técnicas de imunologia prof.doutor josé cabeda estudos de citocinas
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Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia
Estudos de citocinas
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Estudos de citocinas
Em condições normais não são detectáveis citoquinas nos Em condições normais não são detectáveis citoquinas nos fluidos biológicosfluidos biológicos
A presença de citoquinas nos fluidos biológicos é A presença de citoquinas nos fluidos biológicos é caracteristicacaracteristica de situações patológicasde situações patológicas De estadios de situações patológicasDe estadios de situações patológicas
As citoquinas podem ser estudadas por:As citoquinas podem ser estudadas por: Imunoensaios (ELISA, RIA)Imunoensaios (ELISA, RIA) BioensaiosBioensaios Citometria Citometria Métodos molecularesMétodos moleculares
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Detecção de citoquinas: ELISA
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Bioensaios
Uso de uma linha celular que responde à presença de uma Uso de uma linha celular que responde à presença de uma citocinacitocina
Cultura da linha celular na presença e na ausência de Cultura da linha celular na presença e na ausência de fluido a testar, e na presença da citocina recombinante.fluido a testar, e na presença da citocina recombinante.
A medida da actividade celular é indicadora da A medida da actividade celular é indicadora da presença/ausência de citocinapresença/ausência de citocina
Tipos de bioensaios (actividade celular medida)Tipos de bioensaios (actividade celular medida) Actividade citotoxicaActividade citotoxica ProliferaçãoProliferação Função celular específicaFunção celular específica Quantidade de uma proteína induzidaQuantidade de uma proteína induzida
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Activationof M in vitro
+/-
Cytokine secretion
Remove cytokine containing
supernatant
Test for effecton other
cells
Which cytokine?
Detecção de citoquinas:Bioensaios
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Include an antibody that blocks
interleukin-1
Test for a characteristiceffect on other cells
e.g. interleukin-1Induces proliferation in
thymocytes
- IL-1 present+ IL-1 absent+
Especificidade dos bioensaios
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Citometria de fluxo
Estimular as célulasEstimular as células MitogénioMitogénio Ag+coestimuladores Ag+coestimuladores
((-CD28+ -CD28+ -CD49d)-CD49d) Bloquear a secreção de Bloquear a secreção de
citoquinas (brefeldin –BfA ou citoquinas (brefeldin –BfA ou monensin)monensin)
Lisar os eritrócitos e fixarLisar os eritrócitos e fixar Permeabilizar as célulasPermeabilizar as células Marcar com anticorpoMarcar com anticorpo Analisar Analisar
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Detecção de IFN-por citometria
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Ensaios Moleculares
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Estudo de doenças Auto-imunes
Doenças Autoimunes endócrinasDoenças Autoimunes endócrinas
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Doenças Autoimunes endócrinas
Tiroidite Crónica (Doença de Hashimoto)Tiroidite Crónica (Doença de Hashimoto) Doença de GravesDoença de Graves Diabete Melitus dependente de InsulinaDiabete Melitus dependente de Insulina Doença da AddisonDoença da Addison
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Doenças Autoimunes endócrinasAutoantigénios
Peroxidase da Tiroide (TPO)Peroxidase da Tiroide (TPO) Antigénios Adrenais (Doença de Addison)Antigénios Adrenais (Doença de Addison) Ovario, Testiculos, PlacentaOvario, Testiculos, Placenta Antigénios da paratiróideAntigénios da paratiróide Células parietais gástricasCélulas parietais gástricas TSH-RTSH-R
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Diabetes Mellitus
Causada pela destruição das células beta do Causada pela destruição das células beta do pâncreas, mediada por células Tpâncreas, mediada por células T
