MICROCULTIVO Los mohos viven como saprofitos en el suelo y agua donde contribuyen a la descomposicin de la materia orgnica y al reciclado de materia orgnica, utilizando enzimas extracelulares como celulasas y pectinasas, manteniendo de esta manera la fertilidad del suelo. Los hongos se aprovechan directamente como alimento (por ejemplo los championes) e indirectamente en la elaboracin de cerveza, vino y pan (Saccharomyces cerevisiae o especies relacionadas con sta). Adems el queso Roquefort se produce inoculndolo con Penicillium roquefortii durante su elaboracin y otros quesos suaves como el camembert se producen inoculando Penicillium camemberti. El moho crece sobre la superficie produciendo una proteasa que descompone la estructura del queso. Otros ejemplo es el inters en la produccin de protena de origen unicelular a partir de mohos, ya sea apara alimento del hombre o del ganado, por ejemplo el uso de Candida utilis y la levadura desecada Saccharomyces cerevisiae Adems de la produccin de alimentos, los mohos producen cido ctrico para bebidas embotelladas, se basa en el crecimiento de Aspergillus niger, el descubrimiento de penicilinas como productos metablicos de Penicillium notatum revolucion la medicina moderna, hoy en da se produce con una variedad denominada Penicillium chrysogenum. Existen otros antibiticos producidos por mohos estos son las cefalosporinas, griseofulvina, cido fusdico Algunas caractersticas de los mohos. Los mohos tienen las siguientes caractersticas: Son eucariontes, presentan un ncleo rodeado de membrana No contienen clorofila Se encuentran distribuidos ampliamente en la naturaleza Los filamentos se llaman hifas y al conjunto de hifas se le llama micelio El interior de la hifa puede estar septada o no Son inmviles, aunque existen esporas mviles La mayora son esporulados La espora se forma por la fusin de los ncleos de dos clulas Si las esporas asexuales estn contenidas en un saco, este recibe el nombre de esporangio, a la hifa que lo sostiene, esporangiforo, y a las esporas esporangiosporas. Si se forma fuera de un saco, se les designa conidiosporas. Las esporas sexuales que se forman dentro de un saco (ascas) se denominan ascosporas Muestran requerimientos nutricionales mnimos y su pH es cercano a 5,6 Los lmites de temperatura para su desarrollo es de -6 > 70 Se multiplican abundantemente a humedades elevadas La mayora de los mohos son aerbicos Son hetertrofos, pero crece bien en cultivos simples Algunos son termodricos Algunos producen micotoxinas

Las levaduras se distinguen de los mohos en que son unicelulares, no suelen formar filamentos y se reproducen por fisin binaria o gemacin. Generalmente son de forma ovalada La identificacin de los mohos, unicelulares o filamentosos se realiza a travs de: Morfologa colonial Microcultivo

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Morfologa microscpica Pruebas metablicas (levaduras) Composicin de la pared celular Respiracin Nutricin Reproduccin Gentica molecular.

Morfologa colonial: Los mohos unicelulares, tienen colonias semejantes a las bacterias, el dimetro oscila entre 2-4 mm, de color blanco, crema, amarillo, rojo, etc. cncavas de aspecto brillante o mate, opacas, de bordes lisos. Morfologa colonial: Los mohos filamentosos (mohos), tienen colonias de 2-3 cm de dimetro, de color olivo, verde claro, grises, blancas, rojas, amarillas, etc. con aspecto polvoso, rugoso, terroso, aterciopelado, algodonoso, generalmente mates, opacas de bordes irregulares. Morfologa microscpica: La morfologa microscpica se observa con la ayuda del microscopio a seco fuerte mediante la realizacin del microcultivo, observndose las siguientes estructuras: 1.- Segn su nivel de organizacin celular pueden ser: Unicelulares (levaduras) Pluricelulares (mohos) Dimrficos (posee ambos tipos de micelio)

Fig. 71 a.- Unicelular Por su tamao

b.- Pluricelular

Fig. 71 Macroscpicos

Microscpicos

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Por su forma

Fig. 72 Amorfos (masa algodonosa)

Definida (crecimiento circular)

Fig. 73 Por su ausencia o presencia de septos Areo fuera del sustrato Profundos dentro del sustrato

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Fig. 74 Por su localizacin

Por su aspecto Algodonoso, aterciopelados, terrosos, hmedo, seco. Por su funcin: Micelio vegetativo: se encarga de la captacin de nutrientes. Micelio areo o reproductor: produccin de esporas (sexual y asexual)

b) De acuerdo al color de las hifas: Hialino: cuando no est pigmentado. Dematiceo: cuando posee color caf oscuro.

c) Su sistema de reproduccin es asexual y sexual: Las esporas asexuales son:

Talosporas. a) b) c) Artrosporas: Son esporas que se forman por fragmentacin de las hifas. Blastospora: Se forman en las levaduras por la gemacin a partir de una clula ya preexistente. Clamidospora: Estas esporas son redondas y tienen doble pared gruesa que les confieren resistencia.

Conidiosporas a) b) Microconidias: Son esporas unicelulares Macroconidias: Son esporas multinucleadas.

Esporangiosporas Son esporas producidas en estructuras especializadas llamadas esporangios, que son sacos redondos unidos al micelio vegetativo, por una estructura llamada esporangiforo. Las esporas sexuales son:

Zigosporas: esporas contenidas en cigosporangios en los Zimomycetes. Ascosporas: esporas contenidas en saquitos denominados ascas en los Ascomicetes. Oosporas: esporas contenidas en oosferas correspondientes a los Oomycetes. Basidiosporas: esporas contenidas en basidios correspondientes en Basidiomicetes. Morfologa colonial de mohos y levaduras

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Fig. 75 Diferentes forma de levaduras y mohos OBSERVACIN MACROSCPICA DE MOHOS. Determinar: Tamao, forma, aspecto, color, produccin de pigmento difusible y anotar los das de incubacin. A continuacin se muestran dibujos de mohos filamentosos. Una vez realizada las observaciones las cepas se pueden sembrar en tubo para su conservacin o para la realizacin del microcultivo Sembrar por punto en tubos con PDA y ADS

Fig. 75 Conservacin de cepas de mohos. IDENTIFICACIN DE MOHOS POR LA TCNICA DE RIDELL (MICROCULTIVO) 1. Cortar cuadros de PDA de una caja Petri de 1 cm de lado y 3 mm de espesor con un bistur estril y caliente.

Fig.76 Forma en que se cortan los cuadros de agar par el microcultivo 2. Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que est sobre una varilla de vidrio doblada en forma de V en una caja de Petri (previamente esterilizada).

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Fig. 77 Material parta el microcultivo y puesta del cuadro de agar 3. Tomar con el asa l inoculo del moho previamente seleccionado. 4. Inocular por picadura en cada uno de los lados del cuadro de agar. 5. Colocar sobre el agar un cubreobjeto y presionar ligeramente para que se adhiera al medio.

Fig. 78 Inoculacin del cubo de agar, y colocacin del glicerol para mantener la huemdad 6. Adicionar 5 ml de glicerol al 10% en la caja Petri. 7. Incubar la caja a 28 C durante 48 h. REALIZAR OBSERVACIONES MNIMO CADA 12 h PARA IDENTIFICAR LOS CUERPOS FRUCTFEROS. 1. Si el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar, retirar el glicerol con una pipeta Pasteur.

Fig. 79 Observacin del crecimiento del hongo y retiro del glicero para su inactivacin 2. Adicionar 5 ml de formaldehdo para inactivar el moho durante 15 minutos.

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Fig. 80.- Inactivacin del moho 3. Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo sobre un portaobjetos que contenga una gota de azul de algodn, sellar la preparacin con barniz de uas transparente. 4. Desprender con cuidado el cuadro de agar y colocar una gota de azul de algodn, colocar un cubreobjetos sobre el colorante y sellar la preparacin. Observar las preparaciones a 10X y 40X.

Fig. 81.- Realizacin de la preparacin en fresco del microcultivo 5. Dibujar las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografa realizar la comparacin de las estructuras reproductoras y vegetativas, identificar de que moho se trata. Por ejemplo: Rizopus sp

Fig. 82 Aspergillus

Penicillium

Alternaria

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Fig. 83 Rhizopus sp

OBSERVACIN MACROSCPICA DE LEVADURAS Para la identificacin de levaduras utilizamos generalmente reacciones de fermentacin de carbohidratos. Observar las levaduras que pueden aparecer sobre la superficie o en el seno del agar. En el primer caso son circulares y de dimetro mayor al de las bacterias; en el seno del agar suelen aparecer estrelladas y algo ms pequeas, son de aspecto hmedo y pueden ser coloridas.

Fig. 84 Crecimiento de levaduras OBSERVACIN MICROSCPICA DE LEVADURAS. 1. De una placa de PDA incubada a 35C seleccionar una colonia de levadura. 2. Fijar la levadura de la misma manera como se fija una bacteria. 3. Teir la preparacin con cristal violeta, lavar y dejar escurrir. 4. Observar la preparacin en 10X y 40X y dibujar.

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Fig. 85 Observacin microscpica de levaduras

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Mtodos de conservacin de cepas En un laboratorio de microbiologa existen cepas microbianas las cuales hay que conservar, tenindose varios mtodos para su conservacin pero es necesario tomar en cuenta las caractersticas del microorganismos, los materiales y los recursos con que se cuenta para elegir el mejor mtodo, pues sucede que nuestras cepas tipo pueden en un momento sufrir las siguientes daos como la deshidratacin, cambios genticos o perdida de la viabilidad y finalmente la muerte celular.

