hebra
adelantada
5!3 global
hebra
retrasada3!5 global
cebadorde RNA
Horquilla de
replicacin
origen
Direccin de movimiento
de las horquillas
hebra adelantada
fragmento de Okazaki
en crecimiento
f. de Okazaki previo
( "1000 nucletidos)
La hebra de DNA con el extremo 3
cerca de la horquilla se llama hebraadelantaday se sintetiza en direccin
5-3 de forma continua.
La hebra retrasadase sintetiza en
direccin 5-3 de forma discontinua
mediante los fragmentos de Okazaki,cada uno con su propio cebador.
Los fragmentos son luego unidospara dar un crecimiento global 3-5.
Ambas hebras se pueden sintetizar
simultneamente gracias a ladisposicin del replisoma.
El DNA slo se sintetiza
en sentido 5-3
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Thumb (pulgar)Palm (palma)Fingers (dedos)3 5 exonucleasa
Las estructuras cristalinas de numerosas DNA polimerasas
unidas a DNA han mostrado la misma disposicin general.
Dominios
Lmina "con
sitio cataltico
Primera estructura de una DNA pol
(fragmento Klenow deE.colipol I, 1985)
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Mecanismo de adicin de un nucletido al cebador
hebra
molde
hebra
cebadora
- entrada del dNTP
- apareamiento con el molde
-
cierre de los dedos
- formacin del enlace fosfodister
- reapertura de los dedos con
desplazamiento de un par de bases
del cebador-molde
Cada uno de estos pasos est muy estimuladopor el apareamiento correcto entre la base deldNTP entrante y la correspondiente en el molde
La actividad exonucleasa 3-5
correctora se activa cuando seincorpora un nucletido mal
apareado y se altera la geometrade las interacciones
El proceso de correccin se
realiza sin liberar el DNA
-
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DNA polimerasas de E. coli.
La DNA pol IIIes la REPLICASA
La DNA pol Isustituye los cebadores de RNA de los fr. de Okazaki por DNA
La DNA pol II, IV y Vestn implicadas en distintos procesos de reparacin del DNA
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$
Holoenzima DNA polimerasa III (DNA pol III*)
Complejo de carga &de la
abrazadera o pinza ', que
carga sta en la hebra
retrasada en cada
fragmento de Okazaki.
- es la replicasa: sintetiza a la vez las dos hebras
- tiene alta procesividad: hasta #500.000 nt
- potencia cataltica: 250-1000 nt/seg
-
tiene alta fidelidad
- hay unas 10-20 por clula de E. coli
- tiene 791,5 kDa, con 10 s.u. distintas
- es un dmero asimtrico (#!"#2)2$%2&&''$
Polimerasa ncleo o core
-
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La flexibilidaddel DNA permite que la hebra retrasada forme un lazo para que
la sntesis sea simultneaen ambas hebras, lo que restringe la exposicin de
DNA de cadena sencilla, ms vulnerable.Los elementos que componen el replisoma (DNA pol, helicasa, primasa, etc)
estn funcionalmente conservadosen todos los organismos.
Las funciones propias de cada uno estn coordinadaspor numerosas
interaccionesmutuas.
Sntesis de las dos hebras en la misma direccin: el replisoma
Hebraadelantada
Hebraadelantada
DNAparental
DNA polimerasa
DNA polimerasa
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Hay 300-400 pinzas ''por clula, unas 20 veces ms que DNA pol III*
Modelo del lazo o del trombn (de varas)
"1000 nucletidos / seg ciclos de 1-2 seg fr. Okazaki: 1-2 kb
L DNA li I ti l i l l li i
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Cierre por DNA ligasa
La DNA polimerasa I tiene un papel esencial en la replicacin:
elimina los cebadores de los fr. de Okazaki por corrimiento de mella
gracias a las actividades 5!3 exonucleasa y 5!3 polimerasa
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Protenas del replisoma de la bacteria Escherichia coli
DNA li d i t
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DNA polimerasas de eucariotas
En total hay unas 13-15.
La Pol (sintetiza la h. adelantada y la Pol )la h. retrasada.
La Pol #sintetiza parte de los cebadores.La Pol *est implicada en el ajuste temporal
de la replicacin.El resto estn implicadas en su mayora en
procesos de reparacin del DNA.
Protenas de la horquilla
de replicacin de
ncleos eucariticos
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El DNA (2,4 nm) pasa a travs del agujero de las pinzas replicativas, que tiene
unos 3,5 nm y est cargado positivamente: hay unin topolgica, que implicaun anclaje mvil de la pinza al DNA.
Pinza '% PCNA%
P t f i l l h ill
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Protenas con funciones anlogas en las horquillas
de replicacin de procariotas y eucariotas
Si t d t i i li i l i t
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Sistemas de terminacin en replicones circulares procariotas:
trampas direccionales para horquillas replicativas
+permisiva
, no permisiva
Ubicacin de los
terminadores Ter
Punto de
encuentro
Secuencias
atrapadoraspara la
horquilla B
horquilla
A
horquilla
B
Secuencias
atrapadoraspara la
horquilla A
La protena terminadora Tusse une
a las secuencias Ter, donde bloqueadireccionalmente a la helicasa DnaB y
al replisoma, que se desarma
El bl d l d li i d l
-
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El problema de la duplicacin de los extremosy
el mantenimiento de la longitud de los telmeros
en replicones lineales como los de eucariotas
eliminacin cebador RNA
ligacin fr. Okazaki
5
53
3
5
53
3
hebra adelantada
h. retrasada
53
5
3
5
3
hebra
adelantada
hebra
retrasada
movimiento de la horquilla
5
cebador
Fr. de Okazaki
Soluciones:
- circularizar el DNA
- usar una protena cebadora
- aadir repeticiones al extremo 3
copia incompleta del extremo 5
y acortamientos enreplicaciones sucesivas:
prdida de material gentico
telmeros
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Replicacin de los telmeros
La telomerasa extiende el extremo 3
usando su secuencia de RNA paraaparear con la zona de ssDNA, y su
funcin transcriptasa reversaparaaadir nucletidos al mismo.
Usa como molde la parte no apareada
de su secuencia de RNA, y comocebador el extremo 3-OH.
Se realizan varias repeticiones del
proceso, aadiendo copias de la mismasecuencia para prolongar la hebra con el
extremo 3.
La hebra con el extremo 5 se rellena
por replicacin convencional de lahebra retrasada: la pol #-primasa
sintetiza un cebador que es extendidopor la DNA pol ).
Luego el cebador de RNA se elimina,
dejando de nuevo un saliente de 12-16nt de ssDNA en el extremo 3
%#/)(#&+1+
9:;