Estudo da função celular T não é práticaEstudo da função celular T não é prática Presença de Autoanticorpos é marcador da Presença de Autoanticorpos é marcador da
doençadoença Auto-anticorpos resultam da libertação de antigénios Auto-anticorpos resultam da libertação de antigénios
das células beta, devido à sua destruiçãodas células beta, devido à sua destruição Mediada pela presença de antigénio. Logo diminui com Mediada pela presença de antigénio. Logo diminui com
a evolução da doençaa evolução da doença Testados por ImunoFluorescência, RIA ou ELISATestados por ImunoFluorescência, RIA ou ELISA
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Auto-antigénios na IDDM Anti células beta = Islet cell antibodies (ICA)Anti células beta = Islet cell antibodies (ICA)
Existem em 70-80% dos doentes diagnosticados de novoExistem em 70-80% dos doentes diagnosticados de novo Descarboxylase do ácido glutâmico (GAD)Descarboxylase do ácido glutâmico (GAD)
Bandas de 64Kd e 50KdBandas de 64Kd e 50Kd Insulinoma Antigen (40 e 37Kd)Insulinoma Antigen (40 e 37Kd)
IA-2IA-2 IA-2IA-2
GLIMA – 38 Kd (só numa minoria de doentes)GLIMA – 38 Kd (só numa minoria de doentes) Anti insulina (IAA)Anti insulina (IAA)
Existem em 50% dos doentes diagnosticados de novoExistem em 50% dos doentes diagnosticados de novo Quanto maior a variedade de auto-anticorpos, maior a Quanto maior a variedade de auto-anticorpos, maior a
probabilidade de o doente possuir IDDMprobabilidade de o doente possuir IDDM
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Auto-antigénios na IDDM
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Estudo de doenças Auto-imunes
Doenças Autoimunes do Doenças Autoimunes do
Sistema NervosoSistema Nervoso
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Doenças Autoimunes do Sistema Nervoso
Bloqueio da transmissão colinérgica periférica por auto-Bloqueio da transmissão colinérgica periférica por auto-anticorposanticorpos
Miastenia GravisMiastenia Gravis Presença de anticorpos anti-receptor da acetilcolina na Presença de anticorpos anti-receptor da acetilcolina na
membrana pós-sináptica do musculomembrana pós-sináptica do musculo
Lambert-Eaton Myastenic Syndrome (LES)Lambert-Eaton Myastenic Syndrome (LES) Presença de anticorpos anti canal de cálcio regulado Presença de anticorpos anti canal de cálcio regulado
pela voltagem, que regula a libertação do transmissor pela voltagem, que regula a libertação do transmissor no terminal nervoso do músculono terminal nervoso do músculo
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Estudo de doenças Auto-imunes
Anemia Hemolitica AutoimuneAnemia Hemolitica Autoimune
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Anemias Hemoliticas autoimunes
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Anemias Hemoliticas autoimunes:Técnicas diagnósticas laboratoriais
Direct Antiglobulin Test (DAT)Direct Antiglobulin Test (DAT) Demonstra o “coating” dos RBC com Ab Demonstra o “coating” dos RBC com Ab in vivoin vivo Usado para investigar :Usado para investigar :
Anemia Hemolitica Autoimune (AIHA)Anemia Hemolitica Autoimune (AIHA) Hemólise induzida por drogasHemólise induzida por drogas Doença Hemolitica do recém-nascidoDoença Hemolitica do recém-nascido Reacção aloimune á transfusãoReacção aloimune á transfusão
Em WAMA (worm) IgG liga RBC de modo estávelEm WAMA (worm) IgG liga RBC de modo estável Em CAD (cold) IgM liga RBC na circulação periférica, activando Em CAD (cold) IgM liga RBC na circulação periférica, activando
o complemento (C3), libertando-se a IgM quando a circulação o complemento (C3), libertando-se a IgM quando a circulação atinge zonas mais quentesatinge zonas mais quentes
Em PCM (semelhante ao CAD mas com IgGEm PCM (semelhante ao CAD mas com IgG sangue coag.sangue coag. Activ. complemento Activ. complemento falsos positivos falsos positivos
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DAT: procedimento