Fig. 91 Deshidratacin del medio en tubo con tapn de algodn. Los tres objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en los laboratorios de microbiologa son: Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservacin; Que durante el tiempo de conservacin sobrevivan al menos el 70-80% de las clulas, y Que estas clulas permanezcan genticamente estables. Los dos primeros objetivos no son muy difciles de conseguir cuando se conoce bien la tcnica microbiolgica, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen varios mtodos de conservacin para los microorganismos. Los mtodos de conservacin de cepas se van a agrupar en tres apartados, que son: Mtodos de eleccin o de conservacin a largo plazo, mtodos alternativos y mtodos restringidos. A.- Mtodos de eleccin o de conservacin a largo plazo. Son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las clulas microbianas, pero stas no han muerto. As se garantiza al mximo la estabilidad gentica, por evitarse la aparicin de generaciones sucesivas. An as no se puede descartar algn cambio originado por el mtodo preparatorio en si mismo. Los mtodos de conservacin pertenecientes a este grupo son dos: Congelacin y liofilizacin. a) Conservacin por congelacin. Se congelan las clulas en suspensin en un lquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centgrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las clulas de agua en forma lquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las clulas as conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor mtodo de conservacin desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las clulas conservadas por este mtodo son los siguientes: 1.Edad de las clulas: En la mayora de los casos conviene utilizar clulas maduras del inicio de la fase estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de organismos que presenten en su ciclo vital algn estado que les prepare para la resistencia a condiciones adversas, es preferible alcanzar este estado. Esto sucede en el caso de microorganismos que esporulan, en algunos pleomrficos e incluso en algunos ms sencillos. Velocidad en la congelacin y descongelacin: Aunque hay programas de congelacin bien estandarizados para determinados casos o circunstancias, en general es mejor que las variaciones de la temperatura sean rpidas, tanto para la congelacin como para la descongelacin, por lo que para descongelar conviene poner las clulas a 37C.

2.-

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3.-

Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo ms baja posible. Lo mejor es guardar tubos cerrados o sellados, que contengan las clulas microbianas, sumergidos en nitrgeno lquido, que tiene una temperatura de 195C, o bien en la fase gaseosa del nitrgeno lquido, con una temperatura de 140C. Aquellos congeladores que slo alcanzan temperaturas entre 20C y 40C, como ocurre con la mayora, no son aconsejables, entre otras cosas porque debido a la gran concentracin de solutos que existen en la suspensin celular, su punto de congelacin baja. El dao que se produce en las clulas es debido a que a estas temperaturas hay frecuentes congelaciones y descongelaciones. Si se aade un crioprotector no inico, como por ejemplo el glicerol, se reduce la cantidad de hielo que se produce y se evita el aumento de la concentracin inica. Para la conservacin en congeladores, las clulas se almacenan en criotubos (tubos de plstico esterilizables resistentes a la congelacin que cierran hermticamente), preparando lotes de varios tubos para cada cepa a conservar y utilizando en su totalidad un tubo para cada ocasin. De esta manera se evita que las cepas se congelen y se descongelen varias veces. Este mtodo no se debe emplear para la conservacin de microorganismos anaerobios, como por ejemplo el gnero bacteriano Clostridium, ya que al estar las clulas en una superficie hay un mayor contacto con el oxgeno y puede afectarse la viabilidad.

4.-

Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del dao que se pueda producir en las clulas microbianas en el momento de la congelacin. Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores, pero el que se utiliza con ms frecuencia es el glicerol, a una concentracin del 15 al 20%. Tambin se pueden utilizar el dimetilsulfxido, la leche descremada y carbohidratos como glucosa, lactosa, sacarosa o inositol. En su eleccin influye el tipo de microorganismo que se quiera conservar. Conservacin por liofilizacin.

b).-

Tampoco se da crecimiento en las clulas conservadas por este mtodo, puesto que se les ha quitado el agua mediante la liofilizacin, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad gentica es alta, pero a veces no tanto como en la congelacin, porque la liofilizacin se consigue por sublimacin del hielo de las clulas. Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las clulas y despus eliminarla mediante el vaco, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo que acabara afectando a la viabilidad del microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores. Las clulas microbianas as conservadas se someten a un tratamiento ms complejo que en el caso de la congelacin, pues la liofilizacin se hace en dos etapas y se aade la sublimacin del agua a la congelacin previa. Sin embargo, este es un mtodo muy recomendable por su comodidad para el almacenamiento y para el envo de las cepas, pues una vez conseguidos los lifilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18C-20C), con lo cual su envo es muy cmodo. Los factores que hay que tener en cuenta para hacer una buena liofilizacin son lgicamente los mismos que influyen en la congelacin, a los que habr que aadir otros que surgen como consecuencia de la deshidratacin. Sin embargo, antes de pasar a explicar stos, tenemos que hacer unas breves consideraciones sobre los que antes hemos mencionado para el caso de la congelacin. La congelacin puede hacerse rpida o lentamente, la primera sumergiendo los tubos en nitrgeno lquido. Respecto a los crioprotectores, ya vimos que se pueden utilizar varios dependiendo del tipo de microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol, debido a su elevado punto de evaporacin y a su higroscopicidad, que provoca que los lifilos queden muy viscosos. Tampoco es conveniente utilizar el dimetilsulfxido, porque es algo txico, y al concentrarse por la evaporacin del agua puede daar a las clulas microbianas. Por lo tanto, para la liofilizacin se recomiendan como crioprotectores el inositol para la mayora de las bacterias y la leche descremada para mohos y actinomicetos, pero para algunos microorganismos pueden ser ms convenientes otros crioprotectores, como por ejemplo el glutmico-glutamato para las bacterias lcticas, mezclas de glucosa con caldo hgado o chopped meat (sin carne) para bacterias anaerobias. Los nuevos factores que influyen especficamente en la eficacia de la liofilizacin como medio de conservacin son: 1. Tipo de microorganismo. Hay algunos microbios que no resisten la liofilizacin y lgicamente sern aquellos que contengan ms agua en su interior. Algunos mohos filamentosos, especialmente los no esporulados, no se pueden guardar liofilizados y hay que recurrir a otros mtodos.

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2. Concentracin celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una concentracin del orden de 108-109 clulas /ml en el caso de las bacterias y algo inferior en el caso de mohos filamentosos y levaduras. 3. Temperatura durante la sublimacin. Debe ser lo ms baja posible, sin subir por encima de 50C. 4. Grado de deshidratacin alcanzado. Debe ser lo ms alto posible, aunque la concentracin de solutos puede conllevar una pequea cantidad de agua remanente que no es perjudicial. 5. Atmsfera de oxgeno en el tubo. Las clulas liofilizadas se guardan en tubos cerrados al vaco para evitar, tanto la rehidratacin como la presencia de algn gas dentro del tubo, como el oxgeno que puede daar a las clulas. 6. Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante, preferentemente a 18C y sin bajar de los 0C. Los lifilos se deben guardar en la oscuridad. B.- Mtodos alternativos. Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los mtodos de eleccin, bien por carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservacin por estos mtodos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un nico mtodo alternativo, sino que se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos mtodos. a).Conservacin por transferencia peridica.

La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, estas clulas no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas excretan productos txicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y muerte celular, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es el peor mtodo para conseguir la estabilidad gentica, puesto que al estar las clulas creciendo hay una alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las clulas que se estn guardando sern descendientes lejanas de las clulas iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus caractersticas. Si se va a utilizar este mtodo es aconsejable retardar el envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras. Esto se puede conseguir de varias maneras como por ejemplo: disminuyendo la cantidad de inoculo; rebajando la proporcin de algunos nutrientes en el medio de cultivo; inoculando en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos, ya que el crecimiento en presencia de oxgeno es ms rpido y origina productos generalmente txicos; y almacenando los cultivos a 4C-8C. A veces tambin se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estril. Con esto se consigue tambin evitar en la medida de lo posible la desecacin del medio de cultivo, que podra ser txico para las clulas al aumentar su concentracin. Hay que tener en cuenta que los microorganismos muy aerobios, como por ejemplo los mohos filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente cerrados. Por ltimo, otro inconveniente que tiene la transferencia peridica es que la contaminacin de los cultivos resulta ms fcil al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo y tambin por la posibilidad de entrada de caros en los mismos. b).Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar estril.

Es un mtodo alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto mohos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender en agua estril unas cuantas clulas del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos de los anteriormente mencionados. En este caso la concentracin celular no debe ser superior a 104-105 clulas /ml en el caso de bacterias y levaduras. Para los mohos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensin trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensin se hace en agua de mar diluida. Para demostrar la eficiencia de un mtodo en nuestras cepas se tiene que determinar el porcentaje de viabilidad en diferentes periodos, determinar la estabilidad morfolgica y fisiolgica, bioqumica y la virulencia.. C.- Mtodos restringidos. En este grupo se engloban mtodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario recurrir a la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilizacin o la congelacin, como por ejemplo los gneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. Los cuatro mtodos que vamos a citar se basan en la paralizacin del crecimiento por eliminacin del agua disponible para las clulas.

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a).-

Desecacin en papel de filtro.

Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann n 3) que se impregna con una solucin muy densa de clulas y se deja secar al aire (en condiciones estriles). Tambin es posible desecarlos por el procedimiento que se llama desecacin lquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelacin previa de las clulas. El vaco producido por el liofilizador deseca las clulas, pero hay que evitar que un vaco excesivo provoque evaporacin brusca con ebullicin o que la temperatura disminuya demasiado, ocasionando la congelacin incontrolada de las clulas. b).Desecacin en suelo, arena, silicagel, etc.

Se aaden las clulas a estos sustratos que las protegern al desecar. Los microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este mtodo, este mtodo es barato y de fcil conservacin.

Fig. 92 Deshidratacin del medio para generacin de esporas en mohos

Fig. 93 Conservacin de esporas en aceite mineral y arena estril Desecacin en bolitas de alginato. ste es un procedimiento bastante eficaz. Las clulas se encuentran en una matriz de alginato y la eliminacin del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertnicas sucesivas y posterior desecacin al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados hermticamente y a temperaturas de entre 4C y 18C, pudindose guardar incluso a 80C debido al bajo contenido en agua de las clulas y la proteccin que suministra el soporte de alginato. Este es un mtodo que se est utilizando incluso para la conservacin de algas y clulas vegetales. c).Desecacin en sal para halobacterias.

Para su conservacin por este mtodo se mezclan las clulas con sal y se dejan desecar espontneamente. Debido a la higroscopicidad de la sal, la desecacin no es total, pero las clulas dejan de multiplicarse por ser insuficiente el nivel de agua disponible.

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Por ltimo, y a modo de resumen, unas consideraciones finales. Cualquiera que haya sido el mtodo empleado en la conservacin de las cepas microbianas, cuando stas se recuperan para hacer nuevos lotes para su conservacin o para trabajar con ellas, se recomienda no utilizar directamente las clulas que se han estado guardando, porque stas vienen de una situacin de estress ms o menos fuerte (sobre todo cuando se han conservado por liofilizacin) y por lo tanto no son adecuadas para ningn tipo de prueba. Primero habra que revitalizarlas o rejuvenecerlas sembrndolas en un medio no selectivo, es decir, un medio que asegure lo ms posible el crecimiento, y a partir de este primer crecimiento ya se puede trabajar con ellas, cultivndolas en medios selectivos cuando sea necesario. Igualmente hemos de tener presente que, dada la enorme diversidad microbiana, cada microorganismo soportar determinados mtodos de conservacin mejor que otros, o ser necesario tomar precauciones especiales en su conservacin. Como ya dijimos al comienzo, no existe un mtodo general de conservacin de los microorganismos, aunque no resulta difcil determinar el ms aconsejable en cada caso. La mayora de microorganismos de inters sanitario pueden conservarse a largo plazo con los mtodos generales de congelacin y/o liofilizacin, y para periodos cortos pueden mantenerse vivos. CULTIVO EN TUBO INCLINADO PARA CONSERVACIN DE CEPAS POR REFRIGERACIN 1.- Tomar un tubo con agar de soya y tripticasena y sembrarlo por estra simple 2.- Adicionarle 3 ml de aceite mineral estril. (El aceite se puede esterilizar en autoclave o en el horno) 3.- Cerrar el tubo con el tapn, etiquetar el tubo perfectamente, colocarlo dentro de un bote y guardarlo en el refrigerador.

Fig. 94.- Diferentes formas de conservacin de cepas

Fig. 95 Una de las formas ms usuales de conservar las cepas es en congelacin

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PRUEBAS BIOQUMICAS Aislamiento Una vez transcurrido el tiempo de incubacin del cultivo, observamos la placa de Petri, escogeremos las colonias que estn separadas, a estas les realizaremos la morfologa colonial previamente revisada, adems haremos una tincin de Gram para determinar el grupo al que pertenece. Una vez conocido el Gram podremos realizar la Identificacin del microorganismo y para ello es necesario elegir las ms adecuadas acorde a lo que tenemos y a lo que nos sugiere la bibliografa, pues existen algunas marchas ya descritas las cuales nos son de gran valor para la Identificacin. La mayora de las pruebas utilizadas para evaluar la actividad bioqumica o metablica de las bacterias, por medio de las cuales podemos identificarlas hasta especie, es realizando un subcultivo de la colonia pura, aunque es posible efectuar observaciones preliminares utilizando ciertos medios de aislamiento primario, selectivo o diferencial. Se recomienda que de una sola colonia hacer una suspensin bacteriana en 1 ml de solucin salina fisiolgica 0.85 p/v para que de ah se tome la muestra e inocular todo el juego de pruebas bioqumicas. Los siguientes pruebas de Identificacin para bacterias estn agrupados por bacterias Gram (-) y +). PRUEBAS BIOQUMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Fermentacin de carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol, rafinosa, ramnosa, xilosa, etc.) TSI (fermentacin de glucosa, produccin de cido sulfhdrico y produccin de gas) LIA ( Descarboxilacin de la lisina) MIO (movilidad, Descarboxilacin de la ornitina y la produccin de indol) SIM (movilidad, produccin de cido sulfhdrico) Rojo de metilo Produccin de urea Reaccin de Voges Proskauer Utilizacin de Malonato Utilizacin del citrato Licuefaccin de la gelatina Crecimiento en caldo nutritivo Utilizacin de la esculina Utilizacin del gluconato Requerimientos de oxgeno Catalasa Oxidasa Reduccin de nitratos Fermentacin O/F PRUEBAS BIOQUMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM POSITIVAS Fermentacin de carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol, rafinosa, ramnosa, xilosa, etc.) TSI (fermentacin de glucosa, produccin de cido sulfhdrico y produccin de gas) LIA ( Descarboxilacin de la lisina) MIO (movilidad, Descarboxilacin de la ornitina y la produccin de indol) SIM (movilidad, produccin de cido sulfhdrico) Catalasa

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Oxidasa Reduccin de nitratos Hemlisis Crecimiento en NaCl al 5, 10 y 15 % Crecimiento en bilis al 40 % Coagulasa Licuefaccin del a gelatina Hidrlisis de la esculina Voges - Proskauer Prueba de la fosfatas Prueba de la DNAsa Incubacin a 10 y 45 C Reduccin con azul de metileno Hidrlisis del hipurato Formacin de cpsula Hidrlisis del almidn Debemos mencionar que para la identificacin de un microorganismo es necesario consultar la literatura para hacer una seleccin de pruebas recomendable y lograr el objetivo lo ms rpido posible y sin perdida de tiempo y de pruebas, las pruebas antes mencionadas son algunas de las cuales podemos realizar en un momento dado y a continuacin se describirn algunas de ellas. UTILIZACIN DE CARBOHIDRATOS 1.- HIDRLISIS DE ALMIDN Fundamento. Determinar la capacidad de un microorganismo para secretar la enzima amilasa para la degradacin de almidn en molculas ms pequeas para ser utilizadas en su metabolismo. a.- En una caja con agra almidn se procede a inocular por estras simple la placa b.- Incubar la caja a 35C durante 24 h. c.- Despus de la incubacin aadir unas gotas de lugol cubriendo la superficie de la placa. RESULTADOS:

+ Positivo.- Si se forma un halo claro alrededor de la estra. - Negativo.- No se forma un halo claro alrededor de la estra.

Fig. 96 Siembra en agar almidn y realizacin de la prueba con lugol 2.- FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS EN TUBOS CON CALDO ROJO DE FENOL

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Fundamento: Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio, produciendo cido y/o gas en una campana de Durham; el medio es lquido y como indicador contiene rojo de fenol por lo que: Indicador de pH: rojo de fenol pH cido: Color amarillo pH alcalino: Color rojo Prueba positiva: da una coloracin amarilla y con la produccin de gas (aerognica) Prueba negativa el color se mantiene de color rosa-rojiza. El tiempo de incubacin es de 24 h a.- Al tubo con campana de Durham y caldo rojo de fenol ms el carbohidrato por ejemplo sacarosa, inocular 0.1 ml de la suspensin microbiana. b.- Incubar a 35 C de 24 a 48 horas c.- Observar el tubo RESULTADOS:

+ Positivo.- Si hay cambio de color de rojo a amarillo y formacin de gas en la campana de Durham - Negativo.- Si hay no cambio de color de rojo a amarillo y formacin de gas en la campana de Durham

Fig. 97 Fermentacin de un azcar con campana de Durham 3.- FERMENTACIN DE AZUCARES EN MEDIO TSI. Deteccin de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azcar hierro (TSI). Fundamento: Este medio sirve para determinar la fermentacin de glucosa, sacarosa y lactosa adems de la produccin de gas a partir de glucosa y la produccin de cido sulfhdrico que precipita como sulfuro frrico al reaccionar con el hierro, la liberacin del cido sulfhdrico se libera por accin enzimtica, de los aminocidos que contienen azufre produciendo una reaccin visible de color negro. La formula del TSI y del KIA son idnticas, salvo que el TSI contiene 10 g/l de sacarosa adems de glucosa y lactosa (triple azcar), el agar esta preparado en pico de flauta, de tal manera que se tienen 2 cmaras de reaccin dentro del mismo tubo. La porcin inclinada, pico de flauta expuesta en toda su superficie al oxgeno, es aerbica y la parte inferior llamado fondo est protegida del aire y es relativamente anaerobia. Al preparar el medio es importante que el medio solidifique en forma de pico de flauta, adems que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3 cm cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cmaras, para ello utilizar tubos de 13 X 100 mm. La tcnica de inoculacin es por picadura y por estra en el pico de flauta, para esto hay que utilizar el asa recta, primero se introduce en la parte profunda y luego se estra el pico de flauta con un movimiento hacia uno y otro lado. Los tubos inoculados se incuban a 35 C durante 18- 24 h. Indicador de pH: rojo de fenol pH cido: Color amarillo

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pH alcalino: Color rojo RESULTADOS: Prueba positiva: La fermentacin de la glucosa se lleva a cabo en anaerobiosis, por lo cual la prueba se lee en el fondo del tubo. Glucosa positiva: Fondo del tubo amarillo Glucosa negativa: Fondo alcalino, sin cambio. Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarilla Sacarosa y lactosa negativas: superficie roja Lactosa positivo: Color amarillo en el pico de flauta. Lactosa negativo: De color rojo en el pico de flauta. Produccin de H2S: Presencia de una coloracin negra. Produccin de CO2 y H2: Burbujas, ligera muesca sobre el costado del tubo desplazamiento del medio del fondo dejando un espacio libre. a.- Inocular con el asa recta por picadura y despus por estra abierta en forma de S sobre el pico de flauta en un tubo con agar TSI a partir de la suspensin. b.- Incubar el tubo a 35 C durante 24 h y observar los cambios en el tubo.

Fig 98 Diferentes resultados del medio TSI Tubo 1: Tubo sin inocular2.- A/A con produccin de gas, 3 A/A sin produccin de gas, 4 K/A sin produccin de gas y H2S negativo, 5 A/A y H2S positivo sin produccin de gas, 6K/A con produccin de H2S y sin produccin de gas.

Fig 99 Diferentes resultados del medio TSI Tubo 1: A/A sin produccin de gas y H2S negativo, 2: K/K y H2S negativo sin produccin de gas, 3 K/K sin produccin de gas y H2S negativo e inmvil , 4 K/A con produccin de gas y H2S negativo, 5: K/A con produccin de gas y H2S positivo y mvil y Tubo 6: A/K

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4.- PRUEBA DE ROJO DE METILO Fundamento: El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6-8 amarillo) y 4,4 (rojo), esta prueba es cualitativa para la produccin de cido y requiere de organismos positivos que produzcan cidos lctico, actico, o frmico a partir de la glucosa, por la va de la fermentacin mixta. Dado que existen muchos microorganismos que producen cidos, slo se consideran rojo de metilo positivo aquellos organismos que puedan mantener este pH bajo un largo tiempo de incubacin (48-72 h), contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio. La preparacin de este medio se hace en tubos de 13 X 100, colocando 4 ml del medio de RM VP y se inocula con el cultivo puro del organismo en estudio. Incubar el caldo a 35 C durante 48 72 h (no menos de 48 h, finalizando este perodo, aadir directamente al caldo 5 gotas del reactivo de rojo de metilo. Indicador de pH: Rojo de metilo Rojo de metilo positivo: Color rojo estable en la superficie del medio que indica la produccin de cido suficiente como para bajar el pH a 4,4. Rojo de metilo negativo: dado que algunos microorganismos produzcan cantidades menores de cido puede producirse un color entre el amarillo y rojo lo que indicara que la prueba es negativa. Controles Prueba Rojo de metilo Control negativo Escherichia coli Control positivo Enterobacter aerogenes

a.- Inocular con 0.1 ml de la suspensin al caldo rojo de metilo. b.- Incubar el tubo a 35C durante 48 h. c.- Despus de la incubacin, aadir al tubo 2 gotas de la solucin de rojo de metilo y observar. RESULTADOS: Prueba positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo. Prueba negativa: El cultivo no cambia de color.