1.1. Colher sangue em EDTA (previne activ.complemento)Colher sangue em EDTA (previne activ.complemento)
2.2. Preparar RBC (2-4%) em PBSPreparar RBC (2-4%) em PBS
3.3. 1 gota RBC em 3 tubos (1 gota RBC em 3 tubos (IgG, IgG, C3b/C3d, e albumina como controlo)C3b/C3d, e albumina como controlo)
4.4. Lavar 4 vezes com PBS (spin 1 min, 3400rpm)Lavar 4 vezes com PBS (spin 1 min, 3400rpm)
5.5. Adicionar 2 gotas de Adicionar 2 gotas de IgG, IgG, C3b/C3d, e 6% albuminaC3b/C3d, e 6% albumina
6.6. Misturar e spin Misturar e spin IgG 15’’-3400rpmIgG 15’’-3400rpm
7.7. Ressuspender suavemente e observar macroscópicamente e Ressuspender suavemente e observar macroscópicamente e microscópicamente para a presença de aglutinaçãomicroscópicamente para a presença de aglutinação
8.8. Incubar 5 min-RT os restantes tubosIncubar 5 min-RT os restantes tubos
9.9. Repetir 6 e 7 para os restantes tubosRepetir 6 e 7 para os restantes tubos
10.10. Adicionar celulas indicadoras (RBC revestidas com o respectivo antigénio) Adicionar celulas indicadoras (RBC revestidas com o respectivo antigénio) a cada tubo negativoa cada tubo negativo
11.11. Repetir passos 6 e 7, descartar tubos com resultados negativos pós passo 10Repetir passos 6 e 7, descartar tubos com resultados negativos pós passo 10
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Eluição de anticorpos de RBC
Lavar RBC com PBS (remove proteínas não ligadas Lavar RBC com PBS (remove proteínas não ligadas especificamente)especificamente)
Ressupender RBC em solução de glicina a baixo pH Ressupender RBC em solução de glicina a baixo pH (promove a dissociação dos anticorpos)(promove a dissociação dos anticorpos)
CentrifugarCentrifugar Recolher o sobrenadante enriquecido em anticorposRecolher o sobrenadante enriquecido em anticorpos Neutralizar o sobrenadante com solução tamponadaNeutralizar o sobrenadante com solução tamponada
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Determinação de amplitude térmica de auto-anticorpos
Cold reactive Ab reagem a 0-4ºCCold reactive Ab reagem a 0-4ºC Anticorpos patogénicos reagem a cerca de 30ºCAnticorpos patogénicos reagem a cerca de 30ºC
1.1. Colher e manter amostra a 37ºCColher e manter amostra a 37ºC2.2. Spin 3400rpm-1minSpin 3400rpm-1min3.3. Incubar 5’ a 37ºCIncubar 5’ a 37ºC4.4. 1 gota RBC 4% a 37ºC + 2 gotas soro/plasma a 37ºC1 gota RBC 4% a 37ºC + 2 gotas soro/plasma a 37ºC5.5. Agitar; incubar 1 hora a 37ºCAgitar; incubar 1 hora a 37ºC6.6. Spin 15’’-3400rpm e examinar macroscópicamenteSpin 15’’-3400rpm e examinar macroscópicamente7.7. Repetir 5 e 6 a 30ºCRepetir 5 e 6 a 30ºC8.8. Repetir 5 e 6 a 22ºCRepetir 5 e 6 a 22ºC
Pos a 30 e 22ºC Pos a 30 e 22ºC Ig patológicas Ig patológicas Pos só a 22ºC Pos só a 22ºC Cold aglutininCold aglutinin A reactividade pode ser melhorada adicionando 30% BSAA reactividade pode ser melhorada adicionando 30% BSA
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Indirect Antiglobulin Test (IAT):(Antibody screen for RBC-Ab)
Routine pre-transfusion testRoutine pre-transfusion test Soro incubado com 2 RBC grupo O comerciais e observados Soro incubado com 2 RBC grupo O comerciais e observados
para aglutinação em 2 fases:para aglutinação em 2 fases: 37ºC com agente “enhancer”*37ºC com agente “enhancer”* Após adição de Após adição de -IgG (reagente coombs)-IgG (reagente coombs)
Se pos. O soro é testado com um painel mais alargado de Se pos. O soro é testado com um painel mais alargado de RBC (8-10) para identificar a especificidade, e excluir os RBC (8-10) para identificar a especificidade, e excluir os falsos positivios devido a alo-anticorposfalsos positivios devido a alo-anticorpos
WAIHA geralmente pan-RBCWAIHA geralmente pan-RBC
* BSA, Low Ionic strenght Saline (LISS), LISS com PEG ou polybrene, ou RBC tratados enzimaticamente)* BSA, Low Ionic strenght Saline (LISS), LISS com PEG ou polybrene, ou RBC tratados enzimaticamente)
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Estudo de Alergias