Fig. 100 Resultados del medio rojo de metilo 5.- PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER Fundamento: La reaccin de Voges Proskauer se basa en la conversin del acetilmetilcarbinol (acetona) en diacetilo por accin del KOH al 40 % y el oxgeno atmosfrico, la acetona se convierte en diacetilo el - naftol acta como catalizador para revelar un complejo de color rojo. Indicador de pH: Rojo de metilo

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Prueba Voges - Proskauer

Control negativo Escherichia coli

Control positivo Klebsiella sp

a.- Inocular un tubo que contenga caldo Voges Proskauer con 0.1 ml de la suspensin b.- Incubar el tubo a 35C durante 24 h. c.- Despus de incubar, agregar 6 gotas de solucin de alfa-naftol y 2 gotas de solucin de KOH, en ese orden estricto y agitar suavemente, dejar en reposo 10-15 minutos y observar los cambios en el medio. RESULTADOS: Prueba positiva: Color rojo ladrillo en la superficie del medio de cultivo (Produccin de acetoina) Prueba negativa: No hay cambio en el color del medio.

Fig. 101- Resultado de la prueba de VP, tubo 1 negativo, tubo 2 positivo y tubo 3 medio sin inocular UTILIZACIN DE SALES ORGNICAS 6.-CITRATO DE SIMMONS Fundamento Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono y compuestos amoniacales como nica fuente de nitrgeno en su metabolismo, provocando una alcalinizacin del medio. Entre las enterobacterias estas caractersticas se dan en los siguientes gneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes. Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrgeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Slo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrn multiplicarse en este medio y liberarn iones amonio lo que, junto con la eliminacin del citrato (cido), generar una fuerte basificacin del medio que ser aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul. Controles Control positivo: Enterobacter aerogenes Control negativo. Escherichia coli. a.- Inocular por estra abierta en forma de S un tubo que contenga agar Citrato de Simmons a partir de la suspensin. b.- Incubar el tubo a 35 C durante 24 h. c.- Observar los resultados RESULTADOS: Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinizacin (color azul). Negativa: No hay desarrollo (medio de color verde).

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Fig. 102 Prueba del citrato de Simmons 7.-CALDO MALONATO Fundamento Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como nica fuente de carbono, con la consiguiente alcalinidad. El malonato es un inhibidor enzimtico ya que interfiere en la oxidacin del cido succnico en cido fumrico, inhibiendo la accin cataltica de la enzima succnico deshidrogenasa, mediante un proceso de inhibicin competitiva. El cido malonico (malonato) se une a la enzima encerrando los sitios activos de manera que la enzima no puede combinarse con su sustrato normal, el cido succnico. Esto ocasiona un bloqueo en la oxidacin del cido succnico Segn la concentracin del malonato, el inhibidor puede retardar simplemente la velocidad de la oxidacin del cido succnico o provocar su completa inhibicin. En el ciclo de Krebs, cada compuesto cido es influido independientemente por enzimas especficas; se consume una molcula y se forma otra en un proceso por etapas. Si se ha suprimido la formacin de un cido, y no es reemplazado, como el cido fumrico, el ciclo de Krebs deja de funcionar, por lo tanto la clula bacteriana, entonces, recurre al ciclo del cido glioxlico para la produccin de intermediarios, para ulterior biosntesis en el metabolismo continuo de esa manera poder regular la cantidad de acetil coenzima A introducida en el ciclo. Indicador de pH: Azul de bromotimol Controles Prueba Caldo malonato Control negativo Salmonella sp Control positivo Alcaligenes faecalis

a.- Inocular con 0.1 ml de la suspensin microbiana un tubo que contenga caldo malonato b.- Incubar el tubo a 35C durante 24 h y observar. RESULTADOS: Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a azul intenso Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color.

Fig. 103.- Prueba negativa y prueba positiva

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8. CALDO UREA Fundamento La urea es una diamida del cido carbnico y esta es fcilmente hidrolizada con la liberacin de amonaco y dixido de carbono. La enzima ureasa que posee un microorganismo puede hidrolizar a la urea que esta presente en el medio de cultivo de acuerdo con la siguiente reaccin: El amonaco reaccionan en solucin para formar carbonato de amonio, producindose una alcalinizacin y un aumento del pH del medio. Inocular un tubo con caldo urea con una asada de la suspensin microbiana a estudiar, si se utiliza agar urea se estra la superficie del medio e incubar el medio a 35 C durante 24 h. Indicador de pH: Rojo de fenol. Controles Prueba Ureasa Control positivo dbil Control positivo rpido Klebsiella sp Proteus sp Control negativo Escherichia coli

a.- Inocular 0.1 ml de la suspensin microbiana a un tubo que contenga caldo urea b.- Incubar el tubo a 35 C durante 24 h. RESULTADOS - Hidrlisis por produccin de ureasa Positiva: Color rosa fucsia en el medio. Negativa: Sin cambio de color en el medio

Fig. 104 Prueba negativa y prueba positiva HIDRLISIS DE PROTENAS Y AMINOCIDOS: 9.- LICUEFACCIN DE LA GELATINA (mtodo del tubo) Fundamento: Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas proteolticas que, a su vez son detectadas por la digestin o licuefaccin de la gelatina presente. Estas enzimas que son capaces de gelatinlisis, se denominan gelatinazas. Las protenas que se producen son demasiado grandes para entrar en la clula por lo tanto para ser metabolizadas deben ser hidrolizadas a componentes ms pequeos, las enzimas exocelulares de tipo proteoltico, gelatinazas son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las protenas y esta capacidad ayuda a la identificacin bacteriana. El catabolismo de las protenas por las gelatinazas se da en dos etapas la primera origina polipptido y posteriormente estos se desdoblan en aminocidos individuales. Controles Control positivo: Staphylococcus aureus Control negativo. Listeria monocytogenes a.- Inocular por picadura un tubo que contenga gelatina nutritiva a partir de la suspensin

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b.- Incubar a 35 C durante 24 h c.- En cada revisin de la prueba sacar de la incubadora y colocar el tubo en el refrigerador por cinco minutos junto con el testigo para verificar el resultado d.- Observar si hay licuefaccin de la gelatina, en el caso de que la prueba sea negativa hay que volver a incubar. Descartar la prueba negativa hasta los 14 das

Fig. 105 Tubo de arriba negativo y el de abajo positivo 10.- MEDIO SIM a.- Inocular por picadura con el asa recta un tubo con medio SIM a partir de la suspensin b.- Incubar a 35 C durante 24 h. c.- Despus de incubar observar el tubo, una coloracin negra indica la formacin de cido sulfhdrico y posteriormente aadir 3 gotas del reactivo de Kovacs o Ehrlich al tubo para observar la presencia o ausencia de indol. RESULTADOS: Produccin de H2S: Presencia de un precipitado color negro alrededor de la picadura o en todo el tubo Produccin de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la superficie al adicionarle el reactivo de Kovacs. Movilidad: Turbidez alrededor de la picadura. Nota: Cuando el microorganismo es mvil y productor de cido sulfhdrico el medio se torna completamente negro.

Fig.- 106Tubo 1 SIM cido sulhidrico positivo y movilidad (+), tubo dos Indol negativo, Tubo 3 microorganismo inmvil, tubo 4 tubo sin inocular, tubo 5 cido sulfhdrico (+) e indol (-) y tubo 6 H2S (-), e indol (+) 11.- MEDIO MIO Fundamento Es un medio semislido, se siembra por picadura y se incuba 24 h a 35 C. Sirve para leer la movilidad, produccin de Indol y descarboxilacin de la ornitina. Cada tubo debe de contener 4 ml del medio utilizando

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tubos de vidrio de 13 X 100 mm con tapn de rosca para evitar la entrada de aire y el medio se deja solidificar en forma vertical. La prueba de movilidad nos sirve para determinar si un microorganismo es mvil por la presencia de flagelos o inmvil. La prueba de Indol nos sirve para determinar si un organismo es capaz de desdoblar el indol de la molcula de triptfano. Este aminocido puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos indlicos principales: indol, escatol e indolactico. El proceso es efectuada por varias enzimas que en conjunto se denomina triptofanasa . Para esta prueba tambin se puede inocular la muestra en caldo triptosa o nutritivo incorporado con triptfano al 1 %. La prueba de la descarboxilacin de la ornitina nos sirve para determinar la capacidad enzimtica de un microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La descarboxilacin es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especficas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminocido dando una amina o una diamina y anhdrido carbnico, la enzima que efecta esta reaccin se llama ornitina descarboxilasa, la cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio cido en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilacin provocan un cambio de pH hacia la alcalinidad.. Adems la descomposicin del aminocido se produce anaerobicamente y el proceso es irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima comn, el fosfato de piridoxal. El aminocido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina descarboxilasa para dar la diamina putrescina y anhdrido carbnico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si recubrimos la superficie del medio con parafina o vaselina. Indicador de pH: Prpura de bromocresol. Control Sustancia Indol Movilidad Descarboxilacin de la ornitina Control positivo Escherichia coli Enterobacter sp Enterobacter cloacae Control negativo Klebsiella pneumoniae Klebsiella sp Klebsiella sp

a.- Inocular por picadura un tubo con medio MIO a partir de la suspensin. b.- Incubar a 35 C durante 24 h y observar si hay descarboxilacin de la ornitina c.- Despus de observar adicionar 3 gotas del reactivo de Kovacs y observar la presencia de indol. RESULTADOS pH cido: vire de color a amarillo (Desaminacin) pH alcalino: vire del color a prpura o morado (descarboxilacin) Movilidad positiva: El medio se enturbia y se ve crecimiento en todo el tubo Movilidad negativa: El crecimiento es slo a lo largo de la picadura. La descarboxilacin de la ornitina se lleva a cabo en condiciones anaerbicas, por lo tanto la prueba solo se lee en el fondo del tubo. Descarboxilacin de la Ornitina positiva: El fondo del tubo debe alcalinizarse y presentar un color prpura o morado. Descarboxilacin de la Ornitina negativa: Fondo del tubo amarillo. Para llevar a cabo la prueba del indol se adiciona a el medio 5 gotas del reactivo de Ehrlich o de Kovacs y se deja durante unos 2 minutos. Indol positivo: Anillo de color rojo Indol negativo: Anillo incoloro o caf.

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Fig. 107 Medio MIO con produccin de indol + y 12.- DESAMINACIN Y DESCARBOXILACIN DE AMINOCIDOS EN MEDIO LIA. Fundamento: En este medio se determina la descarboxilacin de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la Desaminacin de la lisina que se lleva acabo en aerobiosis. La prueba de la descarboxilacin de la lisina nos sirve para determinar la capacidad enzimtica de un microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La descarboxilacin es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especficas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminocido dando una amina o una diamina y anhdrido carbnico, la enzima que efecta esta reaccin se llama lisina descarboxilasa , la cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio cido en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilacin provocan un cambio de pH hacia la alcalinidad.. Adems la descomposicin del aminocido se produce anaerbicamente y el proceso es irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima comn, el fosfato de piridoxal. El aminocido L-lisina es descarboxilado por la enzima lisina descarboxilasa para dar la diamina cadaverina y anhdrido carbnico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si recubrimos la superficie del medio con parafina o vaselina. Al Preparar el medio es importante que se deje solidificar en pico de flauta, que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3 cm. cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cmaras, para ello utilizar tubos de 13 X 100 mm. La tcnica de inoculacin es por picadura y por estra en el pico de flauta, para esto hay que utilizar el asa recta., primero se introduce en la parte profunda y luego se estra el pico de flauta con un movimiento hacia uno y otro lado. Los tubos inoculados se incuban a 35 C durante 18- 24 h. Indicador de pH: Prpura de bromocresol. Controles: Aminocido Descarboxilacin de la Lisina Desaminacin de la Lisina Control positivo Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Control negativo Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes

a.- Inocular por picadura y estra un tubo con medio LIA a partir de la suspensin. b.- Incubar el tubo a 35 C durante 24 h y observar RESULTADOS: - Desaminacin de aminocidos: Positiva: La superficie del tubo es de color rojo vino. Negativa: La superficie no tiene cambios. - Descarboxilacin de aminocidos: Positiva: El fondo del tubo es de color prpura. Negativa: El fondo del tubo es de color amarillo

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Fig. 108 Prueba de LIA DETERMINACIN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO 13.- REDUCCIN DE NITRATOS A NITRITOS Fundamentos La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una caracterstica importante utilizada para la identificacin y diferenciacin de muchas especies, todas las enterobacterias, excepto ciertos biotipos de Enterobacter agglomerans reducen los nitratos. Los organismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxgeno de los nitratos para formar nitritos y otros productos de reduccin. La presencia de nitritos en el medio se detecta aadiendo - naftilamina y cido sulfanlico, con la formacin de un color rojo de diazonio, p sulfobenceno azo - - naftilamina. El color en caso de ser positiva aparecer a los 30 segundos de aadir los reactivos y dado que los reactivos solo detectan nitritos, este ltimo proceso llevara a una lectura falsa negativa, por lo tanto es necesario aadir una pequea cantidad de polvo de Zn a los tubos que sean negativos. Los iones Zn reducen los nitratos a nitritos, y el desarrollo de un color rojo tras agregar el polvo de Zn indica la presencia de nitratos residuales y confirma la reaccin negativa verdadera. Indicador de pH: No tiene indicador. Controles: Prueba Reduccin de nitratos Control positivo Escherichia coli Control negativo Acinetobacter calcoaceticus

a.- Inocular 0.1 ml de la suspensin a un tubo con caldo nitrato b.- Despus de incubar, determinar la presencia de nitritos, aadiendo al tubo 3 gotas de alfa-naftilamina y 3 gotas de cido sulfanlico. Observar si hay cambios de color en el medio: Anotar las observaciones RESULTADOS: - Reduccin de nitratos a nitratos Positiva: Aparicin de un color rojo en 30 s Negativa: Sin cambio de color.

Fig. 109 Prueba positiva y prueba negativa

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14.- DETERMINACIN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO DE LA GLUCOSA EN MEDIO DE HUGH Y LEIFSON Los microorganismos sacarolticos degradan glucosa fermentativamente u oxidativamente, los subproductos de la fermentacin son cidos mixtos relativamente fuertes, que se pueden detectar en un medio de fermentacin convencional. En cambio, los cidos formados por degradacin oxidativa la glucosa son sumamente dbiles y para su deteccin se requiere de un medio de oxido fermentacin mas sensible, como el medio OF. Este medio difiere de otros medios de fermentacin de carbohidratos en lo siguiente: a.- La concentracin de protena (peptonas) ha disminuido del 1,5 al 0,2 %. b.- La concentracin de hidratos de carbono est aumentada del 0,5 % al 1 %. c.- La concentracin de agar est disminuida de 1,5 a 0,25, con lo cual su consistencia es semislida. La menor relacin protena a carbohidrato reduce la formacin de aminas alcalinas que pueden neutralizar las pequeas cantidades de cidos dbiles derivados del metabolismo oxidativo. La concentracin relativamente mayor de carbohidratos sirve para aumentar potencialmente la produccin de cido. La consistencia semislida del agar permite que los cidos formados en la superficie se difundan por todo el medio, facilitando la visualizacin del viraje del indicador de pH. Este medio es tambin apto para determinar la movilidad de un microorganismo. La prueba OF presenta limitaciones, ya que los bacilos fermentadores de desarrollo ms lento pueden no producir cambios de color durante varios das, y las especies que son esencialmente proteolticas pueden con el tiempo producir reversiones de las reacciones dbiles, confundiendo as la interpretacin final. Para realizar esta prueba se necesitan dos tubos con 5 ml del medio en posicin vertical, se inocula por picadura con la suspensin microbiana a estudiar, el asa debe ser introducida hasta llegar casi al fondo del tubo Cubrir un tubo con 1 ml de aceite mineral estril o parafina fundida, dejando el otro tubo abierto al aire. Incubar ambos tubos a 35 C durante 48 h o ms. Indicador de pH: Prpura de bromocresol. Interpretacin. Tipo de metabolismo Oxidativo Fermentativo No sacaroltico Controles Prueba OF Fermentador de la glucosa Oxidador de la glucosa Escherichia coli No sacaroltico Tubo abierto cido amarillo cido amarillo Alcalino - verde Tubo cubierto Alcalino verde cido amarillo Alcalino verde

Pseudomonas aeruginosa Moraxella sp

a.- Inocular por picadura dos tubos con medio de Hugh Leifson, a partir de la suspensin, a un tubo se le agrega 0,4 ml de aceite mineral. b.- Incubar a 35 C y observar a las 24 h y anotar el color del tubo despus de la incubacin y comparar con el siguiente cuadro: Color del tubo Tubo con sello Tubo sin sello Tipo de Metabolismo de aceite de aceite + + + Fermentativo Oxidativo

Amarillo Amarillo

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Verde

+

+

No asimila glucosa

Fig. 110Metabolismo oxidativo y metabolismo fermentativo 15.- PRUEBA DEL CIANURO DE POTASIO Fundamento: Determinar la capacidad e un organismo de vivir y reproducirse en un medio que contenga cianuro de potasio. La respiracin aerbica es un proceso biolgico de oxidacin reduccin que produce energa y por medio del cual un sustrato orgnico es oxidado, el mismo trasfiere electrones e iones hidrgeno por medio del sistema de transporte de electrones, al aceptor de hidrgeno final, el oxgeno molecular. El proceso produce agua o perxido de hidrgeno, segn la especie bacteriana y su sistema enzimtico. Controles Control positivo: Klebsiella Control negativo. Escherichia col. a.- Inocular por asada un tubo con caldo cianuro de potasio (KCN) a partir de la suspensin e incubar a 35 C. durante 24 a 48 h b.- Despus de incubar, observar si hay crecimiento o no en el medio. RESULTADOS: Positiva: Presencia de crecimiento (turbidez) Negativa: Ausencia de crecimiento (medio claro)

Fig. 111 Crecimiento en KCN 16.- PRUEBA DEL CITOCROMO OXIDASA Fundamento Los citocromos son hemoprotenas que contienen fierro y actan como el ltimo eslabn de la cadena respiratoria, transfiriendo electrones (hidrgeno) al oxgeno, con formacin de agua. El sistema citocromo

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oxidasa se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. La prueba es muy til para el conocimiento de las colonias sospechosas de ser enterobacterias (todas negativas) y para la identificacin de colonias que se presume sean especies de Pseudomonas o Neisseria (positivas) Esta prueba ocupa el diclororhidrato de p-fenilendiamina, que acta como aceptor final de electrones, sustituyendo al oxgeno, la p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en presencia de citocromo oxidasa y oxgeno atmosfrico se oxida formando azul de indofenol. La prueba se lleva a cabo por 3 mtodos que son: 1.- La tcnica directa en placas, en la cual se aaden directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las colonias aisladas que se han desarrollado en la placa. 2.- La tcnica indirecta en tiras de papel filtro, en la que se aaden unas gotas del reactivo y, 3.- Tiras comerciales impregnados del reactivo y secos. En la zona de papel donde se halla el reactivo se extiende un asa de la colonia sospechosa. Se recomienda no emplear alambres de acero inoxidable, dado que los productos de la oxidacin de la superficie formados al esterilizarse a la llama pueden producir reacciones falsas positivas. Controles: Prueba Citocromo oxidasa Control positivo Pseudomonas aeruginosa Control negativo Escherichia coli

a.- Impregnar un pedazo de papel filtro con el reactivo de oxidasa (N.N.N.N-tetrametil-p-fenilendiamina). b.- Tomar una asada del cultivo de TSI y frotarla en el papel y observar. RESULTADOS: Positiva: Color azul violeta. Negativa: No hay cambio de color.