Quantificação de alergéniosQuantificação de alergénios
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Estudo de Alergias
Estudos Estudos in-vivoin-vivo
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Quantificação de Alergénios
Skin testingSkin testing Protein contentProtein content Quantificação de alergénios individuais Quantificação de alergénios individuais
(RIA,ELISA, etc)(RIA,ELISA, etc) ImunoelectroforeseImunoelectroforese PAGEPAGE ImunoblotingImunobloting Inhibition immunoassaysInhibition immunoassays
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Skin testing
Para controlar a possibilidade de choque sépticoPara controlar a possibilidade de choque séptico Médico disponível em SOSMédico disponível em SOS Garrote disponível em SOSGarrote disponível em SOS 1 mg epinefrina disponível em SOS1 mg epinefrina disponível em SOS
Seringa hipodérmica com 100 Seringa hipodérmica com 100 L alergénioL alergénio Injecção de 20-50 Injecção de 20-50 L, cerca de 3mm diâmetroL, cerca de 3mm diâmetro Observação aos 15 minObservação aos 15 min
Medir dois diâmetros e calcular médiaMedir dois diâmetros e calcular média Nova observação aos 30 minNova observação aos 30 min
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Skin testing
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Estudo de Alergias
Testes LaboratoriaisTestes Laboratoriais
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Testes laboratoriais para estudo de alergias
Determinação de IgE totalDeterminação de IgE total Determinação de IgE específica para um alergénioDeterminação de IgE específica para um alergénio Screening multialergénicoScreening multialergénico Imunoblotting com alergéniosImunoblotting com alergénios Medida de alergénios caseirosMedida de alergénios caseiros Skin testingSkin testing
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Determinação de IgE total
Captura com Captura com IgE conjugada com suporte IgE conjugada com suporte sólidosólido
LavarLavar Reagir com Reagir com IgE marcada IgE marcada LavarLavar Detectar a marcação (radioactividade ou Detectar a marcação (radioactividade ou
actividade enzimática)actividade enzimática)
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Determinação de IgE específica para um alergénio
Alergénio ligado a matriz sólidaAlergénio ligado a matriz sólida Adicionar soro doenteAdicionar soro doente Incubar e lavarIncubar e lavar Reagir com Reagir com IgE marcadaIgE marcada LavarLavar Detectar a marcação (radioactividade ou Detectar a marcação (radioactividade ou
actividade enzimática)actividade enzimática)
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Multiple Alergen Screens
Conjugar multiplos alergénios a uma matriz sólidaConjugar multiplos alergénios a uma matriz sólida Ex:Ex:
Mistura de árvoresMistura de árvores Mistura de relvasMistura de relvas Mistura de sementesMistura de sementes Dermatofagoides farinae/pteromyssinus dust Dermatofagoides farinae/pteromyssinus dust
mitesmites Pelo de cão e gatoPelo de cão e gato Etc...Etc...
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Specific IgE Inhibition immunoassays
Reconstituir o alergénio inibitório em PBS em Reconstituir o alergénio inibitório em PBS em diluições sucessivasdiluições sucessivas
Usar PBS como 0% inibição Usar PBS como 0% inibição Adicionar inibidor em diferentes diluições ao soro Adicionar inibidor em diferentes diluições ao soro
do doente e incubar 2 horas com agitaçãodo doente e incubar 2 horas com agitação Alergénio ligado a suporte sólidoAlergénio ligado a suporte sólido Fazer um ensaio de detecção de IgE específicaFazer um ensaio de detecção de IgE específica Calcular a % inibição para cada diluição do inibidorCalcular a % inibição para cada diluição do inibidor Fazer um plot da inibição em função da Fazer um plot da inibição em função da
concentração de inibidorconcentração de inibidor
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