Fig. 112 Prueba de oxidas positiva y negativa 17.- PRODUCCIN DE CATALASA Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepcin es Streptococcus. Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes gneros: Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos tcnicas: Mtodo del portaobjetos (recomendado):

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Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaucin de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dar un falso resultado positivo Fundamento. Determinar la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La catalasa es una enzima que se descompone en perxido de hidrgeno en oxgeno y agua, qumicamente la catalasa es una hemoprotena de estructura similar a la de la hemoglobina. El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aerbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular el perxido de hidrgeno es letal para la clula bacteriana. La catalasa transforma al perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. Controles Control positivo: Staphylococcus aureus Control negativo. Streptococcus sp RESULTADOS: Positiva: Presencia de burbujas de oxigeno. Negativa: Ausencia de burbujas de oxigeno.

Fig. 113 Prueba positiva, negativa y positiva de la enzima peroxidas

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PROCEDIMIENTO PARA MICROBIOLGICO

LA

TOMA,

MANEJO

Y

TRANSPORTE

DE

MUESTRAS

PARA

SU

ANLISIS

En el anlisis microbiolgico de alimentos, la adecuada seleccin de la muestra, la toma correcta, los medios de conservacin y su transporte al laboratorio, son de primordial importancia para obtener resultados significativos y confiables. Esto implica precisar el objetivo del estudio, la naturaleza de las muestras y la cantidad, el tamao o el volumen, en lo posible, sern representativos del producto y del lote o partida de donde provienen. La recoleccin de la muestra se debe efectuar evitando toda contaminacin externa, tanto ambiental como humana para asegurar la integridad de la misma. Se requiere consignar en el informe con que se entrega la muestra todos los datos pertinentes que pudieran afectar la prueba o el significado del resultado, a fin de que el laboratorio lo tome en consideracin. Las condiciones de conservacin y transporte, tiempo comprendido entre la recoleccin de la muestra, su entrega al laboratorio, as como la realizacin del anlisis influyen notoriamente en los resultados obtenidos, ya que la poblacin microbiana puede sufrir cambios cualitativos y cuantitativos. Esto es especialmente cierto en los alimentos perecederos. Cabe destacar la importancia del muestreo y la conservacin para los alimentos perecederos, ya que para, fines oficiales la Ley General de Salud seala claramente que despus de la notificacin de los resultados del anlisis practicado, si existe alguna duda sobre la veracidad de estos, el particular puede impugnar dentro del plazo contemplado en la misma Ley, lo que da como consecuencia que la Secretara de Salud analice la muestra testigo en un laboratorio que sta seale en presencia d las partes interesadas y el resultado obtenido sea el que en forma definitiva acredite si el producto en cuestin rene o no los requisitos y especificaciones sanitarias. Sin embargo los alimentos, an en condiciones apropiadas de conservacin, pueden sufrir cambios significativos en sus caractersticas biolgicas y/o fisicoqumicas, provocando que los resultados de las muestras testigo sean improcedentes. PARMETROS QUE PUEDEN AFECTAR EL ANLISIS MICROBIOLGICO a.- Tiempo de transportacin. Si es muy largo y no se mantiene en condiciones adecuadas el nmero de microorganismos puede aumentar o disminuir. b.- Temperatura. Si no es la adecuada el nmero de microorganismos se eleva o disminuye segn la temperatura a la que se transporte o almacene. c.- pH. Si los microorganismos continan su metabolismo y aumentan el pH el nmero puede disminuir VOCABULARIO 1.- Aspticamente, forma de mantener la ausencia completa de microorganismos vivos en un medio. 2.- Fecha de caducidad, fecha limite en que se considera que un producto, almacenado en las condiciones sugeridas por el fabricante, conserva las caractersticas sanitarias que debe de reunir para su consumo. Despus de esta fecha no debe comercializarse ni consumirse. 3.- Muestra representativa, es un nmero de unidades tomadas de un lote, que han sido seleccionadas en forma aleatoria y cuyas caractersticas son lo ms similar posible a las del lote del que procede. 4.- Muestra testigo, muestra que queda en poder del interesado y en disposicin de la autoridad competente. 5.- Productos perecederos, grupo de alimentos que por su naturaleza biolgica y fsico-qumica, su vida til es de hasta 30 das, dando lugar al establecimiento de una fecha de caducidad, la cual debe ostentarse en su etiqueta o envase. 6.- Toma de muestra, es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de la totalidad del lote o partida. 7.- Vida til o vida de anaquel, es el tiempo durante el cual un alimento es seguro y conserva un nivel de calidad sanitaria aceptable para su consumo, bajo condiciones especficas de procesamiento, envasado y almacenamiento. SIGNIFICADO SANITARIO La adecuada toma de muestra para el anlisis es de primordial importancia. Si la muestra esta recolectada en forma impropia, esto no es representativo del lote y el resultado final puede ser errneo. Una muestra representativa es esencial cuando se buscan microorganismos patgenos o toxinas.

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MUESTREO Y ALMACENAMIENTO En la siguiente tabla se enlistan los productos competencia del control Sanitario de Bienes y Servicios, as como el tamao mnimo de muestra necesario para la realizacin de un anlisis bsicos y especiales. Para el anlisis bsico que comprende microbiolgicos, fisicoqumicos y algunas veces biolgicos, se indica el tamao mnimo de muestra que se debe tomar, tanto en unidades (frascos, botes, latas, cajas, etc. Segn sea la presentacin comercial del producto), como en masa o volumen: gramos (g), kilogramos (kg) o litros (l). Nivel de anlisis y mnimo tamao de la muestra para su entrega al laboratorio. No. Producto Cantidad mnima Bsico 2 Un o 2 l 2 Un o 2 g 2 Un 2 l 2 Un 2 l 2 Un o 25 g3 Un o 250 g 2 Un o 500 g 2 Un o 2 l 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 250 g 3 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 2 l 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 1 kg 2 Un o 250 g 1 Un o 250 g 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 4 Un o 200 g 4 Un o 200 gMicrobiolgico Fisicoqumicos

Cantidad adicional especialMetales pesados Plaguicidas

Otros

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

Agua purificada Hielo Leche pasteurizada, no pasteurizada Leche ultrapasteurizada Leche evaporada Leche condensada azucarada Leche deshidratada Leche rehidratada Quesos Mantequilla Grasa butrica Sueros Crema Yogurt Jocoque Cajeta Flan Helado Leche reconstituida Cremas vegetales Imitacin de quesos Helado de crema vegetal Carne Productos de carne Aves Productos de la pesca (pescados y mariscos) Productos industrializados de la pesca Productos derivados de la pesca Huevo Huevo y sus derivados Aceite comestible Manteca de cerdo Sebo Manteca vegetal Grasas compuestas Aditivos para alimentosfrescas procesadas

1l 1 kg 1l 1l 1 Un * * * 250 g 250 g * * * * * * * * * * * 250 gPieza completa

1l 1 kg 1l 1l 2 Un 1 Un 250 g * 250 g 250 g 250 g 250 g 250 g 500 g 250 g 1l 250 g 250 g 250 g 1 kg 250 g

1l 1 kg 2l 2l 2l

2 Un

2 kg2 UN o 2l1kg Radioactivo

1 kg 1 kg 1 kg 2 kg 1 kg 1 kg

2l

2l

Biolgico

500g 1 kg

1 kg 1 kgBiolgico

250 g 250 g 500 g

1 kg 500 g 0.5 l 0.5 l 0.5 l 0.5 l 500 g 2 kg 500g 500 g 500 g 500 g 500 g

1 Un o 1 l 1 Un o 1l 1 Un o 1 l 1 Un o 1 l 1 Un o 1 kg 200 g Frutas, hortalizas, legumbres 1 kg 5 Un2 Un o 500 g

2 Un 200 2 Un o 200 g g 1 Un o .5 l 1 Un o .5 l 1 Un o .5 l 1 Un o .5 l 500 g 500 g 250 g * * 250 g

Frmulas para lactantes

Alimentos envasados para 2 Un o 500 g lactantes y nios de corta edad

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40 41 42 43 44 45 46 47 48 49

50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Alimentos a base de cereales para lactantes Cacao y sus derivados Cocoa Caf y sus derivados Caf tostado T y sus derivados Productos para infusiones Bebidas no alcohlicas Productos para regmenes especiales Productos para preparar bebidas no alcohlicas y refrescos Bebidas no alcohlicas congeladas Cereales Harinas de cereales Harina de leguminosas secas y sus derivados Productos de harina de cereales Productos amilceos y frituras Edulcolorantes nutritivos Gelatinas y sustitutos Golosinas Condimentos Sal Aderezos Conservas y enlatados cidos Alimentos preparados deshidratados Conservas y enlatados de baja acidez Alimentos preparados refrigerados o congelados Bebidas alcohlicas Bebidas alcohlicas fermentados Bebidas destiladas Licores

2 Un o 500 g

250 g 250 g 250 g 250 g 500 g 500 g 5 Un 5 Un

* * * *

500 g 500 g 500 g 500 g 500 g 500 g 3 Un 3 Un 1 l 250 g

2 kg 2 kg 2 kg 2 kg 2 kg 2 kg

2 Un, 1l * 500 g 2 Un, 1 l * 500 g 2 Un 500 g * 500 g * 500 g * 2 Un o 1 kg2 Un o 500 g 2 Un o 500 g 3 Un 750 g 4 Un o 400 g

1 l o 250 g * 500 g 500 g 500 g 250 g 3 kg 3 kg 3 kg 3 kg 500 g 3 kg 3 kg 3 kg 3 kg 500g 500 g

* *

2 Un o 500g 250 g 250 g * * 250 g

500 g 1000 g2 Un 500 g

* 6 Un del * mismo lote 2 Un 200 g *

200 g2 Un o 500 g

6 Un del * 1 Un del mismo lote mismo lote 1 Un o 250 g 1 Un o 250g *2 Un o 1500 ml 1 Un o 250 g 2 Un o 1500 ml

* * * *

1 Uno 750 ml 1 Un o 750 ml 1 Un o 750 ml 1 Un o 750 ml 1 Un o 750 ml

1 Un 750 ml 1 Un 750 ml 1 Un 750 ml 1 Un 750 ml

o o o o

2 UN o 1500 ml Bebidas alcohlicas 2 Un o 1500 preparadas y envasadas ml Tabaco, sus productos y sucedneos Productos para modificar el 2 Un o 50 olor del cuerpo 100 ml Productos para el cabello 5 Un Productos para el cuerpo 4 Un

1 Un o 750 ml

5 Un o 1 envasa( tabaco pipa) 2 UN 50 100 ml 2 Un o 50 100 ml, 3 Un 200 g 2 Un o 50 100 ml, 3 Un 200 g n 2 Un o 50 100 ml, 3 Un 200 g

5 Un o 1 envase (tabaco de pipa)

Biol Un Biol Un Biol Un

1 1 1

Productos para manos y 4 Un uas

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76 77 78

Productos para el aseo de 6 Un la persona Productos de aseo Productos repelentes a insectos (que se aplican directamente sobre la piel) Faciales cremas, maquillajes, rubores, mascarillas, delineadores, lpices, etc.) Para nios (talcos, aceites, etc.) Alimentos preparados listos para servirse 200 g 4 Un

n 2 Un o 50 100 ml, 3 Un 200 g n 2 Un o 50 100 ml, 3 Un 200 g n 2 Un o 50 100 ml, 3 Un, 2 Un o 50 100 ml,

Biol Un Biol Un Biol Un 3 Un Biol

1 1 1

79

5 Un

*

2 Un

80 81

5 Un 250 g

* 250 g

2 Un

3 Un

Biol

Tomado de:

HERRAMIENTAS PARA EL MUESTREO Las herramientas de que puede disponer un analista varia desde instrumentos comunes para fines de carcter general hasta herramientas especiales, que han de utilizarse en determinadas situaciones para hacer exmenes especficos de productos alimenticios especiales. Todo el equipo para el muestreo deber estar limpio y seco cuando vaya a utilizarse. Para la toma de muestras para anlisis microbiolgico, es esencial disponer herramientas de muestreo, envueltas individualmente, previamente esterilizadas, y de recipientes irrompibles esterilizados. Las herramientas tales como los esptulas, cucharillas, etc., debern ser lisos, sin ningn diseo en la superficie, totalmente de acero inoxidable, envueltos individualmente y esterilizados en la autoclave antes de llevarlos al lugar donde van a utilizarse. Cuando sea necesario esterilizar una herramienta de muestreo en la fbrica, el analista debe seguir el siguiente procedimiento: lavarla perfectamente en la pila de lavado del equipo de la empresa, secarla con una toalla limpia; flamearla despus con la llama de una lmpara de alcohol, y enfriarla antes de utilizarla, la herramienta puede enfriarse con alcohol. INSTRUMENTAL Y EQUIPO BSICO DE MUESTREO Recipientes isotrmicos: Cajas de material aislante equipados con tapas y espacios suficientes para colocar los refrigerantes y las muestras que debern permanecer en la temperatura deseada hasta su ingreso al laboratorio. Bolsas limpias de polietileno estriles de varias medidas para submuestras. Pinzas, tijeras, esptulas, cucharas, cuchillos afilados, termmetro con un intervalo de 0 a 100 grados centgrados; hielo o lquidos precongelados. Hielo seco para las muestras congeladas, hielo o recipientes con lquido precongelados para la refrigeracin. Papelera: plumones marcadores de agua, etiquetas adhesivas, masking tape, diurex, plumas. Bata, cubrebocas, malla para pelo o cofia. Herramientas comunes como alicates, destornilladores y cuchillos, son tiles para abrir los envases, cortar sacos y vaciar los productos alimenticios. Puede disponerse de una herramienta especial para abrir las cajas de cartn que se utilizan para el transporte, ocasionndoles daos mnimos. Una lmpara sorda de luz brillante es muy til cuando hay que trabajar en zonas poco iluminadas. En zonas polvorientas como molinos harineros o elevadores de grano, deber utilizarse una linterna a prueba de explosiones. Se pueden utilizar unas tijeras para cortar los embalajes de tela, o unas pinzas para manipular los cortes hechos en los sacos.

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Una taladradora seca tubular puede emplearse para la harina, la leche en polvo y los productos lcteos en polvo. Usualmente habr que sacar el producto de la probeta con una esptula. Esta probeta no deber usarse para la toma de muestras microbiolgicas. Puede utilizarse tambin un cucharn adecuado de acero inoxidable o aluminio. Sondas o probetas especiales se usan para el muestreo de la mantequilla y el queso. Se hace penetrar la probeta en el producto, y despus se la hace girar para cortar un trozo cilndrico. Para la toma de muestras de queso solamente, se necesitar un compuesto obturante hecho a base de parafina o cera de abejas, para cerrar de nuevo hermticamente las zonas de las que se han tomado las muestras. Un manguito o probeta para harina sirve para el muestreo de las tolvas (fondos) de los elevadores de molinos harineros u hornos de pan de grandes dimensiones. La probeta se clava en el material esttico del equipo, y despus se saca para su examen. Se emplean cucharas y pipetas de plstico desechables esterilizadas para un muestreo asptico destinado al anlisis microbiolgico. Podrn utilizarse tambin guantes de cirujano de ltex o PVC para poder manipular los instrumentos de muestreo sin introducir microorganismos en la muestra. Un tamiz metlico o un recogedor se utilizan para controlar si los cereales a granel tienen insectos, heces de roedores y otras materias extraas. Termmetro completamente metlico, o dos si es necesario para abarcar la escala de temperatura de -35 a 100 grados centgrados, con intervalos de graduacin no superiores a 2 grados centgrados. Su precisin deber calibrarse regularmente con los laboratorios de metrologa oficiales. Se usar alcohol isopropilco o etlico al 70 %, que el muestreador puede llevar en una botella de plstico, para desinfectar las herramientas de muestreo. Podrn utilizarse indicadores de papel para determinar si existen residuos de cloro y tomar el pH del producto, pero este ensayo no debe constituir un sustituto de determinaciones precisas de pH. Papel aluminio. Papel estraza. Algodn. Cerillos o encendedor. Lmparas de alcohol. Frascos con agua clorada y tiosulfato de sodio para la toma de muestra Hielo o bolsas refrigerantes. Guantes estriles

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EQUIPO Autoclave equipada con termmetro de mercurio calibrada 121 C 1 C Horno que alcance una temperatura de 170 5C. Termmetros metlicos (dos si es necesario) para toma de temperatura de alimentos intervalos de -40 a 100C, con intervalos no superiores a 1 C. Preparacin del Material para la Toma de la Muestra. 1.- Todo el material e instrumentos de muestreo que se utilicen para la toma, manejo y transporte de muestras, que van a estar en contado directo con el alimento, debe estar limpio, estril y libre de substancias que pudieran afectar la viabilidad de los microorganismos. 2.- El material para la toma de muestra que requiera esterilizacin, se envolver en forma individual debidamente identificado, con papel de Kraf antes de esterilizado. 3.- La tapa de los frascos se proteger con papel de estraza o aluminio fijndolos adecuadamente. 4.- Colocar cinta testigo en el material a esterilizar. 5.- El material que se utilice para la toma de muestra debe ser esterilizado en autoclave a 121 C durante 15 minutos o en homo a 170C por dos horas, de acuerdo a su naturaleza. 6.- Una vez esterilizado el material debe ser protegido para evitar contaminacin posterior.

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7.- De ser necesario, si se requiere mayor nmero de utensilios, limpiar los que hayan sido usados y empaparlos con etanol o isopropanol al 70%, posteriormente flamearlos y colocarlos en recipientes estriles para evitar su contaminacin o inmediatamente utilizarlos. PROCEDIMIENTO El procedimiento para la toma de muestra, depender del tipo de producto y de la finalidad del examen: OBTENCIN 1.- La toma de muestra de productos envasados con presentacin comercial para venta al menudeo se llevar a cabo en forma aleatoria y no asptica, tomndose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus anlisis, envindose al laboratorio tal como se presentan al consumidor. 2.- Tratndose de productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir stos y extraer la muestra en condiciones aspticas para evitar la contaminacin microbiana. 3.- Los alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones, no requieren precauciones estrictamente aspticas. 4.- Cuando se requiera tomar muestras aspticamente, stas no deben tomarse en reas donde las condiciones sanitarias puedan dar lugar a la contaminacin de las mismas. 5.- Es necesario que el personal que lleve a cabo el muestreo se lave las manos antes de desarrollar ste. Para muestreo asptico debe utilizarse bata, cofia y cubreboca. De ser necesario el contacto directo de las manos con el producto debern usarse guantes estriles. 6.- La toma de muestra debe hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse nicamente al momento de introducir sta y cerrarlos de inmediato. No tocar el interior de los envases y evitar que la tapa se contamine. 7.- Cuando sea necesario tomar la temperatura, la muestra que se utilice para tal fin deber ser diferente de la que se enva para su anlisis. 8.- Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda que la persona que elabora los alimentos, sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estriles con los utensilios que emplea normalmente. Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la temperatura en que se muestrearon, esto nicamente si el traslado es menor a una hora, de lo contrario deben enfriarse a temperatura ambiente y trasladarse en condiciones de refrigeracin. 9.- En el caso de alimentos lquidos o semilquidos se deber agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar y despus efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles. 10.- En alimentos slidos cuando sea necesario cortar el producto, debe muestrearse con ayuda de utensilios estriles como sacabocados, cucharas y o cuchillos. 11.- En productos a granel, tomar la muestra de varios puntos del contenedor para obtener una muestra representativa. 12.- Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de una partida a granel, antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo. PRODUCTOS PERECEDEROS 1.- Los alimentos preparados de consumo inmediato que se venden sin envasar o a granel se consideran como alimentos perecederos y los productos no envasados en los cuales no est definida su vida til o de anaquel, se determinar la fecha de caducidad, con base en productos de caractersticas similares. 2.- Para productos envasados que no contengan fecha de caducidad, se consideran para fines de esta norma, como no perecederos. 3.- Para productos perecederos la toma de muestra para efecto de vigilancia sanitaria ser nicamente por duplicado, la primera se enviar al laboratorio oficial para su anlisis y la segunda se quedar en poder del interesado para su anlisis particular si es necesario. 4.- En caso de impugnacin presentada en los trminos que seala la Ley General de Salud, en productos perecederos, la toma de muestra subsecuente la llevar a cabo personal autorizado tomando como muestras en forma aleatoria del lote existente o la cantidad o nmero estipulado en la norma correspondiente del producto, la

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cual ser analizada por el laboratorio acreditado para realizar terceras y el resultado obtenido ser el que definitivamente acredite que el producto cumple con los requisitos y especificaciones sanitarias exigidas. El nmero de submuestras del total que determinen el cumplimiento sern tres de cinco o lo que estipule la norma correspondiente. IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA 1.- En la toma de muestra es indispensable identificar el recipiente claramente, inmediatamente antes o despus de colocar en l la muestra, mediante rtulo o etiqueta (indelebles), con los siguientes datos: 2.- Fecha, lugar, hora del muestreo, nmero de lote y temperatura de la toma de muestra si es que procede. 3.- La etiqueta deber colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco la caja, en el nudo o cierre de la bolsa en forma tal que se evite que la muestra sea alterada o violada. CONSERVACIN Y TRANSPORTE 1.- El manejo y transporte de las muestras deber efectuarse de tal manera que se impida su ruptura, alteracin o contaminacin, evitando su exposicin a la luz solar directa. 2.- Las muestras deben entregarse al laboratorio lo ms rpidamente posible. Los alimentos perecederos se transportarn bajo condiciones de temperatura de 2 a 8C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las pruebas, las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recoleccin. En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0C, empleando para conservarla hielo seco. Para la refrigeracin es recomendable el empleo de recipientes con liquido refrigerante o hielo potable contenido en bolsas de plstico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados. 3.- En el caso de muestras individuales blandas, evitar que la presin que puedan ejercer otros recipientes o una cantidad excesiva de las mismas las deformen u originen derrames y provoquen que el contenido se ponga en contacto con el exterior de la envoltura. 4.- En el caso de muestras no perecederas, evitar que se daen, humedezcan o contaminen con otras. 5.- Los productos con presentacin comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura ambiente, siempre y cuando sta no exceda de 45C 6.- Para la conservacin, durante el transporte de las muestras no est permitido el empleo de sustancias qumicas. 7.- Las muestras que se entreguen al laboratorio de preferencia deber acompaarse de un informe y el nmero de unidades y/o cantidad. a.- Clave nica que permita la identificacin del domicilio del fabricante, representante y/o distribuidor. b.- Indicar nombre genrico y especfico del producto, as como la marca comercial y cualquier otra informacin que se considere importante. c.-Observaciones, en donde se seale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos antes de efectuar la toma de muestra o algn otro dato que sea significativo para determinar los anlisis microbiolgicos que sean necesarios. d.- La muestra testigo podr eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales que indiquen el cumplimento de las especificaciones sanitarias y el particular no decida llevar a cabo su impugnacin.Tomado de: NOM-109-SSA11994, Bienes y servicios. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico

MUESTRAS PARA AGUA 1 Frasco para muestra de agua. a.- Lavar y secar perfectamente un frasco de boca ancha de 500 ml con tapa. b.- Si la muestra proviene de agua que no ha sido clorada esterilizar el frasco en estufa a 170 C, por una hora o a 121 C durante 15 min. c.- Si la muestra de agua posee cloro residual los frascos se deben esterilizar en estufa a 170 C, por una hora o en autoclave a 120 C durante 15 min, los cuales deben contener 0.1 ml de tiosulfato de sodio al 3% por cada 125 ml de capacidad de los mismos.

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d.- Cubrir la tapa la boca del frasco con papel Kraft y asegurando con una liga. e.- Esterilizar por medio de calor hmedo a 121C durante 15 minutos. f.- Despus de esterilizar, dejar enfriar y colocarlo en una bolsa de plstico nueva g.- Para muestrear hielo, traer una bolsa si es posible, en caso de no utilizar frascos de vidrio de boca ancha de 500 a 1000 ml de capacidad. 2. Muestreo 2.1.- En bomba de mano o grifo del sistema de distribucin. a.- El agua de los grifos debe provenir directamente del sistema de distribucin. No debe efectuarse toma de muestra en grifos que presenten fugas entre el tambor y el cuello, ya que el agua puede correr por la parte exterior del grifo y contaminar la muestra. Deben removerse los accesorios o aditamentos externos como mangueras, boquillas y filtros de plstico o hule antes de tomar la muestra. b.- Debe limpiarse el orificio de salida con una torunda de algodn impregnada de solucin de hipoclorito de sodio con una concentracin de 100 mg/l. c.- Debe dejarse correr el agua aproximadamente 3 min o hasta asegurarse que el agua que contenan las tuberas ha sido vaciada totalmente. d.- Cerca del orificio de salida, deben quitarse simultneamente el tapn del frasco y el papel de proteccin, manejndolos como unidad, evitando que se contaminen el tapn, o el papel de proteccin, o el cuello del frasco. e.- Debe mantenerse el tapn hacia abajo para evitar contaminacin y procederse a tomar la muestra sin prdida de tiempo y sin enjuagar el frasco; se debe dejar el espacio libre requerido para la agitacin de la muestra previa al anlisis (aproximadamente 10% de volumen del frasco). Efectuada la toma de muestra, deben colocarse el tapn y el papel de proteccin al frasco. 2.2.- En captacin de un cuerpo de agua superficial o tanque de almacenamiento. a.- Deben lavarse manos y antebrazos con agua y jabn, b.- Debe quitarse el papel de proteccin evitando que se contamine, y c.- Sumergir el frasco en el agua con el cuello hacia abajo hasta una profundidad de 15 a 30 cm, abrir y enderezar a continuacin con el cuello hacia arriba (en todos los casos debe evitarse tomar la muestra de la capa superficial o del fondo, donde puede haber nata o sedimento y en el caso de captacin en cuerpos de agua superficiales, no deben tomarse muestras muy prximas a la orilla o muy distantes del punto de extraccin); si existe corriente en el cuerpo de agua, la toma de muestra debe efectuarse con la boca del frasco en contracorriente. Efectuada la toma de muestra debe colocarse el tapn, sacar el frasco del agua y colocar el papel de proteccin. d.- En el caso de tanques de almacenamiento, si no es posible la toma de muestra como se indica en este punto, debe procederse como se menciona a continuacin. 2.3.- En pozo profundo. a.- Si el pozo cuenta con grifo para toma de muestra, debe procederse como en inciso b del 4.2.1 b.- Si el pozo no cuenta con grifo para toma de muestra, debe abrirse la vlvula de una tubera de desfogue, dejarse correr el agua por un mnimo de 3 min. y a continuacin se procede como en el oinciso d y e del 4.2.1 2.4 En pozo somero o fuente similar. a.- Cuando no es posible tomar la muestra con la extensin del brazo, debe atarse al frasco un sobrepeso usando el extremo de un cordel limpio. b.- Deben quitarse simultneamente el tapn y el papel de proteccin, manejndolos como unidad, evitando que se contaminen el tapn, o el papel de proteccin, o el cuello del frasco. c.- Debe mantenerse el cuello del frasco hacia abajo y se procede a tomar la muestra, bajando el frasco dentro del pozo, y desenrollando el cordel lentamente, evitando que el frasco toque las paredes del pozo. d.- Efectuada la toma de muestra, deben colocarse el tapn y el papel de proteccin al frasco. 2.5.- Manejo de Muestras

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Si el tiempo de llegada es largo la muestra debe colocarse en hielera con bolsas refrigerantes o bolsas de hielo para su transporte al laboratorio, de preferencia a una temperatura entre los 4 y 10C, cuidando de no congelar las muestras, el periodo mximo que debe transcurrir entre la toma de muestra y el anlisis microbiolgico es de 6 horas. 2.6 Identificacin y Control de Muestras Para la identificacin de las muestras deben etiquetarse los frascos y envases con la siguiente informacin: a.- Nmero de registro para identificar la muestra. b.- Fecha y hora de muestreo. c.- Identificacin del punto o sito de muestreo d.- Temperatura ambiente y temperatura del agua e.- pH f.- Cloro residual si es posible. g.- Tipo de anlisis a efectuarTomado de: NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-014-SSA1-1993 "Procedimientos sanitarios para el muestreo de agua para uso y consumo humano en sistemas de abastecimiento de agua pblicos y privados

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DETERMINACIN DE ORGANISMOS MESOFLICOS AEROBIOS EN ALIMENTOS. Las bacterias mesoflicas aerobias son las que crecen a 35 2C, de 24 a 48 2 horas, en agar cuenta estndar o en agar triptona extracto de levadura, este grupo esta formado por cocos o bacilos Gram positivos, Gram negativos, as como un amplio grupo de especies como: cromgenos, proteolticos, fermentativos, lipolticos, psicrotrficos, patgenos, saprofitos, etctera. En muchos alimentos este grupo de microorganismos arroja los mximos recuentos, aunque dependiendo de la naturaleza de los ingredientes, as como de las condiciones higinicas en las que se prepararon y conservaron los alimentos se puede predecir la vida de anaquel. Tambin llamadas bacterias indicadoras ya que se utilizan como indicadores de la calidad sanitaria, del valor nutricional de alimentos perecederos, del agua potable, equipo y otros productos, as como indicadores de la posible presencia de microorganismos patgenos. Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la tcnica comnmente utilizada es la cuenta por vaciado en placa, donde la tcnica ni pretende poner en evidencia a todos los microorganismos, pues tenemos una variedad de especies y tipos diferenciables por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxgeno disponible, etc., hacen que el nmero de colonias contadas constituyan una estimacin de la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado. PROCEDIMIENTO 1.Pesar 10 g del alimento en condiciones de esterilidad y tratarla como indica la NOM-110-SSA11994, Bienes y servicios. Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. 2.3.4.Realizar diluciones hasta 10-4 en frascos que contengan 90 mL del diluyente. Colocar 1 mL de la dilucin que le indiquen en una caja de Petri y realizar el procedimiento por duplicado. Agregar de 15 a 20 ml de agar cuenta estndar, mantenido a 45C.

5.Homogenizar mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en el sentido contrario y 6 de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporacin del inoculo en el medio, cuidar que el medio no moje la cubierta de la caja. 6.El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos. 7.8.Dejar solidificar el medio e incubar a 35 C por 24 horas o si es necesario hasta las 48 horas. Colocar una Placa de Petri como testigo de esterilidad del medio

9.Despus de la incubacin, conta